EFEKTIVITAS EKSTRAK KULIT BATANG Rhizophora mucronata SEBAGAI ANTIBAKTERI UNTUK MENCEGAH PERKEMBANGAN BAKTERI Edwardsiella tarda PADA IKAN MAS (Cyprinus carpio L.) (Effectiveness Stembark Extract of Rhizophora mucronata as an Anti-bacteria to Prevent Growth of Edwarsiella tarda on Gold Fish (Cyprinus carpio L,)) 1
Ainul Mardiah, 2Dwi Suryanto & 3Desrita
1
Mahasiswa Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara, Medan, Indonesia 20155 2 Departemen Biologi, Fakultas MIPA, Universitas Sumatera Utara, Medan, Indonesia 20155 3 Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Pertanian, Universitas Sumatera Utara, Medan, Indonesia 20155 ABSTRACT This study was aimed to determine antimicrobial potential of stembark extract of R. mucronata against bacterial pathogens E. tarda, to know the extract toxicity to gold fish (Cyprinus carpio. L), and to know the effect of the extract to fish survival rate. Antimicrobial assay of the extract was done using diffusion method, LC50 assay was conducted by putting the fish into chamber with extract concentration of 0, 25, 30, 50, and 75 ppm in water. Survivalship assay to the methanol extract was conducted at concentration of 2,86 and 3,93 ppm along with E. tarda inoculation. To examine stembark extract in inhibition disease caused by E. tarda, methanol extract of the stembark was used in this examination. Goldfish of 5 - 7 cm were subjected to be infected with E. tarda of 107 CFU/ml in intraperitoneal. The result showed that the methanol extract of the stembark was more effective in inhibiting grow of E. tarda. LC50 of the methanol extract was in 39,30 ppm. The methanol extract of 3,93 ppm showed to reduce E. tarda cell from 2,18 x 103 CFU/ml to 1,32 x 103 CFU/ml in gold fish. It showed that methanol extract of 3,93 ppm were not toxic to the fish shown by survival rate of 100%. Survival rate of goldfish treated with the methanol extract was high compared to that of E. tarda ((-) control). The soaking of stembark extract showed a significant effect (P<0.05) toward survival rate of goldfish infected by E. tarda. Keywords : Antibacteria activity, Edwardsiella tarda, Rhizophora mucronata, challenge test PENDAHULUAN Ikan mas merupakan jenis ikan konsumsi air tawar. Di Indonesia ikan ini telah dibudidayakan di kolam biasa, sawah, waduk, sungai air deras, maupun dalam keramba di perairan umum sejak tahun 1920. Budidaya ikan mas dan perikanan pada umumnya tidak terlepas dari resiko yang disebabkan oleh
adanya gangguan penyakit (Purwaningsih, 2013). Mendiagnosis serangan penyakit pada ikan merupakan cara yang tepat untuk mengetahui penyebab serangan dan jenis penyakitnya. Salah satu organisme patogen penyebab timbulnya penyakit ikan pada usaha budidaya adalah bakteri,
diantaranya Edwardsiella tarda. E. tarda adalah salah satu jenis bakteri yang masuk dalam daftar Hama Penyakit Ikan Karantina (HPIK) yang harus dicegah penyebarannya. (Narwiyani dan Kurniasih, 2011). Umumnya pembudidaya sering melakukan pemberian berbagai macam antibiotik seperti ampicillin, chloramphenicol, tetracycline dan disinfektan pada ikan. Pengobatan dengan pemberian antibiotik yang berdampak negatif tersebut merupakan dasar pemikiran untuk mencari alternatif pengobatan yang lebih alami dan ramah lingkungan yaitu dengan terapi herbal menggunakan ekstrak kulit batang R. mucronata. Tumbuhan mangrove diketahui merupakan salah satu sumber senyawa metabolit sekunder (Mulyani dkk. 2013). Arumugam dkk. (2014) menyatakan bahwa Rhizophora mucronata adalah tanaman bakau obatobatan yang, umumnya dikenal sebagai bakau merah. R. mucronata memiliki senyawa metabolit aktif yang penting yaitu senyawa alkaloid, terpenoid, steroid, tanin, kuinon, saponin, flavonoid, glikosida, dan fenol. Pemanfaatan kulit batang R. mucronata ini diharapkan dapat memberikan informasi tentang senyawa yang terkandung di dalam kulit batang R. mucronata yang berpotensi sebagai antimikroba. Penggunaan ekstrak kulit batang R. mucronata sebagai antimikroba juga perlu diketahui tingkat toksisitasnya untuk melihat ada tidaknya efek toksik dan batas keamanan dalam kaitannya dengan penggunaan senyawa yang ada dalam tumbuhan tersebut. Pengujian toksisitas dilakukan dengan menggunakan uji LC50 selama 48 jam. Selanjutnya ekstrak kulit batang R. mucronata diujikan terhadap bakteri E. tarda untuk melihat kemampuan senyawa bioaktif
ekstrak kulit batang R. mucronata dalam menghambat bakteri tersebut Senyawa bioaktif yang terkandung dalam tanaman R. mucronata akan membantu untuk pengembangan obat lebih lanjut (Arumugam dkk., 2014). METODE PENELITIAN Waktu dan Tempat Penelitian dilaksanakan dari bulan Agustus – Desember 2015. Ekstraksi kulit batang R. mucronata dilakukan di Laboratorium Kimia Bahan Alam, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Sumatera Utara. Uji aktivitas antibakteri di Stasiun Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan Kelas I Medan II. Uji toksisitas LC50 dan uji tantang dilakukan di Laboratorium Budidaya Perairan Manajemen Sumberdaya Perairan Fakultas Pertanian Universitas Sumatera Utara. Persiapan dan Ekstraksi Kulit Batang R. mucronata Kulit batang tumbuhan R. mucronata dikumpulkan sebanyak 10 kg dalam berat basah dari kawasan hutan mangrove desa Denai Kuala, Kec. Pantai Labu, Kab. Deli Serdang. Pemanenan kulit batang R. mucronata hanya dilakukan pada pohon dengan diameter lebih dari 30 cm. Kulit batang R. mucronata dicuci dengan air mengalir dan dipotong kecil-kecil kemudian dikeringanginkan selama 7 hari untuk mengurangi penguapan yang mengikutkan senyawa yang terkandung di dalamnya. Proses pengeringan ini bertujuan menurunkan kadar air sehingga tidak mudah ditumbuhi kapang dan bakteri serta menghilangkan aktivitas enzim yang dapat menguraikan lebih lanjut kandungan zat aktif yang terdapat di kulit batang tumbuhan tersebut (Gunawan dan Marina, 2004).
Kulit batang yang sudah kering selanjutnya dipotong kecil agar mudah dihaluskan dengan blender hingga berbentuk serbuk. Serbuk selanjutnya diayak menggunakan ayakan hingga diperoleh serbuk yang halus dan seragam. Langkah selanjutnya adalah ekstraksi bahan aktif. Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi dengan menggunakan tiga pelarut dengan kepolaran berbeda yaitu nheksana (non polar), etil asetat (semi polar) dan metanol (polar). Serbuk sampel masing-masing sebanyak 1,1 kg direndam dengan 6 l pelarut etil asetat, 1,1 kg direndam dengan 5 l pelarut metanol dan sebanyak 2,1 kg direndam dengan 5 l n-heksana di dalam botol kaca. Botol kaca yang berisi rendaman tersebut kemudian ditutup selama 24 jam sambil sesekali diaduk untuk mempercepat kontak antara sampel dengan pelarut. Setelah itu sampel disaring dengan kapas sehingga diperoleh filtrat dan ampas. Filtrat yang diperoleh kemudian pelarutnya dipekatkan dengan penangas air (water bath) sambil sesekali diaduk untuk mempercepat proses penguapan dan diperoleh ekstrak pekat/kering. Ekstrak tersebut kemudian disimpan di dalam beaker glass yang ditutup menggunakan aluminium foil, kemudian disimpan di dalam refrigerator sebelum digunakan. Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap E. tarda Peremajaan bakteri E. tarda dilakukan dengan mengambil isolat menggunakan jarum ose dan menanamnya secara aseptis pada media TSA, kemudian diinkubasi pada suhu 35oC selama 24 – 48 jam. Konsentrasi larutan uji yang digunakan adalah 20%, 40% dan 60% (b/v). Konsentrasi 60% dibuat dengan
cara menimbang ekstrak kulit batang R. mucronata sebanyak 0,6 g yang dilarutkan dengan 1 ml DMSO. Larutan dengan konsentrasi 40% dan 20% dibuat dengan cara pengenceran dari konsentrasi 60% menggunakan 0,5 ml DMSO. Kontrol negatif digunakan DMSO dan kontrol positif digunakan kloramfenikol (30 µg/ml). Tahap pertama yang dilakukan adalah pembuatan suspensi bakteri dengan cara mengambil biakan menggunakan sengkelit (ose) dan disuspensikan dengan cara dimasukan ke dalam tabung berisi 3 ml larutan NaCl 0,9% dan suspensi disetarakan dengan larutan baku Mc. Farland 0.5 yang ekuivalen dengan suspensi sel bakteri dengan konsentrasi 1,5 × 108 cfu/ml (Andrews, 2008). Pengujian antibakteri dengan menggunakan blank disc (kertas cakram kosong) berdiameter 6 mm. Cutton buds steril dimasukkan ke dalam tabung reaksi yang berisi suspensi bakteri dan diguncang sedikit agar bakteri teraduk rata kemudian Cutton buds yang mengandung bakteri dioleskan pada media TSA. Setelah olesan bakteri mengering, kertas cakram yang telah direndam ekstrak selama 1 jam pada berbagai konsentrasi ditiriskan dan diletakkan di atas media yang berisi olesan bakteri dengan sedikit ditekan agar cakram menempel pada permukaan media. Selanjutnya diinkubasi pada suhu 37oC selama 24 jam di inkubator. Setelah diinkubasi selama 24 jam kemudian dilakukan pengukuran zona hambat ekstrak terhadap bakteri. Penentuan zona hambat bakteri yaitu dengan mengukur diameter zona bening yang dapat dideskripsikan dengan Gambar 1.
a c
b
Gambar 1. Perhitungan diameter zona hambat antibakteri Keterangan: a = Diameter kertas cakram (mm) b = Diameter zona hambat yang terbentuk (mm) c = Daerah yang ditumbuhi bakteri b – a = Diameter zona hambat Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Ikan Mas Uji LC50 48 jam menguji cobakan secara langsung konsentrasi ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap benih ikan mas yang berukuran 5 – 7 cm sebanyak 10 ekor per akuarium yang berisi 20 liter air dengan 5 perlakuan yakni A. Tanpa perlakuan 0% (kontrol), B. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata 25 ppm, C. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata 30 ppm, D. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata 50 ppm, dan E. Perlakuan ekstrak kulit batang R. mucronata 75 ppm, dengan masing-masing sebanyak 3 kali ulangan. Parameter yang diamati adalah jumlah mortalitas benih ikan mas dengan tetap menjaga kualitas air tempat hidup ikan uji. Penginfeksian dan Pengujian Bakteri Isolat bakteri E. tarda dimurnikan kembali sebanyak 2 cawan petri penuh yang telah berisi media TSA untuk penyuntikan ikan. Bakteri yang sudah dimurnikan kemudian dipanen dan diencerkan dengan larutan fisiologis (NaCl 0,9%) sebanyak 10 ml. Setelah itu dihomogenkan dengan menggukan vortex dan disetarakan dengan larutan
McFarland 107CFU/ml, kemudian diinfeksikan ke ikan mas. Penginfeksian bakteri pada ikan dilakukan dengan penyuntikan menggunakan jarum suntik sebanyak 0,1 ml/ekor suspensi bakteri dengan kepadatan 107CFU/ml dan disuntikkan secara intraperitoneal (Narwiyani dan Kurniasih 2014). Setelah ikan diinfeksi kemudian diamati pergerakan dan gejala ikan yang terinfeksi bakteri E. tarda. Pemberian pakan dilakukan 2 kali sehari, yaitu pada pagi dan sore hari serta diamati kualitas airnya. Ikan yang telah terinfeksi bakteri kemudian diisolasi dalam media TSA. Setelah bakteri tumbuh, dilakukan uji biokimia pada bakteri tersebut untuk mengetahui apakah bakteri yang menyerang ikan mas adalah bakteri E. tarda. Perhitungan Koloni Bakteri E. tarda pada Ikan Mas Proses penghitungan jumlah koloni bakteri E. tarda dengan metode cawan sebar dengan pengenceran dan untuk menghitung koloni menggunakan metode TPC (Total Plate Count). Ikan yang telah terinfeksi selama 24 jam kemudian dibedah dengan mengambil organ tubuhnya. Menurut KEP-BKIM (2015) ikan ukuran 4 – 6 cm, target uji adalah bagian isi perut sampai dengan ginjal dan sebagian enchepalon yang diambil dari memotong tepi operculum dan menekan secara lateral, sedangkan ikan ukuran lebih dari 6 cm, target uji terdiri dari ginjal, limpa dan otak. Tahap pengenceran yaitu 10-1, 10-2, 10-3, dan 10-4. Sampel organ diambil sebanyak 1 gram dan diencerkan menggunakan media BFP cair sebanyak 10 ml. Empat buah tabung reaksi diisi media BFP cair sebanyak 9 ml. Biakan bakteri diambil sebanyak 1 ml dari campuran bakteri dengan pengenceran 10-1 agar
mendapatkan bakteri dengan -2 pengenceran 10 , begitu seterusnya sampai pengenceran 10-4. Sampel yang sudah diencerkan dikocok dengan menggunakan vortex kemudian dituang sebanyak 1 ml ke media RS dan diberi label sesuai pengenceran. Setelah itu diinkubasi selama 24 jam pada suhu 35oC kemudian dihitung koloni bakteri dengan metode TPC dan dilakukan perhitungan jumlah bakteri menurut menurut (Hadioetomo, 1993 diacu oleh Susanti, 2009). Ni = No x
x 10
Keterangan: Ni = Jumlah sel bakteri (CFU/ml) No = Jumlah koloni bakteri yang tumbuh fp = Faktor pengenceran
Uji Tantang Uji tantang dilakukan pada hari ke-5 pasca penginfeksian, kemudian dilakukan pengobatan dengan 4 perlakuan dan 3 ulangan, yaitu perlakuan kontrol negatif (tidak diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak), kontrol positif (diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak), ekstrak dengan larutan metanol 2,86 ppm dan ekstrak dengan larutan metanol 3,93 ppm (10% dari hasil uji LC50). Benih ikan uji sebanyak 10 ekor dalam 20 liter air per akuarium. Perendaman dilakukan selama 14 hari dan diamati kelulushidupan ikan (SR). Pada saat uji tantang pada hari ke-14 frekuensi pemberian pakan ditingkatkan yaitu tiga kali dalam sehari, dengan jadwal pemberian pagi (07.00-08.00), siang (12.00- 13.00), dan malam (19.0020.00) WIB. Pengamatan Kualitas Air Untuk menjaga kualitas air selama percobaan dilakukan penyiponan
jika diperlukan. Parameter kualitas air yang diukur meliputi suhu, DO, dan pH. Pengukuran kualitas air dilakukan setiap pengamatan, pagi dan sore. Analisis Data Untuk zona hambat pengukuran zona bening dirata-ratakan dan dianalisis dengan metode deskipstif dalam bentuk tabel dan gambar. Uji tantang, analisis data menggunakan ANOVA. Selanjutnya untuk analisis data uji LC50 48 jam dengan perhitungan Analisis Probit yaitu dilakukan dengan persamaan regresi linear y = a + bx yang didapatkan dari grafik hubungan antar log konsentrasi dengan mortalitas probit menggunakan program Microsoft Excel. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Pengujian aktivitas antibakteri dilakukan dengan metode difusi cakram yang menggunakan blank disc ukuran 6 mm. Hasil pengujian ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda menunjukkan bahwa ekstrak tersebut mampu menghambat pertumbuhan bakteri E. tarda. Besarnya daya hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda dapat diketahui dengan mengukur zona bening yang menghambat pertumbuhan bakteri E. tarda menggunakan jangka sorong. Pengamatan terhadap pertumbuhan bakteri E. tarda dilakukan selama 24 jam. Zona hambat ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap bakteri E. tarda dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 2.
Tabel 2. Zona hambat rata-rata ekstrak kulit batang R. mucronata tarda Bakteri
E. tarda
(a)
Ekstrak dengan pelarut Etil Asetat Metanol N-heksana Kloramfenikol DMSO
(b)
terhadap bakteri E.
Diameter rata-rata zona hambat (mm) 60% 40% 20% Kontrol 16,11 8,60 4,75 19,03 13,95 9,38 0 0 0 38,50 0
(c)
(d)
(e)
Gambar 2. Hasil pengujian antibakteri terhadap bakteri E. tarda; (a) ekstrak dengan pelarut etil asetat (b) ekstrak dengan pelarut metanol (c) ekstrak dengan pelarut n-heksana (d) kontrol positif/kloramfenikol (e) kontrol negatif (DMSO)
Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Ikan Mas Toksisitas ekstrak kulit batang R. mucronata dilakukan untuk mengetahui kandungan bioaktif ekstrak tersebut dengan menggunakan Uji LC50. Ekstrak yang paling menghambat pada uji daya hambat diaplikasikan dalam uji LC50, yaitu ekstrak metanol. Data hasil uji LC50 ekstrak metanol dari kulit batang R. mucronata dapat dilihat pada Tabel 3. Tabel 3. Data hasil uji LC50 ekstrak kulit batang R. mucronata dengan pelarut metanol Konsentrasi (ppm) 0 25 30 50 75
Total Populasi 30 30 30 30 30
Jumlah Kematian 0 0 14 30 30
LC50 (ppm)
39,30
Uji Tantang Benih Ikan Mas yang telah terinfeksi dilihat pada perubahan morfologi dan tingkah lakunya. Salah satu perubahan ikan yang terinfeksi bakteri E. tarda yaitu tubuhnya pucat, hilangnya sisik akibat luka dan dapat menyebakan pendarahan bahkan kematian. Ikan yang telah terinfeksi dilakukan uji biokimia untuk memastikan ikan tersebut terinfeksi bakteri E. tarda. Setelah itu dilakukan pengobatan dengan cara perendaman ekstrak. Perhitungan rata-rata kelulushidupan ikan mas setelah diinfeksi bakteri dan direndam ekstrak dapat dilihat pada Tabel 4 dan perubahan ikan yang diinfeksi bakteri dan setelah direndam ekstrak dapat dilihat pada Gambar 3.
Tabel 4. Perhitungan rata-rata kelulushidupan benih ikan mas yang diinfeksi bakteri pasca perendaman Rata-rata Ikan Hidup (ekor) Rata-rata Setelah Perlakuan Kelulushidupan Benih Setelah Diinfeksi Perendaman Ikan Mas (%) ± SD Bakteri Ekstrak Kontrol negatif 10 10 100 ± 0,00a Kontrol positif 7 0,67 6,67 ± 1,154b Ekstrak 2,86 ppm 7,33 6,67 66,67 ± 2,614c Ekstrak 3,93 ppm 7,33 10 100 ± 0,00a Keterangan : Superskrip yang berbeda menunjukkan berbeda nyata (P < 0,05) Kontrol negatif : tidak diinfeksi bakteri dan tidak direndam ekstrak Kontrol positif : diinfeksi bakteri tanpa direndam ekstrak
(a)
(b)
Gambar 3. Uji tantang (a) ikan yang diakibatkan oleh bakteri E. tarda dan (b) ikan setelah diobati dengan perendaman ekstrak
Tabel
5.
Hasil uji biokimia Edwardsiella tarda
Parameter Oksidase Katalase Urea Gelatin TSIA MIO LIA SIM SCA O/F H2S MR/VP Arabinosa Inositol Sorbitol Manitol Maltosa Glukosa
bakteri
Hasil + H2S, gas, K/A Motil (+) Indol (+) Ornitin (+) S (+) I (+) M (+) + F + MR (+) / VP (-) + + + + -
Perhitungan Koloni Bakteri Sebelum dan Sesudah Pengobatan Ikan mas yang telah terinfeksi bakteri maupun sudah dilakukan pengobatan dengan cara perendaman ekstrak kemudian dilakuan perhitungan jumlah koloni bakteri dengan metode TPC (Total Plate Count). Grafik penurunan jumlah koloni bakteri E. tarda pada ikan mas sebelum dan sesudah perendaman ekstrak dapat dilihat pada Gambar 4.
Jumlah Bakteri (CFU/ml)
Uji Biokimia Bakteri Edwardsiella tarda Uji biokimia dilakukan untuk mengetahui bakteri yang yang menyerang benih ikan mas adalah bakteri E. tarda. Hasil uji biokimia bakteri E.tarda yang dapat dilihat pada Tabel 5.
3.4 3.35 3.3 3.25 3.2 3.15 3.1 3.05 3
3,33
3,12
sebelum sesudah
1 2 sebelum sesudah Pengenceran
Gambar 4. Grafik penurunan jumlah koloni bakteri E. tarda pada ikan mas sebelum direndam dan setelah perendaman
Parameter Kualitas Air Kualitas air merupakan suatu variabel yang dapat mempengaruhi kelangsungan hidup ikan. Parameter kualitas air yang diamati adalah suhu, DO, dan pH. Pengukuran dilakukan setiap pagi dan sore selama pengamatan. Kisaran pengukuran parameter kualitas air dapat dilihat pada Tabel 7. Tabel 7. Kisaran rata-rata pengukuran kualitas air Kisaran Kisaran Parameter Pengamatan Normal* Pagi – Sore Suhu (oC) 25,6 – 28,25 28 – 30 DO (ppm) 5,56 – 5,74 3–6 pH 6,57 – 6,74 5–9 Keterangan : *Amri dan Khairuman (2008)
Pembahasan Ekstraksi Proses ekstraksi senyawa kimia yang terkandung dalam tanaman dapat dipengaruhi berbagai aspek, baik dari teknis penyarian maupun faktor tanaman itu sendiri. Sistem penyarian dan polaritas pelarut sangat menentukan perpindahan senyawa kimia tanaman dari dalam sel ke dalam cairan pelarut (Rais, 2014). Ekstraksi dilakukan dengan metode maserasi. Mukhriani (2014) menyatakan bahwa metode ini dilakukan dengan memasukkan serbuk tanaman dan pelarut yang sesuai ke dalam wadah inert yang tertutup rapat pada suhu kamar. Metode maserasi dapat menghindari rusaknya senyawasenyawa yang bersifat termolabil. Ekstrak metanol kulit batang R. mucronata merupakan ekstrak dengan hasil tertinggi sedangkan ekstrak nheksana merupakan ekstrak dengan hasil terendah yang menggunakan sampel dengan jumlah yang paling banyak. Perbedaan jumlah sampel yang digunakan pada proses ekstraksi disebabkan oleh adanya perbedaan
kemampuan pelarut dalam menghasilkan jumlah ekstrak yang dibutuhkan dalam proses uji toksisitas dan uji antimikroba selanjutnya. Polaritas cairan pelarut yang digunakan bergantung dari sifat kimia senyawa aktif yang akan diekstraksi dan kemampuan menembus membral sel (Rais, 2014). Elya dkk. (2009) menambahkan bahwa perbedaan kandungan pada ekstrak disebabkan karena perbedaan sifat kepolaran dari golongan senyawa-senyawa kimia tersebut. Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap E. tarda Ekstrak kulit batang mangrove R. mucronata dengan pelarut metanol memiliki daya hambat tertinggi terhadap bakteri uji. Zona bening ekstrak metanol pada konsentrasi 20%, 40%, dan 60% berkisar 8 – 19,5 mm. Berdasarkan hasil identifikasi kandungan fitokimia ekstrak kulit batang tumbuhan R. mucronata pada penelitian Pradana (2013) bahwa ekstrak metanol positif mengandung fenolik (flavanoid/tanin). Aktivitas antimikroba senyawa fenolik adalah dengan merusak lipid pada membran plasma mikroorganisme sehingga menyebabkan isi sel keluar (Pratiwi, 2008). Beberapa tanin terbukti mempunyai aktivitas antioksidan, menghambat pertumbuhan tumor dan menghambat enzim seperti enzim reverse transkriptase dan DNA topoisomerase. Tanin juga dapat meracuni hati (Robinson, 1995). Pengujian aktivitas ekstrak etil asetat menunjukkan bahwa hambatan pertumbuhan pada konsentrasi 20%, 40% dan 60% berkisar 4 – 18,5 mm. Sedangkan pada pengujian aktivitas ekstrak n-heksana menunjukkan bahwa tidak terlihat zona bening di sekitar
kertas cakram. Berdasarkan hasil uji fitokimia ekstrak n-heksana yang dilakukan Pradana (2013) bahwa nheksana terhadap senyawa golongan alkaloid, fenolik (tanin dan flavonoid), terpen/steroid dan saponin didapatkan hasil yang negatif. Menurut Lisdawati dkk. (2006), bahwa senyawa metabolit sekunder yang larut dalam pelarut nonpolar adalah golongan minyak atsiri, asam lemak tinggi, terpen/steroid dan karotenoid. Pengujian antibakteri dari ketiga ekstrak bahwa ekstrak metanol dan etil asetat adalah ekstrak yang kuat menghambat bakteri sedangkan ekstrak n-heksana tidak menghambat. Hal ini dinyatakan oleh Davis dan Stout (1971) bahwa ketentuan antibakteri adalah sebagai berikut daerah hambatan sebesar 20 mm atau lebih berarti sangat kuat, daerah hambatan 10 – 20 mm kuat, daerah hambatan 5 – 10 mm sedang dan kurang dari 5 mm lemah. Bakteri E. tarda adalah bakteri gram negatif, sementara bakteri gram negatif lebih banyak mengandung lipid, sedikit peptigoglikan, membran luar berupa bilayer (berfungsi sebagai pertahanan selektif senyawa-senyawa yang keluar atau masuk sel dan menyebabkan efek toksik). Membran luar terdiri dari fosfolipid (lapisan dalam), dan lipopolisakarida (lapisan luar) tersusun atas lipid A, yang bersifat nonpolar. Hal ini yang menyebabkan senyawa antibakteri lebih sulit untuk masuk ke dalam sel sehingga aktivitas antibakterinya lebih lemah dibandingkan pada bakteri gram positif (Dewi, 2010). Pengujian kontrol negatif dengan perendaman cakram dengan pelarut DMSO tidak menunjukkan adanya aktivitas penghambatan pertumbuhan. Menurut Widowati dan Mudahar (2009) DMSO merupakan pelarut yang dapat digunakan untuk
melarutkan sebagian ekstrak yang tidak dapat larut dalam air dan pada konsentrasi dibawah 3% biasanya DMSO tidak toksik kepada sel. Pengujian antibakteri digunakan kloramfenikol sebagai kontrol positif dimana menunjukkan aktivitas zona hambat yang sangat besar pada E. tarda yaitu berkisar 37,5 – 39,5 mm. Kloramfenikol merupakan metabolit sekunder dari Streptomyces venezuellae yang berukuran relatif kecil sehingga mudah berdifusi ke dalam tubuh (Pratiwi, 2008). Menurut Wattimena dkk (1998) kloramfenikol bekerja menghambat sintesis protein bakteri dan juga sel eukariosit. Antibiotik ini berpenetrasi mudah ke dalam sel bakteri. Uji LC50 Ekstrak Kulit Batang R. mucronata Terhadap Benih Ikan Mas Pengujian LC50 48 jam yang digunakan adalah ekstrak kulit batang R. mucronata dengan pelarut metanol dengan konsentrasi dengan konsentrasi 25 ppm menunjukkan mortalitas ikan sebesar 0%, hal ini sama pada perlakuan kontrol. Pada konsentrasi 30 ppm memperlihatkan mortalitas benih ikan mas hampir mencapai 50%. Sedangkan pada analisis probit menunjukkan konsentrasi ekstrak dengan pelarut metanol sebesar 39,30 ppm menyebabkan kematian benih ikan mas sebanyak 50% dalam waktu 48 jam. Pemberian ekstrak pada konsentrasi 50 ppm dan 75 pmm mortalitas benih ikan mas sebesar 100%. Hal ini menunjukkan bahwa semakin tinggi pemberian konsentrasi maka semakin meningkat pula kematian pada ikan. Faktor lain yang menyebabkan mortalitas pada benih ikan adalah adanya zat saponin yang terkandung dalam ekstrak kulit batang R. mucronata. Saponin merupakan golongan senyawa glikosida yang dapat
menimbulkan busa bila dikocok dalam air dan dapat menyebabkan hemolisis eritrosit dan dapat bersifat racun pada hewan akuatik/ikan dan dapat menyebabkan kematian (Lukistyowati, 2012). Menurut Wibisono (1989), bahwa nilai yang aman (safety concentration) bagi organisme dari daya racun toksisitas adalah 10% dari nilai LC50. Oleh karena itu, konsentrasi yang ekstrak kulit batang R. mucronata yang aman digunakan untuk ikan mas adalah 10% dari 39,30 ppm yaitu 3,93 ppm. Uji Tantang Ikan mas yang terinfeksi menunjukkan gejala-gejala yang berbeda dari keadaan normal. Pada hari ke dua
setelah penyuntikan, ikan terlihat cenderung diam dan nafsu makan berkurang. Pengamatan ikan pada hari ke empat terjadi perubahan warna tubuh ikan mas yang menjadi lebih pucat, berenangnya tidak beraturan, sirip punggung mulai menghilang dan pecahpecah serta adanya luka borok terutama di sekitar punggung (Gambar 3 a). Menurut Ali. dkk (2014), ikan yang terkena penyakit Edwardsiellosis akan memperlihatkan tanda-tanda pergerakan renang melambat dan mati, warna kulit memucat, terdapat lendir yang berlebihan, terdapat luka, peradangan dibagian mulut serta dibagian tubuh ikan lain seperti bagian sirip punggung, dada dan ekor berwarna kemerahan. Pengamatan ikan pada hari ke lima, ikan mas sudah ada yang mati, yaitu terlihat pada kontrol positif, dimana ikan yang terinfeksi tidak direndam ekstrak. Menurut Ibrahem. dkk (2011), penyebaran infeksi bakteri E. tarda dapat bersifat langsung dan horizontal melalui proses makan, insang, dan permukaan tubuh, bakteri ini dapat menginfeksi terutama ikan yang sakit dan stres dengan prevalensi 43%, namun dapat pula menginfeksi
ikan yang tidak stres dengan prevalensi 7%. Uji tantang pada benih ikan mas, yaitu dengan direndam ekstrak dengan konsentrasi yang berbeda. Keadaan
morfologi benih ikan mas pasca perendaman terlihat adanya warna tubuh yang mulai kembali normal, luka pada bagian punggung menghilang (Gambar 3 b). Perlakuan kontrol negatif, ikan tidak mengalami kematian, perlakuan kontrol positif kelulushidupan ikan 16,67%. Pada konsentrasi ekstrak 3,93% kelulushidupan ikan sebesar 100% dan nilai konsentrasi ini lebih tinggi dibandingkan dengan kontrol positif. Hal ini menunjukkan bahwa perendaman dengan ekstrak dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh ikan terhadap serangan E. tarda sedangkan rendahnya tingkat kelangsungan hidup pada ikan kontrol positif diduga karena infeksi bakteri yang menyerang mengakibatkan ikan menjadi stres sehingga kondisi ikan menjadi lemah dan memudahkan berkembangnya penyakit yang dapat menyebabkan kematian. Menurut Ajizah (2004), semakin kecil dosis, semakin sedikit jumlah zat aktif yang terkandung didalamnya untuk menghambat pertumbuhan suatu bakteri. Hasil uji ANOVA menunjukkan kelulushidupan benih ikan mas yang diberi larutan ekstrak kulit batang R. mucronata secara rendaman selama 14 hari menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata bila dibandingkan dengan kontrol positif (P<0,05). Hal ini diduga karena zat tanin/flavanoid yang tinggi pada dosis tersebut. Menurut Ajizah (2004) tanin memiliki aktivitas antibakteri dengan cara mengkerutkan dinding sel atau membran sel, sehingga mengganggu permeabilitas sel yang dapat mengakibat terganggunya aktivitas hidup sehingga
pertumbuhannya terhambat dan mati. Monalisa dkk. (2011) juga menyatakan bahwa senyawa flavonoid dapat menggumpalkan protein, senyawa flavonoid juga bersifat lipofilik, sehingga dapat merusak lapisan lipid pada membran sel bakteri. Perhitungan Koloni Bakteri Sebelum dan Sesudah Pengobatan Jumlah total bakteri E. tarda dalam CFU/ml setelah di logaritma, yaitu sebelum perendaman 7,29 dan pasca perendaman 5,96, hal ini membuktikan bahwa pertumbuhan dan perkembangbiakan sel bakteri E. tarda menurun setelah pemberian ekstrak. Seperti hasil yang dibuktikan pada uji tantang bahwa pemberian ekstrak dapat mempengaruhi pertumbuhan bakteri. Menurut Lukistyowati dan Syawal (2013) ini membuktikan bahwa keberhasilan untuk pencegahan maupun pengobatan dengan menggunakan bahan alami harus dilakukan serangkaian uji coba dengan mempertimbangkan tingkat keamanan untuk kehidupan ikan dan lingkungan, disamping itu juga perlu diperhatikan konsentrasi dari bahan alami yang efektif untuk berbagai ukuran ikan maupun spesies ikan. Parameter Kualitas Air Kualitas air merupakan salah satu faktor yang mempengaruhi timbulnya penyakit pada ikan, karena penyakit muncul dari interaksi antara inang, patogen, dan lingkungan. Kualitas air yang berada di luar kisaran optimum kebutuhan hidup ikan akan menyebabkan ikan mengalami stres, sehingga akibatnya ikan lebih mudah terserang penyakit. Oleh karena itu kondisi kualitas air selama perlakuan harus diperhatikan, agar tetap berada pada kisaran normal. Oksigen terlarut dibutuhkan untuk menghasilkan energi dari pakan yang masuk ke dalam tubuh.
Sehingga jika DO dalam kondisi optimum maka metabolisme dalam tubuh akan optimal dan energi yang dihasilkan akan banyak (Widanarni dkk., 2010). Hasil yang didapatkan kadar oksigen terlarut berkisar 5,56 – 5,74 mg/l dari keempat perlakuan. Kadar pH selama masa pemeliharaan dari keempat perlakuan didapatkan hasil pH 6,57 – 6,74 dan pengukuran suhu didapatkan yaitu 25,6 – 28,25oC selama pemeliharan 14 hari. Ikan mas dapat bertahan hidup pada derajat keasaman air (pH) rendah, kisaran toleransi terhadap pH berkisar antara 5 – 9 dan dapat bertahan hidup pada pH tinggi atau perairan basa. Kebutuhan oksigen untuk ikan mas di dalam perairan antara 3 sampai dengan 6 ppm. Suhu yang optimal untuk kehidupan dan pertumbuhan adalah 28 – 30oC. Hasil pengukuran kualitas air selama pemeliharan mendapatkan hasil pengukuran layak digunakan untuk pemeliharaan benih ikan mas (Amri dan Khairuman, 2008). KESIMPULAN DAN SARAN Kesimpulan 1. Hasil uji antimikroba terhadap bakteri E. tarda menunjukkan ekstrak metanol kulit batang R. mucronata memiliki aktivitas antibakteri dengan diameter zona hambat yang lebih besar daripada etil asetat dan n-heksana. 2. Nilai hasil uji LC50 ekstrak metanol kulit batang R. mucronata yang mematikan benih ikan mas sebanyak 50% adalah dengan konsentrasi 39,30 ppm. 3. Perendaman ekstrak dapat menurunkan perkembangbiakan bakteri E. tarda pada benih ikan mas dengan jumlah total bakteri dalam CFU/ml setelah di logaritma, yaitu dari 7,29 menjadi 5,96.
Saran Pengujian ekstrak kulit batang R. mucronata terhadap bakteri E. tarda secara in vivo, telah dibuktikan bahwa ekstrak tersebut dapat menghambat pertumbuhan bakteri dilihat secara morfologi dan tingkah laku. Oleh karena itu perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang uji histopatologi untuk mengetahui kerusakan jaringan organ tubuh akibat serangan bakteri E.tarda. Selain itu perlu juga dilakukan isolasi terhadap senyawa metabolit sekunder kulit batang R. mucronata untuk mengetahui senyawa apa atau kombinasi senyawa apa yang memiliki potensi antimikroba. DAFTAR PUSTAKA Ajizah, A. 2004. Sensitivitas Salmonella typhymurium Terhadap Daun Jambu Biji (Psidium guajava L.). Jurnal Bioscientiae. 1(1): 8–31. Ali,
H., F. S. Chowdhury., Ashrafuzzaman., A. N. Chowdhury., R. U. Haque., K. M.A. Zinnah., dan M. Rahman. 2014.Identification Pathogenecity, Antibiotic and Herbal Sensitivity of Edwardsiella tarda Causing Fish Disease in Bangladesh. Jurnal Current Research in Microbology and Biotechnology. 2(1): 292– 297.
Amri, K dan Khairuman. 2008. Buku Pintar Budidaya 15 Ikan Konsumsi. Agromedia Pustaka. Jakarta. Andrews, J. M. 2008. BSAC Standardized Disc Susceptibility Testing Method. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 62: 256 – 278.
Arumugam, S., D. Palanisamy., dan R.T. Sambandam. 2014. Identification of Bioactive Compounds of Rhizophora mucronata Poir. Leaves Using Supercritical Fluid Extraction and Gc-Ms. Journal Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3(10): 1621 – 1631. Davis dan Stout. 1971. Aktivitas Antimikroba Ekstrak Biji Mimba Terhadap Bakteri Salmonella thypidan Staphylococcus aureus. Jurnal Biogenesis. 2(2):64–66. Dewi, F. K. 2010. Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Buah Mengkudu (Morinda citrifolia, Linnaeus) terhadap Bakteri Pembusuk Daging Segar. [Skripsi]. Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam.Universitas Sebelas Maret. Surakarta. Elya B., A. Soemiati., dan Farida. 2009. Antibakteri Ekstrak Kulit Batang Manggis Hutan (Garcinia rigida Miq.). Majalah Ilmu Kefarmasian. 6(1): 9 – 17. Gunawan, D dan S. Marina. 2004. Ilmu Obat Alam (Farmakognosi) Jilid 1. Penebar Swadaya. Jakarta. Ibrahem, M.D., I.B. Shaheed., H.A. Elyazeed., dan H. Korani. 2011. Assessment of The Susceptibility of Polyculture Reared African Catfish and Nile Tilapia to Edwardsiellatarda. Jurnal American Science. 7(3): 779 – 786. Keputusan Badan Karantina Ikan Pengendalian Mutu dan Keamanan Hasil Perikanan. 2015. Petunjuk Teknis Pemantauan Hama dan Penyakit Ikan Karantina. Jakarta.
Lisdawati V., S. Wiryowidagdo., dan L.B.S. Kardono. 2006. Brine Shrimp Lethality Test dari Berbagai Fraksi Ekstrak Daging Buah dan Kulit Biji Mahkota Dewa (Phaleria macrocarpa). Buletin Penelitian Kesehatan. 34(3): 111 – 118. Lukistyowati, I. 2012. Studi Efektifitas Sambiloto (Andrographis paniculata Nees) untuk Mencegah Penyakit Edwardsiellosis Pada Ikan Patin (Pangasius hypopthalmus). Jurnal Berkala Perikanan Terubuk. 40(2): 56 – 74. Lukistyowati, I dan H. Syawal. 2013. Potensi Pakan yang Mengandung Sambiloto (Andrographis paniculata) dan Daun Jambu Biji (Psidium guajava) untuk Menanggulangi Bakteri Aeromonas hydrophila Pada Ikan Baung (Mystus nemurus). Jurnal Akuakultur Rawa Indonesia. 1(2): 135 – 147. Monalisa D., T. Handayani., dan D. Sukmawati. 2011. Uji Daya Antibakteri Ekstrak daun Tapak Liman (Elephantopus scaber L.) Terhadap Staphylococcus aureus dan Salmonella typhi. Jurnal BIOMA. 9(2): 13 – 20. Mukhriani. 2014. Ekstraksi, Pemisahan Senyawa dan Identifikasi Senyawa Aktif. Jurnal Kesehatan. 7(2): 361 – 367.. Narwiyani, S. dan Kurniasih. 2011. Perbandingan Patogenesitas, Edwardsiella tarda Pada Ikan Mas Koki (Charassius auratus) dan Ikan Celebes Rainbow (Telmatherina celebensis). Jurnal
J. Ris. Akuakultur. 6(2): 291 – 301. Pradana, D. 2013. Uji Daya Hambat Ekstrak Kulit Batang Rhizophora mucronata Terhadap Pertumbuhan Bakteri Aeromonas hydrophila, Streptococcus agalactiae dan Jamur Saprolegnia sp. Secara In Vitro. [Skripsi]. Fakultas Pertanian. Universitas Sumatera Utara. Medan. Pratiwi, S.I. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Erlangga. Jakarta. Purwaningsih, I. 2013. Identifikasi Ektoparasit Protozoa pada Benih Ikan Mas (Cyprinus carpio Linnaeus, 1758) di Unit Kerja Budidaya Air Tawar (UKBAT) Cangkringan Sleman DIY. [Skripsi]. Fakultas Sains dan Teknologi. UIN Sunan Kalijaga. Yogyakarta. Rais, I.R. 2014. Ekstraksi Andrografolid dari Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees Menggunakan Ekstraktor Soxhlet. Jurnal Pharmaciana. 4(1): 85 – 92. Robinson, T. 1995. Kandungan Organik Tumbuhan Tinggi. ITB Press. Bandung. Susanti, A. 2009. Pengaruh Pemberian Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b Melalui Artemia dengan Dosis yang Berbeda Terhadap Pertumbuhan dan Kelangsungan Hidup Pasca Larva Udang Windu Penaeus Monodon. [Skripsi]. Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Wattimena J. R., N. C. Sugiarso., Mathilda B. W., E. Y. Sukandar., Andreanus A. S dan Anna R. S.,
1998. Farmakodinami dan Terapi Antibiotik. Gadjah Mada Universitasity Press: Yogyakarta. Widanarni., M.A. Lidaenni., dan D. Wahjuningrum. 2010. Pengaruh Pemberian Bakteri Probiotik Vibrio SKT-b dengan Dosis yang Berbeda Terhadap Kelangsungan Hidup dan Pertumbuhan Larva Udang Windu (Panaeus monodon)
Fab. Jurnal Akuakultur Indonesia. 9(1): 21 – 29. Widowati, L dan H. Mudahar. 2009. Uji Aktivitas Ekstrak Etanol 50% Umbi Keladi Tikus (Typhonium flagelliforme (Lood) Bi) Terhadap Sel Kanker Payudara MCF-7 In Vitro. Media Litbang Kesehatan. 19 (1).
