UNIVERSITAS INDONESIA

UNIVERSITAS INDONESIA

PENGEMBANGAN METODE DETEKSI NEURAMINIDASE BERDASARKAN REAKSI INHIBISI ENZIMATIK OLEH ZANAMIVIR MENGGUNAKAN ELEKTRODA BORON DOPED DIAMOND TERMODIFIKASI EMAS

DISERTASI

WULAN TRI WAHYUNI S NPM. 1206199185

PROGRAM STUDI S3 KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK, JUNI 2015

Pengembangan metode..., Wulan Tri Wahyuni, FMIPA UI, 2015.

UNIVERSITAS INDONESIA

PENGEMBANGAN METODE DETEKSI NEURAMINIDASE BERDASARKAN REAKSI INHIBISI ENZIMATIK OLEH ZANAMIVIR MENGGUNAKAN ELEKTRODA BORON DOPED DIAMOND TERMODIFIKASI EMAS

DISERTASI

Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor dalam Ilmu Kimia

WULAN TRI WAHYUNI S NPM. 1206199185

PROGRAM STUDI S3 KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS INDONESIA DEPOK, JUNI 2015



ATA


PENGANTAR

Puji dan syukur mendalam penulis panjatkan ke hadirat Allah SWT atas limpahan rahmat, karunia, kemurahan, dan pertolongan-Nya sehingga Disertasi dengan judul “Pengembangan Metode Deteksi Neuraminidase Berdasarkan Reaksi Inhibisi Enzimatik Oleh Zanamivir Menggunakan Elektroda Boron Doped Diamond Termodifikasi Emas” berhasil diselesaikan. Pada kesempatan ini penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih yang sebesar-besarnya kepada Dr. Ivandini Tribidasari Anggraningrum selaku promotor dan Dr. Endang Saepudin selaku kopromotor atas bimbingan, arahan, dan diskusi sehingga penelitian dan penyusunan disertasi ini dapat berjalan dengan baik. Terima kasih penulis sampaikan kepada Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Universitas Indonesia Dr. rer.nat. Abdul Haris dan Ketua Departemen Kimia Fakultas MIPA Universitas Indonesia Dr. Endang Saepudin atas kesempatan kepada penulis untuk menyelesaikan program Doktor pada Program Studi Ilmu Kimia FMIPA UI. Penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Dr. Asep Saepumillah selaku ketua Program Pascasarjana Ilmu Kimia dan seluruh staf pengajar program S3 Ilmu Kimia atas ilmu dan diskusi yang sangat berguna selama penulis menempuh pendidikan S3 Ilmu Kimia di Fakultas MIPA Universitas Indonesia. Penulis menyampaikan penghargaan dan terima kasih kepada Tim Penguji Prof. Usman Sumo Friend Tambunan, Dr. Jarnuzi Gunlazuardi, Dr. Herry Cahyana, Dr. Rahmat Wibowo, Prof. Yasuaki Einaga, dan Dr. Cuk Imawan atas masukan dan saran yang sangat bermanfaat untuk kesempurnaan disertasi ini. Ungkapan terima kasih yang sebesar-besarnya juga penulis sampaikan kepada Prof. Yasuaki Einaga atas kesempatan yang berharga bagi penulis untuk menjalankan program sandwich-like dan bergabung dalam group riset yang dipimpinnya di Keio University Jepang, serta atas diskusi yang sangat bermanfaat bagi penulis dalam menyelesaikan penelitian serta menyusun naskah publikasi internasional. Pada kesempatan ini penulis juga menyampaikan terima kasih kepada Direktorat Pendidikan Tinggi atas beasiswa sandwich-like tahun anggaran 2014 yang diberikan kepada penulis. Penulis menyampaikan ungkapan terima kasih kepada Prof. Tun Tedja Irawadi selaku Ketua Departemen Kimia FMIPA IPB periode 2009-2013 dan Prof. Dr.


Purwantiningsih selaku Ketua Departemen Kimia FMIPA IPB periode 2013-2018 atas kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengembangkan diri dan menuntut ilmu pada jenjang S3 di Universitas Indonesia. Ungkapan terima kasih yang tulus penulis sampaikan kepada Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman selaku kepala divisi Kimia Analitik Departemen Kimia FMIPA IPB atas begitu banyak nasehat, dorongan, dukungan, dan kesempatan yang diberikan kepada penulis untuk mengembangkan diri sejak pertama kali penulis menjadi staf pengajar di Divisi Kimia Analitik hingga saat ini. Pada kesempatan ini penulis juga menyampaikan ucapan terima kasih kepada keluarga besar Departemen Kimia FMIPA IPB, khususnya keluarga besar divisi Kimia Analitik atas dukungan, bantuan, dan kerjasama yang diberikan selama penulis menempuh pendidikan. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada keluarga besar Pusat Studi Biofarmaka LPPM IPB atas dukungan yang diberikan. Penulis mengucapkan terima kasih dan hormat yang sedalam-dalamnya kepada orang tua terkasih Bapak B. Saepudin, ibu Titi Rohayati, dan Ibu Hartini atas doa dan dukungan tiada henti yang diberikan kepada penulis. Terima kasih penulis sampaikan kepada Budi Riza Putra, M.Si serta kepada kakak dan adik penulis atas doa dan dukungan yang diberikan. Tidak lupa penulis menyampaikan ungkapan terima kasih yang sebesarbesarnya kepada seluruh anggota Bioelectrochemistry Research Group dan Einaga Research Group atas kebersamaan dan diskusi hangat sehingga penulis dapat menyelesaikan penelitian dan penyusunan disertasi ini. Ucapan terima kasih juga disampaikan kepada teman seperjuangan di program S3 Ilmu Kimia angkatan 2012 atas pertemanan dan silaturahmi yang berkesan. Kepada semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu, disampaikan ucapan terima kasih mendalam atas dukungan dan bantuan yang diberikan. Dengan memohon keridhoan Allah SWT, semoga karya ilmiah ini bermanfaat.

Depok, 4 Juni 2015 Penulis



ABSTRAK

Nama Program Studi Judul

: Wulan Tri Wahyuni S : Ilmu Kimia : Pengembangan Metode Deteksi Neuraminidase Berdasarkan Reaksi Inhibisi Enzimatik Oleh Zanamivir Menggunakan Elektroda Boron Doped Diamond Termodifikasi Emas

Neuraminidase (NA) merupakan enzim yang dapat dimiliki oleh virus, mikroba, dan mamalia, termasuk di antaranya mikroba dan virus patogen. Deteksi NA merupakan aspek penting dalam upaya mengawasi penyebaran penyakit infeksi yang disebabkan oleh mikroba dan virus patogen tersebut. Di samping itu, analisis kuantitatif NA penting dalam penentuan komposisi vaksin. Pada penelitian ini dikembangkan metode deteksi NA dengan teknik elektrokimia berdasarkan inhibisi NA oleh zanamivir. Deteksi NA dilakukan berdasarkan perubahan respon elektrokimia zanamivir dalam buffer fosfat pH 5,5 saat terdapat NA dan tidak. Elektroda Boron doped diamond termodifikasi emas, yaitu Au-BDD dan AuNPs-BDD digunakan sebagai elektroda kerja dan pengukuran dilakukan menggunakan teknik voltametri siklik. Deteksi NA dikembangkan juga pada sistem magnetic beads dan sistem strip test. Pengembangan sistem magnetic beads dimaksudkan sebagai upaya untuk meningkatkan sensitivitas deteksi, sementara sistem strip test merupakan pengembangan awal untuk membuat piranti praktis pengukuran NA. Pengaruh mucin terhadap performa deteksi NA diamati dengan menggunakan mucin submaxillary 0,33 mg/mL. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa terjadi korelasi linear antara konsentrasi zanamivir dengan intensitas puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda BDD termodifikasi emas. Linearitas pengukuran zanamivir berdasarkan puncak arus reduksi emas pada elektroda Au-BDD diperoleh pada kisaran 5 x 10-6 - 1 x 10-4 M (R2 = 0,990) dengan limit deteksi (LOD) 1,49 x 10-6 M, sementara pada elektroda AuNPs-BDD diperoleh pada kisaran konsentrasi 1 x 10-6 - 1 x 10-5 M (R2 = 0,998) dengan LOD 2,29 x 10-6 M. Keberadaan NA menyebabkan konsentrasi zanamivir bebas dalam larutan berkurang dan menurunkan zanamivir yang teradsorpsi pada permukaan selektroda. Akibatnya puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda Au-BDD dan AuNPsBDD meningkat. Kalibrasi linear konsentrasi NA dengan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au-BDD diperoleh pada kisaran 0 – 15 mU (R2 = 0,996) dengan LOD 0,25 mU dan %RSD 1,18 %, sementara kisaran linear 0 – 12 mU (R2 = 0,997), LOD 0,12 mU, dan %RSD 2,49% diperoleh saat pengukuran dilakukan dengan elektroda AuNPs-BDD. Keberadaan mucin tidak memberikan pengaruh yang berarti terhadap deteksi NA dengan metode yang dikembangkan. Sistem magnetic beads belum berhasil meningkatkan sensitivitas deteksi NA. Nilai LOD pengukuran yang diperoleh ialah sebesar 0,64 mU pada kisaran linear 0 – 8 mU. Deteksi NA pada sistem strip test yang dikombinasikan dengan pengukuran elektrokimia telah berhasil dikembangkan


pada kisaran linear 0 - 15 mU dengan nilai LOD sebesar 0,26 mU. Deteksi NA dalam matriks mucin dapat dilakukan pada sistem strip test sekalipun keberadaan mucin dilaporkan dapat menurunkan presisi pengukuran.

Kata Kunci

: Neuraminidase, zanamivir, voltametri, BDD termodifikasi emas, magnetic beads, strip test, mucin


ABSTRACT

Name Study Program Judul

: Wulan Tri Wahyuni S : Chemistry : Development of Neuraminidase Detection Method Based on Its Enzymatic Inhibition by Zanamivir Using Gold Modified Boron Doped Diamond Electrodes

Neuraminidase (NA) is a hydrolase enzyme which is commonly found in viruses, microbes, and mammals, including pathogenic microbes and viruses. Detection of NA is very important for monitoring the spread of such pathogen microbes and viruses. Meanwhile, the quantification of NA is also crucial for vaccine composition investigation. Development of an electrochemical method for NA detection using gold modified boron doped diamond (Au-BDD and AuNPs-BDD) electrodes were conducted in this study. The detection method was developed based on the difference of electrochemical responses of zanamivir in the presence and the absence of NA in phosphate buffer solution pH 5,5. Measurements were performed using cyclic voltammetry technique. Detection of NA also developed on magnetic beads in order to improve the sensitivity of measurement. On the other hand, to build up a practical devices for NA detection, preliminary development of strip test was conducted by using Au-BDD as working electrode. The performance of detection method was evaluated in the presence of 0,33 mg/mL bovine submaxillary gland mucin. A linear calibration curve of zanamivir was observed in the concentration range of 5 x 10 -6 - 1 x 10-4 M (R2 = 0,990) with limit of detection (LOD) of 1,49 x 10-6 M for Au-BDD electrode. Linear calibration curve in the concentration range of 1 x 10 -6 - 1 x 10-5 M (R2 = 0,998) with LOD 2,29 x 10-6 M was observed on AuNPs-BDD. The presence of NA caused the concentration of free zanamivir in the solution decreases and less zanamivir can be adsorbed at the electrode. As the result, the oxidation and the reduction peak currents of gold were increase. Linear calibration curve of NA was obtained in the concentration range of 0 – 15 mU (R2 = 0,996), a LOD of 0,25 mU and %RSD of 1,18 % was achieved on Au-BDD electrode. Furthermore, linear calibration curve of NA on AuNPs-BDD electrode was in the concentration range of 0 – 12 mU (R2 = 0,997) with LOD of 0,12 mU and %RSD of 2,49%. A comparable performance of NA detection was observed in the presence of mucin. Sensitivity of NA detection was decrease in magnetic beads system, the LOD of 0,64 mU was achieved in linear range of 0 – 8 mU. Detection of NA on strip test system was successfully developed in linear range of 0 - 15 mU with LOD of 0,26 mU. NA detection in the presence of mucin was demonstrated on strip test system, the result suggested that the precision was decreased. Nevertheless the method is still promising for pharmaceutical or medical application.


Key Words

: Neuraminidase, zanamivir, voltammetry, gold modified BDD, magnetic beads, strip test, mucin


DAFTAR PUBLIKASI

1. Wulan Tri Wahyuni, Tribidasari A. Ivandini, Prastika K. Jiwanti, Endang Saepudin, Jarnuzi Gunlazuardi, and Yasuaki Einaga. 2015. Electrochemical Detection of Neuraminidase based on Zanamivir Inhibition using GoldModified Boron-Doped Diamond Electrode. Electrochemistry, 83(5): 357– 362. ISSN: 1344-3542. 2. Wulan Tri Wahyuni, Tribidasari A. Ivandini, Endang Saepudin. Electrochhemical Detection of Zanamivir using Gold and Gol-Modified Boron Doped Diamond Electrode. International Conference “Current Breakthrough in Pharmacy Materials and Analysis”. Proceeding, ISBN: 978602-70429-9-5, pp 42-49, January 10th , 2015.

DRAFT ARTIKEL 1. Wulan Tri Wahyuni, Tribidasari A. Ivandini, Endang Saepudin, and Yasuaki Einaga. Gold Nanoparticles-Boron Doped Diamond Electrode for Electrochemical Detection of Neuraminidase. manuscript.

KEIKUTSERTAAN DALAM KONFERENSI INTERNASIONAL 1. Joint Indonesia-UK Conference on Organic and Natural Product Chemistry. Gadjah Mada University, Yogyakarta, 10-11th December 2014. As oral presenter. Title: Development of Voltammetric Detection of Zanamivir at Gold-Modified Boron-Doped Diamond Electrode and Its Application for Neuraminidase Detection. 2. International Conference “Current Breakthrough in Pharmacy Materials and Analysis”. Muhammadiyah University, Solo, January 10th , 2015. Title: Electrochhemical Detection of Zanamivir using Gold and Gol-Modified Boron Doped Diamond Electrode.


DAFTAR ISI

HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ………………………...

i

HALAMAN PENGESAHAN ……………………………………………..

ii

KATA PENGANTAR ……………………………………………………

iii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN DISERTASI …………

v

ABSTRAK …………………………………………………………………

vi

ABSTRACT ………………………………………………………………..

viii

DAFTAR PUBLIKASI ……………………………………………………

x

DAFTAR ISI………………………………………………………………

xi

DAFTAR GAMBAR…………………………………………………….....

xvi

DAFTAR TABEL………………………………………………….............

xxi

DAFTAR LAMPIRAN………………………………………………….....

xxii

BAB I PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang………………………………………………………….

1

1.2 Rumusan Masalah………………………………………………………

3

1.3 Tujuan Penelitian……………………………………………………….

4

1.4 Hipotesis………………………………………………………………..

5

1.5 Ruang Lingkup…………………………………………………………

5

1.6 Manfaat Penelitian……………………………………………………...

6

BAB II TINJAUAN PUSTAKA 2.1 Neuraminidase…………………………………………………………..

7

2.2 Inhibitor Neuraminidase ………………………………………………..

9

2.3 Analisis Oseltamivir ………………..…………………………………..

15

2.4 Analisis Zanamivir ..…………………………………………………....

16

2.5 Deteksi Neuraminidase ………………………………………………...

17

2.6 Elektrokimia : Voltametri ………………………………………………

17

2.7 Boron Doped Diamond (BDD) dan Modified-BDD ……………………

24


2.8 Teknik Spektroskopi untuk Karakterisasi BDD ………………………..

28

2.9 Magnetic Beads …………………………………………………………

32

2.10 Lateral Flow Analysis : Strip Test …………………………………….

32

2.11 Transmission Electron Microscopy (TEM) ………………………......

33

BAB III METODE PENELITIAN 3.1 Bahan dan Peralatan 3.1.1 Bahan ……………………………………………………………..

35

3.1.2 Peralatan dan Instrumen ………………………………………….

35

3.2 Prosedur Kerja 3.2.1 Studi Elektrokimia Zanamivir dan Oseltamivir pada Elektroda Au…………………………………………………………….........

36

3.2.2 Pembuatan Elektroda BDD 0.1%, Au-BDD, AuNPs-BDD ………

37

3.2.2.1 Preparasi Silicon Wafer ……………………………………...

37

3.2.2.2 Fabrikasi Elektroda Boron Doped Diamond 0,1% ……….

37

3.2.2.3 Karakterisasi Elektroda BDD 0,1 % ……………………...

38

3.2.2.4 Pembuatan Gold Modified Boron Doped Diamond Electrode dengan Teknik Elektrodeposisi ….….................

38

3.2.2.5 Pembuatan Gold Nanoparticle Modified Boron Doped Diamond Electrode dengan Teknik Chemical Deposition..

39

3.2.3 Pengukuran Elektrokimia Zanamivir……….…………………….

39

3.2.3.1 Pemilihan Kecepatan Payar Pengukuran Elektrokimia Zanamivir …………………………………………………

39

3.2.3.2 Penentuan Potential Windows Pengukuran Elektrokimia Zanamivir …………………………………………………

39

3.2.3.3 Penentuan Koefisien Difusi ……………………...............

39

3.2.3.4 Pengukuran Zanamivir pada Berbagai Konsentrasi ...........

40

3.2.2.5 Presisi Pengukuran Zanamivir …………………................

40

3.2.4 Pengukuran Elektrokimia Neuraminidase ………………………..

40

3.2.4.1 Optimasi pH ………….……………………………………...

40

3.2.4.2 Optimasi Waktu Reaksi Zanamivir dengan Neuraminidase

40

3.2.4.3 Pengukuran Neuraminidase ………..…………………......

40

3.2.4.4 Presisi Pengukuran Neuraminidase ..…………………......

41


3.2.4.5 Pengaruh Matriks Mucin pada Pengukuran Neuraminidase

41

3.2.5 Immobilisasi Zanamivir pada Magnetic Beads………………........

41

3.2.5.1 Modifikasi Zanamivir dengan Biotin ……………………...

41

3.2.5.2 Aktivasi Magnetic Beads …………………………………

41

3.2.5.3 Modifikasi Magnetic Beads dengan Zanamivir ……….....

42

3.2.5.4 Optimasi Jumlah Magnetic Beads ..…………………........

42

3.2.6 Pengukuran Elektrokimia NA menggunakan Magnetic Beads termodifikasi Zanamivir...................................................................

42

3.2.7 Pengembangan Strip Test untuk Deteksi Neuraminidase …….......

43

3.2.7.1 Rancangan Strip Test ……………………............................

43

3.2.7.2 Immobilisasi Zanamivir …………………………………..

43

3.2.7.3 Deteksi Neuraminidase ………………………..……….....

44

3.2.7.4 Deteksi Neuraminidase pada Matriks Mucin ………..........

44

BAB IV PEMBAHASAN 4.1 Studi Perilaku Elektrokimia Zanamivir dan Oseltamivir pada Elektroda Emas …………………………………………………………………….

45

4.1.1 Studi Perilaku Elektrokimia Zanamivir pada Elektroda Emas .......

45

4.1.2 Studi Perilaku Elektrokimia Oseltamivir pada Elektroda Emas .....

48

4.2 Fabrikasi Elektroda BDD 0,1 %, Au-BDD, dan AuNPs-BDD …………

49

4.2.1 Fabrikasi BDD 0,1 % dengan MPACVD .......................................

49

4.2.2 Karakterisasi BDD 0,1 % dengan Spektroskopi Raman .................

50

4.2.3 Karakterisasi BDD 0,1 % dengan SEM dan XPS ...........................

51

4.2.4 Optimasi Kondisi Pembuatan BDD termodifikasi Emas dengan Metode Elektrodeposisi: Optimasi Potensial dan Waktu Deposisi..

54

4.2.5 Karakterisasi Au-BDD dengan XPS dan SEM dan Evaluasi Stabilitas Elektroda .........................................................................

56

4.2.6 Pembuatan BDD Termodifikasi Emas dengan Metode Chemical Deposition .......................................................................................

58

4.2.7 Karakterisasi AuNPs-BDD dengan XPS dan SEM dan Evaluasi Stabilitas Elektroda..........................................................................

61

4.3 Pengukuran Elektrokimia Zanamivir pada Elektroda Emas, Au-BDD, dan AuNPs-BDD ………………………………………………………..


65

4.3.1 Penentuan Kecepatan Payar Pengukuran Zanamivir ......................

65

4.3.2 Potential Window Pengukuran Zanamivir ....................................

67

4.3.3 Linearitas dan Presisi Pengukuran Zanamivir ................................

67

4.4 Pengukuran Neuraminidase pada Elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD

71

4.4.1 Pengoptimuman pH dan Waktu Reaksi Enzim Neuraminidase ......

73

4.4.2 Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase pada Elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD ..............................................................

74

4.4.3 Stabilitas Elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD pada Pengukuran Neuraminidase ................................................................................

76

4.4.4 Pengaruh Kecepatan Payar pada Pengukuran Enzim Neuraminidase ................................................................................

77

4.4.5 Pengaruh Matriks Mucin pada Pengukuran Enzim Neuraminidase dengan Elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD ................................

78

4.5 Pengukuran Neuraminidase dengan Zanamivir yang Diimmobilisasi pada Magnetic Beads Menggunakan Elektroda Au-BDD ……………...

80

4.5.1 Immobilisasi Zanamivir pada Sistem Magnetic Beads .................

80

4.5.2 Optimasi Konsentrasi Magnetic Beads pada Immobilisasi Zanamivir .........................................................................................

82

4.5.3 Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase dengan Sistem Magnetic Beads ................................................................................

83

4.5.4 Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase dalam Matriks Mucin dengan Sistem Magnetic Beads ............................................

87

4.6 Pengembangan Strip Test untuk Deteksi Neuraminidase ………………

88

4.6.1 Rancangan Strip Test ......................................................................

88

4.6.2 Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase pada Strip Test dengan Elektroda Au-BDD ........................................................

89

4.6.3 Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase dalam Matriks Mucin pada Strip Test dengan Elektroda Au-BDD ......................

90

RINGKASAN HASIL ……………………………………………………..

93

KESIMPULAN DAN SARAN…………………………………………….

94

DAFTAR PUSTAKA……………………………………………………..

96

LAMPIRAN ………………………………………………………………..

107



DAFTAR GAMBAR Gambar 1.1

Konsep pemikiran yang melandasi penelitian ……………

5

Gambar 2.1

Struktur N-acetyl neuraminic acid ………………………

7

Gambar 2.2

Ilustrasi mekanisme kerja NA dalam melepas anakan virus yang siap menginveksi sel inang …………………..

7

Gambar 2.3

Neuraminidase ……………………….............................

8

Gambar 2.4

Ilustrasi mekanisme kerja inhibitor neuraminidase ………

Gambar 2.5

Struktur

obat

influenza

dari

golongan

10

inhibitor

neuraminidase (a) dan bentuk metabolit aktif obat influenza dari golongan inhibitor neuraminidase (b) …….. Gambar 2.6

10

Interaksi oseltamivir dengan neuraminidase tanpa mutasi His274 (a) dan neuraminidase yang mengalami mutasi His274Gly (b) …………………………………………….

12

Gambar 2.7

Interaksi sisi aktif enzim neuraminidase dengan zanamivir

13

Gambar 2.8

Profil perubahan potensial yang diaplikasikan dari V1 ke V2 …………………………………………………………

18

Gambar 2.9

Profil arus versus waktu pada Potential step voltammetry

19

Gambar 2.10

Profil konsentrasi versus jarak menunjukkan gradien konsentrasi di sekitar elektroda ………….........................

Gambar 2.11

Profil tegangan yang diaplikasikan pada linear sweep voltammetry ………………………………………………

Gambar 2.12

21

Profil potensil yang diaplikasikan pada teknik cyclic voltammetry …………………………………………...............

Gambar 2.15

20

Profil hubungan potensial vs arus pada berbagai kecepatan payar untuk sistem quasireversible dan irreversible ……..

Gambar 2.14

20

Profil hubungan potensial vs arus pada berbagai kecepatan payar untuk sistem reversible …………………………….

Gambar 2.13

19

22

Hubungan potensial vs arus (a), hubungan potensial vs arus pada berbagai kecepatan payar untuk sistem reversible (b), sistem quasireversible dan irreversible (c)………………………………………………………….

Gambar 2.16

24

Voltamogram siklik elektroda diamond dalam H2SO4 0.1 M ………………………………………………………….


25

Gambar 2.17

Skema tipe elektroda diamond yang digunakan: a). dopeddiamond thin film electrode, b). doped-diamond thin film electrode dengan interlayer antara substrat dan lapisan diamond, c). doped diamond particle diimmobilisasi pada passivated

surface,

d).

doped

diamond

particle

diimmobilisasi pada insulating film .................................... Gambar 2.18

26

Ilustrasi Rayleigh, Stoke, dan anti-Stoke scattering. Stoke, dan anti-Stoke merupakan inelastic scattering yang digunakan pada spektroskopi Raman ……………………...

29

Gambar 2.19

Komponen utama instrument SEM ……………………….

30

Gambar 2.20

Ilustrasi proses analisis sampel pada XPS ………………….

31

Gambar 2.21

Komponen utama instrument TEM ………………………….

34

Gambar 3.1

Rancangan sel elektrokimia …………………………………..

36

Gambar 3.2

Skema sel elektrokimia pengukuran dengan magnetic beads ………………………………………………………….....

42

Gambar 3.3

Rancangan strip test pengukuran neuraminidase ………...

43

Gambar 4.1

Profil CV PBS pH 7 dan zanamivir 5 x 10-4 M dalam PBS pH 7……………………………………………………….

45

Gambar 4.2

Struktur zanamivir dengan gugus guanidine …………….

47

Gambar 4.3

Ilustrasi mekanisme (a) dan interaksi molekul (b) pada adsorpsi zanamivir di permukaan elektroda Au yang

47

mengganggu pembentukan Au2O3 ……………………………………. Gambar 4.4

Profil CV oseltamivir fosfat 1x10-4 M dalam PBS pH 7…..

Gambar 4.5

Silica wafer (a) dan BDD 0,1 % pada permukaan silica

48

wafer (b) …………………………………………………..

49

Gambar 4.6

Spektrum Raman H-BDD 0,1% …………………………..

51

Gambar 4.7

Topografi permukaan H-BDD (a) dan O-BDD (b) diperoleh dengan SEM pada perbesaran 2500 kali ……….

52

Gambar 4.8

Spektrum XPS H-BDD dan O-BDD …………………….

53

Gambar 4.9

Profil CV zanamivir 1,5 x 10-4 M pada Au-BDD dengan potensial deposisi Au bervariasi dan waktu tetap (a), Plot E terhadap I pada t konstan (b) …………………………

Gambar 4.10

Voltamogram siklik zanamivir 1,5 x 10

-4

M diukur


55

menggunakan elektroda Au-BDD pada waktu deposisi Au bervariasi (a), Plot t terhadap I pada V kostan (b) ………..

56

Gambar 4.11

Spektra XPS (a) dan foto SEM (b) elektroda Au-BDD …..

57

Gambar 4.12

Stabilitas elektroda Au-BDD pada pengukuran …………..

58

Gambar 4.13

Panjang gelombang absorbansi maksimum koloid AuNPs

59

Gambar 4.14

Gambar nanopartikel emas (AuNPs) dengan TEM ………

60

Gambar 4.15

Spektrum XPS H-BDD (a), O-BDD (b), N-BDD (c), AuNPs-BDD (d), Au-BDD (e). Inset spektrum XPS Au ...

Gambar 4.16

Topografi permukaan O-BDD dan N-O-BDD diperoleh dengan SEM pada perbesaran 2500 kali ………………….

Gambar 4.17

Gambar 4.19 Gambar 4.20

63

Analisis unsur Au, C, N, dan O pada elektroda AuNPsBDD diperoleh dengan SEM-EDX ……………………….

64

Stabilitas elektroda AuNPs-BDD pada pengukuran ……...

64

-4

Profil voltametri siklik zanamivir 1,5 x 10 M dalam PBS pH 7 pada berbagai kecepatan payar ……………………..

Gambar 4.21

62

Topografi permukaan AuNPs-BDD diperoleh dengan SEM ………………………………………………………

Gambar 4.18

61

65

Kurva hubungan akar kecepatan payar dengan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), dan AuNPs-BDD (c) …...…………………………………

Gambar 4.22

Profil voltametri siklik zanamivir 1,5 x 10 M dalam PBS

pH 7 pada berbagai potential window ……………………. Gambar 4.23

66

-4

Profil

voltametri

siklik

zanamivir

pada

67

berbagai

konsentrasi dalam PBS diukur dengan elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), dan AuNPs-BDD (c) ………………….. Gambar 4.24

Profil

logaritmik

dan

kalibrasi

linear

69

konsentrasi

zanamivir vs. puncak arus reduksi Au pada elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), dan AuNPs-BDD (c) …. ………….. Gambar 4.25

Profil voltametri siklik zanamivir 1 x 10 -4 M dengan adanya NA (garis merah) dan tidak ada NA (garis hitam)..

Gambar 4.26

72

Ilustrasi mekanisme meningkatnya arus reduksi Au akibat reaksi inhibisi NA – zanamivir …………………………...

Gambar 4.27

70

Penentuan pH (a) dan waktu inkubasi (b) optimum reaksi


72

enzim NA 10 mU dengan zanamivir 1 x 10-4 M …………. Gambar 4.28

73

Profil voltametri siklik zanamivir dengan keberadaan NA berbagai

konsentrasi

dan

kurva

kalibrasi

linear

pengukuran NA berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b) ………………………………………………………… Gambar 4.29

Stabilitas elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b) pada pengukuran NA ……………………………………..

Gambar 4.30

75

76

Kurva hubungan akar kecepatan payar dengan puncak arus reduksi Au saat ada NA pada elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b) ………...……………………………

Gambar 4.31

Profil

voltametri

siklik

pengukuran

NA

77

berbagai

konsentrasi dalam matriks mucin dan kurva kalibrasi linear pengukuran NA dalam matriks mucin berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda AuBDD (a) dan AuNPs-BDD (b) …………………………… Gambar 4.32

Ilustrasi reaksi konjugasi zanamivir dengan biotin dan immobilisasi pada magnetic beads ……………………….

Gambar 4.33

79

80

Spektrum FTIR zanamivir, biotin, magnetic beads, dan zanamivir-biotin-magnetic beads ……………………

82

Gambar 4.34

Voltamogram siklik sistem MB-zanamivir dan MB-biotin

83

Gambar 4.35

Optimasi jumlah magnetic beads pada immobilisasi zanamivir …………………………………………………

Gambar 4.36

Profil XPS elektroda Au-BDD yang diperoleh dengan teknik voltametri siklik …………………………………...

Gambar 4.37

83

Profil

voltametri

siklik

pengukuran

NA

84

berbagai

konsentrasi pada sistem magnetic beads dengan elektroda Au-BDD (a), kurva kalibrasi pengukuran NA pada sistem magnetic beads dengan elektroda Au-BDD (b) ……… Gambar 4.38

Ilustrasi mekanisme berkurangnya arus reduksi Au akibat keberadaan NA pada system magnetic beads …………….

Gambar 4.39

85

Kurva kalibrasi pengukuran NA berdasarkan puncak arus reduksi Au pada sistem magnetic beads dengan elektroda


86

Au-BDD ………………………………………………….. Gambar 4.40

87

Profil voltametri siklik pengukuran NA pada strip test (a), Kurva kalibrasi linear pengukuran NA pada strip test berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda Au-BDD (b) ……………………………………

Gambar 4.41

90

Profil voltametri siklik pengukuran NA dalam matriks mucin pada strip test (a), Kurva kalibrasi linear pengukuran NA dalam matriks mucin pada strip test dengan elektroda Au-BDD (b) ……………………………


91

DAFTAR TABEL Tabel 2.1

Performa elektroda kerja pada penentuan oseltamivir ……

16

Tabel 2.2

Karakteristik BDD pada berbagai nisbah B/C ……………

26

Tabel 3.1

Kondisi operasi MPACVD pada pembuatan BDD 0,1 % ..

37

Tabel 4.1

% atom pada O-BDD dan Au-BDD berdasarkan spectrum XPS ………………………...............................................

Tabel 4.2

% atom berdasarkan spectrum XPS untuk BDD dan modified BDD …………………………………………….

Tabel 4.3

75

Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dengan elektroda BDD termodifikasi emas ……………………….

Tabel 4.6

71

Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dengan elektroda BDD termodifikasi emas ……………………….

Tabel 4.5

63

Ringkasan pengukuran zanamivir dengan elektroda emas dan BDD termodifikasi emas ……………………………..

Tabel 4.4

57

79

Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dan NA dalam Matriks Mucin pada Sistem Magnetic Beads dengan Elektroda Au-BDD ……………………………….

Tabel 4.7

88

Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dan NA dalam Matriks Mucin pada Strip Test dengan Elektroda

Tabel 4.8

Au-BDD …………………………………………………..

92

Ringkasan hasil penelitian ………………………………..

93


DAFTAR LAMPIRAN Lampiran 1

Diagram alir dan tahapan penelitian ……………………...

Lampiran 2

Gambar Instrument MAPCVD (a), SEM (b), Raman spectrometry (c), XPS (d), TEM (e) ……………………...

Lampiran 3

107

108

Profil voltametri siklik oseltamivir 1 x 10 -4 M dalam buffer sitrat pH 7…………………………………………..

109

Lampiran 4

Spektrum Raman H-BDD pada beberapa lokasi …………

110

Lampiran 5

Penentuan koefisien difusi ………………………………..

111

Lampiran 6

Contoh perhitungan penentuan nilai LOD pengukuran zanamivir ………………………….……………………

Lampiran 7

113

Pengukuran NA secara tidak langsung berdasarkan interaksi NA dengan zanamivir menggunakan elektroda bare Au. Voltammogram siklik pengukuran NA (a), kurva kalibrasi pengukuran NA …………………………

114

Lampiran 8

Spektra FTIR larutan zanamivir-biotin dalam buffer fosfat

115

Lampiran 9

Pengukuran NA tanpa zanamivir pada elektroda Au (a), dan Au-BDD (b), kurva hubungan konsentrasi NA dengan puncak arus reduksi emas pada elektroda Au-BDD……… 116

Lampiran 10

Daftar Riwayat Hidup Penulis…………………………….

118

Lampiran 11

Publikasi Ilmiah …………………………………………..

122


BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Neuraminidase (NA) merupakan enzim yang dapat dimiliki oleh virus, mikroba, dan mamalia, termasuk di antaranya mikroba dan virus patogen. Mikroba dan virus patogen yang dilaporkan mengandung NA antara lain Vibrio cholera (Vimr et al., 1988), Streptococcus pneumonia (Berry et al., 1988), Corynebacterium diptheriae (Moriyama & Barksdale, 1967), Erysipelothrix rhusiopathiae (Wang et al., 2005), Clostridium perfringens (Chien et al., 1997), Ornithobacterium rhinotracheale (Kastelic et al., 2013), avian influenza virus dan Newcastle disease virus (Turgeon et al., 2011). Enzim ini berperan dalam proses penyebaran mikroba dan virus patogen dengan cara mengkatalisis pemutusan ikatan glikosidik pada ujung sialic acid atau neuraminic acid sehingga membantu pelepasan mikroba atau virus baru dari dalam sel inang dan memfasilitasi penyebarannya (Samson et al., 2013). Deteksi NA telah dikembangkan untuk mengawasi penyebaran penyakit infeksi yang disebabkan oleh mikroba dan virus patogen (Hurt et al., 2004); (Varillas et al., 2011); (Turgeon et al., 2011); (Yang et al., 2012); (Zhang et al., 2012); (Li et al., 2013). Teknik kuantifikasi NA juga telah dikembangkan dalam upaya menentukan komposisi vaksin influenza yang digunakan untuk mencegah penyebaran virus influenza (Gerentes et al., 1998); (Williams et al., 2012). Di samping itu, deteksi NA telah dikembangkan juga sebagai salah satu teknik alternatif untuk deteksi virus influenza. Teknik deteksi NA yang telah dikembangkan antara lain berbasis reaksi enzimatis antara NA dengan substrat 4-MU-NANA atau derivatnya dan produk reaksi yang memiliki sifat fluoresens dideteksi pada panjang gelombang yang sesuai (Yang et al., 2012; Zhang et al., 2012). Gerentes et al., (1998) mengembangkan teknik ELISA untuk mendeteksi NA. Teknik enzyme link lectin assay dikembangkan oleh Westgeest et al. (2015) untuk mendeteksi aktivitas pemutusan sialidase oleh NA. Kuantifikasi NA juga dilakukan secara simultan dengan deteksi hemagglutinin menggunakan LC-MS-MS (Williams et al., 2012),


sementara Li et al., (2013) dan Takayama et al., (2013) mengembangkan teknik RT-PCR untuk deteksi NA berdasarkan informasi genetiknya. Elektrokimia meupakan green analysis technique karena menggunakan jumlah dan jenis reagen kimia yang sedikit, waktu analisis yang singkat, serta instrument yang sederhana. Boron doped diamond (BDD) merupakan material semikonduktor yang banyak digunakan sebagai elektroda kerja pada analisis elektrokimia. BDD dilaporkan memiliki arus latar belakang yang kecil, jendela potensial yang lebar pada larutan berair, dan memiliki stabilitas kimia dan fisika yang tinggi (Ivandini et al., 2005). BDD dilaporkan memiliki biokompatibilitas yang tinggi karena tersusun atas karbon (Ivandini et al., 2012). Elektroda BDD sering dimodifikasi dengan logam seperti platina (Ivandini, et al., 2005b; Rismetov et al., 2014), nikel (Ivandini et al., 2004; (Zeng et al., 2012), tembaga (Ivandini et al., 2004; (Chiku et al., 2010), dan emas (Yamada et al., 2008; Ivandini et al., 2010). Metal modified BDD dilaporkan memberikan arus latar belakang yang rendah, derau (noises) yang kecil, serta limit deteksi yang rendah (Ivandini et al., 2010; Toghill & Compton, 2010). Deteksi NA dengan teknik voltametri sejauh ini belum dilaporkan karena NA tidak tergolong ke dalam enzim redoks sehingga tidak aktif secara elektrokimia. Kerja NA dalam penyebaran virus influenza dari sel inang dihambat dengan menggunakan inhibitor neuraminidase (NAI). Oseltamivir, zanamivir, peramivir, dan laninamivir merupakan senyawa yang tergolong ke dalam NAI. Oseltamivir dan zanamivir ialah NAI yang telah diizinkan oleh WHO dan digunakan di beberapa negara sebagai obat influenza dengan nama dagang tamiflu dan relenza. Oseltamivir maupun zanamivir berinteraksi dengan sisi aktif NA melalui interaksi elektrostatik dan ikatan hidrogen (Mihajlovic & Mitrasinovic, 2008; Ramachandran et al., 2012). Kendati saat ini telah dilaporkan bahwa NA mengalami mutasi pada sisi aktifnya dan terjadi perubahan interaksi antara NAI dengan sisi aktif NA, namun interaksi NA-NAI masih dapat diamati (Mihajlovic & Mitrasinovic, 2008). Saat ini senyawa baru sebagai kandidat NAI telah banyak dikembangkan antara lain dari golongan peptida siklik (Tambunan et al., 2012) Deteksi zanamivir secara elektrokimia dengan teknik square wave voltammetry telah dilakukan menggunakan hanging mercury drop electrode (HMDE). Deteksi zanamivir pada HMDE didasarkan pada kemampuannya mengkatalisis reaksi evolusi hidrogen (Skrzypek, 2010). Hal ini membuka


peluang dilakukannya deteksi NA secara tidak langsung berdasarkan reaksi inhibisi zanamivir terhadap NA. Namun demikian, penggunaan HMDE sebagai elektroda kerja masih terkendala alasan keamanan. Di samping itu pH optimum deteksi zanamivir pada HMDE yaitu pada pH 2,2 terlalu asam untuk aktivitas NA. Deteksi tidak langsung NA dengan teknik voltametri berdasarkan reaksi inhibisi NA oleh zanamivir dikembangkan pada penelitian ini. Perubahan respon elektrokimia zanamivir pada saat bebas dan saat berinteraksi dengan NA dijadikan dasar deteksi NA dengan teknik voltametri. Elektroda gold-modified boron doped diamond digunakan sebagai elektroda kerja. Dilakukan juga pengujian terhadap sampel NA yang mengandung matriks mucin untuk mengevaluasi kemungkinan diaplikasikannya teknik deteksi yang dikembangkan terhadap real sample. Sistem magnetic beads dikembangkan untuk mengevaluasi pengaruh sistem terhadap performa teknik deteksi NA, sementara sistem strip test dikembangkan sebagai pendekatan untuk menciptakan piranti deteksi NA yang praktis dan mudah digunakan.

1.2 Rumusan Masalah Perumusan masalah dari penelitian yang dilakukan meliputi: 1. Pengukuran zanamivir telah dilakukan dengan teknik voltametri menggunakan hanging mercury drop electrode. Apakah analisis kuantitatif zanamivir dapat dilakukan dengan teknik voltametri menggunakan elektroda Au dan goldmodified boron doped diamond? 2. Gugus karboksilat, amina, dan amida pada zanamivir mengalami interaksi elektrostatik dengan NA. Bagaimana pengaruh NA terhadap respon elektrokimia zanamivir, apakah perubahan respon berkorelasi dengan konsentrasi NA? 3. Magnetic beads banyak digunakan pada deteksi biomolekul termasuk protein. Apakah penggunaannya dapat memperbaiki sensitivitas dan selektivitas pengukuran NA dengan teknik voltametri? 4. Apakah teknik deteksi NA berdasarkan inhibisi NA oleh zanamivir dapat dikembangkan dalam bentuk lateral flow analysis (strip test) yang dikombinasikan dengan terknik voltametri? 5. Mucin merupakan merupakan salah satu komponen yang terdapat dalam matriks spesimen sampel yang digunakan pada pemeriksaan penyakit


pernapasan. Bagaimana pengaruh interferensi mucin pada deteksi NA dengan teknik voltametri?

1.3 Tujuan Penelitian Penelitian yang dilakukan memiliki tujuan sebagai berikut: 1. Mempelajari sifat elektrokimia zanamivir, menentukan kondisi optimum, dan melakukan pengukuran kuantitatif zanamivir dengan teknik voltametri pada elektroda Au dan goldmodified boron doped diamond. 2. Mempelajari pengaruh NA terhadap perilaku elektrokimia zanamivir, menentukan kondisi optimum pengukuran NA, dan melakukan pengukuran NA berdasarkan reaksi inhibisi NA oleh zanamivir dengan teknik voltametri. 3. Melakukan imobilisasi zanamivir pada magnetic beads, menentukan kondisi optimum pengukuran NA dengan magnetic beads, dan mempelajari efektivitas pengukuran NA dengan teknik voltametri pada sistem magnetic beads. 4. Mengembangkan teknik analisis kuantitatif NA dengan lateral flow analysis (strip test) yang dikombinasikan dengan terknik voltametri. 5. Mempelajari pengaruh interferensi mucin pada deteksi NA dengan teknik voltametri.


1.4 Hipotesis Hipotesis dari penelitian yang dilakukan ialah: 1. Analisis kuantitatif zanamivir dapat dilakukan dengan teknik voltametri mengguanakan elektroda emas dan boron doped diamond termodifikasi emas. 2. Perubahan sinyal elektrokimia zanamivir saat bebas dan saat terikat NA dapat menjadi dasar pengukuran NA secara elektrokimia.

1.5 Ruang Lingkup Penelitian mencakup studi elektrokimia zanamivir dan oseltamivir, studi pengaruh NA terhadap perilaku elektrokimia zanamivir, studi pengaruh immobilisasi zanamivir pada magnetic beads terhadap selektivitas dan sensitivitas pengukuran NA, pengembangan strip test untuk deteksi NA, serta studi interferensi mucin terhadap deteksi NA. Konsep pemikiran yang melandasi penelitian disajikan pada Gambar 1.

Gambar 1.1 Konsep pemikiran yang melandasi penelitian.


1.6 Manfaat Penelitian Hasil penelitian diharapkan dapat memberikan informasi mengenai perilaku elektrokimia zanamivir dan oseltamivir pada elektroda gold-modified boron doped diamond. Memberikan gambaran pengaruh NA terhadap perilaku elektrokimia zanamivir. Hal ini dapat menjadi dasar untuk deteksi tidak langsung NA dengan teknik voltametri berdasarkan reaksi inhibisi NA oleh zanamivir.


BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Neuraminidase Neuraminidase (NA) merupakan kelompok besar enzim hidrolase yang memutuskan ikatan glikosidik pada neuraminic acid (Neu5Ac). NA ditemukan pada beberapa jenis virus, mamalia, dan bakteri, namun yang telah banyak diidentifikasi ialah neuraminidase virus. NA virus merupakan glikoprotein dengan bagian tertentu menempel pada membran virus dan bagian kepala yang mengandung sisi katalitik. Aktivitas katalitik NA ialah memutus ujung terminal N-acetyl neuraminic acid (Gambar 2.1). NA memastikan virus tidak terjebak pada permukaan sel dengan cara memutuskan rantai polisakarida. Mekanisme kerja NA diilustrasikan pada Gambar 2.2.

Gambar 2.1 Struktur N-acetylneuraminic acid.

Gambar 2.2 Ilustrasi mekanisme kerja NA dalam melepas anakan virus yang siap menginveksi sel inang. (dimodifikasi dari sumber: Journal.prous.com)


Struktur sisi aktif NA pada beberapa organisme seperti virus influenza A dan B bersifat sangat conserved (Samson et al., 2013). NA merupakan enzim hidrolase. Enzim ini memiliki EC number EC 3.2.1.18. Angka 3 menunjukkan kelompok hidrolase sementara angka 2 menunjukkan ikatan yang dihidrolisis oleh enzim tersebut ialah ikatan glikosidik. NA pada virus influenza dibedakan menjadi N1 hingga N9. N1 merupakan NA yang terdapat pada virus influenza H5N1 dan H1N1 yang terdiri atas 469 residu asam amino. Struktur NA menurut protein data bank disajikan pada Gambar 2.3.

Gambar 2.3 Neuraminidase. (Sumber http://www.rcsb.org/pdb)

Sisi katalitik NA terdiri atas 8 residu gugus fungsi, yaitu Arg118, Asp151, Arg152, Arg224, Glu276, Arg292, Arg371, and Tyr406 dan dikelilingi oleh 11 residu kerangka Glu119, Arg156, Trp178, Ser179, Asp198, Ile222, Glu227, His274, Glu277, Asn294, dan Glu425 yang berimplikasi dengan stabilisasi sisi aktif pada struktur (Colman et al., 1993). Beberapa laporan menuliskan bahwa sisi aktif neuraminidase dapat mengalami mutasi berupa perubahan pada beberapa asam amino di sisi aktifnya.

NA dilaporkan terdapat pada beberapa bakteri patogen seperti Vibrio cholera (Vimr et al., 1988), Streptococcus pneumonia (Berry et al., 1988), Corynebacterium diptheriae (Moriyama & Barksdale, 1967), Erysipelothrix rhusiopathiae (Wang et al., 2005), Clostridium perfringens (Chien et al., 1997), dan Ornithobacterium


rhinotracheale (Kastelic et al., 2013).

NA membantu bakteri ataupun virus

menyerang dan menginfeksi inangnya. O. rhinotracheale merupakan bakteri pathogen bagi ayam dan kalkun yang dilaporkan mengandung NA yang memutuskan sialic acid dari SAα(2-3)gal pada trakea kalkun dan ayam (Kastelic et al., 2013).

E.

rhusiopathiae merupakan bakteri gram positif yang menyebabkan berbagai penyakit patogen seperti luka api pada unggas dan arthritis pada mamalia. Salah satu faktor virulensi dan patogenitas dari E. rhusiopathiae ialah NA. Selain membantu dalam proses penyerangan terhadap host, NA yang dimiliki mikroba juga berfungsi memberikan sialic acid bebas kepada bakteri untuk asimilasi sebagai karbon dan sumber energi (Cortield & Schauer 1982). NA dari C. perfringens berukuran besar 72 kDa dan memiliki kemampuan menghidrolisis glikoprotein dan glikolipida manusia dengan efisiensi yang tinggi (Chien et al., 1997).

2.2. Inhibitor Neuraminidase Inhibitor neuraminidase (NAI) berdasarkan pada struktur 2,3-dihidro analog dari N-acetyl-neuraminic acid (DANA). NA mengikat NAI lebih kuat (afinitas lebih besar) dibanding substrat alami N-acetyl neuraminic acid (Neu5Ac). Akibatnya virus anakan baru gagal dilepaskan dari reseptor sialic acid dan mengalami agregasi pada permukaan sel yang terinfeksi dan menghambat penyebaran infeksi terhadap sel lainnya. Mekanisme kerja NAI disajikan pada Gambar 2.4. Obat yang digolongkan sebagai NAI antara lain oseltamivir, zanamivir, peramivir, dan laninamivir, disajikan pada Gambar 2.5a (Samson et al., 2013). Bentuk metabolit aktif dari obat tersebut disajikan pada Gambar 2.5b (Meeprasert et al., 2012). Di antara NAI tersebut, oseltamivir dan zanamivir telah banyak digunakan di beberapa negara dan telah dijual secara komersial dengan nama dagang tamiflu dan relenza.


Gambar 2.4 Ilustrasi mekanisme kerja inhibitor neuraminidase. (dimodifikasi dari sumber: Journal.prous.com)

(a)

(b)

Gambar 2.5 Struktur obat influenza dari golongan inhibitor neuraminidase (a) dan bentuk metabolit aktif obat influenza dari golongan inhibitor neuraminidase (b). (Sumber: (Samson et al., 2013; Meeprasert et al., 2012).

Oseltamivir secara komersial beredar sebagai oseltamivir fosfat. Oseltamivir mengandung gugus fungsi etil ester yang memerlukan hidrolisis ester untuk dikonversi menjadi bentuk aktifnya, oseltamivir karboksilat. Obat ini diberikan secara oral. Oseltamivir dibuat dari modifikasi kerangka analog, termasuk diadisikannya


rantai samping lipofilik yang ruah yang memungkinkan obat untuk dapat diberikan secara oral. Senyawa ini merupakan NAI yang bersifat kompetitif. Oseltamivir digunakan untuk pencegahan dan pengobatan influenza yang gejalanya baru terjadi kurang dari dua hari. Diberikan secara oral selama 5 hari, dua kali sehari dengan dosis yang disesuaikan dengan berat badan pasien. Oseltamivir fosfat diserap secara cepat dari saluran pencernaan dan dikonversi oleh esterase hati menjadi menjadi metabolit aktifnya, oseltamivir karboksilat (Samson et al., 2013). Sisi aktif neuraminidase berinteraksi dengan oseltamivir melalui interaksi elektrostatik (Gambar 2.6a). Neuraminidase dilaporkan mengalami resistensi terhadap oseltamivir karena terjadinya mutasi pada sisi aktifnya, tepatnya pada His274. Posisi His274 dapat digantikan oleh asam amino dengan rantai samping yang kecil seperti Gly, Ser, Asn, dan Gln, maupun asam amino dengan rantai samping yang besar seperti Phe dan Tyr. Saat mutasi terjadi melalui penggantian His274 dengan asam amino berantai samping kecil, sensitivitas neuraminidase terhadap oseltamivir tidak banyak berubah. Di sisi lain penggantian His274 dengan Phe dan Tyr menyebabkan sensitivitasnya terhadap oseltamivir berkurang (Mihajlovic & Mitrasinovic, 2008). Namun demikian, interaksi sisi aktif neuraminidase yang mengalami mutasi dengan oseltamivir masih dapat diamati (Gambar 2.6b). Zanamivir memiliki bioavailabilitas yang rendah untuk oral sehingga serbuknya dikemas dalam alat inhaler. Hal ini menyebabkan penggunaan zanamivir lebih terbatas dibanding oseltamivir, padahal uji in vitro menunjukkan hambatan zanamivir terhadap neuraminidase virus influenza A (H1N1) dan virus influenza B lebih kuat dibandingkan oseltamivir (CDC, 2009; Sheu et al., 2008). Penggunaan zanamivir bersamaan dengan oseltamivir (bitherapy) telah dicoba oleh Escuret et al., (2012), namun hasil yang diperoleh belum dapat memberikan gambaran mengenai efektivitas bitherapy tersebut. Zanamivir dilaporkan dapat mengalami fotodegradasi dengan laju kinetik yang lambat. Pada paparan sinar matahari yang normal, setelah 18 hari konsentrasinya masih bertahan sebanyak 30% (Zonja et al., 2013). Di sisi lain zanamivir stabil terhadap penyimpanan selama 5 hari pada suhu ruang dan -80 ◦C (Baughman et al., 2007). Sisi aktif neuraminidase berinteraksi dengan zanamivir melalui beberapa gugus fungsi zanamivir seperti ditunjukkan pada Gambar 2.7. O

Asn 294

OH

H2N

Ser 246

Glu 276 Arg 292

O

Glu 277 NH

Tyr 347

H2N

O NH2

O

Arg 224

O

NH2 Pengembangan metode..., Wulan Tri Wahyuni, FMIPA UI, 2015. OH

N

NH2

(a)

O

Asn 294 H2N

Ser 246

OH

Glu 276 O

Glu 277

Tyr 347 Arg 292

NH

Arg 224 O

NH2

H2N

OH

O O

NH2 HN

H N

NH2

O

H2N

Ile 222

O

Arg 371

NH2 H2N

H2N OH

(b)

NH2

Tyr 406

NH

Arg 152

NH

O

O O

H2N O HN

Asp151

NH2 O O

Glu 119

OH

H2N

NH2 HN

O

Ser 179 O

NH

Arg 118

Arg 156

Trp 178

Glu 227

Gambar 2.6 Interaksi neuraminidase dengan oseltamivir (a), ineuraminidase mutasi His274Gly dengan oseltamivir (b). (Sumber: Mihajlovic & Mitrasinovic, 2008)


Gambar 2.7 Interaksi sisi aktif enzim neuraminidase dengan zanamivir (Ramachandran et al., 2012).

Peramivir merupakan turunan siklopentana yang mengandung gugus negatif karboksilat, gugus positif gugus guanidine dan rantai samping lipofilik (Babu et al., 2000). Bioavailabilitasnya rendah sehingga diberikan dengan injeksi atau infus. Afinitas sisi aktif NA terhadap peramivir lebih kuat dibandingkan terhadap oseltamivir (Bantia et al., 2011). Peramivir dapat diberikan kepada pasien penderita avian influenza secara bersamaan dengan oseltamivir karena kerja kedua obat tersebut tidak antagonis (Hernandez et al., 2011). Laninamivir

mengandung

gugus

4-guanidine

dan

gugus

7-metoksi.

Laninamivir menunjukkan kemampuan menghambat neuraminidase virus influenza A pada range yang luas (N1-N9) dan virus influenza B (Yamashita et al., 2009). Laninamivir digunakan dengan cara dihirup sehingga dikemas dalam bentuk alat inhaler. Pengujian terhadap tikus menunjukkan kemampuan laninamivir dalam menghambat neuraminidase lebih kuat dibandingkan oseltamivir dan zanamivir (Kubo et al., 2010). Laninamivir memiliki kemampuan untuk melawan neuraminidase yang sudah mengalami mutasi. Nilai IC 50 laninamivir terhadap neuraminidase tipe mutan dan wild tidak terlalu jauh berbeda (Meeprasert et al., 2012). Virus influenza yang mengalami resistensi terhadap NAI disebabkan oleh mutasi pada neuraminidase yang menyebabkan perubahan bentuk sisi katalitik dari


neuraminidase dan menurunkan kemampuan binding NA terhadap NAI. M utasi His274Tyr, Arg292Lys, dan Asn294Ser berkaitan dengan menurunnya kemampuan binding antara oseltamivir dengan neuraminidase sehingga menyebabkan resistensi terhadap oseltamivir. Mutasi Arg292Lys dan Asn294Ser menyebabkan tidak terjadinya rotasi Glu276 dan tidak terjadi ikatan antara Glu276 dengan Arg224 sehingga tidak terjadi pembentukan pocket pada neuraminidase yang mampu berikatan dengan rantai hidrofobik pada oseltamivir. Zanamivir tidak memiliki gugus hidrofobik tetapi memiliki gugus guanidine sehingga resistensi yang terjadi disebabkan oleh mutasi pada kerangkan residu katalitik. Peramivir memiliki gugus hidrofobik seperti oseltamivir dan memiliki gugus guanidine seperti zanamivir sehingga resistensi terhadap paramivir analog dengan yang terjadi pada oseltamivir dan zanamivir. Resistensi terhadap laninamivir belum dilaporkan hingga saat ini, namun demikian laninamivir berikatan dengan neuraminidase pada sisi ikatan yang mirip dengan ikatan antara zanamivir dengan neuraminidase sehingga resistensi terhadap laninamivir dimungkinkan terjadi (Samson et al., 2013). Di samping NAI yang telah disebutkan di atas, telah dikembangkan beberapa senyawa yang berpotensi sebagai NAI, antara lain dari golongan peptida siklik (Tambunan et al., 2012). Beberapa senyawa peptida siklik yang dikembangkan memiliki aktivitas hambatan dan afinitas lebih baik dibandingkan NAI yang telah digunakan. Di antara peptide siklik yang telah dikembangkan tersebut terdapat kandidat yang potensial menggantikan NAI karea diketahui juga memiliki toksisitas yang rendah. Terdapat juga senyawa yang berpotensi dikembangkan sebagai NAI yang diisolasi dari Zingiberaceae, yaitu 1, 2-di-O- β-D-glucopyranosyl-4-allylbenzene (BGA). Senyawa ini memiliki aktivitas hambatan terhadap NA, terdapat sekitar 14 residu pada sisi aktif NA yang berinteraksi dengan BGA (Tambunan et al., 2010).

2.3.

Analisis Oseltamivir Penentuan oseltamivir telah dilakukan dengan HPLC (Joseph-Charles et al.,

2007), elektroforesis kapiler

(Laborde-Kummer et al., 2009),

LC-MS-MS

(Lindegårdh et al., 2007) dan kolorimetri (Green et al., 2008), spektrofotometri (Malipatil et al., 2010), dan potensiometri (Hamza et al., 2012). Penentuan oseltamivir


secara kualitatif dengan teknik voltametri siklik telah dilakukan oleh Ivic et al., (2011). Elektroda kerja yang digunakan ialah elektroda emas polikristalin. Puncak oksidasi dan reduksi oseltamivir teramati pada potensial -0,5 dan -0,7 V. Elektrolit yang digunakan pada penelitian ini ialah NaHCO 3 0,05 M dengan pH 8,4. Puncak oksidasi dan reduksi oseltamivir tidak dapat teramati saat digunakan glassy carbon sebagai elektroda kerja. Hal ini menunjukkan bahwa elektroda glassy carbon tidak dapat digunakan untuk analisis kualitatif oseltamivir. Pop et al., (2010) melaporkan analisis kuantitatif oseltamivir menggunakan teknik differential pulse voltammetry. Elektroda kerja zinctetranaphthaloporphyrin (ZnTNP) based diamond electrode, zinc-5,10,15,20-tetra(4-sulfophenyl)porphyrin (ZnTSPP) based diamond electrode, ZnTNP based carbon paste electrode, dan ZnTSPP based carbon paste electrode memiliki sensitivitas masing-masing 0,844 mA/mol/L; 36 mA/mol/L; 27,8 mA/mol/L; dan 67 mA/mol/L. Daerah kerja masingmasing 10-11-10-7 mol/L; 10-10-10-8 mol/L; 10-9-10-7 mol/L; 10-9-10-7 mol/L. Limit deteksi analisis kurang dari 10-9 mol/L dan %RSD kurang dari 1,0 %. Respon elektroda yang digunakan stabil selama lebih dari 3 bulan. Pada Pop et al., (2012) kembali melakukan analisis kuantitatif oseltamivir dengan teknik differential pulse voltammetry. Pada penelitian ini digunakan delapan buah elektroda kerja, yaitu ZnTNP diamond, ZnTNP carbon, ZnTSPP diamond, ZnTSPP carbon, Zntetraphenylporphyrin (ZnTPP) diamond, ZNTPP carbon, Zn-phthalocyanine (ZnPc) diamond, dan ZnPc carbon. Elektrolit yang digunakan ialah titrisol dengan pH 5. Performa masing-masing elektroda disajikan pada Tabel 2.1.

Tabel 2.1 Performa elektroda kerja pada penentuan oseltamivir Senyawa Elektroaktif

Matriks

ZnTNP

Diamond Carbon Diamond Carbon Diamond Carbon Diamond

ZnTSPP ZnTPP ZnPc

Range konsentrasi linear (mol/L) 10-11 – 10-7 10-9 – 10-7 10-10 – 10-8 10-9 – 10-7 10-11 – 10-9 10-13 – 10-11 10-8 – 10-6

Limit of Detection

Sensitivitas

E (mV)

6,28 x 10-12 7,00 x 10-10 7,30 x 10-11 1,95 x 10-10 7,19 x 10-12 3,64 x 10-14 8,17 x 10-9

844 nA/mol/L 27,8 mA/mol/L 36 mA/mol/L 67 mA/mol/L 45 nA/mol/L 212 mA/mol/L 88,5 nA/mol/L

831±5 -678±4 398±8 648±5 691±8 -668±7 683±8


Carbon

10-9 – 10-6

6,74 x 10-10

2,95 mA/mol/L

-678±9

2.4. Analisis Zanamivir Penentuan zanamivir dalam serum dan urin telah dilakukan dengan teknik LCMS-MS. Deteksi dilakukan dengan menggunakan isotop stabil sebagai standar internal. Zanamivir pada range konsentrasi 10-5000 ng/mL dapat dideteksi dengan metoda yang dikembangkan dengan jumlah sampel yang digunakan sebanyak 0,2 mL dengan waktu analisis 5 menit (Allen et al., 1999). Baughman et al., (2007) menggunakan

teknik

positive

ion

hydrophilic

interaction

chromatography

(HILIC)/tandem mass spectrometry (MS) untuk menganalisis zanamivir dalam plasma tikus dan kera. Limit kuantitasi dari teknik yang digunakan ialah 2 ng/mL dan konsentrasi tertinggi yang dapat dideteksi ialah sebesar 10000 ng/mL. Rasio sinyal terhadap derau pada 2 ng/mL ialah 5:1. Teknik LC dengan TOF quadrupole MS juga telah dikembangkan untuk analisis zanamivir. Teknik ini dapat mendeteksi zanamivir pada rentang 5-1000 ng/mL (Ge et al., 2012). Analisis zanamivir dengan teknik voltametri telah dilaporkan oleh Skrzypek (2010). Dilaporkan bahwa zanamivir bertindak sebagai elektrokatalis pada permukaan mercury drop electrode yang akan mengkatalisis evolusi hidrogen. Analisis zanamivir dengan teknik Square Wave Voltammetry telah dilakukan pada kondisi pH buffer sitrat-fosfat 2,2. Teknik ini dapat mendeteksi zanamivir pada range 4,8 x 10-7 – 1,2 x 10-5 mol/L dengan limit deteksi dan limit kuantitasi berturut-turut sebesar 1,5 x 10-7 dan 4,8 x 10-7.

2.5. Deteksi Neuraminidase Deteksi neuraminidase (NA) telah dilaporkan dengan teknik enzimatis, fluorometrik, ELISA, spektroskopi, melting analysis, RT-PCR. Teknik analisis NA berdasarkan

reaksi

enzimatis

dilakukan

dengan

menggunakan

2'-(4-

Methylumbelliferyl)-α-D-N-acetylneuraminic acid (4-MUNANA) maupun derivatnya sebagai substrat. Produk reaksi enzimatis yang memiliki sifat fluoresens dideteksi pada panjang gelombang yang sesuai (Yang et al., 2012). Zhang et al., (2012) mengembangkan deteksi NA dengan teknik enzimatis ini pada microfluidic chip.


Deteksi dan kuantisasi NA dengan teknik

immunocapture ELISA

dikembangkan oleh Gerentes et al., (1998) berdasarkan penggunaan monoclonal antibodi spesifik untuk NA. Teknik ini dapat mendeteksi NA yang telah dimurnikan hingga konsentrasi 7 ng/mL. Deteksi NA secara simultan dengan hemagglutinin dikembangkan dengan LC-MS-MS. Teknik ini dapat mendeteksi hingga 1 ug/mL (Williams et al., 2012). Teknik melting analysis telah digunakan untuk mendeteksi perubahan pada sequence NA tanpa memerlukan probe yang spesifik (Varillas et al., 2011), sementara RT-PCR juga telah dikembangkan untuk menganalisis perubahan atau mutasi yang terjadi pada NA virus (Takayama et al., 2013).

2.6. Elektrokimia: Voltametri Voltametri merupakan salah satu teknik untuk menginvestigasi mekanisme elektrolisis. Pada teknik voltametri, arus yang mengalir diamati untuk setiap potensial yang diaplikasikan pada elektroda kerja. Voltametri termasuk ke dalam teknik potentiostatic atau controlled potential technique. Potensial diaplikasikan pada rentang tertentu untuk mendorong terjadinya transfer muatan (reaksi redoks) pada interface elektroda dengan larutan. Besarnya arus yang dihasilkan pada proses tersebut kemudian diukur (Wang, 2006). Komponen penting pada teknik voltametri meliputi hal-hal berikut: 1. Elektroda : Biasanya digunakan logam yang bersifat inert seperti emas atau platinum. Saat ini selain digunakan batangan logam banyak juga digunakan nanopartikel logam atau oksida logam yang dilapiskan pada material substrat yang sesuai. 2. Pelarut : Merupakan zat cair yang memiliki konstanta dielektrik yang tinggi untuk memastikan dapat melarutkan elektrolit dan membantu menghantarkan arus. Air dan asetonitril merupakan contoh pelarut yang banyak digunakan. 3. Background electrolyte : Merupakan garam yang inert secara elektrokimia, biasanya dimasukkan dalam konsentrasi yang cukup tinggi dibanding analat (0,1 M). Berfungsi mengalirkan arus listrik, contohnya: NaCl, tetrabutilamonium perklorat. 4. Reaktan/analat : Merupakan spesi yang akan ditentukan secara elektrokimia. Biasanya berada pada konsentrasi rendah, kurang dari 10 -3 M.


Berdasarkan potensial yang digunakan, voltametri dibedakan menjadi tiga, yaitu: a). Potential Step, b). Linear Sweep, c). Cyclic Voltammetry.

a. Potential Step Voltammetry Pada potential step voltammetry, tegangan atau potensial yang diaplikasikan diubah dari V1 menjadi V2 (Gambar 2.8).

Gambar 2.8 Profil perubahan potensial yang diaplikasikan dari V1 ke V2. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

Seiring dengan proses elektrolisis yang terjadi pada permukaan elektroda, terbentuk gradien konsentrasi karena konsentrasi di permukaan elektroda akan berkurang terkonsumsi oleh proses elektrolisis. Dropnya gradien konsentrasi berdampak pada turunnya arus listrik yang dihasilkan. Respon arus yang dihasilkan disajikan pada Gambar 2.9 dan profil gradien konsentrasi disajikan pada Gambar 2.10.

Gambar 2.9 Profil arus versus waktu pada Potential step voltammetry. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)


Gambar 2.10 Profil konsentrasi versus jarak menunjukkan gradien konsentrasi di sekitar elektroda. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

b. Linear Sweep Voltammetry Pada linear sweep voltammetry kisaran potensial tertentu diaplikasikan, misal antara V1 dan V2, tegangan dipayar pada kisaran tersebut mulai dari nilai V1 hingga V2 (Gambar 2.11). Besarnya kecepatan payar (scan rate) dihitung berdasarkan kemiringan garis yang menghubungkan V1 dengan V2.

Gambar 2.11 Profil tegangan yang diaplikasikan pada linear sweep voltammetry. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

Pada linear sweep voltammetry, voltamogram yang dihasilkan bergantung pada beberapa faktor, antara lain : a). laju transfer elektron, b). reaktivitas dari spesi elektroaktif, dan kecepatan payar tegangan. Voltamogram linear sweep voltammetry menunjukkan hubungan antara tegangan yang diaplikasikan dengan arus yang dihasilkan. Semakin tinggi kecepatan payar, maka besarnya arus yang dihasilkan juga semakin tinggi (Gambar 2.12)


Gambar 2.12 Profil hubungan potensial vs arus pada berbagai kecepatan payar untuk sistem reversible. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

Apabila sistem yang terjadi bersifat quasireversible dan irreversible maka profil hubungan tegangan vs arus pada berbagai kecepatan payar disajikan pada Gambar 2.13.

Gambar 2.13 Profil hubungan potensial vs arus pada berbagai kecepatan payar untuk sistem quasireversible dan irreversible. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

c. Cyclic Voltammetry Voltametri siklik (CV) memiliki kemiripan dengan linear sweep voltammetry, perbedaannya ialah setelah potensial yang diaplikasikan mencapai nilai V2 potensial dipayar kembali hingga mencapai nilai V1. Bentuk potensial yang diaplikasikan ialah bentuk triangular (Gambar 2.14). Parameter eksperimental yang diperhatikan pada


CV ialah initial potential, switching potential, dan scan rate. Biasanya scan rate atau kecepatan payar yang digunakan disesuaikan dengan ukuran elektroda yang digunakan. Sebagai contoh, bila elektroda yang digunakan memiliki diameter puluhan mm kecepatan payar yang digunakan bisa mencapai 250 mV/s, diameter elektroda 1-2 mm kecepatan payar bisa mencapai 1000 mV/s. Semakin kecil diameter elektroda biasanya kecepatan payar yang digunakan semakin besar. Sementara itu, parameter kuantitatif yang penting pada CV meliputi potensial puncak katodik dan anodik (E p,c dan Ep,a), puncak arus katodik dan anodik (ip,c dan ip,a), perbedaan puncak potensial katodik dan anodik (ΔEp = ǀEp,a – Ep,cǀ), potensial formal reaksi redoks (Eº = [Ep,a+Ep,c]/2), potensial setengah puncak ialah (E p/2 = E saat i = ip/2) (Foster & Walsh, 2005).

Gambar 2.14 Profil potensil yang diaplikasikan pada teknik cyclic voltammetry. (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

Voltametri siklik dapat memberikan informasi termodinamik suatu proses redoks dan informasi kinetik transfer elektron heterogen. Di samping itu dapat diperoleh informasi potensial redoks suatu spesies elektroaktif serta memberikan informasi mengenai efek media terhadap suatu reaksi redoks. Selama pemayaran pada potensial yang ditentukan, arus akan diukur dengan potensiostat dan plot potensial vs arus yang dihasilkan dikenal sebagai cyclic voltammogram (Wang, 2006). Pada sistem reversible dengan jumlah elektron yang terlibat dalam reaksi redoks ialah n, pada suhu 298 K berlaku persamaan Randles-Sevcik: Ip = (2,69 x 105)n3/2AD1/2Cv1/2 A merupakan luas area elektroda (cm 2), D koefisien difusi ((cm2s-1), C konsentrasi larutan, dan v ialah kecepatan payar (Vs-1). Pada sistem reversible Ep tidak


bergantung pada v dan ǀip,c/ip,aǀ adalah 1. Berlaku pula hubungan ǀEp – Ep/2ǀ = 56,5/n mV, ΔEp = Ep,a – Ep,c = 0,059/n . Pada sistem irreversible dengan jumlah elektron yang terlibat dalam reaksi redoks ialah n, pada suhu 298 K berlaku persamaan Randles-Sevcik : Ip = (2,99 x 105)α1/2ACD1/2v1/2 Di mana α merupakan koefisien transfer dan bergantung pada bentuk energi penghalang pada transfer elektron. ǀE p – Ep/2ǀ = 1,847 RT/αF = 47,7/α (mV) pada 25 ºC. Pada kondisi irreversible sempurna, E p akan bergeser ke arah potensial lebih negatif (untuk reaksi reduksi) dengan meningkatnya kecepatan payar (Foster & Walsh, 2005), dengan kata lain sistem irreversible total ditandai bergesernya nilai potensial redoks dengan perubahan kecepatan payar (Wang, 2006). Sementara itu pada kondisi di mana analat teradsorpsi sebagai lapisan tipis terbatas pada elektroda, berlaku bahwa arus pucak proporsional dengan v, bukan dengan v1/2 seperti yang berlaku pada sistem reversible maupun irreversible. Di bawah kondisi isotherm Langmuir (ketika tidak ada interaksi antara adsorbat yang berdekatan) FWHM = 3,53 RT/nF = 90,6/n mV. FWHM ialah lebar total puncak katodik dan anodik pada setengah puncak arus. Terjadinya penyimpangan dari nilai ini mengindikasikan adanya tarikan atau tolakan (interaksi) antara adsorbat yang berdekatan (Foster & Walsh, 2005). Voltamogram yang dihasilkan pada cyclic voltammetry menunjukkan hubungan antara potensial vs arus (Gambar 2.15a).

Voltamogram untuk sistem

reversible pada berbagai kecepatan payar disajikan pada Gambar 2.15b sementara untuk sistem quasireversible dan irreversible disajikan pada Gambar 2.15c. Siklik voltametri banyak digunakan untuk mengelusidasi mekanisme reaksi yang kompleks dan mengkuantitasi analat dalam sampel. Berbagai bidang seperti industri, biomedis, dan lingkungan telah memanfaatkan teknik analisis ini.

Kronoamperometri Kronoamperometri melibatkan penggunaan potensial konstan selama jangka waktu tertentu. Kronoamperometri akan menghasilkan kurva hubungan antara waktu versus arus. Nilai arus akan berkurang seiring dengan berjalannya waktu karena spesi elektroaktif pada permukaan elektroda akan terkonsumsi pada reaksi elektrokimia yang terjadi pada potensial yang digunakan. Teknik ini banyak digunakan untuk


menentukan nilai koefisien difusi spesi elektroaktif atau daerah permukaan elektroda kerja mengikuti persamaan Cottrell berikut.

I, n, F, A, D, C, t berturut-turut merupakan arus, jumlah elektron yang terlibat dalam reaksi redoks, tetapan Faraday, luas permukaan elektroda, koefisien difusi, konsentrasi, dan waktu.

a

b

c

Gambar 2.15 Hubungan potensial vs arus (a), hubungan potensial vs arus pada berbagai kecepatan payar untuk sistem reversible (b), sistem quasireversible dan irreversible (c). (Sumber: http://www.cheng.cam.ac.uk)

2.7. Boron Doped Diamond (BDD) dan Modified-BDD Diamond merupakan material dengan kekerasan sangat tinggi (1 x 10 4 kg/mm2), konduktivitas termal yang tinggi (2600 W/mK), dan charge carrier mobilities yang tinggi (untuk elektron sebesar 2200 cm 2/Vs). Diamond bersifat insulator, namun doping terhadap diamond menyebabkannya bersifat semikonduktor hingga metalik dengan konduktivitas bergantung pada level doping yang dilakukan. Dopant untuk diamond antara lain ialah boron yang menghasilkan semikonduktor tipe p, nitrogen, fosforus, dan sulfur yang menghasilkan semikonduktor tipe n. Dopant


campuran dapat juga digunakan dan akan membentuk co-doped diamond, dopant campuran tersebut antara lain menggunakan nitrogen-boron dan boron-sulfur (Kraft, 2007). Diamond yang telah didoping oleh boron menghasilkan boron doped diamond (BDD) yang banyak digunakan sebagai elektroda pada analisis elektrokimia. BDD memiliki keunggulan antara lain potential window yang lebar (Gambar 2.16), background current yang rendah, inert dan stabil. BDD dapat difabrikasi dengan teknik chemical vapor deposition (CVD). Teknik CVD dapat diklasifikasikan menjadi tiga kelompok, yaitu plasma assisted CVD, hot filament assisted CVD, dan combustion flame CVD. Teknik yang paling banyak digunakan ialah microwave plasma assisted CVD (MPACVD). Pada teknik CVD biasanya gas metana atau campuran metana dengan aseton, digunakan sebagai sumber karbon. Sementara sebagai sumber boron dapat digunakan diboran, trimetilboron, atau borat organik (Ivandini et al., 2005).

Gambar 2.16 Voltamogram siklik elektroda diamond dalam H2SO4 0,1 M. (Sumber: Fujishima et al. 2005)

Lapisan BDD dapat ditumbuhkan pada substrat non diamond seperti Si, Mo, W, Ti, dan Nb. Substrat yang paling umum digunakan ialah Si, hal ini dikarenakan Si memiliki struktur yang mirip diamond (Ivandini, Einaga, et al., 2005). Rasio boron terhadap karbon (B/C) yang digunakan saat proses deposisi mempengaruhi BDD yang dihasilkan. Semakin tinggi nilai rasio B/C, BDD semakin besar nilai konduktivitas BDD. BDD dengan rasio B/C yang tinggi banyak digunakan untuk reaksi sintesis dan


penguraian secara elektrokimia, sebaliknya B/C yang lebih rendah digunakan untuk sensor (Levy-clement, 2005). Tabel 2.2 menyajikan karakteristik BDD pada berbagai nisbah B/C. Menurut Kraft (2007) BDD dapat dideposisikan pada substrat dengan beberapa cara seperti disajikan pada Gambar 2.17. Tabel 2.2 Karakteristik BDD pada berbagai nisbah B/C. (Sumber: Levy-clement, 2005) B/C dalam fase gas (ppm) 200 800 1200 1600 2000 2800 6000 6500 8000 10000 12000 14000

Fase padat [B] (cm-3)

Resistivitas (Ω cm)

Ketebalan (µm)

8 x 1017 2 x 1019 5 x 1019 9 x 1019 1 x 1020 4 x 1020 2 x 1021 3 x 1021 5 x 1021 7 x 1021 1 x 1022 1,5 x 1022

4200 1800 250 60 11

9,5 9 9 9,2 8,2 7,5 7,0 6,8 4,6 4 4 4

0,06 0,06 0,06 ≈ 0,1 ≈ 0,1

Rerata ukuran butir (µm) ~6 ~4 ~ 3,5 ~ 2,5 ~ 2,8 ~2 ~ 1,3 ~1 ~ 0,1 ~1

Živcová et al., (2013) melaporkan bahwa BDD dapat dikategorikan sebagai BDD berkualitas tinggi apabila memiliki karbon sp 3 yang tinggi dan sedikit sekali terdapat karbon sp2, sementara BDD berkualitas rendah memiliki karbon sp 2 dalam jumlah yang banyak. Kualitas BDD biasanya dikarakterisasi dengan spektroskopi Raman karena dapat menunjukkan keberadaan karbon sp2 maupun sp3.

Gambar 2.17 Skema tipe elektroda diamond yang digunakan: a). dopeddiamond thin film electrode, b). doped-diamond thin film electrode dengan interlayer antara substrat dan lapisan diamond, c). doped diamond particle diimmobilisasi pada passivated surface, d). doped diamond particle diimmobilisasi pada insulating film. (Sumber: Kraft 2007)


BDD yang difabrikasi dengan menggunakan MPACVD ialah H terminated BDD (H-BDD) karena plasma yang digunakan berasal dari gas H2 (Ivandini, Einaga, et al., 2005). Stabilitas H-BDD dilaporkan dapat terganggu akibat penyimpanan atau paparan udara dan pemakaian terus-menerus (Vanhove et al., 2007). Modifikasi dapat dilakukan terhadap doped diamond electrode, antara lain modifikasi permukaan melalui treatment anodik atau katodik pada elektrolit berair, melalui treatment plasma, reaksi kimia, penataan elektroda lapisan diamond, deposisi logam berukuran nano atau oksida logam, deposisi lapisan tipis, serta implantasi ion (Kraft, 2007). Modifikasi BDD dapat menghasilkan oxygen terminated, amine terminated, carboxyl terminated, dan metal-modified BDD. Oxygen terminated BDD (O-BDD) merupakan salah satu jenis BDD yang banyak digunakan untuk keperluan sensing molekul biologis. O-BDD dapat dihasilkan melalui treatment anodik terhadap H-BDD. O-BDD memiliki jendela potensial yang lebih lebar, reprodusibilitas yang tinggi, stabilitas yang baik (stabil digunakan dalam waktu lebih dari 3 bulan), sensitivitas yang tinggi, dan selektivitas yang baik, serta mudah disiapkan (Yu et al., 2012). O-BDD dilaporkan telah digunakan untuk analisis dopamine (Popa et al., 1999; Tryk et al., 2007), asam urat dan asam askorbat (Popa et al., 2000), purin dan pirimidin (Ivandini et al., 2007). Metal-modified BDD banyak dikembangkan untuk elektroda sensing. Logam yang digunakan untuk memodifikasi BDD antara lain platina (Ivandini, et al., 2005b; Rismetov et al., 2014), nikel (Ivandini et al., 2004; (Zeng et al., 2012), tembaga (Ivandini et al., 2004; (Chiku et al., 2010), dan emas (Yamada et al., 2008; Ivandini et al., 2010). Modifikasi BDD dengan logam dapat dilakukan dengan teknik elektrodeposisi pada potensial tertentu maupun dengan teknik implantasi ion logam. Modifikasi BDD juga telah dilakukan dengan logam berukuran nano, antara lain nanopartikel emas menghasilkan gold nanoparticles modified boron doped diamond (AuNPs-BDD). Nanopartikel emas memberikan aktivitas katalitik lebih tinggi dibandingkan elektroda emas. Elektroda AuNPs-BDD inert secara kimia, stabilitasnya tinggi, memiliki potential window yang lebar, capasitive background current yang rendah (Kraft, 2007; Zhou & Zhi, 2009), serta signal to background current yang dapat dikontrol (Tian & Zhi, 2007). Di samping itu modifikasi boron doped diamond electrode dengan nanopartikel emas dilaporkan dapat meningkatkan respon elektroda hingga empat kali lipat (Siné et al., 2006).


2.8. Teknik Spektroskopi untuk Karakterisasi BDD Kualitas

BDD

yang diperoleh

dari

proses

fabrikasi

BDD

sangat

mempengaruhi pengukuran elektrokimia yang melibatkan BDD tersebut sebagai elektroda kerja. Teknik spektroskopi digunakan untuk mengkarakterisasi BDD, antara lain spektroskopi Raman, Scanning Electron Microscopy (SEM), dan X-ray photoelectron spectroscopy (XPS).

a.

Spektroskopi Raman Spektroskopi Raman merupakan teknik spektroskopi yang mendeteksi vibrasi

molekul. Cahaya berinteraksi dengan molekul dan mengubah polarisasi awan elektron di sekitar inti dan membentuk fraksi yang tidak stabil yang akan mengemisikan kembali radiasi (scattering). Apabila proses scattering yang terjadi menginduksi pergerakan inti, maka terjadi inelastic scattering. Teknik spektroskopi Raman berdasarkan pada inelastic scattering (penghamburan inelastic) cahaya monokromatik oleh molekul yang bervibrasi. Inelastic scattering yang dimaksud ialah bahwa frekuensi foton dalam cahaya monokromatik berubah akibat berinteraksi dengan sampel (Gambar 2.18). Stoke dan anti-stoke scattering merupakan inelastic scattering yang dimanfaatkan pada spektroskopi Raman (Smith & Dent, 2004).

Gambar 2.18 Ilustrasi Rayleigh, Stoke, dan anti-Stoke scattering. Stoke, dan antiStoke merupakan inelastic scattering yang digunakan pada spektroskopi Raman. (Sumber : Smith & Dent, 2004).


Proses yang terjadi pada Spektroskopi Raman ialah Foton dari sumber radiasi diserap oleh sampel lalu diemisikan kembali dengan frekuensi lebih kecil atau lebih besar dibandingkan frekuensi asalnya. Foton yang diserap sampel

menyebabkan

molekul sampel tereksitasi dan menjadi electric oscillating dipole yang kemudian mengemisikan cahaya. Instrumen dasar pada Spektrometer Raman meliputi sumber radiasi (laser), sample illumination system and light collection optic, wavelength selector, dan detektor (photodiode array / PDA, charge couple device / CCD, atau photomultiplier Tubes / PMT). Instrumen Raman biasanya perlu dikalibrasi sebelum digunakan. Kalibrasi antara lain dilakukan dengan menggunakan naftalena. Penghamburan Raman mengekspresikan pergeseran atau perubahan energi yang terlibat dalam inelastic scattering. Pergeseran energi (enegy shift) pada sumbu X Spektrum Raman seharusnya dinyatakan sebagai Δcm -1, namun untuk kepraktisan dinyatakan sebagai cm-1. Daerah yang paling banyak digunakan informasinya ialah pada pergeseran energi 3600-200 cm-1, dan ada juga yang memanfaatkan daerah pergeseran energi yang lebih sempit, disesuaikan dengan keperluan.

b.

Scanning Electron Microscopy (SEM) Scanning Electron Microscope (SEM) banyak digunakan untuk mempelajari

struktur permukaan suatu sampel padat. Signal pada SEM dihasilkan dari interaksi berkas elektron dengan permukaan sampel. Informasi yang dapat diperoleh dari analisis dengan SEM antara lain morfologi (tekstur) permukaan sampel padat, struktur kristal, dan orientasi material penyusun sampel. Secara umum instrument SEM terdiri atas electron source, condenser lens, objective lens, scan coils, vacuum system, aperture, magnification control, stigmator, sample holder, dan detector. Elektron yang dihasilkan electron gun diakselerasi dengan energi antara 1 hingga 30 keV. Lensa condenser kemudian memfokuskan berkas elektron hingga akhirnya mencapai sampel dengan diameter 2-10 nm. Gambar topografi permukaan sampel dihasilkan berdasarkan scanning electron pada permukaan sampel. Magnifikasi/perbesaran dapat dilakukan disesuaikan dengan detail pengamatan yang ingin dilakukan terhadap topografi sampel (Goodhew et al., 2001). Gambar 2.19 menunjukkan komponen utama pada instrumen SEM.


Gambar 2.19 Komponen utama instrument SEM. (sumber: http://www.purdue.edu/ehps/rem/rs/sem.htm) c.

X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) Prinsip kerja dari instrumen X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) ialah

dengan meradiasi sampel dengan radiasi x-ray yang menyebabkan elektron sampel lepas. Identifikasi unsur dalam sampel dilakukan berdasarkan energi kinetik dari fotoelektron yang dilepaskan tersebut. Komposisi relatif unsur dalam sampel juga dapat ditentukan berdasarkan intensitas fotoelektronnya. Informasi yang akan diberikan oleh instrument ini biasanya berupa spektrum yang memuat binding energy atau chemical shift dari fotoelektron sebagai sumbu X dan intensitasnya sebagai sumbu Y. Pada XPS berlaku hubungan KE = hν – BE – eΦ, KE merupakan energi kinetik fotoelektron yang lepas, hν merupakan energi foton X-Ray, BE merupakan energi ikatan dari orbital atom yang melepaskan elektron, dan eΦ merupakan fungsi kerja spektrometer. Instrumentasi XPS meliputi sumber radiasi sinar X (X-ray) biasanya ialah anoda (Mg/Al), monokromator, Ar ion gun, sample holder, vacuum system, electron energy analyzer, dan detector. Ilustrasi proses pada XPS disajikan pada Gambar 2.20.


Gambar 2.20 Ilustrasi proses analisis sampel pada XPS. (Sumber: Fadley, 2010) 2.9. Magnetic Beads Partikel magnet banyak digunakan untuk berbagai analisis seperti pemisahan, sensing, dan drug delivery. Saat ini tersedia partikel magnet dengan berbagai ukuran mulai dari berukuran mikro (20µm) hingga nano (50 nm). Partikel magnet berukuran nano biasanya digunakan untuk penelitian immunology pemisahan sel, sementara yang berukuran mikro digunakan untuk berbagai keperluan analisis (Aytur et al., 2006). Permukaan partikel magnet (beads) dimodifikasi melalui pre-coupled dengan biomolekul (protein, antibodi, antigen, DNA/RNA probe) atau ligan yang memiliki afinitas terhadap molekul target. Streptavidin merupakan salah satu biomolekul berupa protein dengan bobot molekul sekitar 53 kDa yang digunakan untuk memodifikasi magnetic beads (MB). Produk komersial MB-streptavidin telah banyak tersedia dan mudah diperoleh. Streptavidin memiliki afinitas terhadap molekul biotin (vitamin H). Setiap satu molekul streptavidin dapat mengikat 4 molekul biotin melalui ikatan nonkovalen. Interaksi yang terjadi antara streptavidin dengan biotin ialah ikatan hidrogen dan gaya van der waals. Afinitas streptavidin dengan biotin sangat besar, konstanta afinitas biotin-streptavidin dalam larutan dapat mencapai 10 15 M-1 (Green, 1963). Interaksi biotin-streptavidin juga bersifat stabil terhadap pengaruh suhu dan pH.


Molekul target dapat diimobilisasi pada magnetic beads dengan cara dikonjugasikan terlebih dahulu dengan biotin. Interaksi biotin streptavidin selanjutnya dapat menyebabkan molekul target terimobilisasi pada magnetic beads. Konjugasi molekul target dengan biotin dapat terjadi melalui beberapa tipe proses biotinilasi, bergantung pada gugus fungsi yang dimiliki molekul target. Biotinilasi molekul target dapat terjadi melalui gugus amina primer, sulfidril, karboksil, residu karbohidrat pada glikoprotein, dan melalui nukleotida.

2.10.

Lateral Flow Assay : Strip test Lateral Flow Assay (LFA) merupakan teknik analisis kualitatif maupun

kuantitatif yang mengkombinasikan biorecognition probe dengan

kromatografi.

Umumnya dilakukan pada sebuah strip sehingga sering juga disebut sebagai strip test. LFA yang sukses dikembangkan ialah Lateral Flow Immunoassay yang dikenal juga dengan istilah immunokromatografi. Pada dasarnya LFA (khususnya immunokromatografi) memiliki format yang tersusun atas sample application pad, conjugate pad, nitrocellulose membrane, dan adsorbent pad. Sample application pad biasanya terbuat dari selulosa atau glass fiber, pada bagian ini sampel diaplikasikan. Bagian ini diharapkan dapat mentransport sampel secara kontinu, seragam, dan perlahan. Adakalanya sample pad didesain untuk proses pretreatment seperti pemisahan komponen sampel, penghilangan partikel interferent dan pH adjustment. Conjugate pad merupakan tempat labelled biorecognition molecule ditempatkan. Biasanya conjugate pad dibuat dari glass fiber, selulosa, atau poliester. Nitrocellulose membrane merupakan support tempat sampel bermigrasi menuju control dan test line yang juga terletak pada nitrocellulose membrane ini. Adsorbent pad disimpan pada bagian ujung, berfungsi menjaga aliran cairan sampel pada membrane nitrocellulose dan mencegah terjadinya aliran balik cairan sampel. Bagian tersebut disusun pada backing plastic atau plastik penyangga (Sajid et al., 2014).

2.11

Transmission Electron Microscopy (TEM) Instrumen TEM beroperasi menggunakan electron gun yang dihasilkan oleh

sumber elektron seperti filament yang dipanaskan pada suhu mencapai 2800 K (thermionic

gun).

Electron

gun

difokuskan

dengan

menggunakan

lensa

elektromagnetik sebelum mengenai sampel. Elektron yang berenergi tinggi tersebut


akan mengenai sampel dan berinteraksi dengan atom pada sampel. Selanjutnya elektron yang sama ataupun berbeda akan meninggalkan sampel untuk membentuk image yang dibaca oleh detektor. Pada TEM digunakan viewing screen yang biasanya merupakan lapisan electron-fluorescent yang dapat digunakan pada kondisi vakum. Viewing screen dirangkaikan dengan vertical microscope column yang ketinggiannya disesuaikan dengan rangkaian lensa yang digunakan, pole pieces, dan cooling water. Biasanya digunakan 2 buah lensa kondensor (collecting and directing beam), 4 atau 5 lensa projektor (projecting image onto a screen). Elektron dengan energi ratusan sampai ribuan kV dihasilkan oleh electron gun yang berada pada bagian paling atas dari microscope column. Bagian berikutnya ialah 2 buah lensa kondensor yang bekerja mengurangi energi electron beam dan mengontrol diameternya sebelum mengenai sampel. Aperture condensor terletak di antara lensa kondensor dan digunakan untuk mengatur sudut konvergensi. Setelah lensa kondensor terdapat specimen chamber. Bagian berikutnya ialah lensa objektif yang berfungsi membentuk image intermediet pertama dan pola difraksi yang kemudian diperbesar oleh lensa proyektor berikutnya dan ditampilkan pada fluorescent screen. Beberapa lensa proyektor digunakan untuk memperbesar image sebelum ditampilkan (Goodhew et al., 2001). Gambar 2. 21 menunjukkan komponen utama instrumen TEM.


Gambar 2.21 Komponen utama instrument TEM. (sumber : http://www.en.academic.ru)


BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Bahan dan Peralatan 3.1.1 Bahan Bahan yang digunakan pada penelitian meliputi zanamivir (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd.), oseltamivir (U.S.Pharmacopeia standards), neuraminidase dari bakteri Clostridium perfringens (Sigma Aldrich), gas hidrogen, metana, dan trimetilboron, HAuCl4.4H2O (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd.), Mucin dari bovine submaxillary glands (Sigma Aldrich), Nitrocellulose membrane dengan ukuran pori 0,45 µm (Bio-Rad), glass fiber filter (Merck Millipore Ltd.), EZ-Link® Sulfo-NHS-Biotin

(Thermo

Scientific),

Dynabeads®

M-280

Streptavidin

(INVITROGEN), Allylamine (Tokyo Chemical Industry Co. Ltd.), Na 3C6H5O7, 2propanol, K2HPO4, KH2PO4, H3PO4, H2SO4, etanol absolut, NaOH 0,014 N, KOH, asam sitrat, dan natrium sitrat (Wako Pure Chemicals Industries, Ltd. Atau Merck Millipore Ltd.), liquid blocker mini pen (Daido Sangyo, Japan), dan high purity aquades dengan konduktivitas maksimum 18 MΩ dari Simply-Lab water system (DIRECT-Q 3 UV, Millipore).

3.1.2 Peralatan dan Instrumen Peralatan yang digunakan pada penelitian ialah berbagai peralatan gelas, micropipette, neraca analitik, sonikator, vortex, magnetic particle concentrator (Invitrogen DynaMagTM-2), magnetic stirrer, incubator (Sansyo Incubator SIB-35), lampu UV, pH meter (Horiba Laqua), elektroda platina sebagai counter electrode, elektroda pembanding Ag/AgCl (ALS RE-1C), elektroda Au dan BDD sebagai working electrode. Instrumen yang digunakan meliputi Electrochemical Analyzer (ALS/H CH Instruments), Raman spectroscopy (Olympus BX51M), Scanning Electron Microscopy (SEM) FEI Sirion, Transmission Electron Microscopy (TEM) FEI TECNAI G2, X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) Jeol JPS-9010 TR photoelectron/spectrometer, dan Microwave Plasma-Assisted Chemical Vapor Deposition (MPACVD) AX6500X Seki Technotron Corp. 3.2 Prosedur Kerja


Penelitian dilakukan dalam dua tahapan. Tahap pertama meliputi fabrikasi dan karakterisasi elektroda, studi perilaku elektrokimia zanamivir, dan pengukuran zanamivir. Pada tahap dua dilakukan optimasi deteksi NA secara tidak langsung berdasarkan respon elektrokimia zanamivir saat ada dan tidak ada NA, pengukuran NA pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD, immobilisasi zanamivir pada permukaan elektroda Au-BDD, dan pengembangan teknik deteksi NA dengan bantuan magnetic beads, serta pengebangan awal metode deteksi NA dengan lateral flow analysis (strip test). Diagram alir penelitian disajikan pada Lampiran 1.

3.2.1 Studi Elektrokimia Zanamivir dan Oseltamivir pada Elektroda Au Sel pengukuran voltametri disiapkan terdiri atas Ag/AgCl sebagai reference electrode, platina sebagai counter electrode, dan Au sebagai working electrode (Gambar 3.1). Larutan zanamivir dan oseltamivir dalam buffer fosfat (PBS) 0,1 M pH 7 dimasukkan ke dalam kompartemen sampel pengukuran voltametri. Profil voltametri siklik zanamivir dan oseltamivir diamati pada rentang potensial 0 hingga +1500 mV dengan kecepatan payar (scan rate) 100 mV/s.

Gambar 3.1 Rancangan sel elektrokimia.


3.2.2 Pembuatan Elektroda Boron Doped Diamond (BDD) 0,1 %, Gold modified Boron Doped Diamond Electrode (Au-BDD), dan Gold Nanoparticles modified Boron Doped Diamond Electrode (AuNPs-BDD) 3.2.2.1 Preparasi Silicon Wafer Bagian permukaan yang mengkilap dari silicon wafer digosokkan pada permukaan nanodiamond selama kurang lebih 30 menit hingga terbentuk goresan diamond pada permukaannya. Silicon wafer yang telah digores kemudian disonikasi dengan isopropanol sebanyak 2 kali masing-masing selama 5 menit dan dikeringkan. 3.2.2.2 Fabrikasi Elektroda BDD 0,1% dengan menggunakan Microwave Plasma Assisted Chemical Vapor Deposition (MPACVD ) Silicon wafer yang telah disiapkan pada bagian 3.2.2.1 kemudian ditaruh dalam sample holder yang telah dibersihkan, bagian yang telah digosok berada di atas. Sampel holder selanjutnya diletakkan di dalam MPACVD chamber (Lampiran 2), setelah cover kaca diletakkan, selanjutnya MPACVD chamber ditutup. Plasma yang digunakan berasal dari gas hidrogen (H2), gas metana (CH4) digunakan sebagai sumber karbon dan trimetilboron (C3H9B) sebagai sumber boron. Kondisi proses chemical vapor deposition pada pembuatan BDD disajikan pada Tabel 3.1. Setelah proses deposisi selesai didapatkan elektroda BDD dengan konsentrasi 0,1 % Boron.

Tabel 3.1 Kondisi operasi MPACVD pada pembuatan BDD 0,1 % Parameter

Kondisi

CH4 (standard cubic centimeters per minute / sccm)

20

H2 (sccm)

530

TMB (sccm)

2

O2 (sccm)

0,5

Chamber Pressure (Torr)

80

Plenum Pressure (Torr)

70

Microwave Power (W)

6000

Temperature (◦C)

987

Deposition Time (h)

6

3.2.2.3 Karakterisasi Elektroda BDD 0,1 % Karakterisasi dengan Spektrometer Raman. Elektroda BDD yang dihasilkan kemudian dikarakterisasi dengan instrumen spektrometer Raman (Lampiran 2).


Sebelum digunakan, instrumen dikalibrasi terlebih dahulu dengan naftalena. Pengukuran spektrum Raman dilakukan pada beberapa titik BDD yang diperoleh. Karakterisasi dengan Scanning Electron Microscope (SEM). Katakterisasi elektroda BDD dengan SEM dilakukan dengan merekatkan elektroda pada carbon tape lalu dimasukkan ke dalam bilik SEM untuk kemudian dikarakterisasi ukuran kristal dan topografi permukaannya. Gambar instrumen SEM yang digunakan pada penelitian disajikan pada Lampiran 2. Karakterisasi dengan X-Ray Photoelectron Spectroscopy (XPS). Karakterisasi dengan XPS dilakukan dengan cara memasukkan elektroda BDD ke dalam bilik XPS dengan merekatkannya pada sample holder dengan carbon tape untuk kemudian dikarakterisasi kandungan atom karbon, oksigen, emas, dan nitrogen pada elektroda BDD dan modified-BDD. Gambar instrumen XPS yang digunakan pada penelitian disajikan pada Lampiran 2. 3.2.2.4 Pembuatan Gold Modified Boron Doped Diamond Electrode dengan Teknik Electrodeposition Elektroda BDD yang telah diperoleh disusun pada kompartemen sampel pengukuran voltametri (Gambar 3.1). Ke dalam kompartemen dimasukkan larutan HAuCl4.4H2O 2 mM dan H2SO4 0,5 mM dengan perbandingan 1:1. Elektrodeposisi Au pada permukaan BDD dilakukan pada variasi potensial -800 hingga 0 mV. Setelah mendapatkan potensial deposisi optimum, waktu deposisi Au pada permukaan BDD divariasikan pada 50, 100, 150, dan 200 detik. Elektroda gold modified BDD yang diperoleh selanjutnya disebut sebagai elektroda Au-BDD. Elektroda Au-BDD yang telah dibuat dikarakterisasi dengan menggunakan SEM dan XPS. Stabilitas elektroda diamati dengan melakukan pengukuran sebanyak 30 kali ulangan.

3.2.2.5 Pembuatan Gold Modified Boron Doped Diamond Electrode dengan Teknik Chemical Deposition Elektroda H-BDD terlebih dahulu dioksidasi dengan siklik voltametri sebanyak 20 kali dalam larutah H2SO4 0,1 M dan dilanjutkan dengan teknik amperometri pada potensial 3 V selama 20 menit. O-BDD yang diperoleh selanjutnya direndam dalam allylamina selama 6 jam sambil diradiasi dengan cahaya ultraviolet (Tian et al., 2006). N-BDD yang diperoleh selanjutnya direndam selama 90 menit dalam larutan


nanopartikel emas (AuNPs) yang telah disiapkan dengan metode Turkevich (Kimling et al., 2006). Elektroda gold modified BDD yang diperoleh selanjutnya disebut sebagai AuNPs-BDD. Karakterisasi elektroda AuNPs-BDD dilakukan dengan menggunakan SEM dan XPS. Stabilitas elektroda diamati dengan melakukan 30 kali ulangan pengukuran.

3.2.3 Pengukuran Elektrokimia Zanamivir 3.2.3.1 Pemilihan Kecepatan Payar Pengukuran Elektrokimia Zanamivir Kecepatan payar (scan rate) pengukuran elektrokimia zanamivir divariasikan pada 25, 50, 100, 150, 200, dan 250 mV/s. Pengukuran dilakukan pada suhu ruang menggunakan Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding, kawat platina digunakan sebagai counter electrode, dan Au-BDD sebagai elektroda kerja. Larutan zanamivir 1,5 x 10-4 M dalam PBS 0,1 M digunakan pada pengukuran. Hubungan antara kecepatan payar dengan arus reduksi selanjutnya ditentukan. 3.2.3.2 Penentuan Potential Windows Pengukuran Elektrokimia Zanamivir Potential windows pengukuran elektrokimia zanamivir ditentukan pada rentang -2 hingga +1,5 V. Pengukuran dilakukan pada suhu ruang menggunakan Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding, kawat platina digunakan sebagai counter electrode, dan Au-BDD sebagai elektroda kerja. Larutan zanamivir 1,5 x 10-4 M dalam PBS 0,1 M digunakan pada pengukuran. 3.2.3.3 Penentuan Koefisien Difusi Koefisien difusi pada pengukuran zanamivir ditentukan dengan mengukur arus pada potensial tetap yaitu 1100 mV selama 10 detik. Besarnya arus dialurkan terhadap waktu. Koefisien difusi ditentukan dengan menggunakan persamaan Cottrell setelah mengalurkan 1/√t dengan arus. 3.2.3.4 Pengukuran Zanamivir pada Berbagai Konsentrasi Disiapkan larutan zanamivir dengan berbagai konsentrasi pada kisaran 1 x 10 12

hingga 1 x 10-4 M dalam PBS 0,1 M. Larutan zanamivir diukur dengan kondisi

pengukuran yang optimum. Selain itu dilakukan juga pengukuran zanamivir pada rentang konsentrasi yang lebih sempit yaitu pada rentang 1 x 10-6 hingga 1 x 10-4 M. 3.2.3.5 Presisi Pengukuran Zanamivir Larutan zanamivir diukur dengan teknik voltametri siklik sebanyak sembilan kali ulangan pada tiga level konsentrasi. Nilai % RSD pengukuran menunjukkan presisi pengukuran zanamivir.


3.2.4 Pengukuran Elektrokimia Neuraminidase 3.2.4.1 Optimasi pH Digunakan 3 mL larutan zanamivir pada konsentrasi 1 x 10-4 M dalam PBS 0,1 M pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 7; dan 8. Selanjutnya ke dalam masing-masing larutan zanamivir dimasukkan neuraminidase (NA) dengan konsentrasi 10 mU. Dilakukan inkubasi selama 30 menit pada suhu 37 ◦C. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan 1 mL 0,014 M NaOH dalam etanol 83 % (Ye et al., 2012). Besarnya respon elektrokimia larutan zanamivir diukur pada kondisi pengukuran optimum. 3.2.4.2 Optimasi Waktu Reaksi Zanamivir dengan Neuraminidase Digunakan 3 mL larutan zanamivir pada konsentrasi 1 x 10-4 M dalam PBS 0,1 M pH optimum. Ke dalamnya dimasukkan NA dengan konsentrasi 10 mU dan dilakukan inkubasi pada suhu 37 ◦C selama 10, 20, 25, 30, dan 40 menit. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan 1 mL 0,014 M NaOH dalam etanol 83 %. Besarnya respon elektrokimia larutan zanamivir diukur pada kondisi pengukuran optimum. 3.2.4.3 Pengukuran Neuraminidase Digunakan 3 mL larutan zanamivir pada konsentrasi 1 x 10-4 M dalam PBS 0,1 M pH optimum. Ke dalam masing-masing larutan tersebut dimasukkan NA dengan konsentrasi masing-masing 0 hingga 15 mU dan dilakukan inkubasi pada suhu 37 ◦C selama waktu kontak optimum. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan 1 mL 0,014 M NaOH dalam etanol 83 %. Besarnya respon elektrokimia larutan zanamivir diukur pada kondisi pengukuran optimum. 3.2.4.4 Presisi Pengukuran Neuraminidase Digunakan 3 mL larutan zanamivir pada konsentrasi 1 x 10-4 M dalam buffer fosfat pH optimum. Dimasukkan NA ke dalam larutan zanamivir dan dilakukan inkubasi pada suhu 37 ◦C selama waktu kontak optimum. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan 1 mL 0,014 M NaOH dalam etanol 83 %. Dilakukan sebanyak 9 kali ulangan dan presisi pengukuran ditentukan. 3.2.4.5 Pengaruh Matriks Mucin pada Pengukuran Neuraminidase Digunakan 3 mL larutan zanamivir pada konsentrasi 1 x 10-4 M dalam PBS pH optimum. Dimasukkan NA pada konsentrasi 0 hingga 15 mU bersama mucin dengan konsentrasi 3,3 mg/mL ke dalam larutan zanamivir dan dilakukan inkubasi


pada suhu 37 ◦C selama waktu kontak optimum. Aktivitas enzim dihentikan dengan menambahkan 1 mL 0,014 M NaOH dalam etanol 83 %.

3.2.5. Immobilisasi Zanamivir pada Magnetic Beads 3.2.5.1 Modifikasi Zanamivir dengan Biotin Zanamivir dilarutkan dalam PBS 0,1 M dengan konsentrasi 1 x 10-3 M. Sementara itu sulfo-NHS-biotin (dengan jumlah sesuai protocol uji pada produk) dilarutkan dalam ultrafure water dan disiapkan fresh sesaat sebelum digunakan. Larutan zanamivir dicampurkan dengan larutan Sulfo-NHS-Biotin dan didiamkan selama 2 jam pada suhu 8 ºC. Larutan zanamivir yang sudah direaksikan dengan biotin siap digunakan atau dapat disimpan pada suhu -20◦C. Analisis FTIR dilakukan untuk memeriksa keberhasilan biotinilasi. 3.2.5.2 Aktivasi Magnetic Beads Magnetic beads yang mengandung gugus avidin diaktivasi terlebih dahulu dengan cara mencampurkan 20 µL magnetic beads 10 mg/mL dengan 1 mL PBS 0,1 M. Campuran divortex selama 5 menit dan PBS dipisahkan dari magnetic beads dengan menggunakan bantuan magnetic particle concentrator. Proses ini diulangi sebanyak 4 kali. Magnetic beads kemudian dilarutkan dalam PBS 0,1 M hingga diperoleh konsentrasi 200 µg/mL. 3.2.5.3 Modifikasi Magnetic Beads dengan Zanamivir Magnetic beads yang telah diaktivasi dicampur dengan zanamivir-biotin. Campuran divortex pelan selama 30 menit. Dilakukan pemisahan antara magnetic beads yang telah mengikat zanamivir (MB-streptavidin-biotin-zan) dengan cairan pelarut menggunakan magnetic particle concentrator. Selanjutnya dilakukan pencucian dengan PBS 0,1 M sebanyak 3 kali.

MB-streptavidin-biotin-zan

selanjutnya dilarutkan kembali dalam PBS 0,1 M pH 5,5 untuk digunakan dalam pengujian NA. 3.2.5.4 Optimasi Jumlah Magnetic Beads Jumlah Magnetic beads yang digunakan pada immobilisasi zanamivir dioptimasi untuk menentukan perbandingan yang optimum antara zanamivir dengan magnetic beads. Zanamivir-biotin yang digunakan dibuat tetap 1 x 10-3 M, sementara jumlah magnetic beads divariasikan pada selang 40 hingga 200 µg. Metode


pencampuran mengikuti prosedur pada poin 3.2.5.3. Evaluasi dilakukan dengan pengukuran voltametri siklik larutan magnetic beads-zanamivir.

3.2.6. Pengukuran Elektrokimia NA menggunakan Magnetic Beads Termodifikasi Zanamivir Rancangan sel elektrokimia terdiri atas elektroda kerja Au-BDD menggunakan 0,5 cm barrel type rare earth magnet, sebagai elektroda pembanding digunakan Ag/AgCl (KCl jenuh), sedangkan elektroda pendukung digunakan kawat platina berbentuk spiral. Skema sel pengukuran disajikan pada Gambar 3.2

Gambar 3.2 Skema sel elektrokimia pengukuran dengan magnetic beads. Keterangan : a. Counter electrode

b. Reference electrode

c. Au-BDD Electrode

d. Magnet bar

Larutan NA dengan variasi konsentrasi dalam PBS 0,1 M pH 5,5 diukur menggunakan sel elektrokimia sesuai skema pada Gambar 3.2. Pengukuran dilakukan pada kondisi optimum pengukuran NA yang telah diperoleh pada penelitian tahap sebelumnya.

3.2.7 Pengembangan Strip test untuk Deteksi Neuraminidase 3.2.7.1 Rancangan Strip test Rancangan strip test disiapkan meliputi bagian sample pad yang terbuat dari glass fiber filter berukuran 0,5 cm x 0,5 cm, nitrocellulose membrane tempat sampel bermigrasi berukuran 0,5 cm x 1,5 cm yang mengandung zanamivir yang telah diimmobilisasi pada daerah ujung, dan adsorbent pad berukuran 0,5 cm x 0,5 cm. Pada bagian ujung atas dan bawah nitrocellulose membrane tempat sampel bermigrasi diaplikasikan liquid blocker mini pen. Rancangan strip test yang dibuat disajikan pada Gambar 3.3.


Gambar 3.3 Rancangan strip test pengukuran neuraminidase.

3.2.7.2 Immobilisasi Zanamivir Zanamivir 10-2 M diaplikasikan sebanyak 15 µL pada nitrocellulose membrane. Proses aplikasi dilakukan 3 tahap, masing-masing 5 µL dengan selang waktu 10 menit untuk setiap aplikasi. Dipastikan zanamivir telah teradsorpsi dengan baik dan pelarut telah kering sebelum aplikasi berikutnya dilakukan.

3.2.7.3 Deteksi Neuraminidase NA dilarutkan dalam PBS pH 5,5 dan sebanyak 50 µL NA dengan konsentrasi 0 hingga 15 mU diaplikasikan pada sample pad. Sampel yang telah diaplikasikan akan berjalan di sepanjang nitrocellulose membrane mencapai zanamivir dan menuju adsorbent pad. Bagian spot zanamivir selanjutnya digunting lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 25 menit. Setelah 25 menit, aktivitas enzim dihentikan dengan meneteskan 15 µL 0,014 M NaOH dalam etanol 83 %. Setelah reaksi enzim dihentikan, diteteskan 3 mL PBS 0,1 M pH 5,5 dan dilakukan pengukuran dengan elektroda Au-BDD. 3.2.7.4 Deteksi Neuraminidase pada Matriks Mucin NA dilarutkan dalam PBS pH 5,5, sebanyak 50 µL NA dengan konsentrasi 0 hingga 15 mU dicampurkan dengan mucin dan diaplikasikan pada sample pad. Konsentrasi mucin dalam sampel ialah 3,3 mg/mL. Sampel yang telah diaplikasikan berjalan disepanjang nitrocellulose membrane mencapai zanamivir dan menuju adsorbent pad. Bagian spot zanamivir selanjutnya digunting lalu diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 25 menit. Setelah 25 menit, aktivitas enzim dihentikan dengan


meneteskan 15 µL 0.014 M NaOH dalam etanol 83 %. Setelah reaksi enzim dihentikan, diteteskan 3 mL PBS 0,1 M Ph 5,5 dan dilakukan pengukuran dengan elektroda Au-BDD.


BAB IV

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1

STUDI

PERILAKU

ELEKTROKIMIA

ZANAMIVIR

DAN

OSELTAMIVIR PADA ELEKTRODA EMAS 4.1.1

Studi Perilaku Elektrokimia Zanamivir pada Elektroda Emas Profil voltametri siklik zanamivir (Zan) dalam buffer fosfat (PBS) diamati

untuk mengetahui perilaku elektrokimia dari analat tersebut. Elektroda kerja yang digunakan ialah emas, elektroda platina dan Ag/AgCl masing-masing digunakan sebagai elektroda counter dan reference. Pada Gambar 4.1 dapat diamati bahwa profil voltametri siklik (CV) zanamivir dalam PBS 0,1 M pH 7 tidak menunjukkan adanya puncak oksidasi maupun reduksi zanamivir. Puncak yang teramati ialah oksidasi air menghasilkan gas oksigen yang mulai muncul pada daerah potensial sekitar 1,23 Volt. Reaksi oksidasi air terjadi mengikuti persamaan: 2H2O(l)  O2(g) + 4H+(aq) + 4e-. Selain puncak oksidasi air, teramati puncak oksidasi emas dan puncak reduksi emas. Reaksi oksidasi dan reduksi emas dapat dituliskan sebagai berikut: Oksidasi 2Au(s) + 3H2O(l)  Au2O3(aq) + 6H+(aq) + 6eReduksi Au2O3(aq) + 6H+(aq) + 6e-  2Au(s) + 3H2O(l) 500 400 300

I / uA

200

O2 evolution Au oxidation

100 0 -100

Au reduction

-200 -300 -400

PBS -4 Zan 5 x 10 M

-500 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E / V (vs. SSCE) Gambar 4.1 Profil CV PBS pH 7 dan zanamivir 5 x 10-4 M dalam PBS pH 7. Pada Gambar 4.1 dapat diamati bahwa puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada voltamogram siklik zanamivir (garis berwarna merah) mengalami penurunan


intensitas dibandingkan pada voltamogram siklik PBS. Di samping itu, dapat diamati terjadinya pergeseran potensial oksidasi dan reduksi emas. Potensial oksidasi emas bergeser ke nilai yang lebih positif, sementara potensial reduksinya bergeser ke nilai yang lebih negatif. Hal ini mengindikasikan bahwa keberadaan zanamivir mempengaruhi transfer elektron pada elektroda kerja sehingga mengurangi intensitas dan menyebabkan pergeseran potensial reduksi dan oksidasi emas pada elektroda Au yang digunakan. Zanamivir merupakan senyawa dengan gugus guanidine yang memiliki titik isoelektrik 7,4 (Gambar 4.2). Pada pH 7 zanamivir akan bermuatan positif, namun demikian gugus fungsi guanidine memiliki pasangan elektron bebas dan dapat menjadi donor elektron. Interaksi antara nitrogen pada gugus guanidine yang kaya akan elektron bebas dengan Au yang memiliki orbital elektron yang kosong telah dilaporkan (Ahrens et al., 1999; Zawadzki, 2003; Coles, 2006; Abdou et al., 2009). Atom nitrogen pada gugus guanidine memungkinkan senyawa tersebut dapat teradsorpsi pada permukaan elektoda Au (Daigle & BelBruno, 2011). Adsorpsi zanamivir pada permukaan elektroda Au diduga dapat mengganggu pembentukan oksida emas Au2O3. Adsorpsi senyawa organik pada permukaan elektroda mengganti posisi molekul air yang telah teradsorpsi lebih dulu (Bockris et al., 2000; Srinivasan, 2006) mengikuti reaksi berikut: [organic]sol + nH2Oads ↔ [organic]ads + nH2Osol Hal ini dapat mengganggu terbentuknya oksida emas Au2O3 yang terbentuk melalui reaksi 2Au(s) + 3H2O(l)  Au2O3(aq) + 6H+(aq) + 6e-. Di sisi lain, DuVall & McCreery (1999) melaporkan bahwa teradsorpsinya senyawa organik pada permukaan elektroda menyebabkan turunnya laju transfer elektron pada permukaan elektroda. Kondisi ini menyebabkan intensitas puncak arus oksidasi dan reduksi Au menjadi lebih rendah. Ilustrasi mekanisme dan interaksi molekul pada adsorpsi zanamivir di permukaan elektroda Au disajikan pada Gambar 4.3.

Gugus guanidine


Gambar 4.2 Struktur zanamivir dengan gugus guanidine.

Sementara itu (Skrzypek, 2010; Skrzypek, 2012) melaporkan bahwa senyawa yang mengandung gugus guanidine dapat terprotonasi dan teradsorpsi pada permukaan elektroda. Lebih lanjut gugus guanidine dapat mengkatalisis reduksi hidrogen pada permukaan elektroda. Proses adsorpsi senyawa dengan gugus guanidine pada permukaan elektroda ditunjukkan dengan perubahan kapasitas double layer, zero charge potential, dan tegangan permukaan pada zero charge potential.

(a)

(b)

Gambar 4.3 Ilustrasi mekanisme (a) dan interaksi molekul (b) pada adsorpsi zanamivir di permukaan elektroda Au yang mengganggu pembentukan Au2O3. 4.1.2

Studi Perilaku Elektrokimia oseltamivir pada Elektroda Emas Perilaku elektrokimia oseltamivir fosfat diamati dengan elektroda emas

sebagai elektroda kerja, Ag/AgCl sebagai elektroda pembanding, dan platina sebagai elektroda counter. Larutan oseltamivir fosfat (Os) 1 x 10-4 M dalam PBS pH 7 diukur dengan teknik voltametri siklik. Profil voltametri siklik yang diperoleh (Gambar 4.4) tidak menunjukkan adanya puncak oksidasi maupun reduksi oseltamivir. Puncak


oksidasi dan reduksi yang teramati merupakan puncak oksidasi dan reduksi Au. Hal yang menarik adalah keberadaan oseltamivir fosfat pada konsentrasi 1 x 10 -4 M tidak mengurangi intensitas puncak arus oksidasi dan reduksi Au. Hal ini diduga terjadi karena senyawa oseltamivir fosfat tidak mengandung gugus guanidine seperti halnya zanamivir sehingga proses adsorpsi pada permukaan elektroda tidak terjadi. Kondisi ini menyebabkan studi elektrokimia oseltamivir fosfat tidak dilakukan pada tahap selanjutnya. Selain menggunakan buffer fosfat, studi perilaku oseltamivir dilakukan dengan menggunakan buffer sitrat pH 7. Namun demikian hasil yang diperoleh juga tidak menunjukkan puncak arus oksidasi maupun reduksi oseltamivir, keberadaan oseltamivir juga tidak mengurangi intensitas puncak arus oksidasi dan reduksi Au (Lampiran 3). 250 200

O2 evolution

150

I / uA

100

Au oxidation

50 0 -50

Au reduction

-100 PBS pH 7 -4 Os 1x10 M

-150 -200

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

E / V (vs. SSCE)

Gambar 4.4 Profil CV oseltamivir fosfat 1 x 10-4 M dalam PBS pH 7.

4.2

FABRIKASI ELEKTRODA BORON DOPED DIAMOND (BDD) 0,1%, Au-BDD, dan AuNPs-BDD

4.2.1

Fabrikasi BDD 0,1 % dengan Microwave Plasma Assisted Chemical Vapor Deposition (MPACVD ) Lapisan diamond yang didoping dengan boron pada konsentrasi 0,1 % telah

berhasil dibuat pada penelitian ini dengan menggunakan MPACVD. Chemical Vapor Deposition merupakan teknik deposisi yang efisien untuk menumbuhkan lapisan polikristalin diamond pada permukaan substrat non diamond. Substrat yang


digunakan ialah silica wafer. Substrat Si sering digunakan karena dapat meminimalkan kontaminasi silang atom dopant dan dapat membentuk kontak tanpa penghalang dengan lapisan atas diamond. Substrat terlebih dahulu ditreatment dengan serbuk diamond berukuran nano hingga terbentuk goresan yang berfungsi sebagai sisi aktif nukleasi diamond (Ivandini et al., 2005). Konversi karbon dari gas metana menjadi kristal diamond terjadi pada permukaan substrat dengan bantuan plasma dari H2. Permukaan silica wafer sebelum dilapisi boron doped diamond mengkilat seperti kaca. Silica wafer sebelum dan setelah dilapisi boron doped diamond disajikan pada Gambar 4.5.

(a)

(b)

(a)

(b)

Gambar 4.5 Silica wafer (a) dan BDD 0,1 % pada permukaan silica wafer (b).

Boron yang didoping pada lapisan diamond yang ditumbuhkan diharapkan dapat meningkatkan konduktivitas BDD yang dihasilkan dan tetap mempertahankan sifat diamond sehingga BDD yang dihasilkan memiliki sifat unggul berupa potential window yang lebar, background current yang rendah, dan stabilitas yang tinggi. Pada level konsentrasi boron yang rendah akan terbentuk BDD dengan sifat semikonduktor, sementara pada konsentrasi boron yang semakin tinggi konduktivitas BDD akan semakin meningkat. BDD dengan sifat semikonduktor lebih dipilih untuk keperluan

sensor

(Levy-clement,

2005).

Level

doping

boron

dilaporkan

mempengaruhi katalisis reaksi tertentu pada permukaan BDD. Cai et al., (2005) melaporkan aktivitas elektrokatalisis reaksi reduksi oksidasi hidrogen dan oksigen meningkat dengan mengingkatnya level doping. Pada penelitian ini konsentrasi boron yang didoping ialah sebesar 0,1 % atau rasio B/C dalam ppm sebesar 1000 ppm.


BDD yang diperoleh dari proses deposisi dengan MPACVD merupakan Hterminated BDD (H-BDD). Hal ini dikarenakan plasma yang digunakan melibatkan penggunaan gas hidrogen. H-terminated BDD selanjutnya dioksidasi menjadi Oterminated BDD (O-BDD) melalui elektrooksidasi pada potensial tinggi. Proses ini tidak sepenuhnya mengubah gugus C-H pada permukaan BDD menjadi C-OH atau C=O, hanya meningkatkan ratio atau jumlah gugus C-OH atau C=O pada permukaan BDD. O-BDD dilaporkan memiliki potential window yang lebih lebar dan memberikan hasil pengukuran yang lebih stabil dibandingkan H-BDD. Pada penelitian ini dilakukan deposisi emas pada permukaan BDD. Sumber Au yang digunakan ialah larutan garam emas yang menyediakan ion Au 3+ sehingga penggunaan O-BDD dianggap lebih sesuai dibandingkan H-BDD.

4.2.2

Karakterisasi BDD 0,1 % dengan Spektroskopi Raman Spektroskopi Raman digunakan untuk mengkarakterisasi apakah lapisan

diamond telah berhasil dibentuk dengan baik pada permukaan substrat silica wafer. Spektrum Raman dapat menunjukkan keberadaan berbagai fasa karbon meliputi karbon amorf, grafit, diamond, dan fasa intermediet. Spektrum Raman dari H-BDD 0,1 % yang telah dibuat disajikan pada Gambar 4.6 sementara spektrum Raman pada berbagai titik pengamatan permukaan BDD disajikan pada Lampiran 4. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa lapisan diamond telah berhasil terbentuk pada seluruh permukaan silica wafer. Keberhasilan terbentuknya lapisan diamond pada penelitian ini ditunjukkan dengan munculnya puncak karbon sp 3 dari diamond dengan geseran 1332-1334 cm-1. Menurut Ivandini et al., (2005) phonon diamond akan muncul pada geseran Raman 1332 cm-1. Keberadaan boron ditunjukkan oleh adanya puncak yang lebar pada geseran Raman sekitar 500 cm -1 (Bogdanowicz et al., 2013); (Živcová et al., 2013). Selain itu, keberadaan boron ditunjukkan oleh asymmetry Fano resonance (Macpherson, 2015). Hampir tidak teramati keberadaan karbon amorf dan grafit (karbon sp2) pada geseran 1500 dan 1580 cm-1, hal ini mengindikasikan bahwa BDD dengan kualitas yang baik telah berhasil difabrikasi. 160000

120000 100000

120000

Intensity (a.u.)

Intensity (a.u.)

140000

C sp3

140000

160000

100000 80000 60000 40000

80000

20000

60000

0 200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

Pengembangan metode..., Wulan Tri Wahyuni, FMIPA UI, 2015. 40000 -1

B

Raman shift (cm )

asymmetry Fano resonance

Gambar 4.6 Spektrum Raman H-BDD 0,1%.

4.2.3

Karakterisasi BDD 0,1 % dengan Scanning Electron Microscopy (SEM) dan X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) Topografi permukaan dari elektroda H-BDD 0,1 % yang telah dibuat

dianalisis dengan menggunakan Scanning Electron Microscopy (SEM). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa partikel boron doped diamond terbentuk seragam dengan ukuran partikel sekitar 3-4 µm (Gambar 4.7). Hasil ini sesuai dengan rerata ukuran kristal boron doped diamond yang dilaporkan oleh (Levy-clement, 2005). Kristal dengan ukuran yang sama dapat diamati pada permukaan elektroda O-BDD.

(a)

(b)

Gambar 4.7 Topografi permukaan H-BDD (a) dan O-BDD (b) diperoleh dengan SEM pada perbesaran 2500 kali.

Informasi mengenai komposisi unsur penyusun elektroda H-BDD dan O-BDD diketahui melalui analisis dengan X-ray photoelectron spectroscopy (XPS). Hasil analisis XPS terhadap H-BDD dan O-BDD (Gambar 4.8) menunjukkan bahwa terdapat puncak dengan intensitas yang kuat pada energi ikatan sekitar 284 eV yang


merupakan puncak karbon dan puncak pada energi ikatan

sekitar 532 eV yang

menunjukkan keberadaan oksigen. Spektrum XPS H-BDD menunjukkan keberadaan puncak oksigen dengan intensitas rendah, hal ini dimungkinkan karena terjadinya adsorpsi oksigen pada permukaan H-BDD ataupun karena oksidasi parsial pada HBDD. Pada spektrum XPS dapat diamati bahwa intensitas puncak oksigen pada OBDD lebih besar dibandingkan H-BDD, hal ini menunjukkan bahwa anodic treatment H-BDD dalam H2SO4 telah mengoksidasi permukaan BDD. Oksidasi tersebut meningkatkan oksigen pada permukaan BDD. Menurut Azevedo, et al., (2007), dekonvolusi yang dilakukan terhadap puncak karbon dapat menunjukkan 5 puncak. Puncak dengan intensitas paling tinggi pada binding energy sekitar 284,1 eV merupakan puncak bulk diamond (C 1s) dari ikatan C-C. Puncak dengan binding energy lebih kecil (binding energy sekitar 283,5 eV) merupakan puncak karbon grafit pada BDD. Tiga puncak dengan binding energy lebih besar diduga berturut-turut menunjukkan karbon dari ikatan C-H (binding energy sekitar 284,5 eV), karbon dari ikatan C-OH (binding energy sekitar 285,2 eV), dan karbon dari gugus fungsi karbonil dengan binding energy sekitar 286 eV (Azevedo et al., 2007). Pustaka lainnya menyebutkan bahwa dekonvolusi terhadap puncak karbon dapat menunjukkan puncak ikatan karbon dengan boron (C-B) pada binding energy sekitar 285,5 eV, sementara puncak B1s muncul pada 190,5 eV (Murugaraj et al., 2012). Dekonvolusi terhadap puncak oksigen pada energi ikatan sekitar 532 eV dapat menunjukkan 4 puncak. Puncak tersebut masing-masing merupakan puncak dari oksigen yang teradsorpsi dengan binding energy sekitar 531 eV), puncak oksigen dari gugus fungsi C-OH pada binding energy sekitar 532 eV, puncak oksigen dari C=O dengan binding energy sekitar 533,5 eV dan puncak oksigen dari H2O yang teradsorpsi pada binding energy sekitar 534,5 eV (Azevedo et al., 2007).


Gambar 4.8 Spektrum XPS H-BDD dan O-BDD.

Perhitungan % atomic XPS untuk oksigen dilakukan berdasarkan intensitas puncak spektra dan bulk sensitivity factor oksigen mengacu pada (Moulder et al., 1995). Diperoleh informasi bahwa pada H-BDD persentase karbon dan oksigen berturut-turut sebesar 90,89 % dan 9,11 %, sementara pada O-BDD persentase karbon ialah 84,97 % dan oksigen ialah 15,03 %. Telah terjadi kenaikan persentase jumlah atom oksigen pada O-BDD dibandingkan dengan H-BDD, namun proses oksidasi yang dilakukan tidak mengubah semua ikatan C-H pada permukaan BDD menjadi COH.


4.2.4

Optimasi Kondisi Pembuatan BDD termodifikasi Emas dengan Metode Elektrodeposisi: Optimasi Potensial dan Waktu Deposisi Ukuran, bentuk, dan distribusi partikel Au pada permukaan elektroda BDD

selama proses nukleasi dan pertumbuhan inti Au ditentukan oleh konsentrasi garam Au yang digunakan, potensial deposisi, waktu deposisi, dan kehalusan permukaan BDD yang digunakan. Pada penelitan ini, parameter yang divariasikan ialah potensial dan waktu deposisi. Konsentrasi garam Au biasanya digunakan pada konsentrasi rendah, namun demikian perlu dipilih konsentrasi yang tidak terlalu rendah agar proses nukleasi dipastikan dapat terjadi. Garam Au yang digunakan pada penelitian ini ialah HAuCl4 dengan konsentrasi 2 mM. Deposisi garam Au pada permukaan BDD terjadi melalui reduksi Au(III) menjadi Au(0) mengikuti persamaan reaksi berikut: AuCl4 + 3e

Au + 4Cl-

Proses reduksi Au dapat mulai terjadi pada potensial sekitar 1 V vs. NHE (Kohl, 2010) atau 0,8 V vs. SSCE. Pada penelitian ini digunakan range potensial 0 hingga -0,8 V vs. SSCE pada penentuan potensial optimum deposisi Au untuk memberikan overpotensial dan memastikan terjadinya nukleasi endapan Au di permukaan BDD. Pada proses deposisi digunakan H2SO4 0,5 mM, keberadaan H2SO4 diharapkan dapat menjadi media konduksi dan menjaga agar garam Au tetap larut. Pengoptimuman potensial deposisi Au pada permukaan BDD dilakukan pada waktu konstan. Elektroda BDD termodifikasi Au (Au-BDD) yang dihasilkan selanjutnya digunakan untuk mengukur zanamivir dengan konsentrasi 1,5 x 10-4 M pada kecepatan payar 100 mV/s. Hasil yang diperoleh disajikan pada Gambar 4.9. Dapat diamati bahwa potensial deposisi Au pada permukaan BDD yang optimum untuk pengukuran zanamivir ialah pada -200 mV.


80 60

I / uA

40

E E E E E

20

= = = = =

-800 mV -600 mV -400 mV -200 mV 0 mV

0 -20 -40 -1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

E / V (vs. SSCE)

(a)

(b)

Gambar 4.9 Profil CV zanamivir 1,5 x 10-4 M pada Au-BDD dengan potensial deposisi Au bervariasi dan waktu tetap (a), Plot E terhadap I pada t konstan (b).

Optimasi waktu deposisi Au pada permukaan BDD dilakukan dengan memvariasikan waktu deposisi pada potensial optimum (-200 mV). Waktu deposisi divariasikan pada 50, 100, 150, dan 200 detik. Elektroda Au-BDD yang dihasilkan digunakan untuk mengukur zanamivir dengan konsentrasi 1,5 x 10-4 M pada kecepatan payar 100 mV/s. Hasil yang diperoleh disajikan pada Gambar 4.10. Dapat diamati bahwa besarnya arus reduksi Au meningkat seiring dengan meningkatnya waktu deposisi Au. Namun demikian besarnya arus reduksi Au pada waktu deposisi 150 dan 200 detik tidak berbeda signifikan dengan waktu deposisi 100 detik (α = 0,05). Berdasarkan hasil yang diperoleh, potensial deposisi -200 mV dan waktu deposisi 100 detik digunakan untuk menyiapkan elektroda Au-BDD pada tahapan kerja lebih lanjut.


30 25 20 15 10

I / uA

5 0 -5 -10

50 s 100 s 150 s 200 s

-15 -20 -25 -30 -35 -40

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

E / V (vs. SSCE)

(a)

(b)

Gambar 4.10 Voltamogram siklik zanamivir 1,5 x 10-4 M diukur menggunakan elektroda Au-BDD pada waktu deposisi Au bervariasi (a), Plot t terhadap I pada V kostan (b).

4.2.5

Karakterisasi Au-BDD dengan X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) dan Scanning Electron Microscopy (SEM) dan Evaluasi Stabilitas Elektroda Profil topografi dan spektrum XPS Au-BDD yang dihasilkan melalui

elektrodeposisi disajikan pada Gambar 4.11. Berdasarkan spektrum XPS dapat diketahui bahwa Au telah berhasil dideposisikan pada permukaan BDD, hal ini ditunjukkan dengan munculnya puncak Au 4f5/2 dan 4f7/2 pada energi ikatan 87 dan 83 eV. Tabel 4.1 menunjukkan % atomic dari atom C, O, dan Au pada O-BDD dan Au-O-BDD berdasarkan spektrum XPS. Dapat diamati bahwa persen atom C menurun dengan terdeposisinya Au pada permukaan BDD, penurunan tersebut tidak terjadi pada atom oksigen. Pada proses elektrodeposisi, atom Au terdeposisi secara fisik pada permukaan BDD sehingga menutupi karbon. Proses elektrodeposisi yang terjadi tidak melalui ikatan maupun interaksi kimia antara ion Au yang bermuatan positif dengan unsur oksigen yang bersifat elektronegatif. Profil topografi berdasarkan foto SEM juga menunjukkan bahwa Au telah berhasil dideposis secara homogen pada permukaan BDD dengan ukuran patikel pada kisaran 10 hingga 50 nm.


(a)

(b) Gambar 4.11 Spektra XPS (a) dan foto SEM (b) elektroda Au-BDD.

Tabel 4.1 % atom pada O-BDD dan Au-BDD berdasarkan spektrum XPS H-BDD

O-BDD

Au-BDD

C (XPS atomic %)

90,80

84,97

79,62

O (XPS atomic %)

9,11

15,03

18,82

Au (XPS atomic %)

Elektroda

Au-BDD

1,55

yang

diperoleh

dievaluasi

stabilitasnya

dengan

pengukuran zanamivir dalam PBS pH 7 sebanyak tiga puluh kali ulangan. Pengukuran


dilakukan pada jendela potensial 0 – 1500 mV dengan kecepatan 100 mV/s. Intensitas puncak arus reduksi Au yang diperoleh dari tiga puluh ulangan memiliki nilai standar deviasi sebesar 0,34 (Gambar 4.12). Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa elektroda Au-BDD yang diperoleh melalui elektrodeposisi memiliki stabilitas yang cukup baik. 0

Ip,c /µA

-5

-10

-15 0

5

10

15

20

25

30

Number of Cycles

Gambar 4.12 Stabilitas elektroda Au-BDD pada pengukuran.

4.2.6

Pembuatan BDD Termodifikasi Emas dengan Metode

Chemical

Deposition Deposisi Nanopartikel emas (AuNPs) pada permukaan BDD memerlukan teknik tertentu. AuNPs dideposisikan pada permukaan BDD antara lain dengan vacuum vapor deposition (Yagi et al., 2004) dan sputtering (Roustom et al., 2005). Namun demikian kedua metode tersebut kompleks. Cara yang lebih sederhana untuk mendeposisikan AuNPs pada permukaan BDD antara lain ialah dengan chemical deposition. Teknik ini diawali dengan memodifikasi permukaan BDD terlebih dahulu menggunakan amina. Gugus amina selanjutnya memungkinkan AuNPs terdeposisi pada permukaan BDD melalui ikatan kovalen. BDD merupakan elektroda yang dikenal memiliki stabilitas kimia dan sifat inert bahkan dalam kondisi yang sangat ekstrim. Modifikasi permukaan BDD dengan gugus fungsi tertentu memerlukan teknik yang tepat. Modifikasi permukaan BDD dengan gugus amina dapat dilakukan dengan electrochemical anodization dalam ammonia cair (Charrier et al., 2013), plasma treatment dengan gas NH3/He (Szunerits


et al., 2006), atau dengan menggunakan allylamine dengan radiasi ultraviolet 254 nm. Pada penelitian ini, aminasi dilakukan dengan menggunakan allylamine dengan radiasi ultraviolet 254 nm selama 6 jam. Gugus amina dari allylamine menempel pada permukaan BDD melalui ikatan kovalen. Ikatan kovalen terjadi melalui reaksi radikal yang diinisiasi radiasi UV. AuNPs yang digunakan pada penelitian ini disiapkan melalui reaksi reduksi larutan garam emas dalam air dengan sitrat mengacu pada metode Turkevich dan Frens. Keberadaan ion sitrat akan menstabilkan partikel AuNPs yang dihasilkan. Spektrum absorbansi UV dari koloid AuNPs yang dihasilkan menunjukkan panjang gelombang maksimum pada 518 nm (Gambar 4.13), menurut Kimling et al., (2006) panjang gelombang maksimum absorbansi koloid AuNPs berkorekasi dengan ukuran partikel AuNPs. Partikel AuNPs dengan ukuran 9 hingga 100 nm memiliki panjang gelombang absorbansi maksimum pada 518 nm hingga 565 nm.

1.0

518 nm

Absorbance

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 400

500

600

700

800

Wavelength / nm

Gambar 4.13 Panjang gelombang absorbansi maksimum koloid AuNPs. Analisis dengan Transmission Electron Microscopy (TEM) menunjukkan bahwa partikel AuNPs yang dihasilkan memiliki ukuran sekitar 15 nm (Gambar 4.14). Pada gambar terlihat bahwa nanopartikel Au memiliki ukuran yang seragam dan terpisah satu sama lain (tidak mengalami agregasi). Agregasi tidak terjadi karena keberadaan ion sitrat yang mengelilingi nanopartikel Au. Pada pH terlalu asam, nanopartikel Au dapat mengalami agregasi karena adanya gaya elektrostatik yang kuat antara ion H+ dari asam dengan ion sitrat yang bermuatan negatif. Saat ion sitrat


berinteraksi dengan H+ dari asam maka nanopartikel Au tidak lagi dikelilingi sitrat dan akan mengalami agregasi.

Gambar 4.14 Gambar nanopartikel emas (AuNPs) dengan TEM.

Deposisi AuNPs pada permukaan BDD yang telah diaminasi didasarkan pada terbentuknya ikatan kovalen partikel AuNPs dengan pasangan elektron non ikatan amina. Ikatan kovalen yang terbentuk ialah kovalen koordinasi antara pasangan elektron bebas nitrogen dengan orbital elektron kosong pada Au seperti orbital 5f dan 5g serta orbital pada kulit ke enam. Interaksi elektrostatik antara amina yang bermuatan positif dengan sitrat yang bermuatan negatif menyebabkan deposisi AuNPs pada permukaan BDD lebih efektif. Keberhasilan deposisi AuNPs pada permukaan BDD terjadi secara efektif pada pH 4 hingga 5 (Tian et al., 2006). Pada pH terlalu asam, akan terjadi aggregasi partikel AuNPs yang ditandai dengan berubahnya warna merah rubi menjadi ungu kebiruan. Sementara itu pada pH basa gugus amina pada permukaan BDD kurang terprotonasi sehingga interaksi elektrostatik amina dengan ion sitrat berkurang dan deposisi partikel AuNPs pada permukaan BDD menjadi kurang optimum. Pada penelitian ini deposisi AuNPs pada permukaan BDD dilakukan dengan menggunakan koloid AuNPs pada pH 4,5. BDD termodifikasi nanopartikel emas melalui metode chemical deposition selanjutnya disebut sebagai AuNPs-BDD. 4.2.7

Karakterisasi Elektroda AuNPs-BDD dengan X-ray Photoelectron Spectroscopy (XPS) dan Scanning Electron Microscopy (SEM) serta Evaluasi Stabilitas Elektroda Keberhasilan aminasi permukaan O-BDD ditunjukkan dengan munculnya

puncak N pada energi ikatan 400 eV (Gambar 4.15c). Puncak tersebut diduga berasal dari NH2 yang berikatan dengan karbon (ikatan C-NH2). Gambar 4.16 menunjukkan


profil topografi elektroda O-BDD dan N-BDD yang diperoleh dari foto Scanning Electron Microscopy with Energy Dispersive X-Ray Analysis (SEM-EDX). Dapat diamati keberadaan atom nitrogen yang ditunjukkan dengan titik berwarna biru tersebar merata pada permukaan O-BDD. Hal ini menunjukkan bahwa aminasi telah berhasil dilakukan pada permukaan O-BDD.

C

(e)

O

(d) (c) (b)

100

95

90

85

80

Au

75

70

(a) 65

60

Binding Energy / eV

(e)

N

(d) (c) (b) (a) 600

500

400

300

200

Binding Energy / eV

100

0

Gambar 4.15 Spektrum XPS H-BDD (a), O-BDD (b), N-BDD (c), AuNPs-BDD (d), Au-BDD (e). Inset spektrum XPS Au.


Gambar 4.16 Topografi permukaan O-BDD dan N-BDD diperoleh dengan SEM pada perbesaran 2500 kali.

Sementara itu keberhasilan deposisi AuNPs pada permukaan BDD ditunjukkan dengan munculnya dua buah puncak masing-masing Au 4f5/2 dan 4f7/2 pada energi ikatan 88 dan 84 eV (Gambar 4.15d dan inset). Intensitas kedua puncak Au pada AuNPs-BDD tersebut lebih lemah dibandingkan dengan intensitas Au pada Au-BDD (Gambar 4.15e dan inset). Hal ini berkaitan dengan jumlah partikel AuNPs yang berhasil dideposisikan. Tabel 4.2 menunjukkan persentase atom C, O, N, dan Au yang dihitung berdasarkan nisbah intensitas puncak spektra dengan bulk sensitivity factor mengacu pada Moulder et al., (1995). Dapat diamati bahwa proses aminasi permukaan BDD dengan allylamine diikuti dengan menurunnya persentase atom karbon, sementara persen atom oksigen relatif tetap. Hal ini menunjukkan bahwa oksigen tidak terlibat secara

langsung

dalam

pembentukan

ikatan

kovalen

yang

menyebabkan

menempelnya amina pada permukaan BDD. Ikatan kovalen diduga terjadi melalui reaksi radikal antara allylamina dengan permukaan BDD. Reaksi diawali dengan abstraksi hidrogen dari ikatan C-H pada permukaan BDD oleh radiasi ultraviolet. Karbon radikal yang terbentuk pada permukaan BDD selanjutnya membentuk ikatan kovalen melalui reaksi radikal dengan karbon berikatan rangkap pada allylamina. Dugaan reaksi yang terjadi ialah sebagai berikut: BDD-H → BDD∙ + H∙ BDD∙ + H∙ + CH2=CHCH2NH2 → BDD-CH2CH2CH2NH2 Tabel 4.2 % atom berdasarkan spektrum XPS untuk BDD dan modified BDD O-BDD

N-BDD

AuNPs-BDD

C (XPS atomic %)

84,97

72,10

73,12

O (XPS atomic %)

15,03

15,14

14,64

12,76

11,40

N (XPS atomic %) Au (XPS atomic %)

0,84 .


Gambar 4.17 menunjukkan profil topografi elektroda AuNPs-BDD yang diperoleh dari foto SEM. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa metode chemical deposition telah berhasil mendeposisikan AuNPs pada permukaan amine terminatedBDD. Nanopartikel Au ditunjukkan dengan bulir warna putih pada permukaan AuNPs-BDD. Sementara itu Gambar 4.18 menunjukkan hasil analisis SEM-EDX masing-masing unsur Au, C, N, dan O pada elektroda AuNPs-BDD. Gambar 4.18 mengkonfirmasi bahwa Au telah berhasil dideposisikan pada permukaan amine terminated-BDD. Elektroda BDD termodifikasi emas yang dihasilkan melalui chemical deposition ini selanjutnya disebut sebagai AuNPs-BDD.

Gambar 4.17 Topografi permukaan AuNPs-BDD diperoleh dengan SEM.


Gambar 4.18 Analisis unsur Au (merah), C (hijau), N (biru muda), dan O (biru) pada elektroda AuNPs- BDD diperoleh dengan SEM-EDX.

Elektraoda AuNPs-BDD yang diperoleh dievaluasi stabilitasnya dengan digunakan dalam pengukuran zanamivir dalam PBS pH 7 sebanyak tiga puluh kali ulangan. Pengukuran dilakukan pada jendela potensial 0 – 1500 mV dengan kecepatan 100 mV/s. Intensitas puncak arus reduksi Au yang diperoleh dari tiga puluh ulangan pengukuran memiliki nilai standar deviasi sebesar 0,09 (Gambar 4.19). Hasil yang tersebut menunjukkan bahwa elektroda AuNPs-BDD memiliki stabilitas yang baik.

0

Ip,c /µA

-5

-10

-15

0

5

10

15

20

25

30

Number of Cycles

Gambar 4.19 Stabilitas elektroda AuNPs-BDD pada pengukuran.


4.3

PENGUKURAN ELEKTROKIMIA ZANAMIVIR PADA ELEKTRODA EMAS, Au-BDD, dan AuNPs-BDD

4.3.1 Penentuan Kecepatan Payar Pengukuran Zanamivir Kecepatan payar pengukuran zanamivir divariasikan pada kecepatan 25 mV/s hingga 250 mV/s. Larutan zanamivir dalam PBS 0,1 M digunakan untuk pengukuran. Peningkatan kecepatan payar berkorelasi dengan meningkatnya puncak arus oksidasi

I / uA

dan reduksi Au yang terdeteksi (Gambar 4.20). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60

Scan rate / mVs

-1

25 50 100 150 200 250

-1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

E / V (vs. SSCE)

Gambar 4.20 Profil voltametri siklik zanamivir 1,5 x 10-4 M dalam PBS pH 7 pada berbagai kecepatan payar.

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa terjadi hubungan linear antara akar kecepatan payar (v1/2) dengan arus reduksi emas mengikuti persamaan RandlesSevcik (Gambar 4.21). Hal ini menunjukkan bahwa transfer massa dari larutan ke permukaan elektroda dikontrol oleh difusi. Pada penelitian ini kecepatan payar 100 mV/s dipilih untuk pengukuran selanjutnya.


(b)

(a)

(c) Gambar 4.21 Kurva hubungan akar kecepatan payar dengan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), dan AuNPs-BDD (c).

Besarnya koefisien difusi ditentukan dengan pengukuran arus pada potensial reduksi emas. Berdasarkan persamaan Cottrell diperoleh koefisien difusi pengukuran zanamivir pada elektroda emas dan BDD termodifikasi emas masing-masing 1,71 x 10-8 cm2s-1 dan 3,54 x 10-8 cm2s-1.

Menurut (Wong et al., 2015), koefisien

nanopartikel emas dalam air ialah sebesar 1,53 x 10 -7 cm2s-1. Sementara itu nilai koefisien difusi air dalam air murni ialah 2,27 x 10 -5 cm2s-1 (Tanaka, 1978) dan koefisien difusi H+ dalam air ialah 8,1 x 10-5 cm2s-1 (Wraight, 2006). Nilai koefisien difusi yang diperoleh dari percobaan tidak sama dengan nilai koefisien difusi spesispesi yang terlibat dalam reaksi oksidasi dan reduksi emas. Dimungkinkan nilai tersebut merupakan nilai koefisien difusi zanamivir. Perhitungan nilai koefisien difusi disajikan pada Lampiran 5.

4.3.2

Potential Window Pengukuran Zanamivir


Pengukuran zanamivir dengan elektroda kerja Au, Au-BDD, dan AuNPs-BDD dilakukan berdasarkan puncak arus

oksidasi dan reduksi Au. Dengan demikian

potential window yang digunakan ialah pada daerah potensial terjadinya oksidasi dan reduksi emas. Profil voltametri siklik zanamivir 1,5 x 10-4 M dalam PBS pH 7 pada berbagai potential window disajikan pada Gambar 4.22. Oksidasi dan reduksi emas dapat diamati pada potential window 0 hingga 1000 mV. Namun demikian, saat potential window dilebarkan hingga potensial +1500 mV dapat diamati bahwa puncak reduksi Au2O3 memiliki intensitas lebih kuat. Hal ini diduga berkaitan dengan ketersediaan ion H+ di elektroda sebagai hasil dari reaksi oksidasi air atau akibat berkurangnya jumlah H2O di permukaan elektroda akibat oksidasi air sehingga kesetimbangan reaksi redoks emas bergeser ke arah reduksi Au 2O3. Dapat diamati juga terjadinya pergeseran puncak reduksi yang menunjukkan bahwa reduksi Au 2O3

I / uA

memerlukan potensial yang lebih negatif. 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -0.2

0 - 1000 mV 0 - 1100 mV 0 - 1200 mV 0 - 1300 mV 0 - 1400 mV 0 - 1500 mV

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

E / V (vs. SSCE)

1.2

1.4

1.6

-4

Gambar 4.22 Profil voltametri siklik zanamivir 1,5 x 10 M dalam PBS pH 7 pada

berbagai potential window.

4.3.3

Linearitas dan Presisi Pengukuran Zanamivir Hubungan konsentrasi zanamivir dengan puncak arus reduksi Au pada

elektroda Au dan Au-BDD diamati dengan memvariasikan konsentrasi zanamivir pada selang konsentrasi 1,5 x 10-12 M hingga 1,5 x 10-4 M. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa terjadi hubungan logaritmik antara konsentrasi zanamivir dengan puncak arus reduksi Au pada rentang konsentrasi tersebut. Saat rentang konsentrasi dipersempit, hubungan linear antara konsentrasi zanamivir dengan puncak arus


oksidasi dan reduksi Au dapat diamati pada kisaran 1 x 10-5 M hingga 1 x 10-4 M pada elektroda Au dan 5 x 10-6 M hingga 1 x 10-4 M pada elektroda Au-BDD. Hubungan linear yang dibangun berdasarkan puncak arus reduksi memberikan nilai koefisien determinasi yang lebih baik dibandingkan hubungan linear berdasarkan puncak arus oksidasi Au, baik pada elektroda Au maupun Au-BDD. Berdasarkan hasil yang diperoleh, elektroda Au-BDD lebih dipilih untuk pengukuran neuraminidase dibandingkan elektroda Au karena elektroda Au-BDD memberikan daerah linear pada kisaran yang lebih lebar dengan koefisien determinasi yang lebih baik. Pengukuran dengan menggunakan elektroda AuNPs-BDD menunjukkan hubungan konsentrasi zanamivir dengan puncak arus reduksi Au mengikuti profil logaritmik pada selang konsentrasi 1 x 10-6 M hingga 1 x 10-4 M. Hasil ini konsisten dengan pengukuran pada elektroda Au dan Au-BDD yang menunjukkan bahwa pada rentang konsentrasi lebar hubungan antara konsentrasi zanamivir dengan puncak arus reduksi Au mengikuti profil logaritmik. Profil linear pada pengukuran dengan elektroda AuNPs-BDD diperoleh pada selang konsentrasi zanamivir 1 x 10 -6 M hingga 1 x 10-5 M. Gambar 4.23 menunjukkan voltamogram siklik zanamivir yang diukur dengan elektroda Au, Au-BDD, dan AuNPs-BDD pada masing-masing daerah linearnya, sementara Gambar 4.24 menunjukkan kurva hubungan konsentrasi zanamivir dengan puncak arus reaksi reduksi dan oksidasi emas pada elektroda Au, Au-BDD, dan AuNPs-BDD. Limit deteksi (LOD) pengukuran zanamivir ditentukan untuk mengetahui konsentrasi terkecil zanamivir yang dapat dideteksi dan dibedakan dari blanko. Nilai Y untuk menentukan LOD dihitung berdasarkan persamaan 3So + a, a merupakan intersept persamaan kurva kalibrasi sementara So merupakan standar deviasi blanko. Nilai Y yang diperoleh selanjutnya dimasukkan ke dalam persamaan regresi untuk menentukan konsentrasi yang merupakan nilai LOD. Berdasarkan kurva kalibrasi hubungan konsentrasi zanamivir dengan puncak arus reduksi Au pada kisaran konsentrasi linear, diperoleh LOD pengukuran zanamivir pada elektroda Au-BDD sebesar 1,49 x 10-6 M dan pada elektroda AuNPs-BDD sebesar 2,29 x 10-6 M. Contoh perhitungan penentuan nilai LOD disajikan pada Lampiran 6. 500 400 300

I / uA

200 100

[Zanamivir] / uM PBS 10 25 50 75 100

0 -100

Pengembangan metode..., Wulan Tri Wahyuni, FMIPA UI, 2015. -200

(a)

(b)

20 15

[Zanamivir] / uM

I (uA)

10 5

PBS 1.0 2.5 5.0 7.5 10

0 -5 -0.2 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E / V (vs. SSCE)

(c) Gambar 4.23 Profil voltametri siklik zanamivir pada berbagai konsentrasi dalam PBS diukur dengan elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), dan AuNPs-BDD (c).

(a)


(b)

(b)

(c)

Gambar 4.24 Profil logaritmik dan kalibrasi linear konsentrasi zanamivir vs. puncak arus reduksi Au pada elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), dan AuNPs-BDD (c).

Presisi pengukuran zanamivir dengan elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD ditentukan melalui pengukuran larutan zanamivir dalam PBS pada kecepatan payar 100 mV/s sebanyak 9 kali ulangan pada tiga level konsentrasi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa puncak arus reduksi yang terukur sebanyak 9 kali ulangan memiliki presisi yang cukup baik dengan nilai %RSD sebesar 0,5 % pada elektroda Au-BDD dan 2,23 % pada elektroda AuNPs-BDD. Hal ini menunjukkan bahwa pengukuran zanamivir dengan elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD memiliki keterulangan yang baik. Ringkasan hasil pengukuran zanamivir disajikan pada Tabel 4.3


Tabel 4.3 Ringkasan pengukuran zanamivir dengan elektroda emas dan BDD termodifikasi emas Elektroda Parameter

Au

Au-BDD

-5

Kisaran Linearitas (M)

1 x 10 -1 x 10

R2 puncak oksidasi

-4

5 x 10 - 1 x 10

0,960

2

R puncak reduksi

AuNPs-BDD

-6

-4

1 x 10-6 - 1 x 10-5

0,990

0,969

0,946

0,990 -5

0,998

1,53 x 10

-6

1,89 x 10-5

LOD (M) puncak oksidasi

1,25 x 10

LOD (M) puncak reduksi

1,19 x 10-5

1,49 x 10-6

2,29 x 10-6

%RSD (n= 9) puncak oksidasi

2,55

1,14

>10

%RSD (n= 9) puncak reduksi

0,33

0,5

2,23

puncak oksidasi (mA/M)

363,4

40,3

68,8

puncak reduksi (mA/M)

1571,7

34,8

46,9

Sensitivitas

4.4

PENGUKURAN ENZIM NEURAMINIDASE PADA ELEKTRODA AuBDD DAN AuNPs-BDD Profil zanamivir dalam PBS yang mengandung neuraminidase (NA) dan tidak

mengandung NA disajikan pada Gambar 4.25. Dapat diamati bahwa larutan zanamivir dalam PBS yang mengandung NA memiliki intensitas puncak arus reduksi Au lebih besar dibandingkan yang tidak mengandung NA. Hal ini diduga terjadi karena adanya interaksi antara sisi aktif NA dengan gugus fungsi pada struktur zanamivir, termasuk gugus fungsi guanidine. Interaksi NA dengan zanamivir dapat berupa ikatan hidrogen maupun interaksi dwikutub-dwikutub (Ramachandran et al., 2012). Terikatnya zanamivir pada sisi aktif NA menyebabkan jumlah zanamivir bebas dalam larutan menjadi berkurang. Hal ini menyebabkan jumlah zanamivir yang teradsorpsi pada permukaan elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD menjadi berkurang sehingga intensitas puncak arus reduksi Au lebih besar. Ilustrasi mekanisme yang terjadi saat NA berinteraksi dengan zanamivir dan meningkatkan puncak oksidasi dan reduksi emas disajikan pada Gambar 4.26. -0.5

40

20

-4

Zan 1 x 10 M in PBS Zan + NA in PBS

-1.5

Zan 1 x 10 M in PBS Zan + NA in PBS

10

I / uA

0

-2.0 35

25 20

-20

15 10

-3.0

5 0 -5

-30 -0.2

30

-2.5

-10

I / uA

I / uA

-5

-1.0

30

-0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

-3.5

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

E / V (vs. SSCE)

0.3

0.4

0.5


E / V (vs. SSCE)

E / V (vs. SSCE)

0.6

0.7

(a)

(b)

Gambar 4.25 Profil voltametri siklik zanamivir 1 x 10-4 M dengan adanya NA (garis merah) dan tidak ada NA (garis hitam).

Gambar 4.26 Ilustrasi mekanisme meningkatnya arus reduksi Au akibat reaksi inhibisi NA - zanamivir. 4.4.1

Pengoptimuman pH dan Waktu Reaksi Enzim Neuraminidase Suhu dan pH merupakan parameter yang penting bagi aktivitas enzim. Pada

penelitian ini suhu reaksi enzimatis yang digunakan ialah 37 ◦C, mengacu pada assay enzim NA yang umum dilakukan (Ye et al., 2012). Sementara itu pH reaksi enzimatik divariasikan pada pH 4; 4,5; 5; 5,5; 6; 7; dan 8. Aktivitas optimum NA diperoleh pada pH 5,5 (Gambar 4.27a). Hasil ini sesuai dengan informasi dari keterangan produk Sigma Aldrich yang menyatakan bahwa aktivitas optimum NA dari bakteri C. perfringens yang digunakan pada penelitian ini memiliki aktivitas optimum pada kisaran pH 5 hingga 5,5. Aktivitas NA dari C. perfringens masih bisa dipertahankan hingga pH 7, namun akan menurun pada pH di atas 7. Pengukuran aktivitas enzim lebih lanjut dilakukan pada pH 5,5. Zanamivir merupakan inhibitor kompetitif bagi substrat enzim NA. Seperti halnya interaksi NA dengan substratnya, interaksi NA dengan zanamivir akan


dipengaruhi oleh waktu inkubasi. Pada waktu inkubasi optimum, NA memiliki kesempatan yang cukup untuk berinteraksi dengan zanamivir sehingga jumlah zanamivir bebas yang dapat teradsorpsi pada permukaan elektroda kerja akan berkurang. Waktu kontak enzim neuraminidase dengan zanamivir divariasikan pada kisaran waktu 10 hingga 40 menit. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa waktu kontak optimum ialah 25 menit (Gambar 4.27b). Penelitian lain melaporkan waktu inkubasi pada uji aktivitas NA selama 30 menit (Ye et al., 2012).

Gambar 4. 27 Penentuan pH (a) dan waktu inkubasi (b) optimum reaksi enzim NA 10 mU dengan zanamivir 1 x 10-4 M.

4.4.2

Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase pada Elektroda AuBDD dan AuNPs-BDD Pengukuran enzim neuraminidase (NA) dilakukan pada selang konsentrasi 0

hingga 15 mU. Konsentrasi zanamivir yang digunakan ialah 1 x 10-4 M pada pengukuran dengan elektroda Au-BDD dan 1 x 10-5 M pada pengukuran dengan elektroda AuNPs-BDD. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa terjadi korelasi linear antara konsentrasi NA dengan puncak arus oksidasi dan reduksi Au. Kalibrasi linear antara konsentrasi NA dengan puncak arus reduksi Au menunjukkan korelasi yang lebih baik (r2 > 0,99) dibandingkan dengan kalibrasi linear antara konsentrasi NA dengan puncak arus oksidasi Au baik pada elektroda Au-BDD maupun AuNPsBDD. Daerah linear untuk elektroda Au-BDD ialah pada rentang konsentrasi 0 – 15 mU sementara untuk AuNPs-BDD pada konsentrasi 0 – 12 mU. Limit deteksi (LOD) untuk pengukuran NA ialah sebesar 0,25 mU (30,86 ng/mL) dan 0,12 mU (14,81 ng/mL) masing-masing untuk kalibrasi linear berdasarkan puncak arus reduksi pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD. Sementara itu, LOD yang diperoleh


berdasarkan puncak arus oksidasi lebih besar baik pada elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD. Metode yang dikembangkan memiliki LOD yang dapat dibandingkan dengan metode yang telah digunakan sebelumnya, seperti enzimatic assay dengan LOD sebesar 6,5 mU (Yang et al., 2012), immunocapture ELISA LOD sebesar 7,4 ng/mL (Gerentes et al., 1998), dan LC/MS/MS dengan LOD sebesar 1 µg/mL (Williams et al., 2012). Gambar 4.28 menunjukkan profil voltamogram siklik pengukuran NA berbagai konsentrasi dan kurva kalibrasi linear yang diperoleh untuk kedua elektroda kerja yang digunakan. Pengukuran NA menggunakan elektroda bare Au menunjukkan fenomena yang sama, namun lineritas pengukuran tidak memuaskan (Lampiran 7). Presisi pengukuran NA dievaluasi dengan melakukan pengukuran sebanyak 9 kali ulangan pada 3 level konsentrasi. Diperoleh nilai % RSD pengukuran NA berdasarkan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD berturut-turut sebesar 1,18 % dan 2,49 %. Hal ini menunjukkan bahwa pengukuran NA berdasarkan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD memiliki presisi yang baik. Sementara itu, pengukuran NA berdasarkan puncak arus oksidasi Au memiliki presisi yang kurang memuaskan, terutama pada elektroda AuNPs-BDD. Tabel 4.4 menunjukkan ringkasan hasil pengukuran NA pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD. 40 30

I / uA

20 10 0

[NA] (mU) 0 0.5 1.0 6.0 8.0 10.0 12.0 15.0

-10 -20 -30 -0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E / V (vs.SSCE)

(a) 0.0 -0.5 -1.0

[NA] / mU 0 0.5 1 2 4 8 12

-2.0 45 40

-2.5

35 30

[NA] / mU

25

-3.0

I (uA)

I / uA

-1.5

20 15 10

0 0.5 1.0 2.0 4.0 8.0 12

5

-3.5

0 -5 -0.2 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E /V (vs. SSCE)

-4.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

E / V (vs. SSCE)

(b)


Gambar 4.28 Profil voltametri siklik zanamivir dengan keberadaan NA berbagai konsentrasi dan kurva kalibrasi linear pengukuran NA berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b).

Tabel 4.4 Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dengan elektroda BDD termodifikasi emas Elektroda Parameter

Au-BDD

AuNPs-BDD

0 – 15

0 – 12

2

0,956

0,938

2

R puncak reduksi

0,996

0,997

LOD (mU) puncak oksidasi

0,54

1,64

LOD (mU) puncak reduksi

0,25

0,12


3,08

>10


1,18

2,49

Kisaran Linearitas (mU) R puncak oksidasi

4.4.3

Stabilitas Elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD pada Pengukuran Neuraminidase Evaluasi stabilitas elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD dalam pengukuran

neuraminidase dilakukan melalui pengukuran NA dengan konsentrasi yang sama sebanyak tiga puluh kali. Pengukuran dilakukan pada jendela potensial 0 – 1500 mV dengan kecepatan 100 mV/s. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa elektroda AuBDD maupun AuNPs-BDD memiliki stabilitas yang cukup baik, ditunjukkan dengan nilai standar deviasi tiga puluh kali ulangan pengukuran puncak arus reduksi emas pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD masing-masing sebesar 0,17 dan 0,14. Gambar 4.29 menunjukkan profil jumlah pengukuran dengan puncak arus yang diperoleh.


0

Ip,c /µA

-5

-10

-15 0

5

10

15

20

25

30

Number of Cycles 0

(a)

Ip,c /µA

-5

-10

-15

0

5

10

15

20

25

30

Number of Cycles

(b) Gambar 4.29 Stabilitas elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b) pada pengukuran NA. 4.4.4

Pengaruh Kecepatan Payar pada Pengukuran Enzim Neuraminidase Pengukuran NA pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD dilakukan dengan

kecepatan payar yang berbeda pada variasi kecepatan 25 mV/s hingga 250 mV/s. Peningkatan kecepatan payar berkorelasi dengan meningkatnya arus reduksi yang terdeteksi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pada elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD terjadi hubungan linear antara akar kecepatan payar (v 1/2) dengan puncak arus reduksi Au. Hubungan linear yang terjadi mengikuti persamaan Randles-Sevcik (Gambar 4.30). Hal ini menunjukkan bahwa transfer massa dari larutan ke permukaan elektroda saat ada NA dikontrol oleh difusi, sama dengan saat tidak ada NA dalam larutan. 80

I / uA

60 40 20

Scan rate / mVs

-1

25 50 100 150 200 250

Pengembangan metode..., Wulan Tri Wahyuni, FMIPA UI, 2015. 0

(a) 0 -1 -2

I / uA

-3 -4 scan rate / mVs

-5 -6

-8 -9

25 50 100 150 200 250

100 80

I / uA

-7

60 40 20 0 -20 -0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E / V (SSCE)

0.0

0.2

(b)

-1

0.4

0.6

0.8

E / V (vs.SSCE)

Gambar 4.30 Kurva hubungan akar kecepatan payar dengan puncak arus reduksi Au saat ada NA pada elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b).

4.4.5

Pengaruh Matriks Mucin pada Pengukuran Enzim Neuraminidase dengan Elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD Mucin merupakan salah satu komponen mayor dalam matriks sampel cairan

hidung maupun air liur. Pada penelitian ini pengaruh matriks mucin terhadap pengukuran NA diamati dengan menggunakan mucin Bovine Submaxillary Glands type I-S M3895 (Sigma Aldrich) dengan konsentrasi 0,33 mg/mL. Mucin dari Bovine Submaxillary Glands dilaporkan mengandung berbagai glikoprotein dengan beragam karbohidrat yang terikat pada protein, 9 – 17 % di antaranya ialah sialic acid yang merupakan substrat bagi NA (Aldrich, 2014). Pengaruh mucin terhadap pengukuran NA diamati pada selang konsentrasi NA 0 hingga 15 mU. NA masih dapat dideteksi dengan keberadaan mucin pada konsentrasi yang digunakan. Bertambahnya konsentrasi NA berkorelasi dengan meningkatnya puncak arus oksidasi dan reduksi Au yang terukur (Gambar 4.31).


Kalibrasi linear antara konsentrasi NA dengan puncak arus reduksi Au menunjukkan koefisien determinasi (r2) lebih rendah dibandingkan koefisien determinasi yang didapat saat NA diukur tanpa keberadaan mucin, baik pada elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD. Namun demikian limit deteksi dan presisi pengukuran menunjukkan pengaruh mucin tidak terlalu berarti teradap pengukuran NA. Limit deteksi pengukuran NA dalam matriks mucin berdasarkan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD berturut-turut ialah sebesar 0,2 mU dan 0,36 mU. LOD yang diperoleh berdasarkan puncak arus oksidasi pada elektroda Au-BDD ialah 0,19 mU sementara pada elektroda AuNPs-BDD sebesar 0,66 mU. Presisi pengukuran NA dalam matriks mucin dievaluasi dengan melakukan pengukuran sebanyak 9 kali ulangan pada 3 level konsentrasi. Diperoleh nilai % RSD sebesar 0,71 % dan 1,44 % berturut-turut untuk pengukuran berdasarkan puncak arus reduksi Au dengan elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD. Nilai %RSD pengukuran NA berdasarkan puncak arus oksidasi Au ialah 1,31 % dan 4,69%. Hal ini menunjukkan bahwa pengukuran NA dalam matriks mucin dengan elektroda AuBDD maupun Au-NPs-BDD memiliki presisi yang baik. Tabel 4.5 menunjukkan ringkasan hasil pengukuran NA dalam matriks mucin pada elektroda Au-BDD dan AuNPs-BDD. Tabel 4.5 Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dalam matriks mucin dengan elektroda BDD termodifikasi emas Elektroda

Parameter Au-BDD

AuNPs-BDD

Kisaran Linearitas (mU)

0 – 15

0 – 12

R2 puncak oksidasi

0,975

0,949

R puncak reduksi

0,989

0,992


0,19

0,66


0,20

0,36


1,31

4,69


0,71

1,44

2

[NA] / mU 70 60 50 40

I / uA

30 20 10

0 0.5 1.0 2.0 4.0 6.0 8.0 12.0 15.0

0 -10 -20 -30 -40 -0.2 0.0

0.2

0.4


0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

(a) 0 -2 -4

I / uA

[NA] / mU -6 -8

35

[NA] / mU

30

0 0.5 1 2 4 8 12

25

I / uA

-10

0 0.5 1 2 4 8 12

40

20 15 10 5 0 -5 -10 -15 -0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

E / V (vs.SSCE)

-12

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

E / V (vs. SSCE)

(b) Gambar 4.31 Profil voltametri siklik pengukuran NA berbagai konsentrasi dalam matriks mucin dan kurva kalibrasi linear pengukuran NA dalam matriks mucin berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda Au-BDD (a) dan AuNPs-BDD (b). 4.5

PENGUKURAN NEURAMINIDASE DENGAN ZANAMIVIR YANG DIIMMOBILISASI PADA MAGNETIC BEADS MENGGUNAKAN ELEKTRODA Au-BDD

4.5.1

Immobilisasi Zanamivir pada Sistem Magnetic Beads Zanamivir terlebih dahulu dikonjugasi dengan biotin sebelum diimmobilisasi

pada magnetic beads. Hal ini dilakukan dengan mereaksikan zanamivir dengan sulfoNHS-biotin pada pH 7. Gugus amina pada zanamivir akan berikatan dengan gugus karboksilat pada biotin melalui ikatan kovalen dan sulfo-NHS akan terlepas. Setelah terkonjugasi, zanamivir-biotin selanjutnya dicampurkan dengan magnetic beadsstreptavidin. Biotin akan berinteraksi dengan streptavidin melalui ikatan hidrogen dan gaya van der waals sehingga akhirnya zanamivir dapat diimmobilisasi pada magnetic beads (Gambar 4.32). Satu buah streptavidin dapat berinteraksi dengan 4 buah biotin sehingga dapat diasumsikan terdapat 4 zanamivir termodifikasi biotin yang dapat diimobilisasi pada magnetic beads.


Gambar 4.32 Ilustrasi reaksi konjugasi zanamivir dengan biotin dan immobilisasi pada magnetic beads. Keberhasilan proses biotinilasi zanamivir dibuktikan dengan melakukan pengukuran FTIR terhadap zanamivir, biotin, dan zanamivir-biotin yang telah dikonjugasikan dengan magnetic beads. Pengukuran terhadap zanamivir-biotin yang berbentuk larutan dilakukan, namun hasil yang diperoleh sulit diinterpretasi karena puncak pelarut air yang sangat kuat menutupi puncak gugus fungsi lainnya (Lampiran 8). Ikatan kovalen terbentuk antara gugus karboksilat biotin dengan gugus amina dari zanamivir membentuk amida. Hilangnya atau berkurangnya intensitas puncak amina primer dari gugus guanidine zanamivir dapat membuktikan keberhasilan proses biotinilasi yang dilakukan. Amina primer ditunjukkan oleh munculnya dua puncak pada daerah uluran N-H pada daerah 3500-3100 cm-1 dan tekukan N-H pada daerah 1640-1550 cm-1. Gambar 4.33 menunjukkan spektrum FTIR dari zanamivir serta zanamivir yang telah dikonjugasi. Dapat diamati bahwa spektra FTIR zanamivir menunjukkan keberadaan amina primer berupa puncak uluran N-H pada daerah sekitar 3300 cm-1 dan puncak tekuk N-H pada daerah 1600 cm-1. Puncak NH2 dari gugus guanidine zanamivir tidak teramati pada spektra zanamivir-biotin-streptavidin. Pada spectra zanamivir-biotin-MB teramati puncak pada bilangan gelombang 2850 cm-1 yang merupakan uluran gugus C-H, puncak ini teramati pada zanamivir dan bition, pada magnetic beads puncak ini sangat lemah. Hilangnya serapan gugus sulfo


dari sulfo-NHS-biotin pada bilangan gelombang 1350 cm-1 juga dapat menunjukkan keberhasilan proses biotinilasi. Keberhasilan

proses

biotinilasi

dibuktikan

juga

dengan

pengukuran

elektrokimia. Ketika zanamivir berhasil dikonjugasi dengan biotin, saat ditambahkan NA akan terjadi interaksi antara zanamivir dengan NA. Gambar 4.34 menunjukkan bahwa saat NA ditambahkan ke dalam larutan uji, terjadi penurunan puncak arus reduksi Au. Hal ini diduga terjadi karena zanamivir tidak dapat berinteraksi sempurna dengan NA, tidak seperti saat zanamivir belum dikonjugasikan dengan biotin (saat zanamivir bebas). Gugus fungsi zanamivir yang digunakan untuk berinteraksi dengan NA telah digunakan untuk berikatan dengan biotin pada proses biotinilasi. Namun demikian, besarnya penurunan puncak arus reduksi yang terjadi tidak sebesar pada sistem biotin tanpa zanamivir. Hal ini menunjukkan proses biotinilasi telah berhasil mengkonjugasikan zanamivir dengan biotin dan mengimobilisasi zanamivir pada magnetic beads. Zanamivir Sulfo-NHS-biotin MB-streptavidin Zanamivir-biotin-streptavidin-MB

4000

3500

3000

2500

2000

1500

Wavenumber / cm

1000

500

-1

Gambar 4.33 Spektrum FTIR zanamivir, biotin, magnetic beads, dan zanamivirbiotin-magnetic beads.

20

20

15

15 MB-Zan MB-Zan-NA

5 0

5

MB-Biotin MB-Biotin-NA

0 -5

-5 -10

10

I / uA

I / uA

10

-10 Tri Wahyuni, FMIPA UI, 2015. Pengembangan metode..., Wulan

ΔI = 0.74 µA

ΔI = 0.97 µA

Gambar 4.34 Voltamogram siklik sistem MB-zanamivir dan MB-biotin.

4.5.2

Optimasi Konsentrasi Magnetic Beads pada Immobilisasi Zanamivir Magnetic beads yang digunakan pada proses immobilisasi zanamivir perlu

dioptimasi. Jumlah magnetic beads yang terlalu banyak dapat menutupi seluruh elektroda dan pada akhirnya mengganggu pengukuran, sementara bila magnetic beads terlalu sedikit immobilisasi zanamivir tidak efektif. Optimasi jumlah magnetic beads yang digunakan divariasikan pada 40 hingga 200 µg. Magnetic beads-streptavidin dengan jumlah bervariasi dikonjugasikan dengan zanamivir-biotin pada konsentrasi yang konstan. Jumlah magnetic beads menjadi faktor pembatas dalam proses konjugasi yang dilakukan. Hasil yang diperoleh

menunjukkan bahwa jumlah

magnetic beads 120 µg paling optimum digunakan (Gambar 4.35). Jumlah magnetic beads 120 µg digunakan pada pengukuran selanjutnya. -61

I p,c / µA

-62 -63 -64

-65 -66 0

40 80 120 160 Magnetic beads / µg

200

Gambar 4.35 Optimasi jumlah magnetic beads pada immobilisasi zanamivir. 4.5.3

Linearitas dan Presisi Pengukuran Neuraminidase pada Sistem Magnetic Beads Elektroda Au-BDD yang digunakan pada pengukuran NA pada sistem

magnetic beads disiapkan melalui teknik voltammetri siklik. Elektroda BDD


dioksidasi terlebih dahulu melalui anodic treatment pada potensial 3 V selama 20 menit dalam H2SO4 0,1 M. Selanjutnya deposisi Au pada permukaan BDD dilakukan dengan siklik voltammetri terhadap elektroda O-BDD dalam 1 mM K2AuCl4 dalam 0,1 M H2SO4 sebanyak 100 kali siklik pada potensial 0 sampai 1 V dengan kecepatan payar 100 mV/s. Profil XPS dari elektroda yang diperoleh (Gambar 4.36) menunjukkan Au telah berhasil dideposisi pada permukaan BDD.

Gambar 4.36 Profil XPS elektroda Au-BDD yang diperoleh dengan teknik voltametri siklik.

Linearitas NA pada sistem pengukuran dengan menggunakan magnetic beads diamati pada rentang konsentrasi NA 0 hingga 15 mU. Zanamivir-biotin-streptavidinMB pada kondisi optimum dari tahap 4.5.2 direaksikan dengan NA pada berbagai konsentrasi dan diinkubasi pada suhu 37 ◦C selama 25 menit. Setelah reaksi dihentikan, larutan diukur dengan elektroda Au-BDD menggunakan sel yang dilengkapi dengan magnetic bar seperti Gambar 3.2. Hasil pengukuran disajikan pada Gambar 4.37. Pengamatan berdasarkan puncak arus reduksi Au menunjukkan bahwa bertambahnya konsentrasi NA berkorelasi dengan menurunnya intensitas puncak arus reduksi Au. Fenomena ini berkebalikan dengan hasil yang diperoleh pada sistem yang tidak menggunakan magnetic beads. Hal ini diduga terjadi karena gugus fungsi pada zanamivir telah digunakan saat konjugasi dengan biotin sehingga ketika NA direaksikan dengan zanamivir-biotin-streptavidin-MB interaksi antara NA dengan zanamivir sangat lemah atau bahkan tidak terjadi. Kendatipun interaksi antara


zanamivir dengan NA terjadi, interaksi tersebut tidak dapat melepaskan zanamivir dari ikatan kovalennya dengan biotin. Zanamivir tetap terimobilisasi pada magnetic beads yang menempel pada permukaan elektroda. Keberadaan NA diduga dapat menambah tertutupnya permukaan elektroda Au-BDD sehingga menyebabkan intensitas puncak arus

reduksi emas berkurang. Pengukuran NA secara mandiri

(tanpa zanamivir) pada elektroda Au menunjukkan bahwa keberadaan NA tidak menurunkan puncak arus reduksi emas secara bermakna. Sementara pengukuran NA secara mandiri pada elektroda Au-BDD menunjukkan keberadaan NA dapat penurunan puncak arus reduksi emas, namun penurunan tersebut tidak linear terhadap konsentrasi NA (Lampiran 9). Ilustrasi untuk fenomena yang terjadi pada pengukuran NA dengan sistem magnetic beads disajikan pada Gambar 4.38. 120

[NA] / mU

100

0 2 4 8 12 15

80

I / uA

60 40 20 0 -20 -40 -0.2 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E / V (vs. SSCE)

(a) 60

Peak current / µA

40

y = -2,4168x + 44,386 R² = 0,8382

20

Reduction peak Oxidation peak

0

y = 0,623x - 18,778 R² = 0,959

-20 -40

0

3 6 9 12 Neuraminidase Concentration / mU

(b)


15

Gambar 4.37 Profil voltametri siklik pengukuran NA berbagai konsentrasi pada sistem magnetic beads dengan elektroda Au-BDD (a), kurva kalibrasi pengukuran NA pada sistem magnetic beads dengan elektroda Au-BDD (b).

Gambar 4.38 Ilustrasi mekanisme berkurangnya arus reduksi Au akibat keberadaan NA pada sistem magnetic beads.

Hubungan antara intensitas puncak arus reduksi Au dengan konsentrasi NA memiliki koefisien determinasi sebesar 0,959 pada rentang konsentrasi 0 hingga 15 mU. Sementara itu koefisien determinasi untuk hubungan antara puncak arus oksidasi Au dengan konsentrasi NA hanya 0,838. Limit deteksi untuk pengukuran NA pada sistem magnetic beads diperoleh sebesar 1,82 dan 2,32 mU masing-masing untuk pengukuran berdasarkan puncak arus reduksi dan oksidasi Au. Nilai LOD ini lebih besar dibandingkan pengukuran tanpa menggunakan sistem magnetic beads. Hal ini menunjukkan bahwa sitem magnetic beads tidak lebih baik dibandingkan pengukuran NA secara langsung dengan menggunakan elektroda Au-BDD. Presisi pengukuran NA pada sistem magnetic beads dievaluasi dengan melakukan pengukuran sebanyak 9 kali ulangan. Diperoleh nilai % RSD pengukuran NA pada sistem magnetic beads dengan elektroda Au-BDD ialah sebesar 1,41 % dan


3,16 % masing-masing untuk pengukuran berdasarkan puncak arus reduksi dan oksidasi.

4.5.4

Linearitas dan Presisi pengukuran Neuraminidase dalam Matriks Mucin pada Sistem Magnetic Beads Linearitas NA dalam matriks mucin diamati dengan menggunakan mucin pada

konsentrasi 0,33 mg/mL. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa kalibrasi linear hanya dapat diperoleh pada rentang konsentrasi 0 hingga 8 mU dan hanya dapat dibangun berdasarkan puncak arus reduksi Au. Pada konsentrasi lebih besar dari 8 mU bertambahnya konsentrasi NA tidak linear dengan perubahan puncak arus reduksi Au. Kondisi ini dimungkinkan terjadi karena konsentrasi NA yang lebih besar dan keberadaan matriks mucin dari bovine submaxillary glands menutupi permukaan elektroda. Hasil pengukuran yang diperoleh disajikan pada Gambar 4.39. Limit deteksi pengukuran NA dalam matriks mucin dengan sistem magnetic beads ialah sebesar 0,64 mU.

Gambar 4.39 Kurva kalibrasi pengukuran NA berdasarkan puncak arus reduksi Au pada sistem magnetic beads dengan elektroda Au-BDD.

Presisi pengukuran NA dalam matriks mucin pada sistem magnetic beads dievaluasi dengan melakukan pengukuran sebanyak 9 kali ulangan. Diperoleh nilai %


RSD sebesar 7,25 %. Hasil ini menunjukkan bahwa keberadaan matrik mucin mempengaruhi dan menurunkan presisi pengukuran NA dengan sistem magnetic beads. Ringkasan pengukuran NA dan NA dalam matriks mucin pada sistem magnetic beads disajikan pada Tabel 4.6. Tabel 4.6 Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dan NA dalam Matriks Mucin pada Sistem Magnetic Beads dengan Elektroda Au-BDD Hasil Pengukuran Parameter

NA

NA dalam Mucin

Kisaran Linearitas (mU)

0 – 15

0–8

R2 puncak oksidasi

0,838

n/a

R puncak reduksi

0,959

0,950


1,82

n/a


2,32

0,64


3,16

n/a


1,41

7,25

2

4.6

PENGEMBANGAN

STRIP

TEST

UNTUK

DETEKSI

NEURAMINIDASE 4.6.1

Rancangan Strip test Rancangan strip test yang terdiri atas sample pad, nitrocellulose membrane,

test zone, dan adsorbent pad disusun pada plastic baking (Gambar 3.3). Sample pad pada rancangan strip test digunakan untuk meneteskan sampel. Hal ini dilakukan karena apabila sampel diteteskan langsung pada permukaan nitrocellulose membrane dapat terjadi difusi sampel ke arah yang tidak diharapkan. Penggunaan liquid blocker mini pen pada bagian ujung atas dan bawah nitrocellulose membrane juga dimaksudkan untuk mencegah pergerakan cairan sampel ke arah yang tidak diiinginkan. Zanamivir dengan konsentrasi 10-2 M sebanyak 15 µL diaplikasikan secara bertahap pada nitrocellulose membrane. Aplikasi secara bertahap dilakukan untuk mencagah difusi sehingga zanamivir dapat terimobilisasi pada daerah sempit permukaan nitrocellulose membrane . Sampel yang mengandung NA dengan konsentrasi 0 hingga 15 mU bermigrasi pada

nitrocellulose

membrane

hingga

mencapai

zanamivir

yang

telah

diimobilisasikan terlebih dahulu. NA akan berinteraksi dengan zanamivir pada


nitrocellulose membrane. Inkubasi dilakukan pada suhu 37 ºC selama 25 menit untuk memastikan reaksi antara NA dengan zanamivir terjadi. Pengukuran dilakukan pada elektroda Au-BDD dengan diameter 1 cm setelah reaksi enzimatis dihentikan.

4.6.2

Linearitas dan Presisi pengukuran Neuraminidase pada Stip Test dengan Elektroda Au-BDD Hasil pengukuran NA pada perangkat strip test disajikan pada Gambar 4.40

Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pengukuran NA pada strip test linear pada rentang konsentrasi NA 0 sampai 15 mU. Walaupun nilai koefisien determinasi yang diperoleh tidak sebaik pada pengukuran NA dalam larutan, namun masih terkategori baik dengan koefisien determinasi sebesar 98%. Hal ini menunjukkan bahwa strip test deteksi NA berpotensi untuk dikembangkan. Adapun limit deteksi (LOD) pengukuran NA dengan strip test ialah sebesar 0,43 mU untuk pengukuran berdasarkan puncak arus oksidasi dan 0,26 mU untuk pengukuran berdasarkan puncak arus reduksi. Presisi pengukuran NA pada strip test dievaluasi dengan melakukan pengukuran sebanyak 9 kali ulangan pada 3 level konsentrasi. Presisi dinyatakan sebagai % RSD. Diperoleh nilai % RSD untuk pengukuran berdasarkan puncak arus oksidasi Au dan puncak arus reduksi Au pada elektroda Au-BDD masing-masing sebesar 7,80 % dan 3,74 %. Presisi pengukuran berdasarkan puncak arus reduksi Au lebih baik dibandingkan pengukuran berdasarkan puncak arus oksidasi Au.

60

I / uA

40 20 0

[NA] / mU 0 2 4 8 12 15

-20 -40 -0.2

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E / V (vs. SSCE)

(a)


80 Reduction Peak

Peak Current /µA

60

Oxidation Peak

40

y = 3,2213x + 11,436 R² = 0,9773

20

0

y = -1,6889x - 10,181 R² = 0,9814

-20

-40 -60

0

3 6 9 12 Neuraminidase Concentration /mU

15

(b) Gambar 4.40 Profil voltametri siklik pengukuran NA pada strip test (a), Kurva kalibrasi linear pengukuran NA pada strip test berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au pada elektroda Au-BDD (b).

4.6.3

Linearitas dan Presisi pengukuran Neuraminidase dalam Matriks Mucin pada Stip Test dengan Elektroda Au-BDD Pengukuran NA dalam matriks mucin dengan konsentrasi 0,33 mg/mL

menggunakan strip test dilakukan pada selang konsentrasi 0 hingga 15 mU. Hasil yang diperoleh menunjukkan hubungan yang linear hanya dapat dibangun dengan baik dari data puncak arus reduksi Au. Sementara puncak arus oksidasi Au memberikan koefisien determinasi kurang dari 90 %. Hal ini diduga terjadi karena migrasi NA pada nitrocellulose membrane mengalami hambatan akibat keberadaan mucin yang kental. Gambar 4.41 menyajikan voltamogram siklik dan kurva

I / uA

pengukuran NA dalam matriks mucin pada berbagai konsentrasi. 90 80 [NA] / mU 70 60 0 50 2 4 40 8 30 12 20 15 10 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -0.2 0.0 0.2 0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E / V (vs. SSCE)


Peak Current /µA

(a) 100 80 60 40 20 0 -20 -40 -60

y = 2,3501x + 36,288 R² = 0,8695 Reduction Peak Oxidation Peak

0

y = -1,3913x - 23,557 R² = 0,9507

3 6 9 12 Neuraminidase Concentration /mU

15

(b) Gambar 4.41 Profil voltametri siklik pengukuran NA dalam matriks mucin pada strip test (a), Kurva kalibrasi linear pengukuran NA dalam matriks mucin pada strip test dengan elektroda Au-BDD (b).

Nilai limit deteksi pengukuran NA dalam matrik mucin dengan strip test masing-masing ialah 3,67 mU dan 1,61 mU untuk pengukuran berdasarkan puncak arus oksidasi dan reduksi Au. Presisi pengukuran NA dalam matriks mucin pada strip test dievaluasi dengan melakukan pengukuran sebanyak 9 kali ulangan. Nilai % RSD untuk pengukuran berdasarkan puncak oksidasi Au dan puncak reduksi Au pada elektroda Au-BDD masing-masing sebesar 19,22 % dan 6,27 %. Presisi pengukuran berdasarkan arus oksidasi Au tidak baik, sementara presisi pengukuran berdasarkan puncak reduksi Au masih cukup baik. Berdasarkan hasil yang diperoleh, pengukuran NA dalam matriks mucin dengan strip test disarankan dilakukan berdasarkan puncak arus reduksi Au. Ringkasan hasil pengukuran NA pada strip test dengan elektroda Au-BDD disajikan pada Tabel 4.7

Tabel 4.7 Ringkasan pengukuran neuraminidase (NA) dan NA dalam Matriks Mucin pada Strip test dengan Elektroda Au-BDD Hasil Pengukuran

Parameter

NA

NA dalam Mucin

0 – 15 mU

0 – 15 mU

2

0,977

0,869

2

R puncak reduksi

0,981

0,950


0,43

3,67

Kisaran Linearitas (mU) R puncak oksidasi



0,26

1,61


7,80

> 10


3,74

6,27


Tabel 4.8 Ringkasan Hasil Penelitian Measurement of

Zanamivir

Neuraminidase

Neuraminidase with mucin matrix 0,33 mg/mL

Neuraminidase in magnetic beads system

Neuraminidase with mucin matrix 0,33 mg/mL in magnetic beads system

Neuraminidase on strip test

Neuraminidase with mucin matrix 0,33 mg/mL on strip test

Parameter Linearity range (M) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak Linearity range (mU) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak Linearity range (mU) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak Linearity range (mU) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak Linearity range (mU) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak Linearity range (mU) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak Linearity range (mU) R2 Oxidation peak R2 Reduction peak LOD (M) Oxidation peak LOD (M) Reduction peak %RSD (n= 9) Oxidation peak %RSD (n= 9) Reduction peak

Au 1 x 10-5 -1 x 10-4 0,960 0,969 1,25 x 10-5 1,19 x 10-5 2,55 0,33 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a

Electrode Au-BDD 5 x 10-6 - 1 x 10-4 0,990 0,990 1,53 x 10-6 1,49 x 10-6 1,14 0,5 0 - 15 0,956 0,996 0,54 0,25 3,08 1,18 0 – 15 0,975 0,989 0,19 0,20 1,31 0,71 0 - 15 0,838 0,959 1,82 2,32 3,16 1,41 0-8 n/a 0,950 n/a 0,64 n/a 7,25 0 - 15 0,977 0,981 0,43 0,26 7,80 3,74 0 - 15 0,869 0,950 3,67 1,61 >10 6,27


AuNPs-BDD 1 x 10-6 - 1 x 10-5 0,946 0,998 1,89 x 10-5 2,29 x 10-6 >10 2,23 0 - 12 0,938 0,997 1,64 0,12 >10 2,49 0 - 12 0,949 0,992 0,66 0,36 4,69 1,44 0-8 n/a n/a 0,64 n/a 7,25 n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a n/a

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

SIMPULAN

Kesimpulan yang dapat diambil dari penelitian yang telah dilakukan ialah sebagai berikut 1. Zanamivir tidak elektroaktif namun analisis kuantitatif zanamivir secara elektrokimia dapat dilakukan pada elektroda kerja Au dan boron doped diamond

temodifikasi Au (Au-BDD

dan AuNPs-BDD) berdasarkan

penurunan intensitas puncak arus oksidasi dan reduksi Au yang terjadi akibat teradsorpsinya zanamivir pada permukaan elektroda kerja tersebut. 2. Puncak arus oksidasi dan reduksi Au dalam larutan zanamivir yang mengandung neuraminidase (NA) mengalami peningkatan baik pada elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD. Interaksi NA dengan zanamivir menyebabkan jumlah zanamivir bebas dalam larutan berkurang dan jumlah zanamivir yang teradsorpsi pada permukaan elektroda juga berkurang sehingga puncak arus oksidasi dan reduksi Au meningkat. Pada kondisi optimum reaksi NA dengan zanamivir (suhu inhibisi 37 ◦C, pH reaksi 5,5, dan waktu kontak 25 menit) diperoleh hubungan linear antara konsentrasi NA dengan kenaikan puncak arus reduksi dan oksidasi Au. 3. Zanamivir

berhasil

diimmobilisasi

pada

magnetic

beads

dengan

memanfaatkan ikatan kovalen zanamivir dengan biotin dan interaksi biotin dengan streptavidin-magnetic beads. Pada sistem pengukuran dengan magnetic beads keberadaan NA menurunkan arus reduksi Au pada elektroda Au-BDD. Penggunaan magnetic beads belum dapat memperbaiki performa pengukuran NA pada elektroda Au-BDD. 4. Pengukuran NA pada membrane nitrosellulose dapat dilakukan menggunakan teknik voltammetri pada elektroda Au-BDD dengan limit deteksi yang rendah dan presisi pengukuran yang cukup baik sehingga strip test pengukurn NA berpotensi untuk dikembangkan.


5. Pengukuran NA dalam matriks sampel yang mengandung mucin dengan konsentrasi 0,33 mg/mL dapat dilakukan baik pada elektroda Au-BDD maupun AuNPs-BDD. Performa kerja pengukuran NA dalam matriks mucin pada kedua elektroda kerja umumnya berubah secara tidak berarti, dan pada sistem magnetic beads keberadaan mucin menurunkan performa pengukuran.

SARAN

Deteksi neuraminidase secara tidak langsung berdasarkan reaksi inhibisi NA oleh zanamivir menggunakan elektroda boron doped diamond termodifikasi emas telah berhasil dikembangkan. Agar metode yang telah dikembangkan dapat diaplikasikan hal-hal berikut disarankan untuk dilakukan: 1. Dilakukan validasi terhadap metode yang dikembangkan untuk mengabsahkan hasil analisis yang diperoleh dari metode yang dikembangkan. 2. Dilakukan uji banding atau komparasi metode yang dikembangkan dengan metode yang telah established. 3. Mengkombinasikan sistem strip test dengan deteksi amperometri untuk pendekatan aplikasi deteksi NA terhadap sampel real.


DAFTAR PUSTAKA

Abdou, H. E., Mohamed, A. A., & Fackler Jr, J. P. (2009). Gold(I) Nitrogen Chemistry. In Gold Chemistry: Applications and Future Directions in the Life Sciences. Ahrens, B., Jones, P. G., & Fischer, A. K. (1999). Gold ( I ) Complexes with Amine Ligands , 4 [ The Role of N – H ··· Cl Hydrogen Bonds in Gold ( I ) Complexes with Aliphatic Amine Ligands. European Journal of Inorganic Chemistry, (I), 1103–1110. Aldrich, S. (2014). Mucin from bovine submaxillary glands Type I-S. Retrieved January 01, 2014, from https://www.sigmaaldrich.com Allen, G. ., Brookes, S. ., Barrow, A., Dunn, J. ., & Grosse, C. . (1999). Liquid chromatographic–tandem mass spectrometric method for the determination of the neuraminidase inhibitor zanamivir (GG167) in human serum. Journal of Chromatography B, 732(2), 383–393. doi:10.1016/S0378-4347(99)00306-0 Aytur, T., Foley, J., Anwar, M., Boser, B., Harris, E., & Beatty, P. R. (2006). A novel magnetic bead bioassay platform using a microchip-based sensor for infectious disease diagnosis. Journal of Immunological Methods, 314(1-2), 21–9. doi:10.1016/j.jim.2006.05.006 Azevedo, A. F., Matsushima, J., Vicentin, F. C., Baldan, M. R., & Ferreira, N. G. (2007). Characterization of ultrananocristalline diamond films by xps. LNLS (pp. 4–5). Campinas. Babu, Y. S., Chand, P., Bantia, S., Kotian, P., Dehghani, A., El-kattan, Y., … Montgomery, J. a. (2000). Discovery of a Novel , Highly Potent , Orally Active and Selective Influenza Neuraminidase Inhibitor through Structure-Based Drug Design. Journal of Medical Chemistry, 43, 3482–3486. doi:10.1021/jm0002679 Bantia, S., Upshaw, R., & Babu, Y. S. (2011). Characterization of the binding affinities of peramivir and oseltamivir carboxylate to the neuraminidase enzyme. Antiviral Research, 91(3), 288–91. doi:10.1016/j.antiviral.2011.06.010 Baughman, T. M., Wright, W. L., & Hutton, K. a. (2007). Determination of zanamivir in rat and monkey plasma by positive ion hydrophilic interaction chromatography (HILIC)/tandem mass spectrometry. Journal of Chromatography. B, 852(1-2), 505–511. doi:10.1016/j.jchromb.2007.02.006 Berry, A. M., Paton, J. C., Glare, E. M., Hansman, D., & Catcheside, D. E. A. (1988). Cloning and expression of the pneumococcal neuraminidase gene in Escheria coli. Gene, 71, 299–305. Bockris, J. O. M., Reddy, A. K. N., & Gamboa-Aldeco, M. (2000). Modern Electrochemistry: Fundamentals of Electrodics.


Bogdanowicz, R., Fabianska, A., Golunski, L., Sobaszek, M., Gnyba, M., Ryl, J., … Siedlecka, E. M. (2013). Influence of the boron doping level on the electrochemical oxidation of the azo dyes at Si / BDD thin fi lm electrodes ☆. Diamond & Related Materials, 39, 82–88. doi:10.1016/j.diamond.2013.08.004 Cai, Y., Anderson, A. B., Angus, J. C., & Kostadinov, L. N. (2005). Hydrogen evolution on diamond electrodes and its dependence on surface C-H bond strengths. Electrochemical and Solids-State Letters, 8(9), E62–E65. doi:10.1149/1.1999913 CDC. (2009). Oseltamivir-Resistant 2009 Pandemic Influenza A ( H1N1 ) Virus Infection in Two Summer Campers Receiving Prophylaxis-North Carolina. MMWR (Vol. 58, pp. 969–972). Charrier, G., Aureau, D., Gonçalves, A., Collet, G., Bouttemy, M., Etcheberry, A., & Simon, N. (2013). Gold nanoparticles immobilization : Evidence of amination of diamond surfaces in liquid ammonia. Diamond & Related Materials, 32, 36–42. doi:10.1016/j.diamond.2012.11.014 Chien, C., Huang, Y., & Chen, H. (1997). Small neuraminidase gene of Clostridium perfringens ATCC 10543: Cloning, nucleotide sequence, and production. Enzyme and Microbial Technology, 20(4), 277–285. doi:10.1016/S01410229(96)00129-9 Chiku, M., Watanabe, T., & Einaga, Y. (2010). Fabrication of Cu-modified borondoped diamond microband electrodes and their application for selective detection of glucose. Diamond and Related Materials, 19(7-9), 673–679. doi:10.1016/j.diamond.2010.01.048 Coles, M. P. (2006). Application of neutral amidines and guanidines in coordination chemistry. Dalton Transactions, (8), 985–1001. doi:10.1039/b515490a Colman, P. M., Hoyne, P. a, & Lawrence, M. C. (1993). Sequence and structure alignment of paramyxovirus hemagglutinin-neuraminidase with influenza virus neuraminidase. Journal of Virology, 67(6), 2972–2980. Daigle, A. D., & BelBruno, J. J. (2011). Density Functional Theory Study of the Adsorption of Nitrogen and Sulfur Atoms on Gold (111), (100), and (211) Surfaces. The Journal of Physical Chemistry C, 115(46), 22987–22997. doi:10.1021/jp2071327 DuVall, S. H., & McCreery, R. L. (1999). Control of Catechol and Hydroquinone Electron-Transfer Kinetics on Native and Modified Glassy Carbon Electrodes. Analytical Chemistry, 71(20), 4594–4602. doi:10.1021/ac990399d Escuret, V., Cornu, C., Boutitie, F., Enouf, V., Mosnier, A., Bouscambert-Duchamp, M., … Lina, B. (2012). Oseltamivir-zanamivir bitherapy compared to oseltamivir monotherapy in the treatment of pandemic 2009 influenza A(H1N1) virus infections. Antiviral Research, 96(2), 130–7. doi:10.1016/j.antiviral.2012.08.002


Fadley, C. S. (2010). X-ray photoelectron spectroscopy: Progress and perspectives. Journal of Electron Spectroscopy and Related Phenomena, 178-179, 2–32. doi:10.1016/j.elspec.2010.01.006 Foster, R. J., & Walsh, D. A. (2005). Voltammetry: Overview (pp. 181–188). Dulbin: Elsevier Ltd. Ge, J., Liu, F., Holmes, E. H., Ostrander, G. K., & Li, Q. X. (2012). Aqueous normal phase liquid chromatography coupled with tandem time-of-flight quadrupole mass spectrometry for determination of zanamivir in human serum. Journal of Chromatography. B, 906, 58–62. doi:10.1016/j.jchromb.2012.08.020 Gerentes, L., Kessler, N., & Aymard, M. (1998). A sensitive and specific ELISA immunocapture assay for rapid quantitation of influenza A/H3N2 neuraminidase protein. Journal of Virological Methods, 73(2), 185–195. doi:10.1016/S01660934(98)00056-1 Goodhew, P. J., Humphreys, J., & Beanland, R. (2001). Electron Microscopy and Analysis. Green, M. D., Nettey, H., & Wirtz, R. A. (2008). Determination of Oseltamivir Quality by Colorimetric and Liquid Chromatographic Methods. Emerging Infectious Disease, 14(4), 552–556. Green, N. M. (1963). Avidin. Journal of Biochemistry, 89, 599–609. Hamza, S. M., Rizk, N. M. H., & Matter, H. A. B. (2012). A new ion selective electrode method for determination of oseltamivir phosphate (Tamiflu) and its pharmaceutical applications. Arabian Journal of Chemistry. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.arabjc.2012.07.029 Hernandez, J. E., Adiga, R., Armstrong, R., Bazan, J., Bonilla, H., Bradley, J., … Sheridan, W. (2011). Clinical experience in adults and children treated with intravenous peramivir for 2009 influenza A (H1N1) under an emergency IND program in the United States. Clinical Infectious Diseases, 52(6), 695–706. doi:10.1093/cid/cir001 Hurt, A. C., Barr, I. G., Komadina, N., & Hampson, A. W. (2004). A novel means of identifying the neuraminidase type of currently circulating human A(H1) influenza viruses. Virus Research, 103(1-2), 79–83. doi:10.1016/j.virusres.2004.02.017 Ivandini, T. A., Einaga, Y., Honda, K., & Fujishima, A. (2005). Preparation and Characterization of Poly crystalline Chemical Vapor Deposited Boron-doped Diamond Thin Films. In A. Fujishima, Y. Einaga, & D. A. Tryk (Eds.), Diamond Electrochemistry (pp. 11–25). Tokyo: BKC. Inc. Ivandini, T. A., Honda, K., Rao, T. N., Fujishima, A., & Einaga, Y. (2007). Simultaneous detection of purine and pyrimidine at highly boron-doped diamond


electrodes by using liquid chromatography. Talanta, 71(2), 648–55. doi:10.1016/j.talanta.2006.05.009 Ivandini, T. A., Saepudin, E., Wardah, H., Dewangga, N., & Einaga, Y. (2012). Development of a Biochemical Oxygen Demand Sensor Using Gold- Modi fi ed Boron Doped Diamond Electrodes. Ivandini, T. A., Sato, R., Makide, Y., Fujishima, A., & Einaga, Y. (2004). Electroanalytical application of modified diamond electrodes. Diamond and Related Materials, 13(11-12), 2003–2008. doi:10.1016/j.diamond.2004.07.004 Ivandini, T. A., Sato, R., Makide, Y., Fujishima, A., & Einaga, Y. (2005). Ptimplanted boron-doped diamond electrodes and the application for electrochemical detection of hydrogen peroxide. Diamond and Related Materials, 14(11-12), 2133–2138. doi:10.1016/j.diamond.2005.08.022 Ivandini, T. A., Yamada, D., Watanabe, T., Matsuura, H., Nakano, N., Fujishima, A., & Einaga, Y. (2010). Development of amperometric arsine gas sensor using gold-modified diamond electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry, 645(1), 58–63. doi:10.1016/j.jelechem.2010.04.012 Ivic, M. L. A., Petrovic, S. D., Mijin, D. Z., & Drljevic-Duric, K. M. (2011). The qualitative determination of oseltamivir phosphate in Tamiflu® capsule by cyclic voltammetry. Hemijska Industrija, 65(1), 87–91. doi:10.2298/HEMIND100908070A Joseph-Charles, J., Geneste, C., Laborde-Kummer, E., Gheyouche, R., Boudis, H., & Dubost, J.-P. (2007). Development and validation of a rapid HPLC method for the determination of oseltamivir phosphate in Tamiflu and generic versions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 44(4), 1008–1013. doi:10.1016/j.jpba.2007.04.002 Kastelic, S., Bercic, R. L., Cizelj, I., Bencina, M., Makrai, L., Zorman-rojs, O., … Bencina, D. (2013). Ornithobacterium rhinotracheale has neuraminidase activity causing desialylation of chicken and turkey serum and tracheal mucus glycoproteins. Veterinary Microbiology, 162, 707–712. doi:10.1016/j.vetmic.2012.09.018 Kimling, J., Maier, M., Okenve, B., Kotaidis, V., Ballot, H., & Plech, A. (2006). Turkevich Method for Gold Nanoparticle Synthesis Revisited. Journal of Physical Chemistry B, 110, 15700–15707. Kohl, P. a. (2010). Electrodeposition of Gold. In M. Schlesinger & M. Paunovic (Eds.), Modern Electroplating: Fifth Edition (pp. 115–130). John Wiley & Sons, Inc. doi:10.1002/9780470602638.ch4 Kraft, A. (2007). Doped Diamond : A Compact Review on a New , Versatile Electrode Material. International Journal of Electrochemical Science, 2, 355– 385.


Kubo, S., Tomozawa, T., Kakuta, M., Tokumitsu, A., & Yamashita, M. (2010). Laninamivir prodrug CS-8958, a long-acting neuraminidase inhibitor, shows superior anti-influenza virus activity after a single administration. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 54(3), 1256–1264. doi:10.1128/AAC.01311-09 Laborde-Kummer, E., Gaudin, K., Joseph-Charles, J., Gheyouche, R., Boudis, H., & Dubost, J.-P. (2009). Development and validation of a rapid capillary electrophoresis method for the determination of oseltamivir phosphate in Tamiflu and generic versions. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 50(3), 544–546. doi:10.1016/j.jpba.2009.05.016 Levy-clement, C. (2005). Semiconducting and Metallic Boron-Doped Diamond Electrodes. In A. Fujishima, Y. Einaga, & D. A. Tryk (Eds.), Diamond Electrochemistry. Tokyo: BKC. Inc. Li, Y., Wu, T., Qi, X., Ge, Y., Guo, X., Wu, B., … Zhou, M. (2013). Simultaneous detection of hemagglutinin and neuraminidase genes of novel influenza A (H7N9) by duplex real-time reverse transcription polymerase chain reaction. Journal of Virological Methods, 194(1-2), 194–6. doi:10.1016/j.jviromet.2013.08.021 Lindegårdh, N., Hanpithakpong, W., Wattanagoon, Y., Singhasivanon, P., White, N. J., & Day, N. P. J. (2007). Development and validation of a liquid chromatographic-tandem mass spectrometric method for determination of oseltamivir and its metabolite oseltamivir carboxylate in plasma, saliva and urine. Journal of Chromatography. B, 859(1), 74–83. doi:10.1016/j.jchromb.2007.09.018 Macpherson, J. V. (2015). A practical guide to using boron doped diamond in electrochemical research. Phys. Chem. Chem. Phys., 17, 2935–2949. doi:10.1039/C4CP04022H Malipatil, S. M., Jahan, K., & Deepthi, M. (2010). Spectrophotometric Determination Of Oseltamivir Phosphate In Bulk Drug And In Pharmaceutical Formulation . Research Journal of Pharmaceutical , Biological and Chemical Sciences, 1(4), 933–942. Meeprasert, A., Khuntawee, W., Kamlungsua, K., Nunthaboot, N., Rungrotmongkol, T., & Hannongbua, S. (2012). Binding pattern of the long acting neuraminidase inhibitor laninamivir towards influenza A subtypes H5N1 and pandemic H1N1. Journal of Molecular Graphics and Modelling, 38, 148–154. doi:10.1016/j.jmgm.2012.06.007 Mihajlovic, M. L., & Mitrasinovic, P. M. (2008). Another look at the molecular mechanism of the resistance of H5N1 influenza A virus neuraminidase (NA) to oseltamivir (OTV). Biophysical Chemistry, 136(2-3), 152–8. doi:10.1016/j.bpc.2008.06.003 Moriyama, T., & Barksdale, L. (1967). Neuraminidase of Corynebacterium diphtheriae. Journal of Bacteriology, 94(5), 1565–1581.


Moulder, J. F., Stickle, W. F., Sobol, P. E., & Bomben, K. D. (1995). Handbook of Xray Photoelectron Spectroscopy. (J. Chastain & R. C. King, Eds.). Murugaraj, P., Mainwaring, D. E., Al Kobaisi, M., & Siegele, R. (2012). Stable doped sp2 C-hybrid nanostructures by reactive ion beam irradiation. Journal of Materials Chemistry, 22, 18403. doi:10.1039/c2jm32714g Pop, S. F., Stefan-van Staden, R.-I., Ion, R.-M., van Staden, J. F., & Aboul-Enein, H. Y. (2010). Electroanalysis of oseltamivir phosphate using new microsensors based on nanostructured materials. European Cell and Materials, 20(3), 204. Pop, S. F., Stefan-van Staden, R.-I., van Staden, J. F., Aboul-Enein, H. Y., Ion, R.-M., & Aydogmus, Z. (2012). Electroanalysis of Oseltamivir Phosphate Using New Microelectrodes Based on Zinc Complexes with Porphyrins and Phthalocyanines. Journal of the Electrochemical Society, 159(9), B789–B793. doi:10.1149/2.001209jes Popa, E., Kubota, Y., Tryk, D. a., & Fujishima, A. (2000). Selective Voltammetric and Amperometric Detection of Uric Acid with Oxidized Diamond Film Electrodes. Analytical Chemistry, 72(7), 1724–1727. doi:10.1021/ac990862m Popa, E., Notsu, H., Miwa, T., Tryk, D. A., & Fujishima, A. (1999). Selective Electrochemical Detection of Dopamine in the Presence of Ascorbic Acid at Anodized Diamond Thin Film Electrodes. Electrochmical and Solid State Letters, 2(1), 49–51. Ramachandran, M., Nambikkairaj, B., & Bakyavathy, M. (2012). In silico molecular modeling of neuraminidase enzyme H1N1 avian influenza virus and docking with zanamivir ligands. Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2(6), 426– 430. doi:10.1016/S2222-1808(12)60094-2 Rismetov, B., Ivandini, T. A., Saepudin, E., & Einaga, Y. (2014). Electrochemical detection of hydrogen peroxide at platinum-modi fi ed diamond electrodes for an application in melamine strip tests. Diamond and Related Materials, 48, 88–95. Roustom, B. El, Fóti, G., & Comninellis, C. (2005). Preparation of gold nanoparticles by heat treatment of sputter deposited gold on boron-doped diamond film electrode. Electrochemistry Communications, 7(4), 398–405. doi:10.1016/j.elecom.2005.02.014 Sajid, M., Kawde, A., Daud, M., & Daud, M. (2014). Designs , formats and applications of lateral flow assay : A literature review. Journal of Saudi Chemical Society, Accepted m. Samson, M., Pizzorno, A., Abed, Y., & Boivin, G. (2013). Influenza virus resistance to neuraminidase inhibitors. Antiviral Research, 98(2), 174–85. doi:10.1016/j.antiviral.2013.03.014 Sheu, T. G., Deyde, V. M., Okomo-Adhiambo, M., Garten, R. J., Xu, X., Bright, R. a., … Gubareva, L. V. (2008). Surveillance for neuraminidase inhibitor


resistance among human influenza A and B viruses circulating worldwide from 2004 to 2008. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 52(9), 3284–3292. doi:10.1128/AAC.00555-08 Siné, G., Duo, I., Roustom, B. El, Fóti, G., & Comninellis, C. (2006). Deposition of clusters and nanoparticles onto boron-doped diamond electrodes for electrocatalysis. Journal of Applied Electrochemistry, 36(8), 847–862. doi:10.1007/s10800-006-9159-2 Skrzypek, S. (2010). Electrochemical Studies of the Neuraminidase Inhibitor Zanamivir and its Voltammetric Determination in Spiked Urine. Electroanalysis, 22(20), 2339–2346. doi:10.1002/elan.201000163 Skrzypek, S. (2012). Electrode mechanism and voltammetric determination of selected guanidino compounds. Central European Journal of Chemistry, 10(4), 977–988. doi:10.2478/s11532-012-0043-0 Smith, E., & Dent, G. (2004). Modern Raman Spectroscopy - A Practical Approach. Chichester, UK: John Wiley & Sons, Ltd. doi:10.1002/0470011831 Srinivasan, S. (2006). Electrode/Electrolyte Interface: Structure and Kinetic of Charge Transfer. In Fuel Cell: From Fundamental to Application. Szunerits, S., Jama, C., Coffinier, Y., Marcus, B., Delabouglise, D., & Boukherroub, R. (2006). Direct amination of hydrogen-terminated boron doped diamond surfaces. Electrochemistry Communications, 8(7), 1185–1190. doi:10.1016/j.elecom.2006.05.023 Takayama, I., Nakauchi, M., Fujisaki, S., Odagiri, T., Tashiro, M., & Kageyama, T. (2013). Rapid detection of the S247N neuraminidase mutation in influenza A ( H1N1 ) pdm09 virus by one-step duplex RT-PCR assay. Journal of Virological Methods, 188, 73–75. doi:10.1016/j.jviromet.2012.12.005 Tambunan, U. S. F., Amri, N., & Parikesit, A. A. (2012). In silico design of cyclic peptides as influenza virus, a subtype H1N1 neuraminidase inhibitor. African Journal of Biotechnology, 11(52), 11474–11491. doi:10.5897/AJB11.4094 Tambunan, U. S. F., Fadilah, & Parikesit, A. A. (2010). Bioactive Compounds Screening from Zingiberaceae Family as Influenza A / Swine Flu Virus Neuraminidase Inhibitor through Docking Approach. OnLine Journal of Biological Science, 10(4), 151–156. Tanaka, K. (1978). Self-diffusion Coefficients of Water in Pure Water and in Aqueous Solutioiis of Several Electrolytes with 18O and 2H as Tracers. Journal of the Chemical Society, Faraday Transactions 1, 74, 1879–1881. doi:10.1039/F19787401879 Tian, R., Rao, T. N., Einaga, Y., & Zhi, J. (2006). Construction of Two-Dimensional Arrays Gold Nanoparticles Monolayer onto Boron-Doped Diamond Electrode Surfaces. Chemistry of Materials, 18(4), 939–945. doi:10.1021/cm0519481


Tian, R., & Zhi, J. (2007). Fabrication and electrochemical properties of boron-doped diamond film–gold nanoparticle array hybrid electrode. Electrochemistry Communications, 9(5), 1120–1126. doi:10.1016/j.elecom.2006.12.027 Toghill, K. E., & Compton, R. G. (2010). Metal Nanoparticle Modified Boron Doped Diamond Electrodes for Use in Electroanalysis. Electroanalysis, 22(17-18), 1947–1956. doi:10.1002/elan.201000072 Tryk, D. a., Tachibana, H., Inoue, H., & Fujishima, A. (2007). Boron-doped diamond electrodes: The role of surface termination in the oxidation of dopamine and ascorbic acid. Diamond and Related Materials, 16(4-7), 881–887. doi:10.1016/j.diamond.2007.02.002 Turgeon, N., McNicoll, F., Toulouse, M.-J., Liav, A., Barbeau, J., Ho, J., … Duchaine, C. (2011). Neuraminidase Activity as a Potential Enzymatic Marker for Rapid Detection of Airborne Viruses. Aerosol Science and Technology, 45(2), 183–195. doi:10.1080/02786826.2010.530624 Vanhove, E., de Sanoit, J., Arnault, J. C., Saada, S., Mer, C., Mailley, P., … Nesladek, M. (2007). Stability of H-terminated BDD electrodes: an insight into the influence of the surface preparation. Physica Status Solidi (a), 204(9), 2931– 2939. doi:10.1002/pssa.200776340 Varillas, D., Bermejo-Martin, J. F., Almansa, R., Rojo, S., Nogueira, B., Eiros, J. M., … de Lejarazu, R. O. (2011). A new method for detection of pandemic influenza virus using High Resolution Melting analysis of the neuraminidase gene. Journal of Virological Methods, 171(1), 284–6. doi:10.1016/j.jviromet.2010.10.003 Vimr, E. R., Lawrisuk, L., Galen, J., & Kaper, J. B. (1988). Cloning and Expression of the Vibrio cholerae Neuraminidase Gene nanH in Escherichia coli. Journal of Bacteriology, 170(4), 1495–1504. Wang, J. (2006). Analytical Electrochemistry (Third.). New Jersey: John Wiley & Sons, Inc. Wang, Q., Chang, B. J., Mee, B. J., & Riley, T. V. (2005). Neuraminidase production by Erysipelothrix rhusiopathiae. Veterinary Microbiology, 107(3-4), 265–72. doi:10.1016/j.vetmic.2005.01.022 Westgeest, K. B., Bestebroer, T. M., Spronken, M. I. J., Gao, J., Couzens, L., Osterhaus, A. D. M. E., … Graaf, M. De. (2015). Optimization of an enzymelinked lectin assay suitable for rapid antigenic characterization of the neuraminidase of human influenza A ( H3N2 ) viruses. Journal of Virological Methods, 217, 55–63. Williams, T. L., Pirkle, J. L., & Barr, J. R. (2012). Simultaneous quantification of hemagglutinin and neuraminidase of influenza virus using isotope dilution mass spectrometry. Vaccine, 30(14), 2475–82. doi:10.1016/j.vaccine.2011.12.056


Wong, K., Chen, C., Wei, K., Roy, V. a. L., & Chathoth, S. M. (2015). Diffusion of gold nanoparticles in toluene and water as seen by dynamic light scattering. Journal of Nanoparticle Research, 17(153). doi:10.1007/s11051-015-2965-x Wraight, C. a. (2006). Chance and design-Proton transfer in water, channels and bioenergetic proteins. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics, 1757, 886– 912. doi:10.1016/j.bbabio.2006.06.017 Yagi, I., Ishida, T., & Uosaki, K. (2004). Electrocatalytic reduction of oxygen to water at Au nanoclusters vacuum-evaporated on boron-doped diamond in acidic solution. Electrochemistry Communications, 6(8), 773–779. doi:10.1016/j.elecom.2004.05.025 Yamada, D., Ivandini, T. a., Komatsu, M., Fujishima, A., & Einaga, Y. (2008). Anodic stripping voltammetry of inorganic species of As3+ and As5+ at goldmodified boron doped diamond electrodes. Journal of Electroanalytical Chemistry, 615(2), 145–153. doi:10.1016/j.jelechem.2007.12.004 Yamashita, M., Tomozawa, T., Kakuta, M., Tokumitsu, A., Nasu, H., & Kubo, S. (2009). CS-8958, a prodrug of the new neuraminidase inhibitor R-125489, shows long-acting anti-influenza virus activity. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 53(1), 186–192. doi:10.1128/AAC.00333-08 Yang, W., Liu, X., Peng, X., Li, P., Wang, T., Tai, G., … Zhou, Y. (2012). Synthesis of novel N -acetylneuraminic acid derivatives as substrates for rapid detection of influenza virus neuraminidase. Carbohydrate Research, 359, 92–96. doi:10.1016/j.carres.2012.06.009 Ye, D., Shin, W., Li, N., Tang, W., Feng, E., Li, J., … Liu, H. (2012). Synthesis of C4-modi fi ed zanamivir analogs as neuraminidase inhibitors and their anti-AIV activities. European Journal of Medicinal Chemistry, 54, 764–770. doi:10.1016/j.ejmech.2012.06.033 Yu, Y., Zhou, Y., Wu, L., & Zhi, J. (2012). Electrochemical Biosensor Based on Boron-Doped Diamond Electrodes with Modified Surfaces. International Journal of Electrochemistry, Article ID, 1–10. doi:10.1155/2012/567171 Zawadzki, H. J. (2003). Synthesis and spectral studies of gold ( III ) complexes with guanidine derivatives. Transition Metal Chemistry, 28, 820–826. Zeng, A., Jin, C., Cho, S.-J., Seo, H. O., Kim, Y. D., Lim, D. C., … Boo, J.-H. (2012). Nickel nano-particle modified nitrogen-doped amorphous hydrogenated diamond-like carbon film for glucose sensing. Materials Research Bulletin, 47(10), 2713–2716. doi:10.1016/j.materresbull.2012.04.041 Zhang, F., Turgeon, N., Toulouse, M., Duchaine, C., & Li, D. (2012). A simple and rapid fl uorescent neuraminidase enzymatic assay on a micro fl uidic chip. Diagnostic Microbiology and Infectious Disease, 74, 263–266. doi:10.1016/j.diagmicrobio.2012.07.011


Zhou, Y., & Zhi, J. (2009). The application of boron-doped diamond electrodes in amperometric biosensors. Talanta, 79(5), 1189–96. doi:10.1016/j.talanta.2009.05.026 Živcová, Z. V., Frank, O., Petrák, V., Tarábková, H., Vacík, J., Nesládek, M., & Kavan, L. (2013). Electrochemistry and in situ Raman spectroelectrochemistry of low and high quality boron doped diamond layers in aqueous electrolyte solution. Electrochimica Acta, 87, 518–525. doi:10.1016/j.electacta.2012.09.031 Zonja, B., Goncalves, C., Perez, S., Delgado, A., Petrovic, M., Alpendurada, M. F., & Barcelo, D. (2013). Evaluation of the phototransformation of the antiviral zanamivir in surface waters through identification of transformation products. Journal of Hazardous Materials. doi:10.1016/j.jhazmat.2013.10.008


Lampiran 1 Diagram alir dan tahapan penelitian


Lampiran 2 Gambar Instrument MAPCVD (a), SEM (b), Raman spectroscopy (c), XPS (d), TEM (e)

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)


Lampiran 3 Profil voltametri siklik oseltamivir 1 x 10 -4 M dalam buffer sitrat pH 7 350 300 250 200

I / uA

150 100 50 0 -50 -100

CB pH 7 Os in CB pH 7

-150 -1.0

-0.5

0.0

0.5

1.0

1.5

E / V (vs. SSCE)


Lampiran 4 Spektrum Raman H-BDD pada beberapa lokasi

1800 1600

Intensity (a.u.)

1400 1200 1000 800 600 400 200 0 200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 200

400

600

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 200

800

-1

400

600

800

-1

Raman shift (cm )

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 -1

Raman shift (cm )

Raman shift (cm )

(2)

(3)

(1) 50000

Intensity (a.u.)

40000

30000

20000

10000

0 200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 200

400

600

-1

-1

Raman shift (cm )

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 -1

Raman shift (cm )

Raman shift (cm )

(5)

(6)

(4)

50000

Intensity (a.u.)

40000

30000

20000

10000

0 200

400

600

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 200 -1

Raman shift (cm )

(7)

400

600

800

200 1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200

400

-1

Raman shift (cm )

(8)


600

800

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 -1

Raman shift (cm )

(9)

Lampiran 5 Penentuan koefisien difusi

Persamaan Cottrell

Keterangan: D = Koefisien difusi (cm2/s) C = Konsentrasi larutan uji (mol/cm3) Misal 1 x 10-4 M = 1 x 10-7 mol/cm3 A = Luas area elektroda (cm2) = πr2 = 3,14 x (0,2 cm)2 = 1,256 x 10-1 cm2 F = Konstanta Faraday (96500 C/mol) n =Banyaknya elektron yang ditransfer = 6 t = waktu (s)

Koefisien difusi pengukuran zanamivir dengan elektroda Au:

25

I / uA

20 15 10 5 0

0

2

4 6 Time / s

8

10

Koefisien difusi pengukuran zanamivir dengan elektroda Au-BDD:


3 2.5

I / uA

2 1.5 1 0.5 0

0

2

4

6

8

10

Time / s


Lampiran 6 Contoh perhitungan penentuan nilai LOD pengukuran zanamivir Data pengukuran Ip,c (µA)

[Zanamivir]

STDEV

/ µM

1

2

3

Rerata

Ip,c

0

-3,68

-3,65

-3,61

-3,64

0,036

1,0

-3,53

-3,58

-3,60

-3,56

0,036

2,5

-3,48

-3,51

-3,47

-3,48

0,031

5,0

-3,43

-3,39

-3,34

-3,38

0,047

7,5

-3,30

-3,26

-3,21

-3,25

0,046

10

-3,15

-3,15

-3,12

-3,14

0,017

4 Peak Current / µA

3 2 1

y = -0,0688x + 3,1143 R² = 0,9461

Reduction Peak

0

Oxidation peak

-1

y = 0,0469x - 3,61 R² = 0,9984

-2 -3 -4

0

2

4

6

8

10

Concentration of Zanamivir / µM

LOD = a + 3So LOD = -3,61 + (3 x 0,036) LOD = -3,50 Angka tersebut digunakan sebagai nilai Y dan disubstitusi ke persamaan kurva kalibrasi dan diperoleh nilai X (LOD) sebesar 2,29 x 10-6 M.


Lampiran 7 Pengukuran NA secara tidak langsung berdasarkan interaksi NA dengan zanamivir menggunakan elektroda bare Au. Voltammogram siklik pengukuran NA (a), kurva kalibrasi pengukuran NA (b) 250 200 150

I / uA

100

[NA] / mU

50

0 1 2 6 8 15

0 -50 -100 -150 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6

E / V (vs. SSCE) (a) -132.0

I p,c/ µA

-132.2

y = 0.0586x - 133.15 R² = 0.6823

-132.4

-132.6 -132.8 -133.0

-133.2 -133.4 -133.6 0

2.5

5

7.5 10 12.5 Neuraminidase concentration / mU

(b)


15

Lampiran 8 Spektra FTIR larutan zanamivir-biotin dalam buffer fosfat

1.1 1.0

Transmittance

0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 4000

3500

3000

2500

2000

1500

1000

-1

Wavenumber / cm


Lampiran 9 Pengukuran NA tanpa zanamivir pada elektroda Au (a) dan Au-BDD (b), kurva hubungan konsentrasi NA dengan puncak arus reduksi emas pada elektroda AuBDD (c) 100

[NA] / mU 1 2 4 8 12 15

75 50

I / uA

25 0 -25 -50 -75 -100 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.2

1.4

1.6

E / V (vs. SSCE)

(a) 30

[NA] / mU 1 2 4 8 12 15

20

I / uA

10 0 -10 -20 -30 0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

E / V (vs. SSCE)

(b)


-21

Peak Current / µA

-21 -22 -22 y = 0,1457x - 23,23 R² = 0,7483

-23 -23 -24 -24

0

3

6 9 12 Concentration of Neuraminidase / mU

(c)


15

Lampiran 10 Daftar Riwayat Hidup Penulis Nama Lengkap Tempat dan Tanggal Lahir Alamat Rumah Nomor Telepon/Faks Nomor HP Alamat Kantor Nomor Telepon/Faks Alamat e-mail Pendidikan Program: Nama PT Bidang Ilmu Tahun Masuk Tahun Lulus Judul Skripsi/Tesis/ Disertasi

Nama Pembimbing/ Promotor

: Wulan Tri Wahyuni S, S.Si. M.Si. : Sukabumi, 23 November 1982 : Babakan Fakultas No. 36 RT.003 RW.004 Tegallega Bogor Tengah Bogor 16127 : (+62251) 8628766/ (+62251) 624567 : +6285717088321 : Gedung Fakultas Peternakan W2 Level 4, Jl. Agatis Kampus IPB Darmaga, Bogor 16680 : (+62251) 8628766/ (+62251) 624567 : [email protected], [email protected],

S-1 Institut Pertanian Bogor, Indonesia Kimia 2001 2006 Isolasi, Purifikasi, dan Identifikasi Senyawa Anti-βlaktamase dari Banteri IV NF 1-1, Penghambat Pertumbuhan Bakteri Penyebab Diare

Prof. Dr. Ir. Latifah K. Darusman, MS. Dr. Yulin Lestari

S-2 Institut Pertanian Bogor, Indonesia Kimia 2007 2010

S-3 Universitas Indonesia, Indonesia Kimia 2012 2015 Pengoptimuman dan Pengembangan Validasi Sidik Jari Metode Deteksi Kromatografi Cair Neuraminidase Kinerja Tinggi Ekstrak Berdasarkan Reaksi Phyllanthus niruri L. Inhibisi Enzimatik Oleh Zanamivir Menggunakan Elektroda Boron Doped Diamond Termodifikasi Emas Prof. Dr. Ir. Latifah Dr. Ivandini K. Darusman, MS. Tribidasari Dr. Aji Hamim Anggraningrum Wigena Dr. Endang Saepudin

Karya Tulis Dalam Bentuk Artikel Ilmiah/Karya Ilmiah Dalam Prosiding Seminar No. Judul Karya Tulis Nama Dipublikasi Tahun Tingkat Penulis pada (Lokal, (Tuliskan Nasional, secara Internasional) Berurutan) Phaleria marcocarpa Irma H Proceedings 1 2010 Internasional Fruit Extract as Insulinotropic Agent in TreptozotocinInduced Diabetic Cynomolgus Monkeys (Macaca

Suparto, Erni sulistiawati, Bayu Febram Praseto, Wulan Tri Wahyuni, Sylvia

of International Conference on Medicinal Plants Volume 1


fascicularis).

2

3

4

5

6

7

Optimization of Extraction Solvent using Simplex Centroid with Axial Design to Obtain Phyllanthus niruri HPLC Profile Seed Powder of Moringa oleifera as Coagulant for Reduction of Turbidity and Concentration of Manganese and Iron in Water Purification Process Inhibitory activity of Curcuma domestica, Curcuma xanthorrhiza and Zingiber zerumbet mixed extract in proliferation of colon cancer cells HCT (ATCC-CCL 116) Pengoptimuman Ekstraksi Flavonoid Daun Salam (Syzygium polyanthum)

Potency of Ficus carica L. Leaves Extract as Antioxidants and Inhibitory Activity of the Extract against HeLa Cancer Cell Proliferation Potency of Andrographis paniculata, Tinospora crispa, and Combination Extract as αGlucosidase Inhibitor and Chromatographic Fingerprint Profile of the Extracts

Prabandari, Yasmina Paramastri Wulan Tri Wahyuni, Latifah K. Darusman, Aji Hamim Wigena

2010

Internasional

Wulan Tri Wahyuni, Latifah K. Darusman, Restu Sminar Rahayu

Proceedings of International Conference on Medicinal Plants Volume 2 Proceedings of International Conference on Chemical Science

2010

Internasional

Latifah K. Darusman, Wulan Tri Wahyuni, Nurima Zebua

Proceeding of International Symposium on Temulawak

2011

Internasional

Latifah K. Darusman, Wulan Tri Wahyuni, Julia Devy Wulan Tri Wahyuni, Latifah K. Darusman, Redoyan Refli

Proceeding of National Seminar of Pokjanas TOI

2011

Nasional

Proceeding International Seminar of Forest and Medicinal Plants

2013

International

Wulan Tri Wahyuni, Latifah K. Darusman, Rona Jutama

Proceeding of International Seminar on Science

2013

International


Karya Tulis Dalam Bentuk Artikel Ilmiah/Karya Ilmiah Dalam Jurnal Ilmiah No. Judul Karya Tulis Nama Penulis Nama Jurnal No. Penerbitan 1

2

3

4

5

6

7

Daya Inhibisi Ekstrak Flavonoid Buah Mahkota Dewa (phaleria macrocarpa) Terhadap Enzim αGlukosidase First Order Ultraderivative Spectrophotometric Methods for Determination of Reserpine in Antihypertension Tablet Acetylcholinesteras e Inhibition and Antioxidant Activity of Syzygium cumini, S. aromaticum, and S. polyanthum from Indonesia Efektivitas Krim Antijerawat Kayu Secang (caesalpinia sappan) terhadap Propionibacterium acne pada Kulit Kelinci Aktivitas Antibakteri dan Antioksidan daun Kipahit Tithonia diversifolia dan Fraksinasi Senyawa Aktifnya Optimization and Validation of High Performance Liquid Chromatographic Fingerprint of phyllanthus niruri

Irma H. Suparto, Wulan Tri Wahyuni, Rolif Hartika

SAINS

38 (1) 2009

Latifah K. Darusman, Mohamad Rafi, Wulan Tri Wahyuni, Rizna Azrianiningsari

Indonesia Journal of Chemistry

12 (3) 2012

Latifah K. Darusman, Wulan Tri Wahyuni, Farahdina Alwi

Journal of Biological Science

13 (5) 2013

Siti Sadiah, Latifah K. Darusman, Wulan Tri Wahyuni, Irmanida Batubara Wulan Tri Wahyuni, Irmanida Batubara, Ade Suherman

Jurnal Ilmu Kefarmasian Indonesia

11 (2) 175-181

Jurnal Bahan Alam Indonesia

8 (5) 350-356

Wulan Tri Wahyuni, Latifah K. Darusman, Aji Hamim Wigena

Indonesia Journal of Chemistry

14 (2) 2014

Electrochemist ry

83 (5) 2015

Electrochemical Wulan Tri Behavior of Wahyuni,


Zanamivir at GoldModified Boron Doped Diamond Electrodes for an Application in Neuraminidase Sensing

Tribidasari A. Ivandini, Pastika K Jiwanti, Endang Saepudin, Jarnuzi Gunlazuardi, Yasuaki Einaga


UNIVERSITAS INDONESIA

Recommend Documents