SEMMELWEIS EGYETEM SZENTÁGOTHAI JÁNOS IDEGTUDOMÁNYI DOKTORI ISKOLA
Transzszinaptikus pályajelölés rekombináns pseudorabies vírus törzsekkel és a vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladás vizsgálata
Doktori (Ph.D.) értekezés
Dénes Ádám
Témavezető: Dr. Kovács Krisztina, az MTA doktora Hivatalos bírálók:
Dr. Halasy Katalin, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Dobolyi Árpád, tudományos főmunkatárs, PhD
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Nagy György, egyetemi tanár, az MTA Doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Erdei Anna, egyetemi tanár, az MTA Doktora Dr. Madarász Emilia, egyetemi docens, PhD
MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium
Budapest, 2006
Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke.................................................................................................... 4 2. Bevezetés ...................................................................................................................... 6 2.1. Az autonóm idegrendszer ...................................................................................... 6 2.2. Az immunszervek autonóm beidegzése .............................................................. 12 2.2.1. A csontvelő innervációja: ............................................................................. 13 2.2.2. A lép innervációja: ....................................................................................... 14 2.3. A fehér és barna zsírszövet autonóm beidegzése ................................................ 15 2.3.1. A fehér zsírszövet (WAT) innervációja:........................................................ 15 2.3.2. A barna zsírszövet (BAT) innervációja: ....................................................... 15 2.4. A neuroanatómiai pályajelölés (tracing) ............................................................. 16 2.5. Neuroanatómiai pályajelölés pseudorabies vírussal ............................................ 17 2.5.1. A vírus replikációja, transszinaptikus terjedése:.......................................... 18 2.5.2. Transszinaptikus pályajelölés: ..................................................................... 20 2.5.3. Rekombináns „második generációs” vírus tracerek – ripoter fehérjék beépítése: ................................................................................................................ 23 2.5.4. Rekombináns „második generációs” vírus tracerek – a „Dup” vírusok:.... 23 2.6. A pseudorabies vírus fertőzés hatására kialakuló gyulladásos folyamatok a központi idegrendszerben ........................................................................................... 25 3. Célkitűzések ............................................................................................................... 27 4. Anyagok és Módszerek .............................................................................................. 28 4.1. Vírusok ................................................................................................................ 28 4.2. Kísérleti állatok ................................................................................................... 28 4.3. Sejtkultúrák és in vitro víruskinetikai vizsgálatok .............................................. 29 4.4. Vírusok injektálása .............................................................................................. 30 4.4.1. Vírus injektálás a csontvelőbe:..................................................................... 30 4.4.2. Vírus injektálás a fehér és barna zsírszövetbe: ............................................ 31 4.4.3. Vírus injektálás a lépbe: ............................................................................... 32 4.5. Leukociták izolálása és ex vivo jelölés vitális fluoreszcens festékkel ................. 32 4.6. CMTMR-el jelölt sejtek injektálása vírusfertőzött állatokba .............................. 33 4.7. Bromodeoxyuridine (BrdU) beadás .................................................................... 34 4.8. Transzkardiális perfúzió és szövetek kezelése .................................................... 34 4.9. Immunhisztokémia .............................................................................................. 35 4.9.1. Immunperoxidáz hisztokémia: ...................................................................... 35 4.9.2. Immunfluoreszcencia:................................................................................... 35 4.10. Pre-embedding immuncitokémia és elektronmikroszkópia .............................. 38 4.12. Analízis.............................................................................................................. 39 5. Eredmények ................................................................................................................ 41 5.1. A csontvelő központi idegrendszeri autonóm beidegzése................................... 41 5.1.1. A vírussal fertőződött idegsejtek agyi lokalizációja a BDG vírus csontvelői beadását követően ...................................................................................................... 41 5.1.1.1. Jelölődés a szimpatikus határláncban és a gerincvelőben........................ 41 5.1.1.2. Jelölődés az agytörzsben ........................................................................... 43 5.1.1.3. Jelölődés az előagyban.............................................................................. 46 5.1.2. A BDG vírussal fertőződött autonóm neuronok neurokémiai jellemzése ......... 49 5.1.3. Kontroll kísérletek ............................................................................................ 50 5.1.4. A centrális vírusfertőzés okozta gliális aktiváció és fagocitózis....................... 53 5.2. Az epididimális fehér zsírszövet és az intercapsularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata............................................................................. 54
2
5.2.1. A BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációja az agytörzsben....................................................................................... 54 5.2.2. A BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációja az előagyban ......................................................................................... 58 5.2.2.1. Hypothalamus............................................................................................ 58 5.2.2.2. Limbicus rendszer és agykéreg.................................................................. 60 5.3. A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata 61 5.3.1. A vírus centrális terjedése lépbe törtőnő beadás után ..................................... 61 5.3.2. A BDG vírus riporter fehérjéje, a GFP és a virális struktúrfehérjék (PRV) kifejeződése in vitro .................................................................................................... 63 5.3.3. A vírusfertőzés három stádiuma in vivo ........................................................... 64 5.3.4. Gyors mikrogliális válasz a lokális vírusfertőzésre – az érintett neuronok körül kialakuló mikrogliális barrier struktúra szerveződése és szerkezete.......................... 65 5.3.5. Az ED1 -pozitív makrofágok részt vesznek a fertőzött neuronokat kölülvevő gliális barrier kialakításában ..................................................................................... 69 5.3.6. Ex vivo jelölt leukociták beáramlása a perifériáról a fertőzött neuronokhoz .. 72 5.3.7. A vírusfertőzés indukálta sejtproliferáció a fertőzött területeken .................... 74 5.3.8. A vírussal fertőzött idegsejtek és környezetük ultrastruktúrális vizsgálata...... 76 6. Az eredmények megvitatása....................................................................................... 78 6.1. A csontvelő autonóm beidegzése ........................................................................ 78 6.1.1. Metodikai szempontok .................................................................................. 79 6.1.2. A csontvelő beidegzését végző autonóm idegi hálózat anatómiája .............. 81 6.1.3. A csontvelő beidegzésében szerepet játszó neuronhálózat funkcionális jelentősége .............................................................................................................. 85 6.2. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata............................................................................. 87 6.2.1. Metodikai szempontok .................................................................................. 88 6.2.2. A BAT és eWAT beidegzését végző autonóm idegi hálózat anatómiája és ennek funkcionális jelentősége ............................................................................... 89 6.3. A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata 93 7. Következtetések........................................................................................................ 100 8. Összefoglalás ............................................................................................................ 101 9. Summary................................................................................................................... 102 10. Irodalomjegyzék ..................................................................................................... 103 12. Saját közlemények jegyzéke................................................................................... 119 12.1. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények .................................................. 119 12.2. Előadáskivonatok ............................................................................................ 119 13. Köszönetnyilvánítás ............................................................................................... 121
3
1. Rövidítések jegyzéke ASP BAT BDG BDL β-gal BNST CAN cc CCK CeA ChAT CTB CRH CGRP DA DBH DMN DMV eWAT FB GABA GFP Gi HPA HRP HSV 5-HTT IE IFNγ IL-4 IML KPBS LAT LHA LPGi LY MCP-1 MEM MePOA MOI NDS NGS nNOS NTS NPY NY PAG
putative antisense promoter brown adipose tissue (barna zsírszövet) Ba-DupGreen Ba-DupLac béta-galaktozidáz bed nucleus of the stria terminalis (nucleus interstitialis striae terminalis) central autonomic nucleus (centrális autonóm mag) canalis centralis kolecisztokinin centralis amygdala kolin acetiltranszferáz cholera toxin beta corticotropin releasing hormon calcitonin gene-related peptide dopamin dopamin-β-hidroxiláz dorsomedial hypothalamic nucleus (nucleus dorsomedialis hypothalami) dorsal motor nucleus of the vagus (nucleus motorius nervi vagi) epididymal white adipose tissue (epididimális fehér zsírszövet) Fast Blue gamma-amino-vajsav green fluorescent protein (zöld fluoreszcens protein) nucleus reticularis gigantocellularis hypothalamus-hypophysis mellékvesekéreg horse radish peroxidase (torma peroxidáz) herpes simplex vírus 5-hydroxytryptamine transporter (szerotonin-transzporter) immediate-early interferon gamma interleukin-4 intermediolaterális sejt oszlop kálium-foszfát puffer latency assotiated transcript (latencia-asszociált transzkriptum) lateral hypothalamic area (area hypothalamica lateralis) lateral paragigantocellular nucleus (nucleus paragigantocellularis lateralis) Lucifer Yellow monocyte chemoattractant protein-1 Minimum Essential Medium mediális preopticus area (area preoptica medialis) multiplicity of infection normal donkey serum (normál szamár szérum) normal goat serum (normál kecske szérum) neuronális nitrogén oxid szintetáz nucleus tractus solitarius neuropeptid Y Nuclear Yellow periaqueductal gray matter (substantia grisea centralis) 4
PALS PFA PGE2 PNMT POA PRV PVN RMg SP TB TBS TH TLR TRH VHS VIP VMN WAT 6-OHDA
periarteriolar lymhoid sheat (periarteriális hüvely) paraformaldehid prosztaglandin E2 feniletanolamin-N-metiltranszferáz preopticus area pseudorabies vírus paraventricular nucleus (nucleus paraventricularis hypothalami) nucleus raphe magnus substance P True Blue tris buffered saline (tris puffer) tirozin hidroxiláz toll-like receptor thyrotropin-releasing hormone virion host shutoff protein vasoactive intestinal peptide (vazoaktív intesztinális polipeptid) ventromedial hypothalamic nucleus (nucleus ventromedialis hypothalami) white adipose tissue (fehér zsírszövet) 6-hidroxi-dopamin
5
2. Bevezetés
2.1. Az autonóm idegrendszer A vázizomzat szenzoro-motoros beidegzésének kivételével az autonóm idegrendszer szolgáltatja a gerincesek szerveit beidegző idegrostokat és szabályozza ezek aktivitását. Mivel az autonóm folyamatok nagy többségükben nem állnak tudatos kontroll alatt, ezért indokolt az autonóm (független) rendszer elkülönítése a szomatomotoros idegrendszer elemeitől. Anatómiailag az autonóm idegrendszer három komponensre tagolható: a szimpatikus (noradrenerg) és paraszimpatikus (kolinerg) rendszerekre, melyek idegsejtjei a központi idegrendszerben (agy, illetve gerincvelő) erednek, valamint az enterális idegrendszerre, amely a gasztointesztinális traktusban helyezkedik el1. Az enterális rendszer, amely közelítőleg annyi idegsejtet tartalmaz mint a gericvelő2 az intesztinális folyamatokat szabályozza, ugyanakkor a szimpatikus és paraszimpatikus rendszerektől is kap moduláló innervációt3. Az autonóm rendszer működése során a perifériáról eredő viszceroszenzoros információ eléri a centrális autonóm szenzoros területeket, majd feldolgozás után a viszceromotoros rendszer szimpatikus vagy paraszimpatikus impulzust küld a célszerveknek, ami megváltozott működést eredményez. A viszceroszenzoros információ az agyat a craniális idegeken át (ezt a rendszert nevezik „paraszimpatikus” viszceroszenzoros rendszernek is4) valamint a spinális idegeken keresztül („szimpatikus” viszceroszenzoros rendszer) éri el. Az agyi bemenetet négy agyideg szolgáltatja: a nervus trigeminus rendszere (arc, fej területéről származó viszcerális információ); a nervus facialis rendszere (ízlelés); a nervus glossopharyngeus rendszere (kemény szájpad, oropharynx, glomus caroticum beidegzése); a nervus vagus rendszere (oropharynx alsó részének, larynx, trachea, esophagus és számos thoracális, illetve abdominális szerv beidegzése, a pelvicus zsigerek kivételével, ezeket a sacralis spinális idegek innerválják5,6). A négy agyidegből eredő viszcerális afferensek a nucleus tractus solitarius-ban (NTS) végződnek, topografikus organizációt követve5. Az NTS –ből felszálló axonok az agy számos területét elérik, mint a ventrolaterális medulla, a hypothalamus, az amygdala, vagy a nucleus interstitialis striae terminalis (BNST)7 de a legfőbb viszceroszenzoros átkapcsoló állomás a parabrachialis mag. A parabrachialis mag legalább 13 almagot
6
tartalmaz, melyek kiterjedt innervációt adnak az agytörzs, a hypothalamus, a bazális előagy, a thalamus és az agykéreg több területére8-12. A felszálló rostok mellett, az NTS neuronok egy része az agytörzsi autonóm premotoros idegsejteken végződik és részt vesz a viszceroszenzoros információ továbbításában a viszceromotoros rendszer felé13. Az agyidegek által szállított információk mellett a cirkumventrikuláris szervek felől is érkezik viszceroszenzoros információ. A subfornicalis szerv (SFO), az organum vasculosum laminae terminalis (OVLT) és a perifornicalis mag angiotenzin II tartalmú rostokat küldenek a nucleus paraventricularis hypothalami (PVN) magnocellularis és parvocellularis neuronjaihoz14. A keringő adrenomedullin a PVN autonóm neuronjait aktiválja, mely hatás az area postrema adrenomedullin-érzékeny idegsejtjeinek hypothalamusba futó projekciói révén valósul meg15,16. A gerincvelői (spinális) viszceroszenzoros rendszer szállítja a belső szervekből jövő zsigeri információt, amely a központi idegrendszert a gerincvelői idegeken keresztül éri el. A hátsó gyökérben elhelyezkedő hőérzékeny, nociceptív neuronok viszcerális információt továbbítanak mechanikai, kémiai vagy termális stimulus hatására 17,18. Ezek a felszálló pályák nagymértékű átfedést mutatnak a szomatikus afferensekkel, ugyanakkor működésük legtöbbször nem válik tudatossá, kevesebb ingerülettípust továbbítanak és a viszcerális (tudatosult) fájdalom lokalizációja pontatlanabb. Viszonylag kis számú viszcerális szenzoros rost lép be közvetlenül a hátsó szarvba19, legnagyobb részük a lamina I-ben, a IV-V, illetve a VII és X –es rétegben végződik, emellett kis számban az intermediolaterális sejt oszlopban (IML) elhelyezkedő idegsejteket is elérhetik20-23. Általánosan jellemző, hogy a felszálló pályák kollaterálisai konvergálnak a cranialis idegek viszceroszenzoros rendszerével a központi idegrendszer minden szerveződési szintjén24,25. A lamina I –ben elhelyezkedő idegsejtek spinothalamikus axonjainak 80%-a küld kollaterálisokat a parabrachiális magba patkányok esetén26. A parabrachiális magból kiinduló rostok a medulla, hypothalamus, amygdala vagy az intralamináris thalamicus mag területére vetülnek
9,11,27,28
. A
gerincvelői felszálló projekciók egy része az agytörzsben végződik, majd az agytörzsi A1, A6 katekolaminerg magvakból felszálló rostok a ventrális noradrenerg köteghez csatlakozva innerválják a neuroendokrin hypothalamusz idegsejtjeit29-31. A rostrális raphe magokban elhelyezkedő szerotonin tartalmú idegsejtek a hypothalamusba és a limbikus rendszer felé proiciálnak32. A spinális afferensek előagyi vetületei a thalamus és agykéreg szintjén a craniális rendszernek megfelelő területeken találhatók és a craniális rendszer poszterolaterális folytatásának tekinthetők25. 7
A centrális viszceroszenzoros rendszer általános szerveződését végigkövethetjük az 1. ábrán, a felszálló nociceptív idegpályák példáján bemutatva.
1. ábra. A spinoretikulothalamikus traktus. Az ábrán a hypothalamusba és a limbikus rendszerbe felszálló nociceptív idegpályák láthatók. 1, Az agytörzsi katekolaminerg sejtekhez és a formatio reticularis neuronjaihoz futó projekciók; 2, az intalamináris és középvonali thalamikus magokban végződő terminálisok; 3, thalamikus projekciók a cortex cingularis és piriformis területére. A1, A2 – A1 és A2 noradrenerg sejtcsoportok; CC – cortek cingularis; CN – centralis amygdaloid nucleus; CP – cortex piriformis; GR – nucleus reticularis gigantocellularis; LC – locus coeruleus; LHA – area hypothalamica lateralis; PL – nucleus paragigantocellularis lateralis. Az eredeti ábra Pacak és Palkovits közleményében jelent meg13.
A viszceromotoros autonóm rendszer centrális része számos előagyi, agytörzsi magot és magcsoportot tartalmaz, melyek a szimpatikus, paraszimpatikus autonóm idegsejtek működésének szabályozásában vesznek részt vagy a neuroendokrin hypothalamus magcsoportjait innerválják. A funkcionális képalkotó eljárások eredményei szerint az 8
emberi agykéreg területén az anterior cinguláris kéreg, az insularis kéreg és az orbitofrontalis kéreg idegsejtjei valamint az amygdala részt vesznek az autonóm válaszok generálásában33,34. Anterográd és retrográd pályajelöléses kísérletek eredményei szerint majmokban az infralimbikus és prelimbikus areák innerválják a nucleus accumbens, amygdala, lateralis, medialis preopticus area,
nucleus
ventromedialis hypothalami (VMN), nucleus tuberomamillaris, a substantia grisea centralis (PAG) és a dorsomedialis, lateralis, posterior hypothalamicus magok neuronjait35. A centrális autonóm folyamatok egyik fő integrálója a hypothalamus ezen belül nucleus paraventricularis hypothalami (PVN). Rágcsálókban a PVN számos limbikus agyterületről kap innervációt. Ezeknek a bemeneteknek nagy része indirekt úton – valószínűleg GABA-erg interneuronok közvetítésével, kisebb része átkapcsolás nélkül végződik a parvocelluláris neuroszekréciós idegsejteken és a dorsalis, ventralis-mediális parvocelluláris projekciós neuronokon36. A limbikus területek közül a ventrális subiculumból, a prefrontális cortex területéről, az amygdalából, a BNST –ből bizonyítottan érkezik innerváció a PVN-be
37-39
. A hypothalamus területén a nucleus
dorsomedialis hypothalami (DMN) és a mediális preopticus area (MePOA), a nucleus arcuatus, nucleus premammillaris ventralis és a lateralis hypothalamicus area (LHA) szintén beidegzik a PVN neuroszekretoros és projekciós autonóm idegsejtjeit40. A hypothalamusból eredő autonóm pályarendszerek alapvetően három részre oszthatók:
(1)
projekciók
az
agytörzsben
vagy
gerincvelőben
elhelyezkedő
preganglionális idegsejtekhez (2) projekciók azokhoz az agytörzsi ketekolaminerg sejtcsoportokhoz melyek preganglionális neuronokat innerválnak (Ilyenek pl. az agytörzsi A5 katekolaminerg pre-autonóm neuronok, melyeket a PVN-ből jövő rostok bizonyítottan
beidegzik41),
(3)
azon
hypothalamikus
idegsejtek
projekciói
a
gerincvelőben és az agytörzsben elhelyezkedő szenzoros neuronokhoz, amik direkt vagy indirekt viszcero- illetve szomatoszenzoros innervációt kapnak (visszacsatolásos szabályozás)42. A gerincvelőbe és az agytörzsbe leszálló hypothalamikus rostok nagy százaléka oxytocin és vazopresszin tartalmú idegsejtekből ered31 de számos más neuropeptid, (enkefalinok, dynorphinok, neurotensin, POMC, angiotenzin II, galanin) is expresszálódik a projekciós a neuronokban43-45. Az A11 dopaminerg projekció kivételével ezek a leszálló rostok peptidergek43,44. A hypothalamus területén a PVN autonóm neuronjaiból eredő agytörzsi és gerincvelői projekciók kiemelkedő fontosságúak
az
autonóm
szabályozásban46,47. 9
Emellett
a
nucleus
arcuatus,
perifornicalis, supraopticus, mediális preopticus, dorsomediális, ventromediális és tuberomamilláris magcsoportok, valamint az A11, a retrochiasmaticus és a lateralis hypothalamikus areák idegsejtjei adnak innervációt az agytörzsi és gerincvelői autonóm idegsejtek számára48-50. Az agytörzsi katekolaminerg, viszceromotoros neuronok a locus coeruleusban (A6), a subcoeruleus régióban, valamint az A2, A5 és A7 noradrenerg és a C1, C3 adrenerg sejtcsoportokban helyezkednek el a vertolaterális medullában. Ezek innerválják a gerincvelői preganglionális neuronokat melyek többsége az IML –ben és a centrális autonóm magban (CAN) helyezkedik el51-57. Az agytörzsben lévő pre-autonóm neuronok integrálják a centrális autonóm idegsejtekből beérkező impulzusokat, szabályozzák a szimpatikus tónust, éberséget, a kardiovaszkuláris folyamatokat és a szimpatikus rendszer általános aktivitását58-61. A paraszimpatikus preganglionális neuronok a nyúltvelőben helyezkednek el, kisebb részük pedig a sacralis gerincvelőben (cranio-sacralis rendszer). Az agytörzsben a nucleus motorius nervi vagi (DMV), a superior és inferior salivatorius magok, valamint a caudalis medullában elhelyezkedő diffúz neuronpopuláció a nucleus ambiguus és a DMV közötti területen vesznek részt a centrális paraszimpatikus autonóm szabályozásban. A szimpatikus preganglionális neuronok alkotják a gerincvelő oldalsó szarvában, az intermediolaterális sejtoszlopot a thoracalis és első lumbális szegmentumokban (thoraco-lumbalis rendszer). Ezen kolinerg idegsejtek axonjai a paravertebrális dúclánc ganglionjain
végződnek.
A
thoraco-lumbális,
zömében
noradrenalin
tartalmú
szimpatikus ganglionokból eredő posztganglionális rostok csatlakoznak a perifériás idegekhez és beidegzik a különféle célszerveket. A mellékvese velő kromaffin sejtjeit, melyek 4:1 arányban adrenalint illetve noradrenalint szintetizálnak és ganglionokhoz
hasonlóan
dúcléc
eredetűek,
kolinerg
a határlánc
preganglionális
rostok
innerválják1. A szimpatikus idegrendszer a hypothalamus-hypophysis mellékvesekéreg (HPA) tengellyel együttműködve felelős a homeosztázis fenntartásáért és bármilyen stressz hatására a két rendszer elemei gyorsan aktiválódnak, ami a katekolaminok, glükokortikoidok perifériás elválasztásának emelkedését eredményezi. A katekolaminok ezen belül a kardiovaszkuláris tónus, szívritmus, metabolizmus és a termogenezis fő regulátorai. A centrális autonóm rendszer főbb efferens idegpályáit a 2. ábra foglalja össze. 10
2. ábra. A centrális autonóm rendszer főbb leszálló idegpályái. A jobb átekinthetőség kedvéért csak az ismert kapcsolatok egy részét ábrázoltam és az egyes idegpályákat unilaterálisan tüntettem fel. 1 – A limbikus területekről kiinduló projekciók a hypothalamus és az agytörzs felé (rózsaszín); 2 – a
11
hypothalamusból eredő projekciók, melyek közvetlenül, vagy az agytörzsben történő átpakcsolódás után érik el a szimpatikus, illetve paraszimpatikus preganglionális neuronokat (barna); 3 – a gericvelői intermediolaterális sejtoszlopból kiinduló projekciók a szimpatikus határlánc ganglionokhoz (kék); 4 – a szimpatikus határlánc neuronokból eredő posztganglionális idegrostok (zöld); 5 - a nervus vagus paraszimpatikus rostjai (piros). Rövidítések: A5 – A5 katekolaminerg sejtcsoport, Amb – nucleus ambiguus, Arc – nucleus arcuatus, BNST – nucleus interstitialis striae terminalis, C1 – C1 katekolaminerg sejtcsoport, CeA – centrális amygdala, DMV – nucleus motorius nervi vagi, GiA – nucleus reticularis gigantocellularis, IL – cortex infralimbicus, IML – intermediolateralis sejt oszlop, LC – locus coeruleus, MeA – medialis amygdala, PAG – substantia grisea centalis, PeF – nucleus perifornicalis, pir. - cortex piriformis, PoA – area preoptica, PVN – nucleus paraventricularis hypothalami, PrL – cortex prelimbicus, RCh – retrochiasmaticus area, RMg nucleus raphe magnus, S – szimpatikus határlánc, Sol – nucleus tractus solitarius, VG – vegetatív ganglion.
2.2. Az immunszervek autonóm beidegzése Az első eredmények a limfoid szervek beidegzéséről még a 19. század végén születtek, amikor olyan idegrostokat azonosítottak, amik belépnek a nyirokcsomókba62. Az idegrendszer és immunrendszer kapcsolatát később funkcionális vizsgálatok is megerősítették. A korai humán kutatások során kimutatták például, hogy szubkután adrenalin
injekció
hatására
intenzív
leukocitózis
figyelhető
meg,
valamint
tuberkulózisban szenvedő páciensek esetén a fagocita sejtek csökkent aktivitását írták le a betegek pszichogén stresszorokkal teli életperiódusában1. Mindezek ellenére, a csontvelő és a tímusz hematopoézisben és limfopoézisben betöltött szerepének részletes megismerését megelőzően, ezek a vizsgálatok nem tudták az immun- és idegrendszer kapcsolatrendszerét megfelelően értelmezni. Az immunológia és a neuroanatómiai pályajelöléses technikák fejlődésével az immunszervek beidegzése és ennek szerepe az immunfolyamatokban
fokozatosan
vált
ismertté.
Ebben
a
fejezetben
az
immunszervekben fénymikroszkópos immunhisztokémiával és elektronmikroszkópiával azonosított idegrostok típusait és lokalizációját tárgyalom röviden, külön kiemelve a csontvelő és a lép beidegzését. A limfoid szervek a vérerekhez hasonlóan elsősorban szimpatikus innervációt kapnak, mely elsősorban noradrenalin és neuropeptid Y (NPY) tartalmú idegsejtektől ered63. Számos tanulmány igazolta a limfoid szervek általános noradrenerg innervációjának meglétét az eddig vizsgált különféle állatfajokban mind az elsődleges (csontvelő és tímusz) mind a másodlagos nyirokszervekben (lép, nyirokcsomók)64-67. Általánosan jellemző, hogy a posztganglionális idegrostokat tartalmazó idegek a vaszkuláris elemekkel együtt lépnek be az immunszervekbe, ahol kisebb kötegekre oszlanak, majd az erek falának közelében végződnek vagy a szerv parenchymájában szabad idegvégződések
formájában
találhatók.
A
12
tímusz
esetén
a
szervbe
belépő
posztganglionális szimpatikus rostok zöme a kéregállományban, a szeptumok között és szubkapszuláris
régióban
található,
míg
csak
elvétve
találhatók
meg
a
velőállományban66,68-70. A legsűrűbb plexusok a kéregállomány külső részében találhatók, ahol az éretlen tímociták fejlődnek és a kortex mély rétegeiben ahol jelentős a tímociták migrációja. A dopamin β-hidroxiláz (DBH) és TH–immunpozitív rostok jelentős része a vaszkulatúrával asszociált71. Ultrastruktúrális vizsgálatok szerint ugyanakkor, a noradrenerg varikozitások közvetlen környezetében tímociták, hízósejtek, fibroblasztok és eozinofil granulociták találhatók72. A test különböző területén található nyirokcsomók beidegzésére általánosan jellemző, hogy noradrenalin tartalmú szimpatikus rostok az erekkel asszociáltan a hilus területén lépnek be, majd elágaznak és a vaszkuláris elemekkel együtt haladnak a nyirokcsomó velőállományán át. A velőállományban és a paracorticalis régióban a rostok egy része elágazik és az erektől függetlenül halad tovább73. A noradrenerg axonok innerválják a corticalis és paracorticalis T-sejt gazdag régiókat, de hiányoznak a B-sejt gazdag germinális centrumok területéről74. Érdekes módon, az emberi torokmandulák nyiroktüszőinek
nincs
noradrenerg
beidegzése75.
Az
immunszervek
általános
szimpatikus beidegzésének az egyik legismertebb funkcionális példája a katekolaminok immunmoduláns hatása (amit a mellékvese kéregből felszabaduló kortikoszeteroidokkal együtt fejtenek ki)76,77.
2.2.1. A csontvelő innervációja: A (vörös) csontvelő gazdagon vaszkularizált szerv, a hematopoézis elsődleges helye, ahol a vér sejtes elemei folyamatosan keletkeznek az élet során. A csöves csontokba belépő központi artéria longitudinális artériákra ágazik el, melyek újabb elágazások után kapillarizálódnak, majd vénás szinuszoidokban folytatódnak. A vérképző folyamatok a csontvelőben a vérerek közti, fibroblaszt jellegű retikulumsejtekkel kitöltött kötőszövetben mennek végbe Itt a hematopoetikus szövettel együtt fibroblasztok, adipociták, oszteoblasztok és számos egyéb sejttípus is megtaláható78,79. Az idegek a vérerekkel együtt lépnek be a csontvelőbe, a vaszkuláris plexusokkal együtt elérik a velőállományt, elágaznak a parenchymában és a hematopoetikus sejtek között, vagy a szinuszoidok falában végződnek. Immunhisztokémiával rágcsálókban a csontvelő állományában calcitonin gene-related peptid (CGRP), substance P (SP), NPY,
13
tirozin hidroxiláz (TH), és dopamin (DA) tartalmú idegrostokat azonosítottak. A rostok jelentős része az erek falában vagy annak közelében végződik, de direkt kontaktust is kimutattak az idegvégződések és a sztrómasejtek, illetve a hematopoetikus sejtek között 1,80-82
.
Ugyanakkor, a csontvelőben előforduló neurotranszmitterek/neuropeptidek
receptorai is expresszálódnak számos hematopoetikus sejttípusban, ami az idegsejtekből felszabaduló anyagok lokális, hematopoézisre gyakotolt hatására utal83-86. A rágcsálókban végzett vizsgálatok szerint a csontvelői innerváció a fötális élet késői szakaszában alakul ki, éppen a hemopoetikus aktivitás kezdetét megelőző időszakban82,87. A szimpatikus innervációnak a vérsejtek érésében és mobilizációjában lehet szerepe88. Nem ismert ugyanakkor, hogy milyen központi idegrendszeri struktúrák vesznek részt a csontvelőben zajló folyamatok szabályozásában és hogy az ezek által megvalósuló moduláció milyen súllyal esik latba a humorális szabályozó faktorok mellett.
2.2.2. A lép innervációja: A lépbe belépő splanchnicus ideg rostjainak 98%-a szimpatikus rost89, és több tanulmány eredményei szerint a lép innervációjának egészét tekintve a szimpatikus tónus
a
domináns.
A
noradrenerg
posztganglionális
rostok
a
ganglion
mesenterica/coeliaca –ból erednek és az idegek az arteria splenica-val együtt lépnek be a lép állományába. A vérerekkel együtt elágaznak és a trabeculák mentén trabecularis plexusok formájában haladnak tovább66. Noradrenerg rostok a legnagyobb sűrűségben a fehér pulpa centrális artétiájával asszociáltan fordulnak elő, a periarteriális hüvelyek (PALS) zónájában. Denz rosthálózat és varikozitások találhatók a periarteriális plexustól távolabb, a parenchymában is. A szimpatikus idegrostok a T-sejtes area, makrofágok és a B-sejt gazdag marginális régióban található sejtek között futnak és a marginális szinuszok (itt lépnek be a limfociták a lépbe) noradrenerg innervációja is jelentős68,90. A lokális innerváció immunmoduláns hatására utal, hogy a lép műtéti denervációja patkányok esetén gátolja az IL-1β és az IL-6 mRNS, illetve protein expresszióját mind a Trypanosoma brucei által fertőzött, mind pedig intakt állatok peritoneális makrofágjaiban 91.
14
2.3. A fehér és barna zsírszövet autonóm beidegzése Az emlős szervezetben a glikogén szolgál gyorsan mobilizálható, de mennyiségét tekintve nagyon korlátozott energiaforrásként. Az energiatárolás elsődleges helye a fehér zsírszövet (WAT), ahol a táplálékból felvett energia lipidek, elsősorban triacilglicerol formájában raktározódik92. A zsírzsövetben tárolt energia mobilizálásának folyamataiban az autonóm idegrendszer szerepe kiemelkedően fontos. A barna zsírszövet (BAT) fontos szerepet játszik a hideghatás-indukálta hőtermelés folyamataiban, valamint a túlzott mennyiségben bevitt táplálék energiatartalmának gyors felszabadításában. Ezekben a folyamatokban az autonóm beidegzés bizonyítottan részt vesz 93-95. 2.3.1. A fehér zsírszövet (WAT) innervációja: Régóta ismert, hogy a mellékvese velőállományából felszabaduló katekolaminok, elsősorban
az
adrenalin
szekréciója
stimulálja
a
zsírszövet
lipidraktárainak
mobilizációját. A központi idegrendszer autonóm magvai által iniciált szimpatikus aktiváció a preganglionális, majd posztganglionális szimpatikus rostokon át a szimpatikus tónus növekedésével stimulálja a mellékvese kromaffin sejtjeit, melyek adrenalint és noradrenalint juttatnak a keringésbe96,97. Sokáig úgy vélték, hogy nincs direkt beidegzése a WAT zsírsejtjeinek és a zsírszövetben azonosított idegrostokat a vaszkuláris innerváció elemeinek tartották98,99. Később nyilvánvalóvá vált (éheztetett állatok zsírsejtjeinek vizsgálata során, amik lipidtartalmukat elvesztve zsugorodtak és a beidegző rostok láthatóak lettek), hogy az adipociták és az erek is kapnak szimpatikus innervációt100,101. A fehér zsírszövetben adrenalin102, noradrenalin103,104, CGRP105 tartalmú rostokat azonosítottak. 2.3.2. A barna zsírszövet (BAT) innervációja: Elhelyezkedése szerint, a legtöbbet vizsgált barna zsírszövet típus, rágcsálókban könnyű megközelíthetősége miatt az interscapularis barna zsírszövet. Az interscapularis BAT szimpatikus innervációját az intercostalis idegek szállítják, melyek a két különálló interscapularis zsírpárnát szeparáltan idegzik be106. Fluoreszcens mikroszkópiával gazdag noradrenerg innervációt mutattak ki az erek falának közelében és a zsírsejtek
15
között is. 6-hidroxi-dopamin (6-OHDA)–al végzett kémiai denerváció hatására a barna zsírszövet noradrenalin tartalma radikálisan lecsökkent
107
. A BAT –ban található
noradrenerg varikozitások száma és a zsírsejtek noradrenerg innervációja hideg vagy meleg környezethez akklimatizált genetikusan sovány, illetve kövér (ob/ob, leptindeficiens) egerekben elsősorban a külső hőmérséklet, nem az elhízottság függvénye108. A patkány mediasztínális barna zsírszövetében acetilkolin tartalmú paraszimpatikus rostokat is kimutattak szimpatikus, noradrenerg rostokkal együtt109. 2.4. A neuroanatómiai pályajelölés (tracing) Az elmúlt 30 évben, a különféle neuroanatómiai pályajelöléses módszerek alkalmazása sok új információval szolgált az idegrendszer szerveződésére és működésére vonatkozólag. A különböző alkalmazott módszerek közös célja az idegsejtek közötti kapcsolatrendszerek felderítése.
A korai neuroanatómiai pályajelöléses technikák
egyszerű degenerációs módszert használtak: az idegrostok átmetszése vagy terminális mezők roncsolása a proximális rostok pusztulását eredményezi, ami ezüst impregnációs módszerrel kimutatható110. A modern jelölőanyagok (tracerek) az idegsejtek passzív vagy aktív transzportfolyamatait használják fel. Az axonális transzport mechanizmusok (axoplazmatikus áramlás, motorfehérjék) felhasználása szerint a neuroanatómiai tracerek alapvetően kétféle csoportba sorolhatók: -
Retrográd tracerek, melyek terjedése retrográd axonális transzportfolyamatok felhasználásával megy végbe. Ezek alkalmazásakor az adott területre vetülő idegrostok terminálisai (többnyire endocitózissal) a tracert felveszik, majd a sejttestbe szállítják, így a beadás helyére proiciáló idegsejtek lokalizálhatók. Ilyenek a torma peroxidáz (HRP), a cholera toxin beta (CTB) vagy a Fast Blue (FB)
-
Anterográd tracerek, melyek terjedése anterográd axonális transzportfolyamatok felhasználásával megy végbe. Ebben az esetben a beadás helyén elhelyezkedő idegsejtek dendritjei/sejtteste veszik fel a tracert és a mikrotubuláris rendszer segítségével a nyomjelző anyag a sejt szinaptikus terminálisai felé transzportálódik111. Ilyen a Phaseolus vulgaris leucoagglutinin112, a DiI vagy a fluoreszcens dextrán-amin konjugátumok113.
A különféle tracerek kimutatása történhet: (I) hisztokémiai reakcióval, ilyen pl. a HRP, (II) immunhisztokémiával, ilyen a CTB, illetve a Phaseolus lectin vagy (III)
16
autofluoreszcencia alapján, ilyenek a Fluorogold, FB, True Blue (TB), Nuclear Yellow (NY), Lucifer Yellow (LY), vagy a fluoreszcens dextrán-amin konjugátumok. A poszt-mortem minták vizsgálatánál a különféle lipidoldékony anterográd nyomjelző anyagok, mint DiI széles körben használtak és fixált szöveteknél is alkalmazhatók114. A klasszikus neuroanatómiai pályajelöléses módszereket az autonóm idegrendszer perifériás vagy centrális kapcsolatrendszereinek felderítésében számos tanulmány alkalmazta. A periférián a lokális szimpatikus és paraszimpatikus rostok eredetét a különféle szervek esetében retrográd jelölőanyagokkal vizsgálták. Cholera toxin-torma peroxidáz konjugátum hasnyálmirigybe és gyomorfalba injektálását követően retrográd módon jelölődött idegsejteket mutattak ki vagus dorsalis motoros magjában (DMV) patkányok esetén
115,116
. A fehér zsírszövetbe vetítő szimpatikus, T13-L3 határlánc-
ganglionsejteket FluoroGold inguinális és epididimális WAT-ba történő injektálásával azonosították. A neuroanatómiai kapcsolat meglétét úgy is igazolták, hogy egyidejűleg anterográd DiI jelölőanyagot juttattak a határlánc-ganglionokba, amely a zsírsejtek között futó rostokban kimutatható volt 103. Hasonlóképpen, a centrális autonóm szabályozásban részt vevő magokban - mint a PVN- elhelyezkedő projekciós idegsejteket, melyek agytörzsi és gerincvelői autonóm magokba vetítenek, retrográd tracerekkel térképezték fel 46,47. Problémát okoz, hogy a klasszikus, monoszinaptikus tracerek nem képesek a szinaptikus
kapcsolatban
lévő
funkcionális
idegsejt-hálózatok
többszintű
feltérképezésére, csak monoszinaptikus kapcsolatok kimutatására alkalmasak. A transszinaptikusan terjedő neurotróp vírusok neuroanatómiai tracerként történő felhasználása
ezért,
számos
új
információval
szolgált
az
idegsejtek
kapcsolatrendszereinek felderítésében. Az alfa-herpeszvírus családba tartozó herpes simplex vírust (HSV)117, pseudorabies vírust (PRV)118 és az előbbiekkel nem rokon, de szintén
neurotróp
veszettség
vírust119
sikeresen
használták
pályajelölésre.
Mindazonáltal, a PRV- tracinget alkalmazó kísérletek vezettek a legtöbb eredményre és váltak a neuroanatómiai vizsgálatok legelterjedtebb gyakorlati eszközévé. 2.5. Neuroanatómiai pályajelölés pseudorabies vírussal A neurotróp pseudorabies vírus természetes gazdaállata a sertés, amelynek főleg fiatal egyedeiben okoz a vírus akut, gyakran fatális megbetegedést (Aujeszky betegség)120. Emellett, rágcsálókban képes a környéki és központi idegrendszer elemeinek
17
fertőzésére, ami alkalmassá teszi pályajelöléses kísérletekre. Mivel emberekben (valószínűleg a primáták szérumában jelenlévő neutralizáló antitestek miatt)121 a vírus nem okoz megbetegedést, ezért – a szükséges biztonsági előírások szigorú betartása mellett – biztonságosan alkalmazható. 2.5.1. A vírus replikációja, transszinaptikus terjedése: A pseudorabies vírus (az alfa-herpeszvírus család többi tagjával együtt) örökítő anyaga lineáris, kétszálú DNS, ami hozzávetőlegesen 80 gént kódol. A virális gének körülbelül 50%-a nem szükséges a vírus replikációjához sejtkultúrákban, viszont fontos szerepet töltenek be a vírus neurotrofizmusában in vivo. A PRV genom a vírus kapszidban helyezkedik el, melyet egy, speciális fehérjék által felépített „tegument” és egy külső, glikoproteinekből álló burok „envelope” vesz körül122. A produktív infekciót megelőzően, a vírus partikulumok a sejtek plazmamembránján lévő speciális receptorokhoz kötődnek. A vírus envelope glikoprotein D-vel a nectin molekulacsalád (vírusreceptor) tagjai lépnek kapcsolatba, amik nagy affinitásbeli variabilitást mutatnak a különböző herpeszvírus törzsek tekintetében123,124. A vírus adhézióját követi a virális burok (envelope) és a sejt membránjának fúziója, melynek során a nukleokapszid a körülvevő tegumenttel együtt a citoplazmába kerül. A kapszid a perikarion felé migrál, ahol a DNS a tegument fehérjékkel együtt a sejtmagba jut és elkezdődik a replikáció. A litikus ciklus során a virális gének időben szabályozott kaszkád szerint fejeződnek ki, először az „immediate-early” (IE), majd az „early” (E) és végül a késői „late” (L) gének125. A kellő számú kópia elérése után a vírus DNS kapszidokba csomagolódik, amik kijutnak a magból. Az endoplazmatikus retikulumon áthaladva kerülnek a kapszidok a Golgi apparátusba, ahol kettős membrán burkolat alakul ki körülöttük122,126. Az érett víruspartikulumok a perikarionban és a dendritekben mindenütt megtalálhatók. A vírus replikációs ciklusa idegsejtekben körülbelül 6 óra127. Az idegsejtből való kilépéskor a vírus külső membránja fúzionál a plazmamembránnal és a virionok kijutnak az intracelluláris térből. A folyamat összefoglalása a 3. ábrán látható. Elektronmikroszkópos vizsgálatok igazolták, hogy a víruspartikulumok túlnyomó többsége nem kerül ki az extracelluláris térbe, hanem a szinaptikus végződéseken keresztül bejut az afferens idegsejtekbe (retrográd transszinaptikus tejedés)126. Arra is vannak adatok, hogy a vírus az idegsejtekben kapszidok és envelope fehérjék formájában, és nem mint összeszerelődött, egész virion terjed128,129.
18
3. ábra. α-herpeszvírus fertőzés. A. A víruspartikulumok specifikus sejtfelszíni receptorokhoz kötődnek, majd a virális „envelope” fúzionál a plazmamembránnal, aminek eredményeképp a nukleokapszidok a citoplazmába jutnak. A vírus DNS és a tegument fehérjék bejutnak a sejtmagba, ahol megtörténik a vírusgenom replikációja. A DNS az időközben összeszerelődött kapszidokba csomagolódik. Ezt követően a nukleokapszidok elhagyják a sejtmagot, átjutnak az endoplazmatikus retikulumon és exocitotikus vezikulába csomagolódva kijutnak a sejtből (B). Az eredeti ábra Boldogkői és munkatársai közleményében jelent meg122.
19
A morfológiailag eltérő típusú, szinaptizáló afferens rostok között nem találtak lényeges eltérést a vírus felvételében, sem a sejttesten, sem a dendriteken végződő terminálisok esetén126. Itt kell megjegyezni, hogy gazdaállataik idegsejtjeiben az alfaherpeszvírusok elsősorban anterográd módon terjednek és a szinaptikusan kapcsolt posztszinaptikus idegsejteket fertőzik122. A pseudorabies vírus „vad” típusú törzsei – mint a PRV-Becker- retrográd és anterográd terjedésre is képesek rágcsálókban. Az axonon belüli terjedés sebessége megfelel a kinezin (anterográd) és dinein (retrográd) motorfehérjék sebességének, 1,97 illetve 1,28 μm/s129,130. Az α-herpeszvírusok terjedésének folyamatait a fertőzött idegsejtben a 4.ábra foglalja össze.
4. ábra. Az α-herpeszvírusok terjedése a fertőzött neuronokban. A replikációt és összeszerelődést követően az érett virionok kijutnak a szinaptikus résbe, ahol megfertőzik a szinaptikusan kapcsolt neuronokat. Az eredeti ábra Boldogkői és munkatársai közleményében jelent meg122.
Az anterográd terjedésért a vírus glikoprotein E és glikoprotein I fehérjéi felelősek131, melyek közül a glikoprotein E az attenuált (természetes mutáns) Bartha törzs genomjából hiányzik132. Ezért a vírus szinte kizárólag retrográd módon terjed133. Ez a tulajdonság, valamint a vad törzseknél alacsonyabb infektivitása tette a Bartha törzset alkalmassá a neuroanatómiai pályajelöléses kísérletekben történő alkalmazására. 2.5.2. Transszinaptikus pályajelölés: Az első pályajelöléses kísérleteket pseudorabies vírussal Strack és munkatársai végezték a 80-as évek végén, amikor PRV mellékvesébe injektálását követően retrográd virális
fertőzést
mutattak
ki
a
szimpatikus
preganglionális
neuronokban
a
gerincvelőben, valamint agytörzsi és hypothalamikus magokban134. Kimutatták, hogy a gerincvelői fertőzés ugyanazokban a szelvényekben fordul elő, ahol a monoszinaptikus, 20
mellékvesébe injektált FluoroGold jelölődés található és megállapították az agyban megjelenő fertőzött idegsejtek fenotípusát135. A vírus felvételének, terjedésének feltételeit és körülményeit a különböző pályarendszerkben azóta számos tanulmány vizsgálta. Megállapították, hogy az injektált vírus törzs infektivitása, a beadott volumen, a vírus titere, a terminálisok sűrűsége a beadás helyén befolyásolják a fertőzés sebességét, a fertőződő idegsejtek számát és a kísérleti állatok túlélését122,136,137. Centrális beadás esetén a vírus diffúziója a beadás helyén csekély, ugyanakkor nemcsak a terminálisok, de a beadás helyén átmenő rostok is fertőződnek, igaz, kisebb arányban127. A PRV-Bartha retrográd úton terjed a központi idegrendszerben, de nem, vagy csak korlátozottan képes anterográd terjedésre133. A Bartha törzs alkalmazásával számos perifériás szerv központi idegrendszeri autonóm beidegzését térképezték fel, mint a szubmandibuláris nyálmirigy138, hasnyálmirigy139, prosztata140, vese141, vastagbél142, szív143, fehér zsírszövet144, barna zsírszövet93, vagy a lép145. A vírus perifériás szervbe történő injektálása után a fertőzés az autonóm pályákon transszinaptikusan halad retrográd irányban, ami a vírus burokfehérjék ellen termeltetett antitesttel kimutatható146. A fertőzés képe nagy hasonlóságot mutat a különféle perifériás célszervek (beadási területek) esetében, aminek eredményeképp az autonóm rendszer
általános
szerveződési
szintjeinek
leképezését
látjuk
a
fertőződő
magcsoportokban. A kísérleti állatok túlélési idejének növekedésével a beadás helyére proiciáló
idegsejtek
egyre
távolabbi
szinaptikus
partnerei
válnak
fertőzötté
transszinaptikus úton és az infektált neuronok száma növekszik. A vírus által okozott fertőzés a posztganglionális neuronokban jelenik meg először, amik a beadás helyére vetítenek, majd a gerincvelői illetve agytörzsi preganglionális neuronok (IML, illetve centrális autonóm nucleus, CAN) jelölődnek. Monoszinaptikus retrográd tracerek mellékvesébe és a vírus ganglion stellatumba való együttes injektálásával igazolták, hogy a PRV-Bartha törzs által okozott fertőzés a funkcionális kapcsolatban lévő IML neuronokban jelenik meg és nem szomszédos, de nem a célterületre vetítő idegsejtekben147. A túlélési idő növelésével a fertőzés eléri az agytörzsi, hypothalamikus pre-autonóm sejteket, valamint hosszú túlélés esetén a kapcsolódó corticalis területeket. A monoszinaptikus tracerekhez képest a transszinaptikus virális pályajelölés számos előnnyel jár. A vírus „önerősítő”, azaz a replikáció miatt, minden szinaptikus kapcsolaton keresztül megfertőzött idegsejtben megsokszorozódik és így válik képessé 21
újabb neuronok fertőzésére, ezáltal könnyen detektálható a pályarendszer minden szintjén. A transszinaptikus terjedés lehetőséget ad az idegi hálózatok többszintű vizsgálatára. A virális pályajelölés alkalmas az idegsejtek közötti szinaptikus kapcsolatok kialakulásának, átrendeződésének tanulmányozására sőt funkcionális plaszticitás vizsgálatokra is.
Card és munkatársai sikerrel alkalmazták a virális
pályajelölést a centralis autonóm projekciók korai posztnatális kialakulásának vizsgálatában patkányokban148. A maternális depriváció hatására a fejlődő cortexben és a limbikus rendszerben bekövetkező szinaptikus átrendeződéseket is kimutatták retrográd virális tracinggel149. A virális pályajelölések során ugyanakkor sok a felmerülő probléma és bizonytalansági tényező. A vírus által okozott citopatogenitás miatt a fertőzött idegsejtek degenerálódnak. A kialakuló centrális gyulladás és a vírusfertőzés okozta neuron elhalás miatt az injektált kísérleti állatok elpusztulhatnak, ami (főleg a vírulensebb vírustörzsek beadása esetén) limitálhatja, hogy hány szinapszis távolságra jut el a vírus a beadás helyétől (túlélés problémája). A fertőzött idegsejtekben a vírus által expresszált virion host shutoff (VHS) protein122,150,151 működése miatt a neuronok által kifejezett transzmitterek mRNS-ei degradálódhatnak. Ezért problémát okozhat a fertőzött neuronok neurokémiai karakterizálása, mivel a vírus strukturális fehérjéi (amiket immunhisztokémiával kimutatva a fertőzött idegsejtek azonosíthatók) a fertőzés relatíve késői szakaszában jelennek meg. Mindezek ellenére, a katekolaminerg sejtek általában jól azonosíthatók tirozin hidroxiláz (TH)141,152, dopamin-β-hidroxiláz (DBH)145
és
immunhisztokémiai
feniletanolamin-N-metiltranszferáz vagy
immunfluoreszcens
(PNMT)141
kimutatásával.
enzimek
Emellett,
kolin
acetiltranszferáz (ChAT), szomatosztatin, substance P (SP), vazopresszin, oxytocin, vazoaktív intesztinális peptid (VIP), szerotonin, tirotropin rilízing hormon (TRH) kimutatásáról is beszámoltak PRV fertőzött idegsejtekben141,153,154. A fertőzés kizárólag transszinaptikus retrográd terjedése is sokszor megkérdőjelezhető a PRV-Bartha esetén. A vírus dorsalis prefrontalis cortexbe történő injektálását követően a striatum felé történő anterográd transzneuronális terjedés kis mértékű, de kimutatható155.
22
2.5.3. Rekombináns „második generációs” vírus tracerek – ripoter fehérjék beépítése: A vírusgenom módosítására és fejlettebb „tracer” vírusok előállítására többféle megoldás született. Ilyenek a zöld fluoreszcens protein (GFP) vagy LacZ gének beépítése a vírus DNS állományába122,156-158. A vírus replikációja során expresszálódó riporter fehérjék (GFP, vagy LacZ esetén β-galaktozidáz) lehetővé teszik a fertőzött idegsejtek direkt fluoreszcens illetve immunofluoreszcens azonosítását és izogén vírustörzsek koinjektálása során (kettős virális pályajelölés) a különböző törzsek azonosítását. A kettős virális pályajelölés alkalmazása lehetővé teszi annak megállapítását, hogy azonos vagy különböző neuronpopulációk vesznek-e részt két különböző célszerv beidegzésében. Kettős vírusbeadással kimutatták, hogy a menyétben a diaphragmát és rectus abdominis izmot innerváló idegsejtek egy része a nyúltvelői légzőközpontban elkülöníthető populációt alkot (csak egy vírussal fertőződött), de számos neuron kollaterálist küld mindkét izomhoz (mindkét vírussal fertőződött)159. Két független tanulmány kettős vírusbeadást használva mutatta ki, hogy az agytörzs és a hypothalamus több magcsoportjában olyan (szimpato-motor) idegsejtek találhatók, melyek mind a szomatomotoros, mind az autonóm (viszceromotoros) idegrendszer neuronjaihoz küldenek kollaterálisokat160,161. A fluoreszcens riporter fehérjék a vírussal fertőzött idegsejtek akut agyszeleten vagy retinális preparátumon történő azonosítását és elektrofiziológiai vizsgálatát is lehetővé teszik157,162,163. 2.5.4. Rekombináns „második generációs” vírus tracerek – a „Dup” vírusok: A vírus infektivitása döntő tényező a specifikus terjedés és a túlélési idő szempontjából. A pályajelölés eredményességét tekintve az ideális vírus kis citopatogenitású, lassú, specifikus transzneuronális terjedésre képes (nem fertőz meg szinaptikusan nem kapcsolt idegsejteket) és nem öli meg a kísérleti állatot mielőtt kellő számú (5-7) szinaptikus kapcsolatban lévő idegsejten áthalad. A „Dup” víruscsalád izogén tagjait (Ba-DupGreen, BDG és Ba-DupRed, BDL) a Bartha törzs rekombináns módosításával állították elő158.
A vírusok terjedési
tulajdonságai eltérést mutatnak a PRV-Bartha –hoz képest, ami a LacZ (BDL) és GFP (BDG) gén expressziós kazettáknak a virális „putative antisense promoter” (ASP) régióba történő beépítésének eredménye. Így a BDG vírus által fertőzött sejteket GFP, a
23
BDL által fertőzött sejteket β-gal expresszió alapján azonosíthatjuk. Mindkét riporter gén a humán citomegalovírus „immediate-early (IE) one” promóter irányítása alatt áll. Ezek a rekombináns vírusok az autonóm neuronokat lassabban fertőzik és a fertőzés kevesebb idegsejtet érint mint az eredeti Bartha törzs esetében. A lassabb trasszinaptikus terjedés miatt a Ba-Dup vírusokkal hosszabb túlélési idő valósítható meg, ami magasabb rendű agyterületek transszinaptikus elérését is lehetővé teszi. A citomegalovírus IE promóter által meghajtott GFP és LacZ gének a fertőzött idegsejtekben a fertőzés nagyon korai szakaszában kimutathatók, ami lehetővé teszi azok neurokémiai azonosítását.
Így mRNS-ek kimutatására is lehetőség nyílik a
fertőzött neuronokban, mint például a szerotonin tartalmú neuronokban expresszálódó szerotonin-transzpoter (5-HTT) mRNS158. A ripoter fehérjék az IE expressziós kinetika miatt a fertőzött sejtekben jóval korábban kimutathatók, mint a virális struktúrfehérjék (PRV),
melyek
a
fertőzés
későbbi
stádiumában
jelennek
meg
(5.ábra).
5.ábra. A BDG vírus génexpressziós kaszkádja. A vírus DNS sejtmagba történő bejutását követően az immediate early (IE) kinetikával kifejeződő IE180 transzaktivátor fehérje azonnal megjelenik a fertőzött sejtekben, más vírusfehérjék jelenlététől függetlenül. Ezt követi a korai (E) gének átíródása (vízszintes fekete nyilak). A késői gének (vízszintes kék nyilak) a vírus strukturális fehérjéit kódolják (L). A BDG esetén a GFP a humán citomegalovírus IE1 promoter kontrollja alatt áll, ami nagyon korai génexpressziót eredményez. A vírus strukturális fehérjéi később jelennek meg a fertőzött sejtekben. A PRV fertőzés késői stádiumában –valószínűleg a vírus okozta degradációs folyamatok miatt - a GFP eltűnik a fertőzött sejtekből. Így az újonnan fertőződött sejtek csak GFP-t fejeznek ki, később GFP-t és virális strukturális fehérjéket együtt, majd a fertőzés késői stádiumában csak a vírus strukturális fehérjéi detektálhatók. Rövidítések: UL, unique long region; US, unique short region; IR, internal repeat; TR, terminal repeat; rr1, a ribonukleotid reduktáz gén nagy alegysége; tk; timidin kináz gén; gC, glikoprotein C-t kódoló gén; ep0, early protein 0; gfp, green fluorescent protein; ie180, immediately early 180 gén; gE, glikoprotein E. A nyilak (gének) és gömbök (fehérjék) színkódja: szürke: IE180 gén és fehérje; fekete: korai (E) gének és fehérjék; kék: késői (L) gének és fehérjék.
24
A BDG esetén a fertőzés kezdeti stádiumában csak a GFP expresszió detektálható, majd a GFP és PRV fehérjék együttes kifejeződése figyelhető meg. A fertőzés késői stádiumában a GFP eltűnik a fertőzött sejtekből, vagy mennyisége a detekciós küszöb alá esik, így az ilyen sejtek csak a PRV proteineket expresszálják.
2.6. A pseudorabies vírus fertőzés hatására kialakuló gyulladásos folyamatok a központi idegrendszerben Bár a human populáció több mint 90%-a fertőzött valamilyen herpeszvírussal, viszonylag ritkán, főleg immundeficiens egyénekben okoz a herpes simplex virus (HSV) fatális encephalitist és a súlyos akut fertőzések is ritkák164,165. Ebben minden bizonnyal kiemelt szerepe van az agyi immunkompetens gliális sejtalakoknak mint az asztrocita vagy a mikroglia és a perifériáról beáramló leukocitáknak166,167. A rágcsálókban illetve a humán ganglion trigeminale-ban és a perifériás ganglionokban a látens herpeszvírus fertőzés során a HSV transzkripcionálisan aktív, de a latenciaasszociált transzkriptumok (LAT) kifejeződése miatt nem okoz litikus fertőzést. Reaktivációkor a vírus expressziós profilja megváltozik, és replikációt követően anterográd terjedéssel a szenzoros neuronok nyúlványain keresztül eléri a bőrfelszínt ahol léziókat okoz, de csak ritkán következik be súlyos cetrális fertőzés165,168-171. Perifériás vagy centrális beadás után, a pseudorabies vírus által okozott fertőzés rágcsálókban akut és döntően retrográd úton terjed. A vírus eléri a központi idegrendszert, ahol a fertőzött idegsejtek száma az idő előrehaladtával nő, ami gyakran a kísérleti állatok pusztulásához vezet. A korai kutatások kimutatták, hogy centrális pseudorabies vírus fertőzés hatására az agyi mikroglia és asztrocita sejtek aktiválódnak rágcsálókban mind virulens, mind attenuált vírus törzsek esetén. A fertőzés kezdeti stádiumában a mikrogliákban az OX42 és az asztrocitákban a GFAP expressziója nő, majd a GFAP immunpozitivitás a fertőzés előrehaladtával fokálisan csökken, míg az OX42 erősödik172. A fertőzés során ED-1 –et expresszáló makrofágok inflitrációja is megfigyelhető, melyek egy része immunpozitív a vírus antigénekre172. Elektronmikroszkópos vizsgálatok eredményei azt mutatják, hogy a degenerálódó fertőzött neuronokból kiszabaduló vírus extraszinaptikus terjedését az asztociták és a mikroglia sejtek korlátozzák. A gliális elemek fertőződhetnek a vírussal, de infektív virionok nem szabadulnak fel ezekből (nonpermisszív infekció)126.
25
A Becker (vad típusú PRV) törzs intravitreális injektálása során patkányokban, az anterográd és retrográd úton fertőződött agyterületeken perifériás makrofágok, CD4+ és CD8+ T- limfociták infiltrációját mutatták ki173. Cornealis HSV-1 fertőzést követően a ganglion trigeminale-ban végbemenő vírális replikáció hatására (litikus ciklus), 3 nappal a beadás után emelkedett a HSV antigének mennyisége, de lecsökkent a 7. napra. Ez a csökkenés együtt járt a Mac-1+ sejtek és CD8+ T-limfociták számának nagymértékű növekedésével a fertőzött idegsejtek közelében, valamint az interferon gamma (IFNγ) és interleukin-4 (IL-4) citokinek mennyiségének emelkedésével174. A vírusfertőzés hatására
kialakuló
agyi
gyulladás
tehát,
a
centrális
és
perifériás
eredetű
immunkompetens sejtek közreműködésével együtt, vélhetően képes a vírusfertőzés terjedésének korlátozására. Nem ismert ugyanakkor, pontosan milyen celluláris folyamatok során valósulnak meg a virionok és a fertőzött idegsejtek eltakarítása és a virális
fertőzés
továbbterjedésének
26
lokális
gátlása.
3. Célkitűzések
1. A csontvelő autonóm beidegzésében részt vevő központi idegrendszeri struktúrák azonosítása rekombináns pseudorabies vírus törzsek felhasználásával, transzszinaptikus pályajelöléssel.
2. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációjának és fenotípusának felderítése, kettős virális pályajelöléssel. A vizsgálatok célja, hogy megállapítsa, vajon a két zsírszövettípus eltérő működése és funkcionális szerepe betudható-e a lokális innerváció által közvetített eltérő központiidegrendszeri autonóm szabályozásának.
3. A pseudorabies vírus fertőzést kísérő centrális immunfolyamatok sejtszintű vizsgálata és szerepük bizonyítása a vírus nem specifikus terjedésének megakadályozásában.
27
4. Anyagok és Módszerek 4.1. Vírusok A rekombináns pseudorabies vírus törzseket (Ba-DupGreen, BDG; Ba-DupLac, BDL) Dr Boldogkői Zsolt (Szegedei Tudományegyetem) bocsájtotta rendelkezésünke, melyeket
a
Bartha
törzs
módosításával
állítottak
elő158.
A
módosítások
eredményeképpen a „Dup” vírus törzsek alacsonyabb infektivitással rendelkeznek mint az eredeti Bartha törzs, lassabban terjednek a különféle idegi hálózatokban és kevesebb idegsejtet fertőznek (részletesebben lásd a bevezetőben, a vírusok genetikai felépítése és a terjedés sajátosságainak bővebb magyarázata megtalálható a korábban megjelent közleményekben)122,158. A vírusok felnövesztése immortalizált disznó vese sejtvonalon (PK-15) történt steril körülmények között. A konfluens vírusfertőzött sejtkultúrák (alapkultúrák) felülúszója milliliterenként átlagosan 6x108 plakk formáló egységet (PFU) tartalmazott. A vírustartalmú felülúszót 2000xg -n és 4 oC –on centrifugáltuk 15 percig, ezzel elválasztva a PK-15 sejtektől, majd 0.45 μm átmérőjű PVDF (Millipore) membránon átszűrtük. Ezt követően ultracentrifugálással töményítettük 70000xg –n, 1 óráig, ami 1.5x1010 PFU/ml –es titert eredményezett. Az így kapott töményített vírust (sejtmentes) illetve az alakpultúrákat a PK-15 sejtekkel együtt aliquotoltuk, majd -80 oC –on tároltuk felhasználásig. Az infektív titer meghatározása disznó here sejtvonalon történt. A vírusbeadás során a műtéthez használt mennyiséget közvetlenül a beadás előtt olvasztottuk fel. A nem töményített, PK-15 sejteket is tartalmazó alapkultúrák esetén a vírust tartalmazó felülúszót a felolvasztás után centrifugálással (2000xg, 10 perc) a sejtektől elválasztottuk. A vírusokat a műtét közben 4 oC –on tároltuk, hogy titerük állandó maradjon. 4.2. Kísérleti állatok A kísérleteket 300-350 grammos hím Wistar patkányokon végeztük (Toxi-Coop, Budapest, illetve MTA KOKI Orvosi Géntechnológiai Részleg, Budapest). Az állatokat (21 ± 2 oC), páratartalmú (60 ± 10 %) és 12h/12h sötét-világos fényciklusú (a világos
28
periódus kezdete reggel 7.00) szobákban tartottuk, ahol szabványos rágcsálótáphoz és vízhez szabadon hozzáférhettek. Az állatkísérletek az Európai Unió vonatkozó irányelvei (86/609 EEC) és a Magyar Kormányzat 243/98 direktívája szerint folytak. A vírusbeadásokat a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetben (MTA KOKI) végeztük a 3256/002/203 iktatási számú, „Neuroanatómiai pályajelölés retrográd vírusokkal” című állatkísérleti engedély alapján. A vírusbeadásokat követően az injektált állatokat külön ketrecekben helyeztük el. A műtéti beavatkozások és fertőzés által okozott diszkomfort minimalizálása érdekében az állatokat naponta kétszer ellenőriztük. Amennyiben súlyos szisztémás vírusfertőzésre utaló jelet észleltünk bármely állatnál, azt késedelem nélkül túlaltattuk. 4.3. Sejtkultúrák és in vitro víruskinetikai vizsgálatok Annak megállapítására, hogy a BDG vírus struktúrális (kapszid és burok) fehérjéinek (PRV) kifejeződése milyen latenciával követi az IE kinetikával expresszált GFP riporter protein megjelenését a fertőzött sejtekben, in vitro vizsgálatokat végeztünk. Ennek során PK-15 (disznó vese sejtvonal) és NE-4C (immortalizált neuroectodermális sejtvonal175) sejteket fertőztünk BDG-vel. Az NE-4C sejtvonalat poli-L-lizinnel borított Petri-csészékben növesztettük Minimum Essential Medium-ban (MEM; Sigma-Aldrich), 4 mM glutamin (Sigma-Aldrich), 40 mg/ml gentamycin (Chinoin, Budapest) és 5% fötális borjú savó (FCS; Gibco-BRL-Life Technologies, Egyesült Királyság) jelenlétében, 370C-on, 5% CO2-dal dúsított atmoszférában. A PK-15 sejtek felnövesztéséhez ugyanezt a tápfolyadékot használtuk 25 mM Hepes (Sigma) jelenlétében. A vírussal való inkubációt megelőzően mindkét sejttípust 35 mm-es, poli-L-lizinnel borított Petri-csészékbe helyeztük 2x105 PFU/ml – es koncentrációban. Minden kultúrát ugyanabból a 2x106 PFU/ml titerű BDG aliquotból vett vírussal fertőztük. A MOI (multiplicity of infection) értéke 10 PFU/sejt volt. A sejtkultúrákat egyszerre fertőztük BDG-vel, majd 30 perces inkubációt követően a nem kötődött virionokat többszöri PBS-el történő mosással eltávolítottuk. A fertőzést követően, az 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 és 10 órával a kultúrákat 2%-os PFA oldatban fixáltuk (2% PFA 0.1 M PBS-ben, pH 7.4).
29
4.4. Vírusok injektálása A műtéti beavatkozásokhoz a kísérleti állatokat 50 mg/kg ketamin (Richter, Budapest), 10 mg/kg xylazin (Spofa, Cseh Köztársaság) és 5 mg/kg prometazin (EGIS, Budapest) keverékének intraperitoneális injekciójával altattuk (2 ml/kg).
4.4.1. Vírus injektálás a csontvelőbe: 26 állat femorális csontvelejébe adtunk BDG vírust, hogy megfertőzzük a csontvelői idegvégződéseket a transszinaptikus pályajelöléses kísérletekhez. A beadott vírus mennyiségét és titerét előzetes kísérletek eredményei alapján határoztuk meg. 2x106 PFU/ml –es titer esetén az injektált öt állat egyike sem mutatott produktív fertőzést a központi idegrendszerben. Négyből egy, illetve ötből két állat fertőződött 1.2x107 és 2x108 inokulációs titerek esetén. 16 μl ultracentrifugálással koncentrált, 1.5x1010 PFU/ml titerű vírus injektálását követően az állatok 90% -a produktív fertőzést mutatott, ezért ezt a dózist választottuk a további beadásokhoz. A bal femurt műtétileg feltártuk, a csontfelszínt 3%-os hidrogén-peroxiddal (H2O2) megtisztítottuk és két, kis átmérőjű lyukat fúrtunk a distalis epiphysisbe fogászati fúróval. A vírus beadása közben a femurt hidrogén-peroxiddal átitatott vattával izoláltuk, hogy a környező szövetek kontaminálódását megakadályozzuk. Ezt követően, 2x8 μl BGD vírust injektáltunk csontvelőbe egy 10 μl-es Hamilton-fecskendő segítségével. A tűt 5 percig a beadás helyén tartottuk, hogy meggátoljuk a vírus szuszpenzió visszacsorgását a csont belsejéből. A csontba fúrt lyukakat Ethicon csont viasszal lezártuk és a csontfelszínt 70% -os ethanollal áttöröltük, az esetleges virális kontamináció megakadályozása céljából. A csontot körülvevő szétválasztott izmokat összevarrtuk
és
a
műtéti
sebet
varrattal
lezártuk.
A
vírusfertőzés időbeli
progressziójának vizsgálatához különböző túlélési időket választottunk: 4 nap (n=4), 5 nap (n=6), 6 nap (n=7) és 7 nap (n=5). Annak ellenőrzésére, hogy a kialakuló centrális fertőzés valóban jellemző-e a csontvelői beidegzésre, a következő kontrol kísérleteket végeztük: Négy állat kapott BDG inokulumot a bal femur proximális epiphysisébe a distalis beadással egyező mennyiségben. A perioszteum fertőzése során 2 μl, 1.5x1010 PFU/ml tierű vírusszuszpenziót cseppentettünk a csontfelszínre (n=3), majd 10 perces inkubáció után a csontfelszínt 30
tisztára töröltük. Korábbi vizsgálataink eredménye szerint ez a vírus mennyiség és inkubációs
idő
elegendőnek
bizonyult
a
produktív
centrális
vírusfertőzés
megvalósításához a vírus femorális izmokra való cseppentése után. A kísérleti állatok egy másik csoportjánál 10x1 μl BDG-t (6x108 PFU/ml n=3, illetve 1.5x1010 PFU/ml, n=3) injektáltunk a femurt körülvevő izmokba (musculus vastus lateralis és musculus adductor brevis). Annak vizsgálatára, hogy mennyire specifikus a vírus terjedése a csontvelői terminálisokból eredő fertőzés esetén, az ipsilateralis femoralis, ischiadicus és obturator idegeket közvetlenül a vírus beadása után átvágtuk (n=6). A túlélési idő 5 nap volt ezeknél a kísérleteknél, ami elegendő ahhoz, hogy a fertőzés az agy területén megjelenjen. Annak megállapítására, hogy az azonos gerincvelői szelvények által innervált szövetek közül a csontvelőből eredő fertőzés mennyiben jellemző a csontvelőre, kettős vírusbeadást használtunk. E kísérletek során 2x8 μl, 1.5x1010 PFU/ml titerű BDG-t injektáltunk a bal femorális csontvelőbe. 24 órával később, az injektált területet ismét feltártuk és 10x1 μl, 7x108 PFU/ml titerű BDL vírust inokuláltunk a femurt körülvevő vastus lateralis és adductor brevis izmokba. Az állatok túlélése ezután 4 nap volt (5 nap a csontvelői beadásra vonatkoztatva). A vírus injekciók időbeni szeparálására azért volt szükség, mert ez az inkubációs protokoll eredményezte a két izogén rekombináns törzs által okozott fertőzés megfelelő szinkronizálását a központi idegrendszer különböző fertőződő magcsoportjaiban. Ezt a metodikát a fertőzések kinetikájának és a fertőzött neuronok számának összehangolására más kutatócsoport is eredményesen alkalmazta160.
4.4.2. Vírus injektálás a fehér és barna zsírszövetbe: A barna zsírszövet (BAT) és fehér zsírszövet (WAT) központi-idegrendszeri innervációjának összehasonlítása érdekében kettős vírusbeadást alkalmaztunk. Az interscapularis barna zsírszövetet műtétileg feltártuk, majd 10 μl 6x108 PFU/ml titerű BDG vírust injektáltunk 4-5 helyre. A beadások közben ügyeltünk arra, hogy sem a zsírszövetet borító kötőszövet, sem a környező bőrfelszín ne kontaminálódjon vírussal. Az epididimális fehér zsírszövetet bilaterálisan feltártuk és 2x3 μl, 6.9x109 PFU/ml titerű BDL-t injektáltunk mindkét zsírpárnába, egyenként 2-3 helyre elosztva. A különböző koncentrációjú vírusok használatára azért volt szükség, mert így a két vírus
31
által okozott fertőzés összehangolása megvalósítható volt a központi idegrendszerben. A túlélési idők: 3 nap (n=3), 4 nap (n=3), 5 nap (n=4). Annak megállapítására, hogy az egyes idegsejtek fertőződése valamelyik rekombináns vírussal befolyásolja-e az idegsejt másik, izogén vírustörzzsel történő egyidejű fertőződését és ezzel a két illetve egy vírussal fertőzött neuronok arányát, kontroll kísérleteket végeztünk. 6 μl 6.9x109 PFU/ml titerű BDL és 5 μl 7x108 PFU/ml titerű BDG vírust összekevertünk (ez a mennyiség hozzávetőlegesen azonos számú idegsejtet fertőzött azonos beadási terület esetén) és a keverékből 5.5 -5.5 μl-t injektáltunk bilaterálisan az epididimális WAT-ba. A túlélési idő 4 nap volt.
4.4.3. Vírus injektálás a lépbe: A lépbe történő beadásokat a vírus által okozott centrális fertőzés hatására kialakuló gyulladás vizsgálata céljából végeztük. A lépet azért választottuk, mert az általunk alkamazott különböző szervekbe történő beadások közül itt volt a leghosszabb a megvalósítható túlélési idő. Ez által a különböző agyterületek fertőződésének időbeli kialakulása jól elválasztható volt. A lépet műtétileg feltártuk, majd 5x0.4 μl (összesen 2 μl) 1.5x1010 PFU/ml titerű BDGt injektáltunk a hílus környékére. A túlélési idők: 4 nap (n=3), 5 nap (n=8), 6 nap (n=5), 7 nap (n=4) és 10 nap (n=3). A vírusbeadást követően az állatok 90% -a mutatott produktív centrális fertőzést. Azokat az állatokat, amik nem fertőződtek meg a vírus beadását követően 5 nappal, kontrollként használtuk fel az immunhisztokémiai vizsgálatok során. 3 további állat lépébe (a műtét által okozott perifériás gyulladás kontrolljaként) fiziológiás sóoldatot injektáltunk. 4.5. Leukociták izolálása és ex vivo jelölés vitális fluoreszcens festékkel Naív, altatott állatok szívét feltártuk és a bal kamrából steril körülmények között vért gyűjtöttünk
(10-12
ml/állat)
Na-citrát
antikoaguláns
jelenlétében
(Sigma,
végkoncentráció 0.4 %). A vért 1:2 arányban steril PBS-el higítottuk, 15 ml FicollPaque oldatra rétegeztük (Amersham Biosciences; denzitás 1.077 g/ml) és 30 percig centrifugáltuk 400xg-n. A plazma és a ficoll közötti monocitákat és limfocitákat tartalmazó interfázist összegyűjtöttük, majd a sejteket PBS-ben kétszer megmostuk. 32
A femorális és tibiális csontvelőket steril körülmények között eltávolítottuk, steril MEM-ben
10%-os
FCS
jelenlétében
többszöri
szuszpendálással
a
sejteket
diszpergáltuk, majd centrifugáltuk 200xg-n, 10 percig. A vörövérsejt kontaminációt ACK lízis pufferrel (155 mM NH4Cl, 10mM KHCO3, 0.1 mM EDTA) szüntettük meg, amit kétszeri mosás követett PBS-ben. CellTracker™ Orange CMTMR (5-(and-6)-(((4chloromethyl)benzoyl)-amino)
tetramethylrhodamine)
(Molecular
Probes)
vitális
fluoreszcens jelölőanyagot DMSO-ban oldottuk 5 mM-os végkoncentrációban és 5 µles aliquotokat készítettünk, melyeket fagyasztva tároltunk. A sejtek jelölését megelőzően a megfelelő mennyiségű CMTMR-t felolvasztottuk, MEM-el 4 mM glutamin és 40 mg/ml gentamycin jelenlétében 5 µM –os munkahigítást készítettünk, melyet 37 oC-ra előmelegítettünk. Ezt követően a vérből preparált leukocytákat és csontvelői sejteket 30 percen keresztül, 37 oC-on, sötétben inkubáltuk CMTMR-el, majd a be nem épített vitális festéket kétszeri PBS mosással távolítottuk el. 4.6. CMTMR-el jelölt sejtek injektálása vírusfertőzött állatokba 11 patkány lépébe BDG-t injektáltunk, majd 72 illetve 96 órával később frissen preparált, CMTMR-el jelölt csontvelői vagy vér eredetű sejteket juttatunk a keringésbe a juguláris vénán át (1-4x108 sejt/állat). 24 (n=5) illetve 48 (n=6) órával az ex vivo jelölt sejtek beadása azaz 120 órával a vírus injektálása után az állatokat traszkardiálisan perfundáltuk 4%-os paraformaldehid (PFA) oldattal. Negatív kontrollként vírussal nem injektált állatokat használtunk melyeket a fenti módon CMTMR-el jelölt sejtekkel injektáltunk. Annak vizsgálatára, hogy az ex vivo jelölés befolyásolta-e a leukociták aktiválhatóságát vagy képességét az agyba történő infiltrációra a vírusfertőzésre válaszul, két állatnál kis corticalis léziót alkalmaztunk. Ennek során az altatott állatok fejét sztereotaxikus készülékben immobilizáltuk, majd a fejbőr középvonali bemetszését követően 2 mm átmérőjű craniotomiát végeztünk a bal féltekén 2 mm-re lateralisan és caudalisan a bregmától. A dura mater lokális eltávolítása után a cortexen egy 27G méretű steril injekciós tűvel mechanikus léziót ejtettünk a corpus callosum szintjéig. A csonton ejtett furatot csont viasszal lezártuk és a fejbőrt összevarrtuk. Az állatokat ezután CMTMR-el jelölt sejtekkel injektáltuk a fenti protokoll szerint és 48 órás túlélés után perfundáltuk.
33
4.7. Bromodeoxyuridine (BrdU) beadás A vírusfertőzés hatására az agyban bekövetkező sejtproliferáció vizsgálatához 5bromo2’-deoxy-uridin -t (BrdU, Sigma-Aldrich) injektáltunk intraperitoneálisan, 102 órával a BDG-vel történő fertőzés után. Egy dózisban, fiziológiás sóoldatban oldott BrdU-t adtunk be 50 mg/kg koncentrációban. Az állatokat (n=7) 18 órával a BrdU és 120 órával a BDG beadása után perfundáltuk. 4.8. Transzkardiális perfúzió és szövetek kezelése A kísérleti állatokat túlaltattuk és 50 ml fiziológiás sóoldattal, majd ezt követően 400 ml Zambóni fixálóval (4% PFA, 0.2% pikrinsav 0.1M PBS-ben, pH 7.4) transzkardiálisan perfundáltuk. Az ex vivo jelölt sejtekkel injektált állatokat 4%-os PFA oldattal perfundáltuk (4% PFA 0.1M PBS-ben, pH 7.4). Az agyat kivettük, a csontvelői, illetve a zsírszövetbe történő beadások esetén a gerincvelőt teljes hosszában, a paravertebralis dúcláncot a T1 szelvénytől a mellékveséig bilateralisan eltávolítottuk. A szöveteket egy éjszakán keresztül utófixáltuk a perfúziós oldatban, majd 24 órán keresztül, 20%-os szacharózt tartalmazó kálium-foszfát pufferben (KPBS, 1 liter desztillált vízben 0,45 g KH2PO4, 2,908 g K2HPO4 és 9 g NaCl, pH 7.4) inkubáltuk 4o C-on. Az agy esetén 30 μm-es coronalis, fagyasztott sorozatmetszeteket készítettünk szánka mikrotómmal (5 parallel sorozat/agy). A gerincvelőt a metszést megelőzően négy blokkra vágtuk: a C1–T2, T3–T7, T8–T13 és a lumbo-sacralis szelvényeket tartalmazó darabokra. Ezután 50 μm-es sorozatmetszeteket készítettünk (4 parallel sorozat/gerincvelő). Az agy és gerincvelő metszeteket -20
o
C-on, sötétben, fagyálló
folyadékban tároltuk (0,79 g NaH2PO4 x H2O; 6,80 g Na2HPO4 x2H2O; 500 ml DEPCkezelt víz; 300 ml etilénglikol és 200 ml glicerin). Az eltávolított szimpatikus határláncot egy éjszakán keresztül utófixáltuk, majd KPBS-ben kétszer mostuk és a natív preparátumot fluoreszcens mikroszkóp alatt vizsgáltuk. A BDG-vel fertőzött neuronokban kifejeződő GFP autofluoreszcenciája a ganglionok falán keresztül is látható volt, ezáltal a fertőzött sejtek lokalizációját és hozzávetőleges számát meg tudtuk állapítani. Ezt követően 10 mikronos metszeteket készítettünk kriosztáton az immunfluoreszcens vizsgálatokhoz. Az elektronmikroszkópos vizsgálatokra szánt állatokat 6 nappal a BGD csontvelőbe történő beadása után Zamboni oldattal perfundáltuk, mely tartalmazott még 0.08%
34
glutáraldehidet is. 24 órás posztfixálást követően 50 μm-es metszeteket készítettünk vibratómmal. 4.9. Immunhisztokémia
4.9.1. Immunperoxidáz hisztokémia: A PRV –vel fertőzött idegsejtek azonosításához poliklonális, nyúlban termeltetett antitestet használtunk 1:10000 higitásban. Az antitest a főbb virális kapszid- és burokfehérjéket ismeri fel146. Az immuncitokémiai reakció standard avidin-biotinperoxidáz (Vector, Burlingame, CA, USA) módszerrel történt úsztatott metszeteken. A fagyálló folyadékból kivett metszeteket KPBS-ben háromszor mostuk és egy órán át, 2%-os normál kecske szérum (NGS) –al inkubáltuk, amit primer higítóban (KPBS, 0.3% Triton X-100) oldottunk. A primer higítót használtuk minden, az immunperoxidáz és immunfluoreszcens hisztokémia során alkalmazott primer és szekunder antitest higítására. A primer antitest egy éjszakán keresztül történő inkubálását és háromszori KPBS mosást követően, biotinilált 1:1000 higítású kecske anti-rabbit szekunder szérumot adtunk (Vector Laboratories, Burlingame CA), amit szobahőmérsékleten 1 órán át inkubáltunk. Az előhívást avidin-biotin-torma peroxidáz konjugátummal végeztük (ABC, Vector). Kromogénként 3,3’-diaminobenzidin tetrahidrochloridot (DAB, 0,5 mg/ml, Sigma) használtunk 0,03 %-os H2O2 jelenlétében, amit 1,5 %-os nikkelammónium-szulfáttal intenzifikáltunk. A felhúzott metszeteken Nuclear Fast Red (Fluka) háttérfestést végeztünk, majd a tárgylemezeket dehidrálást követően Depex-el lefedtük.
4.9.2. Immunfluoreszcencia: A kettős vagy hármas immunfluoreszcens jelölést szabadon úszó metszeteken végeztük. A fagyálló kimosása után a metszeteket 2% -os normál szamár szérum (NDS) és 2% NGS (Vector Laboratories, Burlingame CA) keverékében 1 órán keresztül blokkoltuk. Ezután a különböző primer antitestek keverékeiben a szöveteket 24-72 órán keresztül 4°C-on, rázóasztalon inkubáltuk. A felhasznált primer antitestek adatait az 1. táblázat tartalmazza: 35
Gazda nyúl
Specificitás PRV burok és kapszidfehérjék
Klonalitás poliklonális
egér
GFP
monoklonális
nyúl
β-galaktozidáz
poliklonális
egér egér
β-galaktozidáz TH
monoklonális monoklonális
nyúl
NPY
poliklonális
kecske egér egér nyúl
Orexin A ED-1 OX42 Iba1
poliklonális monoklonális monoklonális polikonális
egér
BrdU
monoklonális
Származás Lynn W. Enquist, University of Princeton, NJ, USA Molecular Probes, Eugene, OR Molecular Probes, Eugene, OR Promega DiaSorin, Stillwater, MN, USA Dr. R. Corder, Geneva, Swájc Sigma Serotec, Egyesült Királyság Serotec, Egyesült Királyság Wako Chemicals, Németország Sigma
Higítás 1:5000 1:1000 1:1000 1:1000 1:2000 1:1000 1:1500 1:400 1:1000 1:2000 1:1000
1. Táblázat. A táblázat a felhasznált primer antitestek adatait tartalmazza. A PRV és NPY szérumokat ajándékba kaptuk készítőiktől, a többi primer szérum a feltüntetett biotechnológiai cégek katalogizált terméke.
A primer antitestek után háromszori mosás következett KPBS-ben, majd a megfelelő, fluorokróm- vagy biotin-konjugált szekunder antitesteket 2 órán keresztül, szobahőn inkubáltuk. A felhasznált szekunder antitestek adatait a 2. táblázat tartalmazza: Gazda szamár szamár szamár kecske szamár kecske ló nyúl
Specificitás Klonalitás Konjugátum Származás egér IgG poliklonális Alexa 488 Molecular Probes, Eugene, OR nyúl IgG poliklonális Alexa 488 Molecular Probes, Eugene, OR egér IgG poliklonális Alexa 594 Molecular Probes, Eugene, OR nyúl IgG poliklonális Alexa 594 Molecular Probes, Eugene, OR nyúl IgG poliklonális Alexa 350 Molecular Probes, Eugene, OR nyúl IgG poliklonális biotin Vector Laboratories, Burlingame,CA egér IgG poliklonális biotin Vector Laboratories, Burlingame,CA kecske IgG poliklonális biotin Vector Laboratories, Burlingame,CA
Higítás 1:1000 1:1000 1:1000 1:1000 1:500 1:500 1:500 1:500
2. Táblázat. A táblázat az immunfluoreszcens jelöléshez felhasznált szekunder antitestek adatait tartalmazza. Az „Alexa” konjugátumok kromofórok: az Alexa 350 kék, az Alexa 488 zöld, az Alexa 594 piros fluoreszcens emisszós spektrummal rendelkezik.
36
A biotinilált szekunder szérumok esetén a jelölést sztreptavidin-Alexa-350 illetve -594 konjugátumokkal (1:500, Molecular Probes, Eugene, OR) tettük láthatóvá. Ahol a sztreptavidin konjugátumok alkalmazása során megnövekedett hátteret tapasztaltunk, ott a szöveteket a primer antitestek hozzáadását megelőzően sztreptavidin-biotin blokkolóval kezeltük (Vector Laboratories, Burlingame,CA). Kettős vagy hármas immunfluoreszcens jelölés esetén csak a többi fajra kimerített (keresztreakciót nem mutató) szekunder antitesteket használtunk. A fluoreszcens jelölés után többszöri, KPBS-ben történő mosást követően a metszeteket
tárgylemezre
felhúztuk,
majd
Vectashield
fedőanyaggal
(Vector
Laboratories, Burlingame,CA) lefedtük. A
felhúzott
metszetek
egy
részénél
a
fedést
megelőzően
2
μg/ml
diamidinophenylindole (DAPI; Molecular Probes) –al 1 percig festettünk, hogy a sejtmagokat láthatóvá tegyük. A mikroglia sejtek és agyi makrofágok fluoreszcens hisztokémiai jelöléséhez a metszeteket 6 μg/ml biotinilált tomato lectin-nel (Sigma) 2 órán keresztül szobahőmérsékleten inkubáltuk, az Acarin és munkatársai által korábban leírt módon176. A jelölést sztreptavidin-konjugált Alexa-594, illetve Alexa-350 (1:500, Molecular Probes) hozzáadásával tettük láthatóvá. A tomato lectin jelölés és más antigének együttes immunfluoreszcens kimutatása során a primer antitest(ek) hozzáadását és KPBS-mosást követően került sor a tomato lectin kétórás inkubációjára., majd a fluorokróm
konjugált
szekunderek
és
sztreptavidin-fluorokróm
konjugátum
hozzáadására. Hármas immunfluoreszcens vizsgálatoknál a primer antitestek inkubációját követően a fluoreszcens és biotin-konjugált szekundereket együtt adtuk a metszetekhez és két órán keresztül inkubáltuk. Ezt követően a metszeteket KPBS-ben mostuk és a biotinilált szekundert sztreptavidin Alexa-350 vagy Alexa-594 konjugátummal vizualizáltuk. A BrdU-t beépített sejtek immunfluoreszcens azonosításához a metszeteket 30 percig 37°C-on 1N HCl –el előkezeltük, hogy a DNS-t denaturáljuk. Ezt követően egér antiBrdU primer antitesttel inkubáltunk egy éjszakán keresztül, majd szamár anti-egér Alexa-594 szekunder szérumot adtunk a metszetekhez. Annak vizsgálatára, hogy a vírus strukturális fehérjék (PRV) kifejeződése milyen latenciával követi a GFP expresszióját a fertőzött sejtekben in vitro, a BDG-vel fertőzött PK-15 és NE4C kultúrákon GFP+PRV kettős immunfluoreszcens jelölést végeztünk. 37
Ehhez 2% PFA-val fixáltuk a kultúrákat és 20 percig 2% NDS és 2% NGS fedőszérumokat adtunk. Ezt követően egér anti-GFP és nyúl anti-PRV antitestek keverékében egy éjszakán át inkubáltunk, majd a jelölést a megfelelő szekunder antitestek alkalmazásával (szamár anti-egér Alexa-488 és kecske anti-nyúl Alexa-350, 1:500) tettük láthatóvá. A kettős vírusbeadásos kísérletekben a két vírus (BDG, BDL) együttes kimutatásához nyúl anti-β-galaktozidáz és egér anti-GFP antitestek keverékét használtuk. Azoknál a hármas immunfluoreszcens vizsgálatoknál, amikor a különböző vírusokkal fertőzött idegsejtek neurokémiai azonosítását a TH enzim kimutatásával végeztük (GFP+βgal+TH), a GFP expressziót autofluoreszcenciája alapján detektáltuk. A csontvelő innervációjának vizsgálatakor a szimpatikus határlánc metszeteit hordozó tárgylemezeket NPY és GFP antitestek keverékében inkubáltuk 48 óráig, nedves kamrában. A fluoreszcens módon jelölt metszetekről és sejtkultúrákról Nikon Eclipse 6000 mikroszkóp és Spot RT színes, digitális kamera (Diagnostic Instruments, Inc, IL) segítségével készítettünk felvételeket, melyeket file–mérettől függően TIFF vagy JPEG formában mentettünk el. A konfokális lézer scanning mikroszkópos felvételeket Olympus BX-61, illetve Nikon Eclipse E800 mikroszkópokkal készítettük. A kettős- vagy hármas-fluoreszcens képeket Spot Advanced szoftverrel állítottuk elő. A konfokális képek háromdimenziós rekonstrukcióját az Image J (NIH, USA) szoftverrel végeztük.
4.10. Pre-embedding immuncitokémia és elektronmikroszkópia A vírusfertőzött agyszövetből vibratómon 50 μm-es metszeteket készítettünk, melyeket KPBS-ben történő mosás után 25%-os szacharóz oldatban inkubáltunk 3 órán keresztül. Ezt követően folyékony nitrogénben háromszor gyorsan lefagyasztottuk-felolvasztottuk a szöveteket, hogy az antitestek számára feltárjuk. A pre-embedding immunogold reakcióhoz a metszeteket 0.8% BSA-t, 0.1% zselatin-t (IGGS, Amersham Life Science) tartalmazó Tris pufferben (TBS, pH 7.4) 2% NGS jelenlétében blokkoltuk 30 percen keresztül. Ezt követően a szöveteket olyan, 1:5000 higítású nyúl anti-PRV primer szérumban inkubáltuk 24 óráig, amelyet előtte kontrol állatok szövetein előinkubáltunk, hogy az immunfestés háttérmentes legyen.
38
A metszeteket TBS mosást követően 1 nm átmérőjű arannyal konjugált kecske antinyúl IgG-vel (1:50, Amersham Life Science) inkubáltuk 8% BSA-t, 0.1% zselatin-t és 1% NGS -t tartalmazó TBS oldatban 12 óra hosszan, 4°C-on. Kétszeri TBS mosás után 0.1%-os zselatin oldattal mostunk, majd 2%-os glutáraldehiddel 10 percen keresztül utófixáltunk. Az arany szemcséket az Aurion R-gent (Amersham) reagenssel intenzifikáltuk 6 percig. A metszeteket 0.1 M-os PB-ben oldott 1%-os ozmium-tetroxidal kezeltük 1 órán keresztül, majd ethanolban és propilén oxidban történő dehidrálás után Durcupanba (ACM, Fluka) ágyaztuk. Dehidrálás közben a metszeteket 70%-os ethanolban oldott 1%-os uranil-acetáttal kezeltük 40 percig. Az elektronmikroszkópos vizsgálatokhoz az RVMM és a PVN megfelelő területeit kiválasztottuk, lefotóztuk, majd 80 nm-es metszeteket készítettünk ultramikrotómmal. A hártyázott gridekre felvett ultravékony metszeteket Hitachi 7100 elektronmikroszkóppal vizsgáltuk. 4.12. Analízis Az agyban és gerincvelőben a régiók vagy magok azonosításához, illetve határaik megállapításához a Paxinos ás Watson által készített sztereotaxikus atlaszt használtuk177. A fertőzött neuronok pontos lokalizációjának megállapításához az agy és gerincvelő esetén egy-egy teljes sorozatot végignéztünk (a bulbus olfactoriustól a filum terminale kezdetéig). A csontvelőbe történő BDG beadás után a PRV-pozitív idegsejtek számát a gerincvelőben és a különböző agyterületeken az alábbi skála szerint adtuk meg: +, 1–3; ++, 4–8; +++, 9–15; ++++, 16-nál több fertőzött sejt/metszet. Azokban az esetekben, amikor az adott mag vagy magcsoport csak az azonos túlélési idejű állatok egy részénél volt fertőzött, az érintett állatok számát a PRV-pozitív sejtek mennyisége után / -jellel elválasztva megadtuk (lásd: „Eredmények” fejezet, 3. táblázat). A lépbe történő BDG beadás esetén a kvantitatív elemzést digitális képeken végeztük. Az elemzés célja az volt, hogy megállapítsuk a különböző túlélésű állatokban az általunk kiválasztott agyterületeken található neuronokról, hogy a vírusfertőzés milyen stádiumában vannak (azaz friss, vagy már előrehaladott fertőzést mutatnak-e). Ennek kimutatására a vírus azon tulajdonságát használtuk ki, hogy az IE expressziós kinetikát mutató GFP a fertőzött idegsejtekben a fertőzés nagyon korai stádiumában kimutatható, amit a PRV fehérjék expressziója bizonyos latenciával követ (hasonlóan az in vitro víruskinetikai vizsgálatokhoz).
39
Ezért a korai fertőződést mutató „ I. fázis” (csak GFP-pozitív), „II. fázis” (GFP+PRV kettős pozitív) és a késői fertőződést mutató „III. fázis” (csak PRV-pozitív) idegsejteket a (1) rostralis ventromedialis medulla (RVMM) az (2) A5 katekolaminerg régió és a (3) piriform kortex esetén minden harmadik metszeten megszámoltuk. Azért ezeket az agyterületeket választottuk ki, mert az agyi fertőzés először az A5 régióban, később az RVMM-ben jelent meg (4-5 napos túlélésnél), a cortex piriformisban pedig csak a 7. napon (azaz ekkor ez a terület frissen fertőződött, a medulla számos magcsoportja pedig már előrehaladott-késői fertőződést mutat). Az RVMM területén, a bregma szerint caudalisan –13.68 mm és -9.68 mm között, a raphe magnusban, pallidusban és az anterior ventrális gigantocellularis nucleusban előforduló fertőzött idegsejteket számoltuk meg. Az A5 katekolaminerg régióban a számolás a –11 és –9.30 mm közötti területen történt, bilaterálisan. A piriformis kéreg esetén egy 1.8 mm2 –es területen számoltunk –3.30 mm-től 1.70 mm-ig a bregma szerint rostralisan, az A5 régióval megegyező méretű területen. Az ED1-pozitív sejtek mennyiségét a fenti agyterületek esetén digitalis képeken, az Image J szoftver segítségével határoztuk meg, mm2-re vonatkoztatva. Statisztikai vizsgálatokhoz a STATISTICA 6.0 programcsomagot használtuk.
40
5. Eredmények 5.1. A csontvelő központi idegrendszeri autonóm beidegzése 5.1.1. A vírussal fertőződött idegsejtek agyi lokalizációja a BDG vírus csontvelői beadását követően 5.1.1.1. Jelölődés a szimpatikus határláncban és a gerincvelőben A legkorábbi fertőzött idegsejtek a paravertebralis dúclánc lumbális szakaszán jelentek meg, 4 nappal a BDG csontvelői beadása után. A metszést megelőzően a natív határlánc-preparátum minden ganglionját megvizsgáltuk fluoreszcens mikroszkóp alatt, hogy megállapítsuk, a határlánc mely szakaszán történt a primer fertőzés. A 4 napos túlélésű állatoknál egy-négy határlánc dúcban találtunk fertőzött sejteket a lumbális régióban, gangliononként átlagosan öt –tíz GFP-pozitív sejtet. A ganglionok relatíve nagy mérete és vastag tokja miatt ezzel a módszerrel csak a fertőzött dúcok számát, lokalizációját és a fertőzés terjedését tudtuk nyomon követni, de nem számoltuk meg az érintett sejteket. A jelölődött idegsejtek zömmel marginálisan helyezkedtek el, jellemzően ovális sejttesttel és az elnyújtott ganglionok tengelyével páruzamosan futó rostokkal. Kriosztátos metszést követően, a fertőzöt sejtek a dúcok belsejében is azonosíthatók voltak (6. ábra).
6. ábra. Vírussal fertőzött idegsejtek a paraveltebrais dúclánc lumbális szakaszán. A gangion metszetén GFP-t expresszáló sejtek láthatók (autofluoreszcencia) négy nappal a BDG vírus csontvelői injektálása után. A lépték 100 μm.
5 nappal a vírus beadása után a fertőzés az alsóbb thorcalis dúcokban is megjelent és a lumbális gerincvelőben az érintett sejtek száma enyhén emelkedett.
41
A központi idegrendszerben a vírussal fertőzött idegsejteket pontos neuroanatómiai elhelyezkedésük megállapításához a vírus strukturális fehérjéi ellen termeltetett poliklonális antitesttel (anti-PRV) mutattuk ki. A gerincvelőben kis számú, vírus antigéneket kifejező neuron volt megfigyelhető 4 napos túlélésnél. Ezek a T8-L1 szelvényekben az IML területén, bilaterálisan jelentek meg. Emellet, fertőzött sejteket találtunk elszórtan a CAN (X. lamina) területén, a canalis centralis két oldalán. 5 nappal a vírus beadását követően a gerincvelőben számos érintett neuron volt látható (7.ábra).
7.ábra. PRV immunreaktívitást mutató sejtek a thoracalis gerincvelőben, a vírus csontvelői beadását követően. A fertőzött sejtek (nyílhegy) az IML-ben tűnnek fel 4 nappal a csontvelői fertőzés után (bal felső ábra). 5 napos túlélésnél az érintett sejtek kisebb csoportokban találhatók az IML-ben (jobb felső ábra és nagyobb nagyításban a jobb alsó ábra) és a CAN-ban a canalis centralis (cc) körül. Fertőzött sejtek figyelhetők meg a hátsó szarv felszíni (I-II) rétegeiben is (bal alsó ábra). Lépték: 100μm.
A T10-L1 szelvényekben az IML és CAN területén a fertőzött sejtek csoportokban jelentek meg, jelezve a primer fertőzés helyét és kisebb számban a T4-L1 szelvényekben. A lumbalis és sacralis X. lamina területén a centralis szürkeállományban és sacralisan az oldalsó köteg paraszimpatikus preganglionális neuronjai között
42
találtunk PRV-immunreaktivitást mutató (PRV-ir) sejteket. A thoracalis hátsó szarvban az I-II rétegekben kisebb csoportokban, a IV, V, VIII, IX laminákban elszórtan jelentek meg a fertőzött sejtek, bilaterálisan. 5.1.1.2. Jelölődés az agytörzsben 4 napos túlélésnél a négy vizsgált állatból egy mutatott PRV fertőződést az agy területén, az RVMM-ben. 5 nappal a vírus beadása után az agytörzsi jelölődés megjelent az inokulált állatok többségében a C1, A5 katekolaminerg sejtcsoportokban és az RVMM sejtekben, bilaterálisan (8. ábra).
8. ábra. Vírusfertőzött sejtek az agytörzsben, a BGD vírus inoklulálását követő 5. napon. PRVpozitív idegsejtek találhatók a C1 és A5 katekolaminerg sejtcsoportokban a ventrolaterális medullában, a LC-ban, a subcoeruleus régióban és az RVMM területén. Py- pyramis; 4v- negyedik agykamra; 7nnervus facialis. Lépték: 100μm.
A ventromedialis medullában PRV-ir a nucleus raphe magnus, nucleus gigantocellularis (Gi) és nucleus paragigantocellularis lateralis (LPGi) sejtjeiben volt megtalálható. Elszórtan, fertőzött sejtek voltak a nucleus parapyramidalisban és ambiguusban, az NTS-ban és a C3 adrenerg sejtcsoportban.
43
A medulla caudalis részén ventralisan, fertőzött sejteket figyeltünk meg a nucleus reticularis lateralis, C1 régió és nucleus raphe pallidus marginalis területén. A híd és középagy területén PRV-ir volt található a LC, subcoeruleus régió, A7 katekolaminerg sejtcsoport és a hídi formatio reticularis sejtjeiben. Hat állatból kettőben figyeltünk meg kis számú, fertőzött sejtet a nucleus tegmentalis pedunculopontinusban és a nucleus mesencephalicus profundusban. A periaqueductalis szürkeállományban minden állat esetén jelen voltak a fertőzött neuronok, dominánsan a ventrolateralis szubdivízióban. Az agytörzsi jelölődés minden területen bilateralis volt, egyértelmű lateralis dominancia nélkül. A fertőzést mutató agyterületeket és az érintett sejtek átlagos számát a 3. táblázat foglalja össze. Terület
Túlélés 4 nap (n=4)
5 nap (n=6)
6 nap (n=7)
7 nap (n=5)
+/2 +/3 +/2 +/3 +/3 + +
+ + + + + ++++ ++++ + ++/+++ ++ ++/2 +/2 +++
Előagy Cortex infralimbicus Cortex prelimbicus Cortex cingularis Motoros cortex Szomatosensoros cortex Cortex insularis Cortex piriformis Cortex entorhinalis Nucleus diagonalis Brocae Septum
+
Hippocampus Habenula Nucleus interstitialis striae terminalis Substantia innominata Amygdala Organum vasculosum laminae terminalis Nucleus preopticus medianus Nucleus preopticus medialis Area preoptica medialis
+/2 +/1
Area preoptica lateralis Organon subfornicalis Nucleus supraopticus PVN, anterior
+ +/++ +/++ +/2
PVN dorsalis parvocellularis PVN, ventralis parvocellularis PVN, dorsomedialis parvocellularis PVN, magnocellularis PVN, posterior
+ +/1
Nucleus periventricularis hypothalami Nucleus suprachiasmaticus hypothalami Area retrochiasmaticus
+ +
Nucleus perifornicalis
44
++/+++ +/3 +/++ ++ + ++ ++ ++ +/3 +/++ +/++ ++/+++ ++/+++ +/++ +/++ + + +/2 ++
+
Terület
Túlélés 4 nap (n=4)
5 nap (n=6)
Nucleus arcuatus Area hypothalamica lateralis
+
Area hypothalamica dorsalis Nucleus ventromedialis hypothalami
+/2 +/1
Nucleus dorsomedialis hypothalami Area hypothalamica posterior Nuclei mamillares
+/1 +/1
Zona incerta
6 nap (n=7)
7 nap (n=5)
+/2 + + + + ++ + +
Középagy-Híd Substantia grisea centralis
+
nuclei paraoculomotorius Nucleus mesencephalicus profundus
++/+++ +/3
+/2
Nucleus Darkschewitsch Nucleus ruber Area ventralis tegmentalis
+/1
Substantia nigra Nuclei parabrachiales Nucleus tegmentalis laterodorsalis Nucleus tegmentalis pedunculopontinus
+/1 +/++ ++ + +/++ +
A7 regió A5 regió Nucleus reticularis (Pons) Locus coeruleus Subcoeruleus régió
+/3 +/1 +/3 +/2 + + +/3 +/2 +/3 + ++/+++ ++
Nyúltvelő Nucleus reticularis gigantocellularis
+/1
+ + + +/++ +/++ + + + +
++ ++/+++ ++ ++ + + + + + +/2
+ +
+ +/+++ +/++ +
+ +/++ + +
Nucleus lateralis paragigantocellularis Nucleus dorsalis paragigantocellularis Raphe nuclei Ventrolateralis medulla (C1/A1) Nucleus parapyramidalis Nucleus ambiguus C3 regió Nucleus tractus solitarius Area postrema
Gerincvelő Cervicalis Thoracalis Lumbalis
Sacralis
+/1 +/1 +/1
3. táblázat. A BDG-vel fertőződött idegsejtek eloszlása az agy területén, csontvelői vírusbeadást követően. A fertőzött sejtek átlagos számát az alábbi skála szerint adtuk meg: +, 1–3; ++, 4–8; +++, 9– 15; ++++, 16-nál több fertőzött sejt/metszet. Azokban az esetekben, amikor az adott mag vagy magcsoport csak az azonos túlélési idejű állatok egy részénél volt fertőzött, az érintett állatok száma a PRV-pozitív sejtek mennyisége után / -jellel elválasztva található.
45
6 nappal a vírus beadása után a vírusfertőzés retrográd transszinaptikus terjedése az előagyi magok irányába egyértelműen látható volt. Az A5 és C1 sejtcsoportokban, ahol 5 napos túlélésnél a legnagyobb számú fertőzött idegsejt volt megfigyelhető, a neuronális degeneráció jeleit láttuk, ami a fertőzött sejtek számának csökkenését eredményezte. Más területeken - mint az RVMM- a fertőzött sejtek száma emelkedett. A PRV-ir megjelent az area postremaban, a nuclei padunculopontinus és tegmentalis laterodorsalisban, valamint a parabrachialis magcsoportban. A ventrális PAG mentén, a nucleus oculomotorius és nucleus comissuralis Darkscevitsch vonalában szintén megjelentek a fertőzött sejtek. Csak nagyon kis számú érintett neuron volt megfigyelhető a szomatomotor-asszociált területeken, mint a substantia nigra, vagy a nucleus ruber összehasonlítva azokkal a kontroll kísérletekkel, amikor a BDG vírust a femoralis izomzatba injektáltuk (lásd alább). 7 nappal a vírus csontvelői beadása után a fertőzött neuronok többsége eltűnt a korán fertőződött agytörzsi területekről és csak kis számú érintett sejt volt található a PAG (két állat esetén) és a LC (egy állat esetén) területén.
5.1.1.3. Jelölődés az előagyban
5 napos túlélésnél a PRV-pozitív idegsejtek megtalálhatók voltak néhány előagyi mag területén. A köztiagyi jelölődés a PVN-re koncentrálódott, ahol zömében az autonóm működéseket irányító dorsalis és ventromedialis parvocellularis sejtek fertőződtek. A PVN-ben egyértelmű kontralateralis dominancia volt megfigyelhető a virális jelölődésben. A PVN mellett, fertőzött sejteket találtunk a hypothalamus területén a retrochiasmaticus areaban és a lateralis hypothalamusban. Egy állat mutatott virális jelölődést a nuclei mamillareban, a zona incertaban és a dorsomedialis hypothalamicus magban, két állatban jelölt sejtek voltak a ventromedialis hypothalamicus magban és a preopticus areaban. 6 nappal a vírus beadása után, számos előagyi területen találtunk fertőzött idegsejteket. A PVN-ben az érintett sejtek száma megnőtt az 5 napos túlélési időhöz képest, a magnocellularis, dorsomedialis, anterior és posterior parvocellularis szubdiviziók is tartalmaztak fertőzött sejteket. A 7. napra az agytörzshöz hasonlóan, a neuronok degenerációja és eliminációja a hypothalamus korábban fertőződött területein –mint a PVN- szintén megfigyelhető volt (9. ábra).
46
9. ábra. A PRV fertőzés terjedése a PVN-ben. A vírussal fertőzött sejtek először 5 nappal a BDG csontvelői injektálása után jelennek meg a PVN-ben, a dorsalis és ventralis parvocellularis szubdivíziókban. A fertőzött sejtek száma a 6. napra emelkedik, miközben a korábban fertőződött neuronok degenerációja figyelhető meg. Az érintett sejtek zöme eltűnik a PVN-ből 7 nappal a vírus beadása után és új fertőzés nem figyelhető meg. f – fornix; 3V – 3. agykamra. Lépték: 100μm.
6
napos
túlélésnél
a
nuclei
periventricularis,
perifornicalis,
dorsomedialis,
ventromedialis hypothalami; a zona incerta és az area hypothalamica posterior minden vizsgálat állatban tartalmazott fertőzött idegsejteket (n=7). Emellett, elszórt jelölődés volt megfigyelhető nuclei tuberomamillares dorsalis, ventralis, lateralis; nucleus premamillaris területén néhány állat esetén. A nuclei supraopticus, suprachiasmaticus, arcatus; a substantia innominata és a cirucumventricularis szervek – mint az OVLT vagy a subfornicalis szerv – gyenge jelölődést mutatott 2-3 állatban (3. táblázat). Nagy számú fertőzött neuron volt jelen a medialis, medianus, ventrolateralis preopticus magokban, az OVLT –től caudalisan (10. ábra).
47
10. ábra. Vírussal fertőzött sejtek a medialis preopticus areaban (MPO) és a periaqueductalis szürkeálományban (PAG) 6 napos túlélésnél. Lépték: 100μm.
Számos limbicus területen fordultak elő PRV-ir sejtek, mint a centralis, medialis amygdala, a BNST (11. ábra), illetve a lateralis és medialis septalis magok.
11. ábra. Fertőzött előagyi struktúrák 7 nappal a BDG csontvelői injektálása után. A BNST és a CeA neuronjaiban a fertőzés korábban jelenik meg, mint a cerebralis cortex neuronjaiban. Ennek tulajdonítható, hogy 7 napos túlélésnél ezek a sejtek degenerálódnak és ez a PRV immunpozitivitás csökkenéséhez vezet. A kitágult vérerek (nyílhegy) és kisméretű gyulladásos sejtek toborzása (inzert) a fertőzés hatására kialakuló lokális gyulladást jelzik. Ugyanebben az állatban a 7. napon nagy számú fertőzött sejt található az insularis és piriform cortexben, mutatva a fertőzés transszinaptikus terjedését.
48
Ezzel együtt, néhány infektált sejt megjelent az infralimbicus cortexben 2 állat esetén; a cortex prelimbicus, cortex cingulatus területén és a szomatomotoros, szomatoszenzoros corticalis területeken 3 állat esetén. A cortex cerebralis területén a PRV-fertőzött sejtek zöme az cortex insularisban és piriformisban volt megfigyelhető, bregma szerint -1.70 és 2.56 mm között (Paxinos és Watson szerint)177. 7 nappal a vírus beadása után a korábban fertőződött előagyi területeken csökkent a fertőzött neuronok száma, ugyanakkor nőtt az érintett sejtek száma a cortex insularis és piriformis területén. Fertőzött neuronok magányosan, illetve kisebb csoportokban feltűntek a rostralis agranularis insularis cortexben, míg nagyobb clusterekben jelentek meg a mélyebb pyramidalis rétegekben a bregma magasságában. A BNST és amygdala fertőzött sejtjei a 7. napon erőteljes degenerációt mutattak, ami az antigén-pozitivitás részleges csökkenéséhez vezetett. Ezzel együtt kis méretű, gliális- illetve leukocita morfológiát mutató sejtek voltak megfigyelhetők a fertőzött területeken és a kitágult lumenű vérerekkel együtt egyértelműen mutatták a lokális, fertőzés által kiváltott gyulladásos reakciót (11. ábra). A kerek, 10-15 mikron átmérőjű sejtek denzitása a fertőzött idegsejtek közvetlen közelében jóval nagyobb volt, mint a parenchyma többi területén.
5.1.2. A BDG vírussal fertőződött autonóm neuronok neurokémiai jellemzése A vírussal fertőzött idegsejtek fenotípusának megállapítására, a vírus riporter fehérjéjét a GFP-t immunfluoreszcens módszerrel kolokalizáltuk a katekolaminerg bioszintézis meghatározó enzimjével, a TH-val. 5 napos túlélésnél a C1 areában a fertőzött sejtek 21%-a volt TH-pozitív. Az A5 és A7 sejtcsoportok esetén ez az arány 59% illetve 66% volt. A LC fertőzött neuronjainak 81%-a expresszált tirozin hidroxilázt (12. ábra, B). A paravertebralis dúclánc lumbális ganglionjaiban a vírussal fertőzött neuronok egy része neuropeptid Y (NPY) immunpozitivitást mutatott (12. ábra, B).
49
12. ábra. A BDG vírussal fertőződött neuronok neurokémiai jellemzése. A. A virális fertőzést GFP immunfluoreszcenciával mutattuk ki (zöld). Az agytörzsi katekolaminerg (A5, A7) neuronok (TH exprsszió, piros) egy része fertőzöttséget mutat 5 nappal a BDG csontvelői beadását követően. Az inzertek a kettős-pozitív (GFP+TH) sejteket mutatják (sárga) nagyobb nagyításban (nyílhegy). B. 4 napos túlélésnél a GFP autofluoreszcencia (zöld) jelzi a vírussal fertőződött idegsejtek jelenlétét a lumbalis paravertebralis dúclánc ganglionban. Az érintett sejtek azonosíthatók a natív határlánc-preparátumon (bal fölső kép) valamint kriosztátos metszést követően (bal alsó kép). A jobb panelen a fertőzött sejtek NPY-al (piros) való kolokalizációja látható. A nyílhegy mutatja az NPY-pozitív, vírussal fertőzött neuronokat (sárga). 7n – nucleus nervus facialis. Lépték: 100 μm.
5.1.3. Kontroll kísérletek Annak megállapítására, vajon a BDG vírus csontvelői beadása eredményeként fertőződött idegsejtek centrális eloszlása jellemző–e a csontvelőre, a vírust a femur proximalis epiphysisébe injektáltuk (n=4). A jelölt sejtek a T8-L1 gerincvelői szelvényekben voltak megtalálhatók 4 nappal a beadás után. 5 napos túlélésnél a C1, A5, LC sejtcsoportok és a ventromedialis medulla infektált neuronjai hasonló elhelyezkedést
mutattak
a
femur
distalis
epiphysisébe
történő
beadásokkal
összehasonlítva. Egy állatot vizsgáltunk meg 7 napos túlélés után. Ebben az esetben is a vírus fertőzés terjedése és a jelölődött idegsejtek lokalizációja megegyezett a distalis beadásoknál tapasztaltakkkal az előagyi magok területén is. A fertőzött sejtek átlagos
50
száma is nagy hasonlóságot mutatott, metszetenként 6±2.4 sejt a C1-ben; 4.6±2.5 sejt az A5-ben és 7.5±3.5 sejt az RVMM-ben volt PRV immunpozitív a femur distalis, míg rendre 5.1±0.6; 5.7±2.7; 4.5±2.5 sejt a femur proximalis epiphysisébe történő vírusbeadás után. Annak a lehetőségnek kizárására, miszerint a PRV fertőzés a periosteum szenzoros sejtjeiből eredt és nem a csontvelőből, néhány állat esetén a BDGt a feltárt és megtisztított csontfelszínre cseppentettük. Ezekben az állatokban 5 napos túlélésnél csak nagyon gyenge agytörzsi jelölődést tapasztaltunk. Átlagosan az A5 régióban 2.1±0.7, a C1-ben 1.4±0.4 fertőzött sejtet találtunk metszetenként. Ugyanakkor jelölődés volt látható az NTS-ben (2.3±0.7 sejt/metszet), ami a csontvelői beadások esetén nem volt tapasztalható, 5 nappal a vírus beadása után. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy a viszceroszenzoros preautonóm sejtek részt vesznek a csonthártya beidegzésében. Más agyterületeken nem találtunk vírusantigéneket tartalmazó sejteket ennél a túlélési időnél. Az ipsilateralis femoralis, ischiadicus és obturator idegek átmetszése csontvelői beadást követően hatból három állat esetén teljesen meggátolta a gerincvelői és az agytörzsi vírusfertőzés kialakulását 5 nappal a beadás után. Az állatok felénél megfigyelhető fertőzött neuronok eloszlása jellemző volt a csontvelői beadásra, de az infektált sejtek száma jóval alacsonyabb volt. Csak elvétve fordultak elő PRV-pozitív idegsejtek a gerincvelő a T8-L1 szakaszán, az agytörzsben pedig metszetenként átlagosan 2-3 sejtet találtunk (a C1-ben 1.1±0.4, az A5-ben 1.3±0.6, az RVMM-ben 3.6±0.3 sejt/metszet). A kontroll állatok egy másik csoportjánál a femurt körülvevő izomzatból eredő centrális fertőzést hasonlítottuk össze a csontvelőből eredő fertőzéssel. 10 μl, 6x108 PFU/ml titerű BDG beadása után 5 nappal a szomatomotoros működésben részt vevő agyterületek – mint a substantia nigra – sokkal több fertőzött sejtet tartalmaztak, mint amit néhány állat esetén a csontvelői beadás után tapasztaltunk. Fertőzött neuronokat figyeltünk meg a striatumban és a nucleus ruberben, ahol csontvelői beadások során sosem találtunk jelölődést. A szomatomotoros kéregben jóval több fertőzött sejt volt izomba történő beadás után, ugyanakkor kisebb fertőzést találtunk az insularis és piriformis cortexben. Ezzel együtt, az agytörzsi és köztiagyi fertőződő területek hasonlóak
voltak
mindkét
beadási
hely
esetén.
Hogy
cellularis
szinten
megkülönböztessük a transszinaptikus úton csontvelőbe, illetve a femur környéki izomzatba vetítő neuronokat, kettős vírus tracinget alkalmaztunk. Két izogén vírustörzset használtunk a kísérletekhez. A BDG-t (GFP riporter protein expresszió) a 51
femoralis csontvelőbe, a BDL-t (β-gal expresszió) a femurt körülvevő izomzatba injektáltuk. A két vírus által okozott fertőzés összehangolására több előzetes kísérlet történt. Amikor a BDL-t vagy BDG-t beadtuk a musculus vastus lateralis és adductor brevis izmokba, a két vírus törzs terjedése egymással megegyezett, de a fertőzés sokkal gyorsabban elérte az agytörzset mint a csontvelői beadások esetén és jóval több sejt fertőződött. Amikor a BDG-t a csontvelőbe és a BDL-t az izomzatba egyidőben injektáltuk, 5 napos túlélés után a β-gal-pozitív sejtek száma az agytörzsben jóval meghaladta a GFP-t expresszáló sejtek számát. Ezért a további kísérletek során a BDG-t egy nappal a BDL beadását megelőzően injektáltuk (13. ábra).
13. ábra. Kettős virális pályajelölés a csontvelő és a femoralis izmok innervációjának vizsgálatára. A BDG vírust (GFP expresszió, zöld) a femoralis csontvelőbe, a BDL vírust (β-gal expresszió, piros) a musculus vastus lateralis és adductor brevis izmokba injektáltuk. A. A ventrolateralis és ventromedialis medulla területén kettősen jelölt (mindkét vírust tartalmazó) neuronok tallhatók (nyílhegy). Ez megmutatja, hogy az egyes idegsejtek egyszerre két vírussal is produktívan fertőzhetők. B. A különböző beadási területekről eredő fertőzés szeparáltan jelenik meg a PVN-ben. A magban nem találunk kettősen jelölt idegsejteket és a csontvelőből eredő fertőzés kontralaterális dominanciát mutat. 3V – harmadik agykamra. Lépték: 100 μm.
A gerincvelői mellső szarvban BDL-el fertőzött alfa motorneuronokat találtunk az L2S3 szelvénykben, a fertőzés fókusza az L4-L5 szelvényekben volt, ahol metszetenként
52
2-3 neuron jelölődött. Ezek között nem voltak GFP-t kifejező sejtek. Az agytörzsben a két vírustörzs okozta fertőzés átfedő területeket érintett. A ventromedialis medullában az LPGi-ben és az RVLM-ben a C1 területén, átlagosan 2-3 sejt fertőződött mindkét vírussal (13.ábra, A). Az A5, A7 régiók csak elvétve tartalmaztak kettősen jelölt neuronokat. A köztiagyban, PVN területén a két vírus okozta fertőzés teljesen elválasztható volt. Egyik vírust tartalmazó, GFP- illetve β-gal-pozitív sejtek megfigyelhetők voltak a dorsalis és ventralis parvocellularis subdivíziókban, de kettősen jelölt sejtek nem (13. ábra, B). A GFP-t expresszáló idegsejtek kontralaterális dominanciát mutattak (a bal femurba történő beadás után a jobb PVN mutatott erősebb fertőzést), míg a β-gal immunpozitiv sejtek zömében ipsilateralisan voltak találhatók. 5.1.4. A centrális vírusfertőzés okozta gliális aktiváció és fagocitózis Mivel korábbi irodalmi adatok alapján valószínű volt, hogy az agyi mikroglia sejtek aktiválódnak pseudorabies vírus fertőzés során, megvizsgáltuk, szerepet játszhat-e ez a reakció a fertőzött neuronok degenerációjában és eliminációjában. Lectin hisztokémiát alkalmaztunk, amely az agyi mikroglia –makrofág sejtek, valamint endothel sejtek felszínén lévő poli-N-acetil laktózamin molekulákhoz kötődik nagy specificitással 176. 5 nappal a BDG vírus csontvelőbe történő beadása után a fertőzött idegsejtek körül lectin-pozitív sejtekből álló csoportosulást figyeltünk meg az agytörzsben, amely körülvette a fertőzött neuronok sejttestét és a proximális dendriteket (14. ábra).
14. ábra. A vírussal fertőzött neuronok körül kialakuló gliális reakció. 5 nappal a BDG csontvelői beadása után az RVMM-ben található ferőzött neuronok (zöld, PRV immunfluoreszcencia) körül számos tomato lectin-pozitív sejt (piros) található. A. A mikroglia sejtek körülveszik a fertőzött idegsejteket (nyíl), barrier-szerű struktúrát alkotva a perikarion és a distalis nyúlványok körül. B. A degenerálódott, fertőzött sejtek PRV-immunpozitív törmeléke (zöld) a lectin-pozitív fagociták citoplazmájában található. Lépték: 50 μm.
A lectin pozitív sejtek az agy minden területén megtalálhatók voltak a fertőzött neuronok körül, a lectin festés erőssége pedig egyértelműen megnövekedett a fertőzött
53
területeken található mikroglia sejteken a vírusfertőzést nem mutató agyterületekhez képest. A degenerálódott, fertőzött sejtek törmeléke megtalálható volt a lectin-pozitív sejtek citoplazmájában, kis szemcsék formájában. Ugyanakor, a lectinnel jelölődött mikroglia sejtek teljes citoplazmája csak nagyon ritkán volt PRV-immunpozitív, ami arra utalt, hogy ezek a sejtek zömében nem fertőződnek, csak fagocitálják a vírusantigéneket és a neuronális törmeléket.
5.2. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata 4 nappal a BDG vírus interscapularis BAT-ba és a BDL vírus epididimális WAT-ba törénténő injektálása után a gerincvelőben számos fertőzött sejt volt megfigyelhető. A β-gal pozitivitást mutató (WAT felől visszatöltődött) neuronok jellemzően az alsó thoracalis és első lumbális szelvényekben voltak megtalálhatók a preganglionális neuronokat tartalmazó IML és CAN területén. Ezzel szemben a GFP-t kifejező (BAT felől
visszatöltődött) sejtek a thoracalis
T1-T5 szelvények IML és CAN
magcsoportjaiban helyezkedtek el. Ez a beidegzési mintázat megfelelt annak, amit a gerincvelői szelvényezettség ismeretében vártunk. A közbülső, T6-T10 szelvényekben a két vírustörzs fertőzte neuronok területi átfedést mutattak, de itt jóval kevesebb érintett sejt volt megfigyelhető és csak nagyon kis számban találtunk mindkét vírust tartalmazó idegsejteket. Ez azt mutatta, hogy gerincvelői szinten a BAT és WAT –ot innerváló preganglionális neuronok nagyrészt elkülönült populációkat alkotnak. 5.2.1. A BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációja az agytörzsben 4 nappal a vírusok beadása után számos GFP-t és β-gal-t kifejező sejt volt látható az agytörzs területén. A legtöbb pre-autonóm területen mindkét vírus jelenléte kimutatható volt és viszonylag alacsony számú kettősen fertőzött sejt volt található. A medullában az A2, A5, C1 katekolaminerg sejtcsoportok és RVMM neuronjai között BDG-vel és BDL-el fertőzött sejteket is találtunk. Az 5. napra a fertőzött sejtek száma az agytözsben emelkedett. Egyik területen sem volt megfigyelhető valamely vírus kizárólagos jelenléte, bár az érintett magokon/areákon belül a két fertőzés esetenként elválasztható volt. Ugyanakkor a nucleus motorius nervi vagi (DMV) területén a két vírus által fertőzött idegsejtek egyértelműen elkülönültek. A DMV neuronjai szinte kizárólag 54
BDL-el fertőződtek, ami az epididimális zsírszövet DMV általi elkülönült innervációját mutatta, míg a BDG-t tartalmazó neuronok zöme az NTS területén volt megtalálható, gyűrűszerűen körülfogva a DMV dorsalis részét (15. ábra, A).
15. ábra. Fertőzött sejtek az agytörzsben a BDG epididimális WAT-ba és a BDL interscapuláris BAT-ba törtélő beadása után. A. Fertőzött sejtek az NTS-dorsalis motoros vagus komplexben 5 nappal a vírusbeadás után. B. 7 nappal a CTB epididimális WAT-ba történő injektálását követően csak nagyon kis számú, CTB-pozitív sejt látható a DMV-ben. C. Az NTS-ben a BDL-el fertőzött sejtek egy részét az NPY tartalmú rostok innerválják. D. A C1 katekolaminerg régió alatt marginalisan található BDL-el fertőzött sejteket is beidegzik az NPY tartalmú rostok. E. A grafikon az agytörzs C1/A1 (bordó), NTS (narancs), A5 (zöld) és A7 (szürke) katekolaminerg régióiban található BDG, illetve BDL-vírusokkal fertőzött sejtek metszetenkénti átlagos számát és kolokalizációját mutatja a TH enzimmel. F. A BDG és BDL vírusok keverékének beadása után 4 nappal az a RVMM-ben nagy a mindkét vírussal fertőződött sejtek aránya. Rövidítések: cc- canalis centralis. Lépték: A,B- 100 μm; C,F- 50 μm; D- 25 μm.
Ugyanakkor BDL-pozitív sejtek az NTS ben is nagy számmal voltak jelen. Mivel a DMV-ben megfigyelt nagyszámú BDL-el fertőzött sejt azt mutatta, hogy direkt 55
monoszinaptikus kapcsolat lehet a nervus vagus viszceromotoros sejtjei és az epididimális WAT között, cholera toxin β -t (CTB) injektáltunk az epididimális WATba, bilaterálisan. Érdekes módon, 7 nappal a CTB beadása után csak nagyon kis számban voltak megtalálhatók retrográd módon jelölődött, CTB-pozitív sejtek a DMV területén (15. ábra, B). Az NTS- DMV területén található BDL-el fertőződött neuronok közül számos kap NPY innervációt (15. ábra, C). A medulla területén a C1 régió és az RVMM ventrális részén, az agyhártyákhoz közeli területen, a β-gal –pozitív sejtek gyakran az NPY rostokkal gazdagon átszőtt részeken voltak megtalálhatók. Sokat közülük beidegeznek az NPY tartalmú rostok és végződések (15. ábra, D). A TH immunfestést követően a különböző agytörzsi katekolaminerg magvakban nem találtunk szignifikáns különbséget a kolokalizáló GFP illetve β-gal-pozitív sejtek arányát tekintve (15. ábra, E) és a mindkét vírussal fertőzött sejtek száma is alacsony volt. Annak eldöntésére, hogy lehete bármilyen interferencia a két izogén vírustörzs között és lehet –e ez a kis számú GFP+ β-gal –kettős pozitív sejt okozója, a BDG-t és BDL-t összekevertük és a víruskeveréket az epididimális WAT-ba injektáltuk. 4 nappal a vírus beadása után az agy területén található fertőzött idegsejtek több mint 70%-a fertőződött mindkét vírussal (15. ábra, F). Az agytörzsben megtalálható BDG-vel és BDL-el fertőzött sejtek lokalizációját és arányát az egyes területeken a 16. ábra tartalmazza. Csak azokat az érintett agyterületeket tüntettük fel ahol a fertőzés megfigyelhető volt az injektált kísérleti állatok mindegyikében.
56
16.ábra. A fertőzött sejtek lokalizációja és mennyisége az agytörzsben. Az ábrán az agytörzsben található BDG-vel és BDL-el fertőzött sejtek elhelyezkedése és átlagos mennyisége látható. A nyúltvelőhíd területéről vett patkány agy atlasz (Paxinos és Watson, 1997) ábrák rostro-caudalis irányban vannak feltüntetve. A fertőzött sejtek relatív mennyiségét a képeken piros (β-gal-pozitív sejtek), zöld (GFPpozitív sejtek) és sárga (β-gal+GFP kettős pozitív sejtek) gömbök jelzik. A + jelek mennyisége a következő skála szerint lett megadva: +, 1-4 fertőzött sejt; ++, 5-9 fertőzött sejt; +++, 10 nél több fertőzött sejt/ metszet.
57
5.2.2. A BAT és WAT innervációjában szerepet játszó centrális autonóm neuronok lokalizációja az előagyban 5.2.2.1. Hypothalamus A hypothalamus több, neuroendokrin rendszerrel, autonóm rendszerrel illetve táplálékfelvétellel kapcsolatban álló magcsoportjában találtunk fertőzött neuronokat. 4 nappal a vírusok beadása után a fertőzött sejtek elsősorban a PVN-ben, a retrochiasmaticus areában és a lateralis hypothalamusban voltak megtalálhatók. 5 napos túlélésnél a BDG és BDL-el fertőzött sejtek számos hypothalamicus magcsoportban megtalálhatók voltak (17.ábra, A).
17. ábra. Vírussal fertőzött neuronok a hypothalamusban. A. 5 nappal a BDG (zöld) epididimális WAT-ba és a BDL (piros) intercapcularis BAT-ba történő beadását követően számos fertőzött sejt látható a nucleus paraventricularis hypothalami (PVN)-ban. B. Fertőzött neuronok a ventromedialis hypothalamicus magban (VMH), 5 napos túlélésnél. C. Fertőzött neuronok a dorsomedialis hypothalamicus magban (DMN), 5 napos túlélésnél. D. A nucleus arcuatusban található β-gal és GFPpozitív sejtek egy része innervációt kap NPY (kék) tartalmú rostoktól (E.). Rövidítések: 3V- harmadik agykamra. Lépték: A, 100 μm; B-D, 50 μm; E, 25 μm.
Az 5. napra a PVN-ben az érintett sejtek száma a 4. naphoz képest megnőtt, a fertőzés mind az autonóm kapcsolatokkal rendelkező dorsalis, illetve medialis-ventrális mind a
58
neuroendokrin
rendszerrel
kapcsolatban
álló
dorsomedialis
subnucleusokban
megtalálható volt. A két vírussal fertőzött neuronok száma alacsony volt, hasonlóan az agytörzs esetén tapasztaltakhoz. A VMH és a DMN területén is megfigyelhetők voltak BDL-el és BDGvel fertőzött sejtek, de számuk nem volt nagy (17.ábra, B,C). Emellett, a supraopticus, suprachiasmaticus, periventricularis, perifornicalis magokban is megfigyeltünk érintett sejteket. A nucleus arcuatusban (17. ábra, D) mind a β-gal, mind a GFP tartalmú neuronok egy részét NPY tartalmú rostok innerválják (17.ábra, E). A nucleus paraventricularis (PVN) területén megvizsgáltuk, hogy a vírussal fertőzött neuronok mutatnak-e kolokalizációt oxytocinnal (18.ábra, A,B).
18. ábra. Oxytocin és orexin tartalmú, fertőzött neuronok a hypothalamusban. 5 nappal a BDG eWAT-ba és a BDL BAT-ba történő beadása után számos vírusfertőzött sejtet találunk a hypothalamusban. A. A nucleus paraventricularis hypothalami (PVN) területén mind BDG, mind BDL-el fertőzött, oxytocint (kék) tartalmazó sejteket találunk. B. A β-gal-t, GFP-t és oxytocint kifejező sejtek metszetenkénti átlagos száma a PVN-ben. C. A lateralis hypothalamicus areaban (LH) és a nucleus perifornicalisban található BDG-vel és BDL-el fertőzött sejtek egy része orexint tartalmaz. D. A β-gal-t, GFP-t és orexint (kék) kifejező sejtek metszetenkénti átlagos száma az LH-ban és nucleus perifornicalisban. Rövidítések: 3V-harmadik agykamra. Lépték: 50 μm.
59
A PVN területén a β-gal tartalmú neuronok 24.9 %-a, a GFP –t tartalmazó neuronok 14.8 %-a és a két vírussal fertőzött sejtek 25.3 %-a fejezett ki oxytocint. Ugyanakkor a GFP- és β-gal-pozitív idegsejtek száma között nem volt jelentős különbség. A lateralis hypothalamusban (LH) és a perifornicalis nucleusban megvizsgáltuk az orexin expresszióját a WAT és BAT innervációjában szerepet játszó neuronokban (18.ábra, C,D). Az LH esetén a β-gal-t expresszáló sejtek 29.5, a GFP-t expresszálók 26.6, míg a két vírussal fertőzött sejtek 35.7 százaléka tartalmazott orexint. A nucleus perifornicalisban talált β-gal-t kifejező neuronok 35.6, a GFP-kifejező neuronok 17.3, a kettősen fertőzött neuronok 29.8 %-a volt orexinerg.
5.2.2.2. Limbicus rendszer és agykéreg
5 nappal a vírus beadása után az előagyban több, a limbicus rendszerhez tartozó mag területén figyeltünk meg fertőzött sejteket. A GFP- és β-gal-pozitív neuronok aránya nem tért el jelentősen és nem találtunk kizárólag egyik vírust tartalmazó agyterületeket. A fertőzött területek között megtalálható volt a BNST, a septum lateralis, valamint az amygdala centrális és mediális magja. A cerebrális cortexen belül a cortex insularisban voltak érintett sejtek jelentős számban megfigyelhetők. Az előagyban megtalálható BDG-vel és BDL-el fertőzött sejtek lokalizációját és arányát az egyes területeken a 19. ábra tartalmazza. Csak azokat az érintett agyterületeket tüntettük fel, ahol a fertőzés megfigyelhető volt az injektált kísérleti állatok mindegyikében.
60
19. ábra. A fertőzött sejtek lokalizációja és mennyisége az előagyban. Az ábrán az előagy területén található BDG-vel és BDL-el fertőzött sejtek elhelyezkedése és átlagos mennyisége látható a vírusok barna, illetve fehér zsírszövetbe történő inokulációja után. Az ábrák rostro-caudalis irányban vannak feltüntetve (Paxinos és Watson, 1997 alapján). A fertőzött sejtek relatív mennyiségét a képeken piros (βgal-pozitív sejtek), zöld (GFP-pozitív sejtek) és sárga (β-gal+GFP kettős pozitív sejtek) gömbök jelzik. A + jelek mennyisége a következő skála szerint lett megadva: +, 1-4 fertőzött sejt; ++, 5-9 fertőzött sejt; +++, 10 nél több fertőzött sejt/ metszet.
5.3. A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata 5.3.1. A vírus centrális terjedése lépbe törtőnő beadás után A első fertőzött neuronok az agyban négy nappal a BDG lépbe történő beadása után jelentek meg. Metszetenként átlagosan 1-3, PRV immunpozitivitást mutató sejt volt megfigyelhető a C1 és A5 katekolaminerg régiókban és néhány sejt az RVMM-ben.
61
5 napos túlélési időnél fertőzött idegsejteket találtunk a C1, C3, A5, A7 régiókban, a locus coeruleusban (LC), az NTS-ben, a nucleus raphe magnusban és pallidusban, valamint a gigantocellularis és paragigantocellularis magokban a medialis medullaban. Az infektált sejtek megfigyelhetők voltak a PAG területén, a PVN-ben, a retrochiasmaticus areaban és néhány sejt a preopticus magokban. A C1 éa A5 területén kisebb mértékben, az RVMM területén jelentősen megnőtt a fertőzött sejtek száma a 4 napos túlélési időhöz képest. 7 nappal a vírus beadása után a fertőzés számos előagyi területre átterjedt, mint a cortex insularis, illetve piriformis, a lateralis septum, a BNST és az amygdala, miközben a korábban fertőződött területeken, mint az RVMM, az érintett sejtek degenerációja volt látható, ami számuk csökkenését eredményezte. 10 napos túlélésnél a fertőzött sejtek zöme eltűnt az agytörzs területéről. A fertőzött sejtek degenerációját és eltűnését a korábban fertőződött agyterületekről a 20. ábra mutatja be két kiválasztott régió, az RVMM és a cortex piriformis példáján.
20. ábra. A vírusfertőzés terjedése a központi idegrendszerben a BDG lépbe történő beadása után. A lépben található terminálisok fertőződése után a szervet beidegző szimpatikus határlánc ganlionokban jelenik meg a fertőzés (1), melyek a gerincvelői preganglionális IML sejtektől kapnak innervációt (2). Agytörzsi (3) és hypothalamicus (4) autonóm premotoros neuronok direkt rostokat küldenek az IML-be. A később fertőződő corticalis idegsejtek (5) negyedik – ötödik rendű elemek a hálózatban. A szövettani fotókon az RVMM-ben és cortex piriformisban található PRV immunreaktív sejtek láthatók a fertőzést követő különböző túlélési idők esetén. 5 napos túlélésnél nagyszámú fertőzött sejt figyelhető meg az RVMM-ben, de a corticalis területeken még nem jelenik meg az infectio. 7 nappal a vírus beadása után mind a cortex piriformis, mind az RVMM tartalmaz fertőzött sejteket, de az RVMMben az érintett sejtek száma kisebb, mint 5 napos túlélésnél. 10 napos túlélési idő esetén az agytörzsben már alig találhatók PRV immunpozitív neuronok és ezek száma a cortex piriformisban is csökkenést mutat. A nyilak kitágult vérereket mutatnak a fertőzött területeken. Lépték: 100μm.
10 napos túlélésnél a legkorábban fertőződött területeken, mint az A5 vagy az RVMM csak szórványosan fordultak elő vírust tartalmazó neuronok és hasonló jelenség volt
62
megfigyelhető a hypothalamus korán fertőződött területein, mint a PVN. A cortex piriformisban nagy számú degenerálódó neuron volt megfigyelhető, ami a fertőzött sejtek számának kismértékű csökkenését eredményezte a 7 napos túlélési időhöz képest. Emellett, kitágult lumenü vérerek és számos kisméretű, sokszor PRV immunpozitív sejt jelenléte tisztán mutatta a lokális gyulladás és a korábbi virális fertőzés meglétét. 5.3.2. A BDG vírus riporter fehérjéje, a GFP és a virális struktúrfehérjék (PRV) kifejeződése in vitro Annak megállapítására, hogy milyen latenciával jelentkezik a PRV strukturális (kapszid és burok) fehérjék kifejeződése az immediate-early kinetikával expresszálódó GFP riporter proteinhez képest a fertőzött sejtekben, in vitro kísérleteket végeztünk Ennek során PK-15 és NE4C sejteket fertőztünk BDG-vel majd különböző időpontokban fixáltuk a sejtkultúrákat (21. ábra).
21. ábra. A virális strukturális fehérjék kifejeződésének időbeni eltolódása a GFP expressziójához képest a fertőzött sejtekben. A fluoreszcens képeken a GFP (zöld) és a PRV fehérjék (piros) kifejeződése látható a fertőzést követő különböző inkubációs időpontokban a PK-15 (bal oszlop) és az NE4C (jobb oszlop) sejtek esetében. Két órával a fertőzés után a GFP expressziója mindkét kultúrában kimutatható, de PRV fehérjék még nem detektálhatók. Négy órás inkubáció után a PRV fehérjék megjelennek a fertőzött sejtekben, de expressziójuk még alacsony. Hat –tíz órával a fertőzés után a sejtek zömében mind GFP, mind PRV fehérjék kimutathatók és a PRV expressziója megnő a 4 órás időponthoz képest. Lépték: 50 μm.
Egy órával a fertőzés után csak nagyon kevés sejt mutatott GFP expressziót. Két óra után, a GFP kifejeződés mindkét sejttípus esetén látható volt, de a sejtek még nem voltak PRV immunpozitívak. Négy óránál a PK-15 sejtek zöme pozitív volt GFP-re, míg a PRV fehérjék expressziója nagyon alacsony volt. Annak ellenére, hogy a 63
kultúrákban a sejtszámok azonosak voltak, a fertőzött NE4C sejtek aránya átlagosan 40 százaléka volt a fertőzött PK-15 sejtekének. Tíz órával a BDG fertőzés után a GFP-t expresszáló sejtek zöme PRV immunpozititást mutatott és a virális strukturális fehérjék mennyisége megnőtt. 5.3.3. A vírusfertőzés három stádiuma in vivo A BDG által okozott fertőzés három elkülöníthető szakasza volt megfigyelhető az érintett neuronokban az agy területén (22. ábra).
22. ábra. A GFP és PRV fehérjék expressziója in vivo. A. A PRV (kék) és GFP (zöld) együttes immunfluoreszcens kimutatásával különböző fertőzöttségű idegsejtek azonosíthatók a rostralis ventromedialis medullaban. Bal: korai fertőzöttséget mutató (I. fázis) neuronokban csak az immediate early kinetikával kifejeződő riporter protein GFP detektálható. Közép: A korábban fertőződött sejtekben a GFP és PRV fehérjék egyszerre vannak jelen (II.fázis). Jobb: a fertőzés késői stádiumában (III. fázis) a GFP expresszió jelentősen csökken, a PRV fehérjék expressziója dominál. B. A különböző fetőzöttségi stádiumban lévő idegsejtek megoszlása az adott túlélési időpontokban. Az oszlopok a GFP-, PRV-pozitív, illetve GFP-t és PRV fehérjéket együttesen kifejező neuronok metszetenkénti átlagos számát mutatják az RVMM az A5 régió és a cortex piriformis területén a BDG lépbe történő beadását követően.
I. fázis: a fertőzött sejtek még csak GFP-t expresszálnak (korai fertőzés). II. fázis: az érintett sejtekben mind GFP mind a virális struktúrfehérjék (PRV) kifejeződése kimutatható. III. fázis: fertőzött sejtekben a GFP expressziója csökkent, míg a PRV fehérjék expressziója maximális (késői fertőzés). Végül a fertőzött neuronok degenerálódnak, a PRV immunrektivitás csökken, majd eltűnik. 4 napos túlélésnél csak kis számú fertőzött sejt volt megfigyelhető az agy területén a lépbe történő beadást követően. Ezek mind I. vagy II. fázisban voltak, késői fertőzöttséget mutató (III. fázis) vagy degenerálódó sejtek még nem voltak megfigyelhetők. Az RVMM területén az 5. napra szignifikánsan megnőtt a fertőzött sejtek száma, ezek zöme (68.5 %) II. fázisban volt, míg 20.4 %-ban találtunk I. fázisban lévő és 11.1 % -ban III. fázisban lévő sejteket. 7 napos túlélésnél a késői fertőzöttséget 64
mutató, III. fázisban lévő sejtek aránya megnőtt (33.4 %) és a fertőzött neuronok száma lecsökkent az agytörzsben az 5 napos időponthoz képest (17. ábra). Tíz nappal a BDG beadása után a fertőzött sejtek szinte teljesen eltűntek az RVMM és az A5 területéről. Az A5 régióban a 4. napon a fertőzés előrehaladottabb stádiumban volt mint az RVMM-ben, több fertőzött sejt volt megfigyelhető. 5 napos túlélésnél az érintett sejtek 23.2%-a volt I., 44.5%-a II. és 32.3%-a III. fázisban. 7 nappal a beadás után a fertőzött neuronok száma mérsékelten csökkent és a 10. napra a fertőzött sejtek szinte teljesen eltűntek az A5 régióból (1.7±0.4; 1.8±1.4 és 4.3±2.1 sejt/metszet). A cortex piriformis területére a fertőzés jóval később jutott el, mint az agytörzsbe vagy a hypothalamusba. 5 nappal a vírus beadása után még nem találtunk fertőzött sejteket. 6 nap után kis számú, a 7. napra már jelentős mennyiségű érintett sejt volt megfigyelhető. A 7. napon a fertőzött neuronok 30.1 %-a fejezett ki GFP-t (I. fázis), 23.2 %-a PRV-t (III.fázis) valamint 46.7 %-a GFP és PRV együttesen (II. fázis). A 10. napra a korábban fertőződött neuronok degenerációja miatt a fertőzött sejtek száma és az I. fázisban lévő sejtek aránya mérsékelten csökkent, a III. fázisban lévő (késői fertőzést mutató) sejtek aránya nőtt: 21 %-ban találtunk GFP, 43.7 %-ban GFP+PRV és 35.3%-ban PRV pozitív sejteket (11±1.7; 22.5±7.8 és 35±4.2 sejt/metszet).
5.3.4. Gyors mikrogliális válasz a lokális vírusfertőzésre – az érintett neuronok körül kialakuló mikrogliális barrier struktúra szerveződése és szerkezete Az agyi fertőződés hatására aktiválódó mikroglia- makrofág sejtpopuláció kimutatására tomato lectin hisztokémiát és Iba1 valamint OX42 immunfluoreszcenciát használtunk. A virális fertőzést nem mutató állatok agymetszetein a mikroglia sejtek mindhárom markerre pozitívak voltak és a parenchymában egyenletes eloszlást mutattak. A fertőzött állatokban az aktivált mikroglia sejteken a mikrogliális markerek expressziója emelkedett, ami erősebb immunfluoreszcens festődést eredményezett (23. ábra, A, B). 5 nappal a vírus lépbe történő beadása után a fertőzött területeken a mikrogliák száma jelentősen megnőtt és a fertőzött neuronok közelében számos lectin, OX42 vagy Iba1 – pozitív sejt volt megfigyelhető. A gliasejtek denzitása az érintett neuronok közvetlen környezetében sokkal magasabb volt mint a parenchyma fertőzést nem mutató területein. Hasonlóan a csontvelői beadások esetén tapasztaltakhoz (14. ábra), a fertőzött idegsejtek perikarionját és proximális dendritjeit mikroglia sejtek vették körül szorosan, barrier-szerű struktúrát formálva (23. ábra, C). 65
23. ábra. A centrális vírusfertőzés hatására bekövetkező mikrogliális aktiváció és migráció. A. 5 nappal a BDG lépbe történő beadása után a lectin marker expressziója és a lectin-pozitív sejtek sűrűsége a fertőzött területeken megnő. B. Ugyanez figyelhető meg az Iba1 marker esetén. C. A vírussal fertőzött (PRV, zöld) idegsejteket a lectin-pozitív gliasejtek (piros) szorosan körülveszik. A kép 5 nappal a vírusadás után készült, az RVMM-ben. D. 10 napos túlélésnél már nem, vagy alig találunk PRV immunpozitivitást az RVMM-ben, de az aktivált mikroglia sejtek megfigyelhetők. E. A fertőzés továbbterjed a cortex felé, ezért a cortex piriformisban nagyszámú fertőzött neuron található, lectin pozitív gliasejtekkel körülvéve. Lépték: 50 μm.
5 napos túlélésnél, mikor az agytörzs fertőzött területein a mikrogliális aktiváció egyértelmű volt, az agykéreg nem fertőzött területein nem találtunk a mikroglia sejtek aktivációjára utaló jelet. 10 nappal a vírus beadása után, a korán fertőződött területek, mint az A5, C1 régiók vagy az RVMM már csak elvétve tartalmaztak vírussal fertőzött idegsejteket de a mikroglia-makrofág sejtek megtalálhatók voltak ezeken a területeken (23. ábra, D). Ugyanakkor a fertőzés terjedésének következményeként a cortex piriformisban nagyszámú fertőzött neuron volt megfigyelhető. Ezek a neuronok is körül voltak véve lectin-pozitív sejtekkel, bár a gliális barrier nem mindig volt kompakt, különösen amikor nagyszámú fertőzött idegsejt volt található kis területen belül. Az érintett neuronok fertőzöttségi állapotának a mikrogliális aktivációval és toborzással való korrelációjának vizsgálatára a GFP, PRV és lectin markereket hármas immunfluoreszcenciával egyszerre mutattuk ki (24. ábra, A-C).
66
24. ábra. A mikrogliális barrier elszigeteli a fertőzött sejteket környezetüktől az infekció korai stádiumában. A-C. A fluoreszcens képeken a GFP (zöld), PRV (kék) és lectin (piros) markerek együttes detektálásával vizsgálhatjuk a mikrogliális válaszreakció és a neuronok fertőzöttségi állapotának összefüggését. Az I. fázisban lévő neuronok körül még nem alakul ki mikrogliális barrier (A), de a virális fehérjék megjelenése után már igen (B, II. fázis). A késői fertőzöttséget mutató sejtek (III. fázis, csak PRV expresszió), körül már kompakt barrier figyelhető meg (C). D. A degenerálódó idegsejtek (Deg.) törmelékét a lectin pozitív fagociták veszik fel (nyíl), miközben a fertőzött, de még intakt neuron körül számos lectin pozitív sejt található (nyílhegy). A lectin hisztokémiai reakció a mikroglia-makrofág sejtek mellett az endothel sejteket (v) is jelöli. E. A fertőzött sejteket körülvevő mikroglia sejtek átlagos száma II., III. fázisban lévő, valamint degenerálódó sejtek körül szignifikánsan nagyobb, mint a nagyon korai fertőzést mutató, I. fázisban lévő neuronok körül. F. OX42 immunfestéssel ugyanaz a barrier struktúra figyelhető meg a fertőzött neuronok körül, mint a lectin hisztokémia esetén. G. A mikroglia- makrofág sejtekre specifikus Iba1 antigén kifejeződik a barrier-formáló gliasejtekben (kék), de nincs jelen a lectinpozitív vascularis elemek (v, piros) sejtjeiben.
Az I. fázisban lévő (még csak GFP-t kifejező) neuronok körül még nem, vagy csak nagyon kis számban találtunk mikroglia sejteket. Ezzel szemben, a mikrogliális toborzás és a barrier struktúra kialakulása a II. fázisban lévő sejtek körül már egyértelműen megfigyelhető volt. A III. fázisban lévő, késői fertőzést mutató neuronok 67
körül zárt barrier alakult ki. A fertőzött idegsejtek degenerációja után vírusantigéneket tartalmazó, PRV immunpozitív partikulumok, sejttörmelék volt megfigyelhető a lectin pozitív fagociták citoplazmájában, de szabadon a parenchymában nem (24.ábra, D). Vírusantigéneket tartalmazó fagocitákat az agy nem fertőzött területein nem figyeltünk meg. A lectin-pozitív gliasejtek átlagos száma szignifikánsan magasabb volt (P<0,001) a II. vagy III. fázisban lévő neuronok körül mint az I. fázisban lévő neuronok körül (24. ábra, E). Ez azt mutatja, hogy a mikrogliális barrier kialakulása végbemegy mielőtt jelentős mennyiségű vírusantigén lenne megtalálható az érintett sejtekben, azaz sokkal korábban, mielőtt a fertőzött neuronok sejtmembránjának szétesése bekövetkezne. Az in vitro víruskinetikai kísérleteink alapján (24. ábra) az I. és II. fázisok között (PRV proteinek megjelenése a GFP expresszióját követően a fertőzött sejtekben) 4-6 óra telik el. Valószínűsíthető tehát, hogy a mikrogliális aktiváció és barrier-formálás gyors folyamat, ami végbemegy 4-6 óra alatt a fertőzött neuronok körül, in vivo. Az I. fázisban lévő idegsejtek 62,9±14,1 %-a körül egyáltalán nem találtunk lectin-pozitív sejteket, miközben a II. fázisban lévő neuronok 45,5±12,4 %-a, a III. fázisban lévő idegsejtek 75,6±11,4 %-a körül komplett barrier alakult ki. A mikrogliális barrier kialakulása a PRV-immunpozitív sejtek körül az összes fertőzött agyterületen megfigyelhető volt. A barrier csak azokban az esetekben nem volt megtalálható vagy volt hiányos, amikor a fertőzött sejtek nagyon nagy denzitásban fordultak elő az agy valamely területén. Annak igazolására, hogy a lectin-pozitív, barrier-formáló sejtek mikrogliák, OX42 immunfestést végeztünk (24. ábra F). Az OX42 molekula (azaz a 3-as típusú komplement receptor) makrofágokon és aktivált mikroglia sejteken fejeződik ki. A nem fertőzött állatokban az OX42 festődés gyenge volt és az immunpozitivitást mutató sejtek egyenletes eloszlást mutattak a parenchymában. A fertőzött állatokban a lectin és Iba1-pozitív sejtekhez hasonlóan, az OX42-t expresszáló sejtek is koncentráltan a fertőzött neuronok körül helyezkedtek el. A GFP, PRV és OX42 markerek együttes kimutatása megerősítette a korábbi megfigyeléseinket: az OX42-immunpozitív mikroglia sejtek megtalálhatók voltak az II. és III. fázisban lévő neuronok körül, de nem voltak megfigyelhetők az I. fázisban lévő, nagyon korai fertőzöttséget mutató sejtek esetén. Az Iba1 antigén (mikroglia–makrofág marker) szintén kolokalizációt mutatott a lectin-pozitív mikroglia sejtekkel (24. ábra, G) de nem volt megtalálható a lectint kifejező vascularis elemekben. Az Image J programmal „Z” sík szerint digitálisan
68
rekonstruált konfokális mikroszkópos képek megmutatták, hogy a fertőzött neuronok körül a mikroglia háromdimenziós barriert hoz létre (25. ábra). A gliális elemek az érintett sejtek perikarionját és proximális nyúlványait fogták körül, az adott idegsejt fertőzöttségi állapotának megfelelő mértékben.
25. ábra. A fertőzött sejtek körül kialakuló mikrogliális barrierről készített konfokális képek háromdimenziós rekonstrukciója. A. Az Iba1-pozitív mikroglia sejtek (kék) szorosan körülveszik a fertőzött neuronok (zöld) perikarionját és főbb proximális nyúlványait. B. Az „A” ábrán látható Iba1pozitív sejtek által alkotott barrier, a fertőzött sejt megjelenítése nélkül.
5.3.5. Az ED1 -pozitív makrofágok részt vesznek a fertőzött neuronokat kölülvevő gliális barrier kialakításában Az ED1 glikoprotein a humán CD68 molekulával homológ, elsősorban a mieloid sejtek lizoszómális membránján fejeződik ki. Ezt a markert vírussal fertőzött állatok agyában a mononukleáris fagocita sejtek kimutatására használtuk. Ezek egy részét –eredetük szerint- a rezidens, fagocitáló mikroglia sejtek adják, melyeken az aktiváció korai szakaszában még nem, vagy alig figyelhető meg ED1 expresszió. A populáció másik része az infiltrálódó, ED1-et kifejező perifériás makrofágokból áll, melyek immunhisztokémiailag nem különíthetők el a mikrogliától. A kontroll (vírussal nem fertőződött) állatok esetén nem találtunk ED1-pozitív sejteket az agyi parenchymában. 5 nappal a vírus lépbe történő beadása után a nyúltvelőben számos ED1-pozitív sejt volt megtalálható a fertőzött területeken (26. ábra).
69
26. ábra. Az ED1-pozitív fagociták beáramlása a vírussal fertőzött agyterületekre. A. A BDG lépbe történő beadása után 5 nappal az ED1-pozitív fagociták (piros) feltűnnek a fertőzött A5 régióban. A II. fázisban lévő idegsejtek körül (GFP-zöld, PRV-kék együttes expressziója) melyek a vérerekhez közel helyezkednek el, ED1-pozitív sejtek láthatók (B, nyílheggyel jelölt az A képen), míg az erektől távolabb található fertőzött neuronok körül gyakran nem találunk ED1 –et kifejező sejteket (C, nyíllal jelölt az A képen), jelezvén, hogy az ED1 –pozitív sejtek zömében perifériás eredetűek 5 napos túlélés esetén. D. A lectin, ED1, PRV hármas immunfluoreszcencia megerősíti a fenti megfigyeléseket. Az erektől távolabb található fertőzött neuronok körül zömében csak lectin-pozitív sejteket (E, nyílhegy a D képen), az erek közelében elhelyezkedő fertőzött idegsejtek körül ED1 és lectin kettős –pozitív (F, nyíl az F képen) sejteket találunk. 5 napos túlélésnél az RVMM-ben számos fertőzött neuron figyelhető meg (G), melyek szinte teljesen eltűnnek a 10. napra amikor a lokális mikroglia-makrofág sejtek többsége már ED1-pozitív és mikrogliára jellemző morfológiát mutat (H). 10 napos túlélésnél a cortex piriformisban található fertőzött idegsejtek körül csak kis számú ED1-pozitív sejt figyelhető meg (I, J). Lépték: 50 μm.
70
5 nappal a vírus beadását követően az ED1 festődés az immunpozitív fagociták perinukleáris régiójában volt megfigyelhető. Az erek közelében az ED1-et kifejező sejtek sűrűsége mindig meghaladta a parenchyma már területein látható sűrűséget. Számos sejt volt megfigyelhető az agyhártyákon és azok közvetlen közelében a fertőzött területeken. ED1-pozitív sejteket találtunk a fertőzött neuronok közvetlen közelében a gliális barrier alkotó elemeiként, főleg az erekhez közel található fertőzött sejtek körül. Hármas immunfluoreszcens jelölés (GFP, PRV és ED1 markerek) egyértelművé tette, hogy az ED1-jelölt sejtek jelenléte a fertőzött neuronok körül függ a lokális kapillárisoktól mért átlagos távolságtól. A II. fázisban lévő fertőzött neuronok 87,2±19,1 százaléka körül megtalálhatók voltak a lectin-pozitív sejtek, de ha az érintett idegsejt a kapillárisoktól relatíve távolabb helyezkedett el, ED1 immunpozitivitás nem volt megfigyelhető (26. ábra A, C). Ez a térbeli elrendeződés az A5 régióban volt a legegyértelműbb, ahol a vérerek a 7. agyideg internalis rostjaival parallel futnak a ponto-medullaris határon. Az erek közelében elhelyezkedő fertőzött idegsejtek körül az ED1-pozitív sejtek megtalálhatók voltak (26. ábra, A,B). Ez arra engedett következtetni, hogy az ED1 sejtek zöme perifériás eredetű lehet az agyi vírusfertőzés kezdeti stádiumában (5 napos túlélésű állatok esetén) és a barriert alkotó mikroglia sejtek nagyobb része még nem fejez ki ED1-et. A lectin, ED1, PRV hármas immunfluoreszcens jelölés megmutatta, hogy az erek közelében található lectin-pozitív sejtek valóban expresszálnak ED1-et (26. ábra, D, F), míg az erektől távolabb elhelyezkedő sejtek számos esetben csak lectin pozitivitást mutattak (21. ábra, D, E). 7 nappal a vírus beadása után a fertőzés elérte a cortex piriformist és a lectinnel jelölt sejtekből álló barrier megfigyelhető volt, de csak elszórtan találtunk ED1-pozitív sejteket (4. táblázat).
A5 RVMM Piriform cx.
5 nap 598±165.4 251±169.7
7 nap 775±28 1585±300 4.5±1.5
10 nap 1000±66 2459±246.3 156±29.8
4. táblázat. Az ED1-pozitív sejtek száma az A5 régióban, az RVMM-ben és a cortex piriformisban. A BDG lépbe történő beadása után 5 nappal számos ED1 expressziót mutató sejt található az agytörzsben legkorábban fertőződő A5 régióban és a kevéssel később fertőződő RVMM-ben. A sejtszámok az agytörzsben emelkednek a 7. és 10. napra, míg a cortex piriformisban a terület későbbi fertőződése miatt csak 10 napos túlélésnél figyelhetők meg ED1-pozitív makrofágok nagyobb mennyiségben. A számok az adott területre vonatkozó átlagos sejtszám±átlagos eltérés formában vannak feltüntetve.
71
10 napos túlélési idő után a fertőzött területeken jelenlévő lectinnel jelölődött fagociták túlnyomó többsége ED1 immunpozitivitást és mikrogliára jellemző, nyúlványos morfológiát mutatott (21. ábra, H). Ezek az eredmények jelzik, hogy a mikroglia sejtek zöme fagocitikus aktivitást mutat a késői fertőzés esetén. Megvizsgáltuk, hogy lépbe történő vírusbeadás nem indukálja –e
a fagociták szisztémás migrációját az agy
területére. Azokban az állatokban, melyek a lépbe történő vírusbeadás ellenére nem mutattak produktív fertőzést (az összes inokulált állat 10%-a), nem találtunk ED1pozitív sejteket az agyi parenchymában, hasonlóan a kontroll állatokhoz.
5.3.6. Ex vivo jelölt leukociták beáramlása a perifériáról a fertőzött neuronokhoz Mivel a lectin és ED1 markerek egyidejű immunfluoreszcens detektálása azt mutatta, hogy a gliális barriert a rezidens mikroglia és a perifériáról beáramló makrofágok együttesen alkotják ugyanakkor a mikroglia lehet a primer barrier formáló elem, ex vivo jelölést alkalmaztunk, hogy további megerősítést nyerjünk. Naív állatok véréből a monocitákat és limfocitákat tartalmazó frakciót preparáltunk és a sejteket egy vitális, fluoreszcens festékkel, CMTMR–el jelöltük meg. 24 órával a fertőzött neuronok agyban történő megjelenését követően (azaz 5 napos túlélésnél) CMTMR-pozitív sejtek voltak megfigyelhetők az erek lumenében, az erek luminális vagy parenchymális falához rögzülve, illetve a parenchymában a fertőzött területeken. Az ex vivo jelölt sejtek többsége az erek szomszédságában volt látható, egy részük pedig a fertőzött neuronok közvetlen közelében (27. ábra, A-C). A CMTMRpozitív leukociták gyakran az ED1 expressziót mutató sejtek között voltak megtalálhatók, bár csak egyharmaduk fejezett ki ED1- et (27. ábra D, E). Érdekes módon, az ex vivo jelölődést mutató leukociták a fertőzött neuronok körül néhány esetben mint „dupletek” voltak megfigyelhetők (27. ábra F, G), ami arra utalt, hogy a beáramló sejtek proliferálhatnak a vírusfertőzés hatására az agy területén. Ezt a megfigyelésünket későbbi vizsgálataink megerősítették.
72
27. ábra. Ex vivo jelölt leukociták beáramlása a vírussal fertőzött agyterületekre. A. A CMTMRpozitív (piros), ex vivo jelölt leukociták feltűnnek fertőzött területeken, ahol a fertőzött idegsejtek (GFP, zöld) mellett (B.) és az erek közelében a parenchymában (C.) is megfigyelhetők. D. A CMTMR-t tartalmazó sejtek zömében az érintett neuronok környékére gyűlő ED1-pozitív sejtek (kék) között találhatók. E. A „D.” képen nyílheggyel jelölt neuron környezete nagyobb nagyításban. F. A fertőzött idegsejtek körül a CMTMR-pozitív leukociták sokszor mint dupletek találhatók. G. Az „F.” képen nyílheggyel jelölt sejtek nagyobb nagyításban. H. A vérből preparált sejtek egy része kifejezi a lectin és ED1 markereket, míg a csontvelőből preparált sejtek nem (I.).
A legnagyobb számú CMTMR-el jelölt sejt akkor volt megtalálható a parenchymában amikor 3 nappal a vírus beadása után, azaz 48 órával a perfúzió előtt (5 nap túlélés) injektáltuk a jelölt leukocitákat a fertőzött állatokba. Ennél a beadási protokollnál a CMTMR-pozitív sejtek metszetenkénti átlagos száma az RVMM-ben 8.8±5.9, az A5 régióban 6.4±4.6 sejt volt 5 nappal a vírus lépbe történő injektálását követően. Azokban 73
az állatokban ahol az ex vivo-jelölt sejteket 4 nappal a vírus beadása után, azaz 24 órával a perfúzió előtt injektáltuk, a parenchymában megjelenő exogén sejtek átlagos száma jóval alacsonyabb volt (3.4±3.1 sejt/metszet az RVMM és 2.4±1.1 sejt/metszet az A5 régió esetén). Nem találtunk CMTMR-pozitív sejteket az álműtött állatok agyában a vérből preparált és ex vivo jelölt leukociták beadása után. Ugyanakkor, a cerebralis cortex mechanikus lézióját követően az infiltrálódott CMTMR-t tartalmazó sejtek megfigyelhetők voltak a lézió környékén és számuk nagyságrendileg összehasonlítható volt a vírussal fertőzött állatokban talált sejtek mennyiségével. Azok a leukociták, melyeket a femoralis és tibialis csontvelőből preparáltunk, majd jelöltünk ex vivo, ugyancsak megtalálhatók voltak a vírussal fertőzött állatok agyában 5 nappal a vírus beadása után. Érdekes módon az infiltrálódott sejtek nem mutattak sem ED1, sem lectin pozitivitást (27. ábra, I). Az CMTMR-el jelölt, csontvelői eredetű sejtek átlagos száma metszetenként 7.8±4.9 volt az RVMM-ben és 11.6±7.1 az A5 régióban. A kontroll vagy álműtött állatokban nagyon kis számban, de ugyancsak megfigyelhetők voltak CMTMR-pozitív sejtek a cerebralis cortex és a medulla területén (átlagosan 4-5 metszenenként 1 jelölt sejt).
5.3.7. A vírusfertőzés indukálta sejtproliferáció a fertőzött területeken Annak vizsgálatára, vajon a vírussal fertőződött neuronok köré gyűlő mikroglia sejtek, infiltrálódó leukociták és egyéb gliális elemek mutatnak-e proliferációs aktivitást, BrdU-t injektáltunk a fertőzött állatokba és beépülését az S fázisban lévő sejtekbe immunhisztokémiával mutattuk ki. 5 nappal a vírus lépbe történő beadása után számos BrdU-pozitív sejt volt megfigyelhető a fertőzött területeken (28. ábra). Az osztódó sejtek többsége az erek közelében volt található, mind az erek lumenében, mind a luminális vagy parenchymális érfal mellett, valamint a fertőzött neuronok közvetlen közelében. A fertőzött területekhez közel eső agyhártyákon is számos BrdU-pozitív sejtet figyeltünk meg. Az osztódó sejtek egy része az érintett idegsejtek mellett, a gliális barrier részeként is megfigyelhető volt, sokuk pozitivitást mutatott a lectin a vagy Iba1 markerekre (28. ábra B, E).
74
28. ábra. Proliferáció a vírussal fertőzött agyterületeken. 5 nappal a vírus lépbe történő beadása után az osztódó sejtek (BrdU, piros), a fertőzött neuronok (PRV, zöld) és a mikroglia/makrofág sejtek (lectin, kék) együttes immunfluoreszcens kimutatása igazolja, hogy a virális fertőzés hatására proliferációs aktivitás jelenik meg az érintett területeken. A. Az A5 katekolaminerg régióban számos BrdU-pozitív sejt látható a fertőzött neuronok és a vérerek közelében. B. A lectinnel jelölődött mikroglia sejtek (kék) egy része a fertőzött neuronok környezetében inkorporál BrdU-t. A kép az A képen nyílheggyel jelölt részletet mutatja nagyobb nagyításban. C, D. A fertőzött neuronokokhoz közel futó vérerek fala mentén is látható BrdU-pozitívitás. A C kép az A képen nyíllal jelölt részletet mutatja nagyobb nagyításban. A mikroglia sejtek mellett a vascularis elemek (v) is pozitivitást mutatnak a lectin markerre. E. Néhány, a fertőzött neuronok közelében található Iba1-pozitív mikroglia is beépít BrdU-t (nyílhegy) de sok Iba1negatív osztódó sejt is megfigyelhető (nyíl). F. A kontroll állatok agyában nem találunk BrdU-pozitív sejteket. Lépték: 50μm.
A proliferációs tevékenység jelei a fertőzött idegsejtek közelében futó vérerek fala mentén is megfigyelhető volt (28. ábra C). A kontroll állatokban, valamint azokban az állatokban melyek a BDG lépbe történő beadása ellenére sem mutattak produktív infekciót (az összes injektált állat 10%-a) nem találtunk BrdU-pozitív sejteket, ami mutatta, hogy a centrális vírusfertőzés volt a lokális sejtproliferációt kiváltó ok (28. ábra F). A vírussal fertőzött neuronok sohasem mutattak BrdU-pozitivitást, ami jelzi, hogy a BrdU inkorporáció nem a sejtek virális fertőzés okozta degenerációjának vagy a vírus replikációjának volt tulajdonítható.
75
5.3.8. A vírussal fertőzött idegsejtek és környezetük ultrastruktúrális vizsgálata Annak vizsgálatára, hogy a fertőzött neuronok körül kialakuló gliális barrier szerkezetét és megállapítsuk ennek szerepét a vírus terjedésére vonatkozólag, preembedding PRV immunhisztokémiát végeztünk. A vizsgálatok elsődleges célja az volt, hogy megállapítsuk, vajon a vírusfehérjék és a fertőzőképes virionok felszabadulását a fertőzött idegsejtekből hatékonyan gátolja –e a kialakuló gliális barrier struktúra. A vizsgálatokhoz az RVMM-et választottuk, 6 napos túlélés esetén, mivel így egy relatíve kis területen tudtuk egyszerre tanulmányozni a fertőzés különböző stádiumaiban lévő idegsejteket (29.ábra).
29. ábra. A fertőzött neuronok és környezetük ultrastruktúrális vizsgálata. A képeken preembedding, ezüst inteznifikálással erősített immunogold reakció látható a PRV vírusfehérjék ellen 6 nappal a vírus lépbe történő beadása után. A. A fertőzés korai stádiumában lévő (a citoplazma kevés, vírusantigéneknek megfelelő ezüst szemcsét tartalmaz) neuron körül már több glia megfigyelhető (nyilak). B. A fekete kerettel jelölt terület az A képen, nagyobb nagyításban. A gliális sejtmembrán szorosan a fertőzött idegsejt membránjához tapad és az érintkező területek egy részén elektrondenz struktúrák láthatók (az inzert a B képen nyílheggyel jelölt területet mutatja nagyobb nagyításban). C. A mononukleáris sejt a fertőzés előrehaladottabb stádiumában lévő (sok ezüst szemcse a citoplazmában) neuron sejtmembránjához tapad. D. A fertőzött idegsejttel érintkező glia felveszi a PRV immunpozitív partikulumokat. E. A D képen nyíllal jelölt részlet nagyobb nagyításban. F. A degenerálódott neuronokat az agyi makrofágok fagocitálják. A vírusantigéneknek megfelelő ezüst szemcsék membránnal körülvett kompartmentekben láthatók a fagociták citoplazmájában (G és H) ugyanakkor ezek a gliális elemek nem mutatnak fertőződést. Rövidítések: n- nucleus (glia); cit. – citoplazma (fertőzött neuron). Nagyítások: A: 2500x; B: 20000x; inzert: 60000x; C: 8000x; D: 10000x; E: 40000x; F: 7000x; G: 30000x; H: 20000x.
76
A virális fehérjéknek megfelelő ezüst szemcsék a fertőzés kezdeti stádiumában a sejtmagban és a perinukleáris régióban voltak először megfigyelhetők. A már kevés ezüst szemcsét tartalmazó idegsejtek környezetében is legalább 1-3 gliális elem megfigyelhető volt (29.ábra, A). Néhány sejt ezek közül szorosan, a fertőzött neuronokhoz asszociáltan helyezkedett el és a két sejt érintkező membránján elektrondenz struktúrák voltak láthatók. A fertőzés előrehaladottabb stádiumában a PRV immunreaktivitás kiterjedt az egész citoplazmára, kitöltve a sejttestet és a proximális nyúlványokat. Ebben a stádiumban (megfeleltethető a III. fázisnak amikor a GFP expresszió a fertőzött sejtekben lecsökken és a vírusfehérjék expressziója nő) számos mononukleáris fagocita volt látható az érintett neuron körül, megerősítve a korábbi, fluoreszcens mikroszkópos észrevételeket. A gliális elemek és neuronok sejtmembránjai egymással párhuzamos lefutást mutattak és immunreaktív partikulumok voltak megfigyelhetők a fagociták membránján és a fertőzött idegsejtek felé eső citoplazmájában arra utalva, hogy a vírussal fertőzött szövetet az odagyűlő gyulladásos sejtek felveszik (29. ábra, D,E). A fertőzés késői stádiumában a lokális gliasejtek magjában is lehetett néhány ezüst szemcsét látni, de ezek sűrűsége jóval alacsonyabb volt mint az érintett neuronokban. Ugyanakkor, a fagociták magjában sohasem lehetett denz jelölődést látni, ami arra utal, hogy ezek a sejtek rezisztensek a fertőzésre, vagy nagyon kis számban tartalmaznak infektív, replikálódó virionokat. A degenerálódó neuronok a fertőzés legkésőbbi stádiumában csökkenő PRV immunreaktivitást mutattak. A víruspartikulumok nem terjedtek a környező szövetbe kontakt neuronális fertőzés útján, ehelyett a fagociták a szétesett neuronok törmelékét az ezüst szemcsékkel jelölt vírusantigénekkel együtt felvették, melyek ezután membránnal körülvett fagoszómákban voltak láthatók (29.ábra, F-H).
77
6. Az eredmények megvitatása
Az értekezés anyagául szolgáló kutatások során attenuált pseudorabies vírus törzseket használtunk transszinaptikus pályajelölésre. Két különböző paradigmában – a csontvelő és az epidydimális/subcapsularis zsírszövetek esetén – megvizsgáltuk, mely centrális autonóm neuronok és neuronhálózatok állnak kapcsolatban e célszervekkel. Ebben a fejezetben három fontos kérdéskört szerenték megvizsgálni. Az egyik ezek közül a módszertani szempontokkal foglalkozik és megpróbálja megvilágítani, hogy a neurotróp vírustörzsek általában, ezen belül az általunk alkalmazott törzsek mennyiben alkalmasak leíró anatómiai vizsgálatokra és mennyire megbízhatók az így kapott eredmények. Ide tartoznak az adott kísérletek leírásánál (szeparáltan) megvitatandó metodikák, kontroll kísérletek és a vírusok által okozott centrális gyulladásos folyamatok, illetve ezek funkcionális következményei a pályajelölés számára. A második kérdéskör, hogy az általunk virális pályajelöléssel azonosított idegi hálózatok hogyan illeszhetők be az autonóm idegrendszer ismert modelljébe a csontvelőt és a zsírszövetet szabályozó idegsejt populációk esetén. A harmadik kérdéskör, melyet szintén külön tárgyalok a csontvelői és zsírszövetbe történő beadások szerint bontva, a leírt anatómiai struktúrák mellé próbálja az irodalmi adatok alapján ezek lehetséges funkcionális szerepét feltárni. A kísérletek során azonosított fertőződött neuronokat úgy tekintjük, mint valószínű elemeit a célszervek centrális szabályozásának, azonban funkcionális vizsgálatok szükségesek annak megállapítására, hogy ez a szabályozás valóban fennáll-e és pontosan milyen hatása van a célszerv működésére. 6.1. A csontvelő autonóm beidegzése Transszinaptikus virális pályajelöléssel elsőként sikerült azonosítanunk a csontvelő autonóm szabályozásában szerepet játszó központi-idegrendszeri struktúrákat. Az eredményeink azt mutatják, hogy a különféle agyterületeken található fertőzött idegsejtek egy hierarchikusan szerveződő hálózat részei, melynek kimenetét a szimpatikus preganglionális neuronok jelentik. Ez a rendszer irányíthatja a
78
hematopoézist, a vérkeringést és modulálhatja az immunsejtek aktivitását és funkcióit a csontvelőben.
6.1.1. Metodikai szempontok A BDG és BDL attenuált PRV törzsek, ezért a beadások során magas titerű vírusszuszpenziókat használtunk, hogy megfelelő fertőzési hatékonyságot érjünk el. A fertőzés hatékonyságát bizonyítottan befolyásoló faktorok: a (I) beadott volumen, (II) a a vírus titere, (III) az idegvégződések denzitása és (IV) az idegvégződéseken található PRV receptorok mennyisége a beadási területen
127,136,137
. Az előzetes kísérletek során,
amikor 108-109 PFU/ml titerű vírust injektáltunk a csontvelőbe, a produktív centrális fertőzést mindössze az állatok 20-40% -ában figyeltünk meg. Ezért a további kísérletekhez 1.5x1010 PFU/ml titerű vírust használtunk (3x108 injektált virion), ami nagyobb mennyiség, mint ami általánosan használt az eredeti Bartha törzs beadása esetén 139,145. Ugyanakkor az attenuált BDG és BDL törzsek alacsonyabb infektivitással rendelkeznek a GFP és LacZ géneknek a vírusgenom ASP régiójába történt beépítése miatt
158
. Ezek a vírusok az idegpályákat lassabban fertőzik és a fertőzés kevesebb
idegsejtet érint mint az eredeti Bartha törzs esetén
158
. Bár a femoralis csontvelő
80
rágcsálókban nagy számú szimpatikus rostot tartalmaz , nincs információ a csontvelői rostokon expresszált PRV receptorok számáról. Annak kizárására, hogy a nagy titerű vírus injektálása során megfertőztük a környező szöveteket, a csontvelői beadásokat összehasonlítottuk a periosteumra, illetve a femurt körülvevő izmokba történő beadásokkal. A fertőzés hatékonysága a periosteum esetén alacsony volt, az izombeadások után pedig sok motor-asszociált terület jelölődött. Ennek ellenére, az agytörzsben és a femorális izmok esetén a köztiagyban hasonló területeken tapasztaltunk fertőzést, mint a csontvelői beadások során. Ebből arra következtettünk, hogy a medulla/köztiagy területén lehetnek olyan neuronpopulációk, melyek mind a femorális izmokat, mind a csontvelő elemeit innerválják. A kettős vírus tracing megmutatta, hogy csak nagyon kis számú sejtről van szó, melyek mindkét rekombináns vírussal fertőződtek. Ugyanakkor számos nagyméretű α-motorneuron fertőződött a gerincvelőben, az izomba történő beadások után. Ez a (feltehetően) monoszinaptikus kapcsolat azt is eredményezhette, hogy a fertőzés gyorsabban elérte az agytörzset, mint a csontvelői beadások esetén, ami magyarázhatja a jóval erősebb agytörzsi fertőzést 5 napos túlélésnél. Az izomzat gazdagon vaszkularizált és a kettős
79
vírusbeadások során alacsony volt a két vírussal fertőződött sejtek száma, ami arra utalhat, hogy a csontvelői beadások esetén a vascularis elemeken kívül parenchymális rostokat is fertőztünk. Mindenesetre az érintett neuronok centrális eloszlása jellemző volt a csontvelőre, ezért igazoltnak látszik, hogy a fertőzés onnan eredt. Esetünkben a mindkét vírust tartalmazó idegsejtek részét képezhetik annak a közös autonóm-motoros rendszernek, aminek létezését a közelmúltban két független tanulmány is igazolta. Eredményeik szerint az agytörzs és köztiagy bizonyos neuroncsoportjai mind a szomatomotoros, mind az autonóm rendszer felé adnak kollaterálisokat 160,161. A csontvelő, mint reticularis szerv szimpatikus rostok által innervált, ugyanakkor vérerekkel is gazdagon el van látva, melyeknek saját, autonóm beidegzése is van. Az idegrostok, melyek a femurba a foramen nutriciumon keresztül lépnek be a lumbalis plexus részét képezik, amely az erek falához futó szimpato-motoros rostokat is tartalmazza. A csontvelői szimuszoidok fala is beidegzett, melyet TH és NPY tartalmú rostok szolgáltatnak, melyek szabadon végződnek a hematopoetikus/limfopoetikus sejtek között és nincsenek kapcsolatban a vaszkulatúrával 68,80-82,88. Afferens (szenzoros) SP és CGRP tartalmú rostok szintén innerválják a csontvelői prekurzor sejteket
178,179
.
Ezek, kisebb részben szintén felelősek lehetnek a vírus gerincvelő felé történő továbbításában. Így nem jelenthetjük ki teljes biztonsággal, hogy a fertőzés honnan eredt a csontvelőn belül, valószínűleg parenchymalis és vascularis elemeket innerváló rostok is fertőződtek. A virális pályajelölés általános problematikája, hogy nem tud különbeséget tenni a vascularis –nem vascularis innerváció között. Mivel a vérereknek minden szervben gazdag autonóm innervációja van, nehéz megmondani, vajon ezek, vagy más, az adott szerv keringésétől eltérő funkciót szabályozó rostok fertőződnek a beadás során
145
. Ugyanakkor elmondható, hogy más pályajelöléses módszerek sem
képesek a parenchymalis és vascularis rostokból eredő jelölődést megkülönböztetni. Emellett, a csontvelő esetén a vérellátás és a vér által szállított faktorok szoros összefüggésben
állnak
a
szerv
hematopoetikus
funkciójával.
Bizonyos
neurotranszmitterek – mint a noradrenalin – nem szinaptikus úton is felszabadulnak bármely szimpatikus terminálisból és hatással vannak a közeli immunsejtek állapotára, funkciójára 1. Az ischiadicus, femoralis és obturator idegek átmetszése, ami azt a célt szolgálta, hogy meggátoljuk a vírus terjedését a csontvelői rostokat adó neuronokhoz (ún. 1. rendű sejtek), csak az állatok felénél gátolta meg teljesen a fertőzést. Minden fáradozásunk ellenére, valószínűleg a lumbális plexus sok járulékos rostja miatt, nem tudtunk teljes 80
denervációt megvalósítani. Ennek ellenére, a sikertelen átmetszések esetén is nagymértékű csökkenés volt megfigyelhető az agytörzsi fertőzött idegsejtek számát illetően. Ez azt mutatja, hogy a fenti három ideg rostjai közreműködnek a csontvelő innervációjában.
6.1.2. A csontvelő beidegzését végző autonóm idegi hálózat anatómiája A kísérletekhez retrográd módon terjedő vírustörzseket használtunk
158
, ezért a
centrális, vírusantigéneket tartalmazó idegsejtek a csontvelő – paravertebrális határlánc ganglionsejtek – gerincvelői preganglionális neuronok úton fertőződtek. Az első fertőzött idegsejteket a lumbális gangionsejtek között találtuk, ezért úgy véljük, az innen kiinduló rostok azok, melyek terminálisai a csontvelőben vírussal fertőződtek. Mivel ezekben a ganglionokban jóval több fertőzött sejt volt 4 napos túlélésnél mint a gerincvelőben és minden vizsgált állatban ezt tapasztaltuk, nem vizsgáltunk korábbi túlélési időpontokat. Megfigyelésünket az az úttörő, funkcionális vizsgálat is megerősíti, melynek során a lumbális szimpatikus határlánc elektromos stimulációja a retikulociták és neutrofil granulociták vérbe történő elválasztását eredményezte
180
.
Szimpatikus preganglionális neuronok a gerincvelő négy különböző kompartmentjében találhatók: az IML-ben, a CAN –ban, az oldalsó kötegben és a nucleus intercalatusban 134,181
. A BDG vírus csontvelői beadását követően a fertőzött sejtek többsége az IML-
ben, kisebb részben a CAN-ban volt található, jelezve, hogy ezek a sejtek adják a csontvelőt
innerváló
preganglionális
rostokat.
A
szimpatikus
határlánc
posztganglionális és a gericvelő preganglionális neuronjairól ismert, hogy az álataluk innervált szervek/szövetek szerinti topografikus szerveződést mutatnak. A PRV-ir fókusza a csontvelői beadások után a gerincvelő alsó thoracalis és felső lumbalis szakaszán volt, ami megfelel a femur innervációjára vonatkozó korábbi anatómiai ismereteknek. Az egyértelmű gerincvelői szomatotópiától eltérően az autonóm premotoros neuronok, melyek a preganglionális sejteken végződnek, a neuraxis számos területén elosztva találhatók. A korábbi transszinaptikus pályajelöléses kísérletekkel összhangban, a csontvelői beadások esetén is két fő premotor régió mutatott kiterjedt fertőzést: az agytözs és a hypothalamus. A csontvelőből kiinduló virális fertőzés során jelölődött főbb neuronpopulációkat és ezek feltételezett (lehetséges) kapcsolatait a 30. ábra foglalja össze. 81
30. ábra. A csontvelő autonóm szabályozásában résztvevő centrális struktúrák kapcsolatai. A csontvelői axon terminálisok fertőzése után a vírus partikulumok elérik a paravertebrális dúcláncban a ganglionsejtek szómáját. Ezeket az elsőrendű neuronokat a gerincvelői IML preganglionális sejtjei innerválják. Erről a szintről a fertőzés a medulla-híd pre-autonóm idegsejtjeihez terjed, melyek az agytörzs és előagy felől számos területről kapnak beidegzést. Az ábrán csak a főbb lehetséges útvonalak vannak feltüntetve és a jobb áttekinthetőség miatt unilateralisan. Csak az adott túlélési időpontokban minden állatban konzisztensen jelölődött sejtcsoportokat tűntettük fel (a 3. táblázat adatai alapján). Rövidítések: A5 – A5 katekolaminerg sejtcsoport; C1 – C1 katekolaminerg sejtcsoport; CeA – centralis amygdala; GiA – nucleus gigantocellularis reticularis; insularis cx. –cortex insularis; LH – area hypothalamica lateralis; MPA – area preoptica medialis; piriformis cx. – cortex piriformis; PVN – nucleus paraventricularis hypothalami; RMg – nucleus raphe magnus; septal n. – nuclei septalis; Sg – szimpatikus ganglion.
82
Az IML-be érkező direkt projekciók számos agytörzsi területről erednek, mint az A5 sejtcsoport a vetrolateralis pons-medulla területén, a parabrachialis komplex KöllikerFuse magja, az NTS caudalis részének A2 noradrenerg sejtjei, a ventromedialis medulla, ezek belül a nucleus raphe magnus (RMg), és a ventrolateralis medulla C1, C3 adrenerg sejtcsoportjai
182
. Az A5 sejtek fertőzöttsége a csontvelői vírusbeadások után már a
korai túlélési időpontoknál kimutatható volt, ami jelzi, hogy ezek a sejtek proiciálnak a gerincvelői preganglionális neuronokhoz. Az A5 sejtpopuláció noradrenerg rostjai az irodalmi adatok szeint különösen nagy terminális denzitást mutatnak az IML preganglionális sejtjein és a hátsó szarv szenzoros neuronjain
183
. Az LC és a
subcoeruleus area sejtjei is fertőződtek a beadások során, ami jelzi szerepüket a csontvelő beidegzésében. Retrográd pályajelöléses kísérletek eredményi szerint a nagyméretű, multipoláris sejtekből származó axonok a pontomedullaris formatio reticularisban, majd a lateralis gerincvelői kötegben haladva innerválják a gerincvelői neuronokat
51,184
. Az LC neuronokról ismert, hogy részt vesznek a figyelem, éberség,
izgalom illetve a szimpatikus idegrendszer aktivitásának szabályozásában
58
és
közreműködnek a viselkedési – autonóm folyamatok szinkronizálásában. A C1 adrenerg sejtcsoport szintén küld efferens projekciókat a gerincvelői preganglionális neuronokhoz
56,57,185
. A C1 szimpatoexcitatoros neuronjai fontos
szerepet játszanak a szimpatikus reflexek generálásában külső vagy belső stimulusra, míg a C1 területen lévő nem adrenerg sejtek a bazális szimpatikus tónus fenntartásáért felelősek 59-61. A pályajelöléses kísérleteink során vírussal fertőződött A5, LC, C1 és C3 sejteket azon idegi hálózat harmadrendű elemeinek tekintjük, mely részt vesz a csontvelő szabályozásában. A legtöbb PRV pályajelölést alkalmazó tanulmány kimutatta ezeknek a sejtpopulációknak a fertőződését más perifériás célszervekbe történő vírusbeadás esetén is. Valószínűsíthető, hogy ez a hasonlóság részben a különböző szervek vascularis elemeinek hasonló autonóm szabályozásából ered, de a lokális szimpatikus tónus fenntartása, vagy a különféle parenchymális struktúrák hasonló szabályozása is magyarázat lehet. Bár a pályajelöléses kísérletek nem adnak információt a vascularis/parenchymalis beidegzés arányára, a csontvelő esetén funkcionálisan sem lehet ezeket a folyamatokat élesen elválasztani. Több megfigyelés is igazolta, hogy a csontvelői véráramlás a hematopoetikus folyamatok aktivitásával párhuzamosan változik
186,187
. Emellett, az A5, LC, C1 és C3 sejtcsoportok működése
83
hatással lehet a csontvelői nem szinaptikus noradrenalin elválasztás mértékére, amit más immunszervek esetén, mint a lép vagy a tímusz, egyértelműen igazoltak 1. A csontvelői vírusbeadások után a rostralis medialis medullában a nucleus paragigantocellularis dorsalis, lateralis, nucleus gigantocellularis reticularis és nucleus raphe magnus sejtjei is fertőződtek. A fertőzés korai megjelenése ezekben az idegsejtekben jelzi, hogy ezen sejtcsoportok is küldhetnek direkt rostokat a gerincvelői preganglionálisokhoz, amit korábbi, monoszinaptikus tracerekkel végzett kísérletek is alátámasztanak
188-190
.
A hypothalamus területén két főbb területet érintett a fertőzés, melyekről ismert, hogy a gerincvelőbe proiciálnak: a PVN-t és az lateralis hypothalamicus area-t. A retrográd virális pályajelöléses kísérleteknél mindkét terület általánosan érintett. A PVN ventromedialis, dorsalis és lateralis almagjaiból leszálló rostok innerválják a gerincvelői preganglionális neuronokat. A PVN-ben a centrális virális fertőzés kezdeti stádiumában megjelentek vírusantigéneket kifejező neuronok azokban a szubdivíziókban, melyeket korábban monoszinaptikus retrográd tracerekkel azonosítottak a gerincvelői IML-be történő beadások során191,192. Ezeknek az autonóm projekciós neuronoknak mintegy negyede fejez ki oxytocint, corticotropin-releasing hormont (CRH), vazopresszint, szomatosztatint,
vagy
neurotranszmitterek,
mint
metaz
leu-enkefalint31,43,46.
és
angiotenzin
II,
dopamin,
Ezzel
együtt
neurotenzin
más szintén
megtalálhatók ezekben a sejtekben, bár a teljes lista még feltárásra vár. 6 nappal a vírus csontvelőbe injektálása után PRV-pozitív sejteket találtunk a hypophyseotrop parvocellularis és magnocellularis kompartmentekben is, a PVN-ben. Morfológiai és elektrofiziológiai tanulmányok már korábban kimutattak interakciót a parvo – magnocelluláris sejtek között a PVN-en belül
193
. Mostani eredményeink szintén
megerősítik ezen kapcsolatok meglélét, melyeknek szerepe lehet az autonóm – neuroendokrin válaszok koordinálásában. A lateralis hypothalamicus area neuronjai ugyancsak küldenek közvetlen projekciókat a gerincvelői thoracolumbalis szakasz IML-ében lévő preganglionális neuronokhoz43,194. A közelmúltban az LH orexinerg neuronjairól megállapították, hogy olyan általános szimpatikus „vezérlő” sejteknek tekinthetők, melyek egyszerre számos szimpatikus target felé adnak kollaterálisokat
195
. A fenti hypothalamicus területek mellett, a
retrochiasmaticus area és a nucleus arcuatus bizonyos sejtjei is jelölődtek a csontvelői vírusbeadások után. A helyzetet bonyolítja, hogy bár az említett hypothalamicus területek bizonyos sejtjei direkt kapcsolatban állnak a gerincvelői preganglinonális 84
neuronokkal, az itt elhelyezkedő neuronok számottevő populációja innerválja a szimpatikus szabályozásban szerepet játszó agytörzsi területek sejteit is. Többek között az A5, PAG, LC és a ventrolateralis medullában található pre-autonóm sejtekről ismert, hogy kapnak közvetlen innervációt a PVN-ből 55,196,197. A lateralis hypothalamus sejtjei szintén küldenek projekciókat a rostralis ventrolateralis medulla neuronjaihoz, kiemelten a C1 sejtekhez
198
. A medulla és hypothalamus premotoros neuronjai a
cerebralis cortex és a limbicus területek felől számos bemenetet kapnak. A csontvelői vírusbeadások után a hosszabb túlélési időpontoknál fertőzött sejteket figyeltünk meg a BNST, amygdala területén valamint az insularis, piriformis és már corticalis területek neuronjai között. Ez a komplex corticalis –subcorticalis hálózat szerepet játszhat az autonóm válaszok generálásában emócionális hatások, például stressz, félelem, vagy izgalom hatására. Vírusos pályajelöléses kísérletek kimutatták a szimpato-adrenális, cardio-szimpatikus és gastroentero-szimpatikus rendszerek reprezentációját a cerebralis cortex különböző területein
153
. A csontvelőben zajló folyamatok autonóm
szabályozásában fontos szerepe lehet az insularis és piriformis corticalis sejteknek, amik nagy számban jelölődtek a BDG beadása során, míg kisebb mértékű jelölődést tapasztaltunk az infralimbicus, prelimbicus neuronokban. Az ezeken a területeken azonosított fertőzött neuronok minden bizonnyal nem specifikusan a csontvelői működés szabályozásában, mint inkább olyan autonóm folyamatok modulálásában játszanak szerepet, melyek másodlagosan a hematopoetikus környezet megváltozását eredményezhetik.
Annak ellenére, hogy a feltárt neuroanatómiai kapcsolatok
valószínűleg részt vesznek a csontvelői folyamatok szabályozásában, nem sikerült olyan egyedi
sejtcsoportokat
azonosítanunk,
melyek
kizálólagosan
a
csontvelő
szabályozásában játszanának szerepet.
6.1.3. A csontvelő beidegzésében szerepet játszó neuronhálózat funkcionális jelentősége A csontvelői noradrenerg/peptiderg (NPY tartalmú) rostok a vaszkuláris elemeket és stromalis, hematopoetikus sejteket innerválják. Ez az anatómiai szcenárió lehetővé teszi a véráramlás mértékének az immunsejtek fejlődésével és funkciójával való összehangolását. Az autonóm idegrendszer moduláló hatása közvetlenül eléri a csontvelői immunsejteket a nem szinaptius varikozitásokból felszbaduló noradrenalin közvetítésével, melynek receptorai a legtöbb hematopoetikus sejttípus felszínén megtalálhatók. Számos funkcionális bizonyíték van rágcsálók esetén, ami a csontvelői 85
innerváció fontosságára utal. (I) A femur műtéti denervációja egerekben csökkenti a csontvelői sejtek számát és megnöveli a keringésbe kerülő progenitor sejtek mennyiségét
199
. (II) Rövid ideig tartó noradrenalin kezelés képes a csontvelő eredetű
dendritikus sejtekben a Th1/Th2 citokinek termelődésének arányát megváltoztatni 200. A noradrenalin hatással van a dendritikus sejtek migrációjára is
201
, melynek mind az
immunszervekben, mind a gyulladás helyén fontos szerepe lehet. (III) A krónikus szociális stressz során patkányokban a megnövekedett szimpatikus tónus befolyásolja a leukociták cirkulációját és megváltoztatja a különféle fehérvérsejt populációk arányát a csontvelőben, a perifériás vérben valamint a lépben
202
. Rágcsálókban az is jelzi a
csontvelői innerváció szerepét, hogy kialakulása a fötális élet késői szakaszában kezdődik, közvetlenül megelőzve a hematopoetikus aktivitás kezdetét
87,203
. Meg kell
jegyezni, hogy emberben a csontvelő innervációjára (és az immunszervek beidegzésére általánosan) relatíve kevés adat áll rendelkezésre
68,88
, még kevesebb a beidegzés
funkcionális szerepére vonatkozóan. Leírták, hogy azokban a páciensekben akik komplett gerincvelői léziós sérülést szenvedtek el, a hematopoetikus progenitor sejtek növekedése és a limfociták aktivitása (aktiválhatósága) csökkent NPY csökkenti az emberi NK sejtek aktivitását
205
204
. Ismert, hogy at
. Közel sem tisztázott ugyanakkor,
pontosan milyen folyamatokban és milyen arányban vesznek részt az autonóm idegrendszer rostjai által elválasztott anyagok az emberi immunszervek működését illetően. Az általunk azonosított, csontvelőt innerváló centrális neuronhálózat alapvető szerveződése nagy hasonlatosságot mutat azokkal, melyekről más perifériás szervek esetén virális pályajelöléses technikát alkalmazva beszámoltak. Ilyenek a mellékvese 134
, a barna, illetve a fehér zsírszövet 93,144, a vese 206, az emlőmirigy 207, a pancreas 139, a
here 207, vagy más immunszervek, mint a lép
145
. Kettős virális tracinggel azonosítottak
olyan „vezérlő” szimpatikus neuronokat a hypothalamusban és az agytörzsben, melyek mind a cardialis, mind az adrenomedullaris funkciókat végző preganglionális neuronokat innerválják
208
és olyanokat, melyek kollaterálisokat adnak mind az
autonóm mind a motoros rendszer felé
160
. Funkcionális anatómiai tanulmányok
ugyancsak azonosítottak ilyen sejteket. Ismert, hogy a medulla és hypothalamus autonóm premotoros neuronjainak csak egy relatíve kis csoportja mutat aktivációt immun-
192
vagy metabolikus
209
kihívás esetén. Ezek az idegsejtek a gerincvelő
különböző szelvényeiben található preganglionális neuronokhoz küldött széleskörű projekcióiknak tulajdoníthatóan koordinálhatják a szimpatikus kimenetet a különböző 86
célszervek felé. Ezzel együtt, gazdag intrahypothalamicus és intramedullaris kapcsolataik miatt a „vezérlő” szimpatikus neuronok koordinálhatják a szimpatikus aktivációt a végbemenő viselkedési és endokrin válaszreakciókkal. Nem kizárt, hogy a központi idegrendszerben vannak olyan „immunoszimpatikus” általános autonóm neuronok, melyek a neuro-immun folyamatok összehangolását végzik.
6.2. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet centrális autonóm beidegzésének vizsgálata Korábbi transszinaptikus pályajelöléses kísérletek megmutatták, hogy a centrális autonóm idegrendszer részt vesz mind a WAT mind a BAT beidegzésében
93,144
.
Amikor úgy döntöttünk, hogy megvizsgáljuk a két zsírtípus innervációját kettős virális pályajelöléssel, több olyan kérdésre kerestük a választ, melyeket korábban nem, vagy csak érintőlegesen vizsgáltak. A nagyszámú fertőződött sejt és sok átfedő, érintett agyterület miatt, melyeket a korábbi vizsgálatok feltártak nem volt világos, hogy elválaszthatók –e egymástól a BAT és a WAT innervációjában szerepet játszó neuronok agyi lokalizációja vagy neurokémiai jellemzői. Kísérleteink során megvizsgáltuk, hogy találunk-e olyan idegsejteket, melyek mindkét vírussal fertőződtek, azaz a két zsírtípust együttesen beidegző, „közös” autonóm sejteket. Emellett, az alkalmazott kettős vírus tracing technika a pályajelölés kérdésköre szempontjából is több fontos problémát vet fel. Még izogén vírustörzsek alkalmazása esetén is kérdés vetődött fel, vajon egy vírussal fertőzött idegsejtet képes-e egy másik, izogén vírus azonos hatékonysággal fertőzni. Ez alapvetően fontos kérdés, hiszen bármilyen interferencia esetén a kettősen jelölt (két vírust tartalmazó) idegsejtek aránya nem az átfedő innervációs mintázat, hanem a különböző vírusok egymásra gyakorolt (elsősorban gátló) hatásának függvénye lenne. Nem izogén törzsek alkalmazása esetén korábban igazolták, hogy a fertőzött neuronok kevésbé fogékonyak egy másik vírussal való fertőződésre 210. Az sem volt számunkra világos, hogy találunk-e két vírussal fertőzött sejteket a központi idegrendszerben két olyan beadási terület esetén, melyek eléggé távoli gerincvelői szelvények által innerváltak. Megvizsgáltuk, hogy a szomatomotoros rendszer szomatotópiás szerveződéséhez hasonlóan megmutatható-e, hogy efféle elrendeződés a centrális autonóm idegrendszerben is kialakul.
87
6.2.1. Metodikai szempontok A beadások során két attenuált, izogén vírustörzset használtunk, melyeket sikerrel alkalmaztunk a csontvelő innervációjának vizsgálatakor, a femoralis csontvelő (BDG beadás) / femoralis izmok (BDL beadás) paradigmában. Szemben ezekkel a kísérletekkel, ahol a vírusok terjedésének összehangolását úgy végeztük, hogy a BDG beadásához képest 24 órával eltoltuk a BDL beadását, a BAT és WAT innervációjának vizsgálatakor különböző titererű vírusszuszpenziókat használtunk. Előzetes kísérleteink azt mutatták, hogy azonos titerű vírusok esetén a BDG okozta transszinaptikus fertőzés a BAT-ból korábban elérte a medulla-t és nagyobb számú sejt vált fertőzötté mint a BDL eWAT-ba történő injektálása után 4 napos túlélésnél. Ennek oka egyaránt lehetett az, hogy a BAT-ot innerváló gerincvelői szelvényekhez képest az eWAT jóval caudalisabban helyezkedik el vagy az, hogy a BAT területén a lokálisan elérhető terminálisok, vírusreceptorok sűrűsége esetleg nagyobb. A BDG és BDL virulenciája között korábbi vizsgálatok szerint nem volt jelentős különbség
158
. Ezért végül, több
különböző töménységű vírusszuszpenzió kipróbálása után a kísérletekhez használt vírustiterek körülbelül egy nagyságrendnyi eltérése (6x108 PFU/ml a BDG és 6.9x109 PFU/ml a BDL esetén) azt eredményezte, hogy a két rekombináns vírustörzs által okozott fertőzés kinetikája és az érintett sejtek száma hasonló volt az agy területén. A GFP és β-gal-pozitív, fertőzött neuronok az agyban átfedő területeken jelentek meg és a DMV kivételével nem találtunk olyan nucleust ahol dominánsan csak az egyik vírust tartalmazó idegsejtek lettek volna jelen. Ugyankkor, a mindkét vírussal fertőzött sejtek aránya alacsony volt, ami megegyezett a csontvelő-izom beadásoknál tapasztaltakkal. Annak ellenőrzésére, hogy az izogén vírustörzsek alkalmazása ellenére gátolt-e ugyanazon neuron egyszerre két vírussal történő fertőződése a vírusokat összekevertük és az eWAT-ba injektáltuk. A mindkét vírust tartalmazó neuronok 70 százalék fölötti aránya megmutatta, hogy azonos beadási terület esetén nem gátolt a két vírus által okozott koinfekció, azaz az alacsony számú kettősen fertőzött neuron oka a csontvelő/izom illetve a BAT/eWAT kettős vírusbeadásoknál a különböző beadási területek eltérő innervációja lehet. Ezek az eredmények azért is érdekesek, mert nem ismert, hogy a határlánc-ganglionok fertőződését követően nem terelődik-e az infekció „közös” útra, azaz nem következik-e be a célszervet innerváló pre- és posztszinaptikus neuronokkal nem kapcsolódó idegsejtek fertőződése. Korábbi vizsgálatok CTB és fluorogold monoszinaptius tracerek valamint a Bartha törzs együttes beadása során
88
megállapították, hogy funkcionálisan nem kapcsolt, ugyanakkor szomszédos gerincvelői preganglionális neuronok nem fertőződnek 147. Kísérleteink során a fertőzés gerincvelői szinten elkülönült a BAT-ba és eWAT-ba történő beadások után és bár a középső thoracalis gerincvelői szelvényekben mindkét vírus jelen volt, csak elvétve fordultak elő mindkét vírussal fertőzött idegsejtek. A BDG és BDL vírusok lassabb, specifikusabb terjedésre képesek mint a Bartha törzs és a fertőződő neuronok száma is alacsonyabb 122,158
.
Ezért
valószínűsíthető,
hogy
az
agyban
megfigyelt
fertőzött
sejtek
transszinaptikus úton fertőződtek a különböző beadási területek esetén.
6.2.2. A BAT és eWAT beidegzését végző autonóm idegi hálózat anatómiája és ennek funkcionális jelentősége A BDG BAT-ba és a BDL eWAT-ba történő beadását követően először a gerincvelő területén az IML és a CAN neuronjai fertőződtek. Az alsó thoracalis- lumbális szakaszon a BDL, a felső thoracalis szakaszon pedig a BDG fertőzés dominált, ami megfelelt annak amit az általános gerincvelői szelvényezettség ismeretében vártunk és összhangban volt más, korábbi vizsgálatok során kapott eredményekkel. A PRV-Bartha BAT-ba történő injektálása után fertőzött sejteket azonosítottak a ganglion stellatumban és a felső thoracalis IML-ben 211, míg a retroperitoneális zsírszövetbe való vírusbeadást követően a Th5-Th10 szelvényekben volt jelölődés 212. A keringésben lévő adrenalinról ismert, hogy stimulálja a WAT-ban a membránkötött β-adrenerg receptorokat
213
ezzel
növelve a lipolízist és a lipidek oxidációját 214. Kísérleteink során az agytörzs területén a DMV-ben megjelenő BDL fertőzés az eWAT-ba történő beadás után egyértelműen elkülöníthető volt a BDG-okozta fertőzéstől a BAT-ba történő beadás után, mely sejtek zöme az NTS-ben volt található. Annak ellenőrzésére, hogy valóban monoszinaptikus kapcsolat áll-e fenn a DMV és az eWAT között CTB-t injektáltunk az eWAT-ba. Csak nagyon kis számú retrográd módon visszatöltött sejtet figyeltünk meg és mindössze az inokulált állatok egy részénél, ami nem utal kiterjedt monoszinaptikus innervációra. Az irodalmi adatok között
is
számos,
paraszimpatikus
egymásnak
innervációjára
ellentmondó vonatkozólag.
megfigyelés
található
PRV-Bartha
és
a
WAT
fluorogold
retroperitoneális eWAT-ba történő beadását követően retrográd jelölődést figyeltek meg mindkét tracer esetén a DMV-ben, amit a szimpatikus denerváció nem befolyásolt
212
.
Azonosítottak olyan DMV motorneuronokat, melyek egyszerre adnak innervációt a
89
fehér zsírszövet, hasnyálmirigy és máj felé, de nincsenek szinaptikus kapcsolatban a funkcionálisan eltérő működést végző szubkután zsírszövettel 215. Vagotómiát követően a DMV-ben a retrográd jelölődés megszűnt, a plazma inzulin függő glükóz és szabad zsírsav felvétele 33, illetve 36 százalékkal csökkent, miközben egy katabolikus enzim, a hormon-szenzitív lipáz aktivitása 51 százalékkal nőtt. A paraszimpatikus denerváció hatására a retroperitoneális zsírpárnákban a rezisztin és leptin mRNS expresszió csökkent az adiponectin mRNS kifejeződése nem változott
212
. Más tanulmányok
eredményei viszont cáfolják a WAT paraszimpatikus beidegzésének meglétét. Patkányok, C57Bl6-os (normál) és ob/ob (elhízott, leptin receptor deficiens) egerek egyikében sem sikerült vazoaktív intestinális peptid (VIP), vezikuláris acetilkolin transzporter és neuronális nitrogén oxid szintetáz (nNOS) immunreaktivitást kimutatni egyik vizsgált fehér zsírszövet esetében sem (retroperitoneális, epididimális, inguinális szubkután). Egy másik tanulmányban a szerzők a mediasztinális BAT-ban mind szimpatikus, mind paraszimpatikus innervációt kimutattak és a hidegben tartott állatokban a vezikuláris acetilkolin transzportert hordozó terminálisok denzitása nőtt, jelezve, hogy a paraszimpatkus beidegzésnek funkcionális jelentősége lehet
109
. Ezzel
szemben a WAT-ban futó rostok szinte mindegyike pozitívitást mutatott a PGP9.5 pánneuronális markerre és kifejezte a TH enzimet, a katekolamin bioszintézis sebességmeghatározó enzimét. Ugyanakkor a Szibériai hörcsög esetén a 6-hidroxi dopaminnal végzett szimpatikus denerváció meggátolta az inguinális WAT-ból eredő PRV fertőzést a szimpatikus határlánc és a központi idegrendszer területén 216. Kísérleteink során az agytörzsben a DMV-n kívül, a GFP- illetve β-gal-pozitív neuronok számos preautonóm területen egyszerre voltak jelen, bár kevés kolokalizáló sejt volt megfigyelhető. A csontvelő vagy lép innervációját vizsgáló kísérleteinkhez hasonlóan a C1, A5, A7 katekolaminerg sejtek és az RVMM-ben a Gi és LPGi neuronjai a BAT-ba és eWAT-ba történő beadások után is fertőződtek transzneuronális retrográd úton. Ismert, hogy ezek a neuronok direkt projekciókat küldenek az IML-be és a szimpatikus rendszer általános aktivitását szabályozzák vagy részt vesznek a szimpatikus válaszok generálásában 56,57,182,183,185. A raphe pallidus neuronjai ugyancsak fertőződtek a BAT –ba és WAT-ba történő beadások után, már 4 napos túlélésnél, azaz a centrális fertőzés korai szakaszában. Ezekről az idegsejtekről ismert, hogy részt vesznek a BAT mediálta termogenezisben. Patkányok esetén intracerebroventricularis (icv) prosztaglandin E2 (PGE2) injekció hatására a BAT-ban a szimpatikus idegi aktivitás a kontrollhoz képest 224 százalékkal, a BAT hőmérséklete 1.8 celsius fokkal, 90
az artériás középnyomás 23 Hgmm-el nőtt, amit a raphe pallidusba adott glicin vagy muscimol (GABA A receptor antagonista) mikroinjekció gátolt
217
. A raphe pallidus
neuronjain kimutatható a prosztaglandin E receptor EP3 típusa
218
. A VGLUT3
vezikuláris glutamát transzporter-t kifejező raphe pallidus sejtek zöme nem tartalmaz szerotonint és bennük hideg környezet vagy prosztaglandin injekció hatására c-fos expresszió mutatható ki
219
. Mindemellett, kísérleteink során az eWAT felől retrográd
módon visszatöltődött GFP-pozitív sejteket is találtunk a raphe magnus és pallidus területén, ami azt mutatja, hogy a termogenezis mellett az itt található sejtek más folyamatok szabályozásában is részt vesznek. A mesencephalon területén mind BDG, mind BDL-pozitív sejtek jelentős számban voltak találhatók 5 nappal a vírusok beadása után a substantia grisea centralis (PAG) dorsomedialis és ventrolateralis szubdivízióiban. A PAG elektromos stimulációja vagy D,L-homocisztein sav caudalis PAG-ba történő injektálása fokozza a termogenezist amit az interscapularis BAT hőmérsékletének emelkedése mutat
220
. Korábbi, a
pseudorabies vírus Bartha törzsével végzett pályajelöléses vizsgálatok során hörcsögben is azonosítottak fertőzött sejteket a PAG területén a BAT-ba, illetve WAT-ba történő vírusbeadás esetén 93,144. A hypothalamus területén több magcsoportról is ismert, hogy részt vesz a tálpálékfelvétel szabályozásában vagy a termoreguláció folyamataiban. Kísérleteink során mind az eWAT, mind a BAT felől nagy számú, retrográd transszinaptikus úton fertőződött idegsejt volt látható a PVN-ben. A mindkét vírussal fertőződött neuronok alacsony száma ugyanakkor jelezte, hogy a két célszerv szabályozását zömében elkülönült sejtpopuláció végzi. Az area peroptica felől a PVN-be érkező kolinerg beidegzés bizonyítottan fontos eleme a hőháztartás szabályozásának. A preopticus area kolinerg stimulációja a testhőmérséklet csökkenését eredményezi és c-fos expressziót vált ki a PVN-ben, a PVN direkt stimulációja pedig ugyancsak hővesztést okoz
221,222
.
Kokain és amfetamin regulált transzkript (CART) PVN-be történő mikroinjekciója dózisfüggően gátolja az NPY-indukálta táplálékfelvételt és fokozza az uncoupling protein (UCP) 1, 2 és 3 mRNS expresszióját a fehér és barna zsírszövetben
223
.
Kísérleteink során azt találtuk, hogy a PVN-ben az eWAT felől retrográd úton jelölődött β-gal-pozitív neuronok nagyobb arányban tartalmaztak oxitocin-t, mint a BAT innervációjában résztvevő GFP-pozitív neuronok és csak kis számú mindkét vírussal fertőzött sejtet találtunk. Az oxitocint expresszáló idegsejtekről kimutatták, hogy az agytörzsbe, ezen belül az NTS-be proiciálnak, ahol innerválják a kolecisztokininre 91
(CCK) érzékeny neuronokat224. A CART peptid intracerebroventricularis (icv) injektálása c-fos expressziót indukál a PVN oxytocin tartalmú neuronjaiban, megemeli a plazma oxytocin, kortikoszteron és glükóz szintjét, de nem aktiválja a vazopresszint tartalmazó neuronokat és nem befolyásolja a plazmában mérhető vazopresszin mennyiségét kimutatható
225
226
. A PVN oxytocinerg neuronjain leptin receptor expresszió is
. Az eredményeink azt mutatják, hogy a PVN-ben az oxitocint tartalmazó
projekciós neuronok egy populációja fontos szerepet tölt be az epididimális fehér zsírszövetben zajló folyamatok szabályozásában. A lateralis hypothalamus és a nucleus perifornicalis területén található orexin tartalmú idegsejtek egy része fertőződött BDG-vel és BDL-el, jelezve, hogy ezek a sejtek részt vesznek a BAT és az eWAT szabályozásában. A nucleus perifornicalis orexin-t expresszáló neuronjai jóval nagyobb arányban fertőződtek BDL-el, annak ellenére, hogy a GFP- és β-gal-pozitív sejtek száma nem tért el jelentősen egymástól. Az LH- ban és nucleus perifornicalisban eredő orexinerg rostokról ismert, hogy egy részük a gerincvelői preganglionális sejteken végződik (IML), ahol az orexint tartalmazó rostok környezetében mindkét típusú orexin receptor expresszióját kimutatták
194
. Elektrofiziológiai vizsgálatok szintén megerősítették az orexin A és
orexin B közvetlen excitatórikus és szinkronizáló hatását a gerincvelői preganglionális neuronokon, ami a szimpatikus kimenet növekedését eredményezi
227-229
. Az orexint
tartalmazó idegsejteknek fontos szerepe van a táplálékfelvételt fokozó folyamatok szabályozásában 230-233. A nucleus arcuatus területén megfigyelt BDG-vel és BDL-el fertőződött idegsejtek körül számos esetben figyeltünk meg NPY-t tartalmazó rostokat és butonokat. Érdekes módon, az agytörzsben az RVMM és az RVLM területén marginálisan található, BDLel fertőződött, β-gal-t kifejező neuronok gyakran az NPY-t tartalmazó rostokkal asszociáltan jelentek meg. A nucleus arcuatusban található NPY/AGRP neuronokról ismert, hogy fokozzák, a POMC/CART neuronok pedig gátolják a táplálékfelvételt 236
234-
. A nucleus arcuatus NPY-t tartalmazó leptin-szenzitív idegsejtjeinek egy része a
gerincvelői preganglionális neuronokhoz proiciál és serkenti a táplálékfelvételt 237-239. Kísérleteink során a preopticus area (POA) területén is megfigyeltünk GFP-t, illetve βgal-t tartalmazó neuronokat, melyről ismert, hogy a termoregulációs folyamatokban kiemelt szerepet játszik
240
. Patkányok esetén a preopticus area lokális felmelegítése c-
fos expressziót indukál a nucleus supraopticusban és a PAG-ban, miközben hideg környezet hatására a PVN-ben és a nucleus dorsomediális hypothalamiban volt c-fos 92
immunreaktivitás megfigyelhető 241. A ventromedialis POA a fertőzések során kialakuló akut fázis reakcióban a láz kiváltásában vesz részt, termoszenzitív neuronjai PGE2 hatására fokozzák, a termálisan inszenzitív neuronok pedig csökkentik tüzelési frekvenciájukat 242. Konklúzióként megállapíthatjuk, hogy a DMV-ben megfigyelt szinte kizárólagos BDL fertőzés (eWAT felőli retrográd jelölődés) mellett nem találtunk olyan agyterületeket, ahol csak a BAT, vagy csak az eWAT innervációjában résztvelő neuronok vannak jelen. Ugyanakkor a minkét vírussal fertőzött neuronok általánosan alacsony száma azt mutatja, hogy a BAT-ot és eWAT –ot beidegző neuronok zömében elkülönült populációt alkotnak. 6.3. A vírusfertőzés hatására kialakuló centrális gyulladásos folyamatok vizsgálata A csontvelő innervációjának vizsgálatakor megfigyeltük, hogy a fertőzött neuronok körül gliális barrier struktúra alakul ki és a degenerálódott idegsejtek PRVimmunpozitív törmeléke kimutatható volt a lectinnel jelölt fagociták citoplazmájában. Feltételeztük, hogy a lokális gliális reakciónak szerepe lehet a BDG alacsony infektivitásában és a Bartha törzsnél lassabb terjedésében. A PRV fertőződést követő centrális immunreakció tanulmányozására a lépbe történő vírusbeadás modellt választottuk a következő okok miatt: (1) a csontvelői beadások után az agyban régiónként található fertőzött neuronok száma sokszor nem tette lehetővé, hogy egyazon magon belül (azonos területre proiciáló neuronok közül) megfelelő mennyiségű, különböző fertőzöttségi stádiumban lévő sejtet lehessen kis területen belül, azonos metszeten vizsgálni. (2) A lép felől trasszinaptikus retrográd úton fertőződött sejtek kellő számban voltak jelen az agyban és az állatok túlélési ideje nagyon hosszú volt (10 nap), ami lehetővé tette például, hogy frissen fertőződött neuronokat azonosítsunk az előagy több területén akkor, amikor a medullában a fertőzött idegsejtek nagy része már degenerálódott és eltűnt. Ennek azért volt jelentősége, mert igazolni kívántuk, hogy a megfigyelt gliális reakció a fertőzés hatására lokálisan alakul ki és nem szisztémás gyulladás vagy az egész agyat érintő „általános” fertőződés eredménye. (3) Előnyt jelentett továbbá az is, hogy a lép központi idegrendszeri autonóm beidegzését a PRVBartha törzs felhasználásával már korábban leírták
145
, így az általunk azonosított
fertőzött területeket és a fertőzés előrehaladását az agyban össze tudtuk hasonlítani irodalmi adatokkal.
93
Kísérleteink eredményei két elkülönülő témakör szempontjából szolgálnak lényeges információkkal. Egyrészt, a pseudorabies vírussal történő pályajelöléses kísérletek szempontjából alapvető fontosságú, hogy az adott célszervbe inokulált vírus által fertőzött központi idegrendszeri neuronok valóban transszinaptikus úton fertőződtek-e. Amennyiben kontakt fertőzéssel egymással szomszédos, de funkcionális kapcsolatban nem lévő idegsejtekben is megindulhat a vírus replikációja, az azt követően kialakult centrális fertőzés nem csupán a célszerv (beadási terület) szabályozásában résztvevő neuronok lokalizációját mutatja, ami hamis információk sokaságát eredményezi (a vírus közben az aspecifikusan fertőzött neuronokból is továbbhalad transszinaptikus retrográd úton). A korábbi irodalmi adatok és saját kísérleteink alapján valószínű volt, hogy a lokális immunválasz kiemelten fontos a kontakt infekció kialakulásának gátlásában. Másrészt, a pseudorabies vírus – mint α-herpeszvírus- a humán patogén HSV1 és HSV2 közeli rokona, így az általa okozott fertőzés elleni centrális immunválasz megértése fontos információkkal szolgálhat az emberi központi idegrendszeri vírusfertőzések okozta megbetegedések kezeléséhez. Kísérleteink során azonosítottuk a BDG (attenuált pseudorabies vírus törzs) által okozott centrális fertőzés ellen kialakuló gyors, lokális immunválasz sejtes elemeit. Korábbi vizsgálatok kimutatták az asztrociták, mikroglia és agyi makrofágok aktivációját, valamint CD45-pozitív leukociták beáramlását a centrális pseudorabies vírus fertőzés hatására
172
. Ezen vizsgálatok során ugyanakkor sokkal virulensebb
törzseket használtak, ami rengeteg fertőzött idegsejtet, súlyos patológiás elváltozásokat és a gliális elemek, leukociták diszkriminálatlan válaszreakcióját eredményezték. Valószínűleg ennek tudható be, hogy a mikrogliális barrier kialakulását korábban nem figyelték meg pseudorabies vírus okozta fertőzés esetén. A legfontosabb kérdés számunkra az volt, hogy a lokális celluláris válaszreakció képes-e a vírusfertőzés nem szinaptikus terjedésének gátlására, vagy csupán a tömeges neuronális fertőzés és degeneráció hatására kialakuló gyulladás másodlagos elemeként jelenik meg. Meg kívántuk vizsgálni, hogy a fertőzött sejtek körül megfigyelhető barrier elég korán kialakul-e ahhoz, hogy meggátolja a széteső neuronokból az infektív virionok kiáramlását az extracelluláris térbe. Ezért egy erősen attenuált, PRV-Bartha eredetű vírus törzset, a Ba-DupGreen-t (BDG) használtuk a kísérletekhez, amely a központi idegrendszerben sokkal lassabban terjed és kevesebb idegsejtet fertőz, mint az eredeti Bartha törzs 122,158. Így képesek voltunk az érintett, individuális idegsejtek fertőzöttségi állapotát korreláltatni a végbemenő lokális természetes immunválasszal. Az 94
eredményeink alapján úgy gondoljuk, hogy a vírus lassú terjedése és a fertőzött sejtek által indukált rendkívül gyors, mikrogliális toborzás az érintett neuronok korai izolációját eredményezi, ami végül a szétesett sejtek, illetve infektív virionok eliminációjához és a kontakt neuronális fertőzés gátlásához vezet. Ezek a folyamatok nagyban függenek a virális replikáció kinetikájától és a vírus terjedésének sebességétől, valamint a fertőzött idegsejtek és az elérhető mikroglia sejtek számától. Az in vitro víruskinetikai vizsgálataink eredményei alapján 4-6 óra szükséges ahhoz, hogy a PRV strukturális fehérjék kimutatható mennyiségben megjelenjenek a GFP-t (mint a virusfehérjéktól függetlenül, immediate early kinetikával kifejeződő riporter proteint) expresszáló neuronokban a ferőzést követően. Mivel a mikroglia sejtek már jelen voltak a II. fázisban lévő (GFP+PRV-t együttesen expresszáló) neuronok körül, de nem, vagy csak nagyon kis számban az I. fázisban lévő (csak GFP-t kifejező, frissen fertőzött) neuronok körül in vivo, a mikroglia sejtek toborzása és a barrier kialakulása valószínűleg 4-6 órán belül végbemegy azután, hogy a virális replikáció megindult az adott idegsejtben. Két kurrens tanulmány, melyekben in vivo two photon mikroszkópiát használtak megállapította, hogy a nyugvó mikroglia sejtek nyúlványai meglepő motilitást mutatnak és folyamatosan „ellenőrzik” a mikrokörnyezetüket
243,244
.
Mechanikus vagy traumatikus sérülés esetén ezek a nyúlványok azonnal a sérülés helyére kúsznak és 30-120 percen belül izolálják az érintett neuronokat. Eredményeink szintén megerősítik ezt a gyors mikrogliális aktivációt egy más típusú behatás esetén és bizonyítékkal szolgálnak a gyors, irányított mikrogliális migrációra a fertőzött, de morfológiailag még intakt idegsejtek felé. A gyors mikrogliális válaszreakció mechanikus sérülés vagy virális infekció hatására felveti azt a kérdést, hogy hasonló mechanizmusok játszanak-e szerepet a sejtek toborzásában a két eltérő modell esetén. Ismert, hogy a mikroglális toll-like receptorok (TLR) döntő fontosságúak a HSV fertőzések elleni immunválasz kialakulásához. Különösen a TLR2-n és TLR9-n keresztüli jelátvitelnek van jelentősége a proinflammatorikus citokinek és kemokinek termelődésének kiváltásában
245-248
. A
HSV-vel fertőződött neuronok kifejeznek monocyte chemoattractant protein-1 –et (MCP-1), kemokin receptorokat molekulákat
251
249
, komplement fehérjéket
250
és sejtfelszíni MHC-I
. Így a primer gyulladásos szignálok származhatnak közvetlenül az
érintett neuronoktól, bár a mikroglia aktivációjának, migrációjának és barrier formálásának pontos, celluláris mechanizmusa PRV fertőzés esetén még feltárásra vár. Mikrogliális aktivációt indukálhat különféle intracelluláris proteinek és/vagy nagy 95
energiájú purin nukleotidok (mint az ATP, ADP vagy UTP) kiáramlása a sérült neuronokból
243
, ami metabolikus stressz vagy trauma esetén is bekövetkezik és P2
receptor-mediálta mikrogliális aktivációt eredényez
243,252,253
. Ugyanakkor nem biztos,
hogy a fenti mechanizmusok azok, melyek esetünkben felelőssé tehetők a mikrogliális aktivácó és toborzás indukálásában, mert a mikrogliális barrier kialakulása jóval megelőzi a fertőzött neuronok sejtmembránjának szétesését. Ismert, hogy a centrális PRV fertőzés a mikrogliális aktiváció mellett számos egyéb sejttípus aktivációját és beáramlását is eredményezi. A korábbi irodalmi adatokkal összhangban
172
a BDG-vel fertőzött agyterületeken az
ED1-pozitív mononukleáris fagociták toborzását is megfigyeltük. Az ED1-et kifejező sejtek és a lectin-pozitív barrier formáló sejtek vizsgálata során úgy találtuk, hogy a fertőzés kezdeti stádiumában feltűnő ED1-pozitív elemek vér eredetűek és elkülönülnek azoktól a mikroglia sejtektől melyek a fertőzés későbbi szakaszában fagocitikus aktivitást nyernek és eltakarítják a fertőzött neuronokat. Ismert, hogy az aktiválódott mikroglia képes fagocitvá transzformálódni és ezután alakját, illetve az expresszált markereket tekintve nem elkülöníthető a vérpályából beáramlott makrofágoktól az agy területén
254-257
. A makrofágok toborzása a fertőzött területekre valószínűleg lokális
reakció, mert egyértelmű grádiens volt kimutatható az ED1-pozitív sejtek számát tekintve a lokális vérerektől az érintett neuronok felé haladva az infekció korai, centrális szakaszában. Nincsenek adataink arra, hogy a makrofágok beáramlását a fertőzött neuronokból, vagy az aktivált mikroglia sejtekből származó szignálok indukálták. Ugyanakkor az a tény, hogy 7 napos túlélés esetén az újonnan fertőzött corticalis területeken csak elvétve fordultak elő ED1-pozitív sejtek a barrier formáló lectin-pozitív mikroglia sejtek között azt mutatja, hogy a makrofágok toborzása inkább lokális, mintsem szisztémás hatások eredménye. Ismert, hogy mind fiziológiás, mind patológiás körülmények között, bizonyos hematopoetikus sejtalakok és prekurzor sejtek képesek a felnőtt agy területére lépni, ahol például mikrogliává transzformálódnak
258-260
.
Ugyanakkor nem ismert, hogy ezek a sejtek milyen mértékben járulnak hozzá a centrális vírusfertőzés ellen kialakuló természetes immunválaszhoz. Az általunk végzett ex vivo kísérleteknek kettős célja volt: (I) hogy megkülönböztessük az exogén makrofágokat az aktiválódott rezidens mikrogliától a fertőzött idegsejtek körül és (II) annak vizsgálata, hogy azok a naiv, vér és csontvelő eredetű leukociták (különös tekintettel a monocitákra) melyek a vírus perifériás injektálásakor nem voltak a szervezetben, képesek-e infiltrálódni az agyba válaszul a centrális vírusfertőzésre. 96
Kísérleteink szolgáltatták az első direkt bizonyítékot arra nézve, hogy PRV vírus fertőzés során az ex vivo módon jelölt perifériás eredetű leukociták képesek belépni az agy parenchymájába, migrálni a fertőzött neuronokhoz és közreműködni a gliális barrier kialakításában. A CMTMR-el jelölt vérből preparált sejtek esetén célunk az volt, hogy feltárjuk a perifériás monociták/makrofágok szerepét a centrális vírusfertőzés ellen kialakuló gyulladásos válaszreakcióban. Bár ezzel a módszerrel nem tudtunk minden vér eredetű sejtet megjelölni a fertőzött állatokban, eredményeink igazolták, hogy az infiltrálódott CMTMR-pozitív sejtek az ED1-et kifejező sejtek között tűnnek fel, még ha csak egyharmaduk mutatott is ED1 pozitivitást. Ezért valószínűnek tűnik, hogy a mikroglia a primer barrier-formáló sejt a fertőzött idegsejtek körül és az exogén makrofágok később migrálnak az érintett területre. Az egyik virulens PRV törzs, a PRV-Becker által okozott agyi fertőzés esetén Rassnick és munkatársai beszámoltak CD45-t (közös leukocita antigén), CD8-at és CD4-et kifejező leukociták beáramlásáról a fertőzött területkre 173. Ugyanakkor, az aktivált mikroglia is kifejez CD45-öt, így nem lehet egyértelmű különbséget tenni a beáramló leukociták és a rezidens mikroglia között. Kísérleteink továbbá alátámasztják azokat a megfigyeléseket, hogy csontvelő eredetű sejtek is belépnek a kifejlődött agy területére és többek között makrofág-mikroglia sejtek keletkeznek belőlük, melyek aztán az agyi környezet integráns elemévé válnak 258. Ezen felül igazoltuk, hogy patológiás körülmények között bizonyos csontvelő eredetű sejtek részt vesznek a fertőzött idegsejtek izolálásában és eltakarításában. Bár nem sikerült nagyszámú ex vivo jelölt sejt infitrációját kimutatnunk, megfigyeléseink azt mutatták, hogy a beáramlott leukociták egy része proliferációs aktivitást mutat „in situ”, a fertőzött neuronok közelében, hasonlóan a rezidens mikrogliához. A mikrogliáról ismert, hogy képes belépni a sejtciklusba akut neuronális sérülés esetén in vivo vagy in vitro
263
261,262
,
. HSV fertőzés esetén szintén beszámoltak a CD45-pozitív és szatellita
sejtek számának sejtosztódással történő növekedéséről hátsó gyökér ganglionokban 264. Kutatásaink során azt találtuk, hogy a mikrogliákból-makrofágokból álló barrier körülveszi a fertőzött neuronokat, izolálja a környezettől és az érintett sejtek szétesése után a fagociták felveszik a sejttörmeléket a vírusantigénekkel együtt. A korábbi kutatások legtöbbjével ellentétben melyek során virulensebb törzseket használtak 206,265, mi nem a fertőzött sejtek számának növekedését, hanem ellenkezőleg, jelentős csökkenését figyeltük meg a túlélési idő növekedésével. Ennek eredményeképpen a vírusantigéneket tartalmazó neuronok szinte teljesen eltűntek a legkorábban fertőződött 97
területekről (medulla) a fertőzés késői stádiumában. A fertőzött sejtek eltűnése még kifejezettebb volt a BDG csontvelőbe történő beadása esetén
266
ahol az érintett
neuronok teljes száma is jóval alacsonyabb volt, mint a lépbe történő beadások esetén. A fertőzött sejtek számának kismértékű csökkenését a leghosszabb túlélési idő esetén néhány, más kutatócsoport által véghezvitt pályajelöléses kísérlet során is megfigyelték 267,268
. Ez azt mutatja, hogy enyhe fertőzés esetén a Bartha törzs által fertőzött neuronok
degenerációja is kimutatható, ha számottevő újrafertőződés nem következik be az adott agyterületen. Szemben a korábbi elektronmikroszkópos vizsgálatokkal, melyekben a vírussal fertőzött neuronokat a víruspartikulumok jelenléte alapján (átmérőjük herpeszvírus esetén kb. 150 nm) azonosították, mi immunhisztokémiai módszert alkalmaztunk. Ennek előnye az volt, hogy képesek voltunk meghatározni a fertőzés súlyosságát (és hozzávetőlegesen viszonyítani a GFP+PRV-t együttesen kimutató immunfluoreszcens viszgálatokhoz) a PRV fehérjék mennyisége alapján. Emellett, ezzel a módszerrel megállapítható volt, hogy a vírusantigének felvételre kerülnek a gliasejtek által és nem kerülnek ki az extracelluláris térbe a széteső neuronokból. Sohasem talátunk számottevő PRV immunreaktivitást intakt, fertőzött neuronok körül vagy a gliális barrieren kívül, ami azt mutatja, hogy a mikrogliák migrációja a fertőzött neuronokhoz megelőzi a sejtmembrán dezintegrálódását. Már fénymikroszkópos szinten is látható volt, hogy a vírusantigéneket tartalmazó sejttörmeléket a fagociták felveszik. Az ultrastruktúlális vizsgálatok megmutatták, hogy a PRV immunpozitív fagociták nem fertőződnek, a PRV-pozitív törmelék pedig membránnal körülvett fagoszómákban található. Úgy tűnik, a mononukleáris fagociták rezisztensek a BDG vírus okozta fertőzésre, illetve nem szabadulnak fel belőlük infektív virionok. Ezek az eredmények megerősítik a korábbi vizsgálatok eredményeit a Bartha törzs esetén 126. Összegzésként elmondható, hogy sikerült egy attenuált vírusfertőzés hatására kialakuló gyors gliális válaszreakciót azonosítanunk, amely során az érintett neuronok gyors izolációja és eliminációja miatt a kontakt fertőzés gátolt, aminek hatására az infektív virionok és vírusantigének eltűnnek az agy bizonyos területeiről. Eredményeink felhívják a figyelmet arra, hogy a gyors mikrogliális válasz képes arra, hogy meggátolja a herpeszvírus okozta fertőzés lokális terjedését az agy területén. A központi idegrendszerben végbemenő természetes immunválasz megértése nagy fontossággal bírhat az agyi tumor metasztázisok attenuált herpeszvírusokkal történő kezelésében 271
269-
. Másrészt, a csontvelő eredetű sejtek sérült agyterületekre történő infiltrációjának 98
megértése informatív lehet a központi idegrendszer megbetegedéseinek non-invazív, genetikailag módosított hematopoetikus sejtekkel történő terápiás kezelében is 272. Meg kell ugyanakkor állapítani, hogy az elmúlt évek kutatási eredményeit tekintve a központi idegrendszeri gyulladásos folyamatok (különös tekintettel a vírusfertőzés okozta elváltozásokra) kiváltói és következményei sokszor nehezen elválaszthatók és szerepük (előny a patogének elleni védekezésben vagy káros az agyi parenchyma intergitására)
rendkívül
ellentmondásos,
ennél
fogva
állandó
vita
tárgya.
Megállapították például, hogy a gyulladásos folyamatok során aktiválódó ciklooxigenáz 1 és 2 enzimek (melyek a természetes védekező rendszer ismert elemei) szükségesek az infektív pseudorabies vírus keletkezéséhez
273
. Egy új tanulmány szerint pedig
szenzoros neuronok PRV fertőzése során a vírusfertőzés hatására új varikozitások keletkeznek, melyek mentén megvalósulhat a vírus kilépése és a gliális elemek fertőződése
274
. Ezek az adatok azt mutatják, hogy a vírusok és emlősök hosszú
koevolúciója során végbement versengés bonyolult összefüggéseket eredményezett a parazita és a védekező szervezet életműködésében. Emiatt még sok vizsgálatot kell elvégezni ahhoz, hogy képesek legyünk teljes biztonsággal alkalmazni a természetes immunrendszer elemeit a vírusok vagy más ágensek okozta idegrendszeri elváltozások kezelését célzó, terápiás megközelítések során.
99
7. Következtetések
1. Az attenuált, izogén pseudorabies vírus törzsek (BDG és BDL) alkalmasak transszinaptikus pályajelöléses kísérletekre és az így kapott eredmények alapján megismerhetjük a célszervet innerváló központi idegrendszeri autonóm neuronok lokalizációját. A vírusok terjedésének specificitásáért jelentős részben a mikroglia felelős, ami a fertőzött idegsejtek korai izolálásával és a degenerálódott sejtek eltakarításával lehetővé teszi a virális fertőzés lokális terjedésének gátlását. A rendkívül gyors mikrogliális aktiváció, toborzás és gyulladásos effektor működés mechanizmusainak mélyebb megismerése számos, központi idegrendszert érintő elváltozás kezelésében szolgálhat jelentős információkkal a jövőben. 2. A transsszinaptikus virális pályajelöléssel feltérképezett, csontvelőt innerváló autonóm neuronok lokalizációja információkkal szolgál arra nézve, hogy központi
idegrendszer
mely
területei
vehetnek
részt
a
hematopoezis
szabályozásában. Ez a centrális neuronhálózat konrollálja a csontvelői progenitor,
prekurzor
és
érett
sejtalakok
proliferációját,
maturációját,
aktivációját és elválasztását a szisztémás keringésbe.
3. Az epididimális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet beidegzését nagyrészt elkülönült idegsejt populációk végzik a központi idegrendszer
területén,
melyek
többsége
ugyanakkor
az
agy
azonos
magcsoportjaiban található. Ezen eredményeink hozzájárulnak a termoreguláció, metabolikus szabályozás és a táplálékfelvétel szabályozásában résztvevő neuronhálózat működésének megértéséhez.
100
8. Összefoglalás Az α-herpeszvírus családba tartozó neurotróp pseudorabies vírus (PRV) a rágcsálók környéki és központi idegrendszerében transzneuronálisan terjed, ami alkalmassá teszi egymással
szinaptikus
összeköttetésben
lévő
neuronhálózatok
pályajelöléses
kimutatására. Perifériás beadása esetén a vírust a lokális idegvégződések veszik fel és replikációt követően a víruspartikulumok a szinaptikusan kapcsolt idegsejteken keresztül elérik a központi idegrendszert. Kísérleteink során attenuált, rekombináns PRV törzseket használtunk transszinaptikus pályajelölésre. A Ba-DupGreen (BDG) zöld fluoreszcens fehérjét (GFP), a Ba-DupLac (BDL) β-galaktozidázt (β-gal) fejez ki, ami lehetővé teszi a fertőzött sejtek azonosítását és a két rekombináns vírustörzs elkülönítését. Kísérleteink három témakört öleltek fel: (1) Elsőként azonosítottuk a csontvelő
autonóm
beidegzésében
szerepet
játszó
közponi
idegrendszeri
neuronhálózatot. A femorális csontvelőbe BDG-t injektáltunk és vírussal fertőzött neuronokat azonosítottunk a szimpatikus határlánc ganglionokban, valamint számos, autonóm szabályozásban szerepet játszó magban a gerincvelő és az agy területén. Kettős vírusbeadással és kontroll kísérletekkel igazoltuk, hogy a retrográd pályajelöléssel feltárt neuronpopuláció megfelel a csontvelőt beidegző centrális autonóm sejteknek. (2) Kettős vírusbeadással megvizsgáltuk az epididymális fehér zsírszövet és az interscapularis barna zsírszövet beidegzésében szerepet játszó központi-idegrendszeri struktúrákat. Eredményeink azt mutatják, hogy nagyrészt megegyező agyterületek vesznek részt mindkét szerv innervációjában, de a gerincvelő, agytörzs és hypothalamus néhány területén a két zsírszövet típust beidegző neuronpopulációk egymástól elkülöníthetők. (3) Kísérleteinkben elemeztük a pseudorabies vírus fertőzés hatására kialakuló gyulladásos folyamatokat a központi idegrendszerben. Az attenuált BDG vírus által „immediate early” kinetikával kifejezett GFP riporter fehérje és a virális strukturális fehérjék együttes kimutatása lehetővé tette a fertőzés különböző stádiumainak cellularis szinten történő elkülönítését összefüggésben a végbemenő lokális gyulladásos válaszreakcióval. A fertőzött idegsejteket a gyorsan aktiválódó mikroglia sejtek a fertőzés korai stádiumában izolálják a környezetüktől és a perifériáról infiltrálódó leukociták közreműködésével meggátolják a kontakt neuronális fertőzés kialakulását. Az általunk vizsgált folyamatok fontos információval szolgálhatnak a centrális vírusfertőzések ellen kialakuló immunválasz mélyebb megértéséhez.
101
9. Summary Pseudorabies virus (PRV), member of the α-herpesvirus family, is capable to transneuronal spread in the rodent peripheral and central nervous system and become suitable tool for tract-tracing experiments to reveal synaptically linked neuronal circuits. After peripheral administration, the virus is taken up by the local nerve terminals and following replication, viral particles reach the central nervous system through synaptically linked neurons. We have used attenuated PRV strains for transsynaptic tract-tracing. Ba-DupGreen (BDG), expressing green fluorescent protein (GFP) and BaDupLac (BDL) that expresses β-galactosidase allowed us to identify the infected cells and discriminate the two recombinant virus strains. Using these virus constructs three different topics have been investigated: (1) Neuronal circuits in the central nervous system, which are involved in the autonomic innervation of the bone marrow have been identified. Following injection of BDG into the femoral bone marrow, virus infected neurons were revealed in the sympathetic ganglia and in several autonomic-related nuclei of the spinal chord as well as in various brain sites. Dual viral tracing and control experiments confirmed that the retrogradely labeled neuronal population is identical to the central autonomic cells, which innervate the bone marrow. (2) We used dual viral tracing to reveal the central autonomic neurons that are involved in the innervation of the epididymal white- and the interscapular brown adipose tissues. Our results indicate that the majority of the retrogradely labeled brain areas innervate both fat depots, but in some nuclei of the spinal cord, brain stem and hypothalamus, the innervation pattern of the two different adipose tissues is different. (3) We have investigated the inflammatory processes seen during central PRV infection. Simultaneous visualization of the immediate early expressed viral reporter protein GFP and the viral structural proteins allowed us to identify different stages of virus infection in correlation with the ongoing local inflammatory response. Microglia become rapidly activated upon virus infection, isolated infected neurons and, together with exogenous infiltrating leukocytes, prevented contact neuronal infection in the compromised brain regions. Our results contribute to understanding innate immune mechanisms during herpes virus infections in the central nervous system.
102
10. Irodalomjegyzék
1. 2. 3. 4. 5.
6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16.
Elenkov, I.J., Wilder, R.L., Chrousos, G.P. & Vizi, E.S. The sympathetic nerve-an integrative interface between two supersystems: the brain and the immune system. Pharmacol Rev 52, 595-638 (2000). Furness, J.B. & Costa, M. Types of nerves in the enteric nervous system. Neuroscience 5, 1-20 (1980). Vizi, E.S. & Labos, E. Non-synaptic interactions at presynaptic level. Prog Neurobiol 37, 145-63 (1991). Saper, C.B. The central autonomic nervous system: conscious visceral perception and autonomic pattern generation. Annu Rev Neurosci 25, 433-69 (2002). Altschuler, S.M., Bao, X.M., Bieger, D., Hopkins, D.A. & Miselis, R.R. Viscerotopic representation of the upper alimentary tract in the rat: sensory ganglia and nuclei of the solitary and spinal trigeminal tracts. J Comp Neurol 283, 248-68 (1989). Contreras, R.J., Beckstead, R.M. & Norgren, R. The central projections of the trigeminal, facial, glossopharyngeal and vagus nerves: an autoradiographic study in the rat. J Auton Nerv Syst 6, 303-22 (1982). Ricardo, J.A. & Koh, E.T. Anatomical evidence of direct projections from the nucleus of the solitary tract to the hypothalamus, amygdala, and other forebrain structures in the rat. Brain Res 153, 1-26 (1978). Fulwiler, C.E. & Saper, C.B. Subnuclear organization of the efferent connections of the parabrachial nucleus in the rat. Brain Res 319, 229-59 (1984). Chamberlin, N.L. & Saper, C.B. Topographic organization of respiratory responses to glutamate microstimulation of the parabrachial nucleus in the rat. J Neurosci 14, 6500-10 (1994). Bester, H., Besson, J.M. & Bernard, J.F. Organization of efferent projections from the parabrachial area to the hypothalamus: a Phaseolus vulgarisleucoagglutinin study in the rat. J Comp Neurol 383, 245-81 (1997). Moga, M.M. et al. Organization of cortical, basal forebrain, and hypothalamic afferents to the parabrachial nucleus in the rat. J Comp Neurol 295, 624-61 (1990). Herbert, H., Moga, M.M. & Saper, C.B. Connections of the parabrachial nucleus with the nucleus of the solitary tract and the medullary reticular formation in the rat. J Comp Neurol 293, 540-80 (1990). Pacak, K. & Palkovits, M. Stressor specificity of central neuroendocrine responses: implications for stress-related disorders. Endocr Rev 22, 502-48 (2001). Miselis, R.R. The efferent projections of the subfornical organ of the rat: a circumventricular organ within a neural network subserving water balance. Brain Res 230, 1-23 (1981). Shan, J., Stachniak, T., Jhamandas, J.H. & Krukoff, T.L. Autonomic and neuroendocrine actions of adrenomedullin in the brain: mechanisms for homeostasis. Regul Pept 112, 33-40 (2003). Shan, J. & Krukoff, T.L. Area postrema ablation attenuates activation of neurones in the paraventricular nucleus in response to systemic adrenomedullin. J Neuroendocrinol 12, 802-10 (2000). 103
17. 18. 19. 20.
21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32.
33. 34.
Ammons, W.S. Bowditch Lecture. Renal afferent inputs to ascending spinal pathways. Am J Physiol 262, R165-76 (1992). Adelson, D.W., Wei, J.Y. & Kruger, L. Warm-sensitive afferent splanchnic Cfiber units in vitro. J Neurophysiol 77, 2989-3002 (1997). Knuepfer, M.M. & Schramm, L.P. Properties of renobulbar afferent fibers in rats. Am J Physiol 248, R113-9 (1985). Kuo, D.C., Nadelhaft, I., Hisamitsu, T. & de Groat, W.C. Segmental distribution and central projections of renal afferent fibers in the cat studied by transganglionic transport of horseradish peroxidase. J Comp Neurol 216, 162-74 (1983). Roppolo, J.R., Nadelhaft, I. & de Groat, W.C. The organization of pudendal motoneurons and primary afferent projections in the spinal cord of the rhesus monkey revealed by horseradish peroxidase. J Comp Neurol 234, 475-88 (1985). Sugiura, Y., Terui, N. & Hosoya, Y. Difference in distribution of central terminals between visceral and somatic unmyelinated (C) primary afferent fibers. J Neurophysiol 62, 834-40 (1989). Sugiura, Y. et al. Quantitative analysis of central terminal projections of visceral and somatic unmyelinated (C) primary afferent fibers in the guinea pig. J Comp Neurol 332, 315-25 (1993). Mehler, W.R., Feferman, M.E. & Nauta, W.J. Ascending axon degeneration following anterolateral cordotomy. An experimental study in the monkey. Brain 83, 718-50 (1960). Saper, C.B. Pain as a visceral sensation. Prog Brain Res 122, 237-43 (2000). Hylden, J.L., Anton, F. & Nahin, R.L. Spinal lamina I projection neurons in the rat: collateral innervation of parabrachial area and thalamus. Neuroscience 28, 27-37 (1989). Cechetto, D.F., Standaert, D.G. & Saper, C.B. Spinal and trigeminal dorsal horn projections to the parabrachial nucleus in the rat. J Comp Neurol 240, 153-60 (1985). Feil, K. & Herbert, H. Topographic organization of spinal and trigeminal somatosensory pathways to the rat parabrachial and Kolliker-Fuse nuclei. J Comp Neurol 353, 506-28 (1995). Cunningham, E.T., Jr. & Sawchenko, P.E. Anatomical specificity of noradrenergic inputs to the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat hypothalamus. J Comp Neurol 274, 60-76 (1988). Palkovits, M. et al. Noradrenergic innervation of the rat hypothalamus:experimental biochemical and electron microscopic studies. Brain Res 191, 161-71 (1980). Sawchenko, P.E. & Swanson, L.W. The organization of noradrenergic pathways from the brainstem to the paraventricular and supraoptic nuclei in the rat. Brain Res 257, 275-325 (1982). Brownstein MJ, Palkovits M. Catecholamines, serotonin, acetylcholine, and γ-aminobutyric acid in the rat brain: biochemical studies. in Handbook of chemical neuroanatomy, Vol. 2 (eds. Bjorklund A & Hökfelt T.) 23–54 (Elsevier, New York, 1984). Critchley, H.D. Neural mechanisms of autonomic, affective, and cognitive integration. J Comp Neurol 493, 154-66 (2005). Critchley, H.D., Melmed, R.N., Featherstone, E., Mathias, C.J. & Dolan, R.J. Volitional control of autonomic arousal: a functional magnetic resonance study. Neuroimage 16, 909-19 (2002).
104
35. 36. 37. 38. 39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52.
Chiba, T., Kayahara, T. & Nakano, K. Efferent projections of infralimbic and prelimbic areas of the medial prefrontal cortex in the Japanese monkey, Macaca fuscata. Brain Res 888, 83-101 (2001). Herman, J.P. & Cullinan, W.E. Neurocircuitry of stress: central control of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis. Trends Neurosci 20, 78-84 (1997). Dong, H.W., Petrovich, G.D., Watts, A.G. & Swanson, L.W. Basic organization of projections from the oval and fusiform nuclei of the bed nuclei of the stria terminalis in adult rat brain. J Comp Neurol 436, 430-55 (2001). Canteras, N.S., Simerly, R.B. & Swanson, L.W. Organization of projections from the medial nucleus of the amygdala: a PHAL study in the rat. J Comp Neurol 360, 213-45 (1995). Cullinan, W.E., Herman, J.P. & Watson, S.J. Ventral subicular interaction with the hypothalamic paraventricular nucleus: evidence for a relay in the bed nucleus of the stria terminalis. J Comp Neurol 332, 1-20 (1993). Sawchenko, P.E. & Swanson, L.W. The organization of forebrain afferents to the paraventricular and supraoptic nuclei of the rat. J Comp Neurol 218, 121-44 (1983). Hosoya, Y., Sugiura, Y., Ito, R. & Kohno, K. Descending projections from the hypothalamic paraventricular nucleus to the A5 area, including the superior salivatory nucleus, in the rat. Exp Brain Res 82, 513-8 (1990). Palkovits, M. Interconnections between the neuroendocrine hypothalamus and the central autonomic system. Geoffrey Harris Memorial Lecture, Kitakyushu, Japan, October 1998. Front Neuroendocrinol 20, 270-95 (1999). Cechetto, D.F. & Saper, C.B. Neurochemical organization of the hypothalamic projection to the spinal cord in the rat. J Comp Neurol 272, 579-604 (1988). Moga, M.M., Saper, C.B. & Gray, T.S. Neuropeptide organization of the hypothalamic projection to the parabrachial nucleus in the rat. J Comp Neurol 295, 662-82 (1990). Sim, L.J. & Joseph, S.A. Arcuate nucleus projections to brainstem regions which modulate nociception. J Chem Neuroanat 4, 97-109 (1991). Swanson, L.W. & Sawchenko, P.E. Paraventricular nucleus: a site for the integration of neuroendocrine and autonomic mechanisms. Neuroendocrinology 31, 410-7 (1980). Swanson, L.W., Sawchenko, P.E., Wiegand, S.J. & Price, J.L. Separate neurons in the paraventricular nucleus project to the median eminence and to the medulla or spinal cord. Brain Res 198, 190-5 (1980). ter Horst, G.J. & Luiten, P.G. The projections of the dorsomedial hypothalamic nucleus in the rat. Brain Res Bull 16, 231-48 (1986). Swanson, L.W. & Kuypers, H.G. A direct projection from the ventromedial nucleus and retrochiasmatic area of the hypothalamus to the medulla and spinal cord of the rat. Neurosci Lett 17, 307-12 (1980). Takada, M., Li, Z.K. & Hattori, T. A direct projection from the tuberomammillary nucleus to the spinal cord in the rat. Neurosci Lett 79, 257-62 (1987). Loughlin, S.E., Foote, S.L. & Grzanna, R. Efferent projections of nucleus locus coeruleus: morphologic subpopulations have different efferent targets. Neuroscience 18, 307-19 (1986). Satoh, K., Tohyama, M., Yamamoto, K., Sakumoto, T. & Shimizu, N. Noradrenaline innervation of the spinal cord studied by the horseradish
105
53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70.
peroxidase method combined with monoamine oxidase staining. Exp Brain Res 30, 175-86 (1977). Westlund, K.N., Bowker, R.M., Ziegler, M.G. & Coulter, J.D. Noradrenergic projections to the spinal cord of the rat. Brain Res 263, 15-31 (1983). Loewy, A.D., McKellar, S. & Saper, C.B. Direct projections from the A5 catecholamine cell group to the intermediolateral cell column. Brain Res 174, 309-14 (1979). Byrum, C.E. & Guyenet, P.G. Afferent and efferent connections of the A5 noradrenergic cell group in the rat. J Comp Neurol 261, 529-42 (1987). Ross, C.A. et al. Adrenaline neurons in the rostral ventrolateral medulla innervate thoracic spinal cord: a combined immunocytochemical and retrograde transport demonstration. Neurosci Lett 25, 257-62 (1981). Tucker, D.C., Saper, C.B., Ruggiero, D.A. & Reis, D.J. Organization of central adrenergic pathways: I. Relationships of ventrolateral medullary projections to the hypothalamus and spinal cord. J Comp Neurol 259, 591-603 (1987). Nestler, E.J., Alreja, M. & Aghajanian, G.K. Molecular control of locus coeruleus neurotransmission. Biol Psychiatry 46, 1131-9 (1999). Morrison, S.F., Milner, T.A. & Reis, D.J. Reticulospinal vasomotor neurons of the rat rostral ventrolateral medulla: relationship to sympathetic nerve activity and the C1 adrenergic cell group. J Neurosci 8, 1286-301 (1988). Guyenet, P.G., Haselton, J.R. & Sun, M.K. Sympathoexcitatory neurons of the rostroventrolateral medulla and the origin of the sympathetic vasomotor tone. Prog Brain Res 81, 105-16 (1989). Schreihofer, A.M., Stornetta, R.L. & Guyenet, P.G. Regulation of sympathetic tone and arterial pressure by rostral ventrolateral medulla after depletion of C1 cells in rat. J Physiol 529 Pt 1, 221-36 (2000). W, T. Zur Kenntnis der Nerven der Lymphdru¨ sen. Anat Anz 16, 456– 0459 (1899). Madden, K.S., Sanders, V.M. & Felten, D.L. Catecholamine influences and sympathetic neural modulation of immune responsiveness. Annu Rev Pharmacol Toxicol 35, 417-48 (1995). Dahlstrom, A., Mya-Tu, M., Fuxe, K. & Zetterstrom, B.E. Observations on adrenergic innervation of dog heart. Am J Physiol 209, 689-92 (1965). Reilly, F.D., McCuskey, R.S. & Meineke, H.A. Studies of the hemopoietic microenvironment. VIII. Andrenergic and cholinergic innervation of the murine spleen. Anat Rec 185, 109-17 (1976). Williams, J.M. et al. Sympathetic innervation of murine thymus and spleen: evidence for a functional link between the nervous and immune systems. Brain Res Bull 6, 83-94 (1981). Kendall, M.D., al-Shawaf, A. & Zaidi, S.A. The cholinergic and adrenergic innervation of the rat thymus. Adv Exp Med Biol 237, 255-61 (1988). Felten, D.L., Felten, S.Y., Carlson, S.L., Olschowka, J.A. & Livnat, S. Noradrenergic and peptidergic innervation of lymphoid tissue. J Immunol 135, 755s-765s (1985). Kendall, M.D. & al-Shawaf, A.A. Innervation of the rat thymus gland. Brain Behav Immun 5, 9-28 (1991). Kranz, A., Kendall, M.D. & von Gaudecker, B. Studies on rat and human thymus to demonstrate immunoreactivity of calcitonin gene-related peptide, tyrosine hydroxylase and neuropeptide Y. J Anat 191 ( Pt 3), 441-50 (1997).
106
71.
72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87. 88. 89. 90.
Vizi, E.S., Orso, E., Osipenko, O.N., Hasko, G. & Elenkov, I.J. Neurochemical, electrophysiological and immunocytochemical evidence for a noradrenergic link between the sympathetic nervous system and thymocytes. Neuroscience 68, 1263-76 (1995). Novotny, G.E., Sommerfeld, H. & Zirbes, T. Thymic innervation in the rat: a light and electron microscopical study. J Comp Neurol 302, 552-61 (1990). Novotny, G.E. & Kliche, K.O. Innervation of lymph nodes: a combined silver impregnation and electron-microscopic study. Acta Anat (Basel) 127, 243-8 (1986). Felten, D.L. et al. Sympathetic innervation of lymph nodes in mice. Brain Res Bull 13, 693-9 (1984). Yamashita, T. et al. Autonomic nervous system in human palatine tonsil. Acta Otolaryngol Suppl 416, 63-71 (1984). Dhabhar, F.S., Miller, A.H., McEwen, B.S. & Spencer, R.L. Effects of stress on immune cell distribution. Dynamics and hormonal mechanisms. J Immunol 154, 5511-27 (1995). McEwen, B.S. The neurobiology of stress: from serendipity to clinical relevance. Brain Res 886, 172-189 (2000). Mayani, H., Guilbert, L.J. & Janowska-Wieczorek, A. Biology of the hemopoietic microenvironment. Eur J Haematol 49, 225-33 (1992). Bianco, P., Riminucci, M., Gronthos, S. & Robey, P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications. Stem Cells 19, 180-92 (2001). Mach, D.B. et al. Origins of skeletal pain: sensory and sympathetic innervation of the mouse femur. Neuroscience 113, 155-66 (2002). Tabarowski, Z., Gibson-Berry, K. & Felten, S.Y. Noradrenergic and peptidergic innervation of the mouse femur bone marrow. Acta Histochem 98, 453-7 (1996). Calvo, W. The innervation of the bone marrow in laboratory animals. Am J Anat 123, 315-28 (1968). Liebl, B. et al. Quantitation of mRNA for the beta-adrenoceptor gene in human mononuclear leucocytes by in situ hybridization with fluorochrome labeled cloned DNA. J Recept Res 11, 473-82 (1991). McGillis, J.P., Humphreys, S. & Reid, S. Characterization of functional calcitonin gene-related peptide receptors on rat lymphocytes. J Immunol 147, 3482-9 (1991). Santambrogio, L., Lipartiti, M., Bruni, A. & Dal Toso, R. Dopamine receptors on human T- and B-lymphocytes. J Neuroimmunol 45, 113-9 (1993). Petitto, J.M., Huang, Z. & McCarthy, D.B. Molecular cloning of NPY-Y1 receptor cDNA from rat splenic lymphocytes: evidence of low levels of mRNA expression and [125I]NPY binding sites. J Neuroimmunol 54, 81-6 (1994). Miller, M.L. & McCuskey, R.S. Innervation of bone marrow in the rabbit. Scand J Haematol 10, 17-23 (1973). Felten, S.Y. et al. Noradrenergic sympathetic innervation of lymphoid organs. Prog Allergy 43, 14-36 (1988). Klein, R.L., Wilson, S.P., Dzielak, D.J., Yang, W.H. & Viveros, O.H. Opioid peptides and noradrenaline co-exist in large dense-cored vesicles from sympathetic nerve. Neuroscience 7, 2255-61 (1982). Felten, S.Y. & Olschowka, J. Noradrenergic sympathetic innervation of the spleen: II. Tyrosine hydroxylase (TH)-positive nerve terminals form synapticlike
107
91.
92. 93. 94. 95. 96. 97. 98. 99. 100. 101. 102. 103. 104. 105. 106. 107. 108. 109.
contacts on lymphocytes in the splenic white pulp. J Neurosci Res 18, 37-48 (1987). Liu, Y. et al. Splenic denervation suppresses mRNA gene expression and protein production of IL-1beta and IL-6 by peritoneal macrophages in both Trypanosoma brucei brucei-infected and non-infected rats. Neuroimmunomodulation 11, 113-8 (2004). Leech, E.N.A. Biochemistry for the Medical Sciences., (John Wiley, Chichester, West Sussex, 1983). Bamshad, M., Song, C.K. & Bartness, T.J. CNS origins of the sympathetic nervous system outflow to brown adipose tissue. Am J Physiol 276, R1569-78 (1999). Stock, M.J. & Rothwell, N.J. Factors influencing brown fat and the capacity for diet-induced thermogenesis. Int J Obes 9 Suppl 2, 9-15 (1985). Rothwell, N.J. & Stock, M.J. Biological distribution and significance of brown adipose tissue. Comp Biochem Physiol A 82, 745-51 (1985). Hillarp, N.A. & Hokfelt, B. Evidence of adrenaline and noradrenaline in separate adrenal medullary cells. Acta Physiol Scand 30, 55-68 (1953). Edwards, S.L., Anderson, C.R., Southwell, B.R. & McAllen, R.M. Distinct preganglionic neurons innervate noradrenaline and adrenaline cells in the cat adrenal medulla. Neuroscience 70, 825-32 (1996). Wirsen, C. Adrenergic Innervation of Adipose Tissue Examined by Fluorescence Microscopy. Nature 202, 913 (1964). Daniel, H. & Derry, D.M. Criteria for differentiation of brown and white fat in the rat. Can J Physiol Pharmacol 47, 941-5 (1969). Diculescu, I. & Stoica, M. Fluorescence histochemical investigation on the adrenergic innervation of the white adipose tissue in the rat. J Neurovisc Relat 32, 25-36 (1970). Ballard, K., Malmfors, T. & Rosell, S. Adrenergic innervation and vascular patterns in canine adipose tissue. Microvasc Res 8, 164-71 (1974). Slavin, B.G. & Ballard, K.W. Morphological studies on the adrenergic innervation of white adipose tissue. Anat Rec 191, 377-89 (1978). Youngstrom, T.G. & Bartness, T.J. Catecholaminergic innervation of white adipose tissue in Siberian hamsters. Am J Physiol 268, R744-51 (1995). Demas, G.E. & Bartness, T.J. Novel method for localized, functional sympathetic nervous system denervation of peripheral tissue using guanethidine. J Neurosci Methods 112, 21-8 (2001). Shi, H., Song, C.K., Giordano, A., Cinti, S. & Bartness, T.J. Sensory or sympathetic white adipose tissue denervation differentially affects depot growth and cellularity. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 288, R1028-37 (2005). Foster, D.O., Depocas, F. & Zuker, M. Heterogeneity of the sympathetic innervation of rat interscapular brown adipose tissue via intercostal nerves. Can J Physiol Pharmacol 60, 747-54 (1982). Thureson-Klein, A., Lagercrantz, H. & Barnard, T. Chemical sympathectomy of interscapular brown adipose tissue. Acta Physiol Scand 98, 8-18 (1976). Ashwell, M. & Dunnett, S.B. Fluorescent histochemical demonstration of catecholamines in brown adipose tissue from obese (ob/ob) and lean mice acclimated at different temperatures. J Auton Nerv Syst 14, 377-86 (1985). Giordano, A., Frontini, A., Castellucci, M. & Cinti, S. Presence and distribution of cholinergic nerves in rat mediastinal brown adipose tissue. J Histochem Cytochem 52, 923-30 (2004).
108
110. 111. 112.
113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121. 122. 123.
124.
125. 126.
Nauta, W.J. & Gygax, P.A. Silver impregnation of degenerating axons in the central nervous system: a modified technic. Stain Technol 29, 91-3 (1954). Kobbert, C. et al. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog Neurobiol 62, 327-51 (2000). Gerfen, C.R. & Sawchenko, P.E. An anterograde neuroanatomical tracing method that shows the detailed morphology of neurons, their axons and terminals: immunohistochemical localization of an axonally transported plant lectin, Phaseolus vulgaris leucoagglutinin (PHA-L). Brain Res 290, 219-38 (1984). Glover, J.C., Petursdottir, G. & Jansen, J.K. Fluorescent dextran-amines used as axonal tracers in the nervous system of the chicken embryo. J Neurosci Methods 18, 243-54 (1986). Thanos, S. & Bonhoeffer, F. Investigations on the development and topographic order of retinotectal axons: anterograde and retrograde staining of axons and perikarya with rhodamine in vivo. J Comp Neurol 219, 420-30 (1983). Rinaman, L., Card, J.P., Schwaber, J.S. & Miselis, R.R. Ultrastructural demonstration of a gastric monosynaptic vagal circuit in the nucleus of the solitary tract in rat. J Neurosci 9, 1985-96 (1989). Rinaman, L. & Miselis, R.R. The organization of vagal innervation of rat pancreas using cholera toxin-horseradish peroxidase conjugate. J Auton Nerv Syst 21, 109-25 (1987). Rinaman, L. & Schwartz, G. Anterograde transneuronal viral tracing of central viscerosensory pathways in rats. J Neurosci 24, 2782-6 (2004). Strack, A.M. & Loewy, A.D. Pseudorabies virus: a highly specific transneuronal cell body marker in the sympathetic nervous system. J Neurosci 10, 2139-47 (1990). Graf, W., Gerrits, N., Yatim-Dhiba, N. & Ugolini, G. Mapping the oculomotor system: the power of transneuronal labelling with rabies virus. Eur J Neurosci 15, 1557-62 (2002). Aujeszky. A contagious dosease, not readily distinguishable from rabies, with unknown origin (in Hungarian). Veterinarius 25, 387-396 (1902). Hayashi, S., Ogawa, S., Takashima, Y. & Otsuka, H. The neutralization of pseudorabies virus by anti-alpha-galactocyl natural antibody in normal serum. Virus Res 99, 1-7 (2004). Boldogkoi, Z. et al. Novel tracing paradigms--genetically engineered herpesviruses as tools for mapping functional circuits within the CNS: present status and future prospects. Prog Neurobiol 72, 417-45 (2004). Menotti, L. et al. The murine homolog of human Nectin1delta serves as a species nonspecific mediator for entry of human and animal alpha herpesviruses in a pathway independent of a detectable binding to gD. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 4867-72 (2000). Struyf, F., Martinez, W.M. & Spear, P.G. Mutations in the N-terminal domains of nectin-1 and nectin-2 reveal differences in requirements for entry of various alphaherpesviruses and for nectin-nectin interactions. J Virol 76, 12940-50 (2002). Fink, D.J., DeLuca, N.A., Goins, W.F. & Glorioso, J.C. Gene transfer to neurons using herpes simplex virus-based vectors. Annu Rev Neurosci 19, 265-87 (1996). Card, J.P. et al. Pseudorabies virus infection of the rat central nervous system: ultrastructural characterization of viral replication, transport, and pathogenesis. J Neurosci 13, 2515-39 (1993).
109
127. 128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138.
139. 140. 141. 142. 143.
Chen, S., Yang, M., Miselis, R.R. & Aston-Jones, G. Characterization of transsynaptic tracing with central application of pseudorabies virus. Brain Res 838, 171-83 (1999). Penfold, M.E., Armati, P. & Cunningham, A.L. Axonal transport of herpes simplex virions to epidermal cells: evidence for a specialized mode of virus transport and assembly. Proc Natl Acad Sci U S A 91, 6529-33 (1994). Enquist, L.W., Tomishima, M.J., Gross, S. & Smith, G.A. Directional spread of an alpha-herpesvirus in the nervous system. Vet Microbiol 86, 5-16 (2002). Smith, G.A., Gross, S.P. & Enquist, L.W. Herpesviruses use bidirectional fastaxonal transport to spread in sensory neurons. Proc Natl Acad Sci U S A 98, 3466-70 (2001). Husak, P.J., Kuo, T. & Enquist, L.W. Pseudorabies virus membrane proteins gI and gE facilitate anterograde spread of infection in projection-specific neurons in the rat. J Virol 74, 10975-83 (2000). Loewy, A.D. Viruses as transneuronal tracers for defining neural circuits. Neurosci Biobehav Rev 22, 679-84 (1998). Enquist, L.W. & Card, J.P. Recent advances in the use of neurotropic viruses for circuit analysis. Curr Opin Neurobiol 13, 603-6 (2003). Strack, A.M., Sawyer, W.B., Hughes, J.H., Platt, K.B. & Loewy, A.D. A general pattern of CNS innervation of the sympathetic outflow demonstrated by transneuronal pseudorabies viral infections. Brain Res 491, 156-62 (1989). Strack, A.M., Sawyer, W.B., Platt, K.B. & Loewy, A.D. CNS cell groups regulating the sympathetic outflow to adrenal gland as revealed by transneuronal cell body labeling with pseudorabies virus. Brain Res 491, 274-96 (1989). Aston-Jones, G. & Card, J.P. Use of pseudorabies virus to delineate multisynaptic circuits in brain: opportunities and limitations. J Neurosci Methods 103, 51-61 (2000). Card, J.P., Enquist, L.W. & Moore, R.Y. Neuroinvasiveness of pseudorabies virus injected intracerebrally is dependent on viral concentration and terminal field density. J Comp Neurol 407, 438-52 (1999). Jansen, A.S., Ter Horst, G.J., Mettenleiter, T.C. & Loewy, A.D. CNS cell groups projecting to the submandibular parasympathetic preganglionic neurons in the rat: a retrograde transneuronal viral cell body labeling study. Brain Res 572, 253-60 (1992). Jansen, A.S., Hoffman, J.L. & Loewy, A.D. CNS sites involved in sympathetic and parasympathetic control of the pancreas: a viral tracing study. Brain Res 766, 29-38 (1997). Orr, R. & Marson, L. Identification of CNS neurons innervating the rat prostate: a transneuronal tracing study using pseudorabies virus. J Auton Nerv Syst 72, 415 (1998). Huang, J. & Weiss, M.L. Characterization of the central cell groups regulating the kidney in the rat. Brain Res 845, 77-91 (1999). Vizzard, M.A., Brisson, M. & de Groat, W.C. Transneuronal labeling of neurons in the adult rat central nervous system following inoculation of pseudorabies virus into the colon. Cell Tissue Res 299, 9-26 (2000). Standish, A., Enquist, L.W., Escardo, J.A. & Schwaber, J.S. Central neuronal circuit innervating the rat heart defined by transneuronal transport of pseudorabies virus. J Neurosci 15, 1998-2012 (1995).
110
144. 145. 146. 147. 148. 149. 150. 151. 152.
153. 154.
155. 156.
157. 158. 159.
Bamshad, M., Aoki, V.T., Adkison, M.G., Warren, W.S. & Bartness, T.J. Central nervous system origins of the sympathetic nervous system outflow to white adipose tissue. Am J Physiol 275, R291-9 (1998). Cano, G., Sved, A.F., Rinaman, L., Rabin, B.S. & Card, J.P. Characterization of the central nervous system innervation of the rat spleen using viral transneuronal tracing. J Comp Neurol 439, 1-18 (2001). Card J.P., E.L.W. Use of pseudorabies virus for definition of synaptically linked populations of neurons. in Methods in Molecular Genetics (ed. Adolph, K.W.) 363-382 (Academic Press, New York, 1994). Jansen, A.S., Farwell, D.G. & Loewy, A.D. Specificity of pseudorabies virus as a retrograde marker of sympathetic preganglionic neurons: implications for transneuronal labeling studies. Brain Res 617, 103-12 (1993). Rinaman, L., Levitt, P. & Card, J.P. Progressive postnatal assembly of limbicautonomic circuits revealed by central transneuronal transport of pseudorabies virus. J Neurosci 20, 2731-41 (2000). Card, J.P., Levitt, P., Gluhovsky, M. & Rinaman, L. Early experience modifies the postnatal assembly of autonomic emotional motor circuits in rats. J Neurosci 25, 9102-11 (2005). Lin, H.W., Chang, Y.Y., Wong, M.L., Lin, J.W. & Chang, T.J. Functional analysis of virion host shutoff protein of pseudorabies virus. Virology 324, 412-8 (2004). Berthomme, H., Jacquemont, B. & Epstein, A. The pseudorabies virus hostshutoff homolog gene: nucleotide sequence and comparison with alphaherpesvirus protein counterparts. Virology 193, 1028-32 (1993). Toth, I.E., Boldogkoi, Z., Medveczky, I. & Palkovits, M. Lacrimal preganglionic neurons form a subdivision of the superior salivatory nucleus of rat: transneuronal labelling by pseudorabies virus. J Auton Nerv Syst 77, 45-54 (1999). Westerhaus, M.J. & Loewy, A.D. Central representation of the sympathetic nervous system in the cerebral cortex. Brain Res 903, 117-27 (2001). Kalsbeek, A., Fliers, E., Franke, A.N., Wortel, J. & Buijs, R.M. Functional connections between the suprachiasmatic nucleus and the thyroid gland as revealed by lesioning and viral tracing techniques in the rat. Endocrinology 141, 3832-41 (2000). Brideau, A.D., Eldridge, M.G. & Enquist, L.W. Directional transneuronal infection by pseudorabies virus is dependent on an acidic internalization motif in the Us9 cytoplasmic tail. J Virol 74, 4549-61 (2000). Standish, A., Enquist, L.W., Miselis, R.R. & Schwaber, J.S. Dendritic morphology of cardiac related medullary neurons defined by circuit-specific infection by a recombinant pseudorabies virus expressing beta-galactosidase. J Neurovirol 1, 359-68 (1995). Irnaten, M. et al. Activity of cardiorespiratory networks revealed by transsynaptic virus expressing GFP. J Neurophysiol 85, 435-8 (2001). Boldogkoi, Z. et al. Construction of recombinant pseudorabies viruses optimized for labeling and neurochemical characterization of neural circuitry. Brain Res Mol Brain Res 109, 105-18 (2002). Billig, I., Foris, J.M., Enquist, L.W., Card, J.P. & Yates, B.J. Definition of neuronal circuitry controlling the activity of phrenic and abdominal motoneurons in the ferret using recombinant strains of pseudorabies virus. J Neurosci 20, 7446-54 (2000).
111
160. 161. 162. 163.
164. 165. 166. 167. 168. 169. 170. 171.
172. 173. 174. 175. 176.
Kerman, I.A., Enquist, L.W., Watson, S.J. & Yates, B.J. Brainstem substrates of sympatho-motor circuitry identified using trans-synaptic tracing with pseudorabies virus recombinants. J Neurosci 23, 4657-66 (2003). Krout, K.E., Mettenleiter, T.C. & Loewy, A.D. Single CNS neurons link both central motor and cardiosympathetic systems: a double-virus tracing study. Neuroscience 118, 853-66 (2003). Davis, S.F., Williams, K.W., Xu, W., Glatzer, N.R. & Smith, B.N. Selective enhancement of synaptic inhibition by hypocretin (orexin) in rat vagal motor neurons: implications for autonomic regulation. J Neurosci 23, 3844-54 (2003). Smith, B.N. et al. Pseudorabies virus expressing enhanced green fluorescent protein: A tool for in vitro electrophysiological analysis of transsynaptically labeled neurons in identified central nervous system circuits. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 9264-9 (2000). Denes, E. & Ranger-Rogez, S. Main adult herpes virus infections of the CNS. Expert Rev Anti Infect Ther 3, 663-78 (2005). Kennedy, P.G. Viral encephalitis. J Neurol 252, 268-72 (2005). Kodukula, P., Liu, T., Rooijen, N.V., Jager, M.J. & Hendricks, R.L. Macrophage control of herpes simplex virus type 1 replication in the peripheral nervous system. J Immunol 162, 2895-905 (1999). Lang, A. & Nikolich-Zugich, J. Development and migration of protective CD8+ T cells into the nervous system following ocular herpes simplex virus-1 infection. J Immunol 174, 2919-25 (2005). Birmanns, B., Reibstein, I. & Steiner, I. Characterization of an in vivo reactivation model of herpes simplex virus from mice trigeminal ganglia. J Gen Virol 74 ( Pt 11), 2487-91 (1993). Perng, G.C. et al. The latency-associated transcript gene of herpes simplex virus type 1 (HSV-1) is required for efficient in vivo spontaneous reactivation of HSV-1 from latency. J Virol 68, 8045-55 (1994). Frampton, A.R., Jr., Goins, W.F., Nakano, K., Burton, E.A. & Glorioso, J.C. HSV trafficking and development of gene therapy vectors with applications in the nervous system. Gene Ther 12, 891-901 (2005). Lewandowski, G., Zimmerman, M.N., Denk, L.L., Porter, D.D. & Prince, G.A. Herpes simplex type 1 infects and establishes latency in the brain and trigeminal ganglia during primary infection of the lip in cotton rats and mice. Arch Virol 147, 167-79 (2002). Rinaman, L., Card, J.P. & Enquist, L.W. Spatiotemporal responses of astrocytes, ramified microglia, and brain macrophages to central neuronal infection with pseudorabies virus. J Neurosci 13, 685-702 (1993). Rassnick, S., Enquist, L.W., Sved, A.F. & Card, J.P. Pseudorabies virus-induced leukocyte trafficking into the rat central nervous system. J Virol 72, 9181-91 (1998). Liu, T., Tang, Q. & Hendricks, R.L. Inflammatory infiltration of the trigeminal ganglion after herpes simplex virus type 1 corneal infection. J Virol 70, 264-71 (1996). Schlett, K. & Madarasz, E. Retinoic acid induced neural differentiation in a neuroectodermal cell line immortalized by p53 deficiency. J Neurosci Res 47, 405-15 (1997). Acarin, L., Vela, J.M., Gonzalez, B. & Castellano, B. Demonstration of poly-Nacetyl lactosamine residues in ameboid and ramified microglial cells in rat brain by tomato lectin binding. J Histochem Cytochem 42, 1033-41 (1994).
112
177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185.
186. 187. 188.
189. 190. 191. 192. 193.
Paxinos W., W.C. The rat brain in stereotaxic coordinates, (Academic Press, San Diego, 1997). Broome, C.S., Whetton, A.D. & Miyan, J.A. Neuropeptide control of bone marrow neutrophil production is mediated by both direct and indirect effects on CFU-GM. Br J Haematol 108, 140-50 (2000). Broome, C.S. & Miyan, J.A. Neuropeptide control of bone marrow neutrophil production. A key axis for neuroimmunomodulation. Ann N Y Acad Sci 917, 424-34 (2000). DePace, D.M. & Webber, R.H. Electrostimulation and morphologic study of the nerves to the bone marrow of the albino rat. Acta Anat (Basel) 93, 1-18 (1975). Strack, A.M., Sawyer, W.B., Marubio, L.M. & Loewy, A.D. Spinal origin of sympathetic preganglionic neurons in the rat. Brain Res 455, 187-91 (1988). Saper C.B. Central autonomic system. in: The rat nervous system (ed. Paxinos G) (Academic Press, San Diego, 1995). Everitt, B.J. et al. Differential co-existence of neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity with catecholamines in the central nervous system of the rat. Neuroscience 11, 443-62 (1984). Loughlin, S.E., Foote, S.L. & Bloom, F.E. Efferent projections of nucleus locus coeruleus: topographic organization of cells of origin demonstrated by threedimensional reconstruction. Neuroscience 18, 291-306 (1986). Ross, C.A. et al. Tonic vasomotor control by the rostral ventrolateral medulla: effect of electrical or chemical stimulation of the area containing C1 adrenaline neurons on arterial pressure, heart rate, and plasma catecholamines and vasopressin. J Neurosci 4, 474-94 (1984). Iversen, P.O., Nicolaysen, G. & Benestad, H.B. Blood flow to bone marrow during development of anemia or polycythemia in the rat. Blood 79, 594-601 (1992). Iversen, P.O., Thing-Mortensen, B., Nicolaysen, G. & Benestad, H.B. Decreased blood flow to rat bone marrow, bone, spleen, and liver in acute leukemia. Leuk Res 17, 663-8 (1993). Ross, C.A., Ruggiero, D.A., Joh, T.H., Park, D.H. & Reis, D.J. Rostral ventrolateral medulla: selective projections to the thoracic autonomic cell column from the region containing C1 adrenaline neurons. J Comp Neurol 228, 168-85 (1984). Hermann, G.E., Holmes, G.M., Rogers, R.C., Beattie, M.S. & Bresnahan, J.C. Descending spinal projections from the rostral gigantocellular reticular nuclei complex. J Comp Neurol 455, 210-21 (2003). Babic, T. & Ciriello, J. Medullary and spinal cord projections from cardiovascular responsive sites in the rostral ventromedial medulla. J Comp Neurol 469, 391-412 (2004). Saper, C.B., Loewy, A.D., Swanson, L.W. & Cowan, W.M. Direct hypothalamo-autonomic connections. Brain Res 117, 305-12 (1976). Zhang, Y.H., Lu, J., Elmquist, J.K. & Saper, C.B. Lipopolysaccharide activates specific populations of hypothalamic and brainstem neurons that project to the spinal cord. J Neurosci 20, 6578-86 (2000). Leranth, C., Antoni, F.A. & Palkovits, M. Ultrastructural demonstration of ovine CRF-like immunoreactivity (oCRF-LI) in the rat hypothalamus: processes of magnocellular neurons establish membrane specializations with parvocellular neurons containing oCRF-LI. Regul Pept 6, 179-88 (1983).
113
194. 195. 196. 197. 198. 199. 200. 201. 202. 203. 204. 205. 206. 207. 208. 209. 210. 211. 212.
van den Pol, A.N. Hypothalamic hypocretin (orexin): robust innervation of the spinal cord. J Neurosci 19, 3171-82 (1999). Geerling, J.C., Mettenleiter, T.C. & Loewy, A.D. Orexin neurons project to diverse sympathetic outflow systems. Neuroscience 122, 541-50 (2003). Swanson, L.W. & Sawchenko, P.E. Hypothalamic integration: organization of the paraventricular and supraoptic nuclei. Annu Rev Neurosci 6, 269-324 (1983). Shafton, A.D., Ryan, A. & Badoer, E. Neurons in the hypothalamic paraventricular nucleus send collaterals to the spinal cord and to the rostral ventrolateral medulla in the rat. Brain Res 801, 239-43 (1998). Cechetto, D.F. & Chen, S.J. Hypothalamic and cortical sympathetic responses relay in the medulla of the rat. Am J Physiol 263, R544-52 (1992). Afan, A.M., Broome, C.S., Nicholls, S.E., Whetton, A.D. & Miyan, J.A. Bone marrow innervation regulates cellular retention in the murine haemopoietic system. Br J Haematol 98, 569-77 (1997). Maestroni, G.J. Short exposure of maturing, bone marrow-derived dendritic cells to norepinephrine: impact on kinetics of cytokine production and Th development. J Neuroimmunol 129, 106-14 (2002). Maestroni, G.J. Dendritic cell migration controlled by alpha 1b-adrenergic receptors. J Immunol 165, 6743-7 (2000). Engler, H. et al. Effects of social stress on blood leukocyte distribution: the role of alpha- and beta-adrenergic mechanisms. J Neuroimmunol 156, 153-62 (2004). Calvo, W. & Haas, R.J. [On the histogenesis of the bone marrow in the rat. Innervation, stroma and their relations to hemopoiesis]. Z Zellforsch Mikrosk Anat 95, 377-95 (1969). Iversen, P.O. et al. Depressed immunity and impaired proliferation of hematopoietic progenitor cells in patients with complete spinal cord injury. in Blood Vol. 96 2081-3 (2000). Nair, M.P., Schwartz, S.A., Wu, K. & Kronfol, Z. Effect of neuropeptide Y on natural killer activity of normal human lymphocytes. Brain Behav Immun 7, 708 (1993). Schramm, L.P., Strack, A.M., Platt, K.B. & Loewy, A.D. Peripheral and central pathways regulating the kidney: a study using pseudorabies virus. Brain Res 616, 251-62 (1993). Gerendai, I. et al. Transneuronal labelling of nerve cells in the CNS of female rat from the mammary gland by viral tracing technique. Neuroscience 108, 103-18 (2001). Jansen, A.S., Nguyen, X.V., Karpitskiy, V., Mettenleiter, T.C. & Loewy, A.D. Central command neurons of the sympathetic nervous system: basis of the fightor-flight response. Science 270, 644-6 (1995). Elias, C.F. et al. Leptin activates hypothalamic CART neurons projecting to the spinal cord. Neuron 21, 1375-85 (1998). Kim, J.S., Enquist, L.W. & Card, J.P. Circuit-specific coinfection of neurons in the rat central nervous system with two pseudorabies virus recombinants. J Virol 73, 9521-31 (1999). Oldfield, B.J. et al. The neurochemical characterisation of hypothalamic pathways projecting polysynaptically to brown adipose tissue in the rat. Neuroscience 110, 515-26 (2002). Kreier, F. et al. Selective parasympathetic innervation of subcutaneous and intraabdominal fat--functional implications. J Clin Invest 110, 1243-50 (2002).
114
213. 214. 215. 216. 217. 218. 219. 220. 221. 222. 223. 224. 225.
226. 227. 228. 229. 230.
Lafontan, M. & Berlan, M. Fat cell adrenergic receptors and the control of white and brown fat cell function. J Lipid Res 34, 1057-91 (1993). Bartness, T.J., Kay Song, C., Shi, H., Bowers, R.R. & Foster, M.T. Brainadipose tissue cross talk. Proc Nutr Soc 64, 53-64 (2005). Kreier, F. et al. Tracing from fat tissue, liver, and pancreas: a neuroanatomical framework for the role of the brain in type 2 diabetes. Endocrinology 147, 11407 (2006). Giordano, A. et al. White adipose tissue lacks significant vagal innervation and immunohistochemical evidence of parasympathetic innervation. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol (2006). Morrison, S.F. Raphe pallidus neurons mediate prostaglandin E2-evoked increases in brown adipose tissue thermogenesis. Neuroscience 121, 17-24 (2003). Yoshida, K. et al. Neurons of the rat preoptic area and the raphe pallidus nucleus innervating the brown adipose tissue express the prostaglandin E receptor subtype EP3. Eur J Neurosci 18, 1848-60 (2003). Nakamura, K. et al. Identification of sympathetic premotor neurons in medullary raphe regions mediating fever and other thermoregulatory functions. J Neurosci 24, 5370-80 (2004). Chen, X.M. et al. The caudal periaqueductal gray participates in the activation of brown adipose tissue in rats. Neurosci Lett 331, 17-20 (2002). Takahashi, A., Ishimaru, H., Ikarashi, Y., Kishi, E. & Maruyama, Y. Cholinergic input to the supraoptic nucleus increases Fos expression and body temperature in rats. Pflugers Arch 442, 451-8 (2001). Takahashi, A., Ishimaru, H., Ikarashi, Y., Kishi, E. & Maruyama, Y. Opposite regulation of body temperature by cholinergic input to the paraventricular nucleus and supraoptic nucleus in rats. Brain Res 909, 102-11 (2001). Wang, C., Billington, C.J., Levine, A.S. & Kotz, C.M. Effect of CART in the hypothalamic paraventricular nucleus on feeding and uncoupling protein gene expression. Neuroreport 11, 3251-5 (2000). Blevins, J.E., Eakin, T.J., Murphy, J.A., Schwartz, M.W. & Baskin, D.G. Oxytocin innervation of caudal brainstem nuclei activated by cholecystokinin. Brain Res 993, 30-41 (2003). Vrang, N., Larsen, P.J., Kristensen, P. & Tang-Christensen, M. Central administration of cocaine-amphetamine-regulated transcript activates hypothalamic neuroendocrine neurons in the rat. Endocrinology 141, 794-801 (2000). Hakansson, M.L., Brown, H., Ghilardi, N., Skoda, R.C. & Meister, B. Leptin receptor immunoreactivity in chemically defined target neurons of the hypothalamus. J Neurosci 18, 559-72 (1998). Dun, N.J. et al. Orexins: a role in medullary sympathetic outflow. Regul Pept 96, 65-70 (2000). Antunes, V.R., Brailoiu, G.C., Kwok, E.H., Scruggs, P. & Dun, N.J. Orexins/hypocretins excite rat sympathetic preganglionic neurons in vivo and in vitro. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol 281, R1801-7 (2001). van den Top, M. et al. Orexins induce increased excitability and synchronisation of rat sympathetic preganglionic neurones. J Physiol 549, 809-21 (2003). Peyron, C. et al. Neurons containing hypocretin (orexin) project to multiple neuronal systems. J Neurosci 18, 9996-10015 (1998).
115
231. 232. 233. 234. 235. 236. 237. 238. 239. 240. 241. 242.
243. 244. 245. 246.
247.
248.
Sweet, D.C., Levine, A.S., Billington, C.J. & Kotz, C.M. Feeding response to central orexins. Brain Res 821, 535-8 (1999). Edwards, C.M. et al. The effect of the orexins on food intake: comparison with neuropeptide Y, melanin-concentrating hormone and galanin. J Endocrinol 160, R7-12 (1999). Dube, M.G., Kalra, S.P. & Kalra, P.S. Food intake elicited by central administration of orexins/hypocretins: identification of hypothalamic sites of action. Brain Res 842, 473-7 (1999). Wilding, J.P. Neuropeptides and appetite control. Diabet Med 19, 619-27 (2002). Porte, D., Jr., Baskin, D.G. & Schwartz, M.W. Leptin and insulin action in the central nervous system. Nutr Rev 60, S20-9; discussion S68-84, 85-7 (2002). Sainsbury, A., Cooney, G.J. & Herzog, H. Hypothalamic regulation of energy homeostasis. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab 16, 623-37 (2002). Elmquist, J.K. Hypothalamic pathways underlying the endocrine, autonomic, and behavioral effects of leptin. Physiol Behav 74, 703-8 (2001). Kishi, T. & Elmquist, J.K. Body weight is regulated by the brain: a link between feeding and emotion. Mol Psychiatry 10, 132-46 (2005). Elmquist, J.K., Coppari, R., Balthasar, N., Ichinose, M. & Lowell, B.B. Identifying hypothalamic pathways controlling food intake, body weight, and glucose homeostasis. J Comp Neurol 493, 63-71 (2005). Nagashima, K., Nakai, S., Tanaka, M. & Kanosue, K. Neuronal circuitries involved in thermoregulation. Auton Neurosci 85, 18-25 (2000). Yoshida, K. et al. Fos expression induced by warming the preoptic area in rats. Brain Res 933, 109-17 (2002). Ranels, H.J. & Griffin, J.D. The effects of prostaglandin E2 on the firing rate activity of thermosensitive and temperature insensitive neurons in the ventromedial preoptic area of the rat hypothalamus. Brain Res 964, 42-50 (2003). Davalos, D. et al. ATP mediates rapid microglial response to local brain injury in vivo. Nat Neurosci 8, 752-8 (2005). Nimmerjahn, A., Kirchhoff, F. & Helmchen, F. Resting microglial cells are highly dynamic surveillants of brain parenchyma in vivo. Science 308, 1314-8 (2005). Cook, W.J. et al. Persistent expression of chemokine and chemokine receptor RNAs at primary and latent sites of herpes simplex virus 1 infection. Virol J 1, 5 (2004). Boivin, G., Coulombe, Z. & Rivest, S. Intranasal herpes simplex virus type 2 inoculation causes a profound thymidine kinase dependent cerebral inflammatory response in the mouse hindbrain. Eur J Neurosci 16, 29-43 (2002). Aravalli, R.N., Hu, S., Rowen, T.N., Palmquist, J.M. & Lokensgard, J.R. Cutting edge: TLR2-mediated proinflammatory cytokine and chemokine production by microglial cells in response to herpes simplex virus. J Immunol 175, 4189-93 (2005). Kurt-Jones, E.A. et al. Herpes simplex virus 1 interaction with Toll-like receptor 2 contributes to lethal encephalitis. Proc Natl Acad Sci U S A 101, 1315-20 (2004).
116
249. 250. 251. 252. 253. 254. 255.
256. 257. 258. 259.
260. 261. 262. 263. 264. 265.
Coughlan, C.M. et al. Expression of multiple functional chemokine receptors and monocyte chemoattractant protein-1 in human neurons. Neuroscience 97, 591-600 (2000). Thomas, A., Gasque, P., Vaudry, D., Gonzalez, B. & Fontaine, M. Expression of a complete and functional complement system by human neuronal cells in vitro. Int Immunol 12, 1015-23 (2000). Pereira, R.A. & Simmons, A. Cell surface expression of H2 antigens on primary sensory neurons in response to acute but not latent herpes simplex virus infection in vivo. J Virol 73, 6484-9 (1999). Cavaliere, F., Dinkel, K. & Reymann, K. Microglia response and P2 receptor participation in oxygen/glucose deprivation-induced cortical damage. Neuroscience 136, 615-23 (2005). Wang, X. et al. P2X7 receptor inhibition improves recovery after spinal cord injury. Nat Med 10, 821-7 (2004). Medana, I.M., Hunt, N.H. & Chan-Ling, T. Early activation of microglia in the pathogenesis of fatal murine cerebral malaria. Glia 19, 91-103 (1997). Rinner, W.A., Bauer, J., Schmidts, M., Lassmann, H. & Hickey, W.F. Resident microglia and hematogenous macrophages as phagocytes in adoptively transferred experimental autoimmune encephalomyelitis: an investigation using rat radiation bone marrow chimeras. Glia 14, 257-66 (1995). Babcock, A.A., Kuziel, W.A., Rivest, S. & Owens, T. Chemokine expression by glial cells directs leukocytes to sites of axonal injury in the CNS. J Neurosci 23, 7922-30 (2003). Stoll, G. & Jander, S. The role of microglia and macrophages in the pathophysiology of the CNS. Prog Neurobiol 58, 233-47 (1999). Vallieres, L. & Sawchenko, P.E. Bone marrow-derived cells that populate the adult mouse brain preserve their hematopoietic identity. J Neurosci 23, 5197207 (2003). Schilling, M. et al. Microglial activation precedes and predominates over macrophage infiltration in transient focal cerebral ischemia: a study in green fluorescent protein transgenic bone marrow chimeric mice. Exp Neurol 183, 2533 (2003). Tanaka, R. et al. Migration of enhanced green fluorescent protein expressing bone marrow-derived microglia/macrophage into the mouse brain following permanent focal ischemia. Neuroscience 117, 531-9 (2003). Ladeby, R. et al. Proliferating resident microglia express the stem cell antigen CD34 in response to acute neural injury. Glia 50, 121-31 (2005). Hailer, N.P., Grampp, A. & Nitsch, R. Proliferation of microglia and astrocytes in the dentate gyrus following entorhinal cortex lesion: a quantitative bromodeoxyuridine-labelling study. Eur J Neurosci 11, 3359-64 (1999). Eliason, D.A., Cohen, S.A., Baratta, J., Yu, J. & Robertson, R.T. Local proliferation of microglia cells in response to neocortical injury in vitro. Brain Res Dev Brain Res 137, 75-9 (2002). Elson, K., Speck, P. & Simmons, A. Herpes simplex virus infection of murine sensory ganglia induces proliferation of neuronal satellite cells. J Gen Virol 84, 1079-84 (2003). la Fleur, S.E., Kalsbeek, A., Wortel, J. & Buijs, R.M. Polysynaptic neural pathways between the hypothalamus, including the suprachiasmatic nucleus, and the liver. Brain Res 871, 50-6 (2000).
117
266. 267. 268. 269. 270. 271. 272. 273. 274.
Denes, A. et al. Central autonomic control of the bone marrow: multisynaptic tract tracing by recombinant pseudorabies virus. Neuroscience 134, 947-63 (2005). Smith, J.E., Jansen, A.S., Gilbey, M.P. & Loewy, A.D. CNS cell groups projecting to sympathetic outflow of tail artery: neural circuits involved in heat loss in the rat. Brain Res 786, 153-64 (1998). Kim, E.S. et al. Spatial and temporal patterns of transneuronal labeling in CNS neurons after injection of pseudorabies virus into the sciatic nerve of adult rats. Brain Res 857, 41-55 (2000). Andreansky, S. et al. Evaluation of genetically engineered herpes simplex viruses as oncolytic agents for human malignant brain tumors. Cancer Res 57, 1502-9 (1997). Boviatsis, E.J. et al. Long-term survival of rats harboring brain neoplasms treated with ganciclovir and a herpes simplex virus vector that retains an intact thymidine kinase gene. Cancer Res 54, 5745-51 (1994). Miller, C.G. & Fraser, N.W. Requirement of an integrated immune response for successful neuroattenuated HSV-1 therapy in an intracranial metastatic melanoma model. Mol Ther 7, 741-7 (2003). Priller, J. et al. Targeting gene-modified hematopoietic cells to the central nervous system: use of green fluorescent protein uncovers microglial engraftment. Nat Med 7, 1356-61 (2001). Ray, N., Bisher, M.E. & Enquist, L.W. Cyclooxygenase-1 and -2 are required for production of infectious pseudorabies virus. J Virol 78, 12964-74 (2004). De Regge, N. et al. {alpha}-Herpesvirus glycoprotein D interaction with sensory neurons triggers formation of varicosities that serve as virus exit sites. J Cell Biol 174, 267-75 (2006).
118
12. Saját közlemények jegyzéke 12.1. Az értekezés alapjául szolgáló közlemények Zsolt Boldogköi, Attila Sík, Ádám Dénes, Anikó Reichart, József Toldi, Ida Gerendai, Krisztina J. Kovács, and Miklós Palkovits. Novel Tracing Paradigms – Genetically Engineered Herpesviruses as Tools for Mapping Functional Circuits within the CNS: Present Status and Future Prospects. Progress in Neurobiology, 72 (2004) 417-445. Ádám Dénes, Zsolt Boldogköi, Gabriella Uhereczky, Ákos Hornyák, Miklós Rusvai, Miklós Palkovits and Krisztina J. Kovács. Central Autonomic Control of the Bone Marrow: Multisynaptic Tract Tracing by Pseudorabies Virus. Neuroscience 134 (2005) 947-963. Ádám Dénes, Zsolt Boldogkői, Ákos Hornyák, Miklós Palkovits, and Krisztina J. Kovács. Attenuated pseudorabies virus-evoked rapid innate immune response in the rat brain. Journal of Neuroimmunology 180 (2006) 88-103.
12.2. Előadáskivonatok Dénes Ádám, Miklós Ildikó és Kovács Krisztina (2002) A hízósejtek morfológiai és funkcionális vizsgálata a fejlődő agyban. X. Sejt és Fejlődésbiológiai Napok, Siófok Ádám Dénes, Krisztina Kovács (2002) Mast cells in the developing rat brain. Elba Summer School, Italy Ádám Dénes, Miklós Palkovits, Zsolt Boldogköi, Ákos Hornyák and Krisztina Kovács (2004) Pseudorabies virus induced CNS inflammation and rapid glial reaction after peripheral inoculation. IBRO International Workshop on Neuronal Circuits: from Elementary to Complex Functions, 29-31 January, Budapest Dénes Ádám, Boldogköi Zsolt, Palkovits Miklós, Kovács Krisztina (2004) Pseudorabies virus indukálta gyulladás és gyors gliális aktiváció a központi idegrendszerben, perifériás vírusbeadást követően. PHD Tudományos Napok, Budapest Ádám Dénes, Miklós Palkovits, Zsolt Boldogkői, Ákos Hornyák, Krisztina J. Kovács (2004) CNS inflammation and glial reaction against peripherally administered pseudorabies virus. 4th FENS, Lisbon Márton Gábor, Szabó András, Boldogköi Zsolt, Dénes Ádám, Nógrádi Antal (2005) The use of mutant pseudorabies viruses for genetic modification of human embryonic spinal cord neurons. MITT XI., Pécs Boldogkői Zsolt, Dénes Ádám (2005) Viral vectors. MITT XI., Pécs 119
Márton Gábor, Szabó András, Boldogköi Zsolt, Dénes Ádám, Nógrádi Antal (2006) The use of Pseudorabies virus as a gene therapy vector for human embryonic spinal cord neurons. IBRO International Workshop, Budapest Ádám Dénes, Miklós Palkovits, Zsolt Boldogkői, Ákos Hornyák, Krisztina J. Kovács (2006) Rapid microglial barrier formation and innate response control pseudorabies virus spread in the brain parenchyma. PENS Summer School, "The brain as a target for inflammatory processes" 14th-19th May, Berlin Adam Denes, Rishma Vidyasagar, Jianghua Feng, Johanna Närväinen, Barry McColl, Risto A. Kauppinen and Stuart Allan (2006) Endogenous and Exogenous Inflammatory Cell Responses Following Transient Ischaemia in Mice. 14th ISMRM meeting, Seattle Márton Gábor, Szabó András, Boldogköi Zsolt, Dénes Ádám, Nógrádi Antal (2006) The use of Pseudorabies virus as a gene therapy vector for human embryonic spinal cord neurons. 5th FENS, July 8 -12, Wien Miklós Darida, Ádám Dénes, Zsolt Boldogkői, Krisztina Kovács (2006) Dual viral transneuronal tracing of central circuits innervating brown and white adipose tissue. 5th FENS, July 8 -12, Wien Ádám Dénes, Rishma Vidyasagar, Jianghua Feng, Johanna Närväinen, Barry McColl, Risto A. Kauppinen and Stuart Allan (2006) Proliferation and supportive role of self-renewing microglia following transient MCAo. 5th FENS, July 8 -12, Wien
120
13. Köszönetnyilvánítás Szeretnék köszönetet mondani mindazoknak, akik segítettek, támogattak az évek során és lehetővé tették, hogy munkámat a legjobb körülmények között végezzem. Mindenek előtt hálával tartozom témavezetőmnek, Dr. Kovács Krisztinának, aki türelmet és energiát nem sajnálva, állandóan azon fáradozott, hogy ebből az izgága, nyughatatlan ifjúból (azaz belőlem) eredményes kutatót faragjon. Amennyiben ez mégsem sikerült volna tökéletesen, aziránt a felelősség nem őt terheli… Segített a tudományos gondolkodás elsajátításában és engesztelhetetlenül gyomlálta ki elkövetett hibáimat, elírásaimat, segítve, hogy az elvégzett munka a lehető legjobb minőségben kerüljön a tudományos közösség elé. Szeretnék emellett köszönetet mondani közelebbi kollégáimnak, a Molekuláris Neuroendokrinológia Laboratórium minden tagjának: Bosca Zoltánnak, Darida Miklósnak, Dr. Bali Balázsnak, Földes Annának, Dr. Gerencsér Andreának, Jelencsics Kírának, Ladjánszky Veronikának, Dr. Miklós Ildikónak, Pintér Ottónak, Dr. Szalay Katalinnak, Szalay Orsolyának, Szegő Évának, Tőkési Viktóriának, barátságukért és sokéves segítségükért. Ugyancsak köszönettel tartozom a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet minden munkatársának, közülük sokakkal sikerült értékes személyes kapcsolatot is kialakítani az évek során és vannak köztük olyanok is, akiket barátomnak mondhatok. Nagy köszönettel tartozom Prof. Palkovits Miklósnak, akihez bármikor fordulhattam és akitől rengeteget tanultam az évek során. Folyamatosan segítségemre volt Dr. Boldogkői Zsolt, aki a rekombináns vírustörzseket rendelkezésemre bocsájtotta és akitől sok szakmai támogatást kaptam. Hálás vagyok Prof. Nancy Rothwell, Dr. Stuart Allan és Prof. Risto Kauppinen önzetlen
segítségéért,
akik
a
University
of
Manchester
kiváló
kutatóiként
megismertettek egy másfajta tudományos gondolkodással, aminek azóta is nagy hasznát veszem. Végezetül, de egyáltalán nem utolsósorban, nem tudom (és soha nem is leszek képes) megköszönni
szüleimnek,
nagyszüleimnek,
dédmamámnak
hogy
egészséges
gondolatvilágú és boldog gyermekként nézhettem a felnőttkor viszontagságai elé, testvéreimnek, hogy mindig mellettem álltak és feleségemnek, kislányomnak, akik miatt most már tudom, hogy miért is érdemes dolgoznom. 121
