STANOVENÍ VITAMÍNŮ B V POTRAVINÁCH A DOPLŇCÍCH STRAVY METODOU HPLC (rešeršní práce)

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA ANALYTICKÉ CHEMIE

BAKALÁŘSKÁ PRÁCE

STANOVENÍ VITAMÍNŮ B V POTRAVINÁCH A DOPLŇCÍCH STRAVY METODOU HPLC (rešeršní práce) Vedoucí bakalářské práce:

HRADEC KRÁLOVÉ, 2015

PharmDr. Lucie Havlíková, Ph.D.

Veronika Kašpárková

Prohlášení

„Prohlašuji, že tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, které byly pro práci využity, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci náležitě citovány. Práce nebyla využita k získání jiného nebo stejného titulu.“

V Hradci Králové dne

Veronika Kašpárková

Poděkování

Ráda bych touto cestou poděkovala PharmDr. Lucii Havlíkové Ph.D. za její rady, připomínky a odborné vedení, které mi během zpracovávání této bakalářské práce věnovala.

OBSAH Seznam použitých zkratek .............................................................................................6 1.

Úvod ....................................................................................................................8

2.

Cíl a popis zadání práce........................................................................................8

3.

Vysokoúčinná

kapalinová

chromatografie

(High-Performance

Liquid

Chromatography, HPLC)...............................................................................................9 3.1

Obecné informace .........................................................................................9

3.2

Složení zařízení .............................................................................................9

3.3

Detektory ....................................................................................................10

4.

Vitamíny – Přehled ............................................................................................11

5.

Vitamíny skupiny B ...........................................................................................12 5.1

Thiamin – vitamín B1..................................................................................12

5.1.1

Obecné informace.................................................................................12

5.1.2

Analýza vitamínu B1 ............................................................................13

5.2

Riboflavin – vitamín B2 ..............................................................................15

5.2.1


5.2.2


5.3

Niacin – vitamín B3 ....................................................................................18

5.3.1


5.3.2


5.4

Kyselina pantothenová – vitamín B5 ...........................................................21

5.4.1

Obecné vlastnosti..................................................................................21

5.4.2


5.5

Pyridoxal - vitamín B6 ................................................................................24

5.5.1


5.5.2


5.6

Biotin – vitamín B7 .....................................................................................27

5.6.1


5.6.2


5.7

Kyselina listová – vitamín B9......................................................................30 4

5.7.1


5.7.2


5.8

Kyanokobalamin – vitamín B12 ..................................................................32

5.8.1


5.8.2

Analýza vitamínu B12 ..........................................................................33

6.

Celý postup stanovení na dvou příkladech ..........................................................35 6.1

HPLC metoda pro stanovení vitamínu B12 v mase a játrech s detekcí pomocí

hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS)......................35 6.1.1

Princip ..................................................................................................35

6.1.2

Chromatografické podmínky ................................................................36

6.1.3

Vzorky .................................................................................................36

6.1.4

Příprava vzorku pro stanovení jednotlivých forem vitamínu B12 ..........36

6.1.5

Příprava vzorku pro stanovení celkového obsahu vitamínu B12 ............37

6.1.6

Závěr pro stanovení B12 v mase ...........................................................38

6.2

HPLC metoda pro separaci vitamínů B v polyvitamínových premixech s UV

detekcí ....................................................................................................................40

7.

6.2.1

Princip ..................................................................................................40

6.2.2

Chromatografické podmínky ................................................................40

6.2.3

Příprava standardů ................................................................................41

6.2.4

Složení premixů....................................................................................41

6.2.5

Extrakce vitamínů.................................................................................41

6.2.6

Souhrn..................................................................................................43

Závěr..................................................................................................................43

Seznam použité literatury ............................................................................................44

5

Seznam použitých zkratek

ACN

Acetonitril

AdoCbl

Adenosylkobalamin

C18

Oktadecylsilikagel

C-CAD

Corona-Charged Aerosol Detector

CE

Kapilární elektroforéza

CNCbl

Kyanokobalamin

DAD

Detektor s diodovým polem (Diod Array Detector)

Em

Emisní vlnová délka

Ex

Excitační vlnová délka

FAD

Flavinadenindinukleotid

FLD

Fluorescenční detektor

FMN

Flavinmononukleotid

FTIR

Fourierova transformace infračervené spektroskopie (Fourier Transform Infrared Spectroscopy)

HDL

Vysokodenzitní lipoprotein (High-density lipoprotein)

HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-Performance Liquid Chromatography)

ICP-MS

Hmotností spektrometrie s indukčně vázaným plaztem (Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry)

LC

Kapalinová chromatografie (Liquid Chromatography)

LDL

Nízkodenzitní lipoprotein (Low-density lipoprotein)

LOD

Limit detekce (Limit of Detection)

LOQ

Limit kvantifikace (Limit of Quantification)

6

LLE

Kapalina-kapalina extrakce (Liquid-liquid Extraction)

MBA

Mikrobiologické testy (Microbiological Assay)

NAD

Nikotinamidadenindinukleotid

NADP

Nikotinamidadenindinukleotidfosfát

OHCbl

Hydroxykobalamin

PDA

Detektor s fotodiodovým polem (Photo Diode Array)

PLP

Pridoxal-5'-fosfát

RP-HPLC

Vysokoúčinná kapalinová chromatografie s reverzní fází (Reverse-Phase HPLC)

SPE

Extrakce na tuhé fázi (Solid Phase Extraction)

TDP

Thiamin-difosfát

TFA

Trifluoroctová kyselina (Trifluoroacetic acid)

TMP

Thiamin-monofosfát

TTP

Thiamin-trifosfát

UV

Ultrafialové záření

VIS

Viditelné záření

VLDL

Velmi nízkodenzitní lipoprotein (Very Low-density lipoprotein)

7

1. Úvod Téma bakalářské práce jsem si vybrala záměrně, protože si myslím, že dochází ke skloubení dvou velmi zajímavých prvků, tj. HPLC a stanovení vitamínů v potravinách či doplňcích stravy (v této bakalářské práci zaměřeno konkrétně na vitamíny ze skupiny B). Vitamíny skupiny B jsou hojně zastoupeny v lidské potravě. S tím je spojen možný deficit jednotlivých vitamínů (předávkování vitamíny B často nemá závažnější klinické důsledky z hlediska jejich rozpustnosti ve vodě). Největší riziko spojené s příjmem vitamínů bude u skupiny pacientů, kteří jsou odkázáni pouze na jediný zdroj výživy (např. pacienti odkázaní na parenterální výživu, kojenci apod.). Proto je nutno v některých případech nedostatku vitamíny suplementovat, ať už obohacováním potravin vitamíny nebo i samostatným užíváním doplňků stravy. Pro zajištění dostatečné kvality jednotlivých produktů se v praxi potřebujeme spolehnout na optimálně rychlou, přesnou a cenově dostupnou analytickou metodu, pomocí které můžeme obsah vitamínů a dalších jednotlivých složek preparátů monitorovat, a to už při jejich výrobě a také v průběhu celé doby použitelnosti přípravku.

2. Cíl a popis zadání práce Cílem práce je shromáždění informací týkajících se metod stanovení vitamínů skupiny B s využitím vysokoúčinné kapalinové chromatografie v potravinách a doplňcích stravy. Při výběru článků jsem se snažila vyhledávat ty nejaktuálnější, tedy převážně články z posledních pěti let. Bakalářská práce je zpracována ve formě rešerše. Práce je rozdělena na tři hlavní části. První úsek nás seznamuje s HPLC metodou a jejím přístrojovým uspořádáním, dále s vitamíny a jejich rozdělením. Druhá část je věnována jednotlivým vitamínům, jejich obecným vlastnostem a analýze doplněných o tabulku s přehledem metod na jejich stanovení ve vybraných potravinách. Závěrečná třetí část je věnována ukázce kompletního postupu zpracování a stanovení vybraného vitamínu v dané potravině. 8

3. Vysokoúčinná kapalinová chromatografie (High-Performance Liquid Chromatography, HPLC) 3.1 Obecné informace HPLC je anglická zkratka „High performance Liquid Chromatography“ v překladu známá jako vysokoúčinná kapalinová chromatografie. Jak už název napovídá, typickou vlastností HPLC je kapalné skupenství mobilní fáze. V rámci separačního procesu se analyt rozděluje mezi stacionární a mobilní fází. Afinita analytu rozhoduje o času, kterou stráví analyt v příslušné fázi. Kapalinovou chromatografii je možno použít i pro separaci termolabilních a netěkavých sloučenin. Není zde totiž nutné převádět vzorek na plyn, můžeme tedy s výhodou pracovat za laboratorní teploty (1).

3.2 Složení zařízení HPLC zařízení sestává z několika hlavních komponent:  Čerpadlo Slouží k čerpání kapaliny do kolony. Nejčastěji se používají pístová nebo membránová čerpadla. Vhodné čerpadlo by mělo mít co nejstabilnější průtok (malé kolísání průtoku). Mobilní fáze nesmí narušovat materiál čerpadla a zároveň z čerpadla se nesmí do mobilní fáze uvolňovat žádné látky.  Směšovací zařízení Tato součást se využívá hlavně při operacích, kde se v průběhu separace mění složení mobilní fáze, tzv. gradientová eluce. Směšovací zařízení má za úkol při gradientové eluci připravovat směs kapalin, případně v během separace řídit změny ve složení mobilní fáze. Pokud je složení mobilní fáze v průběhu separace stejné, hovoříme o izokratické eluci.  Dávkovací zařízení Jedná se o injekční zařízení, ovládané buď ručně, nebo automaticky. Je zde opět požadavek na inertnost použitého materiálu. Injekční systém může být nahrazen dávkováním pomocí dávkovacího kohoutu. 9

 Kolona Existuje velká škála kolon různých délek, vnitřních průměrů a náplní. Pro rychlé separace jsou vhodné krátké analytické kolony. Vysoce účinné kolony mají malý vnitřní průměr. Používají se i předkolony, které se umisťují mezi čerpadlo a dávkovací zařízení nebo ochranné kolony, umístěné mezi dávkovacím zařízením a analytickou kolonou. Jejich úkolem je chránit kolonu před různými nečistotami a nerozpustným materiálem (1).

3.3 Detektory Používané detektory systému HPLC by měly být selektivní a citlivé pro stanovovaný analyt a na druhou stranu co nejméně citlivé pro mobilní fázi. Nejčastěji se používají detektory fotometrické, refraktometrické a fluorescenční.  Fotometrický detektor Tento typ detektoru proměřuje absorbanci eluátu, který vychází z kolony. Měření pouze při jedné vlnové délce zajišťují jednodušší detektory, ty složitější dovolí nastavení vlnové délky za pomoci monochromátoru. U těch nejdokonalejších je možno díky diodovému poli proměřit absorpční spektrum v celé určené oblasti. Limit detekce je až 10-10 g.ml-1. Citlivost velmi závisí na molárním absorpčním koeficientu látky.  Refraktometrický detektor Detektor zjišťuje rozdíly mezi čistou mobilní fází a indexem lomu eluátu. Limit detekce je 10-7 g.ml-1. Při použití tohoto detektoru je nutné udržovat konstantní teplotu.  Fluorescenční detektor Tento detektor funguje na principu fluorescence, tedy schopnosti látky absorbovat UV záření a následně vysílat záření o vyšší vlnové délce, které se měří fotonásobičem. Limit detekce je 10-12 g.ml-1, jedná se tedy o velmi selektivní detektor.  Další detektory Je možné použít i další detektory jako elektrochemické detektory, FTIR detektor nebo i hmotnostní spektrometr (1).

10

4. Vitamíny – Přehled Vitamíny jsou organické sloučeniny, které slouží pro správnou funkci lidského metabolismu. Ovšem vlivem mutací způsobujících transkripci genů, dochází v organismu ke ztrátě schopnosti dané vitamíny tvořit. Proto hlavní cestou, jak tělu dodat potřebné vitamíny je zejména potrava. Ta musí být různorodá, neboť neexistuje potravina, která by obsahovala požadované denní dávky všech vitamínů. Aby měl specifický vitamín na organismus požadovaný účinek, musí většina vitamínu podlehnout modifikacím, jako je například fosforylace či vazba na nukleotid (2). Vitamíny dělíme na dvě skupiny dle jejich rozpustnosti, a to na ve vodě rozpustné vitamíny a vitamíny rozpustné v tucích. Vitamíny ve vodě rozpustné v těle fungují spíše jako kofaktory specifických koenzymů. Jejich zásoby v organismu jsou jen v malém množství a bývají skladovány krátkou dobu. Proto je potřeba jejich pravidelné doplňování dle požadavků organismu. Řadíme sem vitamíny skupiny B a vitamín C. Vitamín C je významná antioxidační látka, jehož účinek se využívá zejména při nachlazení a infekčním onemocnění (3). V tucích rozpustné vitamíny se svým složením mohou projevovat jako hormony. V organismu se skladují až v takových množstvích, že mohou způsobit některé nežádoucí až toxické příznaky. Do této skupiny vitamínů řadíme vitamín A, D, E, K. Vitamín A má své uplatnění v sítnici, kde se podílí na syntéze fotosenzitivního pigmentu a v buňkách epitelu. Vitamín D se tvoří vlivem UV záření z provitamínů. Společně s dalšími hormony se účastní regulace vápníku v organismu. Vitamín E má své využití jako antioxidant buněk a vitamín K najdeme v játrech při jeho účasti na tvorbě hemokoagulačních faktorů, jimiž tak brání vzniku krvácení. Vitamíny uplatníme například při léčbě hypovitaminóz, kdy podáváme vyšší dávky nebo při předcházení jejich nedostatku. Dále se uplatňují k léčbě některých onemocnění, která mohou být způsobena jiným činitelem než jejich nedostatkem, jako jsou například dermatologická onemocnění (3).

11

5. Vitamíny skupiny B Mezi ve vodě rozpustné vitamíny řadíme vitamíny skupiny B (thiamin, riboflavin, niacin, kyselina pantothenová, pyridoxal, biotin, kyselina listová a kyanokobalamin) a vitamín C. Vitamíny skupiny B fungují zejména jako koenzymy různých metabolických procesů. Vitamín C je významný hlavně jako oxidoredukční látka (3).

5.1 Thiamin – vitamín B1 5.1.1 Obecné informace Vitamín

B1 se

vyskytuje

ve

čtyřech formách – thiamin, thiaminmonofosfát

(TMP),

thiamin-difosfát

(TDP) a thiamin-trifosfát (TTP). TMP Obr. 1 - Thiamin

a TTP poskytují pouze přechodný stav mezi thiaminem a TDP. Ten se tvoří jako kofaktor řady enzymů a je potřebný

zejména pro oxidační dekarboxylaci či v pentózovém cyklu, kde se thiamin podílí na metabolismu sacharidů, zejména na metabolismu glukózy, který je hlavním energetickým zdrojem lidského organismu. Najdeme ho zejména v potravinách, jako jsou pivovarnické kvasnice, obiloviny, klíčky a celozrnná mouka, neloupaná rýže, med, ořechy, dále i v rajčatech, brukvovité zelenině (mrkev, špenát, kapusta, brokolice) a nalezneme ho i v živočišných produktech jako je maso a to především v játrech. Dospělý jedinec denně spotřebuje asi 1-1,2 mg thiaminu. Zvýšené nároky na přísun thiaminu potom mají dorůstající děti, těhotné a kojící ženy, dále lidé, kteří jsou vystaveni vyšší tělesné námaze či stresu nebo užívají antibiotika/chemoterapeutika. Vyšší potřebu tohoto vitamínu projevuje též organismus alkoholiků nebo osob na dialýze. Při nedostatku se zhoršuje krátkodobá paměť, může docházet k stavům se špatnou koncentrací nebo až k depresím. Projevem nedostatku thiaminu je choroba zvaná beri-beri, kte12

rá se dále rozlišuje na suchou a mokrou, podle toho, zda postihuje nervovou soustavu či kardiovaskulární systém. Vitamín B1 se využívá k udržení dobré funkce nervového systému a duševní rovnováhy (blokuje nadměrnou tvorbu kyseliny pyrohroznové jakožto vedlejšího produktu metabolismu sacharidů a díky tomu posiluje paměť a chuť k jídlu). Thiamin není toxický, jelikož vzhledem k jeho rozpustnosti ve vodě je rychle eliminován z těla ven močí (3,4).

5.1.2 Analýza vitamínu B1 Kvantifikace vitamínu B1 se tradičně provádí na základě mikrobiologických testů (MBA) nebo spektrofluorimetrickou detekcí po oxidačním převedení thiaminu na thiochróm. Tyto metody jsou však časově náročné a vyžadují velké množství vzorků. Proto se zavedly metody HPLC pro zlepšení rychlosti, robustnosti a spolehlivosti analýzy. HPLC metody jsou založeny buď na před- nebo post-kolonové derivatizaci thiaminu na thiochróm v kombinaci s fluorescenční detekcí (5). Pro zjišťování celkového obsahu thiaminu v potravinových produktech se příprava vzorku obvykle provádí v autoklávu s 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou po dobu 30-60 min a následně enzymatickou hydrolýzou (takadiastasa a papain), aby došlo k uvolnění vazeb z bílkovin a fosforylovaných forem vitamínu. Vzhledem k tomu, že molární absorpční koeficient vitamínu B1 je poměrně nízký, je obvyklé použít selektivnější a citlivější fluorescenční detekci po oxidaci na thiochróm a to buď před-kolonovou nebo post-kolonovou derivatizací pomocí reakce s alkalickým hexakyanoželezitanem nebo extrakcí do 2-methyl-1-propanolu s přesným časováním. Před-kolonová derivatizace se běžně používá a umožňuje separaci za použití chromatografie s reverzními fázemi. Nicméně roztok musí být analyzován ihned po vytvoření thiochrómu, neboť ten podléhá opětovnému rozkladu, tudíž se musí při jeho stanovení dodržet přesné časování. Post-kolonová derivatizace je výhodná pro rutinní analýzu s možností automatického dávkování v LC. V praxi je však citlivost poněkud nižší, a tak není tato metoda často používána (6).

13

Tab. 1 - Přehled metod stanovení vitamínu B1 v potravinách Vitamín

Analyzovaný vzorek

Zelená listová

(7)

Červené víno

Gradientová eluce

(8)

B1 Kojenecké mléko (tekutá, prášková forma) (9) Džus (10)

Stacionární fáze

Detekce

C18 3µm

HPLC-MS/MS

(100mm × 2,1mm)

a DAD

LOD

LOQ

0,79 ng/ml

2,41 ng/ml

Gradientová eluce Mobilní fáze A: 10 mM octan amonný (pH 4,5) Mobilní fáze B: MeOH s 0,1% kyselinou octovou Mobilní fáze C: MeOH s 0,3% kyselinou octovou

zelenina

THIAMIN

Mobilní fáze

Mobilní fáze A: 10 mM fosfátový pufr (KH2PO4/K2HPO4) Mobilní fáze B: MeOH

0,05 M octan amonný : MeOH 90:10 (v/v) MeOH : fosfátový pufr 90:10 (v/v) : 0,018M trimethylamin upravený na pH 3,55 pomocí kyseliny fosforečné

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

FLD Ex 360nm/Em

2-550 ng/ml

425nm

C-CAD

2,2 µg/ml

7,0 µg/ml

DAD

9,2 ng/ml

22 ng/ml

5.2 Riboflavin – vitamín B2

5.2.1 Obecné informace Riboflavin

se

řadí

mezi

flaviny

a vyskytuje se ve dvou formách – flavinadenindinukleotid (FAD) a flavinmononukleotid (FMN), jež

jsou

součástí oxidačního

metabolismu,

zejména pro přenos elektronů v dýchacím řetězci. V kůži se podílí na metabolismu a výživě kožních žláz, čímž se podílí na tvorbě nových buněk a udržení zdravé pokožky, nehtů i vlasů. Dále vitamín

B2

ovlivňuje

činnost

nervové

soustavy a mozku, posiluje srdeční aparát (přenos kyslíku na svalovou buňku) a význam má i při metabolismu cytosinu, thiaminu a adeninu

Obr. 2 - Riboflavin

ve formě koenzymů, dále ovlivňuje přeměnu tryptofanu na niacin a uplatnění nalezne i pro správnou funkci očí (chrání rohovku a zabraňuje očním zánětům). Vitamín B2 působí synergicky s vitamínem B3 a B6 i s dalšími vitamíny jako jsou vitamín C a A. Zdrojem vitamínu B2 jsou hlavně játra a mléko. Dále i nemleté bílkoviny a pivní kvasnice. Denní dávka riboflavinu je 1,2-1,5 mg. Riboflavin je odolný vůči vysokým teplotám, ale je citlivý na světlo. Mimo to je ničen působením antibiotik a i antikoncepce, zejména té s obsahem estrogenů. Nedostatek tohoto vitamínu ať už spojeného s užíváním jmenovaných léčiv nebo v rámci malabsorbční poruchy se projevuje popraskanými rty a koutky úst, přecitlivělostí na světlo a dalšími zánětlivými změnami na jazyku (3,11).

15

5.2.2 Analýza vitamínu B2 Koncentrace vitamínu B2 je obvykle stanovena jako celkový riboflavin, a to převedením FMN a FAD na riboflavin před samotnou kvantifikací. Standartní metodou pro určení celkového obsahu vitamínu B2 v potravinách je fluorimetrická metoda. V poslední době se však uplatňuje vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenou fází a UV-VIS nebo fluorimetrickou detekcí, jež umožňuje stanovení flavinových derivátů, a to i při velmi nízkých koncentracích (12). Obecně dobře zavedeným postupem je extrakce riboflavinu, FMN a FAD minerální zředěnou kyselinou, např. 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou po dobu 30 až 60 minut, poté následuje enzymatické trávení škrobem s takadiastasou a k uvolnění některých vázaných fosforylovaných forem. Obvyklý postup LC zahrnuje separaci na C18 stacionární fázi s fluorescenční detekcí (excitace 450 nm / emise 522 nm). Pro detekci riboflavinu, FAD a obsahu FMN v zelenině a mouce byla popsána i metoda s využitím kapilární

elektroforézy

(CE)

s

laserem

16

indukovanou

fluorescencí

(6).


Analyzovaný vzorek

Zelená listová zelenina (7)

Víno RIBOFLAVIN

(13)

B2

Mobilní fáze

Detekce

C18 3µm

HPLC-MS/MS

(100mm × 2,1mm)

a DAD

LOD

LOQ

0,07 ng/ml

0,20 ng/ml

0,49 µg/l

1,72 µg/l

0,25 µg/ml

0,75 µg/ml

7,7 ng/ml

16,8 ng/ml


Gradientová eluce Mobilní fáze A: 0,05 mM pufr NaH2PO4 o pH 3,0 s H3PO4 Mobilní fáze B: acetonitril

Gradientová eluce Med (14)

Stacionární fáze

Mobilní fáze A: Vodný roztok TFA (0,025%) Mobilní fáze B: acetonitril

C18 5µm (200mm x 2,1mm)

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

FLD Ex 265nm/Em 525nm

UV-VIS 210nm

Gradientová eluce Cereálie (15)

Mobilní fáze A: 10 mM octan amonný (pH 5,0) ve vodě : acetonitril (95:5,v/v) Mobilní fáze B: 10 mM octan amonný (pH 5,0) v acetonitrilu : voda (95:5, v/v)

C18 3,5µm (100mm x 4,6mm)

FLD Ex 268nm/Em 513nm

5.3 Niacin – vitamín B3

5.3.1 Obecné informace Vitamín B3 je název pro kyselinu nikotinovou a její amidovou formu nikotinamid. Častým zdrojem vitamínu B3 bývá maso (hlavně kuřecí játra), ryby, obiloviny, slunečnice, arašídy, hrách, fazole nebo droždí. Niacin podporuje funkci nervové a trávící soustavy (snižuje obsah cho-

Obr. 3 - Niacin

lesterolu tím, že inhibuje sekreci VLDL z jater a zvyšuje aktivitu periferní lipoproteinové lipázy), dále snižuje vysoký krevní tlak a zmírňuje bolesti hlavy. Vyšší dávky potom pomáhají při revmatoidní artritidě a osteoartróze (je zde využit protizánětlivý účinek). Vasodilatační účinky niacinu spolu s vitamínem B6 podporují prokrvení svalů. Při nadbytku však dochází k vasodilataci, pocitu tepla, vyrážkám a poškození jaterních buněk. Denní dávka by měla být u dospělého člověka 13-17 mg. Při nedostatku dochází k narušení trávení, bolestem hlavy, depresím, nespavosti a nemoci zvané pelagra, nemoci tří D (dermatitis, diarea a demence). Niacin je součástí enzymů redoxního systému (NAD, NADP). Není toxický a je tvořen v játrech z aminokyseliny tryptofanu (2,16).

5.3.2 Analýza vitamínu B3 Niacin může být stanoven kulometrickou, mikrobiologickou a HPLC metodou. Kulometrická metoda je založena na Königově rekci, ve které pyridinové deriváty reagují s bromkyanidem a aromatickým aminem sulfanilové kyseliny. Mikrobiologická metoda může být využita pro stanovení volného niacinu použitím selektivního mikroorganismu jako například Lactobacillus casei nebo pro stanovení celkového niacinu použitím Lactobacillus plantarum, který reaguje s nikotinovou kyselinou i nikotinamidem. 18

HPLC stanovení vitamínu B3 je běžně prováděno s iontově-výměnnou chromatografií nebo RP-HPLC s UV detekcí. Fluorescenční detekci lze použít taktéž, ale vyžaduje post-kolonovou derivatizaci, neboť niacin není přirozeně fluorescenční sloučenina (17). Při určování přirozeně se vyskytujícího niacinu v potravinách je potřeba se rozhodnout, zda se má stanovit celkový niacin nebo volný (dostupný) niacin. Ve zralých obilných zrnech existuje velké množství chemicky vázaných forem kyseliny nikotinové, jsou však nutričně nedostupné. Nicméně, v necereálních rostlinných potravinách se vyskytuje především už jako volná kyselina nikotinová. Pojmy "celkový niacin" a "volný niacin" vyskytující se v potravinách jsou definovány extrakčními podmínkami použitými pro danou analýzu. Obecně "celkový niacin" označuje niacin, který se extrahuje autoklávováním vzorku s hydroxidem nebo minerální kyselinou, 0,5 až 1M, zatímco "volný niacin" označuje niacin, který se extrahuje 0,1 M minerální kyselinou (6).

19


Analyzovaný vzorek


NIACIN

Med (14)

B3 Kojenecké mléko (tekutá, prášková forma) (9)

Mobilní fáze

Stacionární fáze

Detekce

C18 3µm

HPLC-MS/MS

(100mm × 2,1mm)

a DAD

LOD

LOQ

4,35 ng/ml

13,17 ng/ml

0,25 µg/ml

0,75 µg/ml

6,5 µg/ml

22,0 µg/ml

47,8 ng/ml

140,9 ng/ml


Gradientová eluce

C18 5µm


(250mm x 4,6mm)

0,05 M octan amonný : MeOH 90:10 (v/v)

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

UV-VIS 254nm

C-CAD



C18 3,5µm

DAD

(100mm x 4,6mm)

260nm

5.4 Kyselina pantothenová – vitamín B5

5.4.1 Obecné vlastnosti Kyselina pantothenová je součást molekuly koenzymu A, který vykonává funkci kofaktoru u mnoha enzymů, přenášející acetylové skupiny. Je nezbytný pro rozklad mastných kyselin, tvorbu sterolů a oxidativní meta-

Obr. 4 - Kyselina pantothenová

bolismus uhlohydrátů. Vitamín B5 najdeme ve všech tkáních a je tepelně nestabilní. Mezi jeho hlavní účinky patří podpora imunity proti infekcím a alergiím tvorbou protilátek, zlepšuje stav při únavovém syndromu či migréně. Mimo to ovlivňuje správnou funkci mozku a jeho komunikaci s nervovým systémem. Působí také proti stresu a též ovlivňuje množství cholesterolu v krvi tím, že snižuje hladinu LDL v cévních stěnách a naopak navyšuje HDL. Dále podporuje trávení a využívá se pro rychlejší hojení ran. Zdrojem kyseliny pantothenové jsou potraviny jako játra, luštěniny, ryby, vaječný žloutek, droždí, zelenina nebo obiloviny. Denní dávka vitamínu B5 je 6 mg, přičemž kofein a alkohol jej poškozují a tím jeho hladiny snižují. Nedostatek je poté provázen poruchami štěpení a syntézy bílkovin, zvýšenou potřebou spánku, dermatologickými projevy jako jsou vyrážky a akné nebo náchylností k infekcím (2,18).

21

5.4.2 Analýza vitamínu B5 Kvantifikaci kyseliny pantothenové lze provést mikrobiologickou metodou s mikroorganismem Lactobacillus plantarum. Jedná se o turbidimetrickou metodu, kdy po inkubaci s mikrobiologickou kulturou vzniká zákal, který se následně hodnotí. Metoda je velmi jednoduchá a levná, ale nevýhodou je časová náročnost. Pro stanovení vitamínu B5 v multivitamínových tabletách a doplňcích stravy typu kojeneckých přípravků se využívá HPLC metoda na reverzní fázi s UV detekcí při 208nm. Nevýhodou je, že v potravinách je mnoho sloučenin, které absorbují při vlnových délkách okolo 200nm, a tudíž je stanovení B5 v různých sloučeninách obtížné. Další možností je jednoduchá iontově výměnná LC metoda s UV detekcí pro stanovení obsahu pantothenové kyseliny v obohacených potravinách (kojenecká výživa, obilné kojenecké potraviny, lékařské potraviny a potravinové doplňky). Fluorescenční detekci pro kvantifikaci kyseliny pantothenové lze využít v případě, že vitamín B5 podlehne hydrolýze na ß-alanin a pantovou kyselinu horkou alkalickou hydrolýzou. ß-alanin následně dál reaguje za vzniku fluorescenční sloučeniny 1-alkylthio-2-alkylisoindolu. Ten je poté detekován při vlnových délkách Em 345nm/Ex 455nm (19). Další možností stanovení je chromatografie spojená s hmotnostním spektrometrem (HPLC-MS). Jedná se o rutinní metodu kvantifikace vitamínu B5 v potravinách, která zahrnuje RP-HPLC metodu, kde jako stacionární fáze byl použit oktadecylsilikagel. Jako mobilní fáze pro metodu LC-MS se dříve používala trifluoroctová kyselina, která byla nahrazena kyselinou mravenčí. Detekce byla provedena s využitím hmotnostního detektoru. Vzorek volného pantothenátu byl získán autoklávováním vodné suspenze potravinového výrobku při 103 °C po dobu 20 minut. Celkový pantothenát byl získán

dalším

zpracováním

s

α-amylázou

22

a

pepsinem

(6).


Analyzovaný vzorek


KYSELINA PANTOTHENOVÁ B5

Med (14) Kojenecké mléko (tekutá, prášková forma) (9) Farmaceutika (injekce, tablety, kapsle, sirupy) (20)

Mobilní fáze

Stacionární fáze

Detekce

C18 3µm

HPLC-MS/MS

(100mm × 2,1mm)

a DAD

LOD

LOQ

7,67 ng/ml

23,25 ng/ml

0,58 µg/ml

1,75 µg/ml

1,7 µg/ml

5,7 µg/ml

2,3 µg/ml

0,7 µg/ml


Gradientová eluce

C18 5µm


(250mm x 4,6mm)


C18 5µm

Gradientová eluce Mobilní fáze A: 0,0125M sůl hexan-1sulfonové kyseliny v 0,1% orthofosforečné kyselině Mobilní fáze B: acetonitril

(250mm x 4,6mm)

UV-VIS 210nm

C-CAD

C18 5µm

UV-VIS

(250mm x 4,6mm)

210nm

5.5 Pyridoxal - vitamín B6

5.5.1 Obecné vlastnosti Vitamín B6 se vyskytuje v 6 základních formách, a to pyridoxin, pyridoxal, pyridoxamin a jejich fosfátové deriváty (pyridoxin

5'-fosfát,

pyridoxal

5'-fosfát

a pyridoxamin 5'-fosfát). Nejvýznamnější formou

je

pyridoxal

5'-fosfát

(PLP),

Obr. 5 - Pyridoxal

který vykonává v organismu roli koenzymu ovlivňující nutriční metabolismus. Ostatní formy se na PLP přeměňují v játrech. Ovlivňuje uvolňování zásob cukrů v játrech a svalech, které jsou přeměněny a slouží jako zdroj energie. Dále hraje roli při produkci červených krvinek, protilátek a hormonů NS – tvorba dopaminu, noradrenalinu, serotoninu či histaminu. Zdrojem pyridoxalu jsou játra, ryby, banány, avokádo, zelenina (květák, špenát, mrkev), vejce, mléko, kvasnice. V nepatrném množství je také produkován střevními bakteriemi. Denní dávka je 1,6 – 2mg. Nedostatek vitamínu B6 se projevuje slabostí, depresemi či například kožními a slizničními onemocněními (2,21).

5.5.2 Analýza vitamínu B6 Vitamín B6 existuje v potravinách jako pyridoxin (nebo též pyridoxol), pyridoxal a pyridoxamin a jejich 5'-fosfátové estery stejně jako pyridoxin glukosid. Bylo vyvinuto mnoho metod pro jeho stanovení. Jednou z možností je tak jako u všech ostatních vitamínu skupiny B mikrobiologická metoda využívající kvasinku Saccharomyces cerevisiae ke stanovení celkového obsahu pyridoxalu v potravinách.

24

Dále je možné použít například HPLC metody s fluorescenčním detektorem pro kvantifikaci všech forem vitamínu B6, které jsou převedeny na vysoce fluoreskující laktonový derivát. Ten je následně měřen RP-HPLC s izokratickou elucí fluorescenčním detektorem s vlnovými délkami Em 430nm/Ex 360nm. Jako mobilní fáze se používá pufr 20 mM fosforečnanu draselného obsahujícího 10% methanol (19). Vitamín B6 se měří jako součet pyridoxinu, pyridoxalu a pyridoxaminu, spolu s jejich fosforylovanými deriváty, glykosylované formy nejsou brány v úvahu. Vitamín se extrahuje z potravy hydrolýzou v kyselém prostředí s 0,1 M kyselinou chlorovodíkovou a je defosforylován enzymaticky. Pyridoxamin se převede na pyridoxal reakcí s kyselinou glyoxylou v přítomnosti Fe2+ a pyridoxal je redukován na pyridoxin působením

borohydridu

sodného

v

25

alkalickém

prostředí

(6).


Analyzovaný vzorek


PYRIDOXAL B6

Farmaceutika (injekce, tablety, kapsle, sirupy) (20) Kojenecké mléko (tekutá, prášková forma) (9) Džus (10)

Mobilní fáze

Stacionární fáze

Detekce

C18 3µm

HPLC-MS/MS

(100mm × 2,1mm)

a DAD

C18 5µm

UV-VIS

(250mm x 4,6mm)

210nm

LOD

LOQ

0,18 ng/ml

0,56 ng/ml

0,3 µg/ml

0,1 µg/ml

3,0 µg/ml

10,0 µg/ml

0,29 ng/ml

0,92 ng/ml


Gradientová eluce Mobilní fáze A: 0,0125M sůl hexan-1sulfonové kyseliny v 0,1% orthofosforečné kyselině Mobilní fáze B: acetonitril

0,05 M octan amonný : MeOH 90:10 (v/v) MeOH : fosfátový pufr 90:10 (v/v) : 0,018M trimethylamin upravený na pH 3,55 pomocí kyseliny fosforečné

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

C-CAD

C18 5µm

HPLC-ED

(250mm x 4,6mm)

Coulochem II

5.6 Biotin – vitamín B7

5.6.1 Obecné vlastnosti Biotin patří mezi tzv. vitageny, které fungují jako zdroje energie pro organismus, tím že se účastní štěpení tuků, cukrů a bílkovin. V malém množství je syntetizován Obr. 6 - Biotin

bakteriemi ve střevech a je přijímám potravou. Ovšem náš organismus

má velmi nízké nároky na jeho množství. Denní dávky vitamínu B7 by měly být v rozmezí 30-60 µg. Biotin slouží zejména jako potravinový doplněk díky jeho pozitivnímu vlivu na vlasy, kůži a nehty. Využívá se k léčbě cukrovky, hlavně diabetes mellitus

II.

typu,

dále

při

terapii

vrozených

poruch

metabolismu

a napomáhá vstřebávání některých vitamínů (B5, B9, B12). Biotin nalezneme v potravinách jako jsou jedlé kaštany, játra, luštěniny, mléko, sója, rýže, vodní meloun, ananas či houby. Nevyhovující je ale konzumace syrových vajec, zejména vaječného bílku, který způsobuje vazbu na avidin za vzniku biotinavidinového komplexu, jenž je biologický neúčinný, a tudíž je odváděn stolicí a dochází k nedostatku biotinu v organismu. Nedostatek vitamínu B7 nastává při poruchách trávení či užíváním antibiotik, nikoli vlivem potravy s výjimkou konzumace vaječných bílků. Projevem bývají letargie, mravenčení končetin, deprese, snížená chuť k jídlu, vypadávání vlasů a vyrážky (3,22).

5.6.2 Analýza vitamínu B7 Nízká koncentrace D-biotinu ve většině potravin a nepřítomnost silných chromoforů v molekule mají takřka vyloučenou jakoukoli citlivou detekci tohoto vitamínu pomocí UV spektrofotometrie. V současné době nejsou k dispozici žádné oficiální LC postupy pro stanovení biotinu.

27

Nejčastěji používanými metodami pro kvantifikaci biotinu o nízkých koncentracích jsou mikrobiologické testy a chromatografické metody. Mikrobiologická metoda využívá například Lactobacillus plantarum, který využívá biotin ke svému růstu a reprodukci. Mikroorganismus se inkubuje s ředěnými extrakty vzorku a vzniklý zákal se měří a hodnotí se výsledný obsah biotinu ve vzorku. Tato metoda je velmi citlivá, ale může postrádat specifitu. Mimo to jsou tyto testy časově náročné. V poslední době je nejběžnější metodou kvantifikace biotinu využívána HPLC metoda s použitím biotin-avidinové interakce či v kombinaci s fluorescenční detekcí po post-kolonové derivatizaci. Fluorescenční derivatizace skupin karboxylových kyselin nabízí užitečný přístup pro stanovení D-biotinu v potravinách (23). Některé hodnocení izotopicky

odborné

obsahu

B7

značeného

studie

též

využívají

v potravinách, biotinu

metodu

tabletách jako

28

a

vnitřního

HPLC-MS/MS premixech

pro

s využitím

standardu

(6).


Analyzovaný vzorek

Mobilní fáze

Stacionární fáze

Detekce

LOD

LOQ

Gradientová eluce Vejce (23)

Mobilní fáze A: Voda s obsahem 0,1% kyseliny mravenčí Mobilní fáze B: MeOH s obsahem 0,1% kyseliny mravenčí

Farmaceutické přípravky nebo doplňky stravy (24)

0,24M vodný roztok kyseliny octové : acetonitril 85:15(v/v)

Mléko

BIOTIN B7

Kojenecké mléko (tekutá, prášková forma) (9)


C18 5µm

HPLC-MS/MS

0,5 ng/ml

(150mm × 2mm)

C18 5µm

Coulometrická

(250mm x 4,6mm)

detekce

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

C-CAD

5 ng/ml

15 ng/ml

4,6 µg/ml

15,2 µg/ml

5.7 Kyselina listová – vitamín B9

5.7.1 Obecné informace Kyselina listová je důležitým vitamínem pro syntézu DNA a obecně nukleových kyselin. Je

nezbytným

činitelem

pro

procesy

s buněčným dělením a při tvorbě červených krvinek. Dále ovlivňuje syntézu a spotřebu ho-

Obr. 7 - Kyselina listová

mocysteinu, což je specifická aminokyselina, která je při vyšších hodnotách rizikovým faktorem vzniku kardiovaskulárních onemocněních. Spolu s vitamínem B6 a B12 se podílí také na přeměně homocysteinu na cystein. Tím vším kyselina listová napomáhá předcházet srdečním a cévním onemocněním. Zdrojem vitamínu B9 je především listová zelenina (špenát, brokolice, kapusta), dále maso, játra, kvasnice, luštěniny a pivo. Denní dávka kyseliny listové je 200µg. V těhotenství jsou však požadovány vyšší hodnoty. Nedostatek je velmi vzácný a podílí se na vzniku megaloblastické anémie, kdy erytrocyty mění svůj tvar, tím že jsou zvětšené a deformované v důsledku čeho ztrácí funkci vázat a přenášet kyslík (3,25).

5.7.2 Analýza vitamínu B9 Foláty se vyskytují pouze v nízkých koncentracích ve většině potravinářských produktů, přičemž 5-methyltetrahydrofolát je nejhojnější forma. Momentálně nejčastější metodou pro stanovení kyseliny listové a folátů je MBA. Stanovení chemických forem folátů obecně zahrnuje několik kroků: - Uvolnění folátů z potravinové matrice - Dekonjugaci z polyglutamátů do monoglutamátů a diglutamátů - Čištění folátů z matrice - Stanovení folátů a / nebo kyseliny listové LC Vzhledem zejména

ke

klíčovými

složitosti kroky

různých příprava 30

přírodních vzorku

forem a

folátů čištění

jsou (6).


Analyzovaný vzorek


Mobilní fáze

KYSELINA LISTOVÁ B9

Kojenecké mléko (tekutá, prášková forma) (9)

Detekce

C18 3µm

HPLC-MS/MS

(100mm × 2,1mm)

a DAD

LOD

LOQ

0,63 ng/ml

1,90 ng/ml

0,15 µg/ml

0,50 µg/ml

5,8 µg/ml

19,0 µg/ml

31,5 ng/ml

106,7 ng/ml


Gradientová eluce Med (14)

Stacionární fáze



C18 5µm (250mm x 4,6mm)

C18 5µm (250mm x 4,6mm)

UV-VIS 210nm

C-CAD



C18 3,5µm

DAD

(100mm x 4,6mm)

284nm

5.8 Kyanokobalamin – vitamín B12

5.8.1 Obecné informace Kyanokobalamin jako jediný vitamín obsahuje ve svém středu kobalt, tudíž má obdobné uspořádání jako hemoglobin, jenž ve svém centru obsahuje železo. Vitamín B12 najde využití při syntéze fosfolipidů buněčných membrán a myelinových pouzder, čím zajišťuje přenos nervových vzruchů a tím udržuje emoční a psychické rozpoložení. Dále se uplatňuje při replikaci

a

tvorbě

DNA,

dělení

buněk

a syntéze ATP jako hlavního zdroje energie. Podporuje dobrou paměť a koncentraci a slouží jako prevence proti vzniku Alzheimerovy choroby a rozvoji aterosklerózy, neboť snižuje

Obr. 8 - Kyanokobalamin

hladinu homocysteinu v organismu. Kyanokobalamin je poškozován alkoholem, antikoncepcí a pilulkami na spaní. Zdrojem jsou potraviny jako maso a vnitřnosti, tedy játra a ledviny, dále ryby, vejce, mléko a sýry. Denní dávka vitamínu B12 je 3 µg. Jeho nedostatek se nejčastěji projeví únavou, mravenčením končetin a bolestmi svalů a kloubů. Dále se mohou vyskytnout deprese a poruchami paměti. Významný nedostatek se může podílet na chudokrevnosti a vzniku myeloblastické anémie (3,26).

32

5.8.2 Analýza vitamínu B12 Vitamín B12 patří do rodiny kobalaminů, kde kyanokobalamin, hydroxykobalamin, adenosylkobalamin a methylkobalamin jsou jeho hlavní formy. V potravinách se běžně stanovuje mikrobiologickými testy (MBA) s využitím Lactobacillus leishmanii jako testovacího organismu. Ačkoli je tento test vysoce citlivý, postrádá specifičnost, neboť některé matrice neaktivních kobalaminů mohou interferovat s růstem mikroorganismu. Další nevýhodou je časová náročnost a nízká přesnost. Dalšími metodami kvantifikace kobalaminů jsou kapilární elektroforéza nebo HPLC v kombinaci s ICP-MS detekcí.

Nejběžnějšími metodou stanovení B12 je

RP-HPLC, tedy vysokoúčinná kapalinová chromatografie s obrácenou fází využívající buď izokratickou či gradientovou eluci s UV detekcí. Byly také popsány postupy například s pomocí LC s MS detekcí a ionizací elektrosprejem (ESI) pro analýzu vitamínu B12 v multivitamínových tabletách či v obohacených potravinových doplňcích. Několik nedávných publikací však nabízí slibné přístupy do budoucna (27).

33


Analyzovaný vzorek Ovoce

Gradientová eluce

(meruňky)

Mobilní fáze A: 0,01% TFA ve vodě Mobilní fáze B: MeOH

(28)

Džus KYANO-

Mobilní fáze

(10)

KOBALAMIN

MeOH : fosfátový pufr 90:10 (v/v) : 0,018M trimethylamin upravený na pH 3,55 pomocí kyseliny fosforečné

Stacionární fáze

Detekce

C18 5µm

DAD

(150mm × 4,6mm)

290nm

C18 5µm

HPLC-ED

(250mm x 4,6mm)

Coulochem II

C18 5µm

PDA

(150mm x 3,9mm)

207nm

C18 5µm

UV

(250mm x 4,6mm)

361nm

LOD

LOQ

0,41 µg/ml

1,22 µg/ml

0,0021 ng/ml

0,007 ng/ml

23 ng/ml

75 ng/ml

2 ng/ml

7 ng/ml

B12 Gradientová eluce Energetické drinky (29)

Mobilní fáze A: MeOH Mobilní fáze B: 0,05M Na2PO4 s obsahem 0,005M sulfonové kyseliny, pH3,0

Maso

0,025% TFA : acetonitril 87:13 (v/v)

(30)

6. Celý postup stanovení na dvou příkladech 6.1 HPLC metoda pro stanovení vitamínu B12 v mase a játrech s detekcí pomocí hmotnostní spektrometrie s indukčně vázaným plazmatem (ICP-MS)

6.1.1 Princip Nejdříve musí dojít k odštěpení vitamínu B12 z peptidu za použití denaturace v slabě kyselém prostředí. Dále se vzorek čistí pomocí extrakce kapalina-kapalina (LLE) a extrakci na reverzní tuhé fázi (SPE). Vitamín B12 se na závěr stanoví za použití HPLC s hmotnostní detekcí. Stanovení vitamínu B12 zahrnuje několik analytických problémů. Analyty, které se vyskytují v potravinářských výrobcích, jsou ve velmi nízkých koncentracích a mají různé chemické formy. K vyhodnocení celkové koncentrace B12 je potřeba stanovit alespoň čtyři nejdůležitější složky: methylkobalamin (MeCbl) adenosylkobalamin (AdoCbl, B12 koenzym) hydroxykobalamin (OHCbl) kyanokobalamin (CNCbl) Všechny složky B12 vykazují velmi nízkou chemickou stabilitu, obzvláště pokud jsou vystaveny světlu, které katalyzuje fotooxidační procesy. MeCbl a AdoCbl ve vodném prostředí (bez kyselin nebo bází) při teplotě 100 °C zcela degradují během 20 minut ve tmě. Světlo snižuje tento čas ještě o další 1 až 2 minuty. Na druhou stranu, kyanokobalamin vykazuje nejvyšší stabilitu ze všech forem B12, je stabilní i pokud je vystaven světlu ve vodném prostředí. Vzhledem k tomu, že MeCbl, AdoCbl a OHCbl jsou velmi nestabilní sloučeniny, jejich určení může být obtížné, někdy přesné stanovení může být až nemožné. Kobalaminy tedy snadno reagují v neutrálním nebo mírně alkalickém médiu s kyanidem sodným (NaCN), kde vytvoří stabilní formu CNCbl. Přeměna kobalaminu na CNCbl zlepšuje také LOQ (mez stanovitelnosti), která je důležitá pokud mají být analyzovány nízké hladiny vitamínu B12 (31).

35

6.1.2 Chromatografické podmínky Analýza byla prováděna na přístroji Shimadzu LC-MS 2020 s ESI zdrojem. Mobilní fáze včetně gradientu a stacionární fáze jsou uvedeny v následující tabulce. Průtok mobilní fáze byl 400 µl/min (31). Tab. 9: Použité mobilní a stacionární fáze (31). Mobilní fáze

Stacionární fáze

Rozpouštědlo A (TFA 0,05%) : rozpouštědlo B (ACN) Kolona 0-5 min. 90% A : 10% B 5-20 min. 70% A : 30 % B 20-30 min. 50% A : 50% B 30-32 min. 90% A : 10% B

COSMOSIL

π-

NAP 3 μm×2 mm×100 mm

6.1.3 Vzorky Testované vzorky masa a jater pocházely z 20-23 měsíců starých krav 10-15 dní po porážce.

6.1.4 Příprava vzorku pro stanovení jednotlivých forem vitamínu B12 50g čerstvě homogenizovaného vzorku masa (nebo 5g hovězích jater) bylo zváženo a převedeno do 250 ml odměrné baňky a smíseno s 200 ml (pro játra s 60 ml) 2,5% octové kyseliny v absolutním ethanolu. Směs byla zhomogenizovaná (tento proces by neměl trvat déle než 30-40s). Baňka byla vyplněna/nasycena argonem, pak těsně uzavřena a zahřáta po dobu 20 minut na teplotu 70°C na vodní lázni. Pak se vzorek zfiltroval a kvantitativně převedl (s ethanolem) do 500 ml varné baňky obalené v hliníkové folii a byl vysušen. Suchá rezidua byla převedena s 10 ml destilované vody do 100ml dělící baňky a bylo třepáno s 50ml ethylacetátu. Po oddělení fází byly 4 ml destilované vody opatrně přidány do dělící nálevky (bez třepání). Spodní fáze byla převedena do 250 ml baňky k centrifugaci. Tento krok byl opakován a zkombinované extrakty byly smíseny s 80 ml acetonu. Baňka byla zahřáta, míchána a centrifugována po 5 minut při 16,800xg a 2°C. Čirý supernatant byl převeden do baňky s kruhovým dnem obalené v hliníkové folii a rotačně odpařen při 35-40°C dokud nevymizela rezidua vody. Zbytek 36

byl kvantitativně převeden s 8ml destilované vody do OASIS HLB WATERS 500 mg 6 ml SPE kolonky. Kolonka byla promyta 8 ml vody 6 ml 5% methanolu. B12 byla eluována pomocí 50% methanolu a sbírána do 25 ml baňky s kruhovým dnem (opět obalené do hliníkové folie) a rotačně odpařena při 30-35°C. Rezidua byla znovu rozpuštěna v 500 μl absolutního ethanolu a kvantitativně převedena do 1ml ethanolu. Ethanol byl odpařen proudem dusíku při 40°C a poté byl vzorek znovu rozpuštěn v 100 μl destilované vody. 20 μl bylo naneseno do HPLC systému. Celá procedura byla prováděna za snížené intenzity světla kvůli riziku rozkladu kobalaminu (31).

6.1.5 Příprava vzorku pro stanovení celkového obsahu vitamínu B12 15g čerstvě homogenizovaného vzorku masa bylo zváženo a převedeno do 250 ml odměrné baňky, smíseno s přebytkem kyanidu sodného (50-80mg) a 100 ml 96% ethanolu. Směs byla zhomogenizovaná (proces by neměl trvat déle než 30-40s). Baňka byla uzavřena a zahřáta po 25 minut na 80°C na vodní lázni a pak byl vzorek zfiltrován, kvantitativně převeden do 250 ml baňky s kruhovým dnem a vysušen. Suchá rezidua byla převedena do 100ml dělící baňky s 10 ml destilované vody. Po fázi oddělení se opatrně přidaly do děličky 4ml destilované vody bez třepání. Spodní fáze byla převedena do 250 ml centrifugační zkumavky. Operace byla opakována a extrakty byly zkombinovány a smíseny s 80 ml acetonu, baňka byla uzavřena, míchána a centrifugována po dobu 5 minut při 16,800xg a 2°C. Čirý supernatant byl převeden do baňky s kruhovým dnem a odpařen dokud nevymizely zbytky vody. Rezidua po odpaření byly kvantitativně převedeny s 8 ml destilované vody do OASIS HLB WATERS 500 mg 6 ml SPE kolonky. Kolonka byla promyta 8 ml vody a 6 ml 10% methanolem. Vitamín B12 byl eluován pomocí 8 ml 50% methanolu, sbírán do 25 ml baňky s kruhovým dnem (obalena hliníkovou folií) a rotačně odpařen při 30-35°C. Rezidua byla znovu rozpuštěna v 500 μl absolutního ethanolu a kvantitativně převedena s 1 ml ethanolu. Ethanol byl odpařen proudem dusíku při 40°C a vzorek byl znovu rozpuštěn v 200 μl destilované vody. 20 μl bylo následně naneseno do systému HPLC. Hlavní rozdíl v přípravě vzorku pro stanovení jednotlivých forem vitamínu B12 a přípravou vzorku pro stanovení celkového obsahu B12 byl v přidání činidla 2,5% kyseliny octové v absolutním ethanolu (pro jednotlivé formy) a činidla kyanidu sodného (pro celkový obsah) (31). 37

6.1.6 Závěr pro stanovení B12 v mase Hlavní formy B12 přítomné v hovězím mase zahrnují adenosinkobalamin (AdoCbl) a v menším množství hydroxykobalamin (OHCbl). Hlavní formy vitamínu B12 v hovězích játrech zahrnují OHCbl, AdoCbl, méně už poté MeCbl a CNCbl.

Obr. 9 - Chromatografická separace studovaných složek vitamínu B12. 1 – MeCbl, 2- CNCbl, 3- AdoCbl, 4- OHCbl (31)

38

Obr. 10 - Chromatografická separace jednotlivých složek vitamínu B12, izolovaných z hovězích jater. 1 – MeCbl, 2- CNCbl, 3- AdoCbl, 4- OHCbl (31)

Výsledky naznačují, že OHCbl je dominantní formou B12 v hovězích játrech (zaujímá 48,2% z celkové stanovené koncentrace). AdoCbl a MeCbl zaujaly 33,8%, a 16,3%. CNCbl zaujal pouze 1,7%. Hladiny B12 v syrovém mase se liší, jsou v rozsahu 2,84 až 3,95 μg/100 g. Ztráty B12 způsobené různými tepelnými úpravami jasně závisí na tepelné úpravě. Grilování a pečení snižuje hladinu na 1,03-1,19 μg/100 g, zatímco u smažení se hladina snížila pouze na 1,48-2,28 μg/100 g. Tepelné zpracování tedy významně snižuje (až o 70%) obsah B12. To odráží nízkou tepelnou stabilitu sloučenin a jejich vysokou rozpustnost ve vodě. Ztráta hmotnosti vzorku v průběhu tepelného zpracování koreluje se ztrátou B12. Nejvyšší ztráty byly pozorovány v průběhu pečení, pravděpodobně vzhledem k vysoké teplotě (180 °C) a době trvání (cca 40 min) procesu. Smažení snížilo obsah B12 v nejmenším rozsahu. Nejvyšší ztráty byly u úpravy grilováním, pravděpodobně proto, že elektrický gril byl pevně přitlačován k celému vzorku masa, zatímco u smažení bylo maso v kontaktu s horkým olejem pouze z jedné strany. Kromě toho, olej zabránil kontaktu smaženého vzorku s kyslíkem a tím kobalaminy byly lépe chráněny před oxidací (31).

39

6.2 HPLC metoda pro separaci vitamínů B v polyvitamínových premixech s UV detekcí

6.2.1 Princip Hlavním zdrojem vitamínů je potrava. Lidská potrava však ne vždy obsahuje množství vitamínů potřebné pro normální vývoj a udržení tělesných funkcí. Proto je nutné obohacení některých potravinářských výrobků a zejména těch, které jsou jediným zdrojem výživy (např. kojenci a klinická výživa), kde je zapotřebí, aby byl zajištěn dostatečný příjem vitamínů. Obohacení potravinářských výrobků vitamíny je obecně dosaženo díky premixům, které obsahují vysokou koncentraci vitamínů. Je tedy potřeba mít rychlé a spolehlivé analytické metody pro regulaci jejich kvality ať už při jejich výrobě nebo například na konci doby použitelnosti přípravků (32).

6.2.2 Chromatografické podmínky Byla použity chromatografické kolony s reverzní fází: Pack Pro (250 mm x 4,6 mm, 5 μm velikost částic, YMC, Evropa, GmbH) Nucleodur pyramid (125 mm × 3 mm, 5 μm velikost částic, Macherey-Nagel, Duren, Německo) Atlantis (250 mm x 4,6 mm, 5 μm velikost částic, Waters, Milford, MA, USA) Pro účely studie byl použit LC systém Agilent 1100 (Agilent Technology Inc., Urdorf, Švýcarsko) s detektorem s diodovým polem (Agilent TechnologyInc., Urdorf, Switzerland). Analýza byla provedena na dvou vlnových délkách: 210 nm pro vitamíny B5, B8 a B12 a 275 nm pro vitamíny B1, B3, B6, B9 a B2. Nástřiky 20 μl vzorku byly injikovány pomocí dávkovacího zařízení Agilent 1100 a chromatografická separace byla prováděna při průtoku 0,8 ml min-1 na koloně Pack Pro a Atlantis a při průtoku 0,25 ml min-1 na koloně Nucleodur. Mobilní fází bylo rozpouštědlo (A), kterou tvoří vodný roztok TFA 0,025% o pH 2,6 a rozpouštědlo (B) acetonitril. Izokratická eluce vitamínů nebyla možná, protože optimální mobilní fáze v nepřítomnosti acetonitrilu umožňuje pouze separaci vitamínů B1, PP. Při vyšších koncentracích organických rozpouštědel (zde byl použit 40% acetonitril), se oddělily vitamíny 40

B2 a B8, zatímco zbytek vitamínů eluoval společně. Z důvodu dosažení oddělení vitamínů na základní linii a zkrácení času celkové analýzy byla použita technika gradientové eluce. Optimální gradient je zaznamenán v následující tabulce (Tabulka č. 10) (32).

Tab. 10: Použité mobilní a stacionární fáze (32). Mobilní fáze Rozpouštědlo A (vodný roztok TFA 0,025% o pH 2,6) : rozpouštědlo B (acetonitril) 0-5 min. 100% A 5-11 min. 25% A : 75 % B 11-19 min. 40% A : 60% B 19 min. a dále 100% A

Stacionární fáze

Pack Pro (250 mm x 4,6 mm, 5 μm velikost částic) Nucleodur pyramid (125 mm × 3 mm, 5 μm velikost částic) Atlantis (250 mm x 4,6 mm, 5 μm velikost částic)

6.2.3 Příprava standardů Multivitamínový zásobní roztok byl připraven navážením 5 mg vitamínu B12, 10 mg vitamínu B8, 12,5 mg vitamínů B2 a B9, 25mg vitamínů B1, B6, PP a 100 mg vitamínu B5 do 100 ml odměrné baňky. Přidalo se 40 ml vody. Roztok se intenzivně třepal a dále se přidalo 4 ml 2M roztoku hydroxidu sodného. Po úplném rozpuštění vitamínů bylo přidáno 50 ml 1 M fosfátového pufru (pH 5,5) a 100 mg vitamínu C. Poté již byl roztok doplněn vodou po značku.

6.2.4 Složení premixů Vybrané premixy se používají k obohacení kojenecké výživy jako mléko nebo produktů na bázi obilovin. Jsou složeny z maltodextrinu a dále obsahují jód, v tucích rozpustné vitamíny (A, D, E, K) a ve vodě rozpustné vitamíny (B1, B2, C, B3, B5, B6, B7, B9 a B12).

6.2.5 Extrakce vitamínů Po homogenizací celého laboratorního vzorku se smísilo 2 g premixu v odměrné 100 ml baňce, 40 ml vody a 4 ml 2M hydroxidu sodného. Suspenze byla intenzivně 41

protřepána. Poté bylo přidáno 50 ml 1M fosfátového pufru (pH 5,5) tak, aby se snížilo pH konečného roztoku na 7. Suspenze byla doplněna vodou po značku a byla vystavena působení ultrazvuku po 10 min v ultrazvukové lázni Bransonic 12 (Carouge, Ženeva, Švýcarsko). Část výsledného roztoku byla odstraněna za kvantifikace vitamínů B5 a B8, zatímco následné ředění 20x nebo 40x vodou bylo použito pro kvantifikaci vitamínů B1, B3, B2, B6 a B9. Roztok byl před samotnou LC- analýzou filtrován přes 0,22 μm filtr (32).

Obr. 11 - LC-UV chromatogram ve vodě rozpustných vitamínů v premixech (32)

42

6.2.6 Souhrn Pomocí této studie byla vyvinuta jednoduchá a rychlá metoda RP-LC metoda pro analýzu vitamínů B1, PP, B6, B5, B9, B2 a B8. Použití metody pro hromadné stanovení ve vodě rozpustných vitamínů v premixech je velmi žádoucí pro kontrolu kvality potravin v potravinářském průmyslu. Navíc, použití mobilních fází, obsahující vodu a acetonitril je plně kompatibilní s MS technikou a umožní charakterizovat degradační produkty vitamínů a i to může přispět k lepšímu porozumění osudu vitamínů v potravinářských produktech (32).

7. Závěr Závěrem lze tedy říci, že HPLC metoda je velmi rozšířená a používaná pro stanovení vitamínů B v potravinách a doplňcích stravy. Postupně nahrazuje metody mikrobiologických testů, které byly zavedeny před více jak 25 lety. Celkově jsem zpracovala přes 31 různých podmínek HPLC stanovení pro různé potraviny (od přírodních produktů jako med nebo maso přes člověkem zhotovené přípravky jako cereálie nebo víno) a doplňky stravy (např. polyvitamínové premixy) v osmi různých vitamínech skupiny B. Z mé rešerše vyplývá, že nejčastěji se používá systém HPLC spojený s UV detekcí, často jsou ale využívány také detektory fluorescenční či detektory s diodovým polem. Z hlediska používaných stacionárních fází jednoznačně nejčastější použití zaujímá u HPLC metody oktadecylsilikagel C18. Do budoucna bude jistě trend v modernizaci metody HPLC pokračovat a tím se bude docilovat rychlejšího a přesnějšího stanovení a tím lepší kompenzace substituovaných vitamínů pro pacienty.

43

Seznam použité literatury (1)

KLOUDA P., Moderní analytické metody, 2. upr. a dopl. vyd., Ostrava, 2003, 132s., ISBN 80-86369-07-2

(2)

LEDVINA M., STOKLASOVÁ A., CERMAN J., Biochemie pro studující medicíny, 2. vyd., Praha: Karolinum, 2009, 546 s., ISBN 978-80-246-1414-4

(3)

HYNIE S., Speciální farmakologie – díl IV Hormony a vitamíny, 2.přeprac.vyd., Praha: Karolinum, 2002, 202 s., ISBN 80-246-0416-7

(4)

GRYGÁRKOVÁ S., Thiamin – vitamín B1, celostnimedicina.cz: Informační server

o

zdraví,

[online],

2009,

[cit.

2015-06-21],

Dostupné

z:

http://www.celostnimedicina.cz/tiamin-vitamin-b1.htm (5)

GRATACÓS-CUBARSÍ M., SÁRRAGA C., CLARIANA M., GARCÍA REGUEIRO J. A., CASTELLARI M., Analysis of vitamin B1 in dry-cured sausages

by

hydrophilic

interaction

liquid

chromatography

(HILIC)

and diode array detection, Meat Science [online], 2011, Volume 87, Issue 3, Pages 234-238, [cit. 2015-04-21], DOI: 10.1016/j.meatsci.2010.10.017, Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030917401000375X (6)

BLAKE CH. J., Analytical procedures for water-soluble vitamins in foods and dietary supplements: a review, Analytical and Bioanalytical Chemistry [online], 2007, Volume 389, Issue 1, Pages 63-76, [cit. 2015-07-14], DOI:

10.1007/s00216-007-1309-9,

Dostupné

z:

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00216-007-1309-9 (7)

SANTOS J., MENDIOLA J. A., OLIVEIRA M. B. P. P., IBÁÑEZ E., HERRERO M., Sequential Determination of fat- and water-soluble vitamins in green leafy vegetables during storage, Journal of Chromatography A, [online], 2012, Volume

1261,

Pages

179-188,

10.1016/j.chroma.2012.04.067,

[cit.

2015-03-30],

Dostupné

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967312006747

44

DOI: z:

(8)

LIDDICOAT C., HUCKER B., LIANG H., VRIESEKOOP F., Thiamin analysis in red wine by fluorescence reverse phase-HPLC, Food Chemistry, [online], [cit.

2015,

2015-07-08],

Volume DOI:

177,

Pages

10.1016/j.foodchem.2015.01.009,

325-329, Dostupné

z:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814615000114 (9)

MÁRQUEZ-SILLERO I., CÁRDENAS S., VALCÁRCEL M., Determination of water-soluble vitamins in infant milk and dietary supplement using a liquid chromatography on-line coupled to a corona-charged aerosol detector, Journal of Chromatography A, [online], 2013, Volume 1313, Pages 253-258, [cit. 2015-0330],

DOI:

10.1016/j.chroma.2013.05.015,

Dostupné

z:


LEBIEDZIŃKA A., MARSZAŁŁ M. L., KUTA J., SZEFER P., Reversedphase high-performance liquid chromatography method with coulometric electrochemical and ultraviolet detection for the quantification of vitamins B1 (thiamine), B6 (pyridoxamine, pyridoxal and pyridoxine) and B12 in animal and plant foods, Journal of Chromatography A, [online], 2007, Volume 1173, Issues 1-2, Pages 71-80, [cit. 2015-04-21], DOI: 10.1016/j.chroma.2007.09.072, Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967307017086

(11)

ARNDT T., Riboflavin, celostnimedicina.cz: Informační server o zdraví, [online],

2008,

[cit.

2015-06-21],

Dostupné

z:

http://www.celostnimedicina.cz/riboflavin.htm (12)

GLISZCZYŃSKA-ŚWIGŁO A., KOZIOŁOWA A., Chromatographic Determination of riboflavin and its derivatives in food, Journal of Chromatography A, [online], 2000, Volume 881, Issue 1-2, Pages 285-297, [cit. 2015-07-15], DOI: 10.1016/S0021-9673(00)00200-4,

Dostupné

z:


ANDRÉS-LACUEVA C., MATTIVI F., TONON D., Determination of riboflavin, flavin mononucleotide and flavin-adenine dinucleotide in wine and other beverages by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection, Journal of Chromatography A, [online], 1998, Volume 823, Issues 1-2, Pages 355-363, [cit. 2015-07-15], DOI: 10.1016/S0021-9673(98)00585-8, Dostupné z: http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967398005858

45

(14)

CIULU M., SOLINAS S., FLORIS I., PANZANELLI A., PILO M. I., PIU P. C., SPANO N., SANNA G., RP-HPLC Determination of water-soluble vitamins in honey, Talanta, [online], 2011, Volume 83, Issue 3, Pages 924-929, [cit. 201503-30],

DOI:

10.1016/j.talanta.2010.10.059,

Dostupné

z:


LANGER S., LODGE J. K., Determination of selected water-soluble vitamins using hydrophilic chromatography: A comparison of photodiode array, fluorescence, and coulometric detection, and validation in a breakfast cereal matrix, Journal of Chromatography B, [online], 2014, Volume 960, Pages 73-81, [cit. 2015-03-30],

DOI:

10.1016/j.jchromb.2014.04.001,

Dostupné

z:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S157002321400230X (16)

GRYGÁRKOVÁ

S.,

Vitamín

B3

-

Niacin,

celostnimedicina.cz:

Informační server o zdraví, [online], 2008, [cit. 2015-06-21], Dostupné z: http://www.celostnimedicina.cz/vitamin-b3--niacin.htm (17)

ROSE-SALLIN Ch., BLAKE Ch. J., GENOUD D., TAGLIAFERRI E. G., Comparison

of

microbiological

and

HPLC

–

fluorescence

detection

methods for Determination of niacin in fortified food products, Food Chemistry, [online], [cit.

2001,

2015-07-25],

Volume DOI:

73,

Issue

4,

Pages

10.1016/S0308-8146(01)00121-2,

473-480,

Dostupné

z:


ARNDT T., Kyselina pantothenová, celostnimedicina.cz: Informační server o zdraví,

[online],

2008,

[cit.

2015-06-21],

Dostupné

z:

http://www.celostnimedicina.cz/kyselina-pantotenova.htm (19)

PREEDY V. R., B Vitamins and Folate: Chemistry, Analysis, Function and Effects, ilustr.vyd., Royal Society of Chemistry, 2012, 855 s., ISBN 978-1-84973369-4

(20)

VIDOVIČ S., STOJANOVIČ B., VELJKOVIČ J., PRAŽIĆ-ARSIĆ L., ROGLIĆ G., MANOJLOVIČ D., Simultaneous determination of some water-soluble vitamins and preservatives in multivitamin syrup by validated stability-indicating high-performance liquid chromatography method, Journal of Chromatography A, [online], [cit.

2008,

2015-04-21],

Volume DOI:

1202,

Issue

2,

Pages

10.1016/j.chroma.2008.06.039,

Dostupné

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0021967308011035 46

155-162, z:

(21)

ARNDT o

zdraví,

T.,

Vitamín

[online],

B6,

celostnimedicina.cz:

2013,

[cit.

Informační

2015-06-21],

server

Dostupné

z:

http://www.celostnimedicina.cz/vitamin-b6.htm (22)

STRUNECKÁ A., PATOČKA J., Biotin – málo známý vitamín, celostnimedicina.cz: Informační server o zdraví, [online], 2011, [cit. 2015-06-21], Dostupné z: http://www.celostnimedicina.cz/biotin-malo-znamy-vitamin.htm

(23)

HÖLLER U., WACHTER F., WEHRLI Ch., FIZET Ch., Quantification of biotin in feed, food, tablets, and premixes using HPLC-MS/MS, Journal of Chromatography B, [online], 2006, Volume 831, Issues 1-2, Pages 8-16, [cit.

2015-07-16],

DOI:

10.1016/j.jchromb.2005.11.021,

Dostupné

z:


ZERZAŇOVÁ A., ŽIŽKOVSKÝ V., KUČERA R., KLIMEŠ J., JESENSKÝ I., DOHNAL J., BARRÓN D., Using of HPLC coupled with coulometric detector for the determination of biotin in pharmaceuticals, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, [online], 2007, Volume 45, Issue 5, Pages 730-735, [cit. 2015-07-16],

DOI:

10.1016/j.jpba.2007.08.010,

Dostupné

z:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0731708507004761 ARNDT T., Kyselina listová, celostnimedicina.cz: Informační server

(25) o

zdraví,

[online],

2012,

[cit.

2015-06-21],

Dostupné

z:

http://www.celostnimedicina.cz/kyselina-listova.htm ŠÁCHA P., Chudokrevnost a vitamín B12, celostnimedicina.cz: Informační

(26)

server

o

zdraví,

[online],

2012,

[cit.

2015-07-08],

Dostupné

z:

http://www.celostnimedicina.cz/chudokrevnost-a-vitamin-b-12.htm (27)

HEUDI O., KILINÇ T., FONTANNAZ P., MARLEY E., Determination of Vitamin B12 in food products and in premixes by reversed-phase high performance

liquid

chromatography and

immunoaffinity

extraction,

Journal

of

Chromatography A, [online], 2006, Volume 1101, Issues 1-2, Pages 63-68, [cit.

2015-04-21],

DOI:

10.1016/j.chroma.2005.09.059,

Dostupné


47

z:

(28)

PŁONKA J., TOCZEK A., TOMCZYK V., Multivitamin analysis of fruits, fruit-vegetable juices, and diet supplements, Food Analytical Methods, [online], [cit.

2012,

Volume

2015-04-12],

DOI:

5,

Issue

5,

Pages

10.1007/s12161-011-9349-3,

1167-1176, Dostupné

z:

http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12161-011-9349-3 (29)

GLISZCZYŃSKA-ŚWIGŁO A., RYBICKA I., Simultaneous Determination of Caffeine and Water-Soluble Vitamins in Energy Drinks by HPLC with Photodiode Array and Fluorescence Detection, Food Analysis Methods, [online], 2015, Volume 8, Issue 1, Pages 139-146, [cit. 2015-07-26], DOI: 10.1007/s12161-0149880-0, Dostupné z: http://link.springer.com/article/10.1007%2Fs12161-0149880-0

(30)

GUGGISBERG D., RISSE M. C., HADORN R., Determination of vitamin B12 in meat products by RP-HPLC after enrichment and purification on an immunoaffinity column, Meat Science, [online], 2012, Volume 90, Issue 2, Pages 279-283, [cit.

2015-07-08],

DOI:

10.1016/j.meatsci.2011.07.009,

Dostupné

z:


SZTERK

A.,

ROSZKO

M.,

MAŁEK

K.,

CZERWONKA

M.,

WASZKIEWICZ-ROBAK B., Application of the SPE reversed phase HPLC/MS technique to determine vitamin B12 bio-active forms in beef, Meat Science, [online], 2012, Volume 91, Issue 4, Pages 408-413, [cit. 2015-07-10], DOI:

10.1016/j.meatsci.2012.02.023,

Dostupné

z:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S030917401200068X (32)

HEUDI O., KILINÇ T., FONTANNAZ P., Separation of water-soluble vitamins

by reversed-phase

ultra-violet

detection:

high performance liquid chromatography with

Application

to

polyvitaminated

premixes,

Journal

of Chromatography A, [online], 2005, Volume 1070, Issues 1-2, Pages 49-56,

[cit.

2015-07-12],

DOI:

10.1016/j.chroma.2005.02.033,

Dostupné


48

z:

STANOVENÍ VITAMÍNŮ B V POTRAVINÁCH A DOPLŇCÍCH STRAVY METODOU HPLC (rešeršní práce)

Recommend Documents