SELEKSI CENDAWAN POTENSIAL PENGHASIL ENZIM ENDOGLUKANASE (KARBOKSIMETIL SELULASE) DAN ISOLASI GEN PENYANDINYA NEO ENDRA LELANA

SELEKSI CENDAWAN POTENSIAL PENGHASIL ENZIM ENDOGLUKANASE (KARBOKSIMETIL SELULASE) DAN ISOLASI GEN PENYANDINYA

NEO ENDRA LELANA

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

SURAT PERNYATAAN Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis yang berjudul Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya adalah karya saya bersama dengan komisi pembimbing dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini.

Bogor, Februari 2009

Neo Endra Lelana NRP P052060101

ABSTRACT NEO ENDRA LELANA. Selection of Potential Fungal for Endoglucanase (Carboxymethyl Cellulase) Producer and Isolation of Its Gene. Supervised by UTUT WIDYASTUTI and NAMPIAH SUKARNO Cellulose is the most renewable resources in the earth. Enzymatic hydrolysis of cellulose can be achieved by synergistic action of three types of cellulase enzyme, namely endoglucanases, exoglucanases/cellobiohydrolases and glucanases. Filamentous fungi, particularly Aspergillus and Trichoderma, are well known as efficient producers of cellulolytic enzymes. The aims of the research were to screen endoglucanases or carboxymethyl cellulase (CMCase) from Aspergillus niger and Trichoderma isolates and to isolate and characterize gene encoding endoglucanase from selected isolate. Fungal isolates were screened by plate screening method in agar medium containing 1% carboxymethyl cellulose with congo red staining and the fungal cellulase activity was measured by dinitrosalicilic acid (DNS) methods from seven days filtrate culture. Trichoderma reesei was used as a standard isolate for cellulase enzyme activity test. Gene encoding endoglucanase of A. niger IPB1, designated eglA, was isolated from RNA to obtain coding sequence (CDS) with RT-PCR using specific primer EAF and EAR. The resulting fragment coding eglA was cloned into pGEM-T Easy plasmid, introduced into E. coli DH5α and sequenced by ABI Prism 310 automated DNA sequencer. Characterization of eglA gene was carried out by using several software programs from webserver that available online. Quantitative assay of cellulolytic activity showed that A. niger IPB1 had highest value of specific activity, 5.74 U/mg, compared to other isolates and standard isolate tested and had been chosen as an isolate for isolation gene encoding endoglucanase. The full length of CDS region of eglA gene from A. niger IPB1 had been successfully isolated and cloned into pGEM-T Easy plasmid. The gene was 720 bp in length and encoding 239 amino acids. The result of BLAST analysis of this gene showed high similarity, 97 (E-value 1.1e-148) - 99% (E-value 3.7e-152 ) , with other A. niger endoglucanases obtained from database. Based on deduced amino acids sequenced, eglA of A. niger IPB1 was a secreted protein belonging to glycoside hydrolase (GH) family 12. This enzyme lacked of carbohydrate binding moduls (CBM). From sequence comparisons with GH12 homolog with known sequence in which the catalytic residue had been identified, the identities of the catalytic nucleophile and the acid-base of eglA A. niger IPB1 were Glu116 and Glu 204, respectively. Glucosyl binding site were Trp (22, 49, 51, 85, 120, 144), Tyr (61, 98, 115) and Phe (163, 179). Phylogeny analysis showed that the eglA of A. niger IPB1 had close relationship with another Aspergillus group. Keywords : endoglucanase, eglA, gene isolation, Aspergillus niger, Trichoderma

RINGKASAN

NEO ENDRA LELANA. Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya. Dibimbing oleh UTUT WIDYASTUTI dan NAMPIAH SUKARNO Selulosa merupakan sumber daya terbarukan yang paling berlimpah di alam. Secara enzimatik, selulosa dapat dihidrolisis oleh kerja sinergis tiga tipe enzim selulase, yaitu endoglukanase, eksoglukanase/selobiohidrolase dan glukosidase. Kelompok cendawan berfilamen, terutama Aspergillus dan Trichoderma diketahui merupakan organisme penghasil selulase yang efisien Penelitian ini bertujuan untuk melakukan skrining terhadap enzim endoglukanase atau karboksimetil selulase (CMCase) dari beberapa isolat Aspergillus niger dan Trichoderma koleksi Bagian Mikologi Departemen Biologi F.MIPA Institut Pertanian Bogor dan Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor serta mengisolasi dan mengkarakterisasi gen penyandi endoglukanase dari isolat cendawan potensial terpilih. Seleksi endoglukanase dilakukan dengan skrining pada media agar CMC menggunakan pewarnaan congo red dan pengujian aktivitas enzim menggunakan metode DNS (asam dinitrosalisilat). T. reesei digunakan sebagai isolat standar dari aktivitas enzim endoglukanase. Isolat potensial terpilih selanjutnya digunakan untuk isolasi gen penyandi endoglukanase. Daerah coding sequence (CDS) diisolasi menggunakan RT-PCR dengan primer spesifik EAF (5’-CTCTAACGCCCAACA TGAAG-‘3) dan EAR (5’-TCTAGAACCCTAGTTGACACTGG-‘3) dari RNA total. Produk amplifikasi yang diharapkan ialah sebesar 743 bp. Gen eglA yang diperoleh selanjutnya diklon ke dalam plasmid pGEMT-Easy dan diintroduksikan ke dalam E. coli DH5α. Hasil klon kemudian di urutkan nukleotidanya dengan ABI Prism 310 automated DNA sequencer dan dikarakterisasi menggunakan beberapa software yang tersedia secara online. Berdasarkan uji kualitatif, A. niger IPB1 menghasilkan nisbah selulolitik lebih besar dari isolat Trichoderma dan beberapa A. niger tetapi lebih kecil dari A. niger KB12 dan A. niger TSR52. Namun uji kuantitatif dengan metode DNS menunjukkan isolat A. niger IPB1 mempunyai aktivitas spesifik tertinggi dibanding isolat-isolat lainnya termasuk T. reesei, yaitu 5.74 U/mg. Isolat ini selanjutnya dipilih untuk dilakukan isolasi terhadap gen penyandi endoglukanasenya. Gen eglA berhasil diisolasi dan di klon ke dalam plasmid pGEM-T Easy. Gen ini terdiri atas 720 bp dan mengkodekan 239 asam amino. Analisis BLAST menunjukkan eglA mempunyai kemiripan yang tinggi, yaitu 97 (E-value 1.1e-148) - 99% (E-value 3.7e-152) dengan endoglukanase A. niger lainnya dari database. Berdasarkan deduksi asam aminonya, eglA termasuk ke dalam famili glikosida hidrolase famili 12. Enzim ini tidak mengandung carbohydrate binding moduls (CBM). Berdasarkan perbandingan struktur homolog dengan struktur endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger maupun pengikatan substratnya dapat dideduksikan. Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Situs pengikatan glikosil

diprediksikan tersusun atas residu Trp (posisi 22, 49, 51, 85, 120, 144), Tyr (61, 98, 115) dan Phe (163, 179). Analisis filogenetik menunjukkan eglA A. niger IPB1 mempunyai kedekatan dengan kelompok Aspergillus lainnya. Kata Kunci : endoglukanase, eglA, isolasi gen, Aspergillus niger, Trichoderma

© Hak cipta milik IPB, tahun 2009 Hak cipta dilindungi undang-undang 1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tesis tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar Institut Pertanian Bogor 2. Dilarang mengumumkan atau memperbanyak sebagian atau seluruh tulisan dalam bentuk apapun tanpa ijin Institut Pertanian Bogor.

SELEKSI CENDAWAN POTENSIAL PENGHASIL ENZIM ENDOGLUKANASE (KARBOKSIMETIL SELULASE) DAN ISOLASI GEN PENYANDINYA

NEO ENDRA LELANA

Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Program Studi Bioteknologi

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009

Judul Penelitian

Nama Mahasiswa NIM

: Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya : Neo Endra Lelana : P052060101

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Utut Widyastuti, MS Ketua

Dr. Ir. Nampiah Sukarno Anggota

Diketahui Ketua Program Studi Bioteknologi

Dekan Sekolah Pascasarjana

Dr. Ir. Muhammad Jusuf, DEA

Prof. Dr. Ir. Khairil A. Notodiputro, MS

Tanggal ujian : 20 Februari 2009

Tanggal lulus :

PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT dimana hanya atas karunia dan ijinNyalah karya ilmiah ini dapat diselesaikan. Penelitian ini mengambil tema Seleksi Cendawan Potensial Penghasil Enzim Endoglukanase (Karboksimetil Selulase) dan Isolasi Gen Penyandinya dan telah dilaksanakan sejak bulan September 2007 sampai bulan Desember 2008. Dalam kesempatan ini penulis ingin mengucakan terima kasih yang tak terhingga kepada : 1. Dr. Utut Widyastuti dan Dr. Nampiah Sukarno selaku pembimbing yang telah memberikan bimbingan dan arahan selama berlangsungnya penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. 2. Dr. Aris Tjahjoleksono selaku penguji luar komisi yang telah memberikan arahan dan masukan dalam penulisan karya ilmiah ini. 3. Departemen Kehutanan atas beasiswa yang diberikan kepada penulis dalam menempuh studi S2 ini. 4. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor atas semua fasilitas laboratoriumnya. 5. Proyek Kerjasama Kemitratan Penelitian Pertanian dengan Perguruan Tinggi (KKP3T) antara Departemen Pertanian dan Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor atas dana penelitiannya. 5. Seluruh staf pengajar di Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB atas segala ilmu yang diberikan, beserta seluruh staf administrasi dan staf laboratorium atas segala bantuannya selama penulis menjalankan tugas belajar di IPB. 6. Ayah-Ibu tercinta, Bapak-Ibu mertua, Istriku Ika Prasasty dan anakku Ahmad Aulya Lathief tersayang, dan seluruh keluarga atas segala dukungan dan kesabaran dalam mendampingi penulis. 7. Teman-teman Program Studi Bioteknologi angkatan 2006 : Pak Heri, Pak Tontowi, Pak Roni, Slamat, Ainun, Devi, Wita, Nia, atas dukungan dan bantuan yang diberikan.

8. Teman-teman Lab. Biorin dan Genetika Molekuler : Pak Ulung, Pak Muzuni, Pak Hadi, Pak Mulya, Rizki, Mbak Pepi, Bu Srilis, Bu Yohana, Bu Ratna, Yulia, Niken, Nindya dan sebagainya atas dukungan yang diberikan. 9. Semua pihak yang tidak dapat penulis sebutkan satu persatu yang telah memberikan bantuan kepada penulis dalam menyelesaikan penelitian ini. Penulis menyadari bahwa tesis ini masih belum sempurna. Namun demikian penulis berharap semoga penelitian ini dapat berguna bagi pihak-pihak yang memerlukannya.

Bogor Februari 2009 Neo Endra Lelana

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukoharjo pada tanggal 6 November 1978 dari pasangan Bapak Banendro dan Ibu Sriyati. Penulis merupakan anak pertama dari empat bersaudara. Tahun 1996 penulis lulus dari SMA Negeri 7 Surakarta dan pada tahun berikutnya lulus seleksi masuk UNS melalui jalur UMPTN dan selesai pada tahun 2002. Tahun 2006 penulis diterima di Program Studi Bioteknologi Sekolah Pascasarjana IPB dengan beasiswa dari Departemen Kehutanan Republik Indonesia. Penulis bekerja sebagai calon peneliti di Pusat Litbang Hasil Hutan sejak tahun 2004 dan ditempatkan di Bogor.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ....................................................................................... xiv DAFTAR GAMBAR ................................................................................... xv DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................ xvii I.

PENDAHULUAN .............................................................................. 1.1 Latar Belakang .......................................................................... 1.2 Tujuan ....................................................................................... 1.3 Hipotesis ....................................................................................

1 1 3 3

II.

TINJAUAN PUSTAKA ..................................................................... 2.1 Selulosa ..................................................................................... 2.2 Enzim Selulase .......................................................................... 2.2.1 Klasifikasi selulase ........................................................... 2.2.2 Struktur organisasi enzim selulase .................................... 2.2.3 Mekanisme hidrolisis oleh selulase ................................... 2.3 Glikosida Hidrolase Famili 12 ................................................... 2.4 Mikroorganisme Penghasil Selulase ........................................... 2.5 Sistem Selulolitik pada Cendawan .............................................

4 4 5 6 7 8 9 10 12

III.

BAHAN DAN METODE ................................................................... 3.1 Waktu dan Tempat ..................................................................... 3.2 Bahan Penelitian ........................................................................ 3.3 Metode ...................................................................................... 3.3.1 Pemeliharaan biakan.......................................................... 3.3.2 Uji aktivitas selulolitik....................................................... 3.3.2.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif ..................... 3.3.2.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif . 3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 ............ 3.3.3.1 Isolasi RNA total ....................................................... 3.3.3.2 Sintesis cDNA total ................................................... 3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA ...................................... 3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA .............................. 3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan ................................ 3.3.3.6 Analisis cDNA sisipan .............................................. 3.3.4 Pengurutan nukleotida dan analisis urutan nukleotida .........

14 14 14 14 15 15 15 16 17 17 18 19 19 20 20 21

IV

HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 4.1 Uji Aktivitas Selulolitik .............................................................. 4.1.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif ............................ 4.1.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif ......... 4.2 Isolasi Gen eglA A. niger IPB1 ................................................... 4.2.1 Isolasi RNA total dari ........................................................ 4.2.2 Sintesis cDNA total ...........................................................

23 23 23 24 25 25 26

4.2.3 Isolasi gen eglA................................................................. 4.2.4 Pengklonan gen eglA......................................................... 4.2.5 Verifikasi pengklonan gen eglA......................................... 4..3 Pengurutan dan Karakterisasi Gen eglA A. niger IPB1................ 4.3.1 Pengurutan gen eglA dan deduksi asam aminonya ............. 4.3.2 Analisis kesejajaran urutan nukleotida eglA dengan database di GenBank.......................................................... 4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA .................................. 4.3.4 Analisis domain EglA........................................................ 4.3.5 Analisis hidrofobisitas EglA .............................................. 4.3.6 Kekerabatan EglA A.niger IPB1 dengan endoglukanase organisme anggota famili GH12 lainnya berdasarkan struktur asam aminonya ..................................................... V.

27 27 28 29 29 30 31 32 34

36

SIMPULAN DAN SARAN ................................................................ 38 5.1 Simpulan ....................................................................................... 38 5.2 Saran ............................................................................................. 38 DAFTAR PUSTAKA ......................................................................... 39

DAFTAR TABEL Halaman 1

Kandungan selulosa dari berbagai sumber .............................................. 4

2

Substrat selulosa dan turunannya ............................................................ 6

3

Nisbah selulolitik isolat A. niger dan Trichoderma setelah 24 jam inkubasi pada suhu ruang ....................................................................... 24

4

Aktivitas CMCase A. niger dan Trichoderma pada suhu 50oC yang dipanen setelah 7 hari inkubasi ............................................................... 25

5

Hasil isolasi RNA total ........................................................................... 26

DAFTAR GAMBAR Halaman 1

Struktur molekuler selulosa (Hilden & Johansson 2004) ......................... 5

2

Mekanisme hidrolisis oleh selulase. (a). Retaining mechanism (b). Inverting mechanism .............................................................................. 9

3

Arsitektur domain famili glikosida hidrolase famili 12 (GH12) .............. 10

4

Sinergisme hidrolisis selulosa oleh selulase non-kompleks (Lynd et al. 2002) ..................................................................................................... 11

5

Skema urutan tahapan penelitian ............................................................ 15

6

Aktivitas selulolitik A. niger yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni setelah inkubasi 24 jam pada suhu ruang....................................................................................................... 23

7

Hasil isolasi RNA total A. niger IPB1 yang diisolasi dari miselium setelah inkubasi 3 hari yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). ........................................................ 26

8

Hasil amplifikasi gen aktin dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 3% (b/v). Lajur 1. Penanda ΦX174RF DNA/HaeIII Fragments ; 2. Gen aktin ................................... 27

9

Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. eglA hasil PCR.............................................................................. 27

10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media selektif yang mengandung ampicilin, X-gal dan IPTG ............................ 28 11 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. eglA hasil PCR.............................................................................. 28 12 Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoRI yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. Plasmid rekombinan yang dipotong; 3. Plasmid rekombinan yang tidak dipotong ................................................ 29 13 Urutan nukleotida eglA A. niger IPB1 dan deduksi asam aminonya ....... 30 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter .. 31

14 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan database pfam ........................................................................................ 32 16 Domain umum cellulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM yang dihubungkan oleh daerah penghubung (linker) ………………….... 33 17 Kesejajaran urutan asam amino empat enzim GH 12. Posisi residu nukleofil dan donor proton ditunjukkan dengan tanda anak panah hitam dan putih secara berturut-turut. ...................................................... 34 18 Profil hidrofobisitas menggunakan skala Kyte & Doolittle (Protscale) .... 35 19 Prediksi segmen transmembran (TMHMM) ........................................... 36 20 Pohon filogenetik beberapa endoglukanase anggota famili GH12............ 37

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1

Kurva standar glukosa dan bovine serum albumin (BSA) ....................... 45

2

Peta plasmid pGEM-T Easy (Promega) .................................................. 46

3

Hasil pengurutan sisipan eglA dengan primer T7 dan SP6 ...................... 47

4

Urutan nukleotida sisipan eglA dan deduksi asam aminonya .................. 51

5

Hasil penyejajaran urutan nukleotida eglA dengan database di GenBank menggunakan program BLAST .............................................. 52

6

Hasil penyejajaran urutan nukleotida eglA dengan database di GenBank menggunakan program BLAST .............................................. 55

7

Matrik kesamaan urutan asam amino gen eglA A . niger dengan gen endoglukanase dari organisme lain ......................................................... 58

8

Matrik jarak urutan asam amino gen eglA A . niger dengan gen endoglukanase dari organisme lain ......................................................... 59

9

Multiple sequence alignment asam amino endoglukanase dari bebrapa organisme anggota famili GH12 ............................................................. 60

I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Biomassa tumbuhan merupakan sumber daya terbarukan yang paling banyak ditemukan di alam. Biomassa ini banyak dihasilkan dari kegiatan di bidang kehutanan, perkebunan dan pertanian, namun demikian sumber daya ini belum termanfaatkan secara optimal. Komponen utama penyusun biomassa tumbuhan adalah selulosa, hemiselulosa dan lignin. Dari ketiga komponen ini, kandungan selulosa adalah yang tertinggi. Selulosa merupakan polimer glukosa yang tersusun dari unit-unit glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-1,4-Dglikosidik (Kroon-Batenburg & Kroon 1997; Saxena & Brown 2005) sehingga hidrolisis selulosa dapat menghasilkan glukosa. Hidrolisis selulosa dapat dilakukan secara kimiawi maupun biologis (enzimatik). Secara kimiawi, selulosa dapat dihidrolisis dengan senyawa asam, sedangkan secara enzimatik oleh enzim selulase. Hidrolisis secara kimiawi dapat mengakibatkan degradasi produk monosakarida yang dihasilkan sehingga produk yang dihasilkan rendah, sedangkan hidrolisis secara enzimatik berjalan secara spesifik dan efisien sehingga produk yang dihasilkan lebih tinggi serta berpotensi menghasilkan produksi monosakarida dengan biaya lebih rendah. Selain berperan dalam hidrolisis selulosa, enzim selulase digunakan juga untuk keperluan dalam berbagai macam industri, seperti industri pulp dan kertas untuk deinking dan modifikasi serat; industri tekstil untuk pelembut katun dan tahap finishing denim; industri deterjen untuk perawatan warna, pembersih dan antideposisi; dan industri makanan sebagai pelunak makanan (Zhang et al. 2006). Bersama-sama dengan hemiselulase kebutuhan selulase mencapai 20% dari total pasar enzim dunia (Coral et al. 2002). Potensi pasar selulase ke depan diprediksi akan meningkat cukup signifikan dengan meningkatnya isu mengenai konversi bahan-bahan selulosa menjadi bioetanol. Enzim selulase diklasifikasikan menjadi tiga tipe, yaitu endoglukanase (endo-β-1,4-glucanase, EC 3.2.1.4), selobiohidrolase atau eksoglukanase (exo-β1,4-glucanase, EC 3.2.1.91) dan glukosidase (β-D-glucoside glucohydrolase, EC 3.2.1.21) (Lynd et al. 2002). Hidrolisis selulosa menjadi glukosa merupakan kerja

secara

sinergis

dari

ketiga

kelompok

enzim

tersebut.

Endoglukanase

menghidrolisis ikatan internal selulosa untuk memproduksi ujung rantai baru, eksoglukanase menghidrolisis ujung rantai selulosa untuk menghasilkan selobiosa atau glukosa, dan glukosidase menghidrolisis selobiosa menjadi glukosa. Hidrolisis selulosa oleh endoglukanase bersifat random sehingga degradasi selulosa dapat berlangsung dengan cepat. Beberapa mikroorganisme mempunyai kemampuan untuk memproduksi enzim selulase. Cendawan merupakan mikroorganisme utama penghasil selulase walaupun beberapa jenis bakteri dan aktinomycetes juga menghasilkannya. Kelompok cendawan berfilamen seperti Aspergillus dan Trichoderma diketahui merupakan penghasil selulase yang efisien (Gielkens 1999) dan saat ini sebagian besar produksi komersial enzim selulase di dunia dihasilkan dari kedua kelompok cendawan tersebut (Kirk et al. 2002). Aktivitas selulase dari A. niger (Hurst 1977; Coral et al. 2002; Onsori et al. 2004), dan Trichoderma (Ross et al. 1983; Gosh et al. 1984) sudah dipelajari dan dikarakterisasi, termasuk beberapa gen yang menyandikannya. Namun demikian aktivitas selulase tersebut menunjukkan variasi yang cukup tinggi pada isolat yang berbeda. Sistem selulolitik pada T. reesei mengandung dua gen yang menyandi selobiohidrolase, cbh1 (Teeri et al.1983) dan cbh2 (Chen et al.1997); empat gen yang menyandi endoglukanase, egl1 (Penttila et al. 1986), egl2 (Saloheimo et al. 1988), egl3 dan egl5 (Saloheimo et al. 1994); dan satu gen yang menyandi glukosidase (Barnett et al. 1991). Sementara itu pada Aspergillus niger, terdiri dari tiga gen yang menyandi endoglukanase, eglA, eglB (van Peij 1998) dan eglC (Hasper et al. 2002) dan dua gen yang menyandi selobiohidrolase, cbhA dan cbhB (Gielkens 1999). Upaya peningkatan efisiensi penggunaan enzim selulase di bidang industri yang meliputi peningkatan produksi, aktivitas, spesifisitas, dan stabilitas pH dan suhu terus dilakukan. Di negara-negara berkembang, pendekatan-pendekatan yang dilakukan masih banyak terfokus pada eksplorasi strain-strain untuk mendapatkan enzim-enzim baru. Namun demikian, seiring perkembangan teknologi genetika molekuler, selain eksplorasi strain cendawan juga dilakukan dengan teknologi DNA rekombinan. Produksi enzim selulase komersial mulai didominasi oleh strain-strain mutan maupun strain hasil rekayasa genetik, seperti T. reesei RUT C

30, CL-847, dan VTT-D yang dihasilkan dari T. reesei QM 6a tipe liar (Howard et al. 2003). Oleh karena itu penyediaan data dan informasi mengenai urutan suatu gen yang menyandikan enzim selulase dan organisasinya sangatlah diperlukan dalam pengembangan teknologi enzim berbasis teknologi DNA rekombinan. Kendala pengembangan industri enzim selulase di Indonesia adalah belum adanya strain lokal yang efektif sehingga penelitian untuk mengeksplorasi strain-strain lokal maupun peningkatan kemampuannya dengan teknologi berbasis genetika molekuler perlu dilakukan. Pada penelitian sebelumnya, Bagian Mikologi Departemen Biologi F.MIPA Institut Pertanian Bogor dan Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor telah memperoleh beberapa isolat cendawan yang mempunyai aktivitas enzim selulase. Namun aktivitas enzim selulase isolat-isolat tersebut belum terkarakterisasi dengan baik. Oleh karena itu perlu penelitian mengenai aktivitas enzim selulase terhadap isolat-isolat koleksi tersebut dengan menggunakan isolat T. reseei sebagai standar aktivitas enzim selulase serta isolasi gen penyandi enzim selulase dari isolat potensial yang dihasilkan.

1.2 Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk: 1. Melakukan skrining terhadap enzim endoglukanase dari beberapa isolat Aspergillus niger dan Trichoderma, dan 2. Mengisolasi

dan

mengkarakterisasi

gen

penyandi

enzim

endoglukanase dari isolat cendawan potensial terpilih.

1.3 Manfaat Manfaat yang dapat diambil dari penelitian ini adalah diperolehnya informasi dasar mengenai aktivitas spesifik enzim endoglukanase cendawan potensial terpilih dan gen yang menyandikannya sebagai dasar dalam pengembangan isolat potensial untuk keperluan industri. .

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Selulosa Selulosa merupakan komponen utama penyusun dinding sel tumbuhan bersama-sama dengan hemiselulosa dan pektin. Komposisi selulosa dalam tumbuhan dapat mencapai 40-50% dari massa tumbuhan sehingga selulosa merupakan biopolimer terbarukan yang paling berlimpah di alam (Milala 2005). Produksi selulosa setiap tahun diperkirakan mencapai 4 x 1010 ton (Coughlan 1985). Selain pada tumbuhan, selulosa juga disintesis oleh berbagai jenis organisme lainnya, seperti bakteri, alga dan cendawan. Kandungan selulosa dari berbagai sumber disajikan pada Tabel 1.

Tabel 1 Kandungan selulosa dari berbagai sumber Sumber

Selulosa (%)

Hemiselulosa (%)

Lignin (%)

45

35

15

32.1

24

18

30

50

15

Kayu keras

40-55

24-40

18-25

Kayu lunak

45-50

25-35

25-35

45

31,4

12

Tongkol jagung Jerami padi Jerami gandum

Rumput

Sumber : Howard et al. (2003)

Selulosa merupakan polimer glukosa yang tersusun dari unit-unit glukosa yang dihubungkan dengan ikatan β-1,4-D-glikosidik. Polimer ini tersusun secara paralel dan berikatan silang membentuk sruktur kristalin yang disebut mikrofibril (Gambar 1). Panjang mikrofibril ini bervariasi dari 2000 - 15.000 unit glukosa, tergantung organismenya (Nieduszynski & Preston 1970). Bentuk mikrofibril selulosa ditentukan oleh kompleks geometri selulosa sintase dan lingkungan lokal. Pada tumbuhan, unit mikrofibril mempunyai lebar sekitar 3 nm dan terdiri dari sekitar 36 rantai selulosa dan seringkali di kemas dalam bentuk lebih besar (Doblin et al. 2002).

Non reducing end

Reducing end Unit Glukosa Unit selobiosa

Gambar 1 Struktur molekuler selulosa (Hilden & Johansson 2004)

Selulosa mempunyai struktur kimia yang sederhana, namun demikian sifat-sifat fisiknya, seperti bentuk kristalin, derajat kristalinitas dan berat molekuler mempunyai variasi yang cukup tinggi. Di alam, kebanyakan selulosa diproduksi sebagai kristalin. Struktur ini terdiri dari dua bentuk yang berbeda, yaitu triclinic cellulose (Iα) dan monoclinic cellulose (Iβ). Kedua bentuk ini dibedakan berdasarkan pengemasan kristal, konformasi molekuler dan pola ikatan hidrogen intramolekuler. Perbedaan ini mungkin berpengaruh terhadap sifat-sifat fisik selulosa. Disamping struktur kristalin, selulosa juga tersusun dari struktur non kristalin (amorf). Jumlah dan perbandingan antara struktur kristalin dan non kristalin ini berbeda-beda tergantung organismenya (Saxena & Brown 2005).

2.2. Enzim Selulase Enzim selulase merupakan salah satu kelompok enzim yang termasuk dalam sistem enzim lignoselulotik yang diproduksi mikroorganisme yang berperan dalam degradasi material sel tumbuhan. Enzim ini termasuk dalam famili glikosida hidrolase (GH). Enzim selulase berperan dalam hidrolisis selulosa

dengan memecah ikatan β-1,4-D-glikosidik untuk menghasilkan oligosakarida maupun glukosa.

2.2.1 Klasifikasi enzim selulase Enzim selulase dapat diklasifikasikan berdasarkan spesifisitas terhadap substrat, mekanisme reaksi atau kemiripan strukturnya. Berdasarkan struktur proteinnya, enzim selulase termasuk ke dalam famili glikosida hidrolase (GH). GH merupakan kelompok enzim yang mempunyai aktivitas memotong ikatan glikosisik antara dua atau lebih karbohidrat. GH diklasifikasikan berdasarkan similaritas urutan dan struktur asam aminonya (Henrissat 1991; Henrissat & Bairoch 1993; Henrissat & Bairoch 1996). Saat ini terdapat 113 famili GH yang dilaporkan secara online di website (http://www.cazy.org.) (Cantarel et al. 2009). Untuk selulase, saat ini tersebar sedikitnya ke dalam 11 famili GH, yaitu famili 59, 12, 26, 44, 45, 48 dan 61.

Tabel 2 Substrat selulosa dan turunannya Substrat Larut dalam air Rantai pendek (DP rendah) Silodekstrin Radio-labelled silodekstrin Turunan silodekstrin β-methyllumberlliferil oligosakarida p-nitrofenol oligosakarida Turunan selulosa dengan rantai panjang Carboxymethylecellulose (CMC) Dyed CMC Tidak larut dalam air Selulosa kristalin – katun, selulosa mikrokristalin (Avicel), selulosa bakteri Selulosa amorf-PASC Dyed cellulose Kromogenik dan turunan fluoreforik Trinitrofenil-karboksimetilselulosa (TNP-CMC) Fluram selulosa α-selulosa Ket: Endo = endoglukanase; Ekso = eksoglukanase; ketiga tipe enzim selulase.

Enzim

Endo, ekso, BG Endo, ekso, BG Endo, ekso, BG Endo, ekso, BG Endo Endo Total, endo, ekso Total, endo, ekso Total, endo Endo Endo, total Total BG = glukosidase; Total =

Aktivitas masing-masing enzim selulase dapat diuji menggunakan berbagai substrat selulosa maupun turunannya. Pada umumnya substrat ini dibagi menjadi dua kategori berdasarkan kelarutannya dalam air, yaitu substrat yang larut dalam air dan substrat yang tidak larut dalam air (Tabel 2). Substrat larut dalam air meliputi selodekstrin dengan DP (degree of polymerization) rendah dari 2 sampai 6 unit gula dan turunannya. Sementara itu substrat tidak larut meliputi selulosa yang hampir murni seperti katun, kertas saring Whatman no.1 dan selulosa bakteri, serta selulosa yang tidak murni seperti α-selulosa. Aktivitas enzim endoglukanase pada umumnya dapat diuji dengan substrat CMC (carboxymethyl cellulose) sehingga enzim endoglukanase juga dikenal dengan istilah

CMCase.

eksoglukanase

Sementara

seringkali

diuji

itu

aktivitas

dengan

enzim

substrat

selobiohidrolase

avicel

sehingga

atau enzim

eksoglukanase disebut juga avicelase (Zhang et al. 2006).

2.2.2 Struktur organisasi enzim selulase Pada umumnya enzim selulase terdiri dari dua domain utama, yaitu domain katalitik dan carbohydrate binding moduls (CBM). Kedua domain ini biasanya dihubungkan oleh suatu penghubung yang pendek dan fleksibel (linker). Domain katalitik merupakan bagian terbesar dari enzim dan merupakan tempat dimana hidrolisis selulosa terjadi. Enzim selulase sedikitnya mempunyai satu domain katalitik dan ukurannya bervariasi tiap organisme, dari yang berukuran pendek seperti CelS Erwinia corotovora (232 AA) sampai yang berukuran panjang seperti CelBb Caldochellum saccharolyticum (1.011 AA) (Gilkes 1991). Carbohydrate binding modul (CBM) sebelumnya dikenal dengan cellulose binding domain. Saat ini CBM diklasifikasikan menjadi 45 famili berdasarkan database CAZy (Hashimoto 2006). Domain CBM merupakan daerah yang miskin asam amino bermuatan, mempunyai kandungan asam hidroksiamino yang tinggi dan mengandung residu-residu Trp, Tyr dan Gly yang terkonservasi (Gilkes 1991). Fungsi utama domain CBM adalah meningkatkan efisiensi katalitik enzim terhadap substrat dengan membawa modul katalitik pada substrat (Hashimoto 2006).

Daerah penghubung (linker) merupakan daerah yang menghubungkan antara CBM dan domain katalitik (Gilkes 1991). Linker mempunyai ukuran yang pendek dan sangat bervariasi, dari 6-59 asam amino. Daerah ini kaya prolin, treonin dan serin. Linker berperan dalam menjaga jarak antara domain katalitik dan CBM. Percobaan yang dilakukan dengan menghilangkan daerah linker pada Cel7A T. reesei menunjukkan penurunan kecepatan degradasi selulosa kristalin secara drastis (Srisodsuk et al. 1993).

2.2.3 Mekanisme hidrolisis oleh selulase Hidrolisis enzimatik ikatan glikosidik oleh golongan glikosil hidrolase biasanya dilakukan melalui katalisis asam atau basa yang memerlukan dua residu, yaitu donor proton (HA) dan nukleofil/ basa (B-). Aktivitas katalitik ini disediakan oleh residu asam aspartat atau glutamat. Terdapat dua mekanisme yang dapat dibedakan, yaitu retaining mechanism dan inverting mechanism (Gambar 2) (Davies & Henrissat 1995). Pada retaining mechanism, reaksi tejadi melalui mekanisme penggantian ganda. Pada tahap pertama, salah satu gugus karboksilat berfungsi sebagai katalis asam yang memprotonisasi oksigen dan secara bersamaan karbon C1 diserang oleh nukleofil (B-) dari gugus karboksilat kedua, menghasilkan bentuk antara enzim-glikosil. Pada tahap kedua, gugus karboksilat pertama sekarang berfungsi sebagai katalis basa yang mengaktifkan molekul air. Aktivasi ini menghasilkan nukleofil yang menghidrolisis bentuk antara enzim-glikosil, menghasilkan produk yang mempunyai stereokimia yang sama dengan substrat. Retaining mechanism ini biasanya terjadi pada dua karboksilat yang berjarak 5.5 Å. Sementara itu, pada inverting mechanism, terjadi pengubahan konfigurasi pada karbon C1 anomerik setelah pemutusan ikatan glikosidik. Reaksi terjadi melalui mekanisme penggantian tunggal. Basa (B-) melakukan deprotonasi molekul air yang kemudian menyerang karbon C1 dari cincin glukosa, menghasilkan pembalikan konfigurasi pada karbon C1 anomerik. Inverting mechanism ini biasanya terjadi pada dua karboksilat yang berjarak antara 6.5-9.5 Å.

(a)

A-

A H

o

O

o

ROH

R B

B-

A-

A

H o

O

H

o H

B

(b)

B-

A-

A H

o

O H

O

5.5 Å

OH

o

ROH

R

10 Å O

H B-

H BH

-

HA = Donor proton; B- = Nukleofil Gambar 2 Mekanisme hidrolisis oleh selulase. (a). Retaining mechanism (b). Inverting mechanism 2.3 Glikosida Hidrolase Famili 12 GH12 merupakan salah satu famili Glikosida hidrolase yang mempunyai aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah retaining dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Berdasarkan database pfam, sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur domain yang berbeda (Gambar 3). Arsitektur pertama hanya terdiri dari domain katalitik famili GH12 (Sandgreen et al. 2003a), arsitektur kedua terdiri dari domain katalitik famili GH12 dan domain CBM2 (Sandgreen et al. 2003b), arsitektur ketiga terdiri dari domain katalitik famili GH12 dan CBM1 (Dean et al. 2005), arsitektur keempat terdiri dari domain katalitik famili GH12 dan risin-β-lektin (Copeland et al. 2006), arsitektur kelima

terdiri dari domain katalitik famili GH12 dan adh short (Birren et al. 2005), arsitektur keenam terdiri dari domain katalitik famili GH12, risin-β-lektin dan famili GH5 (Copeland et al. 2007a), dan arsitektur ketujuh terdiri dari domain katalitik famili GH6, CBM3, fn3, famili GH12 dan CBM2 (Copeland et al. 2007b). (Sandgreen et al. 2003a)

GH5

CBM2

GH5

CBM1

GH5

GH5

(Sandgreen et al. 2003b) (Dean et al. 2005) (Copeland et al. 2006)

risin-β-lektin

GH5

GH5

GH6

(Birren et al. 2005)

adh short

risin-β-lektin

CBM3

(Copeland et al. 2007a)

GH12

Fn3

GH5

(Copeland et al. 2007b)

Gambar 3 Arsitektur domain GH famili 12

2.4 Mikroorganisme Penghasil Enzim Selulase Di alam, enzim selulase banyak dihasilkan oleh berbagai jenis cendawan dan bakteri. Namun demikian beberapa jenis organisme, seperti rayap (Watanabe & Tokuda 2001), remis (Xu et al. 2000) dan arabidobsis (Williamson et al. 2002) juga menghasilkannya. Beberapa contoh genus bakteri yang mempunyai aktivitas selulotik adalah Clostridium, Ruminococcus, Caldicellulosiruptor, Butyrivibrio, Fibrobacter, Cellulomonas, Thermobifida, Cytophaga, dan Sporocytophaga, Sementara itu beberapa genus cendawan yang mempunyai aktivitas selulolitik adalah Bulgaria, Chaetomium, Helotium, Coriolus, Phanerochaete, Poria, Schizophyllum, Serpula, serta Aspergillus, Cladosporium, Fusarium, Geotrichum, Myrothecium, Paecilomyces, Penicillium, dan Trichoderma. Di alam, degradasi selulosa kebanyakan dilakukan oleh mikroorganisme aerobik. Mikroorganisme ini menghasilkan enzim selulase non-kompleks yang

terdiri dari endoglukanase, eksoglukanase dan glukosidase yang bekerja secara sinergis

untuk

menghidrolisis

selulosa

(Gambar

4).

Berbeda

dengan

mikroorganisme aerobik, mikroorganisme anaerobik menghasilkan enzim selulase kompleks yang disebut selulosom (Doi et al. 2003; Bayer et al. 2004). Walaupun mikroorganisme anaerobik hanya menyumbang sekitar 5-10% dari biodegradasi total selulosa di alam, namun peranannya sangat penting, karena bertanggung jawab terhadap degragasi daerah anoksik pada danau, laut, dan saluran pencernaan hewan pemamah biak maupun rayap, yang tidak dapat dilakukan mikroorganisme aerobik (Zhang et al. 2006).

kristalin

amorf

glukosa

kristalin

selobiosa

Selo oligosakarida Endoglukanase

Eksoglukanase

Glukosidase

Eksoglukanase

Gambar 4 Sinergisme hidrolisis selulosa oleh selulase non-kompleks (Lynd et al. 2002)

Kelompok cendawan merupakan agen yang paling baik

dalam

mendekomposisi komponen organik, seperti selulosa, dibandingkan dengan bakteri. Kemampuan hidup dan daya saing yang tinggi (Landecker 1972) menjadikan cendawan lebih berperan dalam proses dekomposisi komponen organik di alam. Disamping itu, cendawan juga dikenal sebagai organisme penghasil selulase yang baik, sehingga banyak digunakan dalam produksi enzim selulase secara komersial. Kelompok cendawan berfilamen seperti Aspergillus dan Trichoderma diketahui merupakan penghasil enzim selulase yang efisien (Gielkens 1999) dan saat ini sebagian besar produksi komersial enzim selulase di dunia dihasilkan dari kedua kelompok cendawan ini.

2.5 Sistem Selulolitik pada Cendawan Cendawan mempunyai sistem selulolitik yang berbeda dengan bakteri. Pada cendawan, enzim selulase diproduksi hanya jika diperlukan sedangkan pada bakteri enzim selulase diproduksi secara terus-menerus (konstitutif). Sistem selulolitik pada cendawan yang paling banyak dipelajari dan saat ini dijadikan model sistem selulolitik cendawan adalah sistem selulolitik pada Trichoderma reesei. Sistem ini mengandung dua gen yang menyandi selobiohidrolase, cbh1 (Teeri et al.1983) dan cbh2 (Chen et al.1997); empat gen yang menyandi endoglukanase egl1 (Penttila et al. 1986), egl2 (Saloheimo et al. 1988), egl3 dan egl5 (Saloheimo et al. 1994); dan satu gen yang menyandi glukosidase (Barnett et al. 1991). Sementara itu pada Aspergillus niger, tiga gen yang menyandi endoglukanase, eglA, eglB (van Peij 1998) dan eglC (Hasper et al. 2002) dan dua gen yang menyandi selobiohidrolase, cbhA dan cbhB (Gielkens 1999), sudah dikarakterisasi. Gen-gen penyandi enzim selulase, pada cendawan maupun bakteri, terletak dalam kromosom. Gen-gen ini biasanya terdistribusi secara acak pada genom dan masing-masing mempunyai elemen regulasi sendiri. Pada umumnya gen-gen ini merupakan multidomain, kecuali beberapa gen seperti EGIII dari T. reesei dan EG28 dari P. chysosporium (Lynd 2002). Sistem ekspresi enzim selulase pada cendawan diregulasi pada tingkat transkripsi dan mekanisme regulasinya sampai saat ini masih belum jelas (Ilmen 1997). Ketika cendawan ditumbuhkan pada media yang mengandung selulosa

sebagai satu-satunya sumber karbon, enzim diekspresikan, sedangkan ketika cendawan ditumbuhkan pada media yang mengandung glukosa, tidak ada ekspresi selulosa. Hal ini menandakan bahwa ekspresi enzim selulase diinduksi oleh selulosa dan dihambat oleh glukosa. Selain selulosa, beberapa molekul lain seperti, laktosa, saporosa, selobiosa, dan selotriosa diketahui dapat menginduksi ekspresi selulase (Kubicek et al. 1993).

III. BAHAN DAN METODE

3.1 Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium BIORIN Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan Bioteknologi Institut Pertanian Bogor dari bulan Agustus 2007 - Desember 2008.

3.2 Bahan Penelitian Bahan yang digunakan adalah beberapa isolat A. niger dan Trichoderma koleksi Bagian Mikologi Departemen Biologi F.MIPA dan Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan Bioteknologi, primer spesifik EAF (5’-CTCTAACGCC CAACATGAAG-‘3) dan EAR (5’-TCTAGAACCCTAGTTGACACTGG-‘3) untuk amplifikasi gen endoglukanase yang didesain menggunakan program Primer3 versi 0.4.0 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm) berdasarkan gen endoglukanase A Aspergillus niger dari GenBank dengan nomor aksesi AJ225451 (posisi primer EAF= basa ke-14 sebelum kodon awal sampai basa ke-3 setelah kodon awal, primer EAR= basa ke-9 sebelum kodon akhir sampai basa ke-11 setelah kodon akhir) dengan produk yang diharapkan sebesar 743 bp, primer ActF (5’-ATGGCAGATGCCGAGGATAT-‘3) dan ActR2 (5’-TCGAGGTCGGCCAA CAATAC-‘3) untuk amplifikasi gen aktin (posisi primer ActF = 20 basa pertama dari ekson 1, primer ActR2 = basa ke 44 – basa ke 63 dari ekson 2) dengan produk yang diharapkan sebesar 123 bp, pGEM-T Easy sebagai vektor pengklonan dan E. coli galur DH5α sebagai inang vektor rekombinan.

3.3 Metode Penelitian dilakukan dalam dua tahap (Gambar 5). Tahap pertama ialah seleksi aktivitas enzim endoglukanase dari beberapa isolat A. niger dan Trichoderma dan dilanjutkan dengan tahap kedua, yaitu melakukan isolasi gen penyandi enzim endoglukanase terhadap isolat potensial terpilih.

3.3.1 Pemeliharaan biakan cendawan Isolat-isolat Aspergillus niger dan Trichoderma dipelihara dalam media agar CMC (carboxymethyl cellulose) dan diinkubasikan pada suhu ruang selama 7 hari yang selanjutnya digunakan sebagai sumber inokulum.

TAHAP I Skrining enzim endoglukanase

Koleksi isolat

TAHAP II Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase

Desain primer

Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase

Uji kuantitatif aktivitas enzim endoglukanase

Isolat potensial terpilih

Isolasi gen penyandi enzim endoglukanase

Sekuensing dan karakterisasi DNA

Gambar 5 Skema urutan tahapan penelitian

3.3.2 Uji aktivitas selulolitik 3.3.2.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif Uji kualitatif aktivitas enzim endoglukanase dilakukan sesuai dengan metode Onsori et al. (2004) yang dimodifikasi dengan mengukur zona bening yang terbentuk pada media agar CMC (CMC 1% (b/v), ekstrak yeast 0.05% (b/v), MgSO4 0.05% (b/v), NaNO3 0.2% (b/v) dan KH2PO4 0.1% (b/v), KCl 0.05% (b/v), agar 1.5% (b/v)). Sebagai standar digunakan isolat Trichoderma reesei yang merupakan standar aktivitas enzim selulase. Secara garis besar metode yang digunakan adalah sebagai berikut. Koloni dengan diameter sepuluh mm dari masing-masing isolat hasil peremajaan diinokulasikan ke dalam media agar CMC. Kultur kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama satu hari. Untuk mengetahui aktivitas selulolitik cendawan, biakan berumur 1 hari diwarnai dengan pewarna

congo red 1 % (b/v) selama 0.5-1 jam, diikuti destaining dengan larutan NaCl 1 M selama 15 menit. Adanya aktivitas enzim endoglukanase ditandai dengan terbentuknya zona bening. Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan. Diameter koloni dan zona bening yang terbentuk diukur. Nisbah selulolitik dihitung menggunakan rumus sebagai berikut:

Nisbah selulotik (R) =

diameter zona - diameter koloni diameter koloni

3.3.2.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif Sebanyak 2 x 106 spora/ml A. niger dan Trichoderma yang diproduksi pada media agar CMC diinokulasikan ke dalam 50 ml media CMC cair dalam erlenmeyer 250 ml (Narashima et al. 2006). Untuk masing-masing isolat digunakan tiga ulangan. Kultur diinkubasi dalam inkubator beragitasi selama 7 hari pada kecepatan 150 rpm. Kultur di panen pada umur 7 hari setelah inokulasi. Pemisahan enzim kasar dari biomassa cendawan dilakukan dengan cara menyaring filtrat kasar cendawan dengan kertas saring. Filtrat yang dihasilkan digunakan sebagai ekstrak kasar enzim. Aktivitas enzim endoglukanase diukur berdasarkan produk gula yang dihasilkan dengan metode DNS (asam dinitrosalisilat) (Ghose 1987). Sebanyak 0.5 ml filtrat (ekstrak kasar enzim) dicampur dengan 0.5 ml CMC 1% (b/v) dalam bufer sitrat 50 mM pH 4,8 dan diinkubasikan selama 30 menit pada suhu 50oC. Reagen DNS sebanyak 3 ml ditambahkan ke dalam tabung reaksi. Setelah itu tabung reaksi dipanaskan dalam air mendidih selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu kamar dan dihitung nilai rapat optis (O.D) pada λ540 nm terhadap blanko. Blanko dibuat dengan mengganti sampel dengan bufer sitrat 50 mM pH 4.8. Hasil pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar glukosa yang telah dibuat untuk mengukur kadar glukosa (Lampiran 1). Unit aktivitas enzim endoglukanase dihitung dengan rumus dibawah ini. Satu unit aktivitas enzim endoglukanase didefinisikan sebagai kemampuan enzim dalam menghasilkan 1µmol glukosa per menit.

Unit =

konsentrasi glukosa (ppm) x faktor pengenceran BM glukosa x V enzim (ml) x waktu

Pengukuran kadar protein total dilakukan dengan metode Lowry (Ghose, 1987). Sebanyak 0.5 ml ekstrak kasar enzim dimasukkan kedalam tabung reaksi dan setelah itu ditambahkan 5 ml reagen C. Reagen C dibuat dengan mencampur 100 ml reagen A (Na2CO3 2% (b/v) dalam NaOH 0.1N) dan 2 ml reagen B (CuSO4.5H2O 0.5% (b/v) dalam K Tartarat 1% (b/v)). Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 10 menit. Setelah itu, ke dalam tabung dimasukkan 0.5 ml Reagen D (reagen folin Ciocalteau yang telah diencerkan dengan air sampai 1N). Tabung kemudian divorteks dan didiamkan pada suhu kamar selama 30 menit. Nilai rapat optis (O.D) setiap isi tabung dibaca dengan menggunakan spektrofotometer pada λ750 nm terhadap blanko. Hasil pengukuran kemudian dimasukkan ke dalam persamaan kurva standar bovine

serum albumin (BSA) yang telah dibuat untuk mengukur kadar protein (Lampiran 1). Selanjutnya aktivitas spesifik enzim dapat ditentukan berdasarkan unit/ml aktivitas enzim dan kadar protein yang didapat dengan rumus sebagai berikut.

aktivitas spesifik (unit/mg) =

aktivitas unit (unit/ml) kadar protein (mg/ml)

3.3.3 Isolasi gen penyandi endoglukanase A. niger IPB1 3.3.3.1 Isolasi RNA total Isolasi asam ribonukleat (RNA) total A. niger IPB1 dilakukan pada biakan yang berumur 3 hari. Miselium dari biakan A. niger IPB1 yang ditumbuhkan pada media cair dipanen. Sebanyak 1 g miselium digerus dengan bantuan nitrogen cair dalam mortal sampai terbentuk bubuk halus, kemudian diekstrak dengan 800 µl reagen TRIzol (Invitrogen). Inkubasi dilakukan selama 5 menit pada suhu ruang, selanjutnya ditambahkan 200 µl kloroform, dibolak-balik selama 30 detik. Campuran diinkubasi selama 3 menit pada suhu ruang, selanjutnya disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 15 menit pada suhu 6oC. Supernatan yang diperoleh dipindahkan ke dalam tabung baru dan ditambahkan 500 µl isopropil alkohol, kemudian diinkubasikan selama 10 menit pada suhu ruang dan disentrifugasi pada 9000 rpm (Jouan BR4i) selama 10 menit pada suhu 6oC. Supernatan dibuang dan endapannya dicuci dengan etanol 75% (v/v) dan

disentrifugasi pada 5700 rpm (Jouan BR4i) selama 5 menit pada suhu 6oC. Endapan yang didapat dikeringkan dengan vakum selama 6 menit dan dilarutkan dalam 20 µl ddH2O yang mengandung diethylpyrocarbonate (DEPC) 0.1% (v/v). Kuantifikasi dilakukan dengan melarutkan 1 µl suspensi RNA total dalam 700 µl air DEPC 0.1% (v/v), selanjutnya dibaca nilai rapat optisnya dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm (Sambrook et al. 1989). Keutuhan RNA dianalisis secara kualitatif menggunakan elektroforesis, dengan memigrasikan RNA pada gel agarosa di dalam bufer morpholinopropanesulfonic

acid (MOPS) 1% (v/v) (4,2 g/l 3-morpholinopropanesulfonic acid (C7H15NO4), 0.41 g/l Na-Asetat, 0.37 g/l Na2EDTA.H2O) pada tegangan 100 volt selama 35 menit. Visualisasi RNA dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip).

3.3.3.2 Sintesis cDNA total Sintesis cDNA total dilakukan melalui proses transkripsi balik. Sebanyak 500 ng RNA total dicampur dengan 4 µl 5x reverse transcriptase (RT) bufer, 1 unit Enzim reverse transcriptase (Invitrogen), 10 pmol primer oligo d(T), 2 µl

dithiothreitol (DTT) (0.1 M), 2 µl dNTPmix 2 mM dan ddH2O DEPC 0.1% steril (konsentrasi final) dalam volume 20 µl. Reaksi transkripsi balik dilakukan pada suhu 30oC selama 10 menit, diikuti oleh suhu 42oC selama 60 menit dan 95oC selama 5 menit. Evaluasi terhadap keberhasilan sintesis cDNA total dilakukan dengan mengamplifikasi gen penyandi aktin dengan menggunakan primer spesifik gen aktin dan cDNA total sebagai cetakannya. Komposisi reaksi PCR (polymerase

chain reaction) ialah 0.75 µl cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 15 pmol dari masing-masing primer

ActF dan ActR2, dimethyl sulfoxide DMSO 4% (v/v) (konsentrasi final) dan ddH2O dengan volume reaksi 15 µl. Reaksi PCR dilakukan dengan kondisi praPCR 95oC selama 5 menit diikuti dengan 30 siklus amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 57oC selama 30 detik, dan polimerisasi 72oC selama 2 menit dan pasca-PCR 72oC selama 5 menit dan pendinginan 15oC selama 5 menit

3.3.3.3 Isolasi fragmen cDNA eglA Fragmen cDNA eglA diisolasi dengan PCR menggunakan primer spesifik gen endoglukanase yang telah didesain. Komposisi PCR ialah 1 µl cDNA total, 1x bufer Taq, 0.25 unit Taq DNA polimerase, 2 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 20 pmol dari masing-masing primer forward dan reverse, DMSO 4% (v/v) (konsentrasi final) dan ddH2O dengan volume reaksi 20 µl. PCR dilakukan dengan kondisi pra-PCR 95oC selama 5 menit

diikuti dengan 30 siklus

amplifikasi yang terdiri dari denaturasi 94oC selama 30 detik, annealing 57oC selama 30 detik, dan polimerisasi 72oC selama 2 menit dan pasca-PCR 72oC selama 5 menit dan pendinginan 15oC selama 5 menit.

3.3.3.4 Pengklonan fragmen cDNA eglA Fragmen cDNA eglA yang telah diisolasi disisipkan ke dalam vektor pengklonan pGEM-T Easy (Promega, Madison, WI, USA) (Lampiran 2) dan diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α. Hasil PCR diligasikan dengan pGEM-T Easy mengikuti petunjuk produsen (Promega) yaitu dengan mencampur 7.5 ng hasil PCR, 10 ng pGEM-T Easy, 0.3 Weiss Unit T4 DNA ligase dan 1x bufer ligasi dengan volume reaksi 10 µl, kemudian diinkubasi pada suhu 4oC selama semalam. Hasil ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α menggunakan metode Suharsono (2002). Metode ini dilakukan dalam dua tahap, yaitu pembuatan sel kompeten dan transformasi bakteri. Sel kompeten dibuat dengan membiakkan koloni tunggal E.coli DH5α dalam 2 ml media LB (LuriaBertani) cair (tripton 1% (b/v), ekstrak yeast 0.5% (b/v), NaCl 1% (b/v)) pada suhu 37oC selama semalam dalam inkubator beragitasi (250 rpm). Sebanyak 100

µl biakan E.coli DH5α kemudian dibiakkan kembali dalam 10 ml media LB cair sampai mencapai OD600=O.5 (densitas sel 4.107 – 7.107 sel/ml. Sebanyak 1.5 ml biakan bakteri diendapkan dengan senrifugasi pada kecepatan 5000 rpm, suhu 4oC selama 10 menit. Endapan bakteri kemudian disuspensikan dalam 600 µl bufer transformasi (TB) (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2.2H2O, 250 mM KCl, 55 mM MnCl2, pH 6,7) dan diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Setelah disentrifugasi pada kecepatan 5000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit, endapan bakteri diresuspensikan dengan 60 µl TB, ditambah 4.2 µl DMSO dan

diinkubasikan dalam es selama 20 menit. Transformasi dilakukan dengan mencampur sel bakteri kompeten yang dihasilkan dengan 10 µl plasmid hasil ligasi dan diinkubasi dalam es selama 30 menit. Campuran kemudian diberikan kejutan panas dengan diinkubasi pada suhu 42oC selama 1 menit dan setelah itu diinkubasikan kembali dalam es selama 5 menit. Campuran kemudian ditambah dengan 200 µl media YT (16 g/l tripton, 10 g/l ekstrak yeast, 5 g/l NaCl, pH 7,0) dan diinkubasikan pada suhu 37oC selama 60 menit. Bakteri kemudian disebar dalam media agar LB yang mengandung 50 µg/ml ampisilin, 10 µl 100 mM isopropiltio-β-galaktosida (IPTG) dan 50 µl 2% (b/v) X-gal (5-bromo-4-chloro-3-

indolyl-β-D-galactoside) dan diinkubasi pada suhu 37oC selama semalam.

3.3.3.5 Seleksi transforman rekombinan E.

coli

DH5α

yang

mengandung

vektor

rekombinan

diseleksi

menggunakan seleksi resistensi terhadap ampisilin dan seleksi biru putih. Koloni yang tumbuh berarti bakteri transforman, sebab E. coli DH5α baru memiliki gen

amp (ketahanan terhadap ampisilin) setelah ditransformasi oleh pGEM-T Easy. Ada dua jenis warna koloni yang tumbuh yaitu koloni biru dan putih. Koloni biru berarti bakteri transforman pGEM-T Easy non rekombinan, sehingga gen lacZ masih utuh dan menghasilkan enzim β-galaktosidase untuk memotong substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Koloni putih berarti bakteri transforman yang mengandung pGEM-T Easy rekombinan, karena gen

lacZ menjadi rusak karena tersisipi oleh fragmen DNA (insertional inactivation) dan tidak akan menghasilkan enzim β-galaktosidase.

3.3.3.6 Analisis cDNA sisipan Analisis cDNA sisipan dilakukan melalui PCR terhadap koloni putih yang dihasilkan dan pemotongan plasmid rekombinan dengan enzim restriksi EcoRI. Koloni putih yang terbentuk digunakan sebagai cetakan untuk reaksi PCR dalam mendeteksi keberadaan gen endoglukanase. Koloni putih diambil dengan tusuk gigi steril kemudian disuspensikan ke dalam 7.42 µl ddH2O dan dipanaskan dalam

waterbath pada suhu 95oC selama 10 menit dan didinginkan dalam es selama 5

menit. Reaksi PCR dilakukan dengan campuran dan kondisi reaksi yang sama dengan isolasi cDNA eglA. Koloni putih yang menghasilkan pita sesuai dengan ukuran fragmen cDNA sisipan setelah PCR terhadap koloni digunakan sebagai bahan untuk isolasi plasmid yang akan dianalisis lebih lanjut. Plasmid diisolasi dari E. coli DH5α transforman rekombinan menggunakan prosedur Suharsono (2002). E. coli ditumbuhkan dalam 2 ml media LB dan diinkubasi dalam inkubator beragitasi (250 rpm) pada suhu 37oC semalam. Kultur bakteri di sentrifugasi dengan kecepatan 12000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Pelet disuspensikan dengan 100 µl coldTEG buffer (50 mM glukosa, 25 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA), ditambahkan 200 µl NaOH/SDS buffer (1 N NaOH, 1% SDS), dibolak-balik perlahan dan diinkubasi dalam es selama 5 menit, selanjutnya ditambahkan 300 µl

icecalsal buffer (3 M NaOAc, 11.5% asam asetat glasial, ddH2O), dihomogenkan dan disimpan dalam es selama 3 menit. Larutan disentrifugasi 12000 rpm pada suhu 4oC selama 10 menit. Supernatan disuspensikan dengan 1x volume PCI (fenol:kloroform:isoamil alkohol (25:24:1)), diinkubasi selama 10 menit pada suhu ruang dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Supernatan ditambah 2x volume etanol absolut, diinkubasi selama 2 jam di freezer dan selanjutnya disentrifugasi 12000 rpm selama 10 menit. Pelet dikeringkan dan kemudian ditambahkan 30 µl ddH2O. RNA didegradasi dengan menambahkan 100 ppm RNAse dan diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit. Plasmid dielektroforesis di agarosa 1% (b/v) dalam bufer TAE 1x (40 mM Tris-asetat, 1 mM EDTA) pada tegangan 100 volt selama 30 menit.

3.3.4 Pengurutan nukleotida dan analisis urutan nukleotida Pengurutan fragmen cDNA eglA dilakukan menggunakan DNA sequencer ABI Prism Model 3100 versi 3.7 di Badan Pengkajian dan Penerapan Teknologi. Urutan nukleotida gen endoglukanase yang dihasilkan dianalisis menggunakan beberapa program yang tersedia. Analisis homologi urutan nukleotida yang dihasilkan terhadap organisme lain dilakukan menggunakan program BLAST2 (basic local alignment search tool) (http://www.ebi.ac.uk/blast2), deduksi asam amino

dilakukan

dengan

menggunakan

program

Translate

Tools

(http://expasy.ch/tools/translate) (Gasteiger et al. 2003), analisis situs pemotongan dilakukan dengan menggunakan program NEBcutter (http://tools.neb.com/ NEBcutter) (Vincze et al. 2003), analisis hidrofobisitas dilakukan dengan menggunakan

program

ProtScale

pada

http://www.expasy.ch/cgi-

bin/protscale.pl dan TMHMM (http://cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0) (Claverie & Notredame 2003; Gasteiger et al. 2003), analisis domain dilakukan dengan menggunakan program Pfscan (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN) (Claverie & Notredame 2003), multiple sequence alignment dilakukan dengan program Tree

based Consistency Objective Function For alignmEnt Evaluation (T-COFFEE) (Notredame et al. 2000), visualisasi multiple sequence alignment dengan program Chroma (Goodstadt & Ponting 2001) dan konstruksi pohon filogenetik dengan program phylogeny inference package (PHYLIP) (http://bioweb.pasteur.fr/ seqanal/phylogeny/phylip-uk.html) dan visualisasi pohon filogenetik dengan program njplot versi 2.3.

IV. HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Uji Aktivitas Selulolitik 4.1.1 Uji aktivitas selulolitik secara kualitatif Aktivitas selulolitik beberapa isolat A. niger dan Trichoderma diuji pada media agar CMC. Adanya aktivitas selulolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni cendawan (Gambar 6). Pewarna Congo Red berinteraksi secara kuat dengan polisakarida yang mengandung ikatan β-(1,4) dan

β-(1,3) glikosidik membentuk kompleks warna-glukan (Teather & Wood 1982). Zona bening yang terbentuk mengindikasikan tidak adanya kompleks warnaglukan akibat terjadinya hidrolisis ikatan glikosidik CMC. Sedangkan daerah yang masih berwarna merah mengindikasikan masih adanya kompleks warna-glukan yang mengindikasikan tidak terjadi hidrolisis substrat CMC. Rata-rata nisbah selulolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat A. niger KB12 sebesar 0.47 dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB12 sebesar 0.02 (Tabel 3). Besarnya nisbah selulolitik ini seringkali tidak berkorelasi dengan besarnya aktivitas selulase. Hal ini kemungkinan disebabkan adanya variasi kecepatan pertumbuhan cendawan.

a

b

Gambar 6 Aktivitas selulolitik yang ditunjukkan dengan terbentuknya zona bening disekeliling koloni setelah inkubasi 24 jam pada suhu ruang. (a) A. niger, (b) Trichoderma.

Tabel 3 Nisbah selulolitik A. niger dan Trichoderma setelah 24 jam inkubasi pada suhu ruang Isolat

Rata-rata diameter koloni (cm)

Rata-rata diameter zona bening (cm)

Aspergillus niger IPB1 A. niger IPB4 A. niger IPB5 A. niger KB12 A. niger TSR12 A. niger TSR13 A. niger TSR52 Trichoderma reesei Trichoderma IPB2 Trichoderma IPB9 Trichoderma IPB11 Trichoderma IPB12

20.25 19.92 20.17 15.67 18.33 17.58 17.75 29.33 30.00 32.67 24.00 33.17

28.08 23.50 23.83 23.00 25.08 21.33 24.50 30.33 31.00 34.17 25.83 34.00

Rata-rata nisbah selulolitik 0.37±0,011 0.18±0,078 0.18±0,019 0.47±0,056 0.37±0,042 0.22±0,076 0.38±0,033 0.03±0,001 0.03±0,001 0.05±0,028 0.08±0,007 0.02±0,007

4.1.2 Uji aktivitas enzim endoglukanase secara kuantitatif Rata-rata aktivitas spesifik tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. niger IPB1 sebesar 5.74 U/mg dan terkecil ditunjukkan oleh isolat Trichoderma IPB2 sebesar 1.31 U/mg (Tabel 4). Beberapa isolat A. niger dan Trichoderma, seperti A. niger IPB1, A. niger TSR52, A. niger IPB5, A niger KB12, A. niger TSR12, A. niger TSR13 menunjukkan aktivitas yang lebih tinggi dibandingkan isolat T. reesei yang merupakan standar aktivitas enzim selulase. Elshafei et al. (1990) melaporkan bahwa aktivitas enzim endoglukanase A. terreus lebih tinggi dibandingkan Trichoderma viride yang merupakan standar aktivitas enzim selulase, sedangkan Pothiraj et al. (2006) melaporkan aktivitas enzim endoglukanase A. niger lebih tinggi dibandingkan A. terraus. Namun demikian pembandingan secara langsung hasil ini sulit dilakukan karena banyaknya faktor yang mempengaruhi, seperti komposisi media dan pemilihan substrat yang dapat mempengaruhi aktivitas enzim (Sharma et al. 1986). Banyak faktor terlibat dalam kinerja suatu enzim, seperti suhu dan pH. Pada penelitian ini digunakan metode yang umum digunakan untuk sistem enzim selulase T. reesei (Ghose 1987) sehinggga tidak menutup kemungkinan aktivitas beberapa isolat A. niger pada uji ini belum mencapai aktivitas optimalnya. Beberapa laporan menunjukkan aktivitas enzim endoglukanase A. niger mempunyai kisaran suhu dan pH yang luas. Suhu optimum aktivitas endoglukanase A. niger dilaporkan berkisar 40oC (Coral et al. 2002) dan 70oC

(Hong et al. 2001). pH optimum aktivitas enzim endoglukanase A. niger dilaporkan berkisar 4.5 dan 7.5 (Coral et al. 2002), antara 6.0 dan 7.0 (Akiba et al. 1995), dan 6.0 (Hong et al. 2001).

Tabel 4 Aktivitas enzim endoglukanase A. niger dan Trichoderma pada suhu 50oC yang diukur setelah 7 hari inkubasi Nama isolat

Rata- rata biomassa (mg)

Rata-rata aktivitas spesifik (U/mg)

42 48 37 45 51 31 41 38 43 47 35 37

5.74±0.58 5.42±0.67 4.96±0.24 4.83±1.01 4.68±0.46 4.30±0.54 3.03±0.42 3.01±0.26 2.73±0.38 2.53±0.59 2.35±0.94 1.31±0.80

A. niger IPB1 A. niger TSR52 A. niger IPB5 A. niger KB12 A. niger TSR12 Trichoderma IPB11 A. niger TSR13 Trichoderma reseei A. niger IPB4 Trichoderma IPB9 Trichoderma IPB12 Trichoderma IPB2

4.2 Isolasi Gen eglA A. niger IPB1 4.2.1 Isolasi RNA total Isolasi RNA total dilakukan pada isolat yang mempunyai aktivitas spesifik tertinggi, yaitu isolat A. niger IPB1. RNA total berhasil diisolasi dari miselium A.

niger IPB1 yang ditumbuhkan dalam medium induksi CMC. Kuantitas RNA total yang dihasilkan berdasarkan pengukuran dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm adalah 176.4 µg tiap gram miselium. Selanjutnya berdasarkan nilai rasio OD260/OD280, yaitu sebesar 1.72, maka RNA total yang dihasilkan mempunyai kemurnian yang cukup tinggi (Tabel 5). Manchester (1996) menyatakan bahwa kemurnian RNA yang tinggi ditunjukkan dengan nilai rasio OD260/OD280 antara 1.8 dan 2.0. Hasil elektroforesis menunjukkan RNA total hasil isolasi mempunyai integritas yang cukup tinggi. Hal ini ditunjukkan dengan adanya dua pita yang dominan, yaitu RNA ribosomal (rRNA) 28S dan 18S (Gambar 7).

Tabel 5 Hasil isolasi RNA total Absorban Bahan Miselium A. niger IPB1

λ260

λ280

0.210

0.122

λ260/ λ280

Total RNA (µg/ g miselium)

1.72

176.4

rRNA 28S rRNA 18S

Gambar 7 Hasil isolasi RNA total A. niger IPB1 yang diisolasi dari miselium setelah inkubasi 3 hari yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v).

4.2.2 Sintesis cDNA total Sintesis cDNA dilakukan menggunakan RNA total yang telah diisolasi sebagai cetakan melalui proses transkripsi balik. Proses ini menggunakan primer oligo(dT) sehingga hanya mRNA yang akan disintesis menjadi cDNA karena adanya ekor poli(A) pada ujung 3’. Sebagai kontrol keberhasilan sintesis cDNA, dilakukan amplifikasi terhadap gen aktin menggunakan primer spesifik (ActF dan

ActR2). Hasil amplifikasi gen aktin dengan cDNA sebagai cetakan menghasilkan satu pita DNA yang berukuran 123 bp (Gambar 8). Hasil ini menunjukkan bahwa sintesis cDNA total telah berlangsung dengan baik. Selain itu, hasil ini juga menunjukkan RNA yang dihasilkan tidak terkontaminasi oleh DNA genom. Adanya kontaminasi oleh DNA akan ditunjukkan dengan adanya dua pita DNA yang dihasilkan, yaitu pita berukuran 123 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi cDNA dan pita berukuran 223 bp yang menunjukkan hasil amplifikasi DNA

genom. Pada DNA genom terdapat intron antara ekson1 dan ekson2 sehingga fragmen yang dihasilkan lebih besar. 1

2

310 bp 194 bp 118 bp

123 bp

Gambar 8 Hasil amplifikasi gen aktin dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 3% (b/v). Lajur 1. Penanda ΦX174RF DNA/HaeIII Fragments; 2. Gen aktin

4.2.3 Isolasi gen eglA Hasil sintesis cDNA selanjutnya digunakan sebagai cetakan untuk mengisolasi gen eglA. Isolasi gen eglA dilakukan dengan amplifikasi menggunakan PCR dengan primer spesifik EAF dan EAR. Amplifikasi gen eglA

A. niger IPB1 menghasilkan pita sekitar 750 bp sesuai dengan hasil prediksi dari database (Gambar 9). 1

1000 bp 750bp

2

750 bp

Gambar 9 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. eglA hasil PCR

4.2.4 Pengklonan gen eglA Gen eglA hasil isolasi disisipkan dalam plasmid pGEM-T Easy, ditengah gen lacZ dengan bantuan enzim ligase. Hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli galur DH5α yang selanjutnya ditumbuhkan dalam media seleksi yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG. Keberhasilan pengklonan gen eglA dapat diketahui dengan terbentuknya koloni putih (Gambar 10).

Koloni E. coli galur DH5α yang dapat tumbuh pada media yang mengandung ampisilin adalah koloni yang mengandung plasmid pGEM-T Easy. Plasmid ini mempunyai gen resistensi ampisilin yang mengekspresikan β-

lactamase yang merusak cincin β-lactame sehingga bakteri yang mengandung plasmid ini dapat hidup dalam media yang mengandung ampisilin. Adanya gen

eglA yang menyisip ke dalam gen lacZ dibuktikan dengan warna koloni yang putih. Gen lacZ merupakan gen yang menyandi β-galaktosidase yang mengubah substrat X-gal yang tidak berwarna menjadi berwarna biru. Adanya penyisipan gen eglA pada gen lacZ mengakibatkan ekspresi gen lacZ terganggu dan βgalaktosidase tidak diekspresikan, sehingga tidak ada perubahan warna pada substrat X-gal dan koloni yang dihasilkan berwarna putih.

Koloni putih Koloni biru

1 ml

Gambar 10 Koloni E. coli hasil transformasi yang ditumbuhkan dalam media selektif yang mengandung ampisilin, X-gal dan IPTG.

1

1000 bp 750 bp

2

750 bp

Gambar 11 Hasil amplifikasi eglA dengan PCR yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. eglA hasil PCR

4.2.5 Verifikasi pengklonan gen eglA Untuk memastikan bahwa sisipan pada gen lacZ adalah gen eglA maka dilakukan verifikasi dengan menggunakan PCR-koloni menggunakan primer

spesifik eglA maupun pemotongan DNA plasmid dengan enzim EcoRI. PCRkoloni pada koloni putih menghasilkan pita yang berukuran sekitar 750 bp yang sesuai dengan ukuran eglA (Gambar 11). DNA plasmid dari koloni putih diisolasi dan selanjutnya di potong dengan menggunakan EcoRI. Enzim ini dipilih karena situs pemotongannya mengapit sisipan sehingga diharapkan pemotongan akan menghasilkan dua pita, yaitu DNA sisipan dan vektor pembawanya. Hasil pemotongan DNA plasmid menunjukkan adanya dua pita yang berukuran sekitar 3000 bp dan 750 bp (Gambar 12). Ukuran sekitar 3000 bp sesuai dengan ukuran pGEM-T Easy, yaitu sebesar 3015 bp, sedangkan ukuran sekitar 750 bp sesuai dengan ukuran produk amplifikasi eglA. Dari dua hasil verifikasi ini dapat dipastikan bahwa DNA yang menyisip dalam gen lacZ plasmid pGEM-T Easy adalah gen eglA A. niger IPB1. 1

2

3

3000 bp

1000 bp 750 bp

vektor

sisipan

Gambar 12 Hasil pemotongan DNA plasmid rekombinan dengan EcoRI yang dideteksi dengan elektroforesis menggunakan gel agarosa 1% (b/v). Lajur 1. Penanda 1 kb; 2. Plasmid rekombinan yang dipotong; 3. Plasmid rekombinan yang tidak dipotong

4.3 Pengurutan dan Karakterisasi Gen eglA A. niger IPB1 4.3.1 Pengurutan gen eglA dan deduksi asam aminonya Pengurutan gen eglA A. niger IPB1 pada pGEM-T Easy dilakukan menggunakan ABI Prism 3100 versi 3.7 dengan primer sp6 dan T7 (Lampiran 4). Dari hasil pengurutan diperoleh gen eglA A. niger IPB1 sebesar 720 bp yang menyandi 239 asam amino (Gambar 13).

Sequence ID : EglA_niger atgaagctccccgtgacacttgctatgcttgcggccaccgccatgggccagacgatgtgc M K L P V T L A M L A A T A M G Q T M C tctcaatatgacagtgcctcgagccccccatattcagtgaaccagaacctctggggcgag S Q Y D S A S S P P Y S V N Q N L W G E taccaaggcaccggcagccagtgtgtatatgtcaacaaactctccagcagtggtgcatcc Y Q G T G S Q C V Y V N K L S S S G A S tggcacaccgaatggacctggagcggtggtgagggaacagtgaaaagctactctaactct W H T E W T W S G G E G T V K S Y S N S ggcgttacatttaacaagaagctcgtgagtgatgtatcaagcatccccacctcggtggaa G V T F N K K L V S D V S S I P T S V E tggaagcaggacaacaccaacgtcaacgccgatgtcgcgtatgatcttttcaccgcagcg W K Q D N T N V N A D V A Y D L F T A A aatgtggaccatgctacttctagcggtgactatgaactgatgatttggcttgcccgctac N V D H A T S S G D Y E L M I W L A R Y ggcaacatccagcccattggcaagcaaattgccacggccacagtgggaggcaagtcctgg G N I Q P I G K Q I A T A T V G G K S W gaggtgtggtatggcagcaccacccaggccggtgcggagcagaggacatacagcttcgtg E V W Y G S T T Q A G A E Q R T Y S F V tcggaaagccctatcaactcatacagtggggccatcaatgcatttttcagctatctcact S E S P I N S Y S G A I N A F F S Y L T cagaaccaaggctttcccgccagctctcagtacttgatcaatctgcagtttggaactgag Q N Q G F P A S S Q Y L I N L Q F G T E gcgttcaccgggggcccggcaaccttcacggttgacaactggaccgccagtgtcaactag A F T G G P A T F T V D N W T A S V N -

Nuk 60

AA 20

120 40 180 60 240 80 300 100 360 120 420 140 480 160 540 180 600 200 660 220 720 239

Gambar 13 Urutan nukleotida eglA A. niger IPB1 dan deduksi asam aminonya

4.3.2 Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1 dengan database di GenBank Analisis kesejajaran urutan nukleotida dan asam amino eglA A. niger IPB1 dengan database di GenBank dilakukan menggunakan program BLAST (Basic

Local Alignment Search Tool). Hasil penyejajaran nukleotida

menunjukkan

sekuen eglA A. niger IPB1 mempunyai kemiripan 99% dengan sekuen 14 dari paten WO2004018662 (E-value 3.7e-152 ), 98% dengan sekuen 1 dari paten WO9713853 (E-value 1.7e-151 ), WO9713862 (E-value 1.7e-151 ), US6190890 (E-

value 1.7e-151 ), US6306635 (E-value 1.7e-151 ), dan 97% dengan sekuen 13 dari paten WO2004018662 (E-value 4.5e-149) dan eglA Aspergillus niger CBS 513.88 (E-value 1.1e-148) yang semuanya merupakan gen endoglukanase dari Aspergillus

niger. Sementara itu hasil penyejajaran urutan asam amino menunjukkan urutan eglA mempunyai kemiripan 99% dengan endoglukanase A atau eglA dari Aspergillus niger A. niger (E-value 7.1e-127) , 87% dengan endoglukanase A atau cekA dari Aspergillus kawachi (E-value 1.9e-126 ), 81% dengan endoglukanase A

dari Aspergillus terreus (E-value 6.9e-113) dan 75% dengan endoglukanase atau

celA dari Aspergillus oryzae (E-value 4.8e-105) (Lampiran 5 dan 6). BLAST merupakan program pencari similaritas suatu urutan nukleotida atau asam amino dengan database yang berbasis local alignment, yaitu penyejajaran pada suatu segmen sekuen yang lebih pendek dengan derajat similaritas yang sangat tinggi. Similaritas mengindikasikan homologi suatu gen atau protein. Jika kedua urutan gen atau protein homolog maka dapat dikatakan bahwa keduanya mempunyai leluhur, fungsi dan struktur yang sama. Dua gen atau fragmen DNA dikatakan homolog jika 70% urutan nukleotidanya atau 25% urutan asam aminonya identik (panjang urutan minimal 100) (Claviere & Notredame 2003). Berdasarkan hal diatas maka dapat dipastikan bahwa eglA merupakan gen

eglA dari Aspergillus niger.

Gambar 14 Peta situs pemotongan eglA dengan menggunakan program NEBcutter

4.3.3 Analisis situs pemotongan gen eglA Analisis situs pemotongan enzim restriksi endoglukanase digunakan untuk membuat peta situs pemotongan enzim restriksi (peta restriksi) pada suatu gen atau fragmen DNA. Peta restriksi ini bermanfaat dalam menentukan enzim-enzim restriksi apa saja yang dapat digunakan dalam kegiatan manipulasi suatu gen atau

fragmen DNA. Pada analisis peta pemotongan gen eglA terlihat tidak terdapat situs pemotongan EcoRI yang digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid pGEM-T Easy sebagai vektornya (Gambar 14). Hasil ini sekaligus dapat digunakan untuk verifikasi keberhasilan pengklonan gen eglA pada plasmid pGEM-T Easy. Selain itu terdapat beberapa situs pemotongan yang terdapat pada gen eglA dan situs pengklonan (MCS) pGEM-T Easy, seperti ApaI, NcoI, PstI dan NsiI, sehingga enzim-enzim ini tidak dapat digunakan untuk mengeluarkan DNA sisipan dari plasmid, karena akan memotong DNA sisipan juga (Gambar 14).

A. niger (Glyco hydro 12: 82-239)

T. reesei (Glyco hydro 12: 81-234)

S. lividans (Glyco hydro 12: 111-261; CBM 2 : 279-378)

B. licheniformis (Glyco hydro 12: 104-261) Gambar 15 Perbandingan domain EglA dari berbagai organisme berdasarkan database pfam

4.3.4 Analisis domain EglA Analisis

domain

EglA

dilakukan

menggunakan

program

Pfscan

berdasarkan database Pfam. EglA memiliki katalitik domain yang termasuk dalam

kelompok Glikosida hidrolase famili 12 (GH12) pada posisi asam amino ke-82 sampai asam amino ke-239 (Gambar 15). Arsitektur EglA A. niger ini sama dengan arsitektur beberapa anggota famili GH12 lainnya, seperti Cel12A T. reesei dan Cel12A B. Licheniformis. Arsitektur jenis ini hanya mengandung katalitik domain dan tidak mengandung carbohydrate binding moduls (CBM). Secara umum, kelompok glikosida hidrolase terdiri dari dua domain utama, yaitu katalitik domain dan carbohydrate binding moduls (CBM) yang dihubungkan oleh suatu linker yang kaya akan prolin (Gambar 16). Posisi domain katalitik maupun domain CBM dapat terdapat pada C-terminal maupun Nterminal. Posisi ini tidak menentukan spesifisitas suatu enzim (Gilkes et al. 1991). Peran domain CBM pada enzim sampai saat ini masih belum jelas. Namun demikian Hashimoto (2006) menyatakan peran utama CBM meningkatkan efisiensi fungsi katalisis enzim-enzim karbohidrase walaupun dengan mekanisme yang belum jelas.

CBM

linker

Catalytic domain

Gambar 16 Domain umum selulase yang terdiri dari domain katalitik dan CBM yang dihubungkan oleh daerah penghubung (linker) GH12 merupakan salah satu famili glikosida hidrolase yang mempunyai aktivitas endoglukanase dan xyloglukan hidrolase. Mekanisme katalisisnya adalah

retaining dengan Glutamat (Glu) sebagai basa nukleofil maupun donor protonnya. Sampai saat ini GH12 mempunyai sekitar 151 anggota dengan 7 arsitektur yang berbeda. Sebagian besar anggota mempunyai arsitektur tanpa domain CBM. Sementara itu arsitektur dengan kombinasi antara katalitik domain dan domain CBM, seperti pada Cel2B S. lividans hanya sedikit. Berdasarkan

perbandingan

struktur

homolog

dengan

struktur

endoglukanase lain yang sudah diketahui, residu-residu yang berperan dalam fungsi katalitik EglA A.niger IPB1 maupun pengikatan substratnya dapat dideduksikan (Gambar 17). Glu116 diprediksi berperan sebagai nukleofil dan Glu204 diprediksi berperan sebagai donor proton. Pada famili GH12, posisi

nukleofil ini berdekatan dengan dua residu yang sangat terkonservasi, yaitu Asp99 dan Met118 (Zechel et al. 1998; Sandgreen et al. 2003). Situs pengikatan glikosil diprediksikan tersusun atas beberapa residu dengan rantai samping aromatik, seperti Trp, Tyr dan Phe (Sandgreen et al. 2003). Mengacu pada beberapa residu yang terlibat dalam pengikatan substrat pada famili GH 12 (Goegedebuur et al 2002), residu Trp (posisi 22, 49, 51, 85, 120, 144), Tyr (61, 98, 115) dan Phe (163, 179) pada A. niger IPB1 diprediksi berperan dalam pengikatan substrat glikosil.

A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans

1 10 20 30 40 50 | | | | | | GQ-TMCSQYDSAS-SPPYSVNQNLWGEYQGTGS-QCVYVNKLSSSGASWHTEWTWSGGEG SS-SNPSDKLYFK-NKKYYIFNNVWGADQVSGWWQTIYHN--SDSDMGW--VWNWPSNTS AQ-TSCDQWATFT-GNGYTVSNNLWGASAGSGF-GCVTAVSL-SGGASWHADWQWSGGQN ADTTICEPFGTTTIQGRYVVQNNRWG---STAP-QCVTATDTGFRVTQADGSAPTNGAPK

A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans

60 70 80 90 100 | | | | | TVKSYSN------------SGVTF-NKKLVSDVSSIPTSVEWKQDNTNVNADVAYDLFTA TVKAYPSIVSGWHWTEGYTAGSGF-PTRL-SDQKNINTKVSYSI-SANGTYNAAYDIWLH NVKSYQN------------SQIAIPQKRTVNSISSMPTTASWSYSGSNIRANVAYDLFTA SYPS---VFNGCHYTN---CSPGTDLPVRLDTVSAAPSSISYGFVDGAV-YNASYDIWLD

A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans

110 120 130 140 150 160 | | | | | | ANVDHAT--SSGDYELMIWLARYGNIQPIGKQIATATVGGKSWEVWYGSTTQAGAE-QRT -NTNKASWDSAPTDEIMIWLNNT-NAGPAGSYVETVSIGGHSWKVYKGYIDAGGGKGWNV ANPNHVT--YSGDYELMIWLGKYGDIGPIGSSQGTVNVGGQSWTLYYGYN----GA-MQV PTA-RT--DGVNQTEIMIWFNRVGPIQPIGSPVGTASVGGRTWEVWSGGN----GS-NDV

A.niger B.licheniformis T.reesei S.lividans

170 180 190 200 210 | | | | | YSFVSESPINSYSGAINAFFSYLTQNQGFPASSQYLINLQFGTEAFTGGPATFTVDNWTA FSFIRTANTQSANLNIRDFTNYLADSKQWLSKTKYVSSVEFGTEVF-GGTGQINISNWDV YSFVAQTNTTNYSGDVKNFFNYLRDNKGYNAAGQYVLSYQFGTEPFTGS-GTLNVASWTA LSFVAPSAISGWSFDVMDFVRA-TVARGLAENDWYLTSVQAGFEPWQNG-AGLAVNSFSS

Gambar 17 Kesejajaran urutan asam amino empat enzim GH 12. Posisi residu nukleofil dan donor proton ditunjukkan dengan tanda anak panah hitam dan putih secara berturut-turut.

4.3.5 Analisis hidrofobisitas EglA Analisis hidrofobisitas dilakukan untuk mengetahui profil hidrofobisitas dari suatu urutan asam amino. Analisis ini digunakan untuk untuk menentukan apakah suatu protein termasuk protein yang larut dalam air atau protein membran (Zhao & London 2006). Profil hidrofobisitas berdasarkan skala Kyte & Doolittle menunjukkan secara keseluruhan EglA mempunyai nilai hidrofobisitas yang

relatif negatif (hidrofilik) sehingga diprediksi kuat merupakan protein yang larut dalam air (Gambar 18). Selain itu terlihat adanya satu segmen transmembran pada N terminal (berdasarkan nilai kepercayaan yang direkomendasikan pada skala Kyte & Doolittle, yaitu 1.6). Adanya satu segmen transmembran pada daerah Nterminal mengindikasikan bahwa protein tersebut disekresikan (Clavarie & Notredame 2003). Hasil ini dikuatkan dengan analisis menggunakan TMHMM (Gambar 19) yang menyimpulkan bahwa EglA A. niger IPB1 merupakan protein di luar sel.

Gambar 18 Profil hidrofobisitas menggunakan skala Kyte & Doolittle (Protscale)

Gambar 19 Prediksi segmen transmembran (TMHMM)

4.3.6 Kekerabatan EglA A.niger IPB1 dengan endoglukanase anggota famili GH12 lainnya berdasarkan struktur asam aminonya. Analisis filogenetik dilakukan untuk menggambarkan hubungan kedekatan gen eglA A. niger IPB1 dengan gen-gen endoglukanase famili GH 12 lainnya. Analisis ini dilakukan dengan membandingkan gen eglA A. niger IPB1 dengan gen lainnya berdasarkan nilai kesamaan sekuennya. Analisis kesamaan EglA

A.niger IPB1 berdasarkan urutan asam aminonya dilakukan terhadap beberapa endoglukanase dari anggota famili GH12. EglA A. niger IPB1 mempunyai kesamaan tertinggi, 99%, dengan endoglukanase A A. niger database. EglA juga menunjukkan kesamaan yang tinggi dengan endoglukanase kelompok Aspergillus lainnya, yaitu 63% dengan A.aculaetus dan 60% dengan A. kawachi. Sementara itu kesamaan eglA A. niger IPB1 dengan kelompok bakteri dan archaea adalah kecil. A. niger IPB1 mempunyai kesamaan 18% dengan S .lividans dan 15% dengan P. furiosus. Kesamaan antar anggota famili GH12 ini merupakan hasil penyejajaran keseluruhan urutan gen GH12 yang meliputi daerah dengan similaritas tinggi dan daerah beragam. Hasil penyejajaran menunjukkan daerah yang mempunyai similaritas tinggi terletak pada domain katalitik sedangkan diluar domain katalitik sangat bervariasi (Lampiran 7).

Pohon

filogenetik

yang

menggambarkan

tingkat

kekerabatan

endoglukanase beberapa anggota famili GH12 dikonstruksi menggunakan program PHYLIP berdasarkan hasil multiple sequence alignment famili GH12 dengan program T-COFFEE yang mempunyai tingkat akurasi tinggi (Edgar & Badzoglou

2006).

Secara

garis

besar,

gen-gen

endoglukanase

terlihat

mengelompok sesuai dengan taksonnya, yaitu bakteri, cendawan dan archaea (Gambar 20). Kelompok cendawan terbagi menjadi tiga subfamili, yaitu subfamili1 yang terdiri dari kelompok Ascomycetes (A. aculeatus, A. kawachi, A.

niger, Fusarium equiseti, Bionectrica ochroleuca, T. viride, T. reesei), subfamili2 yang terdiri dari beberapa kelompok Ascomycetes (A. oryzae dan A. nidulans) dan Oomycetes (Phytophthora sojae dan Phytophthora ramomum), dan subfamili3 terdiri dari kelompok Basidiomycetes (Phanerochaete crhysosporium dan

Polyporus arcularius).

*

Ascomycetes

Fungi

Ascomycetes & Oomycetes

Basidiomycetes

Bakteri

Archaea

Gambar 20 Pohon filogenetik beberapa endoglukanase anggota famili GH12

V. SIMPULAN DAN SARAN

5.1 Simpulan Nisbah selulolitik terbesar ditunjukkan oleh isolat A. niger KB12, diikuti berturut-turut oleh isolat A. niger TSR52, A. niger IPB1 dan A. niger TSR12. Namun demikian isolat A. niger IPB1 menunjukkan aktivitas spesifik tertinggi, yaitu sebesar 5.74 U/mg, dibanding isolat-isolat lainnya. Gen eglA dari A. niger IPB1 berhasil diisolasi dan menunjukkan kesamaan nukleotida yang tinggi dengan endoglukanase dari A. niger dari database. Hasil karakterisasi menunjukkan eglA dari A. niger IPB1 merupakan protein yang disekresikan dan termasuk dalam anggota famili Glikosida Hidrolase famili 12 dengan residu Glu116 dan Glu 204 berturut-turut sebagai nukleofil dan donor proton.

5.2 Saran Aktivitas enzim selulase dipengaruhi oleh banyak faktor, seperti komposisi media dan suhu dan pH optimum. Untuk itu masing-masing isolat A.

niger dan Trichoderma perlu dikarakterisasi untuk mengetahui aktivitas optimumnya. Isolasi dan karakterisasi gen-gen selulase lainnya, seperti eksoglukanase dan glukosidase perlu dilakukan sehingga dapat dilakukan perakitan gen-gen masing-masing tipe selulase yang mempunyai kemampuan terbaik.

DAFTAR PUSTAKA Akiba S, Kimura Y, Kumagai H. 1995. Purification and characterization of protease resistant cellulase from Aspergillus niger. J Ferment Bioeng 79 (2): 125-130. Baker SE. 2006. Aspergillus niger genomics: past, present and into the future. Med Mycol 44, S17-S21. Barnett CC, Berka RM, Fowler T. 1991. Cloning and amplification of the gene encoding an extracellular β-glucosidase from Trichoderma reesei: evidence for improved rates of saccharification of cellulosic substrates. Bio/Technol 9:562–567. Bayer EA, Belaich JP, Shoham Y, Lamed R. 2004. The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall polysaccharides. Annu Rev Microbiol;58:521–54. Birren BW, Lander ES, Galagan JE, Devon K, Nusbaum C, Ma LJ, Jaffe DB, Butler J, Alvarez P, Gnerre S, Grabherr M, Kleber M, Mauceli EW, Brockman W, Rounsley S, Young SK, LaButti K, Pushparaj V, Untereiner W. 2005. Annotation of the Chaetomium globosum CBS 148.51. Broad Institute. Unpublished. Cantarel BL, Coutinho PM, Rancurel C, Bernard T, Lombard V, Henrissat B. 2009. The Carbohydrate-Active EnZymes database (CAZy): an expert resource for Glycogenomics. Nuc Acids Res 37: 233–238. Chen CM, Gritzali M, Stafford DW. 1987. Nucleotide sequence and deduced primary structure of cellobiohydrolase II from Trichoderma reesei. Bio/Technol 5: 274–278. Clavarie JM and Notredame J. 2003. Bioinformatics for Dummies. Wiley Publishing Inc. Copeland A , Lucas S, Lapidus A , Barry K , Detter J C , Glavina del Rio T , Hammon N , Israni S , Dalin E , Tice H , Pitluck S, Zharchuk I, Schmutz J, Larimer F, Land M, Hauser L, Kyrpides N, Mikhailova N, Berry AM, Adney WS, Normand P, Leu D, Pujic P, Richardson P. 2007b. Complete sequence of Acidothermus cellulolyticus 11B. US DOE Joint Genome Institute. Unpublished. Copeland A, Lucas S, Lapidus A, Barry K, Glavina del Rio T, Dalin E, Tice H, Pitluck S, Sun H, Schmutz J, Larimer F, Land M, Hauser L, Kyrpides N, Kim E, Jensen PR, Moore BS, Udwary DW, Richardson P. 2007a. Complete sequence of Salinispora tropica CNB-440. US DOE Joint Genome Institute. Unpublished.

Copeland A, Lucas S, Lapidus A, Barry K, Glavina del Rio T, Dalin E, Tice H, Bruce D, Pitluck S, Jensen P, Richardson P. 2006. Sequencing of the draft genome and assembly of Salinispora arenicola CNS205. US DOE Joint Genome Institute. Unpublished. Coral G, Arikan B, Unaldi MN, Guvenmez H. 2001. Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus niger Z10 wild-type strain. Turk J Biol 26: 209-213. Coughlan M. 1985. Cellulases: production, properties and applications. Biochem Soc Trans 13: 405-406. Dean RA, Talbot NJ, Ebbole DJ, Farman ML, Mitchell TK, Orbach MJ, Thon MR, Kulkarni R, Xu JR, Pan H, Read ND, Lee YH, Carbone I, Brown D, Oh YY, Donofrio N, Jeong JS, Soanes DM, Birren BW. 2005. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nat 434:980-986. Doblin MS, Kurek I, Jacob-Wilk D, Delmer DP. 2002. Cellulose biosynthesis in plants: from genes to rosettes. Plant Cell Physiol 43:1407-1420 Doi RH, Kosugi A, Murashima K, Tamaru Y, Han SO. 2003. Cellulosomes from mesophilic bacteria. J of Bacteriol 185 (20):5907–5914 Edgar RC and Batzoglou S. 2006. Multiple sequence alignment. Curr Opinion in Struc Biol 16:368–373. Elshafei AM, Vega JL, Klasson KT, Clausen EC, Gaddy JL. 1990. Cellulase and hemicellulose formation by fungi using corn stover as a substrate. Biol wastes 32:209-218. Gasteiger E, Gattiker A, Hoogland C, Ivanyi I, Appel RD and Bairoch A. 2003. ExPASy: the proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis Nuc Acids Res 31 (13):3784-3788. Ghose TK. 1987. Measurements of cellulases activity. Pure & Appl Chem 59 (2): 257-268. Ghosh A, Ghosh BK, Vasquez HT, Eveleigh DE, Montenecourt BS. 1984. Cellulase secretion from a hyper cellulolytic mutant of Trichoderma reesei Rut-C30. Arch of Microbiol 140:126-133. Gielkens MMC, Dekkers E, Visser J, Graaf LH. 1999. Two cellobiohydrolasesencoding genes from Aspergillus niger require D-xylose and the xylanolytic transcriptional activator XlnR for their expression. Appl Environ Microbiol 65 (10):4340-4345.

Gilkes NR, Henrissat B, Kilburn DG, Miller RC, Warren RAJ. 1991. Domains in microbial β-1,4-Glycanases: sequence conservation, function, and enzyme families. Microbiol Rev 55 (2):303-315. Goedegebuur F, Fowler T, Phillips J, van der Kley P, van Solingen P, Dankmeyer L, Power SD. 2002. Cloning and relational analysis of 15 novel fungal endoglucanases from family 12 glycosyl hydrolase. Curr Genet 41:89–98. Goodstadt L, Ponting CP. 2001. Chroma:Consensus based-colouring of multiple alignment for publication. Bioinformatic appl note 17 (9):845-846. Han SJ, Yoo YJ, Kang HS. 1995. Characterizatin of bifunctional cellulase and its structural gene. J Biol Chem 270 (43):26012-26019. Hashimoto H. 2006. Recent structural studies of carbohydrate-binding modules Cell Mol Life Sci 63:2954–2967. Hasper AA, Dekker E, van Mil M, van de Vondervoort PJI, de Graaff LH. 2002. EglC, a new endoglucanase from Aspergillus niger with major activity towards xyloglucan. Appl Environ Microbiol 68 (4):1556-1560. Henrissat B, Bairoch A. 1993 New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J 293:781– 788. Henrissat B, Bairoch A. 1996. Updating the sequence-based classification of glycosyl hydrolases. Biochem J 316:695–696. Henrissat B. 1991. A classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochem J 280:309–316. Hilden L, Johansson G. 2004. Recent developments on cellulases and carbohydrate binding modules with cellulose affinity. Biotechnol Lett 26: 1683-1693 Hong J, Tamaki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumaga H. 2001. Cloning of a gene encoding highly stable endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast. J Biosci Bioeng 92 (5):434-441. Howard, RL, Abotsi E, Jansen van Rensburg EL, Howard S. 2003. Lignocellulose biotechnology: issue of bioconversion and enzyme production. African J of Biotechnol 2 (12):602-612. Hurst PL, Nielsen J, Sullivan PA, Shepperd MG. 1977. Purification and properties of a cellulase from Aspergillus niger. Biochem J 165:33-41.

Ilmen M, Saloheimo A, Onella ML, and Pentilla ME. 1997. Regulation of cellulase gene expression in the filamentous fungus Trichoderma reesei. Appl Environ Microbiol 63 (4):1298-1306. Kirk O, Borchert TV, Fuglsang CC. 2002. Industrial enzymes applications. Curr Opin Biotechnol 13: 345-351. Kroon-Batenburg LMJ, Kroon J. 1997. The crystal and molecular structures of cellulose I and II. Glycoconjugate J 14:677-690. Kubicek CP, Messner R, Gruber F, Mandels M, and Kubicek-Pranz EM. 1993. Triggering of cellulase biosynthesis by cellulose in Trichoderma reesei. Involvement of a constitutive, sophorose-inducible, glucose-inhibited betadiglucoside permease. J Biol Chem 268:19364-19368. Landecker EM. 1972. Fundamental of the Fungi. Prentice Hill Mc. New York University. Lynd, LR, Weimer PJ, van Zyl WH, and Pretorius IS. 2002. Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnology. Microbiol and Mol Biol Rev 66 (3):506-577. Manchester KL. 1996. Use of UV methods for measurement of protein and nucleic acid concentrations. Bio/Techol 20:968-970. Milala MA, Shugaba A, Gidado A, Ene AC and Wafar JA. 2005. Studies on the Use of Agricultural Wastes for Cellulase Enzyme Production by Aspegillus niger. Res J of Agric and Bio Sci 1(4):325-328. Narasimha G, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajasekhar RB. 2006. Nutrient effects on production of cellulolytic enzymes by Aspergillus niger. African J of Biotechnol 5 (5):472-476. Nieduszynski IA, Preston RD. 1970. Crystallite size in natural cellulose. Nat 225:273-274. Notredame C, Higgins DG, Heringa J. 2000. T-Coffee: a novel method for fast and accurate multiple sequence alignments. J Mol Bio 302:205-217. Onsori H, Zamani MR, Motallebi M, Zarghami N. 2004. Identification of over producer strain of endo-β-1,4-glucanase in Aspergillus species: Characterization of crude carboxymethyl cellulase. African J of Biotechnol 4 (1): 26-30. Penttila M, Lehtovaara P, Nevalainen H, Bhikhabhai R, Knowles J. 1986. Homology between cellulase genes of Trichoderma reesei: complete nucleotide sequence of the endoglucanase I gene. Gene 45:253–263.

Pothiraj C, Balaji P, Eyini M. 2006. Enhanced production of cellulases by various fungal cultures in solid state fermentation of cassava waste. African J of Bacteriol 5 (20):1882-1885. Ross A, Schugerl A, Scheidingh W. 1983. Cellulase production from Trichoderma reesei. Eur J Microbiol Biotechnol 18:29-37. Saloheimo A, Henrissat B, Hoffre´n AM, Teleman O, Penttila M. 1994. A novel, small endoglucanase gene, egl5, from Trichoderma reesei isolated by expression in yeast. Mol Microbiol 13:219–228. Saloheimo M, Lehtovaara P, Penttila M, Teeri TT, Stahlberg J, Johansson G, G Pettersson, Claeyssens M, Tomme P, Knowles J K C. 1988. EGIII, a new endoglucanase from Trichoderma reesei: the characterization of both gene and enzyme. Gene 63:11–21. Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual (2nd ed) USA. Cold spring harbor lab pr 1577 hlm. Sandgreen M, Gualfetti PJ, Shaw A, Gross LS, Saldajeno M, Day AG, Jones A, and Mitchinson C. 2003a. Comparison of family 12 glikoside hidrolases and recruited substitutions important for thermal stability. Prot Sci 12: 848-860. Sandgren M, Gualfetti PJ, Paech C, Paech S, Shaw A, Gross LS, Saldajeno M, Berglund GI, Jones TA, Mitchinson C. 2003b. The Humicola grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 A resolution and the impact of its free cysteine residues on thermal stability. Prot Sci 12:2782-2793. Saxena IM, Brown RM. 2005. Cellulose biosynthesis: current views and evolving concepts. Annals of Bot 96:9–21. Schuster E, Dunn-Coleman N, Frisvad JC, van Dijck PW. 2002. On the safety of Aspergillus niger-a review. Appl Microbiol Biotechnol 59:426-435. Sharma TR, Sreekantiah KR. 1986. Production of cellulases and D-xylanases by some selected fungal isolates. Enzyme Microbiol Technol 8:178-182. Suharsono. 2002. Konstruksi pustaka genom kedelai kultivar Slamet. Hayati 9 (3): 67-70. Teeri T, Salovuori I, Knowles J. 1983. The molecular cloning of the major cellulase gene from Trichoderma reesei. Bio/Technol 1: 696–699. van Peij NNME, Gielkens MMC, de Vries RP, Visser J, de Graaff LH. 1998. The transcriptional activator XlnR regulates both xylanolytic and endoglucanase gene expression in Aspergillus niger. Appl Environ Microbiol 64 (10):3615–3619.

Vincze T, Posfai J, and Roberts RJ. 2003. NEBcutter: a program to cleave DNA with restriction enzymes. Nuc Acids Res 31(13):3688-3691. Watanabe H, Tokuda G. 2001. Animal cellulases. Cell Mol Life Sci 58:1167-1178. Xu B, Hellman U, Ersson B, Janson JC. 2000. Purification, characterization and amino-acid sequence analysis of a thermostable, low molecular mass endobeta-1,4-glucanase from blue mussel, Mytilus edulis. Eur J Biochem 267:4970-4977. Zechel DI, He S, Dupont C, Withers SG. 1998. Identification of Glu-120 as the catalytic nucleophile in Streptomyces lividans endoglucanase celB. Biochem J 336:139-145. Zhang YHP, Himmel ME, Mielenz JR. 2006. Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies. Biotechnol Adv 24:452-481. Zhao G, London E. 2006. An amino acid ‘‘transmembrane tendency’’ scale that approaches the theoretical limit to accuracy for prediction of transmembrane helices: Relationship to biological hydrophobicity. Prot Sci 15:1987–2001.

LAMPIRAN Lampiran 1 Kurva standar glukosa dan bovine serum albumin (BSA)

Absorbansi (540 nm)

Kurva Standar Glukosa 1.8 1.6 1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0

y = 1.876x - 0.1866 R2 = 0.9981

absorbansi Linear (absorbansi)

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

Konsentrasi Glukosa (mg/ml)

Kurva Standar BSA

Absorbansi (750 nm)

0.800

y = 0.8986x + 0.0693 R2 = 0.9971

0.700 0.600 0.500

(absorbansi)

0.400

Linear ((absorbansi))

0.300 0.200 0.100 0.000 0.00

0.20

0.40

0.60

Konsentrasi BSA (mg/ml)

0.80

Lampiran 2 Peta plasmid pGEM-T Easy (Promega)

Lampiran 3 Hasil pengurutan sisipan eglA dengan primer T7 dan SP6

Lampiran 4 Urutan nukleotida sisipan eglA dan deduksi asam aminonya cggccgcgggaattcgattctctaacgcccaacatgaagctccccgtgacacttgctatg R P R E F D S L T P N M K L P V T L A M cttgcggccaccgccatgggccagacgatgtgctctcaatatgacagtgcctcgagcccc L A A T A M G Q T M C S Q Y D S A S S P ccatattcagtgaaccagaacctctggggcgagtaccaaggcaccggcagccagtgtgta P Y S V N Q N L W G E Y Q G T G S Q C V tatgtcaacaaactctccagcagtggtgcatcctggcacaccgaatggacctggagcggt Y V N K L S S S G A S W H T E W T W S G ggtgagggaacagtgaaaagctactctaactctggcgttacatttaacaagaagctcgtg G E G T V K S Y S N S G V T F N K K L V agtgatgtatcaagcatccccacctcggtggaatggaagcaggacaacaccaacgtcaac S D V S S I P T S V E W K Q D N T N V N gccgatgtcgcgtatgatcttttcaccgcagcgaatgtggaccatgctacttctagcggt A D V A Y D L F T A A N V D H A T S S G gactatgaactgatgatttggcttgcccgctacggcaacatccagcccattggcaagcaa D Y E L M I W L A R Y G N I Q P I G K Q attgccacggccacagtgggaggcaagtcctgggaggtgtggtatggcagcaccacccag I A T A T V G G K S W E V W Y G S T T Q gccggtgcggagcagaggacatacagcttcgtgtcggaaagccctatcaactcatacagt A G A E Q R T Y S F V S E S P I N S Y S ggggccatcaatgcatttttcagctatctcactcagaaccaaggctttcccgccagctct G A I N A F F S Y L T Q N Q G F P A S S cagtacttgatcaatctgcagtttggaactgaggcgttcaccgggggcccggcaaccttc Q Y L I N L Q F G T E A F T G G P A T F acggttgacaactggaccgccagtgtcaactagggttctagaaatcactagtgaattcgc T V D N W T A S V N - G S R N H - - I R = Primer EF dan ER = Situs pemotongan EcoRI = Kodon awal dan kodon akhir

Lampiran 5 Hasil penyejajaran urutan nukleotida eglA dengan database di GenBank menggunakan program BLAST WU-BLAST2 Results SUBMISSION PARAMETERS Title

Sequence

Sequence length

720

Sequence type

n

Program

WU-blastn

Version

2.0MP-WashU [04-May-2006]

Number of scores

100

Number of alignments

50

Expected threshold

10

Filter

dust

Show Annotation

Blast Result

Bottom of Form

Alignment

MView

XML

Bottom of Form Bottom of Form Bottom of Form

DB:ID

Source

SUBMIT ANOTHER JOB

Reset

fasta

Bottom of Form

Length

Score

Identity%

Positives%

E()

EM_PAT:CQ786069

Sequence 14 from Patent WO2004018662.

720

3546

99

99

3.7e-152

EM_PAT:A62439

Sequence 1 from Patent WO9713853.

1017

3528

98

98

1.7e-151

EM_PAT:A62449

Sequence 1 from Patent WO9713862.

1017

3528

98

98

1.7e-151

EM_PAT:AR130937

Sequence 1 from patent US 6190890.

1017

3528

98

98

1.7e-151

1 2 3 4

EM_PAT:AR174096

Sequence 1 from patent US 6306635.

1017

3528

98

98

1.7e-151

EM_PAT:CQ786068

Sequence 13 from Patent WO2004018662.

3619

2014

97

97

4.5e-149

EM_FUN:AJ224451

Aspergillus niger eglA gene

2199

1991

97

97

1.1e-148

EM_FUN:AM270318

Aspergillus niger contig An14c0110, complete genome.

56009

2014

97

97

1.8e-142

EM_EST:DR701805

Asn_01310 Aspergillus niger pBluescript (EcoRI-XhoI) Aspergillus niger cDNA clone Asn_01310, mRNA sequence.

712

3213

98

98

4.1e-137

EM_EST:DR707073

Asn_07711 Aspergillus niger pBluescript (EcoRI-XhoI) Aspergillus niger cDNA clone Asn_07711, mRNA sequence.

682

3084

98

98

2.8e-131

EM_EST:DR702066

Asn_01595 Aspergillus niger pBluescript (EcoRI-XhoI) Aspergillus niger cDNA clone Asn_01595, mRNA sequence.

692

3077

98

98

5.8e-131

EM_FUN:D12901

Aspergillus kawachii mRNA for endo-beta-1,4glucanase.

839

2760

87

87

1.0e-116

EM_PAT:A57153

Sequence 12 from Patent WO9629415.

2360

1565

86

86

1.4e-114

EM_PAT:AR099313

Sequence 12 from patent US 6077702.

2360

1565

86

86

1.4e-114

EM_PAT:A57143

Sequence 2 from Patent WO9629415.

669

2573

87

87

3.5e-108

EM_PAT:AR099308

Sequence 2 from patent US 6077702.

669

2573

87

87

3.5e-108

EM_EST:DR706058

Asn_06385 Aspergillus niger pBluescript (EcoRI-XhoI) Aspergillus niger cDNA clone Asn_06385, mRNA sequence.

461

2086

98

98

5.0e-86

5 6 7 8 9

10

11

12 13 14 15 16 17

EM_EST:DR706804

Asn_07374 Aspergillus niger pBluescript (EcoRI-XhoI) Aspergillus niger cDNA clone Asn_07374, mRNA sequence.

718

2073

97

97

1.2e-85

EM_FUN:D83731

Aspergillus oryzae celA gene for endo-1,4-betaglucanase, complete cds.

1819

1126

75

75

6.3e-80

EM_HTG:AB228441

Aspergillus oryzae cDNA, contig sequence: AoEST5314.

596

1571

75

75

7.1e-63

EM_FUN:AP007159

Aspergillus oryzae RIB40 genomic DNA, SC026.

2324132

1126

75

75

2.0e-62

EM_FUN:X52525

Aspergillus aculeatus FI-CMCase mRNA for endo-1,4beta-D-glucanase (EC 3.2.1.4)

932

866

66

66

1.3e-49

EM_EST:DR702515

Asn_02122 Aspergillus niger pBluescript (EcoRI-XhoI) Aspergillus niger cDNA clone Asn_02122, mRNA sequence.

287

1134

98

98

8.0e-43

EM_PAT:A57152

Sequence 11 from Patent WO9629415.

345

787

85

85

9.4e-42

EM_PAT:AR099312

Sequence 11 from patent US 6077702.

345

787

85

85

9.4e-42

EM_FUN:D00546

Aspergillus aculeatus gene for endo-1,4-beta-Dglucanase, exons 1, 2, 3, complete cds.

1643

627

64

64

6.6e-40

EM_FUN:AF435072

Aspergillus kawachii endoglucanase (cel12B) gene, complete cds.

886

604

62

62

6.4e-32

EM_PAT:EA135892

Sequence 207 from patent US 7214786.

951

607

60

60

1.1e-30

EM_PAT:EA135891

Sequence 206 from patent US 7214786.

829

607

60

60

3.1e-30

EM_EST:DR630484

EST1020612 FvI Gibberella moniliformis cDNA clone FVIDR28, mRNA sequence.

869

570

61

61

7.9e-18

EM_EST:DR631639

EST1021767 FvI Gibberella moniliformis cDNA clone FVIEB76, mRNA sequence.

736

570

61

61

9.3e-18

18

19 20 21 22 23

24 25 26 27 28 29 30 31

Lampiran 6

Hasil penyejajaran urutan asam amino eglA dengan database di GenBank menggunakan program BLAST

WU-BLAST2 Results SUBMISSION PARAMETERS Title

Sequence

Database

uniprot

Sequence length

239

Sequence type

p

Program

WU-blastp

Version

2.0MP-WashU [04-May-2006]

Matrix

BLOSUM62 Number of scores

Number of alignments

50

Filter

seg

Show Annotation

Bottom of Form

Blast Result

Bottom of Form

MView

100

Expected threshold

10

DbClustal

XML

Bottom of Form Bottom of Form Bottom of Form

SUBMIT ANOTHER JOB Reset

Bottom of Form fasta

Alignment

1 2 3

DB:ID

Source

Length

Score

Identity%

Positives%

E()

UNIPROT:A2R322_ASPNC

Endoglucanase A eglA-Aspergillus niger OS=Aspergillus niger (strain CBS 513.88 / FGSC A1513) GN=eglA PE=3 SV=1

239

1258

99

99

UNIPROT:O74705_ASPNG

Endoglucanase A OS=Aspergillus niger GN=eglA PE=1 SV=1

239

1254

98

99

1.9e-126

UNIPROT:GUNA_ASPKA

Endoglucanase A OS=Aspergillus kawachi GN=cekA PE=2 SV=1

239

1126

87

94

6.9e-113

4 5 6

7

8 9 10

11 12 13 14 15

UNIPROT:Q0CLB5_ASPTN

Endoglucanase A OS=Aspergillus terreus (strain NIH 2624) GN=ATEG_05519 PE=4 SV=1

239

1052

81

89

4.8e-105

UNIPROT:O13454_ASPOR

Endo-1,4-beta-glucanase (Predicted protein) OS=Aspergillus oryzae GN=celA PE=4 SV=1

239

985

75

84

6.0e-98

UNIPROT:A1DC06_NEOFI

Glycosyl hydrolase family 12 protein OS=Neosartorya fischeri (strain ATCC 1020 / DSM 3700 / NRRL 181) GN=NFIA_100330 PE=4 SV=1

231

935

73

81

1.2e-92

UNIPROT:B0YB66_ASPFC

Endoglucanase, putative OS=Aspergillus fumigatus (strain CEA10 / CBS 144.89 / FGSC A1163) GN=AFUB_091730 PE=4 SV=1

234

820

61

76

1.8e-80

UNIPROT:Q4WGT4_ASPFU Endoglucanase, putative OS=Aspergillus

234

820

61

76

1.8e-80

UNIPROT:GUN_ASPAC

Endoglucanase-1 OS=Aspergillus 237 aculeatus PE=1 SV=1

817

62

75

3.8e-80

UNIPROT:A1DCV6_NEOFI

Endoglucanase, putative OS=Neosartorya fischeri (strain ATCC 1020 / DSM 3700 / NRRL 181) GN=NFIA_027400 PE=4 SV=1

234

809

60

75

2.7e-79

UNIPROT:Q0CFW4_ASPTN Endoglucanase I OS=Aspergillus terreus

238

803

60

77

1.2e-78

UNIPROT:A1CDU5_ASPCL

Endoglucanase, putative OS=Aspergillus clavatus GN=ACLA_007820 PE=4 SV=1

234

797

59

76

5.1e-78

UNIPROT:Q8NJY2_ASPKA

Endoglucanase OS=Aspergillus kawachi GN=cel12B PE=4 SV=1

237

774

60

74

1.4e-75

UNIPROT:Q0C8U0_ASPTN

Endoglucanase I OS=Aspergillus terreus (strain NIH 2624) GN=ATEG_09894 PE=4 SV=1

234

734

55

71

2.4e-71

UNIPROT:Q8NJY7_9ASCO

Endoglucanase OS=Stachybotrys echinata GN=cel12A PE=4 SV=1

237

639

50

62

2.8e-61

fumigatus GN=AFUA_7G06150 PE=4 SV=1

(strain NIH 2624) GN=ATEG_07420 PE=4 SV=1

16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27

UNIPROT:Q08HM8_STACH

Endoglucanase OS=Stachybotrys chartarum GN=cel12A PE=4 SV=1

238

637

50

63

4.6e-61

UNIPROT:B2W8G6_PYRTR

Endoglucanase A OS=Pyrenophora triticirepentis (strain Pt-1C-BFP) GN=PTRG_06274 PE=4 SV=1

238

628

50

67

4.1e-60

UNIPROT:Q8NJZ6_9PEZI

Endoglucanase OS=Chaetomium brasiliense GN=cel12A PE=4 SV=1

247

621

48

66

2.3e-59

UNIPROT:Q8NJY5_TRIKO

Endoglucanase OS=Trichoderma koningii GN=cel12A PE=4 SV=1

234

613

49

64

1.6e-58

UNIPROT:A2TDD5_9HYPO

Endogluanase III pigment OS=Hypocrea pseudokoningii PE=2 SV=1

234

610

49

64

3.3e-58

UNIPROT:Q8NJY8_BIOOC

Endoglucanase OS=Bionectria ochroleuca GN=cel12D PE=4 SV=1

237

608

47

62

5.4e-58

UNIPROT:Q8NJZ4_FUSEQ

Endoglucanase OS=Fusarium equiseti GN=cel12A PE=4 SV=1

238

607

46

65

6.9e-58

UNIPROT:Q8NJY4_TRIVI

Endoglucanase OS=Trichoderma viride GN=cel12A PE=4 SV=1

233

605

48

65

1.1e-57

UNIPROT:O00095_TRIRE

Endo-beta-1,4-glucanase (Beta-1,4glucanase) OS=Trichoderma reesei GN=egl PE=1 SV=1

234

603

48

64

1.8e-57

UNIPROT:Q2H360_CHAGB

Putative uncharacterized protein OS=Chaetomium globosum GN=CHGG_03786 PE=4 SV=1

245

601

48

64

3.0e-57

UNIPROT:Q9P8N6_COCCA

Mixed-linked glucanase OS=Cochliobolus carbonum GN=MLG2 PE=4 SV=1

239

590

48

63

4.4e-56

257

589

46

64

5.6e-56

UNIPROT:A4REG2_MAGGR Putative uncharacterized protein OS=Magnaporthe grisea GN=MGG_00677 PE=4 SV=1

Lampiran 7 Matrik kesamaan urutan asam amino gen eglA A . niger dengan gen endoglukanase dari organisme lain

1.P.furiosus 2.S.solfataricus 3.B.licheniformis 4.S.halstedi 5.S.lividans 6.P.carotovorum 7.A.aculeatus 8.A.kawachii 9.A.niger_CBS513 10.T.viride 11.T.reesei 12.B.ochroleuca 13.F.equiseti 14.P.chrysosporium 15.P.ramorum 16.P.sojae 17.P.arcularius 18.A.niger_IPB1 19.A.nidulans 20.A.oryzae 21.A.niger_CBS120

1

2

3

4

5

6

7

8

9

ID 0.303 0.194 0.163 0.139 0.163 0.171 0.165 0.161 0.191 0.186 0.147 0.162 0.171 0.172 0.150 0.181 0.153 0.162 0.163 0.161

0.303 ID 0.195 0.147 0.165 0.173 0.167 0.164 0.170 0.203 0.171 0.167 0.176 0.187 0.147 0.165 0.140 0.173 0.135 0.159 0.170

0.194 0.195 ID 0.201 0.198 0.625 0.272 0.256 0.255 0.265 0.292 0.271 0.251 0.238 0.211 0.239 0.264 0.258 0.263 0.256 0.255

0.163 0.147 0.201 ID 0.709 0.197 0.218 0.211 0.199 0.216 0.213 0.203 0.201 0.180 0.183 0.186 0.177 0.196 0.209 0.241 0.199

0.139 0.165 0.198 0.709 ID 0.181 0.206 0.197 0.202 0.199 0.191 0.196 0.191 0.176 0.163 0.168 0.190 0.187 0.216 0.201 0.202

0.163 0.173 0.625 0.197 0.181 ID 0.263 0.249 0.277 0.285 0.270 0.262 0.268 0.238 0.236 0.236 0.242 0.280 0.318 0.264 0.277

0.171 0.167 0.272 0.218 0.206 0.263 ID 0.924 0.627 0.555 0.559 0.536 0.540 0.384 0.416 0.400 0.414 0.627 0.506 0.451 0.627

0.165 0.164 0.256 0.211 0.197 0.249 0.924 ID 0.598 0.525 0.546 0.515 0.506 0.367 0.400 0.394 0.398 0.598 0.477 0.422 0.598

0.161 0.170 0.255 0.199 0.202 0.277 0.627 0.598 ID 0.483 0.488 0.481 0.463 0.357 0.355 0.363 0.379 0.992 0.425 0.407 0.000

10 0.191 0.203 0.265 0.216 0.199 0.285 0.555 0.525 0.483 ID 0.748 0.473 0.475 0.382 0.327 0.335 0.402 0.471 0.451 0.412 0.483

11 0.186 0.171 0.292 0.213 0.191 0.270 0.559 0.546 0.488 0.748 ID 0.502 0.462 0.362 0.339 0.351 0.402 0.483 0.447 0.412 0.488

12 0.147 0.167 0.271 0.203 0.196 0.262 0.536 0.515 0.481 0.473 0.502 ID 0.529 0.317 0.347 0.339 0.344 0.469 0.393 0.376 0.481

13 0.162 0.176 0.251 0.201 0.191 0.268 0.540 0.506 0.463 0.475 0.462 0.529 ID 0.347 0.374 0.370 0.376 0.463 0.400 0.370 0.463

14 0.171 0.187 0.238 0.180 0.176 0.238 0.384 0.367 0.357 0.382 0.362 0.317 0.347 ID 0.306 0.319 0.641 0.353 0.379 0.371 0.357

15 0.172 0.147 0.211 0.183 0.163 0.236 0.416 0.400 0.355 0.327 0.339 0.347 0.374 0.306 ID 0.821 0.353 0.351 0.458 0.444 0.355

16 0.150 0.165 0.239 0.186 0.168 0.236 0.400 0.394 0.363 0.335 0.351 0.339 0.370 0.319 0.821 ID 0.341 0.359 0.467 0.448 0.363

17 0.181 0.140 0.264 0.177 0.190 0.242 0.414 0.398 0.379 0.402 0.402 0.344 0.376 0.641 0.353 0.341 ID 0.375 0.398 0.404 0.379

18 0.153 0.173 0.258 0.196 0.187 0.280 0.627 0.598 0.992 0.471 0.483 0.469 0.463 0.353 0.351 0.359 0.375 ID 0.425 0.399 0.992

19 0.162 0.135 0.263 0.209 0.216 0.318 0.506 0.477 0.425 0.451 0.447 0.393 0.400 0.379 0.458 0.467 0.398 0.425 ID 0.708 0.425

20 0.163 0.159 0.256 0.241 0.201 0.264 0.451 0.422 0.407 0.412 0.412 0.376 0.370 0.371 0.444 0.448 0.404 0.399 0.708 ID 0.407

21 0.161 0.170 0.255 0.199 0.202 0.277 0.627 0.598 0.000 0.483 0.488 0.481 0.463 0.357 0.355 0.363 0.379 0.992 0.425 0.407 ID

Lampiran 8 Matrik jarak gen eglA A . niger dengan gen endoglukanase dari organisme lain 1 1.P.furiosus 2.S.solfataricus 3.B.licheniformis 4.S.halstedi 5.S.lividans 6.P.carotovorum 7.A.aculeatus 8.A.kawachii 9.A.niger_CBS513 10.T.viride 11.T.reesei 12.B.ochroleuca 13.F.equiseti 14.P.chrysosporim 15.P.ramorum 16.P.sojae 17.P.arcularius 18.A.niger_IPB1 19.A.nidulans 20.A.oryzae 21.A.niger_CBS120

0.0000 1.4572 2.4728 2.5359 2.6894 2.6847 2.6970 2.7958 2.5083 2.9410 2.9504 2.9600 2.8308 2.6304 3.2890 2.9720 2.5145 2.4540 2.4483 2.6509 2.0851

2 1.4572 0.0000 2.4865 2.3982 2.5237 2.6824 2.3360 2.4894 2.2669 2.4511 2.6531 2.6621 2.4651 2.5737 2.8134 2.6503 2.4837 2.2637 2.1621 2.3728 1.9719

3 2.4728 2.4865 0.0000 1.7684 1.8828 0.4803 1.8005 1.8324 1.9202 1.7155 1.6212 1.9432 1.7181 1.8596 1.9167 1.7722 1.7812 1.9223 1.4580 1.5678 1.7662

4 2.5359 2.3982 1.7684 0.0000 0.3415 1.8647 1.3600 1.4807 1.5732 1.4844 1.4502 1.5375 1.6097 1.4600 1.6676 1.5698 1.4390 1.5864 1.2729 1.4314 1.6745

5 2.6894 2.5237 1.8828 0.3415 0.0000 1.9504 1.4092 1.5331 1.6131 1.6879 1.5949 1.6197 1.7527 1.5193 1.8524 1.7249 1.4860 1.6266 1.2480 1.3875 1.7452

6 2.6847 2.6824 0.4803 1.8647 1.9504 0.0000 1.8151 1.8422 1.8922 1.8565 1.7240 2.0701 1.8288 1.9126 1.6940 1.6982 1.7832 1.9022 1.5923 1.8357 1.8503

7 2.6970 2.3360 1.8005 1.3600 1.4092 1.8151 0.0000 0.0775 0.4877 0.6230 0.6284 0.7235 0.6793 1.0567 1.0760 1.0681 0.9720 0.4889 0.7093 0.7919 0.5164

8 2.7958 2.4894 1.8324 1.4807 1.5331 1.8422 0.0775 0.0000 0.5364 0.6934 0.6710 0.7764 0.7525 1.1293 1.1354 1.1294 1.0661 0.5377 0.8179 0.8949 0.5906

9 2.5083 2.2669 1.9202 1.5732 1.6131 1.8922 0.4877 0.5364 0.0000 0.7913 0.7979 0.8478 0.8586 1.1804 1.1972 1.1940 1.1457 0.0080 0.8122 0.8826 0.0000

10

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

2.9410 2.4511 1.7155 1.4844 1.6879 1.8565 0.6230 0.6934 0.7913 0.0000 0.3072 0.8474 0.8334 1.2082 1.3194 1.2897 1.1275 0.8042 0.9165 0.9829 0.7853

2.9504 2.6531 1.6212 1.4502 1.5949 1.7240 0.6284 0.6710 0.7979 0.3072 0.0000 0.7643 0.8478 1.2638 1.3050 1.2583 1.1504 0.8108 0.9431 1.0813 0.8588

2.9600 2.6621 1.9432 1.5375 1.6197 2.0701 0.7235 0.7764 0.8478 0.8474 0.7643 0.0000 0.7321 1.3572 1.3336 1.2912 1.2939 0.8580 1.0481 1.1461 0.8900

2.8308 2.4651 1.7181 1.6097 1.7527 1.8288 0.6793 0.7525 0.8586 0.8334 0.8478 0.7321 0.0000 1.2419 1.1338 1.1148 1.2043 0.8609 0.9984 1.0714 0.8808

2.6304 2.5737 1.8596 1.4600 1.5193 1.9126 1.0567 1.1293 1.1804 1.2082 1.2638 1.3572 1.2419 0.0000 1.3755 1.4033 0.4327 1.1918 1.0087 1.0632 1.2949

3.2890 2.8134 1.9167 1.6676 1.8524 1.6940 1.0760 1.1354 1.1972 1.3194 1.3050 1.3336 1.1338 1.3755 0.0000 0.2008 1.1906 1.2069 0.8474 0.9615 1.1614

2.9720 2.6503 1.7722 1.5698 1.7249 1.6982 1.0681 1.1294 1.1940 1.2897 1.2583 1.2912 1.1148 1.4033 0.2008 0.0000 1.2729 1.2038 0.7591 0.9056 1.0637

2.5145 2.4837 1.7812 1.4390 1.4860 1.7832 0.9720 1.0661 1.1457 1.1275 1.1504 1.2939 1.2043 0.4327 1.1906 1.2729 0.0000 1.1566 0.9098 0.9403 1.2690

2.4540 2.2637 1.9223 1.5864 1.6266 1.9022 0.4889 0.5377 0.0080 0.8042 0.8108 0.8580 0.8609 1.1918 1.2069 1.2038 1.1566 0.0000 0.8473 0.9192 0.0151

2.4483 2.1621 1.4580 1.2729 1.2480 1.5923 0.7093 0.8179 0.8122 0.9165 0.9431 1.0481 0.9984 1.0087 0.8474 0.7591 0.9098 0.8473 0.0000 0.3194 0.8122

2.6509 2.3728 1.5678 1.4314 1.3875 1.8357 0.7919 0.8949 0.8826 0.9829 1.0813 1.1461 1.0714 1.0632 0.9615 0.9056 0.9403 0.9192 0.3194 0.0000 0.8826

2.0851 1.9719 1.7662 1.6745 1.7452 1.8503 0.5164 0.5906 0.0000 0.7853 0.8588 0.8900 0.8808 1.2949 1.1614 1.0637 1.2690 0.0151 0.8122 0.8826 0.0000

Lampiran 9 Multiple sequence alignment asam amino endoglukanase dari bebrapa organisme anggota famili GH12 P.furiosus_DSM_3638 S.solfataricus_P2 B.licheniformis S.halstedii S.lividans P.carotovorum_subsp.carotovorum A.aculeatus A.kawachii A.niger_CBS120 T.viride T.reesei B.ochroleuca F.equiseti P.chrysosporium P.ramorum P.sojae P.arcularius A.niger_IPB1 A.nidulans A.oryzae A.niger_CBS513 Consensus/80%

MSKKK----FV--IV-SILTILL---VQA-IYFVEKY(43)DGDG-NPEFYIEINLWNIL MIMNK----LY---I-IIVPIIVIIVVGV-IGGAIYL(59)NNST-VPSFYLEVNMWNAK MKNNH(11)CIIVLAGPLSAFA---AS---SSNPSDK----LYFK-NKKYYIFNNVWGAD MRALP(16)LAT-VA-AVLAAAP--AAHADTLVCEQY----GSTTIQGRYVVQNNRWGAS MRTLR(19)FAL-VS-SLVTAAA--PAQADTTICEPF----GTTTIQGRYVVQNNRWGST MLTVN(14)FSALLLSPLTVSA---VS---SSKDADK----LYFE-NNKYYVFNNVWGKD MKAFH------L-LA-ALAGAA---VAQQ-AQLCDQY----ATYT-GGVYTINNNLWGKD MKAFH------L-LA-ALSGAA---VAQQ-AQLCDQY----ATYT-GGVYTINNNLWGKD MKLPV------T-LA-MLAATA---MG---QTMCSQY----DSAS-SPPYSVNQNLWGEY MKFLQ------I-AP-TLLPVA---LA---QSSCSQY----ATFS-GGNYALSNNLWGQS MKFLQ------V-LP-ALIPAA---LA---QTSCDQW----ATFT-GNGYTVSNNLWGAS MKTGI-----AY-LA-AVLPLA---MA---ESLCDQY----AYLS-RDGYNFNNNEWGAA MKSTL------L-LAGAFAPLA---FA---KDLCEQY----GYLS-SDGYSLNNNVWGKD MFKAL----LAVGFAIALTFAS---AA---QTITGQY----DCIP-AGAYTLCQNLWGEY MKFLV----PAT-L--ALAAVAS--TASA-QEYCGRD----DNKV-VGPYTVYNNLWAED MKFLL----PAT-V--TIAALAS--SASA-QQFCGRD----DNKV-VGDYTVYNNLWAEE MHFST----LAT-LV-AVAATA---SA---QTLSGQY----DCAP-AGAYTLCQNLWGES MKLPV------T-LA-MLAATA---MG---QTMCSQY----DSAS-SPPYSVNQNLWGEY MKLLA-----LS-LA-SLASAAT--ITRR-ADFCGQW----DTAT-AGNFIVYNNLWGQD MKFLT----PLV-LS-SLASAAA--LNRR-ADMCGQW----DTTT-TDKFTLYNNLWGEG MKLPV------T-LA-MLAATA---MG---QTMCSQY----DSAS-SPPYSVNQNLWGEY M+h........h.ls.slhshA...ht....phs.pb....sshs.ss.Y.l.pNlWG..

P.furiosus_DSM_3638 S.solfataricus_P2 B.licheniformis S.halstedii S.lividans P.carotovorum_subsp.carotovorum A.aculeatus A.kawachii A.niger_CBS120 T.viride T.reesei B.ochroleuca F.equiseti P.chrysosporium P.ramorum P.sojae P.arcularius A.niger_IPB1 A.nidulans A.oryzae A.niger_CBS513 Consensus/80%

N-ATGFAEMTYNLTSGV--LHYV(9)DRSNWVH------GYPEIFYGNKPWNANYATDGP T-WNGNYTMVFNPLTRTLSVSFN(4)NPLQWTN------GYPEIYVGRKPWDTSYA--GQ-VSGWWQTIYH-NSDS-DMGW-----VWNWPSNTSTVKAYPSIVSGWH-WTEGYTA-GS A----PQCVTATDSG-F-RVTQ----ADGA-VPTNGAPKSYPSVFNGCH-YTN---C-SP A----PQCVTATDTG-F-RVTQ----ADGS-APTNGAPKSYPSVFNGCH-YTN---C-SP E-VKGWQQTVFY-NSPT-SMGW-----NWHWPSSSSSVKAYPSLVSGWH-WTAGYTE-NS A-GSGSQCTTVNSASSA-GTSWS---TKWNWSGGENSVKSYANS--------------GL A-GSGSQCTTVNSASSA-GTSWS---TKWNWSGGENSVKSYANS--------------GL Q-GTGSQCVYVDKLSSS-GASWH---TEWTWSGGEGTVKSYSNS--------------GV A-GSGSGCITDVSLG-G-SAVWS---TTWDWSGGQSNVKGYPNI--------------AL A-GSGFGCVTAVSLS-G-GASWH---ADWQWSGGQNNVKSYQNS--------------QI T-GTGDQCTYVDSTSSG-GVSWH---SDWTWSGSESEIKSYPYS--------------GL S-GTGDQCTHVNWNNAN-GAGWD---VEWNWSGGKDNVKSYPNS--------------AL A-GVGSQNSTLISTNGN-AVTWQ---TNWTWANNPNTVKSCASH--------------SF NDPKGKQCTEVTGSTSS-SVSWQ---TSFNWAGDSWQVKSFANA--------------AL NDPKGGQCTEVTGSTSS-SVSWQ---TSFNWAGDNWQVKSFANA--------------AL S-GVGNQNSTLISTSGN-TVSWR---TQWQWQNNPNNVKSYANL--------------LS Q-GTGSQCVYVNKLSSS-GASWH---TEWTWSGGEGTVKSYSNS--------------GV NADSGSQCTGVDSANGN-SVSWH---TTWSWSGGSSSVKSYANA--------------AY NADSGSQCTGLDSDDGN-TIAWH---TSWTWTGGAGQVKSFANV--------------AY Q-GTGSQCVYVDKLSSS-GASWH---TEWTWSGGEGTVKSYSNS--------------GV ..spG.bsshhs..s.s.sssW....spasWsss.splKtYss...............t.

P.furiosus_DSM_3638 S.solfataricus_P2 B.licheniformis S.halstedii S.lividans P.carotovorum_subsp.carotovorum A.aculeatus A.kawachii A.niger_CBS120 T.viride T.reesei B.ochroleuca F.equiseti P.chrysosporium P.ramorum P.sojae P.arcularius A.niger_IPB1 A.nidulans A.oryzae A.niger_CBS513 Consensus/80%

I--PLPSKVSNLTDFYLTISYKLEP---KNGLPINFAIESWLTR---EAWRTTGINSDEQ N--IFPMRIGNMTPF--MVSFYINLTKLDPSINFDIASDAWIVRPQIAFSPGTAPGNGDI ---GFPTRLSDQKNINTKVSYSISA----NG-TYNAAYDIWLHN---T-NKASWDSAPTD GTN-LPAQVSGIASAPSSISYGFVG----SA-VYNASYDIWLD-----PTPK-KNGVNRT GTD-LPVRLDTVSAAPSSISYGFVD----GA-VYNASYDIWLD-----PTAR-TDGVNQT ---GLPIKLSSNKSITSNVTYSIKS----TG-TYNAAYDVWFHT---T-DKASWDSTPTD TFN--KKLVSQISQIPTTARWSYDN----TGIRADVAYDLFTA-----ADINHVTWSGDY SFN--KKLVSQISHIPTAARWSYDN----TCIRRGRAYDLFTA-----ADINHVTWSGDY TFN--KKLVSDVSSIPTSVEWKQDN----TNVNADVAYDLFTA-----ANVDHATSSGDY NIP-NKRLVSSISSMPTTAQWSYSG----SSIRADVAYDLFTA-----SNPNHVTYSGDY AIP-QKRTVNSISSMPTTASWSYSG----SNIRANVAYDLFTA-----ANPNHVTYSGDY DLP-EKKIVTSIGSISTGAEWSYSG----SNIRADVAYDIFTA-----ADPNHATSSGDY LIGEDKKTISSITNMQSTAEWKYSG----DNLRADVAYDLFTA-----ADPNHETSSGEY PI---------ASSAPTAWNWTYVT--ESQGIRADVSYDIWFGK---AQSGNPATSASSY KFN--PKQVSAITSIPTSIKYAYTY---DGKIIANVAYDLFTS-----SSE---GGSVEY KFT--PKQVSTVTSIPTSIAYKYTY---DGNIIANVAYDLFTS-----STP---TGDVEY NSA-KGVQLSAVRAAPTAWQWEYES--KSDGIRADVSYDIWLGT---APSGDPASRASSY TFN--KKLVSDVSSIPTSVEWKQDN----TNVNADVAYDLFTA-----ANVDHATSSGDY QFT--ATQLSSLSSIPSTWEWQYST----TDVVANVAYDLFTS-----SSI---GGDSEY NFE--ATQLSQLSSIPSTWKWENTG----SDIVADVAYDLFTS-----SSA---DGDEEY TFN--KKLVSDVSSIPTSVEWKQDN----TNVNADVAYDLFTA-----ANVDHATSSGDY .......bl*slssbs*shpapbss....ssl.hssAYDlahs.....ss....s.sspb

P.furiosus_DSM_3638 S.solfataricus_P2 B.licheniformis S.halstedii S.lividans P.carotovorum_subsp.carotovorum A.aculeatus A.kawachii A.niger_CBS120 T.viride T.reesei B.ochroleuca F.equiseti P.chrysosporium P.ramorum P.sojae P.arcularius A.niger_IPB1 A.nidulans A.oryzae A.niger_CBS513 Consensus/80%

EVMIWIYY-DGLQPA---GSKVK-EIV(8)PVNATFEVWKANI------GWEYVAFRIKT EIMVWLFS-QNLQPA---GQQVG-EVV(8)LVNATFQVWKMKNVP-W-GGWEYIAFRPDG EIMIWLNNT-NAGPA---GSYVE-TVS---IGGHSWKVYKGYIDAGGGKGWNVFSFIRTA EIMIWLNKVGPIQPI---GSQAG-TAS---VGGRTWQVWRGSN-----GSNDVISFVAPS EIMIWFNRVGPIQPI---GSPVG-TAS---VGGRTWEVWSGGN-----GSNDVLSFVAPS ELMIWLNNT-NAGPA---GDYIE-TVF---LGGSSWNVFKGWINAGNGKGWNVFSFVRTS ELMIWLARYGGVQPI---GSQIA-TAT---VDGQTWELWYGAN-----GSQKTYSFVAPT ELMIWLARYGGVQPL---GSQIA-TAT---VEGQTWELWYGVN-----GAQKTYSFVAAN ELMIWLARYGNIQPI---GKQIA-TAT---VGGKSWEVWYGSTTQ-AGAEQRTYSFVSES ELMIWLGKYGDIQPI---GSSQG-TVN---VGGTSWNLWYGPN-----GSMQVYSFVAPG ELMIWLGKYGDIGPI---GSSQG-TVN---VGGQSWTLYYGYN-----GAMQVYSFVAQT EVMIWLANLGGLTPI---GSPIG-TVK---AAGRDWELWDGYN-----GAMRVYSFVAPS ELMVWLARIGGVQPI---GSLQT-SVT---IEGHTWELWVGMN-----GSMKVFSFVAPT EIMIWLSGLGGIQPV---GHQILSGLN---IAGHTWNLWSGPN-----SNWQVFSFVISS ELMVWLSALGGAWPLTETGKPIK-SLK---LGGVDFDLYQGMN-----KNVKVFSYVAKK ELMVWLSALGGAWPLTDSGKPIK-TVT---AGGVEFDLYQGFN-----KKVKVFSYVAKK EIMIWLSGLGGIQPV---GSKILSGVN---VAGHTWDLWKGPN-----SNWQVLSFVSST ELMIWLARYGNIQPI---GKQIA-TAT---VGGKSWEVWYGSTTQ-AGAEQRTYSFVSES EIMIWLAALGGAGPISSTGSSIA-TVT---LGGVTWNLYSGPN-----GSMQVYSFVASS EIMIWLAALGGAGPISSTGSAIA-TPT---VGGQSWSLYSGPN-----GQMTVFSFVASS ELMIWLARYGNIQPI---GKQIA-TAT---VGGKSWEVWYGSTTQ-AGAEQRTYSFVSES ElMIWLs.hGsh.Pl...Gp.l..*ss...lsG.*Wpla.G.s.......bpsbSFVs.s

P.furiosus_DSM_3638 S.solfataricus_P2 B.licheniformis S.halstedii S.lividans P.carotovorum_subsp.carotovorum A.aculeatus A.kawachii A.niger_CBS120 T.viride T.reesei B.ochroleuca F.equiseti P.chrysosporium P.ramorum P.sojae P.arcularius A.niger_IPB1 A.nidulans A.oryzae A.niger_CBS513 Consensus/80%

-PIKEGT-VT-IPYGAFISVAANISSLPNYTELYLEDVEIGTEFGT--P-STT--SAHLE -WKVT-NGYVAYEPNLFIKALNNFASYNI-TNYYLTDWEFGTEWGTMTSNGTAYFSWTIS -NTQS---AN-LNIRDFTNYLADSKQWLS-KTKYVSSVEFGTEVFG--G-T-G--QINIS -AVAS---WS-FDVMDFVRNT-IARGMAQ-NNWYLTSVQAGFEPWQ--N-GA---GLAVN -AISG---WS-FDVMDFVRAT-VARGLAE-NDWYLTSVQAGFEPWQ--N-GA---GLAVN -NTNS---AS-LNIRHFTNYLVGTKKWMS-NTKYISSVEFGTEIFG--G-D-G--QIDIT -PITS---FQ-GDVNDFFKYLTQNHGFPA-SSQYLITLQFGTEPFT--G-GPA--TLSVS -PITS---FQ-GDINDFFKYLTQNHGFPA-SSQYLITLQFGTEPFT--G-GPA--TLNVA -PINS---YS-GDINAFFSYLTQNQGFPA-SSQYLINLQFGTEAFT--G-GPA--TFTVD -NLTN---WS-GDVKNFYTYLQNNKGYPA-SSQYVLSYQFGTEAFT--G-S-G--TLN-N -NTTN---YS-GDVKNFFNYLRDNKGYNA-AGQYVLSYQFGTEPFT--G-S-G--TLNVA -QLNS---FD-GEIMDFFYVVKDMRGFPA-DSQHLLTVQFGTEPIS--G-SGA--KFSVS -PVNN---FN-ADIKQFWDYLTKSQNFPA-DNQYLLTFQFGTEPFT--G-DNA--KFTVT GEVRN---FS-ADLNEFFQYLIQSQGVA--STQYLQAIQVGTEPFV--G-SAS---LLTE -TATS---FT-GDLKQFFDQLPSDNTIP--ATQFLQKVEAGTEPFQ--G-TNA--KLVVT -SATS---FT-ADLKYFFDQLPADNNLP--QTQYLQKVEAGTEPFQ--G-KNA--KMVVS GDITD---FN-VDLKDFFNYLTQSQGVA--ASQYVQAIQTGTEPFT--G-SAS---LFTK -PINS---YS-GAINAFFSYLTQNQGFPA-SSQYLINLQFGTEAFT--G-GPA--TFTVD -TTES---FS-ADLMDFINYLVENQGLS--NSQYLTHVQAGTEPFT--G-SDA--TLTVS -TTED---FS-ADLNDFLKYLQEEQGMP--SSQYLTHVQAGTEPFS--G-SNV--KFTTS -PINS---YS-GDINAFFSYLTQNQGFPA-SSQYLINLQFGTEAFT--G-GPA--TFTVD .shps...as.h-l..FbphL.pspsbs..sspYl.slphGTEsas..G.sst..pbsls

P.furiosus_DSM_3638 S.solfataricus_P2 B.licheniformis S.halstedii S.lividans P.carotovorum_subsp.carotovorum A.aculeatus A.kawachii A.niger_CBS120 T.viride T.reesei B.ochroleuca F.equiseti P.chrysosporium P.ramorum P.sojae P.arcularius A.niger_IPB1 A.nidulans A.oryzae A.niger_CBS513 Consensus/80%

WWITNI(7)PLIS NFYE------TLL NWDVT------VR SFSSTV(118)CA SFSSTV(119)TV KWSVD------VK NWSAS------VQ DWSAS------VQ NWTAS------VN TWTAS------IN SWTAS------IN HWSAK------LG NFNAH------LK SFAVAV-----NV NYSVQ------VK SYSVQ------VK AYSVAI-----NQ NWTAS------VN SYSVS------VS SYSVS------VA NWTAS------VN sassp......l.