Role sacharidů v živých organismech Jitka Moravcová Ústav chemie přírodních látek, VŠCHT Praha, e-mail:
[email protected]
Úvod Sacharidy jsou v přírodě nejzastoupenější přírodní látky; jejich roční produkce v biomase je vyšší než 100 biliónů tun. Z chemického hlediska jsou polyhydroxyaldehydy (aldosy) nebo polyhydroxyketony (ketosy) a podle počtu jednotek v molekule se dělí na monosacharidy (např. d-glukosa, d-fruktosa), oligosacharidy (do 10 jednotek, např. HO
HO O OH
O OH
OH HO
HO
OH
(II) β-anomer O
HO
OH OH
(II) α-anomer
CHO OH
HO
OH OH CH2OH
OH
OH
HO
O OH OH HO
HO
(II) β-anomer
(II) α-anomer
D-glukosa
(I)
OH
O OH
HO
OH
OH
O
HO
O HO
OH HO
OH OH
(III)
*
O
HO HO O HO
O OH
HO O HO
O OH
HO O HO
O OH
HO O HO
O OH
OH n
OH
sacharosa (II)
celulosa (IV)
Obrázek 1 Způsoby kreslení vzorců sacharidů, mutarotace Obr. 1 Způsoby kreslení vzorců sacharidů, mutarotace
sacharosa, maltosa) a polysacharidy (desítky, spíše tisíce jednotek, např. celulosa nebo škrob). Pro znázornění struktury sacharidů se používá několik druhů vzorců (Obr. 1) 1: Fischerovy (I), Harworthovy (II), Milsovy (III) a vzorce vyjadřující skutečnost, že atomy pyranosového kruhu neleží v jedné rovině (IV). V roztoku podléhají sacharidy tzv. mutarotaci, což je ustavení rovnováhy mezi formou acyklickou a pětičlenným (furanosa) a šestičlenným kruhem (pyranosa) (Obr. 1, d-glukosa). Tím, že hydroxylová skupina
63
OH
v poloze 4 nebo 5 atakuje karbonylovou skupinu v poloze 1, uzavírá se kruh a v poloze 1 vzniká nové stereogenní centrum; takové diastereoisomery se nazývají anomery a označují se α- nebo β-anomery. V přírodě včetně biologických systémů se nacházejí jak sacharidy volné, tak jejich nejrůznější deriváty, jichž je ohromné množství. Z fyzikálně-chemických vlastností volných sacharidů je nutné zmínit, že jsou vysoce polární, chirální sloučeniny, enantiomerně čisté, dobře se rozpouštějí ve vodě a jsou prakticky nerozpustné v organických rozpouštědlech. Jsou biodegradabilní a z obnovitelných zdrojů, ale bohužel obsahují příliš mnoho funkčních skupin podobné reaktivity, takže jejich chemická modifikace je značně obtížná. O tom, že sacharidy jsou mimořádně důležitou skupinou přírodních látek svědčí i ta skutečnost, že za jejich výzkum byly uděleny tři Nobelovy ceny: Hermanu Emilu Fischerovi (1912, za synthesu sacharidů a purinů), Walteru Normanu Harworthovi (1937, za synthesu sacharidů a vitaminu C) a Luisu Frederiku Leloirovi (1970, za objevení nukleotidů a jejich významu pro biosynthesu sacharidů). Historie využití sacharidů lidskou populací je stará jako lidstvo samo. První vlastností sacharidů, která byla a stále je pro člověka důležitá, je jejich nutriční hodnota. Sacharidy tvoří nedílnou a podstatnou součást naší potravy. Pravidelně konzumujeme polysacharidy (škrob, celulosa, pektin, inulin), disacharidy (sacharosa, trehalosa, laktosa) i monosacharidy (d-glukosa, d-fruktosa, d-mannosa) a jejich deriváty (např. glykosidy). Za zmínku stojí výjimečné postavení sacharosy, která je důležitou komoditou. Její celosvětová produkce je vyšší než 115 miliónů tun, přičemž asi 70 % se stále vyrábí z cukrové třtiny, zbytek je získáván z řepy cukrové, a pro potravinářské účely se používá až 95 % produkce. Technologie její výroby je perfektně vypracovaná a na sacharosu se tak můžeme dívat i jako na chemickou sloučeninu, které se vyrábí nejvíce. Dalším masivně vyráběným produktem jsou fruktosové sirupy, jejichž vstupní surovinou je škrob. Řada potravních doplňků obsahuje sacharidy jako základní složku, např. glukosamin, chondroitin a další. Sacharidy jsou důležitou průmyslovou surovinou i mimo oblast zpracování potravin a opět to je obnovitelnost jejich zdrojů, která je jejich nespornou výhodou. Sem lze zařadit výrobu celulosy z dřevní hmoty a následné zpracování na papír. Celulosa a kafr byly dvě základní suroviny pro celuloid, z něhož se sice filmy už nevyrábějí, ale stále je potřebný pro míčky na stolní tenis. Alkylovaná celulosa pak tvoří základní materiál pro kryty počítačů a pro další podobné výrobky. Je často používaná jako adsorpční materiál filtrů a pro chromatografie. Zájem chemického průmyslu o sacharidy roste tak, jak klesá zásoba fosilních surovin. V některých státech (Brazílie) je již sacharosa zpracovávána na
64
bioethanol, intenzivně se zkoumá možnost výroby polymerů odvozených od sacharosy a dalších produktů. Zatím většímu průlomu v technologiích brání i některé vlastnosti samotných sacharidů, které nejsou zrovna příliš výhodné pro velkotonážní produkci. Dobře lze tuto situaci dokumentovat právě na sacharose:
Výhody
Nevýhody
nízká cena
je polyfunkční
100% čistota
je nerozpustná v běžných organických rozpouštědlech
je krystalická a není hygroskopická
není stabilní v kyselém prostředí
je chirální a enantiomerně čistá je z obnovitelných zdrojů
Dále je nutno zvažovat i další kriteria související s vlastnostmi produktů a meziproduktů ze sacharosy a s dostupností technologií. Lze je formulovat například do následujících obecných zásad: i) produkty musejí mít lepší aplikační nebo ekologické vlastnosti, a nebo musejí být levnější než ty původní, ii) meziprodukty by měly být zpracovatelné běžnou průmyslovou chemií (např. polymerizací), iii) technologie by měly zahrnovat minimum reakčních kroků s využitím levných činidel za environmentálně bezpečných podmínek, iv) reakce by měly probíhat buď ve vodném roztoku nebo bez rozpouštědla, v) v žádném stupni nelze použít kyselé prostředí nebo kyselé katalyzátory, vi) isolace a separace produktů musí být co nejjednodušší a snadno převoditelná z laboratorního do provozního měřítka. Právě zřejmé výhody sacharosy podnítily obrovský zájem chemiků o její využití jako průmyslové suroviny. Zatímco v období do roku 1965 bylo publikováno jen 15 plně identifikovaných derivátů sacharosy, v současné době je popsáno více než 300 těchto sloučenin2, což je přičítáno zájmu vyvolaném ropnou krizí v sedmdesátých letech minulého století. Fakt, že sacharidy jsou součástí biologicky aktivních přírodních látek rostlinného i živočišného původu, je znám už dlouho. Například sekundární metabolity rostlin se vyskytují převážne ve formě glykosidů, které jsou ve vodě rozpustné a umožňují tak rostlině transportovat biologicky aktivní ale ve vodě nerozpustný aglykon na místo poškození. Tyto glykosidy se řadí mezi tzv. fytoalexiny, což jsou látky, která rostlina
65
synthetisuje, je-li vystavena stresu vyvolaným např. suchým počasím, mechanickým poškozením nebo požerem či útokem plísní (Obr. 2). Tvorba glykosidů je využívána CH2OH
CH2OH
O
O O-aglykon
OH HO
OH + HO-aglykon
OH HO
OH CH2OH HOCH2
glukosid OH
silybin, aglykon ostropestřece marijánského
O
HO
O
O
O
OH O
HO
CH2OH
OH
OH
salicin, glukosid vrby bílé
OH
O
OH
OMe
O
OH OH
HO
O
OH
O
O
kumestrol, aglykon vojtěšky seté
genistein, aglykon sóji luštinné HO
O
Obrázek 2 Struktury některých fytoalexinů
Obr. 2 Struktury některých fytoalexinů
rostlinami i k detoxifikaci. Člověk se z chování přírody poučil a vyrábí preparáty, ve kterých je léčivo navázáno na např. d-glukosu glykosidovou nebo esterovou vazbou, což mu dodá rozpustnost ve vodě. Enzymy střevní mikroflóry nebo kyselé pH v žaludku pak účinnou složku z preparátu uvolní. Sacharidy jsou rovněž důležitými stavebními jednotkami (celulosa) nebo zdrojem energie (škrob). Rovněž nikdy nebyla zpochybňována důležitost sacharidů jako složek např. pojivových tkání (glykogen), a nebo jako součást jiných pro život nezbytných látek (ribonukleové a deoxyribonukleové kyseliny či proteiny). V těchto případech bylo ale na sacharidy pohlíženo jako na kostru těchto mnohem důležitějších molekul a nebo jako na sloučeniny, které jsou schopny modifikovat některé jejich fyzikálně-chemické vlastnosti. S rozvojem biochemie a zejména buněčné biologie byly objeveny nové funkce sacharidů v živých organismech a za posledních 20 let tak prožívá chemie sacharidů obrovský rozmach. Byl objeven tzv. sacharidový kód, který je využíván ke hledání selektivních, cíleně působících therapeutik s minimálními vedlejšími účinky a který je pravděpodobně hlavním motivem základního i aplikovaného výzkumu sacharidů v současné době.
66
Sacharidový kód
V živém organismu je neustálá buňka
toxin protilátka
potřeba dorozumívání se na buněčné
baktérie
úrovni (Obr. 3). Buněčné virus
rozpoznávání je základem imunitní odpovědi, uplatňuje se při ataku baktérií a virů, kde právě zachycení pathogenu na povrchu hostitelské
buňka
buňky tvoří první fázi onemocnění; jeho role v rozšiřování nádorových buněk v organismu je rovněž důležitá. Aby tyto procesy vůbec probíhaly, musí být splněny dvě základní podmínky: organismus musí mít k dispozici receptor („čtecí zařízení“), což jsou často proteiny buněčných povrchů, které obvykle postrádají katalytickou aktivitu enzymů (tzv. lektiny), a nějakou část biopolymeru nesoucí zašifrovanou informaci. K tomu, aby skupina látek mohla plnit funkci informačního systému, musí splňovat několik požadavků: a) specifické kódování (informace musí být jednoznačná a musí být i dešifrovatelná s nízkou pravděpodobností špatné interpretace); b) šifrovací sekce biomolekuly musí být malá, aby její synthesa nebyla energeticky náročná, a musí být prostorově snadno přístupná; d) kódovací sloučeniny musejí mít dostatečný potenciál pro rychlé strukturální změny. Všechny tyto požadavky splňují sacharidy v míře více než dostatečné. Sacharidy jsou prakticky nevyčerpatelnou zásobárnou rozmanitých struktur, neboť kupříkladu každá hexosa nabízí pět hydroxylových skupin jiné molekule sacharidu ke tvorbě glykosidové vazby. Kromě lineárních oligomerů mohou tvořit i rozvětvené struktury, což je vlastnost v biologickém systému zcela unikátní. Tak by 20 hexos mohlo teoreticky poskytnout 6,4 . 1015 hexamerů, zatímco 20 aminokyselin pouze 1,4 . 107. Sacharidy jsou dále konformačně flexibilní, důležitá je zejména volná rotace kolem glykosidové vazby, přitom ale jednotlivé konformery mohou mít různou afinitu k vazebnému místu receptorudekodéru. Sacharidy jsou tedy téměř ideální sloučeniny pro generování kompaktních jednotek s explicitními informačními vlastnostmi. Za tímto účelem jsou oligosacharidy v organismu vázány kovalentní vazbou na lipidy a proteiny nebo peptidy a často se označují jako sacharidový epitop.
67
Sacharidy tvoří jen asi 1 % hmotnosti člověka, zatímco proteiny zhruba 15 % stejně jako lipidy, 5 % je anorganických solí a zbytek je voda. Nepočítáme-li d-ribosu a 2-deoxyHO
HO HO
O OH
OH
OH
OH
HO
O
O
OH D-glukosa (Glc)
OH D-galaktosa (Gal)
HO
HO HO
O OH
OH HO
R9
9 R5
R7
O R8 6 8 7 NH O
5 O
HO
OH HO
N-acetyl-D-galaktosamin (GalNAc)
2
R4
D-glukuronová kyselina (GluA)
OH
HO OH D-idouronová kyselina (IdoA)
sialové kyseliny
OH O
OH
(Fuc)
O COOH OH
OH
OH
OH
OH
L-fukosa
O
NHAc
4
HO
OH D-xylosa (Xyl)
O
NHAc
O
OH
COOH OH
N-acetyl-D-glukosamin (GlcNAc)
O HO
OH
COOH 1
3
7-O-acetyl 4-O-acetyl N-glykolyl 8-O-acetyl 9-O-laktyl 8-O-methyl 8-O-sulfát 9-O-acetyl 9-O-fosfát R4,R5,R7,R8,R9 = H kyselina neuraminová kyselina N-acetylneuraminová N-acetyl (NeuAc, Neu5Ac, NANA)
Obrázek 4 Struktury základních monosacharidů lidského těla
Obr. 4 Struktury základních monosacharidů lidského těla
d-ribosu (součást RNA a DNA) , je základních monosacharidů v lidském těle deset (Obr. 4), z nichž kyselina neuraminová, d-glukosamin a d-galaktosamin se vyskytují ve formě svých N-acetylderivátů. Kyselina neuraminová tvoří celou řadu dalších derivátů, které se nazývají společným názvem kyseliny sialové. Biosynthesa glykokonjugátů probíhá krok za krokem v endoplasmatickém retikulu a Golgiho aparátu. Exogenní monosacharidy penetrují do buňky a jsou přeměněny do stavebních bloků, typicky do podoby glykosylnukleotidů, které jsou dále transformovány na oligosacharidy a navázány na lipidickou nebo proteinovou kostru. Těchto transformací se účastní celá řada glykosidas a glykosyltransferas. Jakmile se glykokonjugáty dostanou na povrch buňky, slouží jako ligandy pro receptory jiných buněk nebo pathogenů.
Typy interakcí sacharidů s proteiny
Jako receptory se pro interakce se sacharidy uplatňují především proteiny (lektiny), a to prostřednictvím nevazebných interakcí, které mohou být typu vodíková vazba, 68
asociace s kovy, nepolární a iontová interakce. Důležité je, že při těchto interakcích nedochází k žádné chemické transformaci sacharidu, a proto se obecně netýkají enzymů. Jedna isolovaná interakce proteinu se sacharidem je slabá, a proto nepostačuje k předání informace. Naštěstí jak receptor tak oligosacharid jsou multifunkční sloučeniny schopné mnohonásobných interakcí („glycoside cluster effect“). Vodíkové můstky. Jsou typickým příkladem interakce, která prakticky nikdy není
osamocená, ale vždy se jedná o celou síť interakcí bidentálního charakteru s obecným
5 Příklady interakcí monosacharidů s proteiny: Obrázek 5Obr. Příklady interakcí monosacharidů s proteiny:
a) vodíkové můstky, b) asociace s kovem, c) hydrofobní interakce
a) vodíkové můstky, b) asociace s kovem, c) hydrofobní interakce
motivem NH…OH…O=C, kterých se účastní pobočné řetězce aminokyselin, jako jsou Asn, Asp, Glu, Gln, Arg nebo His, a sacharidové hydroxylové skupiny i kyslík pyranosové kruhu (Obr. 5a). Účast molekul vody je zcela obvyklá. Asociace s kovy. Interakci nejčastěji zprostředkovává vápník a dále mangan
(Obr. 5b). Komplementární kontakt nepolárních ploch. I když jsou sacharidy především
polárními sloučeninami, jsou schopny i nepolárních interakcí, neboť jedna ze stran molekuly sacharidu bývá více hydrofobní než druhá; v případě d-galaktosy je to strana B strana A OH OH O HO strana B
OH
D-galaktopyranosa
OH
(jako strana A se označuje ta strana, kde se atomy uhlíku počítají od nižšího k vyššímu ve směru pohybu hodinových ručiček), která je například hydrofobnější než odpovídající B strana d-glukosy nebo d-mannosy, protože konfigurace na atomu C-4 je l a hydroxylová skupina směřuje nahoru do strany A (Obr. 5c). Z toho důvodu je
d-galaktosa skoro vždycky v nepolární interakci s aromatickým kruhem vhodné aminokyseliny. V případě oligosacharidů může nastat dokonce interakce se dvěma pyranosovými kruhy a molekula disacharidu je tak uzavřen mezi dvě nepolární plochy.
69
Iontová interakce. Uplatňuje se u nabitých sacharidů, tj. těch, které obsahují
aminoskupinu, glukuronovou nebo idouronovou kyselinu či kyseliny sialové, přičemž karboxylová skupina je skoro vždy asociována s argininem. Tento typ interakce zodpovídá za afinitu aminoglykosidových antibiotik.
Glykolipidy Glykolipidy jsou
Obrázek 6 Struktura hopanoidů a lipoteichových kyselin
součástí buněčných membrán
OH OH
a vyskytují se ve všech
OH
organismech. Po chemické stránce jsou heterogenní skupinou amfifilních molekul, které mají jednu nebo více molekul monosacharidů vázaných jako glykosidy na hydrofobní
O
OH
OH R OH O
R = CH2OH, CH2NH2, COOH
HO OX O OX OOX OO PO ( O P O) O P O n O O O O OH X = H, glykosyl HO OH
O HO
O OH
O OH
OR1 OR2
kostru acylglycerolu nebo ceramidu. Přispívají ke stabilizaci a vyšší pevnosti membrán a rovněž se uplatňují v buněčné komunikaci, při modulaci receptorů a nebo signální transdukci, diferenciaci, proliferaci a onkogenezi. Mezi glykolipidy prokaryotů se řadí hopanoidy, mykoláty, lipoteichové kyseliny, lipoglykany, lipopoly-sacharidy a sfingoglykolipidy. Hopanoidy jsou glykosidy s rigidními pentacyklickými aglyko-ny a v membráně pravděpodobně vážou cholesterol, a tím ji zpevňují (Obr. 6). Mykoláty jsou součástí obálky mykobakterií, kde fungují jako efektivní bariéra proti pronikání antibiotik a chemotherapeutik. Lipoteichové kyseliny (Obr. 6) a jim podobné lipoglykany se nevyskytují současně v cytoplasmatické membráně jedné a téže grampozitivní bakterii, a proto se předpokládá, že jejich funkce jsou zaměnitelné. Lipopolysacharidy (LPS) jsou sloučeniny specifické pro gramnegativní bakterie, kde tvoří vnější povrch vnější membrány (Obr. 7). Obsahují lipidickou část (lipid A), která je v poloze 6´ glykosylována polysacharidem, který se skládá z tzv. jádra a O-antigenu. Zatímco struktura jádra je víceméně rigidní, je struktura O-antigenu variabilní a specifická, v některých případech O-antigen i chybí. LPS jsou endotoxiny, které vyvolávají u lidí a vyšších organismů septický šok. V USA se ročně vyskytne 500 000 případů sepse ročně, z nich 20 – 50% je smrtelných; pokud se ovšem rozvine
70
septický šok, je úmrtnost 90 %. Nositelem toxicity je lipid A, který stimuluje hostitelskou buňku k nadprodukci endogenních mediátorů, např. cytokinů, které v malém množství aktivují imunitní systém hostitele, ale ve velkém vyvolají horečku, tachykardii, vysoký tlak a následně smrt díky nefunkčnosti všech orgánů spojených s krevním oběhem. Některé lipidy A jsou toxické méně a slouží jako inspirativní matrice pro návrh nových léčiv. AbeOAc Glc GlcNAc Man( Rha Gal Glc Gal )Gal n Glc Hep
2Hep-OPO3
Hep KDO KDO O O O O P O O -O NH O O
HO HO
O
O
HO HO
KDO O HO O O O
O O
HN
HO
O O P O OO O
O OH
HO HO HO HO
O OH
OH COOH
OH O Hep
HO
OH
O HOOH Abe
Obrázek 7 Struktura LPS baktérie Sallmonela typhimurium Obr. 7 Struktura LPS baktérie Sallmonela typhimurium Obrázek 8 Struktura glykosfingolipidu Sphyngomonas paucimobilis GluA O HO HO
Glykosfingolipidy gramnegativních
OH
bakterií jsou složeny z ceramidu (sfinganin
O HO O HO
acylovaný mastnou kyselinou) α-glykosylo-
H N O
OH
vaného molekulou GluA (Obr. 8). Tři molekuly glykosfingolipidů představují strukturální jednotku odpovídající lipidu A. Glykosfingolipidy vykazují i podobnou biologickou aktivitu jako lipid A, ačkoliv jejich monomery jsou biologicky neaktivní. Ukazuje se, že pravděpodobně existuje jakási
71
supramolekulární struktura glykosfingolipidů, která je zodpovědná za jejich biologické a fyzikálně-chemické vlastnosti. Živočišné glykosfingolipidy jsou rovněž odvozeny od ceramidu a jsou buď neutrální nebo kyselé, kterým negativní náboj dodávají sialové nebo uronové kyseliny a dále sulfáty, fosfáty a fosfonáty mono- a oligosacharidů. Nacházejí se v nervovém systému a mozku. Více glykosylované glykosfingolipidy jsou ve všech tkáních a nazývají se podle oligosacharidového řetězce, např.: ganglio ( -D-Gal-(1-3)- -D-GalNAc-(1-4)- -D-Gal(1-4)-D-Glc-), neolakto ( -D-Gal-(1-4)- -D-GalNAc-(1-3)- -D-Gal-(1-4)-D-Glc-), isoglobo ( -D-GalNAc-(1-3)- -D-Gal-(1-3)- -D-Gal-(1-4)-D-Glc-) a další. Gangliosidy jsou kyselé glykosfingolipidy, které obsahují jednu nebo více sialových kyselin (Obr. 9). Řada z nich jsou antigeny krevních skupin, mohou vyvolat autoimunitní poruchu, modifikují aktivitu funkčně naprosto rozdílných receptorů, např. gangliosid GM1 aktivuje nervový růstový faktor. Gangliosidy se účastní adhezních procesů, kde představují vazebná místa pro toxiny, viry a bakterie, kdy se cukerná část glykosfingolipidu váže na lektinový receptor pathogenu. Sfingolipidy jsou nezbytné pro správnou funkci lidské kůže, kde přispívají ke vzniku permeační bariéry pro přenos vody. Mezi intenzivně studované glyko-lipidy patří glykosfingolipidy parazitů. Zdá se, že tyto konjugáty jako Obrázek 97 Struktura gangliosidu GMI, který je receptorem toxinu střevní cholery
integrální součást povrchu parazita
gangliosid GM2 gangliosid GM3
OH OH OH OH O O O HO O OH OH NHAc OH O HO OH HOOC O O O O OH HN OH O ( ) HO ( )16 12 O OH HO AcNH OH ceramid NeuAc glukosylceramid
hrají důležitou roli v různých mechanismech nutných pro jeho přežití. Hlísty využívají molekulární mimikry, aby zabránily imunogennímu
rozpoznání, a jsou-li poznány, snaží se obejít svoje zničení tím, že se aktivně účastní imunoregulačního mechanismu. V prvé řadě napodobují strukturu glykosfingolipidů hostitelského organismu, protože ty odpovídají za adhezi buněk.
72
Glykoproteiny, proteoglykany a peptidoglykan Glykoproteiny jsou přítomny ve všech organismech a to jak v intracelulárním tak extracelulárním prostoru i v buněčných membránách (enzymy, antibody, receptory, hormony, cytokiny, strukturální proteiny). Obsah sacharidů je v nich různý; pohybuje se od 1 hm% v kolagenu až po 99 hm% v glykogenu. Nejčastěji jsou sacharidy vázány jako Oa N-glykosidy, ojediněle rovněž jako C-glykosidy, a nebo přes ethanolaminfosfát. Vazebným místem pro tvorbu N-glykosidů je asparagin a z jednoduchých sacharidů se váže nejčastěji Glu, Rha nebo GalNAc. Pro vznik O-glykosidů jsou využívány O H 2N
NH
protein
O - O P O O OH O HO HO O ethanolaminfosfát OH O HO HO
GalNAc Gal-Gal-Gal Gal
HO HO
Man
ethanolaminfosfát O OH O O HO
diacylglyceroly ceramid R2 alkylacylglyceroly
OH O H 2N O O
R1
OH OH O
mastné kyseliny OH
O P O O-
Obrázek 10 10 Minimální struktura GPIGPI kotvy a některé strukturální variace Obr. Minimální struktura kotvy a některé strukturální variace
hydroxylové skupiny zejména serinu a threoninu, dále pak tyrosinu, hydroxyprolinu nebo hydroxylysinu. Z jednoduchých sacharidů jsou obvykle navázány GalNAc, GlcNAc, Fuc, Xyl, Glu, Gal, Man nebo Ara. Vazba přes ethanolaminfosfát využívá C-koncové aminokyseliny proteinu a dává stabilní, orientované připojení sacharidů na membránu obvykle na extracelulárním povrchu buňky. Toto spojení se nazývá glykosylfosfatidylinositolová (GPI) kotva (Obr. 10). N-Glykany
Základem struktury všech N-glykanů je stejný pentasacharid jádra, který je připojen na asparagin (Obr. 11). K němu jsou připojeny tykadlové („antennae“) oligosacharidy, které mohou být lineární i rozvětvené. Podle jejich struktury a způsobu připojení se
73
rozeznávají čtyři základní skupiny tykadel: oligomannosa, komplexní, hybridní a nejnovější typ obsahující D-xylosu. Asn
Man(α1-6)[Man(α1-3)]Man(β1-4)GlcNAc(β1-4)GlcNAc(β1-N) pentasacharid jádra O
O
O
O tykadlové oligosacharidy O O O O
O O
pentasacharid jádra
Asn
O O O O
Obrázek 11 Schematická N-glykanů Obr. 11struktura Schematická struktura
N-glykanů
Struktura N-glykanového cukerného epitopu je specifická pro buňku a je označována jako antigenní determinant. Tvoří např. antigeny krevních skupin H, A a B, které jsou složkami sfingolipidů na povrchu erythrocytů. Mají jen velmi malé rozdíly v určující struktuře tykadel, které ale mají dalekosáhlé důsledky. Sérum jedinců s krevní skupinou A obsahuje protilátky anti-B, zatímco krevní skupina B má protilátky anti-A. Skupina AB nemá protilátky žádné, neboť její erythrocyty nesou oba antigeny A i B. Lidé s krevní skupinou O mají obě protilátky a jejich buňky neobsahují antigeny žádné. Antigen H je prekurzorem oligosacharidů A a B a je přítomen na povrchu buněk krevní skupiny O. Struktura sacharidových epitopů jednotlivých krevních skupin je následující: H: Fuc(α1-2)Gal(β1-3 nebo 4)GlcNAc; A: GalNAc(α1-3)[Fuc(α1-2)]Gal(β1-3 nebo
4)GlcNAc; B: Gal(α1-3)[Fuc(α1-2)]Gal(β1-3 nebo 4)GlcNAc. O-Glykany
Tvoří rovněž velmi pestrou škálu cukerných motivů, které jsou navázány na hydroxylovou skupinu serinu nebo threoninu. Dělí se na dvě základní skupiny: O-glykany mucinového a nemucinového typu. První typ se nazývá mucinový proto, že byl poprvé identifikován v hlenu, a obsahuje až dvacet monosacharidů vázaných prostřednictvím Nacetylgalaktosaminu. Formálně se O-glykany mucinového typu dělí na osm skupin podle monosacharidů jádra (Gal, GalNAc, GlcNAc), na kterých jsou připojeny další tykadlové sacharidy (nejčastěji Fuc a NeuNAc). Základní struktura, GalNAc(α1-O)Ser/Thr, se nazývá Tn antigen. Obvykle tvoří klastry na krátkém úseku peptidové sekvence Ser-ThrPro, které se taká říká mucinová doména. O-Glykany nemucinového typu zahrnují větší
74
výběr sacharidů jádra a místem glykosylace proteinu je opět hydroxylová skupina serinu nebo threoninu. Rovněž O-glykany jsou pro organismus a jeho zdravotní stav velice důležité, neboť nesou antigeny rakovinných buněk a jsou rozpoznávací doménou pro buněčné interakce.Proteoglykany Proteoglykan je protein, ve kterém jsou vázány tzv. mukopolysacharidy, což jsou lineární glykosaminoglykanové polymery, které mají v řetězci 15 až několik set základních disacharidových jednotek. Vždy nesou záporný náboj a jejich základními jednotkami jsou N-sulfátovaný D-glukosamin (GlcNS), GlcNAc a GalNAc, které se střídají s Gal, D-
glukuronovou (GluA) nebo L-idouronovou (IdoA) kyselinou. Jsou zejména v pojivových tkáních, neboť to jsou vysoce hydratované molekuly. Asi nejznámější je heparin, který se používá více než 60 let proti srážení krve, dále kyselina hyaluronová, která je součástí synoviální tekutiny očního sklivce nebo dermatan-sulfát přítomný v kůži (Obr. 12). Řada onemocnění jako je atherosklerosa, některé druhy rakoviny či Alzheimerova choroba se GlcA(β1-3)GlcNAc(β1-4)
HO
O O HO O O NHAc n* OH hyaluronová kyselina O
*
O3SO
OH
COO *
IdoA(α1-3)GalNAc(β1-4)
HO
O - OR HO COO
OR
O
* HO
O
O O NHAc n* OH COO dermatan-sulfát
IdoA(α1-4)GlcNAc(α1-4) heparin (R = H) a heparin-sulfát (R = SO3-)
O
HN SO3- O
OH
n
*
Obrázek 12 Opakující se disacharidová jednotka některých mukopolysacharidů
Obr. 12 Opakující se disacharidová jednotka některých mukopolysacharidů
dávají do souvislosti s abnormalitami v biosynthese a opracování proteoglykanu. Peptidoglykan
Peptidoglykan (dříve označovaný jako murein) je základním polymerem buněčných stěn gramnegativních i grampozitivních bakterií. Jeho struktura má tři základní charakteristické složky: polysacharidovou matrici, pentapeptidový pobočný řetězec a mezipeptidové můstky (Obr. 13). Všechny peptidoglykany obsahují střídavě (β1-4)vázaný GlucNAc a N-acetylmuramovou kyselinu (MurNAc) a to v počtu 5 – 45 jednotek. Struktura pentapeptidu je částečně proměnlivá, má obecnou sekvenci Ala-γ-D-Glu-Xaa-DAla-D-Ala, kde Xaa je Lys pro grampozitivní nebo meso-diaminopimelová kyselina pro gramnegativní bakterie.
75
GlcNAc
NHAc
HO O OH
O
O
OH O
O O
H3C
O NHAc
MurNAc
NHAc
HO OH
Ala
O
O H3C
OH O
O O
O NHAc
Ala
D-Glu
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Glu
D-Glu
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Ala
Xaa
D-Ala
D-Glu
Ala
Ala CH3
O
CH3
O O
O ObrázekObr. 13 Struktura peptidoglykanu 13 Struktura peptidoglykanu
Interakce sacharidových epitopů s lektiny
Lektiny jsou proteiny, které vážou mono- a oligosacharidy reverzibilně a s vysokou specifitou, ale současně nevykazují žádnou katalytickou aktivitu a narozdíl od antibodů nejsou ani produktem imunitní reakce organismu. Každý lektin obsahuje typicky dvě nebo více domén rozpoznávající sacharidy (tzv. carbohydrate recognition domain, CRD), jinými slovy jsou di- až polyvalentní. Proto také, když reagují s buňkami, např. erythrocyty, nejenže vážou sacharidy na jejich povrchu, ale vyvolávají i zesíťování buněk jejich následné srážení, které se nazývá aglutinace. Tato vlastnost je charakteristická a základní pro všechny lektiny. Lektiny mohou stejným způsobem srážet polysacharidy nebo proteiny. Oba děje, aglutinace a srážení, jsou inhibovány sacharidovými ligandy, pro které jsou lektiny specifické. Lektiny, resp. receptory lektinového typu, jsou ve všech organismech, od virů a bakterií přes rostliny až k živočichům a savcům. Tvoří heterogenní skupinu oligomerních proteinů, které se liší velikostí, strukturou i stereochemií svých CRD domén, ale lze vystopovat jisté podobnosti v sekvencích aminokyselin. Lektiny byly poprvé isolovány z rostlin, a to v roce 1919 z fazolí a dnes známe v luštěninách již více než 100 zástupců. Velice známý a klasický je konkavalin A z Canavalia ensiformis nebo toxin ricin z Ricinus communis. Je prakticky neuvěřitelné, že role lektinů v rostlinách je dodnes prakticky
76
neznámá. V dalším textu bude uveden základní přehled o lektinech z hlediska jejich specifity k sacharidovým epitopům a funkce v živém organismu. Lektiny se formálně člení na jednoduché a mozaikové. Jednoduché mají molekulovou hmotnost pod 40 kDa a vedle CRD mohou obsahovat další domény. Patří sem všechny rostlinné a z živočišných lektinů jen galektiny (dříve zvané S-lektiny). Mozaikové lektiny obsahují několik druhů vazebných míst, z nichž jenom jedno má vlastnosti SRD. Patří sem virové hemoaglutininy na jedné straně a živočišné C-, P- a Ilektiny na straně druhé. Galektiny
Tato rodina lektinů specifická pro β-D-galaktosidy se obvykle nachází uvnitř buňky v cytoplasmě a buněčném jádru, někdy ale jsou přítomny i na buněčném povrchu a v extracelulárním prostoru. Galektiny mají afinitu i vůči β-D-glukosidům a laktose. Předpokládá se, že mají rozhodující roli při normálním rozvoji a dělení buněk. Zvýšená koncentrace galektinu-3 přítomného na povrchu rakovinných buněk může být odpovědná za adhezi těchto buněk v cílových orgánech, kroku nezbytném pro tvorbu metastáz. Inhibitory tohoto procesu mohou mít účinky protimetastázové. Byly objeveny i protilátky proti galalektinům; např. sérum pacientů s Hodgkinsovým sarkomem obsahovalo v 50 % případů protilátku proti galektinu-9, zatímco sérum zdravých osob či osob postižených jiným nádorovým onemocněním žádné takové protilátky neobsahovalo. Zdá se, že se otevírají nové therapeutické a diagnostické cesty i pro galektiny. C-Lektiny
Tato rodina lektinů vyžaduje pro interakci se sacharidy přítomnost vápenatého kationtu. Dělí se na několik dalších podskupin. Endocytické lektiny jsou receptory vázané v buněčné membráně např. v játrech,
a mají různou specifitu (Gal, GalNAc, Man, Fuc). Např. povrch makrofágů obsahuje lektinový receptor specifický pro D-mannosu a na něj se váže na D-mannosu bohatý glykan z povrchu bakterie, kterou makrofág usmrtí tzv. lektinofagocytosou. Tento typ obrany, která není závislá na tvorbě protilátek, je znám jako součást vrozené imunity. Selektiny zprostředkovávají adhezi cirkulujících leukocytů na výstelku cévních stěn,
což je první krok pro přenos leukocytů z cirkulačního systému a pro jejich další migraci do tkáně. Rozpoznávacím epitopem je terminální tetrasacharid, sialyl-LewisX (sLe x ). P
L-selektin je pověstný jako naváděcí receptor, je přítomen na všech leukocytech
77
P
a zabezpečuje recirkulaci lymfocytů tím, že je směruje do obvodových lymfatických uzlin. E- a P-selektiny jsou vytvářeny na povrchu výstelky cévních stěn jen tehdy, jsou-li tyto buňky aktivovány mediátory (např. interleukin-2) uvolňovanými ze tkáně jako odpověď na poranění, ischémii nebo infekci. Afinita sLe x je k různým selektinům různá, jak vyjadřují P
P
následující disociační konstanty (mM): E-selektin, 0,7; P-selektin, 8; L-selektin, 4. P-Lektiny
Tyto lektiny jsou specifické pro rozpoznávání D-mannosa-6-fosfátu a slouží pro nasměrování lysosomálních enzymů na místo určení. Pokud nemá enzym tento sacharidový epitop, pak není P-lektiny rozpoznán a je vyloučen do mimobuněčného prostoru. I-Lektiny
Rodina I-lektinů je poměrně úzká a rozpoznává sialovou kyselinu při nejrůznějších interakcích buněk. Sialoadhesin a lektin CD22 jsou součástí imunitního systému. Jiné lektiny
V poslední době byl objeveno několik intracelulárních lektinů, které se účastní biosynthesy glykoproteinů, jejich roztřídění a transportu na povrch buňky. Z nich lektin zvaný kalnexin je v endoplasmatickém retikulu, kde se váže na terminální D-glukosu nově tvořeného glykoproteinu a kontroluje tak správnost sestavení glykanu. Jeho úlohou je být jakousi gardedámou glykoproteinu.
Taktika hledání potenciálních therapeutik Nejdůležitější funkcí oligosacharidů v glykokonjugátech je jejich účast v řadě fyziologických a pathologických procesů, kde slouží jako rozpoznávací markery. Tak se účastní adheze infekčních buněk na buňku hostitelskou, zrání a směrování leukocytů, interakcí imunitního systému nebo tvorby a diferenciace rakovinných buněk a jejich metastáz a dalších životně důležitých pochodů. Porozumění tomu, jakými mechanismy sacharidy do těchto dějích vystupují, je velice důležité, protože rozpoznávání je vždy první fázi onemocnění a cíleně zasáhnout v tomto okamžiku je samozřejmě žádoucí. Hledání inhibitorů tohoto děje sleduje principiálně dva základní motivy: aktivitu proti biosynthese glykokonjugátů a nebo interferenci s glykokonjugáty v procesu rozpoznávání. Přes obrovské úsilí vědců jsou zatím pokroky v hledání léčiv a vakcín na bázi sacharidů
78
poněkud problematické. Důvodů je několik, některé z nich byly již zmíněny v úvodu. Prozatím chybí metodika porovnatelná se synthesou peptidů na pevném nosiči, modifikace polyfunkčních molekul jsou vždy obtížné a drahé a sacharidy obecně mají dosti nevhodné vlastnosti pro použití jako léčiva: jejich afinita k proteinům je nízká a podávané orálně jsou inaktivní, protože jsou snadno hydrolyzovány enzymy in vivo. Mohou být proto podávány pouze injekčně pro léčbu akutních symptomů, ale i tak mohou podléhat ataku glykosidas např. v séru. Afinitu k proteinům zvyšují do jisté míry polyfunkční interakce. Z uvedených důvodů je často výhodné nahradit sacharidy látkami, které napodobují jejich strukturu a funkci v procesu rozpoznávání, ale které mají lepší stabilitu, specificitu, afinitu a synthetickou dostupnost. Porozumění procesu rozpoznávání a definování role sacharidů je proto velice důležité. Postup při hledání potenciálních therapeutik lze rozdělit do několika základních procesů, jejichž pořadí není až tak důležité, protože se většinou jedná o vedle sebe probíhající děje. •
Studium interakcí sacharidů s proteiny. Výjimečné místo patří v tomto směru
interakcím s lektiny. Sem patří studium struktury proteinu a stereochemie jeho aktivního místa pomocí molekulárního modelování, instrumentálních technik (NMR, MS, SPR) a rentgenostrukturní analýza proteinu samotného či jeho komplexu se sacharidy. Stejnými metodikami a dále ještě mikrokalorimetrií se studují i interakce sacharidu s proteinem. Výsledkem potom je teorie formulující základní požadavky na strukturu sacharidu, t.j. definují se ty funkční skupiny, které jsou pro interakce nezbytné. •
Modifikace struktury sacharidu. Obvykle se odstraňují ty funkční skupiny, které se na
interakcích nepodílejí, čímž se zjednoduší synthesa a zvýší se hydrofobicita molekuly. Poté se naopak zavádějí skupiny nové, které např. přinášejí do molekuly náboj nebo zvyšují stabilitu vůči hydrolyse. •
Biologické testy. Interakce nově připravené sloučeniny s lektinem se studují pomocí
metod uvedených v prvním bodě a vyvozují se další závěry týkající se nároků na strukturu sacharidu. Tyto tři kroky se neustále opakují. Často studovaným případem pro therapeutickou intervenci je interakce oligosacharidu sialyl-Le x (sLe x , Obr. 14) s E-selektinem a lze na P
P
P
P
něm dobře demonstrovat zásady uvedené výše. Interakce nastává hned zpočátku reakce
79
organismu na poškození a představuje jeden z iniciačních kroků tvorby a směrování bílých krvinek, jehož sacharidovým epitopem je právě sLe x . P
P
Obrázek 14 Struktura oligosacharidu sLe x
Chyba v tvorbě a nadprodukce leukocytů
P
mohou mít pro organismus fatální
Fuc
OH OH
následky. Mnohá zánětlivá onemocnění
H 3C Gal
a to jak akutní (septický šok) tak chronická
HOOC
(asthma, arthritida) by mohla být léčena antagonisty této interakce. Dalším polem
OH
OH O
O
OH
O
HO
OH
O
O
NHAc OH O
O OH
GlcNAc
OH HO NeuAc AcNH OH
působnosti je chemotherapie nádorových onemocnění, protože je známo, že právě
tato interakce je odpovědná za vysokou tendenci některých tumorů vytvářet metastáze. Na základě známé konformace sLe x vázané na E- a P-selektiny odvozené z NMR měření P
P
doplněné výsledky krystalografických studií lektinových vazebných domén byly definovány důležité funkční skupiny v molekule, které jsou nezbytné pro vznik vazby na lektiny (Obr. 14, vyznačeny tučně). Pro rozpoznání E-selektinem jsou rozhodující všechny tři hydroxylové skupiny na Fuc, z nichž ty v poloze C-3 a C-4 koordinují vápenatý kation. Stejně důležitá je přítomnost volných hydroxylových skupin v poloze C-4 a C-6 Gal a karboxylová skupina sialové kyseliny. Molekula GlcNAc nepřispívá k interakcím žádnou svojí funkční skupinou a může být principiálně nahrazena řadou bifunkčních spojovacích členů. Strana B D-galaktosy i sialové kyseliny jsou pravděpodobně v kontaktu s nepolárními plochami vazebné domény E-selektinu a skutečně částečné nahrazení OH OH O 10x
O
Aktivita sLex = 1 OH OH HO
H3C -OOC
O
OH OH O OH N
OOC ( ) O 3
CH3 OH OH O
OH OH O - OOC O O OH
5x
OH
-
O
CONH
COOEt
O
BnO
O 1,1x
OH OH O OH HO -
OOC ( ) CONH 3
CON
Obrázek 15 Analogy sLe x a jejich relativní aktivity vůči E- selektinu P
OH 20x CONH(CH2)13CH3
Obr. 15 Analogy sLex a jejich relativní aktivity vůči E-selektinu P
80
OH
OOC
10x
OH OH
OH OH O
sacharidů aromatickými či jinými hydrofóbními jednotkami vedlo ke zvýšení afinity k E-selektinu. Takovým způsobem byly připraveny antagonisté sLe x s velice dobrou P
aktivitou k E-selektinu (Obr. 15).
Literatura: 1 P
P
2 P
Pacák J., Drašar P.: Chemické Listy 95(10), 665-9 (2001).
Moravcová J.: Chemické Listy 95(4), 202-211 (2001).
P
81
P
82