Proteomics. Waarom DNA alleen niet genoeg is

Proteomics Waarom DNA alleen niet genoeg is…

Reinout Raijmakers Netherlands Proteomics Centre Universiteit Utrecht, Biomolecular Mass Spectrometry and Proteomics Group

Van DNA naar organisme Eiwitten zijn de belangrijkste schakels tussen DNA en het organisme.

DNA 30.000 genen

RNA vertaald genen in eiwit

Eiwit meer dan 1,000,000

Cel eiwitnetwerk

Organisme 2 miljard jaar evolutie

Proteomics voor de massa

Een organisme bestaat uit cellen


De kern van iedere cel bevat chromosomen met de genetische code membraan

Nucleolus

Porien

Chromatine

Set met 23 paar menselijke chromosomen met alle genetische informatie

Chromosomen Proteomics voor de massa

Een chromosoom is een opgevouwen streng DNA Chromosoom

ATCCGTTATGCT TAGGCAATACGA

DNA


Het genoom • DNA is opgebouwd uit 4 bouwstoffen: de basen of nucleotiden A C T G • Het complete Menselijke Genome bestaat uit 3.000.000.000 nucleotiden (basen). • Al het menselijk DNA is in kaart gebracht. De gegevens liggen opgeslagen in een database

…TGAC… … A C T G … Proteomics voor de massa

Genen en het Genotype Alle erfelijke eigenschappen liggen vast in het DNA. Het stukje DNA dat de code bevat voor een erfelijke eigenschap wordt een gen genoemd.

..AGC TAT CAA ATG CCG TAG ATC CGT AGT GTA AAC AAG ATC GTT TGG AAA TTG CAG ATC AGT AAG CGT AGA TCG TGT TGA CG...... Een set van alle genen van een organisme wordt het genotype genoemd. De nucleotiden volgorde van alle genen is bekend.


Fenotype Het fenotype is het totaal van alle waarneembare eigenschappen (kenmerken) van een organisme.

De rups en de vlinder hebben het zelfde genotype (DNA) maar zijn toch verschillend. Ze hebben een verschillend fenotype.


Van Genotype naar Fenotype • Alle 200 celtypen hebben dezelfde set met genen, maar alleen die eiwitten worden aangemaakt die de cel nodig heeft voor zijn taak: Expressie. • Verschillen in expressie verklaren de verschillende fenotypen. • Expressie kan beinvloed worden door omgevingsfactoren.

DNA

RNA

Eiwit

Eiwit

Fenotype

Synthese


Eiwitten bepalen hoe we er uit zien DNA 98 procent identiek

• DNA bepaalt wie we zijn (genetisch bepaald) • Eiwitten bepalen hoe we er uit zien.


Hoe bepalen eiwitten het fenotype ? De genen (het DNA) geven slechts de totale catalogus van mogelijke eiwitten. Maar welke eiwitten en hoeveel van elk wordt bepaald door de expressie van eiwitten. Hoe en wanneer een eiwit actief wordt, wordt bepaalt door de veranderingen die het eiwit nog ondergaat na de expressie: de zogenaamd post-translationele eiwit veranderingen De eiwitnetwerken bepalen tenslote het functioneel geheel in de cellen, weefsels en het organisme Proteomics voor de massa

Wat is een eiwit ? • Eiwitten zijn opgebouwd uit 20 verschillende bouwstenen: de aminozuren. • Een eiwit kan bestaan uit een keten van 50 tot enkele duizenden aminozuren, de primaire volgorde of sequentie genoemd. • Een eiwit wordt gevouwen in een complexe 3-dimensionale structuur. • De volgorde van de aminozuren en ruimtelijke structuur bepalen de functie van het eiwit.

Ser Val

LeuLeu Ala

Thr Cys


Hoe wordt een eiwit uit DNA vertaald? Voor elk aminozuur bestaat een unieke combinatie van 3 nucleotiden. De vertaling en aanmaak van eiwitten vindt plaats op de ribosomen van het cytoplasma

Verschillende eiwitten met ruimtelijke structuur

Antilichaam

Hemoglobline Insuline Kinase

Synthetase


Wat is Proteomics ? Proteomics is de studie naar eiwitten. Proteomics is ook het vergelijken van eiwitten tussen verschillende organismen, weefsels of cellen Proteomics is ook het vergelijken van eiwitpatronen tussen gezonde en zieke mensen.

Protein Genomics

Proteomics Proteomics voor de massa

Analyseren van eiwitten Het analyseren van eiwitten wordt bemoeilijkt door: • Het grote aantal verschillende eiwitten ( > 1,000,000, 1 gen kan leiden tot meerdere eiwitten). • De hoeveelheid materiaal is vaak beperkt. Het kan niet in het lab vermenigvuldigd worden zoals dat wel met DNA kan (PCR). • Eiwitten gaan snel kapot. • Dure en geavanceerde analyse apparaten zijn nodig.


Analyseren van eiwitten. • Een veel gebruikte techniek om dat ene bepaalde eiwit te isoleren uit een mengsel van duizenden eiwitten is 2D gel electrophorese. •Deze techniek maakt gebruik van de unieke eigenschappen van elk eiwit, namelijk: het moleculaire gewicht (grootte) en de lading. 1e dimensie: lading pH 10

pH 3

pH 10

200.000 Dalton

-

+ pH 10

-

In een elektrisch veld bewegen eiwitten naar de pH waar ze neutraal zijn.

1000 Dalton

+

pH 3

+

-

pH 3

2e dimensie: grootte

In een elektrisch veld bewegen kleinere eiwitten sneller dan grote eiwitten.


Het resultaat: een eiwitkaart Elk stipje (spotje) op de kaart is een ander eiwit, of een andere variant van een eiwit! pH

3

10 Molecuul gewicht (grootte) 200,000 Dalton

1000 Dalton


Isoleren van een eiwit naar keuze • Het eiwit van interesse wordt uit de gel gesneden en in een reageerbuis gedaan. • Het eiwit wordt in stukjes “geknipt” met een enzym, bijvoorbeeld trypsine, omdat het intakte eiwit te groot is om te karakteriseren. • De stukjes (fragmenten) worden gekarakteriseerd in een Massa Spectrometer

“massaspectrometrie”

spot uitsnijden

2D-gel

Eiwitten in stukjes knippen met enzym


Wat is Massaspectrometrie (MS) • MS is een krachtige analytische techniek die wordt gebruikt om (onbekende) eiwitten te indentificeren en/of te kwantificeren. • Bovendien kan de structuur en chemische eigenschappen van het eiwit worden achterhaald.

Er zijn verschillende methoden:

Electrical field

Time-Of-Flight

Magnetic field Proteomics voor de massa

Wat doet Massaspectrometrie Een apparaat om moleculen te ‘wegen’, een moleculaire weegschaal: Voor: • Mengsel van munten met verschillend gewicht • Verschillend aantal per munt

Na: • Sorteer op gewicht

massaspectrum

Aantal

• Sorteer op aantal

Gewicht (massa) Proteomics voor de massa

Massaspectrometrie met de “Time-Of-Flight “ methode: “flight tube”

Electrisch veld

Detector

De moleculen gaan “hardlopen” onder invloed van een hoog spanningsverschil in de buis, de snelste (kleinste) komt als eerste aan:

start

finish Proteomics voor de massa

Massaspectrometrie met de “Time-Of-Flight “ methode:

Alle moleculen gaan tegelijkertijd de buis in

De snelheid kan worden omgerekend naar een massa. De hoogte van de piek geeft de hoeveelheid aan.

Kleine moleculen vliegen sneller!

Massaspectrum Proteomics voor de massa

Massaspectrometrie van een eiwit: R

Eiwit:

R

K

K

R

K

knippen van het eiwit met het enzyme trypsine 1 K 2 K 3 R 4 R 5 K 6 R Massaspectrometrie bepaalt de massa’s van de brokstukken Het patroon is uniek voor het eiwit: identificatie van het eiwit !

relative intensity

Trypsine knipt na elke lysine (K) of arginine (R), en maakt daarmee brokstukken die eindigen op K of R:

1

2

3 4

5

6

m/z

Is te vergelijken met een vingerafdruk van het eiwit!


Identificatie van een eiwit: 1

2

3 4

5

6

Het massaspectrum van een eiwitmengsel wordt vergeleken de gegevens in de database

De 30.000 genen van het menselijk genoom met de bijbehorende eiwitten zijn opgeslagen in een Database

De computer geeft een lijst met alle mogelijke eiwitten die er in een monster zitten!


Toepassingen van Proteomics: • Identificatie van eiwit biomarkers specifiek voor eiwit expressie • Quantificering van de eiwit expression met biomarkers onder specifieke omstandigheden,bijvoorbeeld bij medische behandeling. • Toepassing in de ontwikkeling van nieuwe medicijnen • Identificatie van eiwitten die een rol spelen bij specifieke ziekten


Toepassingen van Proteomics: Stamcellen afkomstig uit embryos kunnen ziekten als Multiple Sclerose of Parkinson genezen. Maar ze zijn moeilijk aan te komen en controversieel. Een mogelijk alternatief zijn stamcellen gemaakt van bijvoorbeeld huidcellen. Alleen, dit is nog erg nieuw en zulke zijn lastig om te maken. Het DNA is per definitie hetzelfde, maar alleen proteomics kan ons vertellen of deze cellen echte stamcellen zijn!


Proteomics: wat zijn de problemen? Er zijn zoveel verschillende eiwitten, het is (nog) niet mogelijk ze allemaal te zien!

Wat als eiwitten te groot of te klein zijn voor scheiding, of geen geschikte fragmenten opleveren voor massaspectrometrie?

alle

Maar, in sommige organismen is dit al (bijna) mogelijk, zoals in gist:

eiwitten gist


Proteomics: wat is de toekomst? Gist: • genoom helemaal bekend (6000 genen) • proteome bijna helemaal bekend

Mens: • genoom helemaal bekend (25000 genen) • is dit proteoom binnenkort ook helemaal bekend? We hopen van wel, maar waarschijnlijk duurt het nog lang, want we zijn toch wel meer dan 4x zo ingewikkeld als bier, of niet?


Proteomics. Waarom DNA alleen niet genoeg is

Recommend Documents