PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKUSEBAGAINUTRACEUnCALFOOD ANTI ENTEROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC)
RUDI RAWENDRA
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR 2005
PROSPEK PENGEMBANGAN IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU SEBAGAI NUTRACEUnCALFOOD ANTI ENTEROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEe)
RUDI RAWENDRA
Disertasi Sebagai Salah Satu Syarat untuk Memperoleh Gelar Doktor pada Program Studi Sains Veteriner Sekolah Pasca Sarjana
SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR
2005
Judul Oisertasi
Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kering Beku Sebagai
Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) Nama
Rudi Rawendra
NRP
B 161020041
Program Studi
Sains Veteriner Disetujui Komisi Pembimbing
Dr.drh. I Wayan Teguh Wibawan, MS
Prof. Dr. Fachriyan Hasmi Pasaribu
Ketua
Anggota
Dr. Ir. Rahmat Pambudy. MS
Anggota
Ketua Program Studi Sains VellerilnE
drh. BarnballlO
Tanggal Lulu.: 1
iIIok,lah Pascasarjana
vaflnda Manuwoto, M.Sc.
3
JUL
1Il6
Tanggal Ujian: 21 Juni 2005
Abstrak RUDI RAWENDRA. Prospek Pengembangan Imunoglobulin Y (lgY) Kerlng Beku Sebagai Nutraceutical Food Anti Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). Dibimblng Oleh : I WAYAN TEGUH WlBAWAN. FACHRIYAN HASMI PASARIBU dan RAHMAT PAMBUDY Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) merupakan palogen penling penyebab diare pada anak dibawah 2 tahun, khususnya bayi berumur kurang dan 6 bulan di negara ber1<:embang. Isolat lapangan EPEe galur K1.1 setelah direidentifikasi digunakan sebagai bahan whole killed vaksin yang disuntikkan secara intravena pada ayam petelur single comb white leghom berumur 34 minggu. Setelah imunoglobulin Y (lgY) anli EPEC ditemukan dalam serum darah melalui uji agar gel precipitation test (AGPn. telur dikoleksi dan dipisahkan komponen IgY dan kuning telur dengan teknik water dilution method yang kemudian dikering bekukan. IgY Kering Beku Terdenaturasi oleh pH, pepsin, tripsin dan suhu maupun IgY WSF Kering Beku yang tidak didenaturasi kemudian diuji aktivitas netralisasinya dengan teknik enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Selain bertujuan untuk memproduksi IgY Kering Beku, penelitian ini juga mempelajari efikasinya secara in vitro dan in vivo. IgY Kering Beku yan9 dihasilkan mampu menghambat pertumbuhan EPEe pada media trypticase soy broth, mampu menghambat perlekatan EPEe pada sel kultur HEp-2, mampu menghambat perlekatan EPEe dan lesi attaching and effacing pada intestinal anak kelinci yang diinfeksi EPEe. Karakter IgY Kering Beku yang dihasilkan menunjukkan kemampuan cross reactivity terhadap EPEe gaJur K 1.3, K 1.5 dan tidak ditemukan didalam serum darah tikus putih setelah hewan coba tersebut diberi IgY secara per oral. Produksi telur anti EPEe memerlukan tambahan biaya sebesar 6,3 sampai 16,7 % dari total biaya produksi telur.
Kata Kunci. Imunoglobulin Y (lgY). enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). water soluble fraction (WSF). HEp-2. lesi attaching and effacing (Iesi AlE).
Abstract
RUDI RAWENDRA. Application Prospect of Freeze-Dried Immunoglobulin Y (lgY) as an Anti Enteropathogenic Escherichi!,?oli (EPEC) Nutraceutical Food. Advisory committee: I WAYAN TEGUH WIBAWAN, FACHRIYAN HASMI PASARIBU and RAHMAT PAMBUDY Enteropathogenic Escherichia coli (EPEe) is the most..important pathogen that causes diarrhea on infants less than 2 years old, especially babies under 6 months old in developing countries. Field isolates of EPEe K 1.1 strain after reidentification is used as a whole killed vaccine that intravenously applieated to ~eek,-old single comb brown legtrom /tIyer. After immunoglobulin Y (I9Y) anti EPEC was founded in serum by agar gel precipnation test (AGPT). eggs were collected, IgY was separdted from yolk using water dilution method and then freeze dried. Freeze dried IgY was denaturized by pH, pepsin, trypsin and temperature, as well as the undenaturated then were tested its neutralization activity using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Besides aiming to produce freeze dried IgY, this research also studied its in vitro and in vivo effication. The produced freeze dried IgY were able to inhibit EPEe growth on trypticase soy broth media, EPEe adhesion on HEp-2 cell culture as we.!! as EPEC adherence, lesions attaching and effacing on EPEe infected young rabbits intestine. Characteristic founded from freeze dried IgY showed cross reactivity to EPEe K 1.3, K 1.5 strain and were not founded in mouse serum after the experimental animal were given IgY per oral. The production of anti EPEC IgY required an additional 6.3 to 16.7% cost from the total egg production cost. Keywords: Immunoglobulin Y (lgY). enteropathogenic Escherichia coli (EPEC). water soluble fraction (WSF), HEp-2. lesion attaching and effacing.
PRAKATA Puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SNT atas segala
karunia~Nya
sehingga karya ilmiah ini berhasil diseJesaikan. Disartasi ini memuat lima bab
yang menyangkut penelitian tentang produksi, karakterisasi, pengujian in vitro, pengujian in vivo dan analisa tambahan biaya untuk menghasilkan kuning telur anli enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) maupun imunoglobulin Y (lgY) Kering Beku anti EPEC. Penelilian yang dilaksanakan sejak bulan April 2003 hingga April 2005 ini mendapal dukungan dana Hibah Pasca tahun 2004. Terima kasih kepada Dr. drh. I Wayan Teguh Wibawan MS, Prof. Dr. drh Fachriyan Hasml Pasaribu, Dr. Ir. Rahmal Pambudy MS, drh Bambang Ponljo Priosoeryanlo MS. PhD, Dr. drh. Heru Selijanlo, Dr. drh. Kamalluddin Zarkasie, Dr. drh. Relno 0 Soejoedono MS, Dr. dr. Sri Budiarti, drh. Sri Laksmi Damayanti Joesoef PhD, Dr. drh Ita Djuwila M.Ph:l, Dr. Sinis Munandar, Ir. Sapuan Tinggal M.Ed, Dr. Ir. Momon Rusmono MS, Heri Badjuri M.Sc, drh Roesian Isdhianlo, drh lia SRi Halimah MSi, Dr. drh. Sri Eslur.ingsih MS, Prof. Dr. drh. Bibiana Lay M.Sc, Dr. drh. Bambang Purwantara, Prof. Dr. Ir. Rudy Tarumingkeng, drh. Hemomoadl Huminlo MVS, drh. Ekowati Handrayani MS PhD, drh. Dewi Ralih Agungpriyono PhD, Dr. drh. Risa TIuria Tampubolon MS, Dr. Ir. Bambang Kiranadl MS, Prof. Ir Wasmen Manalu MSc PhD, Dr. drh. Marthen B Malole MSc, Prof. Dr. Ir. Zairin MS, drh. Adi Winarto MS PhD, Dr. drh. Setyo Widodo, drh. Widianlo Dwi Suryo M.Sc PhD, drh. Umi Cahyaningsih MS PhD, drh. I Kelut Mudile Adyane
MSi, Agus Somantri SPd,
Suryono, drh Chandramaya
lJamayanti, Yayan Herdiansyah SKH, Binsar Riyadi SKH, Dhodon Ramdhona, Pipit Surya, Tn Wahono, Indardi, Hellen Fadma dan Oeo Rawendra atas konstribusi pemikiran, fasilitas dan tenaganya selama pelaksanClar. proses
penelitian maupcn penulisan disertasi ini. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2005
Roo; Rawendra
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada 30 Juni 1958 di Satu, sebagai anak kedua dari enam bersaudara dan ayah loekito Handroyo (aim) dan ibu Suhartati.
Setelah lulus dan Sekolah Pertanian Menegah Atas Negeri Malang pada
tahun 1976, penulis melanjutkan pendidikan di Tingkat Persiapan Bersama Institut Pertanian Bogor. Pada tahun 1978 melanjutkan di Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, lulus sebagai Sarjana Kedokteran Veteriner
tahun 1981 dan lulus sebagai Dolder Hewan di
tahun 1982. Tahun 1989,
melanjutkan program magister pada School of Food Science and Technology,
The University of New South Wales, Sydney-Australia dan lulus tahun 1991. Mulai tahun 2002 melanjutkan program Doktor pada program studi Sains Veteriner di Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor. Sejak tahun 1982 sampai 1985 penulis bekerja sebagai Technical Service PT. Pyridam yang ditempatkan di wilayah Jawa Timur dan Indonesia Bagian Timur. Tahun 1986 sampai sekarang bekerja di Badan Pengembangan Sumber Daya Manusia Pertanian - Departemen Pertanian yang saat ini bertugas sebagai dosen di Sekolah Tinggi Penyuluhan Pertanian Malang. Penulis
menikah
dengan
drh.
Masdiana
Chendrakasih
Padaga,
M.App.Sc, PhD pada tahun 1982 dan dikaruniai seorang putra. Paduan Deoly Ananthur Rawendra dan seorang putri. Reynetha Soliandra Rawendra.
DAFTAR lSI DAFTAR TABEL..........................................................................................
iii
DAFTAR GAMBAR ......................................................................................
iv
DAFTAR LAMPIRAN ...................................................................................
v
DAFTAR SINGKATAN.................................................................................
vi
PENDAHULUAN .... ,..................................................................................... Latar Belakang.................................................................................... Perumusan Masa/ah ........... '............................................................... Tujuan Penelitian ..... ................... .......................... ............................. Manfaat Penelitian ...............................................................,.............. Hipotesa ............................................................................................. TINJAUAN PUSTAKA.................................................................................. Enteropathogenic Escherichia coli (EPEC) ......................................... Patogenesis dan Faktor Virulensi........................................................ 1. Patogenesis.................................................................................. 2. Faktor Virulensi .............................. ................................................ Gejala Klinis, Patologis dan Diagnostik .............................................. 1. Gejala Klinis ................................................................................. 2. Patologis ....................................................................................... 3. Diagnosa....................................................................................... Terapi ................................................................................................ Imunoglobulin Y (lgY) ......................................................................... Produksi IgY ...................................................................................... Struktur dan Stabilitas IgY................................................................... Water Soluble Fraction Ig y........................................................ Pemanfaatan IgY Sebagai rmunoterapi Peroral EPEe........................ PRODUKSIIMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) Abstrak ................................................... ........................................... Abstract ....................................... .......... .............. .................. ........... Pendahuluan..... ........... ............... ............................................ Bahan dan Metode.. ..................... ........................ .............. ............... Hasil dan Pembahasan ........... ...... ..................................................... Simpulan................. .. .................. ...................................................... Pustaka.............. .................... .............. ................... ......................
1 1
2 2 3 3
4 4 5 5 6 8
8 9 11 12 12 13 15 17 18
20 21 22 22 27 34 35
AKTIVITAS NETRALISASI FRAGMEN DAN EFEK SISTEMIK IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) Abstrak ........................... .................... .............................................. 38 Abstract .............................................................................................. 39 Pendahuluan....................................... ............................ ................... 40 Bahan dan Metode................... .......................................................... 42 Hasil dan Pembahasan....................................................................... 45 Simpulan.................................... .. .......................... ...................... ...... 50 Pustaka............................................................................................... 51
EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) DALAM PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN DAN ADHESI Abstrak ............................................................................................... Abs/Tact ..... .........................................................................................
Pendahuluan .............................................. '" .... '"................................. Bahan dan Metode .................................... '" .. '".................................... Hasil dan Pembahasan....................................................................... Simpulan........................................................................................ ..... Pustaka...............................................................................................
53 54 55 56 58 64 64
EFEKTIVITAS PEMBERIAN PERORAL IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPA THOGENIC Escherichia coli (EPEC) IN VIVO Abstrak ............................................................................................... 66 Abs/Tact ..... .......................................................... .............................. ~7 Pendahuluan....................................................................................... 68 Bahan dan Metode.............................................................................. 69 Hasil dar. Pembahasan....................................................................... 71 Simpulan.................. ........................................................................... 76 Pustaka.................. ............................................. .............................. 76 TAMBAHAN BIAYA DAN POTENSI NILAI TAMBAH USAHA TELUR BERKASIAT OBAT Abstrak ......... ..................................................................................... Abs/Tact .............................................................................................. Pendahuluan....................................................................................... Bahan dan Metode.............................................................................. Hasil dan Pembahasan....................................................................... Simpulan......... ..................... .............................................................. Pustaka...............................................................................................
79 80 81 82 86 92 92
PEMBAHASAN UMUM ................................................ ...............................
94
SIMPULAN DAN SARAN .......................................................................... . 106 DAFTAR PUSTAKA ................................................. .
107
LAMPIRAN ........................................................ .
116
DAFTAR TABEL 1. Patotipe dan fakter virulens E coli . ...... ... ... ........... ...... 2. Pola pe~eka!an E. coli pada sel kultur HE~2 ........................................ 3. Perbandingan proses dan produksi IgY terhadap IgG ........................... 4. Perbandingan struktur dan stabilitas IgY terhadap IgG ........................ 5. Penelitian pemanfaatan IgY sebagai Imunisasi pasif peroral................ 6. Pelaksanaan vaksinasi .......................................................................... 7. Hasil uji biokimiawi isolat Escherichia coli ............................................. 8. Awal pembentukan respon imun rute vaksinasi intramuskuler ................ 9. Konsentrasi protein dan IgY Kering Beku .............................................. 10. Respon imun tertinggi n.Jte vaksinasi intramuskuler ................................ 11. Bera! molekul fragmen IgY ..................................................................... 12. ELISA Unit serum darah tikus putih setelah pemberian IgY peroral.. .... 13. Rancangan percobaan efektivitas pemberian IgY anti EPEe ................ 14. Persentase pertambahan berat badan anak kelinci ............................... 15. Rerata produksi telur ayam ...................... .......................... .................... 16. Tambahan biaya produksi telur berkasiat obat ....................................... 17. Biaya produksi 1 kglgY Kuning Telur Kering Beku................................. 18. Biaya produksi 1 kg IgY WSF Kuning Telur Kering Beku .......................
4 11 14 16 19 24 28 30 30 32 46 49 71 72 88 89 90 91
DAFTAR GAM BAR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Patogenesis EPEC ............................................. ;................................... 5 Sistem sekresi Tipe III dan pemindahan TIR .......................................... 7 Perkiraan mekanisme diare akibat infeksi EPEe ................................. 9 Struktur pedestal-like dan intimate binding EPEe ................................. 10 Struktur Ig G, IgY, dan deletion IgY (liFe) ............................................. 15 Pola perlekatan isolat pada sel kultur HEp-2 ........................................ 28 AGPT serum darah .............................................................................. 29 8. Aktivitas netralisasi IgY anti EPEe gatur K1.1 ........................................ 31 9. Cross reactivity IgY anti EPEC galur K1.1 ............................................. 34 10. Berat motekul fragmen IgY Kering Beku................................................. 45 11. Aktivitas netralisasi fragmen IgY Kering Beku ....................................... 47 12. Aktivitas dan kapasitas fagositosis makrofag ........................................ 50 13. Efektivitas penghambatan adhesi berbagai dosis IgY pada Sel HEp-2. 59 14. Sel kultur Hep-2 terinfeksi EPEC ......................................................... 59 15. Kurva normal pertumbuhan EPEC pada media TSB ............................ 60 16. Penghambatan pertumbuhan EPEC di TSB ........................................ 61 17. Penghambatan pertumbuhan EPEC di TSB oleh IgY terdenaturasi ..... 63 18. Intestinal normal dan terinfeksi EPEC ................................................... 73 19. Penghambatan periekatan dan lesi AlE EPEe pada permukaan sel epitel anak kelinci .... ........................................... ............................................. 74 20. Lesi attaching and effacing .................................................................... 75 21. Pemindahan IgG oleh reseptor FcyRn ................................................... 101 22. Aktivitas fagositosis ............................................................................... 102
DAFTAR LAMPIRAN 1. PRODUKSI IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) .................................. 116 2. AKTIVITAS NETRALISASI FRAGMEN DAN EFEK SISTEMIK IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) ......................................................................... 127 3. EFEKTIVITAS IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKU ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) DALAM PENGHAMBATAN PERTUMBUHAN DAN ADHESI............................................................. 136 4. EFEKTIVITAS PEMBERIAN PERORAL IMUNOGLOBULIN Y (lgY) KERING BEKl.I ANTI ENTROPATHOGENIC Escherichia coli (EPEC) IN VIVO ...... 141 5. TAMBAHAN BIAYA DAN POTENSI NILAI TAMBAH USAHA TELUR BERKASIAT OBAT ................................................................................ 148
DAFTAR SINGKATAN
AGPT ASI Baduta
BFP BHI BSA CFU DAEC DMEM eae
EAEC EAF
EHEC EIEC ELISA EMB EPEC EspA EspB EspD Esps
ETEC EU Flab)" Fab
FAS Fe FeyRn
FDA FPLC GRAS HAMA HeLa HEp-2 IL-8 ITP LA
LDL LEE Lesi AlE
LPS LT MALT MLC NF-K-B NMEC N-WASP OMP PCR PMN
Agar gel precipitation test Air susu ibu Bawah 2 tahun Bundle forming pi/lus Brain heart infusion Bovine serum albumin Colony fanning unit Diffusely adherent Escherichia coli Qubellco minimal essential medium Escherichia coli attaching and effacing Enferoaggregative Escherichia coli EPEe adherence factor Enterohaemoffhagic E. coH Enteroinvasive E. coli Enzyme-linked immunosorbent assay Eosin methylene blue
Enteropathogenic Escherichia coli EPEe secreted protein A EPEC secreted protein B EPEe secreted protein D EPEe secreted proteins Enterotoxigenic Escherichia coli
ELISA Unil Fragman antigen binding sites Fragmen antigen binding site Fluorescent actin staining Fragmen crysfalization Frogmen crystalization gamma receptors Food Drug Administration Fast performance liquid chromatography Generally regarded as safe Human anti-mouse IgG antibodies Human laryngotrachealis Human epidermoid carcinoma Interleukin-B 1,4,5-lnositol TriPhosphat Localized adherence Low density lipoprotein Locus of enterocyte effacement Lesi attaching and effacing Lipopolisakalida heat-labile toxin Mucosa-associated lymphoid tissue Myosin light chain Necrosis factor -1(-8 Neonatal meningitis Escherichia coli Non Wiskoff-Aldrih syndrome Outer membrane proteins Polimerase chain reaction Polymorphonuclear neutrophil
Rantai H Rantai L
ROEC-1 Region V
REPEC RF SOS-PAGE slgA
SLT SPF -S-SST Tir
TPC TSB TTSS UPEC WSF liFe IgY v y
Rantai Heavy Ranta; Light Rabbit diarrheagenic Escherichia cofi-1 Region variable Rabbit enteropathogenic Escherichia coli Rheumatoid factor Sodium dodeeyl sulphat<>-poly aerylamide gel electrophoresis Secretory IgA Shiga-like toxin Specified pathogen free Ikatan disulfida Heat-stable toxin Translocated intimin receptor Total plate count Trypticase soy broth Type three secretion systems Uropathogenic Escherichia coli Water soluble fraction. Deletion Fc IgY Upsilon Gamma
