1
Přístrojové zajištění derivatizačních a detekčních metod Většina derivatizačních reakcí – v kapalném fázi (homogenní prostředí) často v tzv. reaktoru (standardizované) např. Pico-Tag čistě chemické reakce (viz předchozí), také der. postupy zprostředkované enzymatickou reakci před- a post-kolonová reakce je-li derivatizační reaktor stabilní součástí chromatografu, označuje se spojení „on-line“ x „off-line“ alespoň výhledově se bude použití on-line metod stále více rozšiřovat, i když samozřejmě jejich použití není univerzální. Asi největší překážkou k jejich většímu využití je přístrojová náročnost a samozřejmě cena. Z hlediska přípravy vzorku vyžadují mnohem menší objemy vzorků, na druhou stranu však nejsou všechny v současnosti používané techniky vhodné k těmto účelům (např. extrakce kapalina-kapalina). Materiály pro on-line kombinaci bývají dražší, na druhou stranu jsou nižší náklady na chemikálie, např. rozpouštědla a výhodnější je menší časová náročnost. Předkolonová derivatizace off-line umožňuje drastické podmínky; není časové omezení; nemusí být 100%, ale reprodukovatelná; derivatizační činidlo mísitelné s mob. fází nebo odstranit = rozpustný pouze analyzovaný produkt; off-line lze použít ke zvýšení hydrofobicity a tím z hydrofilní matrice izolovat analyty, jež jsou předmětem zájmu, snadněji než bez derivatizace on-line
podmínky a) der. činidla v mob. fázi netěkavá a chemicky stálá b) vznikající produkty rozpustné v mob. fázi c) musí probíhat v malém objemu d) relativně rychlé výhody: menší množství vzorku nevýhoda: všechny složky systému, tj. derivatizační reagencie, rozpouštědla a všechny produkty rozpustné v dané mobilní fázi a eluovatelné daným analytickým systémem
Postkolonová derivatizce off-line zřídka používané – jímání frakcí, obtížná automatizace (stanovení fosfátu ve fosfolipidech). Bohužel k tomuto systému off-line jsme velmi často tlačeni přístrojovou dostupností (např. MALDI, ale i NMR atd.) on-line v současnosti nejběžnější spřažení metod (viz dále); tyto kombinace zachovávají separační účinnost použité analytické metody, kterou jinak velmi potlačíme systémem off-line (sběrem frakcí) Derivatizace biol. vzorků v homogenním prostředí – problematická (tvorba sraženin) = úprava před analýzou (viz předchozí přednáška) nebo derivatizace na pevné fázi (zakotvena na nosiči) Výhody:
Postkolonové reaktory 1. použít publikované separační postupy 2. vznik vedlejších produktů není tak závažný jako u předkolonové derivatizace 3. reakce nemusí probíhat kvantitativně a reakční produkty nemusí být stálé. Reakce ale musí být reprodukovatelná, potřebujeme 2. čerpadlo
2
A) Otevřený tubulární reaktor Nejjednodušší – trubička (skleněná, křemenná, nerez. ocel, polytetrafluoroethylen – PTFE) stočená do kruhu nebo podobně, ještě lepší spirálně stočený. Rychlé reakce (do 1 min), při použití „spletených“ reaktorů (spletená vlákna) až několik minut B) Náplňové reaktory trubice z nerez. oceli plněná nosičem (většinou skleněné perličky 10-15 µm), reakční doba 0,5-4 min). Dnes: spíše aktivní nosič než inertní materiál – ionexy, redoxní činidla, nosiče obohacené katalyzátorem nebo nosiče s imobilizovanými enzymy = označ. reaktory s tuhou fází C) Reaktory se segmentovaným tokem v analyzátorech s kontinuálním průtokem (1969 - AA) Přerušení, segmentace, sloupce protékající kapaliny vzduchem nebo inertním plynem brání difůzi separované zóny. K segmentaci lze také použít nemísitelné kapaliny (voda-organika). 2 nejdůl. faktory ovlivňující účinnost reaktoru jsou smáčivost stěny a segmentační frekvence. Lze využít reakce probíhající až desítky minut použití v praxi zejména tam, kde fungují jako extrakční soustava velkou pozornost výběru rozpouštědel – smáčivost trubice má velký význam na účinnost zařízení před vstupem do detektoru je třeba odstranit segmenty plynu (org. kapaliny) – T separátory – využívají rozdílné povrchové smáčivosti různých materiálů (PTFE-sklo; vatička PTFE) membránové separátory – nejdřív PTFE membrána, nyní sendvič (střední část z PTFE, obě sousední z oceli) D) Reaktory z porézních a dutých vláken odstraňují problém vznikající z nedokonalého mísení efluentu s reagenciemi, minimální příspěvek k rozšíření separovaných zón vlákna (trubičky) ze spletených PTFE vláken v nádobce plněné vhodným činidlem (např. alkalizace NaOH — konverze na UV absorbující produkty) E) Fotochemické reaktory nefluoreskující na fluoreskující nebo elektroaktivní produkty kapilára – křemenná, temperovaná (teplotní fluktuace – reakční kinetika) F) Zdvojené reaktory každý reaktor na jiném principu 1 – ohřátím k hydrolýze 2 – ozářením na fluoreskující produkty G) Enzymové reaktory zakotvená fáze na nosičích (agarosa, celulóza, polyakrylamid, sklo, silikagel) nejobvyklejší – úprava povrchu nosiče aminopropylem a následná aktivace glutaraldehydem, pak se koordinuje enzym jako ligand Aplikace zásadně rychlé reakce
3
Redoxní reakce – pro elekrochemickou detekci (amperometrie, coulometrie, potenciometrie) nebo pro přímé převedení analytu na fluoreskující sloučeninu vitamin K — redukcí vyniká hydrochinon (flourimetricky) postkolonová generace jodu nebo bromu – I nebo Br reagují se separovanými látkami a přebytek halogenu je detekován amperometricky často používána je postkolonová oxidace vedoucí ke vzniku fluoreskujících produktů aminocukry – redukční vlastnosti, např. redukují měďnatou sůl bis(1,10-fenanthrolinu), vzniklý bis(1,10-fenanthrolin) měďný se amperometricky reooxiduje na Ag/AgCl elektrodě Hydrolytické reakce např. kortisol na fluoreskující produkty účinkem HCl Chemiluminiscenční reakce citlivé a selektivní stanovení řady látek vázaných (hydrofobně) na bílkoviny nebo fosfolipidy 3 systémy využívající: 1) deriváty kys. šťavelové (peroxyoxalátová), 2) lucigenin, 3) luminol Termálně iniciované reakce AA – ninhydrin Komplexotvorné reakce pomalé = málo rozšířené nepřímá fluormetrie iontů kovů (viz následující přednáška o stanovení kovů Postkolonové on-line derivatizační reakce viz tab. Enzymové reakce Imobilizované enzymy (předkolonové úpravy), např. β-glukoronidáza k analýze estriolových glukuronidů → produkt estriol
4
Detektory
Absorbance molární extinkční koeficient je specifický pro každou molekulu UV cutoff – sole a aditiva – zvýšení vlnové délky a absorbance a) fixní vlnová délka b) variabilní vlnová délka c) skenující (rychle skenující – 10-20x /s) d) photodiode array (výhoda – spektrum, obr.) výhody – vysoká citlivost, selektivita X univerzálnost (200 nm), nízké pozadí – umožňuje gradientovou eluci, nedestruktivní, snadné nevýhody – analys musí absorbovat, vln. délka ne pod cutoff, odpověď je rozdílná pro jednotlivé látky Index lomu (Refractive Index) porovnává index lomu čisté mobilní fáze s fází obsahující analyt; může být positivní i negativní 3 způsoby: deflekce (ohyb), Fresnel odraz a interference deflekce – měří difrakci (ohyb) světelného paprsku procházejícího skrz celu Fresnel odraz – měří intenzitu odraženého paprsku na rozhraní kapaliny a skleněného bloku. Dva světelné paprsky prochází skleněným hranolem a pak jdou do dvou foto cel (referenční a vzorková), detektor měří rozdíly mezi jejich ohybem světla interferometrický design – využívá spliterů (štěpení) k rozdělení paprsku před vzorkovou a referenční celou a jeho znovu-spojení při detekci. Jestliže je rozdíl v jejich obsahu – rozdíl v optické délce - může být konstruktivní nebo destruktivní Aplikace: size-exclusion chromatography (izokrat. separace), polymery a proteiny, cukry. Skoro pro všechny látky (mimo ty, které mají index lomu podobný jako mob. fáze), nedestruktivní, střední citlivost – vhodné pro preparativní chromatografii, změna s teplotou (změna hustoty), zpětný tlak rovněž mění hustotu Fluorescenční přirozená fluor. – benzen a deriváty (bílkoviny – tryptofan, tyrosin – jako UV) absorbuje energii ve specifické vlnové délce (excitační), dosahuje excitovaný stav a pak se vrací do původního stavu emisí světla při delší vln. délce (emisní λ) Vysoká selektivita (2 vln. délky) a citlivost (laser !!!!) hlavní nevýhoda- rozdílné vln. délky pro každou látku, derivatizace Elektrochemické detektory – měří elektrická data z roztoků pomocí 2 elektrod Amperometrické nejčastější pod názvem amperometrická detekce, kdy vzorek prochází elektrolytickou reakcí - po aplikaci konstatního napětí je měřen výsledný proud v čase. Pro látky které jsou snadno oxidovatelné nebo redukovatelné (aromatické aminy a fenoly) extrémně selektivní – pouze molekula, která je oxidovatelná nebo redukovatelná pracovní napětím může být detekována mob. fáze – elektrochemicky inertní, disociovatelný elektrolyt
5
vysoká citlivost modifikace – pulzní amperometrie Coulometric (voltametrický) modifikace amper., totální konverze všech molekul reakcí – způsobeno velkou pórezní grafitovou pracovní elektrodou nebo pomalým průtokem mob. fáze; citliva metoda, ale produkuje mnoho šumu = limita detekce obdobná Vodivostní detekce elchem. detekce k detekci iontů. Roztok bohatý na ionty je lepší vodič proudu než roztok málo ionty. Konstantní napětí v cele detektoru a měří se proud v čase. Hlavně pro analýzu organických a anorganických iontů eluovaných z iontově-výměnných kolon. Citlivé, ale neselektivní Aplikace: katecholaminy Radioaktivní pevná nebo průtoková cela (scintilační koktejl) Rozptyl světla Mnohaúhlový rozptyl laserového světla (Multi-Angle Laser Light Scattering Detector) interakce světla a hmoty když světlo udeří do hmoty, způsobí dočasný dipól v molekule který osciluje ve frekvenci dopadajícího světla. Když se molekula vrací do původního stavu, emituje světlo v různých směrech Celkový rozptyl světla je přímo úměrný molek. hmotnosti a koncentraci (software – v sérii s UV či RI k určení koncentrace) Určení Mw větší než 10.000 (není přesné pro menší než 5.000) Evaporative Light Scattering (odpařovací rozptyl světla) univerzální detektor, k detekci všech látek méně těkavých než mob. fáze výtok z kolony – zmlžen (nebulizován), vytvořena jednotná mlha která je zahřáta k odstranění těkavého rozpouštědla netěkavý analyt prochází skrz celu, kde rozptýlí paprsek ze zdroje světla Aplikace: cukry, lipidy (x jiné metody); kompatibilita s gradientem výhody: univerzálnost, gradient, nezávislý na teplotě nelineární kalibrační křivka Corona – Detekce nabitého aerosolu (Charged Aerosol Detector) Měření náboje spojeného s částicí analytu. Náboj je v přímém poměru k množství analytu ve vzorku. Detekce netěkavých analytů včetně těch bez chromoforu. Odpověď detektoru nezávisí na optických vlastnostech analytu (jako u UV/VIS detekce) nebo ionizovatelnosti (jako u MS – hmotnostní spektrometrie) Postup: 1) Přeměna analytu na částice (rozprášení, odpaření rozpouštědla) 2) Proud kladně nabitého plynu se srazí s částicemi analytu – náboj je přenesen na částice (větší částice, větší náboj); náboj získá plyn (N2) průchodem skrz vysokonapěťový platinový korónový nabíječ (corona charger)
6
3) Částice jsou převedeny do kolektoru kde je změřen vysoce citlivým elektrometrem. Alternativa k ostatním detektorům (hlavně netěkavé analyty: od lipidů po proteiny, DNA, oligosaccharidy, aminokyseliny, cukry, léčiva, ba i ionty), Univerzální detektor, citlivost až pikogramy.
Nepřímá detekce princip – fyzikální náhrada přidávané, dobře detekovatelné složky (chromoforu, fluoroforu nebo iontu) sledovaným analytem. Nejjednodušším mechanismem je zředění mobilní fáze vstupujícím analytem Univerzálnost nepřímá UV – nejběžnější; do mobilní fáze se přidává UV-aktivní látka -proba fig 4.1 smysl zobrazení píků je určován druhem anal. vzorku. Analyty, které nenesou žádný náboj a nebo mají stejný náboj jako proba – negativní píky, nenabité analyty – poskytují positivní píky, pokud jsou tak polární, že se eluují před systémovým píkem – obr. 4.2 Smysl píku závisí na náboji solutu a jeho retenci relativně k použité probě a je nezávislý na množství dávkované látky (obr. 4.3, tab. 4.1) Pokud má analyzovaný solut podobné detekční vlastnosti jako přidaná proba – výsledek je součet detek. vlastností proby a solutu (DOPA, dihydroxyfenylalanin – obr. 4.4) Volba složek – aby sledovaný analyt byl eluován v těsné blízkosti proby (docílíme jak změnou koncentrace použité proby, tak změna hydrofobních vlastností tuhé fáze (čím vyšší obsah alkylů v solutu, tím hydrofobnější musí být proba a tím méně hydrofobní musí být adsorbent) CE: kationty – (nízké pH) imidazol, N,N-dimethyl benzylamin, on-column chelatace (hydroxymáselná kys.) anionty – obrátit EOF – chromát, pyromelitat, benzoát, naftyl sulfonát
Spřažené techniky spřažené techniky – kombinace separačního potupu s technikou založenou na zcela odlišném principu nebo kombinace dvou a více separačních technik – důležitost multi*dimenzionálnosti Hmotnostní detektor hmotnostní detektor – univerzální, strukturální informace, interface k HPLC, nyní za atmosférického tlaku - účely: 1) přeměnit analyt v roztoku na ionty v plynné fázi (ESI, APCI i APPI) – produkuje ionty za atmosférického tlaku; rozdíl – jak jsou ionty tvořeny 2) odstranění HPLC rozpouštědla; k zamezení kolizí iontu analytu s rozpouštědlem – vakum (typicky 10-5 torru); jakmile je iont vytvořen – ionty v mobilní fázi dopraveny do MS skrz kapiláru a sérii clon, které redukují tlak systému; ionty jsou filtrovány a detekovány na základě poměru hmota k náboji Ionizace elektrosprejem produkce iontů začíná s nabitými polárními analyty v HPLC rozpouštědle. LC eluent je rozprášen
7
(nebulizován) do komory za atmosférického tlaku v přítomnosti silného elektrostatického pole a vyhřátého sušícího plynu. Eluent — špička jehly — vysoké napětí a tlak proudu plynu — aerosol nabitých kapének; odpařování — nabitý analyt migruje k povrchu, kapénka exploduje — menší nabité kapénky; když aerosol analytu dosáhne kritického rozměru (10 nm) — ionty analytu vytrženy z kapénky do plyné fáze; tyto ionty jsou přitahovány a prochází skrz kapiláru do hmotnostního analyzátoru Vhodnost: velké biomolekuly (proteiny, peptidy, oligonukleotidy); mají často více než 1 náboj, proto lze analyzovat až 150 000 (3000 m/z) Chemická ionizace x ESI tvoří ionty v plynné fázi (spíš než v HPLC eluentu) — analyt musí mít určitou těkavost. HPLC eluent je zmlžen ve vyhřívané komoře (analyt i solvent vypařen); korónový výboj ionizuje páry rozpouštědla („vybíjené“ elektrony) — ionty rozpouštědla předají náboj molekulám analytu chemickými reakcemi (chemická ionizace) Vhodnost: široká oblast polárních a nepol. látek, Mw menší než 1.500, ne pro nestabilní látky, normal-phase HPLC, protože většinou nepolární látky Fotoionizace Relativně nová metoda, jako při APCI – „vybíjecí“ lampa produkuje fotony v úzké oblasti ionizačních energií (opatrně zvolena k ionizaci co největšího množství molekul analytu a přitom k minimalizaci ionizace molekul rozpouštědla) — vzniklé ionty jdou skrz kapiláru do hmotn. analyzátoru Možnosti uspořádání ESI Pufry a mobilní fáze Detektory Quadrupól 4 paralení tyče ve čtverci; ionty analytu jdou skrz; napětí na tyče generuje elektromagnetické pole – toto pole určuje, který poměr hmota/náboj iontů projde filtrem v daném čase, nejjednodušší a nejlevnější 2 módy: scan a SIM Time-of-flight stejná elektromagnet. síla je aplikována na všechny ionty ve stejném čase, udělí jim akceleraci k letu dolů trubicí; lehčí ionty cestují rychleji a dosáhnou detektor první – poměry hmota/náboj iontů jsou určeny dle „času příletu“ široké hmotnostní spektrum, přesné stanovení Iontová past z kruhové elektrody a dvou uzávěrů = dohromady komůrka; ionty vstupující do komůrky jsou chyceny elektromagnetickým polem. Jiné pole může být aplikováno k selektivnímu vypuštění iontů z pasti. Výhoda – může sloužit k mnohonásobné hmot. detekci bez dalšího hmotnostního analyzátoru Jiná spřažení: s ICP-MS (inductively coupled), AAS, AES, NMR atd, ale i SPE, mikrodialýza …
8
GC detekce MS FTIR infračervená spektroskopie (Fourierova transformace); složky separované GC postupují do světelné trubice kde absorbují infračervené záření vycházející ze zdroje; Fourierova transformace interferogramu poskytuje IR spektrum, které lze použít jak k detekci dané látky, tak k její identifikaci, příp. určení čistoty FID flame ionization detection plamenový ionizační detektor ECD electron-capture elektron zachycení FPD flame photometric det. plamenový fotometr NPD nitrogen phosphorus det. (dusík fosfor detekce) TCD thermal conductivity det. (tepelně vodivostní det.) MALDI-MS (Matrix –assisted laser desorption/ionization /TOF time-of-flight makromolekulární látky jsou uloženy do lože nízkomolekulární matrice (značný přebytek, látky schopny absorbovat světlo laserového paprsku). Po krátkém ozáření laserem dochází k iradiaci vzorku a k současné desorpci a ionizaci sledované látky, která vykazuje minimální nebo žádnou absorpci při vlnové délce použitého laseru peptidy, proteiny, nukl. kys., glykokonjugáty bílkovin – matrice: kys. hydroxyskořicová
