41
PERBANYAKAN SPORA T. asperellum T13danA. niger A1 DALAMMEDIA PADAT DAN CAIR ABSTRAK Tujuan penelitian adalah mendapatkan media padat dan cair terbaik untuk perbanyakan spora A. niger A1dan T. asperellumT13.Di samping itu dilakukan analisis pembentukan asam sitrat, malat, oksalat dan α-ketoglutarat serta IAA, GA dan ABA selama masa inkubasi. Sedang pemekatan spora dari kapang uji dilakukan dengan beberapa kecepatan sentrifugasi. Dilakukan pra-inokulasi dan seleksi awal dengan perendaman media uji dalam akuades sebanyak 5, 10 dan 15 mL, masing-masing selama 1 dan 2 jam sebelum media disterilisasi. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pra-perlakuan terbaik adalah penambahan 5 mL akuadesdengan perendaman selama 2 jam. Media perbanyakan padat terpilih adalah jagung, beras dan milet, media cairT. asperellum T13terpilih adalahT1-2 , T34, T5-6, T7-8, T9 danT10 dan untuk A. niger A1adalah A1-2, A 3, A 4, A 5, A 6, A 7-8, A 10 9, dan A10. Spora T. asperellum T13 terbanyak 5,34 x 10 spk/mL diperoleh dari media milet dan 3,1x1010 spk/mL dari media cair T3-4. Spora A. niger A1terbanyak 3,03 x 1010 spk/mL diperoleh dari media beras merah, dan 1,6 x 1010 spk/mL dari media cair A5. Produksi spora berkorelasi nyata positif dengan penurunan pH dan produksi asam sitrat, malat, oksalat dan α-ketoglutarat. Asamasam organik diproduksi tinggi pada hari ketiga. Produksi asam sitrat pada media padat lebih tinggi pada hari ketiga sementara media cair pada hari ke 6 untuk kedua kapang uji. Asam sitrat terbanyak 2.533,27 ppm dihasilkan pada media T12untuk T. asperellumT13 dan 872,46 ppm pada mediaA3 untuk A. niger A1.Produksi fitohormon pada hari ke enam inokulasi sangat fluktuatif dan sangat ragam.T. asperellum T13 memproduksi IAA tertinggi5.445,01 ppm pada media milet, ABA 764,65 ppm pada T7-8 dan763,58 ppm pada media T3-4dan produksi 445,01 ppm GA pada milet. A. niger A1 memproduksi IAA tertinggi 1.588,32 ppm pada media milet, ABA173,61 ppm pada media A4danABA 2.617,14 ppm pada beras merah.Pemekatan spora terbaik adalah sentrifugasi pada kondisi suhu 4oC selama 5 menit dengan kecepatan 10.000 g untuk T. asperellum T13 dan 6.000 g untuk A. niger A1. Kata kunci :Aspergillus niger,Trichoderma asperellum, asam indol asetat, asam giberelat, asam absisat, asam malat, asam sitrat, asam oksalat, asam α-ketoglutarat, pemekatan spora.
PENDAHULUAN Produksi biofertilizer dan biofungisida yang berbasis mikroba pada umumnya dikemasdalam bentuk spora dengan bahan pembawa. Masalah yang dihadapi dalam produk hayati berbasis mikroba adalah teknik perbanyakan spora
42
yang produktif dan efisien, cara pengemasan yang mampu mempertahankan viabilitas spora dalam jangka waktu tertentu, serta cara pengemasan yang efisien. Perbanyakan spora adalah proses penggandaan jumlah spora kapang yangdapat dilakukan menggunakan mediapadat maupun cair. Bahan dalam bentuk padat maupun cair yang mengandung spora dan ditambahkan pada substrat disebut inokulum.Media perbanyakan spora dapat menggunakan bahan alami maupun sintetik.Faktor yang menentukan pertumbuhan adalah kandungan air, karbon, nitrogen, mineral, vitamin dan bahan tambahan lainnya. Pertumbuhan mikroba dapat dilakukan dalam kultur diam atau goyang, yang akan membedakan aerasi. Banyaknya udara yang tersedia untuk kultur menentukan perbedaan pertumbuhan maupun hasil metabolisme yang dihasilkan oleh setiap jeniskapang. Kapang memerlukan waktu 3-5 hari untuk pertumbuhan di media media padat.Kapang menghasilkan enzim secara optimum pada hari ke tiga. Pertumbuhan kapang dapat dibagi dalam 6 fase, dan produksi spora terbanyak berlangsung pada fase eksponensial, dimana dihasilkan enzim yang menghambat pertumbuhan, sehingga spora kapang sudah dibentuk secara optimal untuk dapat bertahan hidup. Substrat merupakan bahan yang akan dimetabolisme oleh kapang agar bertahan hidup. Untuk produksi massal, media perbanyakan spora umumnya menggunakan limbah pertanian.Hal yang perlu diperhatikan dalam penggunaan media adalah komposisi bahan yang mencakup kemurnian bahan, rasio C/N, tersedianya nutrisi. Selain itu perlu diperhatikan pengaruh pencampuran bahan, pH, efek sterilisasi pada mineral dan garam dan adanya perubahan pada media sebelum dans setelah inokulasi seperti suhu, aerasi, dan antifoam. Selama proses perbanyakankapang melakukan reaksi metabolisme dan hasil metabolismediekskresikan ke dalam media, baik berupa metabolit primer seperti asam-asam organik sitrat, oksalat, malat dan α-ketoglutarat. Disamping itu dihasilkan juga fitohormon asam indol asetat (IAA), asam giberelat (GA) dan asam abisat (ABA). Reaksi yang terjadi merupakan proses perubahan kimia yang dikatalis oleh enzim-enzim kapang, dan mengakibatkan perubahan karakteristik media, diantaranya penurunan pH.
43
Asam sitrat merupakan salah satu metabolit primer yang dihasilkan oleh kapangA. niger, dan erat hubungannya dengan aktivitas pelarutan fosfat dalam tanah yang berlangsung akibat dari efek penurunan pH dan pengkelatan kationkation. Fitohormon merupakan hasil metabolit sekunder yang dihasilkan pada kondisi tertentu. Bilkayet al. (2010) menyatakan produksi IAA A. niger tertinggi dihasilkan pada hari ke enam, sedangkan GA pada hari ke 12. Selain itu, kultur dengan
pengocokan
dilaporkan
menghasilkan
fitohormon
lebih
tinggi
dibandingkan dengan kultur statis. Tahapan setelah spora diproduksi adalah penyimpanan dalam bahan pembawa. Semakin besar jumlah spora yang diproduksi, akan semakin banyak diperlukan bahan pembawa yang mungkin akan menimbulkan masalah transportasi ke lapang untuk diaplikasikan.Pemekatan spora merupakan salah satu alternatif untuk efisiensi kemasan dan pengiriman. Beberapa teknik yang sudah dikenal diantaranya sentrifugasi yang telah diteliti oleh Charvat (2007) untuk spora mikoriza, Bassel dan Miller
(1982) memekatkan spora pakis Onoclea
sensibilis L., Zhou et al. (2006) memekatkan Bacillus thuringiensis dan d’Enfert dan Mol (2005) memekatkan A.fumigatus. Teknik kering beku yang biasanya digunakan untuk preservasi jangka panjang dapat juga dijadikan alternatif sebagai pemekatan spora karena cairan yang menyertai spora akan diuapkan pada teknik L-drying atau disublimasi pada teknik kering beku atau liofilisasi (Ilyas 2007). Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan media terbaik untuk perbanyakan spora, serta teknik sentrifugasi untuk pemekatan spora yang optimum untuk kapangT. asperellum T13dan A.niger A1.
BAHAN DAN METODE Percobaan terdiri dari lima kegiatan, yaitu (i) optimasi perlakuan prainokulasi media padat perbanyakan spora, (ii) seleksi awal media perbanyakan spora, (iii) optimasi media perbanyakan spora, (iv) analisis asam-asam organik dan fitohormon dan (v) penetapan teknik pemekatan spora dengan sentrifugasi.
44
Optimasi Perlakuan Pra-inokulasi Media Padat Perbanyakan Spora Dua kapangindigenusyang diuji, yaituT.asperellum T13 dan A.niger A1. Percobaan didisain berdasarkan rancangan lingkungan acak lengkap (RAL) dengan dua faktor, yaitu faktor perendaman selama 1 dan 2 jam. Faktor kedua, yaitu volume akuades yang ditambahkan dalam media dengan tiga taraf, yaitu 5,10 dan 15 mL. Media padat yang digunakan,yaitu beras merah, beras menir, jagung, jagung menir dan milet. Perlakuan diulang sebanyak enam kali. Media padat direndam sempurna selama satu dan dua jam dalam air panas. Media yang sudah direndam selanjutnya ditimbang sebanyak 10 g dalam kemasan plastik tahan panas ukuran 0,5 kg dan ditambahkan 5, 10 dan 15mL akuades lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121oC, 30 menit dan dikeringanginkan dalam biosafety cabinet (Lampiran 12). Suspensi kapang disiapkan dengan menambahkan 100 mL NaCl 0,85% steril pada dua cawan Petri yang berisi biakan kapang berumur 2 sampai 3 minggu, dan dikocok selama 15 menit dengan kecepatan 150 rpm (Lampiran 11). Selanjutnya sebanyak 1 mL suspensi spora diinokulasikan ke dalam kantong berisi media padat lalu ditutup menggunakan plastic sealer membentuk prisma segitiga. Media diinkubasi selama 6 hari dalam kotak dalam kondisi gelap. Spora dipanen dengan cara menambahkan 100 mL larutan NaCl 0,85% steril ke dalam botol selai berisi media spora, mengocoknya di atas pengocok dengan kecepatan 150 rpmselama 15 menit (Lampiran 14). Penghitungan jumlah spora dilakukan dengan menggunakan hemasitometer(Jaiswal 2005) dengan modifikasi. Spora visual, kemudahan panen dan kepadatan miselia dinilai secara kategorik pada skalaskor 1-5 selanjutnya diuji berdasarkan uji non-parametrik Kruskal-Walis.
45
Seleksi Awal Media Perbanyakan Spora Seleksi Awal Media padat Media padat direndam sempurna selama 2 jam dalam air panas. Media yang sudah direndam selanjutnya
ditimbang sebanyak 10 g dalam kemasan
plastik tahan panas ukuran 0,5 kg dan ditambahkan 5mL akuades lalu disterilisasi dengan autoklaf pada suhu
121oC, 30 menit dan
dikeringanginkan dalam
biosafety cabinet. Selanjutnya perlakuan sama dengan percobaan pra-inokulasi. Seleksi Awal Media cair Untuk perbanyakan sporaA. niger A1digunakan enam jenis media dan delapan jenis media T. asperellum T13. Sebanyak 200 µLsuspensi spora diinokulasikan ke dalam labu Erlenmeyer berukuran 250 mL, yang masingmasing berisi 50 mL media cair yang digunakan, yaitu T1-2, T3-4, T5-6, T7-8, T9 dan T10(Tabel 4) untuk T. asperellum T13 dan delapan media cair, yaitu A1-2, A3, A4, A5, A6, A7-8, A9 dan A10 untuk A. niger A1 (Tabel 5). Inkubasi dilakukan dalam inkubator 28oC selama enam hari. Perlakuan diulang sebanyak enam kali. Peubah yang diukur adalah kemampuan menghasilkan spora pada hari ke 6 secara visual. Media yang mampu memenuhipermukaan media dengan spora digunakan selanjutnya (Jaiswal et al. 2005) dengan modifikasi. Optimasi Media untuk Perbanyakan Spora Percobaan dilakukan untuk memperoleh jenis media
terbaik
untuk
perbanyakan spora T. asperellum T13 dan A. niger A1. Percobaan terdiri dari dua kegiatan, yaitu perbanyakanspora dalam media padat dan media cair terseleksi. Optimasi Media Padat untuk Perbanyakan Spora Beras merah, milet, jagung dan beras putihdigunakan dalam percobaan optimasi yang masing-masing diulang sebanyak enam kali. Sebanyak 1 mL suspensi kapang uji diinokulasikan ke dalam 10 g media padat perbanyakan steril dalam kantong plastik. Media disiapkan berdasarkan hasil percobaan prainokulasi. Inkubasi dan penghitungan spora dilakukan sama seperti perlakuan seleksi awal (Lampiran 13).Peubah lain yang diukur adalah pH awal dan hari
46
keenam inkubasi (Lampiran 3), di samping itu dilakukan analisis terbentuknya asam sitrat, malat dan α-ketoglutarat serta asam indol asetat (IAA), asam giberelat (GA) dan asam absisat(ABA) menggunakan UPLC (Lampiran 15 dan 16).
Optimasi Media Cair untuk Perbanyakan Spora Jenis media yang diuji terdiri dari enamjenis media T. asperellumT13 dan delapanjenis media A. niger A1dengan perbedaan komposisi berdasarkan sumber karbon, nitrogen dan mineral makro maupun mikro (Tabel 4 dan 5).
Tabel 4 Komposisi media cair T. asperellum T13 Komposisi
T1-2
T3-4
T5-6
T7-8
T9
T10
g/L Yeast extract Glukosa KH2PO4 MgSO4,7H2O KCl FeSO4.7H2O ZnSO4 CuSO4 (NH4)2SO4 Sukrosa Jagung Kentang Beras putih
2,80 30,00 1,00 0,50 0,50 0,01 0,01 0,005
20,00
5,00
20,00
1,00 0,50 0,50 0,01 0,01 0,005 10,00 10,00
5,00 60,00
5,00
5,00
60,00 60,00
Tabel 5Komposisi media cair A. niger A1 Komposisi
A1-2
A3
A4
A5
A6
A7-8
A9
A10
g/L Al(PO4) Ca3(PO4)2 NaCl MnSO4.7H2O MgSO4,7H2O KCl FeSO4.7H2O (NH4)2SO4 Glukosa Yeast CaCl2 Sukrosa Jagung Kentang Beras putih
5,00 0,20 0,0025 0,10 0,20 0,0025 0,50 10,00 0,50
5,00
5,00
5,00 0,20 0,0025 0,10 0,20 0,0025 1,00
5,00 0,20 0,0025 0,10 0,20 0,0025 1,00
0,10 0,0025 0,10 0,20 0,0025 1,00
0,10 0,0025 0,10 0,20 0,0025 1,00
0,10 0,200 10,00
0,10 0,200 5,00
0,10 0,200 10,00
0,10 0,400 10,00
5,00 60,00
5,00
5,00
60,00 60,00
47
Sebanyak 50 mL media cair diinokulasi dengan 200 µL suspensi spora. Media diinkubasi selama 6 hari dalam inkubator 28oC (Lampiran 13). Perlakuan diulang sebanyak enam kali dan peubah yang diamati adalah jumlah spora, penurunan
pH,
produksi
asam-asam
organik
serta
kandunganfitohormon(Lampiran 15). Analisis Asam Sitrat, Malat, α-Ketoglutarat, IAA, GA dan ABA Sebanyak 2 mL dari masing-masing biakan uji hasil inokulasi berumur 6 hari disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g selama 5 menit. Dari contoh uji kemudian dianalisis kandungan asam sitrat, asam malat dan asam α-ketoglutarat. Di samping itu juga dianalisis kandungan IAA, ABA dan GAdilakukan menggunakan UPLC (Lampiran 16). Analisis kromatografi menggunakan Acquity UPLC H-Class. Ekstrak sampel sebanyak 1 µL diinjeksikan ke dalam kolom Acquity UPLC BEH C18 (1,7 µm, 2,1 x 50 mm) dengan detektor Acquity UPLC PDA. Analisis hormon menggunakan elusi isokratik dengan fase gerak akuades dijadikan pH 4,0 oleh penambahan H3PO4 dan asetonitril (74:26) dan laju alir 0,2 mL/menit. Signal komponen dimonitor pada panjang gelombang 208 nm selama 3 menit. Sedangkan analisis asam organik menggunakan elusi isokratik dengan fase gerak akuades dijadikan pH 2,5 oleh penambahan H2SO4 dan laju alir 0,1 mL/menit. Signal komponen dimonitor pada panjang gelombang 210 nm selama 4,5 menit. Standar hormon (asam indol-3asetat, asam gibberellat, dan asam absisat) dan asam organik (asam oksalat, asam sitrat, asam maleat, dan asam α-ketoglutarat) dilarutkan dalam fase gerak masingmasing. Metode Analisis Data Penentuan media optimum dilakukan berdasarkan analisis LSD. Apabila terdapat peubah yang memberikan pengaruh nyata (Fhitung>Ftabel ), maka dilanjutkan dengan uji Duncan (DMRT) pada selang kepercayaan 95% untuk menguji beda antar perlakuan. Hubungan korelasi di antara pH, spora dan asamasam organik diukur berdasarkan koefisien korelasi Pearson.
48
Penetapan Teknik Pemekatan Spora dengan Sentrifugasi Sebanyak 2 mL 1,7x109 satuan pembentuk koloni (spk)/mL suspensi spora T. asperellum T13 dan 3,9x108 spk/mL A. niger A1 dimasukkan ke dalam tabung mikro 2 mL, selanjutnya disentrifugasi untuk pemekatan spora uji (Lampiran 17). Sentrifugasi dilakukan pada suhu 4oC selama 5 menit dengan enam kecepatan yang diuji, yaitu : 4.000 g, 6.000 g, 8.000 g, 10.000 g, 12.000 g dan 16.000 g. Kecepatan sentrifugasi terbaik disimpulkan berdasarkan kecepatan yang menghasilkan jumlah spora terendah yang tertinggal dalam supernatan. Spora dihitung menggunakan hemasitometer. Jumlah tersebut merupakan nilai kehilangan yang harus diminimalisasi. Setiap perlakuan diulang sebanyak enam kali. Fraksi pelet hasil sentrifugasi diresuspensi dengan menambahkan 1 mL NaCl 0,85% dan sebanyak 1 mL ditumbuhkan dalam media PDB agar dengan teknik tuang cawan. Spora dihitung menggunakan colony counter.
HASIL DAN PEMBAHASAN
Optimasi Perlakuan Pra-inokulasi pada Media Perbanyakan Padat Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa pengamatan spora secara visual dan kemudahan panen tidak berbeda nyata antaraperlakuan perendaman selama 1 jam dalam 10 mL akuades dengan perlakuan perendaman selama 2 jam dalam 5 mL akuades, dengan sedikit lebih tinggi pada 2 jam 5 mL. Produksi spora terbaik adalah pada kondisi perendaman 1 jam dalam akuades 10 mLnamun tidak berbeda nyata dengan perlakuan 2 jam dalam 5 mL(Tabel 6). Kondisi optimum prainokulasi yang ditetapkan adalah 2 jam perendaman dalam air panas (60oC) dengan penambahan akuades 5 mL dan sterilisasi autoklaf 121oC 30 menit. Kondisi ini diambil berdasarkan tidak adanya perbedaan kemudahan panen, miselia dan spora secara visual. Selain itu, tidak terdapat beda nyata pada jumlah spora perlakuan 1 jam 10 mL dan 2 jam 5 mL. Penetapan 2 jam perendaman didasari atas pertimbangan memberikan ketersediaan air yang lebih banyak untuk mendukung pertumbuhan spora dan perendaman dalam air panas
49
bertujuan untuk menyiapkan tekstur media yang lebih lunak pasca autoklaf untuk memudahkan pelekatan miselia. Tabel 6 Interaksi waktu perendaman dan penambahan air terhadap spora visual, miselia, kemudahan panen dan jumlah spora Miselia tn
Kemudahan Panen tn
3.50 ± 1.43
2.00 ±1.30
2.35 ± 0.81
3.58 ± 3.72
c
10
3.15 ± 2.11
2.30 ± 1.42
2.15 ± 0.88
5.50 ± 3.55
a
15
2.55 ± 1.88
1.45 ± 1.28
1.40 ± 1.05
4.34 ± 4.34
b
5
3.40 ± 1.57
1.45 ± 1.15
2.25 ± 0.91
5.33 ± 3.59
a
10
2.65 ± 1.98
2.15 ± 1.60
1.90 ± 1.12
4.14 ± 2.97
ab
Prendaman
Vol. Air (mL)
1 Jam
5
2 jam
SporaVisual tn
Jumlah Spora (108 spk/mL)*
15 3.35 ± 1.46 1.55 ± 0.69 1.60 ± 0.82 4.63 ± 4.18 bc * Keterangan : : tidak berbeda nyata (P>0.05), : berbeda nyata (p<0.05) menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%.Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%. tn
Seleksi Awal Media Perbanyakan Spora Mediaberpengaruh nyata terhadap produksi spora, produksi miselia dan tingkat kemudahan panen. Produksi spora tertinggi diperoleh dari media beras merah, yaitu sebanyak 8,13 x108 spk/mL suspensi. Beras merah mengandung lebih banyak mineral seperti Mn, Fe, Na dan Mg dibandingkan dengan media lainnya. Hasil spora tidak berbeda nyata terdapat pada media jagung. Umumnya elemen-elemen ini berperan sebagai kofaktor dalam reaksi-reaksi metabolisme biokimiawi. Sedangkan produksi spora pada media milet, jagung menir dan beras menir lebih rendah (Gambar 8). Menurut Santika (2010) kemampuan beras merah menghasilkan spora terbanyak diduga disebabkan pH yang tidak asam, kandunganprotein,Zn, Fe, dan tiamin yang lebih tinggi. Kemudahan panen tertinggi diperoleh pada milet dan jagung (Tabel 7).Milet berupa butiran biji berbentuk bulat relatif kecil, tidak hancur oleh perasan, dan tidak lengket. Spora tumbuh berupa lapisan tipis di atas permukaan secara merata sehingga mudah dibilas pada saat panen. Sporakapang cenderung tumbuh semakin banyak pada permukaan media semakin luas dan oksigen cukup banyak. Panen yang relatif lebih sulit terjadi pada media menir, hal ini disebabkan struktur media lebih cair dan lengket (Tabel 7). Media menir tidak digunakan untuk percobaan selanjutnya.Pertumbuhan miselia berbanding terbalik dengan
50
spora. Umumnya miselia dihasilkan melimpah pada kondisi menguntungkan bagi kapangseperti pada media yang kaya akan nutrisi. Secara umum, produksi spora oleh T.asperellum T13 dari hasil perhitungan hemasitometer dan pengamatan visual lebih tinggi dengan perbedaan nyata dibandingkan dengan A.niger A1. Produksi miselia berbanding terbalik dengan spora (Tabel 8). Tidak terdapat perbedaan nyata untuk kemudahan pemanenan spora pada kedua kapang uji.
Gambar 8Kemudahan panen, produksi spora, dan produksi miselia pada media padat. Keterangan :Jumlah spora dinyatakan dalam 108 spk/mL.
Tabel 7 Produksi spora, miselia dan tingkat kemudahan panen pada media perbanyakan padat Jenis Media Beras Menir Beras Merah Jagung Jagung Menir Milet Keterangan:
Jumlah spora (x108 spk/mL) **
Produksi miselia**
Tingkat Kemudahan panen **
1,88 ± 1,36 ab 1,50 ± 0,92 b 1,00 ± 0,53 b 2,88 ± 1,55 a 1,38 ± 0,92 b
2,85 ± 2,84 b 8,13 ± 2,67 a 5,41 ± 5,35 ab 2,42 ± 1,79 b 3,46 ± 2,12 b
1,13 2,50 2,75 2,13 3,00
± 0,35 c ± 0,53 ab ± 0,71 a ± 0,83 b ± 0,00 a
**
: berbeda sangat nyata (P<0.01),menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%.
Tabel 8 Produksi spora, kemudahan panen, produksi miselia dan spora visual pada dua kapang uji Spora **
Medium
Aspergilus 2,36±2,09 Trichoderma 6,81±3,70 Keterangan:
**
Kemudahan Panen tn b a
2,02±1,08 1,87±0,87 *tn
Miselia **
2,20±1,65 1,43±0,56
SporaVisual ** a b
2,10±1,79 4,10±1,00
b a
: berbeda sangat nyata (P<0.01), : tidak berbedanyata (P>0.05)menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%.
51
Optimasi Media Perbanyakan Spora Produksi Spora pada Media Perbanyakan Perbanyakan spora dalam medium milet memberikan hasil tertinggi untuk T. asperellum T13. Produksi spora tidak berbeda nyata baik padamilet, media beras putih, beras merah dan jagung (Tabel 9). pH yang ideal untuk T. asperellum T13adalah netral. Hasil yang diperoleh didukung penurunan pH yang minim pada media milet dan media ini juga memiliki kandungan protein yang lebih tinggi dibandingkan denganmedia yang lain(Gambar 9).
Gambar 9Produksi spora dan selisih pH T.asperellumT13(kiri) dan A.niger A1(kanan) dalam media padat.
Produksi spora T. asperellum T13dalam media cair T3-4 tidak berbeda nyata dengan T1-2 (Gambar 10). Media T3-4 yang terdiri dari ekstrak khamir dan sukrosa mampu menghasilkan spora sebanyak media lengkap T1-2. Media T9, dengan kentang dan gula pasir masih termasuk dalam kelompok yang sama (Tabel 10). T9dengan sukrosa sebagai sumber karbon, dan kentang karbohidrat lebih rendah, lemak dan protein, namun tinggi akan vitamin dan mineral (Mg, K, Ca, Fe). Hasil menunjukkan tidak adanya perbedaan nyata produksi spora umum pada empat media padat uji (Tabel 9) . Produksi spora terbanyak namun tidak berbeda nyata adalah pada media milet untuk T. asperellum T13 ( 5,34 x 1010 spk/mL)dan beras merah untuk A. niger A1 ( 3,03 x 1010 spk/mL).
52
Tabel 9 Produksi spora dan penurunan pH dua kapang uji pada media padat Kapang
Jenis Media Beras Putih
T. asperellum T13
Beras Merah Milet
pH0 tn
pH6 **
6,75 ± 0,04 6,68 ± 0,03 6,72 ± 0,01
ΔpH6**
Jumlah Spora tn
4,58 ± 0,67
b
2,16 ± 0,68
a
352,20 ± 251,76
5,57 ± 0,43
a
1,11 ± 0,45
b
362,07 ± 242,55
5,88 ± 0,10
a
0,84 ± 0,10
c
534,17 ± 157,04
Jagung 6,64 ± 0,02 5,92 ± 0,10 a 0,72 ± 0,11 c 475,00 ± 278,11 Beras Putih 6,73 ± 0,01 5,13 ± 0,61 a 1,60 ± 0,61 b 41,27 ± 20,04 Beras Merah 6,66 ± 0,06 5,12 ± 0,32 a 1,54 ± 0,32 b 302,57 ± 205,37 A. niger A1 Milet 6,71 ± 0,01 5,35 ± 0,50 a 1,36 ± 0,51 b 193,57 ± 62,86 Jagung 6,64 ± 0,03 5,20 ± 0,66 a 1,44 ± 0,66 b 229,57 ± 142,31 ** *tn Keterangan: : berbeda sangat nyata (P<0.01), : tidak berbedanyata (P>0.05)menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%.
Tabel 10Produksi spora dan penurunan pH media cair T. asperellum T13 Jenis Media
T9
T1-2 T3-4 T5-6 T7-8
T10 Keterangan:
pH0 **
pH6 ** d
5,39 5,76 5,46 6,18 6,16 6,17
b c a a a
3,08 4,26 2,90 4,54 6,07 4,80
ΔpH6** c b c b a b
Jumlah Spora ** ab
2,31 1,50 2,56 1,64 0,09 1,37
c a bc d c
298,40±182,04 310,20±155,23 6,00±5,70 44,30±31,54 253,00±120,40 42,50±33,63
a a b b ab b
**
: berbeda sangat nyata (P<0.01)menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%. Jumlah spora dalam 108 spk/mL.
Tabel 11 Produksi spora dan penurunan pH media cair A. niger A1 Jenis Media
A9
A1-2 A3 A4 A5 A6 A7-8
A10 Keterangan:
pH0 ** 5,70 6,13 5,91 4,79 4,46 5,87 6,17 6,32
c ab bc d d bc ab a
pH6 ** 4,18 4,32 4,55 3,05 3,00 4,43 6,50 4,48
b b b c c b a b
ΔpH6 ** 1,52 1,81 1,36 1,74 1,46 1,44 0,33 1,84
a a a a a a b a
Jumlah Spora ** 62,35±50,42 19,57±10,83 22,27±33,25 159,43±96,18 98,33±77,82 64,43±57,23 48,10±34,04 25,07±16,04
bc c c a bc bc bc c
**
: berbeda sangat nyata (P<0.01)menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%. Jumlah spora dalam 108 spk/mL.
Secara umum, penurunan pH keempat media padat yang diuji selama inkubasi dan jumlah spora yang diproduksi juga tidak berbeda nyata. Penurunan pH pada media cair beras putih A10sebesar1,84 menghasilkan produksi spora
53
yang lebih rendah dibandingkan dengan tiga media lainnya, menunjukkan adanya hubungan antara penurunan pH dan produksi spora (Tabel11). Media perbanyakan padat terbaik untuk A. niger A1 adalah beras merah. pH beras merah sesuai dengan pH optimum kapang ini, yaitu 5,0-5,5, dan mengandungFe3+, Zn2+, Mn2+. Menurut Guilherme et al. (2008)mineral tersebut dalam kultur A. niger dapat meningkatkan pertumbuhan dan produksi asam sitrat. Media perbanyakan cair terbaik untuk A. niger A1 adalah A5 (Gambar 10) yang berbeda nyata dengan media lainnya. Media A5 menggunakan aluminium fosfat sebagai substrat, dan sukrosa menggantikan glukosa, lebih banyak kandungan garam
NaCl dan ion amonium, pengurangan ekstrak khamir dan
penggunaan CaCl2, dibandingkan dengan komposisi yang digunakan dalam media A1. Media A6 dengan satu perbedaan pada CaCl2 dua kali lebih banyak diandingkan dengan A5menghasilkan spora lebih sedikit menunjukkan adanya ion Ca berlebih kemungkinan mengkelat fosfat yang terlarut.
Gambar 10 Produksi spora dan selisih pHT. asperellum T13(kiri) dan A. niger A1(kanan)dalam media cair. Penggunaan Al-P dalam media menghasilkan pertumbuhan spora tertinggi, yang terlihat dalam produksi spora A1-2, A5 dan A6.Kapang efektif dalam melarutkan P terikat aluminium. Barosso dan Nahas (2008) melaporkan bahwa pelarutan Ca-P meningkat oleh glukosa dan Al-P oleh sukrosa. Amonium lebih mampu melarutkan P dibandingan dengan ekstrak khamir. Hal ini disebabkan metabolisme amonium akan menyebabkan pH medium mengalami penurunan
54
menjadi lebih asam dan lebih mendukung pertumbuhan A.niger. Penurunan pH media yang cukup tinggi selama masa inkubasi diperoleh dari media A5 yang menghasilkan spora tertinggi. Penurunan pH yang tinggi berpengaruh positif terhadap perbanyakan spora A. niger A1, selain pH awal yang rendah (Tabel 10). Selain itu, faktor nutrisi dan suhu juga menentukan pertumbuhan kapang. Secara umum terdapat perbedaan produksi spora antara kedua kapang uji (Tabel 12).Tampak bahwa T. asperellum T13 menghasilkan spora lebih banyak (4,31x1010spk/mL)dibandingkan dengan A. niger A1 1,92x 1010 spk/mL. Hasil ini memperkuat hasil percobaan awal.
Hasil
ini diperoleh dalam kondisi tidak
adanya perbedaan penurunan pHantar media uji(Tabel 13). Tabel 12 Produksi spora dan penurunan pH pada dua kapang uji Kapang
pH0 tn
pH6 **
T. asperellumT13 A. nigerA1
6,70 6,68
5,49 5,20
Keterangan:
ΔpH6tn a b
Jumlah Spora **
1,21 1,48
430,86 191,74
a b
**
: berbeda sangat nyata (P<0.01)menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%. Jumlah spora dalam 108 spk/mL. ΔpH adalah selisih pH awal dan inkubasi hari keenam.
Tabel 13 Produksi spora dan penurunan pH pada media padat yang diuji Jenis Medium
pH0 **
Beras Putih Beras Merah Milet Jagung
6,74 6,67 6,71 6,64
Keterangan:
pH6 ** a b a c
4,86 5,34 5,62 5,56
ΔpH6** b a a a
1,88 1,33 1,10 1,08
Jumlah Spora tn a b b b
196,73 332,32 363,87 352,28
**
: berbeda sangat nyata (P<0.01)menurut uji lanjut LSD pada selang kepercayaan 95%. Angka yang diikuti oleh huruf yang sama tidak berbeda nyata pada uji lanjut LSD dengan selang kepercayaan 95%. Jumlah spora dalam 108 spk/mL. ΔpH adalah selisih pH awal dan inkubasi hari keenam.
Produksi Asam-asam Organik Selama Tahap Perbanyakan Spora Produksi spora berkorelasi positif dengan produksi asam sitrat, namun tidak berkorelasi dengan pembentukan asam malat dan asam α-ketoglutarat serta penurunan pH media(Tabel 14). Penurunan pH media selama masa inkubasi berkorelasi sangat nyata dengan produksi asam sitrat, asam maleat dan oksalat, kecuali asam α-ketoglutarat.
55
Kultur dalam media padat dan cair A. niger A1 memproduksi asam-asam organik pada hari ke 3. Secara umum, asam-asam organik total diproduksi paling tinggi pada hari ke tiga, dan tertinggi pada media padat A. niger A1 dan media T34T.
asperellum T13(Gambar 11).Kapangmenghasilkan asam-asam organik melalui
jalur siklus asam sitrat.
Banyaknya asam α-ketoglutarat yang terakumulasi,
menunjukkan laju biosintesis tidak terhenti pada jalur produksi asam sitrat namun berlanjut ke produksi asam α-ketoglutarat untuk menghasilkan energi. Tabel 14 Hubungan korelasi Pearson antara produksi spora, penurunan pH dan produksi asam-asam organik pada media cair Spora
ΔPH6
As. α-Ketoglutarat Asam Sitrat Asam Maleat
tn
DPH6
-0,053
Asam α-Keto Asam Sitrat Asam Maleat Asam Oksalat
-0,152 tn -0,007 0,484 ** 0,445 -0,087 tn 0,343 -0,024 tn 0,358
tn **
0,353 0,016 0,525
* *
* tn
tn
0,201 0,358
**
tn
0,296 tn
**
Keterangan: tn:tidak berkorelasi secara nyata(P>0.05). * berkorelasi nyata(P<0.05), sangat nyata (P<0.01) menurut uji korelasi Pearson. ΔPH6:selisih pH awal dan inkubasi hari ke 6. 7500 Asam Organik Total Asam Sitrat
Konsentrasi (ppm)
6000
4500 14732,39
2942,31 3198,65
3000 3958,85
1739,77
Hari 3
Mil
Jag
399,71222,89 160,09
BP
164,01128,49
BM
T9
T 7-8
T 5-6
T 3-4
Mil
104,83
T 1-2
Jag
BP
T9
T 7-8
T 5-6
T 3-4
T 1-2
405,00
727,16 810,18 534,54 461,48 50,25
T 10
875,00 207,77
BM
1399,15
0
T 10
1500
Hari 6
4000
Jenis Media
Asam Organik Total Asam Sitrat
2979,04
2000 3306,64 2640,45
2609,34 2075,08
2137,72
2046,42
1794,08
Hari 6 Jenis Media
Mil
Jag
A9
A5
A4
A3
A 1-2
Mil
Jag
Hari 3
1208,78 1148,96
97,28
34,73
BP
BM
A 10
A9
803,12 539,90 336,28
BP
315,75
136,70
A 7-8
A6
A5
A4
A3
0
538,85
BM
931,54 558,72 180,87 77,65
A 10
1349,00
A 7-8
2036,89
A6
1000
A 1-2
Konsentrasi (ppm)
3000
56
Gambar 11Profil produksi asam sitrat dan asam organik total T. Asperellum T13(atas) dan A. niger A1(bawah) pada berbagai media perbanyakan. Keterangan: Jag (jagung), BM (beras merah), BP (beras putih) dan Mil (milet).
Produksi asam sitrat dalam media cair cenderung dihasilkan pada inkubasi hari ke 6, baik pada T. asperellumT13 maupun oleh A. niger A1 (Tabel 15), namun media padat lebih menghasilkan asam sitrat pada hari ke 6.Secara umum, A. niger A1 menghasilkan asam sitrat lebih banyak dalam media padat.Produksi asam sitrat dan asam-asam organik lainnya dipengaruhi oleh beberapa faktor, diantaranya jenis galur, lama fermentasi, nutrisi dalam media, aerasi, kadar air dalam fermentasi padat dan pH. Asam sitrat merupakan metabolit primer, tidak dihasilkan dalam jumlah sangat banyak pada kondisi normal. Upaya memperoleh produksi asam sitrat tinggi untuk skala industri dilakukan salah satunya dengan perolehan mutan Aspergillus sp.(Andersen et al. 2011). Tabel 15 Produksi asam sitrat dan asam organik total selama inkubasi T. asperellum T13 Hari ke 3 Hari ke 6 Media T1-2 T3-4 T5-6 T7-8 T9 T10 Jgng Bmer Bput Milet
Sitrat 7,86 80,28 99,40 4,65 1,06 0,70 3,88 3,36 0,00 6,92
A.org . total 1.399,15 14.732,39 3.958,84 207,77 874,99 50,25 727,16 534,54 461,48 810,18
Sitrat 2.533,27 1.650,68 763,95 293,39 49,00 126,88 2,50 1,64 0,00 5,41
A.org. total 2.942,31 319,65 1.739,77 405,03 104,83 164,01 222,89 12.49 399,71 160,09
A. niger A1 Hari ke 3 Sitrat Media A1-2 A3 A4 A5 A6 A7-8 A9 A10 Jgng Bmer Bput Milet
0,08 0,00 0,00 2,45 1,75 7,48 1,44 0,73 5,92 12,38 4,06 7,10
A.org. total 1.349,00 2.036,89 558,72 180,87 77,65 2.046,42 931,54 136,69 2.137,72 3.306,64 2.640,45 2.609,34
Hari ke 6 Sitrat 26,34 872,46 190,73 0,31 152,97 103,74 9,82 0,00 1,83 2,83 1,02 1,83
A.org. Total 315,75 2.979,04 538,85 34,73 336,28 539,90 803,12 97,28 1.372,58 2.277,14 2.075,08 1.569,59
Keterangan: konsentrasi asam sitrat dan asam organik dalam satuan ppm.
Barosso et al. (2006) menyatakan bahwa salah satu mekanisme yang menjelaskan aktivitas pelarutan fosfat disebabkan oleh sekresi proton sebagai akibat dari penggunaan amonium. Namun, asam sitrat dan glukonat tetap akan dihasilkan oleh A. niger meskipun tanpa amonium nitrat. Penambahan garam ini memicu produksi asam sitrat dan menurunkan secara drastis asam glukonat. Hal ini menunjukkan bahwa pelarutan Ca-P dan Al-P berhubungan dengan produksi asam dan penurunan pH. Selanjutnya, asam-asam organik juga sangat penting
57
sebagai faktor pengkelat kation yang terikat dengan P pada fosfat sukar larut. Pelarutan Ca-P dijumpai maksimum dalam media glisin, yang ditunjukkan dengan pertumbuhan sangat tinggi. Oleh sebab itu
pelarutan fosfat juga berkorelasi
dengan pertumbuhan A.niger. Mekanisme pelarutan fosfat dari bahan yang sukar larut oleh aktivitas mikroba seperti Al-P banyak dikaitkan dengan kemampuan mikroba dalam menghasilkan enzim fosfatase dan asam-asam organik hasil metabolisme seperti asam sitrat,oksalat, suksinat dan α-ketoglutarat. Hasil penelitian Papagianni (2007) menunjukkan berbagai reaksi dan enzim metabolik berperan dalam produksi asam sitrat oleh A. niger dalam siklus asam sitrat (Krebs). Produksi Fitohormon Selama Tahap Perbanyakan Spora Tiga jenis fitohormon ABA, GA dan IAA yang diukur pada hari ke 6 inokulasi menunjukkan produksi asam absisat atau ABA tertinggi diperoleh pada media cair T5-6 dan A4. GA tertinggi diproduksi pada media padat dan IAA diproduksi oleh T. asperellum T13 dalam media T3-4, jagung dan milet. A. niger A1 memproduksi ABA, GA dan IAA dalam media A3 dan A9(Tabel 16). Menurut Gemishev et al. (2005) produksi ABA olehkapang didukung oleh keberadaan glukosa dan kondisi cekaman kekeringan ataupun salinitas. GA tidak dijumpai hampir pada seluruh media pada pengukuran 6 hari. Menurut Bilkay et al. (2010) IAA dihasilkan optimum pada hari keenam, sedangkan GA optimum diproduksi pada hari ke 12, yang mungkin menjelaskan hasil penelitian ini. Pada beberapa media padat, GA dihasilkan dalam jumlah besar, seperti milet untuk T. asperellum T13 dan jagung untuk A. niger A1. Produksi GA dipengaruhi oleh suhu optimum yang lebih tinggi dibandingkan IAA (30oC untuk GA dan 25-28oC untuk IAA). Percobaan dilakukan denganinkubator 28oC untuk media cair dan dalam laci plastik untuk media padat yang lebih mendukung produksi IAA. Produksi GA pada media padat berlangsung lebih cepat, kemungkinan disebabkan oleh peningkatan suhu selama inkubasi. Penempatan media padat dalam kantong plastik disealed dan bertumpukan dalam laci plastik memungkinkan peningkatan suhu.
58
Menurut Bilkay et al. (2010) produksi spora berkorelasi positif dengan produksi GA, dijumpai pada milet, media penghasil spora terbanyak T. asperellum T13 dan beras merah untuk A. niger A1. Semua media menghasilkan ABA dalam jumlah bervariasi hingga 764,65 ppm. Produksi tertinggi dijumpai pada media cair T3-4 dan T7-8 untuk T. asperellum T13 dan A4 untuk A. niger A1, yang berkorelasi dengan cekaman yang dialami kapang. Media T3-4 dan T7-8 memberikan cekaman karena miskinnya elemen mineral, dan kurangnya kandungan gula. Pada media A4 terutama disebabkan oleh kurangnya gula. Hal ini diperkuat oleh pernyataan Bilkay et al.(2010), yang menyatakan ABA diproduksi akibat cekaman gula dan garam. Nambara dan Marion-Poll (2005) menyatakan bahwa kapang mensintesis ABA melalui jalur mevalonat MVA berbeda dengan jalur Embden-MeyerhofParnas EMP yang berlangsung pada tumbuhan. Tabel 16 Produksi ABA, GA dan IAA dalam kultur perbanyakan cair dan padat T. asperellum T13 dan A. niger A 1
Keterangan: konsentrasi asam sitrat dan asam organik dalam satuan ppm.
Penetapan Teknik Pemekatan Spora dengan Sentrifugasi Kecepatan Sentrifugasi Optimum Hasil sentrifugasi untuk pemekatan spora dengan beberapa kecepatan sentrifugasi menunjukkan bahwa minimum spora yang tertinggal dalam supernatan T asperellum T13adalah pada 10.000 g, sedang untuk A. niger A1 adalah 6.000 g (Gambar 14). Hal ini menunjukkan bahwa spora A. niger lebih mudah dipekatkan daripada sporaT asperellum T13. Spora T asperellum T13 memiliki diameter spora 10 µm, yang lebih besar dibandingkan dengan spora A. niger yang berdiameter sekitar 1 µm (Gambar 12), namun bersifat lengket dan
59
menempel pada matriks media. Hal ini menyebabkan sporaT asperellum T13 lebih sukar untukdipekatkan dibandingkan dengan spora A.niger. Peningkatan kecepatan sentrifugasi menyebabkan peningkatan kandungan spora dalam fraksi supernatan, yang berarti menurunnya retensi spora dalam pelet. Fenomena ketidakstabilan lebih nyata pada spora T. asperellum yang mencapai titik
terendah
spora
supernatan,
dan
mengalami
peningkatan
dengan
bertambahnya kecepatan sentrifugasi sampai 16.000 g. Pada A.niger, mulai dari kecepatan 6.000 g hingga 12.000 g menunjukkan kestabilan, dan mengalami ketidakstabilan pada kecepatan sentrifugasi di atas 12.000 g (Gambar 13). Zhou et al. (2006) memekatkan spora B. thuringiensis dan mengamati efek kandungan padatan spora, kecepatan sentrifugasi dan lamanya sentrifugasi terhadap retensi spora pada fraksi pelet. Hasil yang diperoleh menunjukkan bahwa ketiga peubah yang diukur berpengaruh nyata terhadap banyaknya spora yang tertahan pada fraksi pelet spora Bt. Peningkatan kecepatan sentrifugasi dan waktu menurunkan retensi spora Bt, namun persentasi retensi akan meningkat apabila bobot spora dinaikkan.
(a) (b) Gambar 12Bentuk dan ukuran sporaA. niger A1 (a) dan T. asperellum T13 (b).
Keterangan: spora A. niger A1 cenderung berdiameter kecil (1 µm), berwarna cokelat kehitaman dan berbentuk bulat. Spora T. asperellum T13 berdiameter lebih besar (10 µm), kehijauan dan berbentuk bulat atau lonjong.
Charvat (2007) melakukan pemekatan spora mikoriza arbuskula vesikula menggunakan teknik sentrifugasi
dengan alat sentrifus Sorvall RC-2B pada
kecepatan 4.000 rpm, selama 5 menit. Bagianyang diambil adalah pelet yang merupakan hasil pemekatan spora. Bassel dan Miller (1982)melaporkan pemekatan spora pakis dengan teknik sentrifugasi dan membuktikan kestabilan polaritas spora yang disentrifugasi pada kecepatan 10.000 g selama 30 menit.
60
d’Enfert dan Mol (2005) menggunakan teknik sentrifugasi dengan kecepatan 4.000 g selama 5 menit pada 4oC untuk pemekatan spora A.fumigatus untuk tujuan transformasi dengan teknik elektroporasi menunjukkan efisiensi yang tinggi. Perdue et al. (2003) melakukan preparasi spora B. anthracis untuk mendeteksi kontaminasi penyakit antraks pada susu dan melihat kemungkinan pengaruh proses sterilisasi terhadap bakteri tersebut, dan pemekatan spora dilakukan dengan sentrifugasi spora pada 8.000 g selama 10 menit. Konsentrasi spora dalam supernatan (x106)
2.0 1.8 1.6
T.asperellum T13
1.4
A.niger A1
1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0.0 4000
6000
8000
10000
12000
16000
Kecepatan Sentrifugasi (g)
Gambar 13 Profil konsentrasi spora dalam supernatan pasca sentrifugasi. Viabilitas Spora Pasca Pemekatan Viabilitas spora pasca percobaan diuji melalui (i) pengamatan spora pasca pengamatan di bawah mikroskop, yang menunjukkan tidak terlihatnya gejala lisis akibat cekaman tekanan osmotik maupun kerusakan, berupa perubahan bentuk, ukuran dan pecahnya spora akibat tekanan mekanis sentrifugasi (Gambar 14) dan (ii) penghitungan jumlah koloni pada media PDB agar hasil tuang cawan spora A. niger A1 pasca pemekatan ( 3,18 x108 spk/mL) menunjukkan jumlah koloni yang tidak banyak berbeda dengan konsentrasi spora awal (7,8x108spk/mL). Angka penghitungan pada hasil tuang cawan tidak seakurat penghitungan spora menggunakan hemasitometer karena dihitung berdasarkan pertumbuhan koloni. Dapat disimpulkan bahwa viabilitas spora tidak berubah akibat pemekatan dengan teknik sentrifugasi pada kecepatan uji.
61
Gambar 14Spora T. asperellum T13 dan A. niger A1 sebelum dan sesudah pemekatandengan cara sentrifugasi.Keterangan: setelah pemekatan (2 dan 4), bentuk dan ukuran spora tidak menunjukkan perubahan, menunjukkan bahwa spora tidak mengalami lisis oleh sentrifugasi pada kecepatan uji.
SIMPULAN Media padat
milet
dan media cair T3-4adalah media terbaik untuk
perbanyakan spora T. asperellum T13, sedangkan untukA. niger A1adalah media padat beras merahdan media cair A5. Produksi spora berkorelasipositif sangat nyata dengan penurunan pH dan produksi asam sitrat. Produksi asam-asam organik total media cair dan padat terjadi pada hari ke tiga. Asam-asam organik total yang diproduksi meliputi asam sitrat, malat, oksalat dan asam α-ketoglutarat.Produksi asam sitrat, pada media cair optimum pada hari ke 6 sedangkan media padat pada hari ketiga. Produksi ABA, IAA dan GA beragam, dan hasil yang kurang optimum disebabkan oleh tiga faktor, waktu yang belum sesuai dengan maksimum produksi, terutama GA (12 hari) dan IAA (setelah 6 hari), faktor aerasi dan suhu optimum. Semua media menghasilkan ABA. Pemekatan sporaT. asperellum T13terbaik adalah dengan sentrifugasi pada 4oC, selama 5 menit berkecepatan 10.000 g, sedangkan untuk pemekatan spora A. niger A1terbaik adalah sentrifigasi berkecepatan 6.000 g.
