PENINGKATAN PERAKARAN BIBIT MANGGIS (Garcinia mangostana L.) MELALUI INOKULASI Agrobacterium rhizogenes L I Z A W A T I

PENINGKATAN PERAKARAN BIBIT MANGGIS (Garcinia mangostana L.) MELALUI INOKULASI Agrobacterium rhizogenes

LIZAWATI

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007


OLEH : LIZAWATI A. 361020071


SURAT PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa segala pernyataan dalam disertasi saya yang berjudul :

”PENINGKATAN PERAKARAN BIBIT MANGGIS (Garcinia mangostana L.) MELALUI INOKULASI Agrobacterium rhizogenes”

merupakan gagasan atau hasil penelitian disertasi saya sendiri dengan bimbingan Komisi Pembimbing, kecuali yang dengan jelas ditunjukkan rujukannya. Disertasi ini belum pernah diajukan untuk memperoleh gelar sejenis di Perguruan Tinggi lain. Semua data dan informasi yang digunakan telah dinyatakan dengan jelas dan dapat diperiksa kebenarannya.

Bogor,

2007

LIZAWATI NRP. A 361020071

ABSTRACT LIZAWATI. Improvement of mangosteen (Garcinia mangostana L.) seedling root system through Agrobacteriun rhizogeneses inoculation. Supervised by ROEDHY POERWANTO, IMAN RUSMANA, SOBIR, TRI MUJI ERMAYANTI.

Mangosteen is known as a slow growing plant, this is due to the root that is fragile, sensitive to the environmental condition and easily disturbed. Great care is therefore required during the transplanting of seedling, which form a long taproot with few laterals. Many writers note an apparent absence of root hairs at all stage of growth. The use of Agrobacterium rhizogenes may improve root system of mangosteen. The soil bacterium Agrobacterium rhizogenes can induce the abundant adventitious root formation at the infection site through the transfer of genetic material T-DNA, a part of the Root inducing (Ri) plasmid from bacterium to the plant genome. This research is aimed to develop a technique in improving root system of Mangosteen using Agrobacterium transformation technique in order to improve seedling growth. This research is divide into two step of research, I) improvement of mangosteen seedling root system through A. rhizogeneses inoculation at the mangosteen nursery ; and II) induction of root formation using A. rhizogenes in vitro. The materials used in this experiment were ; mangosteen fruit originated from Purwakarta and A. rhizogenes collection from Puslit Biotechnology LIPI Cibinong-Bogor. The result showed that strains inoculation of ATCC-15834, 509 , 07-20001, A4, and R-1000 increased : stem diameter, plant height, leaf number, lateral and tersier roots number better than control. Inoculation with cutting root method results in the higher live plant percentage compared with dipping root method. A. rhizogenes strain ATCC15834 (OD600 = 1.0) was able to infect 6 week old of mangosteen seedling root. Based on PCR product, TL-DNA from A. rhizogenes strain ATCC-15834 succeeded to be transferred into genome of mangosteen seedling root cell since the rolB gene was detected at 780 bp agarose electrophoresis. The A. rhizogenes strains ATCC-15834 could increase the root anatomy in terms of the mean xylem vascular diameter, conductivity, total xylem width, roots hair, nutrient uptake (N, P and K), IAA hormone content and was better than and control. 509, 07-20001, ATCC-158343 strains induced root formation. All explant with cotyledon that were root formation were induced were able to survive at acclimation stage, but none for cotyledoneless explants. Anatomy observation showed that 509 resulted in higher xylem diameter, total number of xylem, conductivity, and higher ration of conductivity/total root transversal area in comparation to control.

Key words : hormone, root hairs, strain, soil bacterium, T-DNA, xylem

RINGKASAN LIZAWATI. Peningkatan Perakaran Bibit Manggis (Garcinia mangostana L.) Melalui Inokulasi Agrobacterium rhizogenes. Dibimbing oleh ROEDHY POERWANTO, IMAN RUSMANA, SOBIR, TRI MUJI ERMAYANTI.

Pertumbuhan tanaman manggis yang lambat, disebabkan antara lain akar tumbuh dengan lambat, rapuh, jumlah akar lateral terbatas dan tidak mempunyai rambut akar, mudah rusak dan terganggu akibat lingkungan yang tidak menguntungkan. Salah satu upaya yang dapat dilakukan untuk meningkatkan sistem perakaran manggis adalah dengan pemanfaatan bakteri Agrobacterium rhizogenes. Bakteri A. rhizogenes merupakan bakteri tanah yang mempunyai kemampuan untuk menstranfer sebagian bahan genetiknya (T-DNA) pada sel tanaman melalui pelukaan. T-DNA tersebut membawa gen-gen yang terlibat dalam proses induksi akar. Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan teknologi peningkatan sistem perakaran tanaman manggis melalui inokulasi A. rhizogenes sehingga mempercepat laju pertumbuhan bibit tanaman manggis. Penelitian terdiri dari dua percobaan, yaitu; I) Perbaikan sistem perakaran tanaman manggis melalui inokulasi A. rhizogenes terhadap semai manggis, dan II) Induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan A. rhizogenes secara in vitro. Hasil penelitian menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, dan 509 mampu meningkatkan pertumbuhan panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi tanaman, dan jumlah daun tanaman bibit manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong lebih efektif dalam menginokulasi akar bibit manggis dibandingkan dengan akar ditusuk. Bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD600=1.0 dapat menginokulasi akar bibit manggis umur 6 minggu. Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibandingkan bibit yang tidak diinokulasi. Serta menghasilkan serapan hara (N dan P) daun, dan kandungan total hormon IAA yang paling tinggi. Strain ATCC15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada gel elektroforesis. Induksi perakaran eksplan tunas manggis secara in vitro dengan A. rhizogenes mampu menginduksi terbentuknya akar adventif pada tempat infeksi setelah diinokulasi dengan strain 509, 07-20001, dan ATCC-15834 dan mampu tumbuh hingga 75 % pada tahap aklimatisasi. Hasil anatomi akar menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain 509 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang, total luasan sayatan melintang dan rasio (luas serapan / total luasan sayatan melintang) yang lebih besar dibandingkan bibit manggis yang tidak diinokulasi (kontrol).

Kata kunci : bakteri tanah, hormon, strain, rambut akar, T-DNA, xilem

© Hak cipta milik Institut Pertanian Bogor, Tahun 2007 Hak cipta dilindungi undang-undang

1. Dilarang mengutip sebagian atau seluruh karya tulis ini tanpa mencantumkan atau menyebutkan sumber a. Pengutipan hanya untuk kepentingan pendidikan, penelitian, penulisan karya ilmiah, penyusunan laporan, penulisan kritik atau tinjauan suatu masalah. b. Pengutipan tidak merugikan kepentingan yang wajar IPB 2. Dilarang mengumumkan dan memperbanyak sebagian atau seluruh karya tulis dalam bentuk apapun tanpa seizin IPB


LIZAWATI

DISERTASI Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Program Studi Agronomi


Judul Disertasi

: Peningkatan Perakaran Bibit Manggis (Garcinia mangostana L.) melalui Inokulasi Agrobacterium rhizogenes .

Nama Mahasiswa

: Lizawati

NO. MAHASISWA

: A 361020071

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. S o b i r, MS Anggota

Prof. Dr. Ir. H. Roedhy Poerwanto, M.Sc Ketua

Dr. Tri Muji Ermayanti Anggota

Dr.Ir. Iman Rusmana, MS Anggota

Diketahui

Ketua Program Studi Agronomi

Dr. Ir. Satriyas Ilyas, MS

Tanggal Ujian : 24 Agustus 2007

Dekan Sekolah Pascasarjana IPB

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS

Tanggal Lulus :31 Agustus 2007

RIWAYAT HIDUP

Penulis dilahirkan di Kabupaten Kerinci Provinsi Jambi pada tanggal 5 Desember 1970, adalah anak keempat dari pasangan Drs. H. M. Rusli dan Hj Azizah. Penulis menyelesaikan pendidikan dasar di SD Negeri 52/IV Jambi pada tahun 1984, SMP Negeri 8 Jambi pada tahun 1987, dan SMA Negeri I Jambi pada tahun 1990. Penulis melanjutkan pendidikan di Universitas Jambi Fakultas Pertanian dan lulus pada tahun 1994. Tahun 1995 penulis diangkat menjadi staf pengajar Fakultas Pertanian Universitas Jambi.

Penulis

melanjutkan pendidikan Master di Institut Pertanian Bogor pada Program Studi Bioteknologi dan lulus tahun 2002. Pada tahun yang sama penulis mendapat kesempatan untuk melanjutkan ke jenjang doktor pada Program Studi Agronomi Institut Pertanian Bogor. Selama mengikuti program S3, penulis menyajikan karya ilmiah berjudul Metode Inokulasi Agrobacterium rhizogenes pada Bibit Tanaman Manggis (Garcinia mangostana L.) pada Seminar Nasional Perhimpunan Hortikultura Indonesia pada bulan November 2006.

Sebuah artikel akan

diterbitkan pada Jurnal Buletin Agronomi Vol. XXXV, No. 2, dengan judul Pertumbuhan Bibit Tanaman Manggis (Garcinia mangostana L.) setelah Inokulasi dengan Berbagai Strain Agrobacterium rhizogenes. Karya ilmiah tersebut merupakan bagian dari program S3 penulis.

PRAKATA

Puji syukur Alhamdulillah penulis panjatkan ke hadirat Alloh SWT, karena atas rahmat dan hidayat-Nya penelitian dan penulisan Disertasi berhasil diselesaikan.

ini

Penelitian ini dibiayai oleh Program Riset Unggulan

Strategis Nasional (RUSNAS) melalui Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika, LPPM-IPB. Pada kesempatan ini penulis mengucapkan rasa terimakasih yang tulus kepada : 1. Prof.Dr. Ir. Roedhy Poerwanto, MSc, Dr. Ir. Sobir, MS; Dr. Ir. Iman Rusmana, MSi, Dr. Ir. Tri Muji Ermayanti, selaku komisi pembimbing yang telah memberikan kepercayaan dan bimbingan selama penelitian sampai penyusunan Disertasi. 2. Dr. Ir. Satriyas Ilyas, MS selaku Ketua Program Studi Agronomi dan seluruh dosen Program Studi Agronomi yang selalu memberikan dukungan. 3. Dr. Ir. Nurul Khumaida, MSc selaku penguji luar komisi pada saat ujian tertutup yang telah banyak memberikan saran dan Dr. Ir. Darda Effendi, MS selaku penguji luar komisi pada saat ujian prakualifikasi bersama Dr. Ir. Maya Melati, MSc sebagai wakil Program Studi Agronomi. 4. Dr. Ir. Agus Purwito, MSc dan Dr. Ir. Ika Mariska APU selaku penguji luar komisi pada saat ujian sidang terbuka. 5. Rektor Universitas Jambi yang telah memberikan kesempatan untuk mengikuti program S3 di IPB. 6. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi, yang telah memberikan beasiswa BPPS. 7. Staf dosen, peneliti dan karyawan di Pusat Kajian Buah-buahan Tropika LPPM-IPB Prof. Dr. Ir. Hj. Syafrida Manuwoto, MSc., Ir. Hj. Yayah K. Wagiono, MEc., Dr. Ir. Sriani Sutjiprihati, MS., Dr. Ir. Rahmad Suhartanto MS. Dr. Ir. M. Firdaus, MSi., Ir. Ivone O. Sumaraw, MS., Endang Gunawan SP. MSi., Kusuma Darma SP. MSi., Heri Harti SP., Rena Destriani Amd., Rika Lesmawati Amd., Naekman Naiboho SP dan M. Syafrudin atas segala bantuan dan dukungan yang telah diberikan. 8. Bapak Sulaeman, pak Sukardi, dan bu Ade serta seluruh karyawan Kebun Percobaan Tajur atas segala bantuannya.

9. Sulassih SP dan Sapitri atas bantuan dan kerjasamanya selama penelitian berlangsung di Laboratorium PKBT-IPB serta Erwin dan Deritha di Puslit Bioteknologi LIPI-Cibinong. 10. Dr. Ir. Juliarni M.Agr, Dr. Ir. Ragapadmi Purnamaningsih, M.Si, Dr. Ir. Ireng Darwati, Ir. Dorly MSi, Ir. Muhammad Arif Nasution, MP, Ir. La Ode Safuan, MP, Ir. Dirvamena Boer, M.Sc, Ir. Liferdi, M.Si dan Dewi Sukma, SP. M.Si atas kebersamaan dan diskusinya selama penelitian berlansung. 11. Dr. Ir. Nurita Toruan-Matius MS dan Dr. Ir. Hajrial Aswidinnoor M.Sc, yang telah memberikan dorongan agar penulis melanjutkan program S3. 12. Ayahanda H. M. Rusli, ibunda Hj. Azizah, ayah dan ibunda mertua H. Dja’far Madjid dan Hj. Zubaidah serta seluruh keluarga atas doa dan dukungan yang telah diberikan kepada penulis. 13. Suami tercinta Ir. Zainuddin, M.Si dan ananda tersayang Puja Ahmad Habibi atas pengorbanan, ketulusan, kesabaran dan pengertian yang telah diberikan selama ini. 14. Semua pihak yang telah membantu dan memberikan dukungan selama pendidikan S3. Akhirnya, diiringi doa semoga seluruh kegiatan studi ini bernilai ibadah dihadapan Alloh SWT, baik bagi penulis maupun semua pihak yang terlibat di dalamnya, semoga hasil-hasil penelitian ini dapat didayagunakan lebih lanjut bagi kemaslahatan masyarakat maupun bagi kemajuan ilmu pengetahuan.

Bogor,

Penulis

2007

GLOSARIUM Adventif

Agrobacterium rhizogenes

: Perkembangan organ seperti tunas, akar bunga; atau emberio yang berasal dari suatu titik tumbuh yang tidak lazim.

: Bakteri tanah yang bersifat aerobik, beraksi negatif terhadap pewarnaan gram dan dapat menyebabkan terbentuknya akar rambut pada tanaman dikotil dan monokotil.

Aklimatisasi

: Masa adaptasi planlet dari lingkungan fisik aseptik terkendali ke lingkungan tanah.

Apomiksis

: Reproduksi melalui bentuk seperti biji tetapi melalui penyerbukan.

Auksin (IAA)

: Zat pengatur tumbuh tanaman yang mendorong pertumbuhan tanaman. Auksin alami yang dikenal ialah indolaseticacid (IAA) terutama mempengaruhi perbesaran sel dan pertumbuhan pucuk apikal tanaman, inisiasi akar dan perkembangan akar samping, penghambatan masa tunas samping, menunda penuaan daun dan absisi. Aktifitas IAA dapat rusak karena intensitas cahaya yang tinggi.

Bakteri

: Suatu mikroorganisme prokariotik dalam domain bacteria

Eksplan

: Bagian tanaman yang digunakan sebagai bahan untuk inisiasi suatu kultur misalnya kultur in vitro.

tanpa

Elektroforesis

: Pemisahaan molekul berdasarkan muatan listriknya.

Floem

: - Kulit kayu bagian dalam pada batang yang berguna untuk mendistribusikan protein dan karbohidrat, merupakan serangkaian sel yang membentuk pembuluh ayak, mempunyai sel dasar berupa sel tapis yang berdinding sel tipis. - Sekumpulan sel jaringan pembuluh yang berdinding tebal pada akar dan berada diantara jaringan xilem dan kulit luar akar.

Gen

: Unit dasar pembawa sifat keturunan yang merupakan sekuen nukleotida-nukleotida DNA penyandi produk fungsional dari RNA.

Genom

: Seperangkat lengkap gena dalam suatu organisme

Hara

: Bahan kimia anorganik (dari dalam tanah) yang diserap oleh tanaman untuk dibentuk menjadi senyawa-senyawa organik yang kompleks yang dimanfaatkan sebagai pembentuk sel, jaringan dan organ tanaman.

Infeksi

: Kemasukan bibit penyakit.

Inokulasi

: Pemasukan bakteri kedalam tubuh melalui luka atau melalui alat yang digoreskan pada kulit dan tidak selalu menimbulkan infeksi.

In vitro

: Di dalam tabung atau di dalam botol kultur.

In vivo

: Di dalam tanaman utuh yang tumbuh dirumah atau dilapang.

Jumlah kopi (turunan)

kaca

: Jumlah molekul suatu plasmid yang terdapat dalam satu sel

Juvenil

: Suatu periode dalam tanaman ketika pembungaan tidak terjadi dan tanaman tidak dapat dirangsang untuk berbunga dengan ZPT atau perangsang pembungaan lainnya.

Kromosom

: Molekul asam nukleat yang dapat mengadakan replikasi sendiri serta membawa sejumlah gena.

Konjugasi

: Pada bakteri merupakan transper DNA diantara dua sel yang bersambungan secara temporer.

Konduktivitas xilem

: Daya hantar pembulah xilem untuk mengirimkan atau mengalirkan senyawa organik kebagian pucuk tanaman.

Kofaktor

: Setiap molekul atau ion non protein yang diperlukan agar suatu enzim bisa berfungsi dengan baik. Kofaktor dapat berikatan secara permanen dengan tempat aktif enzim atau bisa berikatan secara longgar dengan subtrat selama kalisis.

Meristem

: Jaringan tanaman yang terdiri dari sel-sel hidup dan berdinding tipis yang mampu membelah berulang-ulang.

Nursery

: Tempat untuk pemeliharaan tanaman. Struktur atau bangunan (biasanya bernaungan) tempat tanaman dirawat , diperbanyak dan diperbesar hingga siap dipasarkan.

Opin

: Turunan asal amino yang diproduksi tanaman terinfeksi A. rhizogenes dan dipergunakan bakteri sebagai sumber karbon dan nitrogen.

Planlet

: Tanaman lengkap hasil regenerasi kultur in vitro

Plasmid

: Molekul DNA yang biasanya sirkular, yang terpisah dari kromosom tuan rumah sering ditemukan dalam bakteri dan beberapa sel jenis lain.

Primer (pemula)

: Oligonukleotid untai tunggal pendek yang bila melekat melalui pasangan basa pada molekul cetakan untai tunggal, akan bertindak sebagai titik permulaan sintesis untai yang komplementer yang diarahkan oleh enzim polimerase DNA.

Primer spesifik

: Primer yang susunan nukleotidanya tertentu dan merupakan komplemen dari cetakan DNA yang akan dianalisis

Rambut akar

: Seperti tabung yang tidak bercabang, terbentuk di bagian belakang daerah pemanjangan akar, permukaan luarnya berlendir dan berfungsi memperluas permukaan serapan akar

Reaksi rantai Polimerase (PCR) : Suatu teknik untuk perbanyakan DNA in vitro dengan cara menginkubasi dengan primer khusus, molekul DNA polimerase dan nukleotida. Rekombinasi

Sistim jaringan vaskuler

: Pertukaran urutan DNA antara molekul-molekul yang berbeda yang terjadi baik secara alamiah maupun sebagai hasil manipulasi DNA. : Sistem yang dibentuk oleh xilem dan floem diseluruh tumbuhan, yang berfungsi sebagai sistem transpor untuk air (xilem) dan nutrien (floem)

Stele

: Silinder pembuluh pusat pada akar di mana xilem dan floem berada

T-DNA

: Bagian plasmid Ri yang ditransfer pada DNA tanaman.

Transformasi

: Proses pengambilan DNA asing oleh suatu sel yang kemudian DNA asing tersebut dapay berintegrasi dengan DNA kromosom dari sel yang mengambilnya melalui proses rekombinasi.

Virulen

: Kemampuan patogen untuk menyebabkan penyakit.

Xilem

: Jaringan pengangkut air dan hara yang terlarut dalam tanah, arah gerakannya dari akar menuju daun (akropetal).

Zat pengatur tumbuh (ZPT)

: Semua senyawa baik alami maupun sintetik yang dalam konsentrasi rendah dapat mengatur (merangsang atau menghambat) pertumbuhan dan perkembangan sel atau tanaman. Dapat dikatakan bahwa semua hormon adalah ZPT, tetapi tidak semua ZPT adalah hormon.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL .................................................................. DAFTAR GAMBAR .............................................................. DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................

xiii xv xvii

PENDAHULUAN Latar Belakang......................................................................... Perumusan Masalah................................................................ Tujuan Penelitian..................................................................... Hipotesis.................................................................................. Kegunaan Penelitian................................................................ Strategi Penelitian....................................................................

1 3 4 5 5 5

TINJAUAN PUSTAKA Tinjauan Umum Tanaman Manggis ..................................... Sistem Perakaran dan Upaya Perbaikan Akar Bibit Manggis.. Perbaikan Sistem Perakaran Tanaman dengan Transformasi Agrobacterium rhizogenes ...................................................

8 10 17

PENINGKATAN PERAKARAN BIBIT MANGGIS MELALUI INOKULASI Agrobacterium rhizogenes TERHADAP SEMAI MANGGIS Abstrak .................................................................................. Abstract ………………………………………………………….. Pendahuluan ……………………………………………………. Bahan dan Metode …………………………………………….. Hasil Penelitian …………………………………………………. Pembahasan ......................................................................... Simpulan ...............................................................................

27 28 29 31 43 62 69

INDUKSI AKAR EKSPLAN MANGGIS (Garcinia mangostana L.) DENGAN Agrobacterium rhizogenes SECARA IN VITRO Abstrak .................................................................................. Abstract ………………………………………………………….. Pendahuluan ……………………………………………………. Bahan dan Metode …………………………………………….. Hasil Penelitian …………………………………………………. Pembahasan ……………………………………………………. Simpulan …………………………………………………………

70 71 72 73 77 88 93

PEMBAHASAN UMUM ……………………………………………..

95

SIMPULAN DAN SARAN UMUM ................................................

105

DAFTAR PUSTAKA ....................................................................

1 06

LAMPIRAN ..................................................................................

115

DAFTAR TABEL Halaman 1.

Panjang akar primer bibit (cm) dan jumlah akar sekunder bibit manggis umur 24 MSI ..............................................................

43

2. Jumlah akar tertier dan pertambahan diameter batang bibit manggis umur 24 MSI ................................................ ..

44

3. Pertambahan jumlah daun dan tinggi bibit manggis umur 24 MSI ..................................................

46

4. Panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan panjang akar tampak bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes........................................................ ....

49

5. Jumlah akar tertier bibit manggis umur 15 BSI...................................

50

6. Jumlah akar kuarter bibit manggis umur 15 BSI.................................

51

7. Anatomi akar bibit manggis umur 15 bulan BSI..................................

52

8. Pertambahan tinggi dan jumlah daun bibit manggis 15 bulan BSI.......

56

9. Pertambahan diameter batang bibit manggis umur 15 bulan BSI.......

57

10. Berat kering tajuk bibit manggis umur 15 bulan BSI..........................

58

11. Serapan hara daun bibit manggis umur 15 bulan BSI.......................

60

12. Kandungan hormon IAA akar bibit manggis umur 15 bulan BSI........

61

13. Persentase bertunas dan pembentukan tunas majemuk dari 1-8 MSP …………………………………………

77

14. Pengaruh inokulasi beberapa strain A.rhizogenes terhadap kecepatan terbentuknya akar eksplan pucuk manggis dengan biji.........................

79

15. Penambahan diameter batang, tinggi dan jumlah daun tanaman manggis setelah diaklimatisasi ..............................................................

81

16. Panjang akar primer, jumlah akar sekunder, dan jumlah akar tersier tanaman manggis setelah diaklimatisasi ...............................................

82

17. Rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan , total luasan sayatan melintang dan rasio (luas serapan / total luasan sayatan melintang umur 3 BST................

84

18. Pengaruh inokulasi beberapa strain A.rhizogenes terhadap kecepatan terbentuknya akar eksplan pucuk manggis tanpa biji............................

87

19. Pertumbuhan kultur setelah di inokulasi dengan berbagai strain A.rhizogenes umur 12 MSP...................................................................

87

DAFTAR GAMBAR Halaman 1. Alur kerja penelitian...........................................................................

6

2. Penampang membujur zona pertumbuhan pada ujung akar.............

10

3. Sayatatan melintang akar tumbuhan dikotil........................................

12

4. Peta genetik Agrobacterium rhizogenes (Jeng-Sheng 2001)………..

17

5. Biosíntesis IAA pada tanaman dan bakteri…………………………….

23

6. Bahan tanam ……………………………………………………………..

33

7. Tahapan Inokulasi……………………………………………………….

33

8. Performansi akar bibit manggis yang diinokulasi A. rhizogenes dengan metode akar dipotong.........................………. .......................

45

9. Performansi bibit manggis hasil inokulasi berbagai stain A. rhizogenes dengan metode akar dipotong.........................................………….......

47

10. Persentase tanaman yang hidup pada berbagai perlakuan metode inokulasi strain A.rhizogenes..................................................

48

11. Persentase tanaman yang hidup pada berbagai strain A.rhizogenes..

48

12. Sayatan melintang akar bibit manggis.................................................

53

13. Rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi ......................................................................

54

14. Hasil Scanning Electron Microscop (SEM) rambut akar bibit manggis umur 15 bulan setelah diinokulasi dengan strain A.rhizogenes............

54

15. Performansi bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi..…...........

59

16. Hasil PCR akar bibit manggis yang diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes ............................................................................

62

17. Induksi tunas manggis secara kultur in vitro.........................................

78

18.Tunas terbanyak yang berhasil diinduksi secara kultur in vitro..............

78

19. Performansi akar planlet manggis umur 6 minggu setelah inokulasi....

80

20. Performansi bibit yang tumbuh pada media aklimatisasi umur 3 bulan setelah tanam..........................................................................................

81

21. Performansi bibit manggis umur 3 bulan setelah aklimatisasi...............

83

22. Sayatan melintang akar bibit manggis umur 3 bulan setelah aklimatisasi............................................................................................

85

23. Primordia akar yang terbentuk 6 MSP....................................................

86

24. Eksplan manggis tanpa biji umur 12 minggu.........................................

88

25. Proses tranfer T-DNA Agrobacterium (de la Riva et al, 1998)...............

97

26. Bibit dan akar manggis hasil inokulasi A. rhizogenes yang mengalami pembusukan…………….……………………………………...........……….

99

DAFTAR LAMPIRAN

Halaman 1. Metode perhitungan anatomi akar bibit manggis.................................

115

2. Pembuatan larutan scanning electron microscop................................

116

3. Komposisi larutan dan bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA, PCR dan elektroforesis...............................................................

117

4. Penetapan kandungan nitrogen dengan metode semi-mikro kjeldahl..

118

5. Penetapan kandungan P dan K dengan metode pengabuan...............

119

6. Prosedur analisis hormon IAA...............................................................

120

7. Komposisi media MS ............................................................................

121

8. Komposisi media WPM ........................................................................

122

PENDAHULUAN Latar Belakang

Manggis (Garcinia mangostana L) merupakan tanaman asli Asia Tenggara dan diduga berasal dari Indonesia (Yaacob & Tindall 1997). Buah manggis dianggap sebagai salah satu jenis buah yang terbaik, rasanya lezat dan segar sehingga menyebabkan buah ini banyak disukai dan dijuluki sebagai “Queen of the tropical fruit”.

Manggis memiliki prospek yang cerah untuk

dikembangkan di Indonesia karena

kesesuaian agroklimat dan ketersediaan

lahan. Di Indonesia tanaman manggis ditemukan di sebagian besar wilayah dan tersebar mulai dari pulau Sumatera, Jawa, Bali, Kalimantan, Sulawesi, Nusa Tenggara dan Kepulauan Maluku. Luasnya penyebaran tanaman manggis ini mengakibatkan panjangnya masa panen manggis di Indonesia bila dibandingkan dengan masa panen di negara-negara penghasil manggis lainnya. Hal ini merupakan suatu potensi yang jika dimanfaatkan akan dapat menambah pendapatan masyarakat. Buah manggis selain dikonsumsi dalam negeri juga telah diekspor ke mancanegara. Pada saat ini volume ekspor manggis secara konsisten terus meningkat sejak tahun 1999, dan pada tahun 2005 ekspor manggis mencapai 8.471 ton dengan nilai US $ 6,3 juta sehingga menempati urutan pertama dari seluruh ekspor buah segar nasional (Departemen Pertanian 2005). Pembudidayaan tanaman manggis seharusnya telah lebih maju dari tanaman buah-buahan tropika lainnya, akan tetapi tanaman manggis yang ada sekarang masih sangat sedikit mendapat input budidaya. Tanaman manggis yang ada sekarang sebahagian besar tanaman manggis tua yang terdapat di hutan-hutan campuran, kebun campuran dan pekarangan rumah masyarakat dimana pertumbuhan dan perkembangannya tergantung pada alam sehingga produktivitas manggis belum optimal. Pembudidayaan tanaman manggis yang relatif lambat dibanding tanaman buah tropika lain diduga berhubungan dengan laju pertumbuhan manggis yang sangat lambat dengan masa yuwana (juvenil) yang panjang (8–15 tahun) sehingga menimbulkan keengganan para petani, pengusaha dan masyararakat untuk membudidayakannya.

Banyak

laporan

penelitian

menyebutkan

bahwa

lambatnya

pertumbuhan manggis antara lain disebabkan oleh (a) buruknya sistem perakaran, sehingga (b) penyerapan air dan hara lambat, (c) rendahnya laju fotosintesis, dan (d) rendahnya laju pembelahan sel pada meristem pucuk (Wible, Chacko & Downtown, 1992; Ramlan et al. 1992; Poerwanto, 2000). Pada tanaman manggis akar tumbuh dengan sangat lambat, rapuh, jumlah akar lateral terbatas dan tidak mempunyai rambut akar, mudah rusak, dan terganggu akibat lingkungan yang tidak menguntungkan, sehingga luas permukaan kontak antara akar dan media tumbuh sempit yang menyebabkan serapan air dan hara terbatas

(Cox 1988). Rendahnya serapan hara dan air ke dalam tanaman

kurang mendukung aktifitas fisiologi tanaman dan menganggu ritme endogen secara keseluruhan di dalam tanaman (Hidayat 2002). Upaya penelitian untuk memperbaiki sistem perakaran bibit manggis telah dilakukan oleh Poerwanto et al. (1998) dengan pemberian endomikoriza Gigaspora sp. pada bibit manggis dan Hidayat et al. (1999) dengan pemberian IBA (50-150 ppm) pada biji dan akar manggis. Percobaan untuk meningkatkan pertumbuhan bibit manggis secara in vitro juga telah dilakukan oleh Goh et al. (1990); Te-chato (1997) dan Pertamawati (2003). Pada penelitian ini dilakukan percobaan

menginokulasi

bibit

manggis

dengan

bakteri Agrobacterium

rhizogenes. Perbaikan sistem perakaran menggunakan A. rhizogenes telah banyak dilaporkan sebelumnya pada tanaman buah-buahan, seperti pada kiwi (Rugini et al. 1991), apel (Sutter & Luza 1993; Damiano & Monticelli 1998), almond (Damiano et al. 1995), walnut (Caboni et al. 1996) dan pada beberapa tanaman tahunan berkayu, seperti pada Eucalyptus (MacRae & Staden 1993), Larix dan pinus (McAfee et al. 1993; Li & Leung 2001). Agrobacterium rhizogenes merupakan bakteri tanah gram-negatif yang termasuk

pada

kelompok

Rhizobiacea,

mempunyai

kemampuan

untuk

menstranfer sebagian bahan genetiknya (DNA) pada sel tanaman yang luka (Nilson & Olsson 1997; Han et al. 1997). DNA yang ditransfer disebut dengan TDNA yang memiliki gen-gen untuk mensintesis fitohormon yaitu auksin. Salah satu fungsi auksin adalah diperlukan dalam proses pembelahan sel dan inisiasi akar (Davies 2004). Strain A. rhizogenes yang mempunyai virulensi tinggi diduga dapat menstranfer

T-DNA

ke

kromosom

tanaman

manggis

sehingga

dapat

memperbaiki sistem perakaran manggis dengan membentuk akar-akar adventif. Akar ini dapat membantu peningkatan proses penyerapan air dan unsur hara yang diperlukan dalam metabolisme tanaman, sehingga pertumbuhan tanaman manggis yang telah ditransformasi dengan menggunakan A. rhizogenes akan lebih baik dibandingkan yang tidak diinokulasi.

Perumusan Masalah

Produksi bibit merupakan faktor penting pada suatu mata rantai usaha di bidang pertanian sehingga tersedianya bibit bermutu dalam jumlah banyak dan dalam waktu yang relatif singkat sangat diharapkan dalam menunjang keberhasilan pengembangan budidaya dan perbaikan kualitas produksi. Kendala dalam pengembangan usaha tanaman manggis antara lain pertumbuhannya yang lambat yang disebabkan oleh buruknya sistem perakaran, sehingga penyerapan air dan hara menjadi lambat (Wible et al. 1992; Poerwanto 2000). Menurut Damiano & Monticelli (1998), pada tanaman tahunan berkayu perakaran merupakan masalah utama yang sulit dipecahkan untuk bibit yang diperbanyak dengan perkecambahan biji maupun in vitro. Hal ini disebabkan tingkat oksidasi fenol yang tinggi dan kurangnya ko-faktor perakaran (Mariska & Purnamaningsih 2001). Pada penelitian ini dilakukan inokulasi bakteri A. Rhizogenes pada bibit manggis dengan tujuan untuk meningkatkan sistem perakaran tanaman manggis. Bakteri A. rhizogenes diharapkan dapat menginfeksi tanaman manggis, sehingga menyebabkan terjadinya proliferasi akar. Akar dapat terbentuk karena terjadi transfer sebagian fragmen DNA yaitu T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel tanaman. T-DNA tersebut membawa gen-gen yang terlibat dalam proses induksi akar yaitu daerah root loci (rol) A, B, C dan D pada bagian TL (Slightom et al. 1986; Chriqui et al. 1996), sedangkan bagian TR membawa gen iaaM dan iaaH yang terlibat dalam biosintesis auksin, selain itu transformasi ini membawa gen yang berguna untuk menyandi sintesis senyawa opin (Giri & Narasu 2000). Integrasi T-DNA plasmid Ri ke dalam genom sel tanaman, apabila terekspresi menyebabkan terjadinya produksi fitohormon endogenous atau

reaksi

hipersensitif

tanaman

terhadap

auksin

sehingga

menyebabkan

berkembangnya akar (Jeng-Sheng 2001; Gelvin 2003). Akar yang terbentuk dapat terus tumbuh walaupun bakteri sudah mati. Selain itu, jaringan tersebut dapat tumbuh secara in vitro dalam media tanpa zat pengatur tumbuh auksin yang biasa diperlukan untuk memacu pertumbuhan jaringan tanaman. Transformasi genetik ini terjadi secara alami, karena adanya kontak langsung antara bakteri dengan sel tanaman. Daerah TL-DNA dari A. rhizogenes lebih penting untuk menginduksi akar, karena rolB berperan meningkatkan pool auksin aktif dalam tanaman dengan hidrolisis konjugat IAA inaktif dan mengatur sensivitas sel terhadap IAA. Gen rolC berperan meningkatkan level sitokinin melalui aktivitas β-glucosidase yang mampu melepaskan sitokinin aktif dari konjugatnya. Hasil akhir dari ekspresi berbagai gen rol pada T-DNA dari Riplasmid adalah terbentuknya jaringan akar (Jeng-Sheng 2001; Valpuesta 2002). Sampai

sejauh

ini, pemanfaatan bakteri A.

rhizogenes untuk

meningkatkan sistem perakaran tanaman manggis belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu diteliti bagaimana peranan bakteri A. rhizogenes dalam meningkatkan sistem perakaran tanaman manggis sehingga didapatkan metode yang sesuai untuk memperbaiki sistem perakaran tanaman manggis. Perbaikan sistem perakaran tanaman manggis diharapkan dapat meningkatkan

pertumbuhan

karena

perakaran

yang

lebih

baik

dapat

meningkatkan suplai hara ke tanaman, meningkatkan laju metabolisme tanaman dan akhirnya dapat meningkatkan produksi tanaman. Dari penelitian ini diharapkan diperoleh suatu teknologi yang dapat meningkatkan sistem perakaran pada bibit tanaman manggis sehingga mempercepat pertumbuhan bibit di lapangan. Tujuan Penelitian

Tujuan Umum Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mendapatkan teknologi perbaikan sistem perakaran tanaman manggis melalui inokulasi A. rhizogenes sehingga mempercepat laju pertumbuhan bibit tanaman manggis.

Tujuan Khusus 1. Mendapatkan galur A. rhizogenes yang dapat menginfeksi akar manggis baik secara in vivo maupun in vitro. 2. Mempelajari sistem perakaran tanaman manggis (Garcinia mangostana L.) yang telah diinfeksi A. rhizogenes. 3. Mendapatkan bibit tanaman manggis yang telah terintegrasi T-DNA dari A. rhizogenes.

Hipotesis 1. Satu atau beberapa galur A. rhizogenes dapat menginfeksi tanaman manggis baik secara in vivo maupun in vitro. 2. T-DNA dari A. rhizogenes dapat terintegrasi pada kromosom tanaman manggis. 3. Inokulasi A. rhizogenes dapat menginduksi pembentukan rambut akar pada akar semai dan planlet manggis. 4. Infeksi A. rhizogenes memberikan pengaruh terhadap pertumbuhan, morfologi, anatomi akar dan penyerapan hara bibit manggis. Kegunaan Penelitian 1. Didapatkan landasan untuk langkah-langkah upaya perbaikan sistem perakaran bibit manggis. 2. Mendapatkan bibit manggis dengan sistem perakaran yang lebih baik dengan pertumbuhan yang lebih cepat. 3. Diperoleh suatu teknologi yang dapat meningkatkan sistem perakaran pada tanaman manggis sehingga dapat mempercepat pertumbuhan bibit manggis Strategi Penelitian

Disertasi ini disusun berdasarkan dua topik penelitian. Topik penelitian pertama adalah “Peningkatan perakaran bibit manggis melalui inokulasi A. rhizogenes terhadap semai manggis”, penelitian ini terdiri atas dua tahapan percobaan yang saling berkaitan, yaitu : Seleksi galur A. rhizogenes spesifik penginduksi perakaran manggis, galur A. rhizogenes yang dapat menginfeksi dan metode inokulasi yang terbaik hasil percobaan pertama, dilanjutkan untuk

percobaan kedua yang berjudul “Pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk menginduksi perakaran manggis”. Topik penelitian kedua adalah “Induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan A. rhizogenes secara in vitro”, penelitian ini terdiri atas dua tahapan percobaan yang saling berkaitan, yaitu Multiplikasi tunas tanaman manggis melalui kultur in vitro, yang bertujuan untuk mendapatkan media yang terbaik untuk multiplikasi tunas manggis secara in vitro. Eksplan manggis yang dihasilkan pada percobaan ini, diinduksi perakarannya dengan berbagai galur A. rhizogenes pada percobaan kedua yang berjudul “Induksi perakaran eksplan tunas manggis dan aklimatisasi planlet manggis hasil inokulasi A. rhizogenes. Percobaan ini bertujuan untuk mendapatkan galur A. rhizogenes yang dapat menginduksi perakaran eksplan tunas manggis secara in vitro. Bagan alur kerja penelitian yang menunjukkan keterkaitan antar penelitian disajikan pada Gambar 1.


Bibit Tanaman Manggis

Peningkatan perakaran bibit manggis melalui inokulasi A. rhizogenes terhadap semai manggis

Induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan A. rhizogenes secara in vitro

Seleksi galur A. rhizogenes spesifik yang menginduksi perakaran bibit manggis

Multiplikasi tunas tanaman manggis melalui kultur in vitro

Pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk menginduksi perakaran manggis

Induksi perakaran eksplan tunas manggis dan aklimatisasi planlet manggis hasil inokulasi A. rhizogenes

Mendapatkan bibit manggis dengan sistem perakaran yang baik dengan pertumbuhan yang lebih cepat

Gambar 1. Alur kerja penelitian

II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Tinjauan Umum Tanaman Manggis Manggis (Garcinia mangostana L.) yang termasuk ke dalam familia Guttiferae merupakan tanaman yang berasal dari daerah Asia Tenggara khususnya Thailand, Malaysia dan Indonesia (Nakasone & Paull 1999). Tanaman manggis merupakan pohon besar berdaun lebar dan rimbun. Tinggi pohon yang telah dewasa mencapai 10-25 m. Bentuk tajuk pohon bervariasi dari bulat silindris hingga kerucut dengan penyebaran simetris ke semua arah. Lebar tajuk merentang hingga 12 m dan semakin mengecil ke arah puncak pohon. Diameter batang pokok pohon dewasa dapat mencapai 60 cm dengan percabangan ke semua arah. Daunnya tunggal dan berpasangan di sisi ranting. Bentuk daun bulat panjang dengan ukuran panjang 13-26 cm dan lebar 6-12 cm. Helai daunnya kaku dan tebal. Daun muda yang baru tumbuh berwarna cokelat kemerahan, kemudian sesuai dengan umur pertumbuhannya berubah menjadi cokelat kehijauan, hijau muda, lalu hijau tua (Tirtawinata et al. 2000). Bunga manggis terletak di ujung ranting, memiliki tangkai bunga yang pendek dan tebal, daun kelopak empat helai tersusun dalam dua pasang dan daun mahkota empat helai.

Kedua pasang kelopak memiliki panjang 2 cm,

berwarna hijau kekuningan, berlekuk dan tumpul, sedangkan mahkotanya berwarna hijau kekuningan dengan bagian di sekelilingnya berwarna kemerahan, tebal, tumpul dan berdaging. Bunga manggis muncul secara menyendiri atau berpasangan pada bagian ujung ranting di luar kanopi (Nakasone & Paull 1999). Bunga manggis adalah dioecious (berumah dua), tetapi hanya bunga betina yang banyak ditemui karena bunga jantan tidak berkembang sempurna (Cox 1988). Proses pembentukan dan perkembangan buah manggis terjadi pada laju yang konstan antara 100–160 hari dari awal pembungaan hingga pematangan buah.

Buah manggis berdiameter 4–8 cm, berbentuk bulat,

berwarna kekuningan hingga berwarna ungu kehitaman pada saat masak dan beratnya berkisar 30-180 g. Daging buah (aril) terdiri atas 5-7 segmen berwarna putih, rasanya manis dan hanya mengandung 1-2 biji. Menurut Prove (1998), komponen nutrisi dalam 100 g buah manggis yang dapat dimakan adalah : 34,0 kkal energi; 87,6% air; 0,6 g protein; 1,0 g lemak; 5,6 g karbohidrat; 5,1 g serat;

7,0 mg kalsium; 13,0 mg magnesium; 13,0 mg fosfor; 7,0 mg sodium; 45,0 potasium; 1,0 mg zat besi; 0,03 mg vitamin B1; 0,03 mg vitamin B2; dan 4,2 mg asam arkorbat (vitamin C). Buah manggis dapat disajikan dalam bentuk segar sebagai buah kaleng, dibuat sirop dan sari buah. Secara tradisional buah manggis adalah obat sariawan, wasir dan luka. Kulit buah dimanfaatkan sebagai pewarna termasuk untuk tekstil dan air rebusannya dimanfaatkan sebagai obat diare. Batang pohon dipakai sebagai bahan bangunan, kayu bakar dan kerajinan. Biji manggis merupakan biji apomiktik, yaitu biji yang dihasilkan tanpa fertilisasi,

berwarna

coklat,

pipih,

tidak

berendosperm

yang

ditutupi

permukaannya oleh jaringan pembuluh (vascular bundles). Biji manggis bersifat poliembrioni dan nutrisi untuk perkembangan embrionya didukung oleh nuselus atau jaringan integumen dan inti endosperm. Secara normal biji manggis selalu dalam keadaan lembab dan bila keadaan lembab tersebut berkurang maka biji dapat mati, keadaan biji seperti ini dikenal dengan nama recalcitrant seed. Sekitar 10% dari biji yang berkecambah dapat menumbuhkan lebih dari satu tunas dan masing-masing tunas dapat tumbuh pada posisi yang berlainan dan masing-masing membawa perakarannya sendiri-sendiri (Nakasone & Paull 1999). Tanaman manggis dapat tumbuh baik pada ketinggian 460-610 m dpl di atas permukaan laut. Verheij (1992) menyatakan bahwa di daerah tropis tanaman manggis masih dapat tumbuh pada ketinggian tempat lebih dari 1000 meter di atas permukaan laut, tetapi semakin tinggi tempat tumbuh akan semakin lambat pertumbuhannya dan semakin lama awal pembungaannya. Tanah yang disukai tanaman manggis adalah jenis tanah gembur yang kaya kandungan bahan organik dengan drainase yang baik. Tanaman manggis tumbuh baik pada tanah lempung berpasir dengan kandungan bahan organik yang tinggi, di samping itu untuk pertumbuhan yang optimum tanah harus subur, air tanahnya harus dangkal dengan ke dalaman 2-3 meter dari permukaan tanah dan dijaga agar tanah tidak sampai kering. Derajat keasaman tanah yang baik untuk tanaman manggis antara 5-7, tetapi tanaman toleran terhadap pH tanah yang rendah. Untuk kesuksesan penanaman, manggis membutuhkan curah hujan merata dengan 10 bulan basah dalam setahun

dengan curah hujan antara

1500-2500 mm per tahun, untuk menstimulir pembungaan tanaman manggis membutuhkan curah hujan lebih dari 100 mm per bulan dengan musim kering yang pendek.

Menurut Tirtawinata et al. (2000) bahwa pada masa awal

pertumbuhan, manggis menyukai naungan, akan tetapi menjelang dewasa, sinar matahari penuh dapat mempercepat masa awal produksinya. Nakasone & Paull (1999) mengemukakan bahwa udara yang lembab dengan suhu udara berkisar 25-35oC sangat menunjang pertumbuhan tanaman manggis. Pada suhu di bawah 20oC pertumbuhannya terhambat dan suhu di bawah 5oC dan di atas 38oC menyebabkan kematian tanaman manggis. Kelembaban udara optimal untuk tanaman manggis ialah sekitar 80% (Verheij 1992). 2.2. Sistem Perakaran dan Upaya Perbaikan Akar Bibit Manggis 2.2.1. Pertumbuhan dan Perkembangan Akar Organ yang pertama terbentuk pada kebanyakan tanaman adalah akar.

Akar yang tumbuh langsung dari benih (radikel) berkembang menjadi

akar primer atau disebut akar tunggang (tap root) pada tanaman dikotil. Pertumbuhan lebih lanjut dari akar primer tergantung pada aktivitas dari meristem apikalnya.

Pembelahan sel berlansung sangat aktif pada bagian

meristem akar ini. Bagian meristem akar ini dilindungi oleh tudung akar (root cap).

Peranan tudung akar penting sekali dalam proses pemanjangan akar

pada saat akar melakukan penetrasi ke dalam tanah.

Tudung akar juga

menghasilkan sejenis bubur polisakarida yang disebut musigel (mucigel) yang berfungsi sebagai pelumas untuk mempermudah penetrasi akar ke dalam tanah (Lakitan 1995). Sel-sel muda yang terbentuk pada meristem kemudian berkembang menjadi sel-sel epidermis, korteks, endodermis, perisikel, xilem, dan floem. Di balik tudung akar (di depan meristem) terdapat suatu zona yang terdiri beberapa sel yang tidak aktif membelah diri. Zona ini disebut quinscent center. Zona ini berfungsi sebagai pengganti jika tudung akar atau meristem mengalami kerusakan. Zona pemanjangan (elongation zone) akar berkisar antara 0.5-1.5 cm pada bagian ujung akar. Laju pemanjangan akar dapat mencapai 2 cm/hari (Gambar 2). Akar primer memanjang lebih cepat dibandingkan dengan akar sekunder, demikian pula akar sekunder memanjang lebih cepat dibandingkan

dengan akar tersier.

Laju pemanjangan akar juga dipengaruhi oleh faktor

internal dan berbagai faktor lingkungan. Faktor internal yang mempengaruhi laju tersebut adalah pasokan fotosintat (umumnya dalam bentuk sukrosa) dari daun. Faktor lingkungan yang berpengaruh antara lain suhu tanah dan kandungan air tanah (Campbell et al. 2000). Selain tumbuh memanjang, akar juga tumbuh secara radial.

Akar

tanaman gimnosperma dan tanaman dikotil mempunyai kambiun vaskuler yang terletak pada posisi di antara pembuluh floem dan xilem. Kambiun berperan dalam penambahan diameter akar (pertumbuhan radial), terutama karena kambiun ini berperan dalam pembentukan sel-sel xilem (ke arah internal) dan sel-sel floem (ke arah eksternal). Tanaman monokotil tidak memiliki kambiun vaskuler. Pertumbuhan radial pada akar tanaman monokotil hanya disebabkan oleh pembesaran sel-sel nonmeristematik.

Dengan demikian, pertumbuhan

radial pada akar tanaman monokotil sangat terbatas. Epidermis Zona diferensiasi

Rambut akar

Zona pemanjangan

Stele Kortek Meristem primer

Zona pembelahan

Protoderm Meristem dasar Prokambium

Tudung akar

Meristem apikal

Gambar 2. Penampang membujur zona pertumbuhan pada ujung akar (Sumber : Campbell et al. 2000) Akar primer selanjutnya akan membentuk cabang yang disebut sebagai akar sekunder.

Akar sekunder umumnya tumbuh secara lateral

(horizontal) oleh sebab itu sering pula disebut sebagai akar lateral. Akar sekunder ini terbentuk beberapa milimeter atau beberapa sentimeter dari ujung

akar primer. Pertumbuhan akar sekunder dimulai pada sel-sel perisikel calon akar sekunder ini sangat aktif membelah diri dan tumbuh menembus lapisan selsel korteks dan epidermis akar primer. Sel-sel perisikel calon akar sekunder ini diduga menghasilkan enzim hidrolitik yang berperan mengurai bahan-bahan penyusun dinding sel korteks dan epidermis yang dilalui dalam proses pertumbuhannya (Lloret & Casero 2000). Melalui proses yang sama, akar-akar tertier akan tumbuh dari sel-sel perisikel akar sekunder (Lakitan 1995). 2.2.2. Rambut Akar Absorpsi air dan zat-zat terlarut oleh tumbuhan berlansung melalui sistem perakaran. Sebagian besar absorbsi terjadi pada daerah rambut akar yang terletak beberapa milimeter di atas ujung akar. Rambut akar adalah sel epidermis berbentuk tabung memanjang mempunyai vakuola lebar dan biasanya berdinding tipis, hanya beberapa tumbuhan rambut tersebut bercabang. Rambut akar panjangnya 80–1500 µm dengan diameter antara 5–20 µm dan dapat mencapai 200 lembar/mm2 (Hidayat 1995). Rambut akar mulai dibentuk di luar daerah meristematik bagian akar muda yang epidermisnya masih dapat memanjang.

Rambut akar biasanya

pertama kali tampak sebagai gelembung kecil di dekat ujung apikal sel epidermis.

Jika sel epidermis terus memanjang setelah terlihat adanya

gelembung, rambut akar ditemukan agak jauh dari ujung apikal sel epidermis yang menjelang dewasa. Rambut akar memanjang di ujungnya yang dindingnya tipis, lunak dan lebih lembut. Pada beberapa tanaman hanya sel epidermis akar tertentu yang disebut trikoblas yang dapat menghasilkan rambut akar, yakni berupa sel-sel kecil hasil pembelahan sel epidermis yang tidak sama. Cutter & Feldman (1970) dalam

Fahn

(1995)

mempelajari

trikoblas

pada

Hydrocharis,

selama

perkembangan trikoblas, nukleus dan nukleolus bertambah volumenya. Trikoblas berisi lebih banyak nukleohiston, protein total, RNA dan DNA inti. Trikoblas tidak berbagi, dan nukleusnya makin menjadi poliploid makin jauh dari ujung akar. Hal tersebut merupakan akibat pengunduran proses pendewasaan dari rambut akar yang berkembang. Terlambatnya pendewasaan ini mungkin merupakan suatu faktor yang sangat diperlukan dalam diferensiasi rambut akar.

Rambut akar biasanya hanya hidup dalam waktu yang singkat, umumnya hanya beberapa hari. Dengan kematian rambut akar dan jika sel tidak mengelupas, dinding sel epidermis menjadi bergabus dan lignin.

Pada

beberapa tumbuhan, rambut akar ditemukan tetap ada pada tumbuhan. Dinding dari rambut akar seperti itu menebal dan kehilangan kemampuan mengambil air dari tanah. 2.2.3. Struktur Internal Akar Epidermis adalah jaringan pelindung dan terdiri atas satu lapisan sel yang tersusun padat. Di bawah epidermis terdapat daerah yang relatif tebal disebut korteks. Korteks terutama tersusun dari sel-sel yang tidak terspesialisasi secara struktural, sel parenkima, dengan ruang antar sel yang luas. Lapisan terdalam korteks terdiri atas sebaris sel disebut endodermis. Dalam keadaan primer dinding semua sel endodermis itu tipis kecuali penebalan seperti pita pada sisi-sisi radial dan melintang sel terdebut. Penebalan ini dikenal sebagai jalur Caspary atau pita Caspary (Fahn 1995). Pada akar primer jalur caspary merupakan batas dalam dari ruang bebas dan tidak permeabel terhadap air dan zat-zat terlarut, sehingga air dan ion-ion terlarut dipaksa melewati protoplas sel untuk mencapai jaringan pembuluh (Harran & Tjondronegoro 1992).

Xilem Floem Perisikel

kambium Endodermis

Epidermis

Kortek

Rambut akar

Gambar 3. Sayatan melintang akar tumbuhan dikotil (Sumber : Campbell et al. 2000)

Bagian tengah akar dinamakan silinder pembuluh. Silinder ini terdiri atas jaringan penyalur air (xilem) dan jaringan penyalur makanan (floem). Antara jaringan pembuluh (xilem dan floem) dan endomermis terdapat lapisan sel parenkima yang tak terpsesialisasi (perisikel) yang berasal dari kumpulan sel meristimatik yang sama seperti xilem dan floem. Perisikel yang tetap mempertahankan sifat meristematiknya membentuk akar-akar lateral.

Xilem

terdiri atas sel-sel penyalur (trakeid) dan anggota pembuluh maupun serat dan parenkima. Trakeid dewasa merupakan sel tunggal yang memanjang. Di dalam dinding yang menebal terdapat bagian-bagian tipis (noktah) yang dapat menyalurkan air dengan mudah. Anggota pembuluh juga terdiri atas sel-sel tunggal dengan dinding yang serupa dengan trakeid tetapi penuh berlubanglubang ujungnya (Gambar 3). Sel-sel tersebut biasanya lebih pendek dibandingkan trakeid dan tersusun dalam baris vertikal. Sebaris anggota pembuluh dinamakan trakea. Serat merupakan sel lancip memanjang yang berdinding tebal terutama berfungsi dalam memperkuat jaringan. Parenkima merupakan semacam jaringan pengisi dan berfungsi dalam penyimpanan makanan (Mauseth 1988). Floem terdiri atas pembuluh tapis, sel pengiring, serat dan parenkima. Anggota pembuluh tapis merupakan sel hidup, tersusun dalam barisan vertikal, yang dikenal sebagai jaringan pembuluh tapis dan berfungsi dalam translokasi zat-zat organik.

Sel-sel pengiring merupakan sel seasal dengan anggota

pembuluh tapis dan tetap berhubungan rapat sesamanya. 2.2.4. Sistem Perakaran Tanaman Manggis Tanaman manggis biasa diperbanyak dengan menggunakan biji, waktu yang dibutuhkan untuk perkecambahan antara 10–45 hari.

Perkecambahan

dimulai dengan pembengkakan pada benih. Akar pertama muncul dari satu bagian pembengkakan (ujung), sedangkan tunas akan tumbuh dari bagian pembengkakan yang lain.

Selanjutnya sistem perakaran berkembang dari

bagian dasar tunas dan sistem perakaran yang pertama terbentuk berhenti berfungsi (Verheij 1992). Satu bulan setelah biji berkecambah, sistem perakaran tanaman manggis masih sangat jarang. Bijinya tetap melekat pada pangkal tunas sampai dengan umur 11 bulan, baik tunas maupun biji yang masih melekat tersebut

masing-masing masih memperlihatkan perakarannya.

Pada umur 2-4 bulan

terjadi peningkatan akar sekunder, sedangkan pertumbuhan akar tersier dimulai pada umur 3 bulan. Akar sekunder maupun tersier tebal, dengan permukaan halus dan tidak berakar rambut pada semua stadia tumbuh (Rukayah & Zabedah 1992). Pertumbuhan tanaman manggis yang lambat berkaitan erat dengan sistem perakarannya.

Tanaman manggis mempunyai akar tunggang yang

panjang dan kuat tetapi percabangan akarnya sangat sedikit, juga tidak memiliki bulu-bulu akar.

Uniknya di antara seluruh spesies Garcinia, hanya Garcinia

mangostana saja yang mempunyai perakaran lemah, sedangkan jenis lainnya memiliki perakaran kuat dan lebat. Hasil pemeriksaan sitologi terhadap tanaman manggis memperlihatkan bahwa tanaman ini mempunyai kromosom poliploid 2n=96 yang sifatnya sangat lemah, laju pembelahan selnya rendah demikian pula pembesaran selnya lambat, sedangkan spesies Garcinia lainnya yaitu G. Hombroniana

dan

G.

Malaccencis,

masing-masingnya

memiliki

jumlah

kromosom, yaitu 2n=48 dan 2n=46 (Verheij 1992). Menurut Cox (1988) pohon manggis dengan tinggi 3.8 m dan lebar tajuk 2.5 m mempunyai sebaran akar terbanyak pada kedalaman 5-30 cm dan akar terpanjang tidak lebih dari 1 m dari pangkal batang. Selain itu Gonzales & Anoos (1952) dalam Pertamawati (1994) mengatakan bahwa pada setiap tanaman manggis yang tingginya lebih dari 1 m, rata-rata mempunyai 5,6 akar primer yang lurus dan panjang, tetapi hanya 1 atau 2 dari akar primer tersebut yang dapat berkembang baik. Hidayat (2002) melaporkan juga bahwa, semakin tua tanaman manggis persentase akar tersier (diameter < 2 mm = feeder root) semakin rendah.

Sebaliknya persentase akar primer dan akar sekunder

semakin tinggi dengan semakin tuanya umur tanaman manggis. Akar tersier merupakan akar penyerap air dan hara mineral, sedangkan akar primer dan akar sekunder berperan sebagai organ penyangga batang dan penyimpan cadangan karbohidrat.

Rendahnya persentase akar tersier pada tanaman manggis

menyebabkan serapan air dan hara rendah. 2.2.3. Upaya Perbaikan Akar Bibit Manggis Dewasa ini pemerintah sedang menggalakkan komoditas nonmigas, melalui pengembangan agribisnis yang dapat meningkatkan perolehan devisa

Negara. Upaya peningkatan ekspor komoditas pertanian memerlukan dukungan penyediaan bibit untuk memenuhi kebutuhan yang semakin meningkat. Penyediaan bibit yang berkualitas merupakan salah satu faktor yang menentukan keberhasilan dalam pengembangan pertanian di masa mendatang. Beberapa penelitian telah dilakukan untuk memperbaiki sistem perakaran bibit manggis baik secara konvensional (in vivo) maupun secara in vitro. Pemberian mikorhiza dapat memperbaiki pertumbuhan dan perakaran bibit manggis. Poerwanto et al. (1998) melaporkan bahwa pemberian mikorhiza dapat meningkatkan pertumbuhan bibit manggis umur 4 minggu. Peningkatan pertumbuhan

bibit

terbaik

diperlihatkan

oleh

pemberian

endomikorhiza

Gigaspora sp dengan meningkatkan panjang akar primer, panjang total akar dan luas daun serta berat kering akar, batang dan daun. Sementara itu, di Malaysia dilaporkan bahwa mikorhiza jenis Scutellospora calospora dan Glamus mosseae mampu

meningkatkan

panjang

dan

percabangan

akar,

meningkatkan

pertumbuhan bibit manggis dan mempersingkat waktu di pembibitan dari 24 bulan menjadi 18 bulan (Masri et al. 1998). Penelitian Hidayat et al. (1999) diketahui bahwa pemberian 50-150 ppm IBA terhadap biji dan akar manggis meningkatkan pertambahan panjang akar, diameter batang, bobot total tanaman, kandungan dan serapan hara daun manggis. Pemberian trikontanol (0.075-0.150 ppm) meningkatkan panjang akar, luas daun, bobot tanaman serta serapan hara daun bibit yang berumur 7 bulan. Upaya perbaikan sistem perakaran manggis juga dilakukan dengan mengiduksi perakaran manggis secara in vitro. Goh

et al. (1994), berhasil

menginduksi perakaran manggis dengan menggunakan IBA yang ditanam dalam vermikulit. Hasil penelitian Te-chato & Lim (1999) perakaran manggis lebih cepat terbentuk, lebih panjang dan kualitasnya lebih baik pada perlakuan perendaman 4,4 mM IBA selama 15 menit dalam gelap dan dikulturkan pada media WP yang ditambah 34,5 µM phloroglucinol. Perlakuan 10-20 ppm IBA diinkubasi dalam gelap selama 14 hari memberikan persentase perakaran yang baik (Triatminingsih et al. 2001). Pertumbuhan dan perkembangan akar manggis yang dikulturkan secara in vitro dapat juga ditingkatkan dengan menerapkan sifat tumbuhan tersebut di lapangan, yaitu dengan mengontrol faktor lingkungan in vitro seperti perlakuan pengaturan CO2 dan peningkatan intensitas cahaya dalam wadah

kultur sehingga eksplan yang mempunyai klorofil dapat melakukan proses fotosintesis dengan optimal. Kultur seperti ini dikatakan bahwa eksplan tumbuh dalam keadaan fotoautotrofik (perbanyakan mikro dengan media bebas gula). Ermayanti et al. (1999) menyatakan bahwa planlet manggis yang ditanam dalam media bebas gula, menggunakan substrat vermikulit dan dengan pengaturan CO2 menghasilkan persen perakaran dan panjang akar yang lebih tinggi dibandingkan kontrol. Pertamawati (2003) juga mendapatkan bahwa, planlet manggis yang dikulturkan secara in vitro dalam keadaan fotoautotrofik nyata lebih baik pertumbuhannya, akar planlet lebih panjang dan daunnya lebih luas dibandingkan dengan keadaan miksotrofik (medium tumbuh mengandung gula). 2.3.

Perbaikan Sistem Perakaran Agrobacterium rhizogenes

Tanaman

dengan

Transformasi

2.3.1. Agrobacterium rhizogenes Agrobacterium adalah

bakteri tanah termasuk famili Rhizobiaceae

bersifat aerobik, bereaksi negatip terhadap pewarnaan gram, dapat tumbuh secara saprofit atau parasit dan menyebabkan penyakit tumor (grown gall) dan akar rambut (hairy root) pada tanaman dikotil dan monokotil. Sel-selnya yang normal berukuran 0,6–1,0 µm dan memiliki 1-6 flagela (Schaad 1988). Menurut Winans (1992) genus ini terdiri dari dua spesies yang bersifat patogen yaitu Agrobacterium

tumefaciens

dan

Agrobacterium

rhizogenes

keduanya

menginfeksi berbagai tanaman pada bagian yang luka. Infeksi sel bakteri pada bagian yang luka menyebabkan sel tanaman berproliferasi membentuk tumor dan akar.

Infeksi oleh A.

tumefaciens menyebabkan tumor yang tidak

terorganisasi dan infeksi oleh A. rhizogenes menyebabkan proliferasi akar. Induksi tumor dan akar yang terjadi disebabkan oleh terjadinya transfer sebagian fragmen DNA atau yang disebut dengan T-DNA dari Agrobacterium ditransfer ke dalam sel tanaman. T-DNA memiliki gen-gen untuk mensintesis auksin dan sitokinin, sehingga apabila berinfeksi dengan DNA tanaman mengakibatkan terjadinya over produksi fitohormon tersebut di dalam sel tanaman (Klee et al. 1987; Winans 1992). T-DNA ini terdapat pada plasmid besar yang disebut Ti-plasmid (tumor inducing) pada Agrobacterium tumefaciens dan Ri (root inducing) pada Agrobacterium rhizogenes (Winans 1992; Gelvin 2003).

Plasmid Ri yang

terdapat pada A. rhizogenes umumnya berukuran sekitar 140–235 kbp dan fragmen DNA yang ditransfer ke dalam sel tanaman sekitar 14-42 kb

yang

merupakan daerah TR dan TL-DNA. Plasmid Ri yang terdapat pada A. rhizogenes mempunyai satu atau dua macam T-DNA yaitu left T-DNA (TL-DNA) dan right T-DNA (TR-DNA). Berbeda dengan TL-DNA, TR-DNA mempunyai persamaan dengan T-DNA A. tumefaciens.

TR-DNA mengandung gen-gen

iaaM dan iaaH yang berfungsi dalam biosintesis auksin dan membawa gen-gen untuk menyandi sintesis senyawa opin (Giri & Narasu 2000). Sedangkan TLDNA mengandung gen-gen rol (root loci) yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD (Slightom et al. 1986). Hasil pengujian White et al. (1985) menunjukkan bahwa protein produk dari berbagai gen rol berperan dalam meningkatkan sensitivitas sel tanaman terhadap auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorong tanaman inang untuk mensintesis auksin. Ri-plasmid dapat dibedakan berdasarkan tipe opin yang dihasilkan yaitu agropin, manopin atau kukumopin (van der Salm et al., 1996). Senyawasenyawa tersebut merupakan sumber karbon dan nitrogen bagi Agrobacterium yang tidak dihasilkan oleh tanaman normal.

Bakteri dengan tipe agropin

mempunyai kedua bagian DNA, sedangkan bakteri dengan tipe manopin hanya memiliki TL-DNA. A. rhizogenes galur agropin yang mengandung TL dan TR-DNA mengandung lokus rol yang bertanggung jawab terhadap pembentukan penyakit akar rambut.

TL-DNA ini homolog dengan T-DNA tunggal dari galur

A.

rhizogenes yang lain. TR-DNA membawa gen agropin (ags), mannopin (mas2’ dan mas1’) dan auksin (iaaM dan iaaH) yang terlibat dalam biosintesis auksin yang juga ditemukan pada T-DNA strain A. tumefaciens (Jeng-Sheng, 2001) (Gambar 4). A.rhizogenes tipe agropin mempunyai kisaran inang yang lebih luas dibandingkan dengan A. rhizogenes tipe lainnya. Umumnya galur Agrobacterium yang digunakan dalam proses transformasi merupakan galur dengan inang luas dengan demikian strain bakteri tersebut patogenik terhadap banyak spesies tanaman.

Gambar 4. Peta genetik 2001).


(Sumber : Jeng-Sheng

2. 3.2. Interaksi Agrobacterium dengan Tanaman Proses transfer T-DNA dari Ti atau Ri plasmid ke dalam genom inti tanaman terjadi akibat adanya interaksi antara A. tumefaciens atau A. rhizogenes dengan sel tanaman yang luka. Sel tanaman yang luka menghasilkan senyawa gula, asam amino atau senyawa fenol (Winans, 1992). Dengan adanya isyarat tersebut maka Agrobacterium bergerak aktif menuju sel tanaman

yang

luka.

Untuk

memperkuat

interaksi

ini

Agrobacterium

mengeluarkan β-1,2-glukan. Beberapa gen dalam kromosom Agrobacterium diketahui merupakan penyandi enzim yang berperan dalam sintesis berbagai senyawa glukan, yaitu chvA, chvB dan pscA (exoC) serta gen cel yang berfungsi mensintesa selulosa fibril (Zambryski et al. 1989). Terbentuknya

senyawa

fenol

seperti

asetosiringon

(AS)

dan

hidroksiasetosiringon (OH-AS) dari sel tanaman yang luka menyebabkan aktifnya ekspresi gen-gen vir (virulensi). Aktivasi ekspresi gen vir dilakukan oleh

protein sensor (bertugas mendeteksi adanya senyawa fenol) yang disandikan oleh gen virA. Produk dari virA menginduksi fosforilasi dari produk virG yang kemudian mengaktifkan ekpresi dari berbagai gen vir lainnya (Powell et al. 1989; Zambryski et al. 1989; Winans 1992; Gelvin 2003). Gen-gen lain yang aktif diantaranya adalah gen virD1 dan virD2. Produk kedua gen ini merupakan endonuklease yang dapat menimbulkan nick (terputusnya rantai DNA) pada basa ketiga dan keempat pada LB dan RB sehingga dapat terjadi proses sintesis utas tunggal (ss)T-DNA. Jika virD1 dan virD2 berada dalam kondisi terbatas, digunakan juga produk virC untuk meningkatkan sintesis (ss)T-DNA (Gelvin, 2003).

Selanjutnya (ss) T-DNA

ditransfer dengan cara membentuk T-kompleks dengan produk virE2 (virE2-TDNA). VirE2 mengikat ssT-DNA pada situs yang tidak spesifik, berfungsi untuk menjaga kestabilan ssT-DNA dari kerusakan akibat nuklease (Jeng-Sheng, 2001; Gelvin, 2003). Menurut Winans (1992) produk dari virD2 akan tetap terikat pada ujung 5 dari T-kompleks dan diduga berfungsi sebagai protein pemandu dalam pelepasan T-kompleks dari Agrobacterium ke sel tanaman, sedangkan virD1 tidak lagi berikatan dengan T-kompleks karena tidak diperlukan dalam proses transfer T-DNA. Produk dari virB menyebabkan terbentuknya pori atau lubang yang dilewati oleh T-DNA pada proses transfer T-kompleks dari bakteri ke tanaman. 2.3.3. Integrasi dan Ekspresi pada Genom Tanaman Secara umum proses infeksi A. rhizogenes mirip dibandingkan dengan A. tumefaciens. Proses transfer ssT-DNA bersifat polar, yaitu bergerak dari batas kanan ke batas kiri dimulai dari ujung 5’ ke ujung 3’ (5’–3’) mirip dengan proses konjugasi.

Satu atau beberapa kopi ssT-DNA dapat terintegrasi ke

dalam genom tanaman pada satu situs yang sama atau terpisah-pisah pada situs yang berbeda (Armitage et al. 1987). Masuknya suatu gen asing dari suatu organisme ke sel lain (tanaman) mengalami beberapa tahap yaitu pengikatan dan pengambilan bahan genetik pada tanaman dan penurunan sifat genetik pada tanaman yang diregenerasikan. Tanaman

yang

telah

mengalami

integrasi

T-DNA

selanjutnya

mengekspresikan enzim baru, mensintesis fitohormon sehingga terjadi over

produksi

fitohormon.

Fitohormon

tersebut

diperlukan

tanaman

untuk

meningkatkan sintesis protein dan memacu pertumbuhan akar primordia yang meningkatkan pertumbuhan akar.

Gen-gen yang terdapat pada T-DNA

dibedakan

yaitu

menurut

peranannya

gen-gen

yang

mempengaruhi

keseimbangan fitohormon dalam sel tanaman inang (oncogene) atau gen yang mempengaruhi produksi opin (opin sintetase). Pada TR-DNA gen yang berfungsi untuk pembentuk auksin adalah iaaM (tms 1), dan iaaH (tms 2), dan juga membawa gen untuk menyandi sintesis senyawa opin. Gen iaaM menyandi pembentukan triptofan 2-monooksigenase yang mengkatalisis perubahan Ltriptofan menjadi senyawa indole-3-asetamida. Sedangkan iaaH menyandi enzim amino hidrolase yang mengubah indole-3-asetamida menjadi asam indole-3-asetat (IAA) (van der Salm et al. 1996; Jeng-Sheng 2001). Daerah TL-DNA berukuran 20 kb, mengandung empat root loci (rol AD) yang terlibat dalam induksi akar, yakni rolA, rolB, rolC dan rolD yang berhubungan dengan open reading frames ORFs 10, 11, 12, dan 15 (Chriqui 1996). Jeng-Sheng (2001) menjelaskan bahwa gen rolB (ORF11) mengkode βglucosidase yang menghidrolisis indol β-glucosida yang diduga berperan meningkatkan pool auksin aktif dalam tanaman dengan hidrolisis konjugat IAA inaktif, mengatur sensivitas sel terhadap IAA dan mendorong pembentukan meristem. Gen rolC (ORF12) diduga berperan meningkatkan level sitokinin melalui aktivitas

β-glucosidase yang mampu melepaskan sitokinin aktif dari

konjugatnya. Gen rolA (ORF10) terlibat lansung dalam induksi akar sedangkan rolD (ORF15) berperan menginduksi pembungaan, namun fungsi biokimia dari kedua gen rol ini belum diketahui (Jeng-Sheng 2001; Valpuesta 2002). Rugini et al. (1992) telah membuktikan bahwa kemampuan perakaran, jumlah akar dan massa akar meningkat ketika gen rolABC terekspresi pada tanaman kiwi.

2.3.4. Perbaikan Sistem Perakaran dengan Agrobacterium rhizogenes Perakaran masih menjadi masalah utama yang sulit dipecahkan pada tanaman tahunan berkayu yang diperbanyak dengan metode perkecambahan biji maupun kultur in vitro.

Percobaan untuk memperbaiki sistem perakaran

selama ini lebih banyak dilakukan dengan penambahan zat pengatur tumbuh dan bahan kimia lainnya. Hasil yang diperoleh memperlihatkan bahwa awal pembentukan akar dapat dipacu lebih cepat, tetapi percepatan peningkatan akar

yang terbentuk tidak terlalu besar. Oleh karena itu perlu dicari upaya lain yang dapat mengatasi masalah perakaran pada tanaman tahunan. Saat ini telah banyak percobaan yang dilakukan untuk mengatasi masalah pengakaran pada tanaman buah-buahan dan tanaman tahunan berkayu dengan menggunakan A. rhizogenes. A. rhizogenes dapat menginduksi pembentukan akar pada tanaman yang terinfeksi. Akar yang terbentuk dapat tumbuh dengan cepat dan biasanya tidak memerlukan hormon pertumbuhan eksogen. Akar tersebut sering disebut dengan ”hairy root” (akar rambut) karena umumnya memperlihatkan morfologi yang berbeda dengan akar tanaman induknya. Akar-akar tersebut biasanya membentuk cabang-cabang lateral dan rambut-rambut akar yang lebih banyak dibandingkan akar normal. A. rhizogenes telah banyak ditransformasikan pada berbagai jenis tanaman, terutama pada tanaman buah-buahan dan kehutanan. Strobel et al. (1987) berhasil meningkatkan pertumbuhan dan produksi tanaman olive (Olea europaea L.) dengan transformasi Ri-plasmid A. rhizogenes galur 232, dan anatomi akar menunjukkan bahwa sistem jaringan pembuluh tanaman olive hasil transformasi sama dengan tanaman kontrol. Strobel & Nachmias (1985) melaporkan bahwa transformasi A. rhizogenes galur 232 pada akar almond meningkatan jumlah dan massa akar, diameter batang serta jumlah daun setelah 90 hari transformasi. Dilaporkan juga bahwa terjadinya peningkatkan pertumbuhan dan produksi setelah transformasi A. rhizogenes galur 232 pada bagian akar tanaman olive (Strobel et al. 1988). McAfee et al. (1993) berhasil menginduksi perakaran Pinus dan Larix spp menggunakan A. rhizogenes galur A4. Damiano & Monticelli (1998) berhasil menginduksi perakaran semua kultivar almond dan apel setelah transformasi dengan A. rhizogenes galur 1855. Pada kultur in vitro, A. rhizogenes galur A4 dan 232 berhasil menginduksi perakaran eksplan tunas apel ’Golden delicious’ (Patena et al. 1988). Infeksi A. rhizogenes galur 1855, dengan dan tanpa penambahan hormon pada kultur in vitro almond, apel, plum, pyrus pyraster dan dua hibrid rootstocks, Citation (plum X peach) dan GF677 (almond X peach) menghasilkan tiga respon, yaitu : genotif yang berakar tanpa auksin, genotif yang berakar hanya dengan auksin dan genotif yang berakar setelah diinfeksikan A. rhizogenes (Damiano & Monticelli. 1998). Induksi akar dengan A. rhizogenes galur LBA9402 ternyata

lebih efektif dalam meningkatkan persen akar dan jumlah akar pada eksplan radiate pine (Pinus radiata D.) dibandingkan galur A4T (Li & Leung 2003). Pembentukan akar oleh transformasi A. rhizogenes sangat dipengaruhi lingkungan tumbuh, diantaranya Menurut

suhu, kelembaban udara, pH dan cahaya.

Whiteman et al. (1988) bahwa efektivitas A. rhizogenes dalam

menginduksi pembentukan akar dipengaruhi oleh beberapa faktor, yaitu

pH

mendekati netral (6.0), suhu 25oC dan bagian tanaman yang diinokulasi. Biosintesis IAA Infeksi A. rhizogenes pada bagian yang luka dapat menyebabkan sel berproliferasi membentuk akar.

Akar yang tumbuh disebabkan oleh adanya

transfer sebagian fragmen DNA atau yang disebut dengan T-DNA dari Agrobacterium ditransfer ke dalam sel tanaman. T-DNA memiliki gen-gen untuk mensintesis fitohormon, sehingga apabila terekspresi mengakibatkan terjadinya over produksi fitohormon tersebut di dalam sel tanaman (Klee et al., 1987; Winans, 1992). Fitohormon adalah zat pengatur tumbuh yang dihasilkan oleh tanaman dan aktif dalam jumlah yang kecil (10-6–10-5 mM). Dikenal beberapa macam golongan fitohormon salah satunya Indole Asetic Acid (IAA). Asam-asam amino aromatik triptofan (Trp) termasuk dalam jalur utama biosintesis dari IAA. Hasilhasil intermediet yang terdapat antara triptofan dan IAA adalah piruvat, triptoamin, dan indol asetaldehida.

asam indol

Triptofan sendiri dihasilkan dari

senyawa berkarbon 7, yakni 3-deoksi-7-fosfo-D-asam arabinoheptulosonat yang merupakan hasil kondensasi dari D-eritrosa-4-fosfat (senyawa berkarbon 4) dan fosfo-enol-piruvat (senyawa berkarbon 3). Hormon IAA juga dapat dibentuk secara langsung dari asam amino serine dengan indol (Wattimena, 1988). Menurut Davies (2004) bahwa jalur pembentukan IAA melalui senyawa intermediat indole-3-pyruvate (IPA) dan indole-3-acetamide (IAM) biasa terjadi pada oleh mikroorganisme, sedangkan jalur lain terdapat dalam tanaman. Jalur IAM terdapat pada semua bakteri Agrobacterium, Bradyrhizobium japonicum, Rhizobium fredii, Azospirillum brasilense, dan Streptomyces (Manulis et al., 1998). Sedangkan biosintesis IAA melalui IPA dijumpai pada tanaman tingkat tinggi dan beberapa jenis bakteri meliputi Rhizobium spp, Azospirillum spp, Ralstonia solanacearum dan Enterobacter cloaceae (Brandl et al., 1996).

Gen-gen pada jalur IAM menyandikan tryptophan monoxygenase (iaaM) dan IAM hydrolase (iaaH), sedangkan enzim kunci pada jalur IPA adalah indole-pyruvate decarboxylase (Gambar 5). Hormon IAA yang dihasilkan oleh tanaman dapat ditransportasikan dan digunakan langsung oleh tanaman, akan tetapi apabila ketersediaannya berlebih maka IAA dapat diikat oleh senyawasenyawa tertentu menjadi IAA asam aspartat, IAA-mioinositol dan IAA glukosa. Senyawa-senyawa tersebut tidak aktif sebagai auksin kecuali bila dihidrolisis kembali menjadi IAA bebas.

Pengaturan ini penting bagi tanaman untuk

mengatur ketersediaan IAA di dalam tanaman sesuai dengan kebutuhan tanaman (Wattimena 1988; Davies 2004).

Gambar 5. Biosintesis IAA pada tanaman dan bakteri (Sumber : Walkel & Estelle 1998)

Kultur Jaringan Tanaman Kultur jaringan tanaman merupakan teknik menumbuh-kembangkan bagian tanaman, baik berupa sel, jaringan, atau organ dalam kondisi aseptik secara in vitro di laboratorium.

Teknik ini dicirikan oleh kondisi kultur yang

bebas kuman, penggunaan media kultur buatan dengan kandungan nutrisi lengkap dan ZPT (Zat Pengatur Tumbuh), serta kondisi ruang kultur yang suhu dan pencahayaannya terkontrol (Yusnita, 2003) Wattimena (2006) menyatakan bahwa perbanyakan secara in vitro dapat dilakukan dengan beberapa metode antara lain melalui multiplikasi tunas dari mata tunas aksilar, melalui pembentukan tunas adventif, atau somatik embriogenesis secara langsung (pembentukannya terjadi lansung dari bagian jaringan eksplan) dan tidak lansung (pembentukannya terjadi setelah melalui tahap pembentukan kalus atau protokorm). Semua sistem propagasi dan kultur jaringan

dimulai

dengan

pemotongan

bagian

kecil

dari

tanaman,

membebaskannya dari kontaminasi mikroorganisme dan menempatkannya dalam media kultur. Bagian tanaman yang dikulturkan tersebut dikenal dengan sebutan eksplan dan merupakan bahan untuk perbanyakan kultur in vitro. Teknik perbanyakan in vitro umumnya dilakukan melalui lima tahap (Werbrouck & Debegh, 1994) ; Tahap 0 : Persiapan dan perlakuan tanaman (sumber eksplan) Tahap 1 : Inisiasi eksplan Tahap 2 : Multiplikasi tunas Tahap 3 : Pemanjangan, induksi akar dan perkembangan akar Tahap 4 : Aklimatisasi dan penanaman di lapangan Tahap 0 dilakukan untuk mendapatkan bahan tanam (eksplan) yang sehat dan kondisi fisiologisnya bagus. Pada tahap ini, tanaman sebagai sumber eksplan perlu dirawat dengan baik dan kadang-kadang perlu perlakuan khusus seperti pemangkasan, penyemprotan zat pengatur tumbuh sehingga kondisi fisiologinya lebih baik.

Pada tahap inisiasi, kegiatan yang dilakukan adalah

memilih bagian tanaman yang akan dijadikan eksplan, mencari prosedur sterilisasi yang efektif namun tidak mematikan eksplan, dan memilih komposisi media yang tepat. perbanyakan in vitro.

Tahap multiplikasi merupakan tahap yang penting dalam

Multiplikasi tunas dilakukan dengan menambahkan zat pengatur tumbuh auksin dan sitokinin dalam media dan mensubkultur planlet pada media yang sama atau media yang berbeda.

Pada beberapa kasus, penggunaan

sitokinin cukup optimal untuk multiplikasi tunas (Werbrouck & Debergh, 1994). Tahap

pengakaran

diaklimatisasi.

dapat

menghasilkan

akar

sehingga

bisa

segera

Apabila sitokinin yang digunakan pada tahap 2 relatif tinggi,

kadang-kadang tunas yang dihasilkan pendek dan sulit berakar. Agar dihasilkan tunas yang panjang dan berakar, planlet ditransfer ke media yang berbeda. Pada tahap aklimatisasi pemilihan media dan kondisi lingkungan rumah kaca perlu diperhatikan untuk mendapatkan pertumbuhan yang baik.

Peningkatan Perakaran Bibit Manggis Melalui Inokulasi Agrobacterium rhizogenes pada Semai Manggis

ABSTRAK Agrobacterium rhizogenes merupakan bakteri tanah yang mempunyai kemampuan untuk menstranfer sebagian bahan genetiknya (T-DNA) pada sel tanaman yang terlukaan. T-DNA tersebut membawa gen-gen yang terlibat dalam proses induksi akar. Tujuan dari penelitian ini adalah : seleksi strain A. rhizogenes spesifik penginduksi perakaran manggis, dan pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk menginduksi perakaran manggis. Penelitian dibagi menjadi dua percobaan, Percobaan (A), menggunakan rancangan acak lengkap dengan kombinasi perlakuan dua faktor, yaitu pertama : 11 strain A. rhizogenes (ATCC-15834, ATCC-8196, R-1000, 0720001, A4, A4 J, 509, 510, 511, MAFF 01-1724, dan tanpa inokulasi), kedua : 2 metode inokulasi (tusuk dan potong), dengan enam ulangan. Hasil penelitian menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 509, 07-20001, A4, dan R-1000 mampu meningkatkan perkembangan akar, yaitu; panjang akar primer, jumlah akar lateral dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu; diameter batang, tinggi, dan jumlah daun bibit tanaman manggis yang lebih baik dibanding dan kontrol. Inokulasi A. rhizogenes dengan metode akar dipotong menghasilkan persentase tanaman hidup lebih tinggi dibanding dengan akar ditusuk. Percobaan (B), menggunakan rancangan acak lengkap (RAL) dengan dua faktor yang disusun secara faktorial. Faktor pertama adalah konsentrasi strain A. rhizogenes, yaitu; G0= kontrol, G1= R1000(OD600 = 0.7), G2= R1000 (OD600 = 1.0), G3= 509(OD600 = 0.7), G4= 509(OD600 = 1.0), 5= A4(OD600 = 0.7), G6= A4(OD600 = 1.0), G7= 07-20001(OD600 = 0.7), G8= 07-20001(OD600 = 1.0), dan G9= ATCC-15834(OD600 = 1.0), G10= ATCC-15834(OD600 = 0.7). Faktor kedua umur bibit manggis yaitu; B1 = 3 minggu, B2 = 6 minggu, dan B3 = 9 minggu. Bakteri A. rhizogenes yang dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis mampu meningkatkan pertumbuhan bibit manggis, baik perakarannya maupun pertumbuhan tajuk. Diperoleh bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD600 = 1.0 yang dapat menginokulasi akar bibit manggis umur 6 minggu. Hasil verifikasi inokulasi A. rhizogenes dengan amplifikasi PCR menunjukkan bahwa strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada gel elektoforesis.

Kata kunci : A. rhizogenes, induksi akar, strain, gen rolB, T-DNA,

Improvement of Mangosteen Seedling Root System through Agrobacterium rhizogenes Inoculation at the Mangosteen Nursery

ABSTRACT The soil bacterium Agrobacterium rhizogenes can induce the abundant adventitious root formation at the infection site through the transfer of genetic material T-DNA, a part of the Root inducing (Ri) plasmid from bacterium to the plant genome. The aims of the study were : (A) selection of A. rhizogenes specific strains to induce mangosteen rooting, and (B) development of effective protocol inoculation of A. rhizogenes to induce mangosteen rooting. The reseach was conducted in two experiments, The experiment (A) was assigned in completely randomized design with two factorial treatments. The fist factor : strains A. rhizogenes (ATCC-15834, ATCC-8196, R-1000, 07-20001, A4, A4-J, 509, 510, 511, MAFF 01-1724, and control), the second factor : transformation method (cutting and dipping). The results showed that strains transformation of ATCC-15834, 509 , 07-20001, A4, and R-1000 increased : lateral and tertier roots number, stem diameter, plant height and leaf number better than control. Inoculation with cutting root method resulted in the higher live plant percentage compared with dipping root method. The experiment (B) was conducted in completely randomized design with two factorial treatments. The first factor : concentration of A. rhizogenes strains {(G0= control, G1= R1000(OD600 = 0.7), G2= R1000 (OD600 = 1.0), G3= TISTR 509(OD600 = 0.7), G4= 509(OD600 = 1.0), G5= A4(OD600 = 0.7), A6= G4(OD600 = 1.0), G7= 07-20001(OD600 = 0.7), G8= 0720001(OD600 = 1.0), and G9= ATCC-15834(OD600 = 1.0), G10= ATCC15834(OD600 = 0.7) }, and the second one were mangosteen seedling old when it is innoculated (3 week, 6 week and 9 week). The results showed that : A. rhizogenes strain ATCC-15834 (OD600 = 1.0) was able to infect 6 week old of mangosteen seedling root. Based on PCR product, TL-DNA from A. rhizogenes strain ATCC-15834 was transferred into genome of mangosteen seedling root cell since the rolB gene was detected at 780 bp agarose electrophoresis.

Key words : A. rhizogenes, gen rolB, root inducing, strain, T-DNA

PENDAHULUAN

Pembibitan manggis melalui biji merupakan cara yang paling umum dilakukan karena mudah, murah dan praktis. Namun laju pertumbuhan tanaman manggis ini selanjutnya lambat. Lambatnya pertumbuhan tanaman manggis ini menyebabkan keengganan petani untuk menanam manggis. Usaha untuk mempersingkat masa vegetatif tanaman manggis dapat dilakukan dengan perbanyakan vegetatif secara sambung (sambung pucuk) dan secara sambung susuan. Namun penyediaan batang bawah masih merupakan kendala dikarenakan pertumbuhan bibit yang lambat, diperlukan waktu sekitar 2-3 tahun untuk mendapatkan kondisi siap sambung (Anwaruddin et al. 1991). Pertumbuhan tanaman manggis yang lambat ini merupakan akibat dari kurang baik dan lemahnya sistem perakaran, rendahnya kapasitas daun untuk menangkap CO2 sehingga laju fotosintesis rendah, rendahnya laju pembelahan sel pada meristem pucuk dan panjangnya dormansi mata tunas (Wieble et al. 1992). Hasil pemeriksaan sitologis terhadap tanaman manggis memperlihatkan bahwa tanaman ini mempunyai kromosom poliploidi (2n = 96) yang sifatnya sangat lemah, laju pembelahan selnya rendah demikian pula perbesaran selnya lambat. Spesies Garcinia lainnya mempunyai kromosom 2n = 48 (Verheij & Coronel 1991). Masri et al. (1998) melaporkan juga bahwa tanaman manggis mempunyai sistem perakaran yang kurang berkembang dimana jumlah akar sekunder per unit panjang akar primer (kapasitas pecabangan akar) manggis lebih kecil 21% dari durian, 27% dari cempedak, dan 45% dari rambutan. Percobaan untuk memperbaiki sistem perakaran guna memacu pertumbuhan bibit manggis telah dilakukan dengan berbagai cara, yaitu ; perendaman biji manggis sebelum semai dalam sitokinin (Poerwanto et al. 1995), GA3 (Rais et al. 1996), IBA dan triakontanol (Hidayat et al. 1999), dan pemanfaatan beberapa jenis cendawan mikoriza arbuskula (Poerwanto et al. 1998; Masri et al. 1999; Muas et al. 2002; Lucia 2005), namun hasilnya belum memuaskan.

Dengan

demikian

diperlukan

usaha

untuk

meningkatkan

perkembangan akar sekaligus memacu pembentukan dan pertumbuhan rambut akar. Usaha untuk memperbaiki sistem perakaran bibit manggis juga dapat dilakukan dengan pemanfaatan bakteri tanah, yaitu bakteri Agrobacterium

rhizogenes. Selain dapat memproduksi hormon IAA, bakteri A. rhizogenes ini juga dapat memodifikasi lingkungan disekitar perakaran seperti meningkatkan kandungan asam-asam organik (malik, laktik, fumarik dan sitrik) yang diperlukan untuk perkembangan akar (McAfee et al. 1993). Pemanfaatan A. rhizogenes pada tanaman telah banyak dilakukan pada tanaman buah-buahan dan tanaman kehutanan akan tetapi

pemanfaatan A. rhizogenes pada tanaman

manggis belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu dipelajari upaya perbaikan sistem perakaran bibit manggis melalui inokulasi A. rhizogenes. Dalam penelitian ini dilakukan dua percobaan inokulasi A. rhizogenes pada bibit tanaman manggis. Percobaan pertama bertujuan untuk menyeleksi strain A. rhizogenes yang dapat menginfeksi akar bibit manggis dan mendapatkan metode inokulasi A. rhizogenes yang terbaik pada akar bibit tanaman manggis. Strain-strain A. rhizogenes yang efektif dan metode yang terbaik untuk menginokulasi akar bibit manggis akan dipergunakan dalam penelitian tahap berikutnya (percobaan kedua).

Percobaan kedua bertujuan

untuk pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk peningkatan perakaran bibit tanaman manggis. Dalam percobaan pertama, seleksi dilakukan terhadap 10 strain A. rhizogenes (diperoleh dari koleksi Puslit Bioteknologi LIPI Cibinong-Bogor) yang diinokulasikan pada bibit manggis dengan metode akar dipotong dan ditusuk. Pengamatan dilakukan terhadap perkembangan akar dan tajuk bibit manggis setelah diinokulasikan dengan berbagai strain A. rhizogenes. Dalam percobaan kedua, menggunakan berbagai konsentrasi A. rhizogenes dan umur bibit manggis. Selain pengamatan yang dilakukan seperti pada percobaan pertama, dalam percobaan kedua juga dilakukan pengamatan anatomi dan fisiologi bibit manggis.

BAHAN DAN METODE

Penelitian ini dilaksanakan mulai bulan Maret 2004 sampai Mei 2007. Kegiatan penelitian dilaksanakan di Laboratorium dan rumah kaca Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika IPB, Laboratorium Mikrobiologi dan Anatomi Tumbuhan FMIPA IPB, Laboratorium Bioteknologi dan Zoologi LIPI Cibinong, Laboratorium BALITBIOGEN dan BALITTRO Cimanggu Bogor.

Percobaan A.

Seleksi Strain Agrobacterium rhizogenes Spesifik Penginduksi Perakaran Bibit Manggis (Garcinia mangostana L.)

Penelitian ini bertujuan untuk menyeleksi strain A. rhizogenes yang dapat menginfeksi akar bibit manggis dan mendapatkan metode inokulasi A. rhizogenes yang terbaik pada akar bibit tanaman manggis.

a). Perlakuan Percobaan Penelitian menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor yang disusun secara faktorial. Faktor pertama adalah strain A. rhizogenes yang terdiri atas 10 strain, yaitu ; A0

= kontrol (tanpa inokulasi A. rhizogenes),

A1

= 509

A2

= 510

A3

= 511

A4

= MAFF 01-1724

A5

= ATCC-15834

A6

= ATCC-8196

A7

= A4

A8

= A4-J

A9

= 07-20001

A10

= R-1000

Faktor kedua adalah metode inokulasi, yaitu; B1

= akar dipotong

B2

= akar ditusuk

Masing-masing perlakuan diulang 3 kali, kombinasi perlakuan 66 satuan percobaan. Setiap satuan percobaan terdiri atas 2 polibag yang masingmasing berisi satu tanaman. Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (uji F). Apabila dalam sidik ragam tersebut terdapat pengaruh perlakuan, analisis dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (α=0.05).

b). Pembuatan Media Kultur A. rhizogenes Bakteri A. rhizogenes yang digunakan ada beberapa strain yaitu ; ATCC15834, ATCC-8196, MAFF 01-1724, 07-20001, A4, A4 J, 509, 510, 511, dan R1000 (A. tumefacien) diperoleh dari koleksi Puslit Bioteknologi LIPI CibinongBogor. Untuk pertumbuhan bakteri digunakan media Yeast Manitol Broth (YMB) (Gelvin et al., 1988) dan media Luria Bertani (LB) (Gelvin et al., 1988). Bahan-bahan untuk pembuatan media YMB yang terdiri dari 10 g manitol, 0.1 g NaCl, 0.2 g MgSO4 7H2O 0.5 g, KH2PO4 dan 0.4 g Yeast Extract dilarutkan dalam akuades menjadi 1 liter media. Setelah itu pH larutan diatur menjadi 7.0 – 7.2. Bahan untuk pembuatan 1 liter media LB berupa 10 g/l bacto tryptone, 5 g/l Yeast Extract, 5 g/l NaCl, pH larutan diatur menjadi 7.5 dengan menggunakan pH meter. Untuk media padat ditambahkan 15 g agar (Bacto). Media disterilisasi dengan otoklaf pada suhu 121oC dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. c). Pengkulturan A. rhizogenes Strain A. rhizogenes dipelihara dalam media padat YMB (ATCC-15834, 07-20001, A4, dan A4-J), dan LB (ATCC-8196, R-1000, dan 509, 510, 511, dan MAFF 01-1724) untuk kemudian diinokulasi di kultur pada 50 ml media YMB dan LB cair. Kultur bakteri diinkubasi di atas mesin pengocok dengan kecepatan 150-200 rpm selama 24 jam, dalam keadaan gelap pada suhu 28oC.

d). Persemaian Benih Manggis Bahan tanam yang digunakan adalah buah manggis asal Purwakarta. Benih dibersihkan arilnya, kemudian dipilih yang besar dan beratnya hampir seragam (≥ 1,2 g). Benih manggis disemai dikotak persemaian menggunakan media pasir yang telah disterilisasi dengan mengukusnya selama 4 jam pada suhu 100oC (Gambar 6).

Buah manggis asal Purwakarta

Berat benih minimum, 1.2 gr

Persemain benih manggis

Gambar 6. Bahan tanam yang digunakan untuk inokulasi A. rhizogenes

e). Inokulasi A. rhizogenes pada Bibit Manggis Inokulasi A. rhizogenes dilakukan dengan menggunakan metode Strobel & Nachmias (1985) yang dimodifikasi Charity (2002). Bibit manggis umur 4 minggu diinokulasi dengan A. rhizogenes pada bagian akar dengan metode akar dipotong sepanjang 1 cm dari ujung akar dan untuk metode akar ditusuk dilakukan penusukan akar dengan jarum streril sebanyak lima tusukkan sepanjang 1 cm dari ujung akar. Kemudian bibit manggis tersebut direndam dalam suspensi berbagai strain A. rhizogenes dan divakum selama 30 menit. Bibit dipindahkan ke kertas merang steril yang telah dibasahi dengan larutan hogland steril dan disimpan selama 2 hari pada suhu 28oC dalam kondisi gelap, kemudian dipindahkan ke kotak pembibitan (Gambar 7).

Daerah inokulasi A. rhizogenes, 1 cm dari ujung akar

Bibit manggis diinokulasi dengan A. rhizogenes

Penanaman bibit manggis

1 cm

Gambar 7. Tahapan inokulasi A. rhizogenes pada bibit tanaman manggis

f). Penanaman Bibit Manggis Media untuk pembibitan manggis terdiri atas campuran pupuk kandang, pasir, kompos daun bambu, dan tanah dengan perbandingan volume 1 : 2 : 2 : 1 yang diaduk rata dan sterilisasi dengan mengukusnya selama 4 jam pada suhu

100oC. Media tanam yang telah disterilisasi dimasukkan ke dalam kotak pembibitan. g). Pemeliharaan Bibit Pemeliharaan bibit manggis dilakukan dengan penyiraman, penyiangan, pemupukan dan pengendalian hama dan penyakit. Penyiraman diberikan setiap hari, untuk memupuk bibit digunakan pupuk NPK (1 g/kotak pembibitan) yang diberikan setiap 4 bulan. Penyemprotan fungisida dan insektisida dilakukan apabila terjadi gejala-gejala serangan hama dan penyakit.

h). Pengamatan Peubah-peubah yang diamati pada penelitian ini dan cara melakukan pengamatannya adalah sebagai berikut : (1) Pertambahan tinggi Pertambahan tinggi tanaman diamati 1 minggu sekali dimulai sejak bibit berumur 1 minggu setelah inokulasi sampai minggu ke-24. Pengukuran dilakukan pada pangkal batang sampai dengan pucuk tempat keluarnya daun termuda. (2) Pertambahan jumlah daun Pertambahan jumlah daun diamati 1 minggu sekali dimulai sejak bibit berumur 1 minggu setelah inokulasi sampai minggu ke-24. Daun yang dihitung yaitu daun yang telah terbuka penuh. (3) Pertambahan diameter batang Pertambahan diameter batang diamati 1 minggu sekali dimulai sejak bibit berumur 1 minggu setelah inokulasi sampai minggu ke-24. Pengukuran dilakukan pada pangkal batang dengan menggunakan jangka sorong. (4) Persentase tanaman hidup diamati setiap 1 bulan sekali dimulai sejak bibit berumur 1 bulan setelah inokulasi sampai bulan ke-6. Data pertambahan tinggi, jumlah daun dan diameter batang diperoleh sebagai nilai selisih dari data pengukuran minggu ke-24 dengan data pengukuran minggu pertama setelah inokulasi. Pembongkaran tanaman dilakukan minggu ke-24 setelah inokulasi, peubah-peubah yang diamati adalah :

(5) Panjang akar primer Pengukuran panjang akar primer dilakukan pada akhir pengamatan. Akar primer dari pangkal batang sampai ujung akar diukur dengan menggunakan penggaris kemudian data yang diperoleh dikurangi dengan panjang akar sebelum diinokulasi. (6) Jumlah akar sekunder Perhitungan jumlah akar sekunder dilakukan pada akhir pengamatan dengan cara menghitung jumlah akar yang tumbuh dan melekat pada akar primer. (7) Jumlah akar tersier Perhitungan jumlah akar tersier dilakukan pada akhir pengamatan dengan cara menghitung jumlah akar yang tumbuh dan melekat pada akar sekunder.

Percobaan B. Pengembangan Protokol Inokulasi A. rhizogenes yang Efektif untuk Menginduksi Perakaran Bibit Manggis Tujuan dari penelitian ini adalah untuk pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk peningkatan perakaran bibit tanaman manggis. a). Perlakuan dan rancangan percobaan Penelitian ini menggunakan Rancangan Acak Lengkap (RAL) dengan dua faktor yang disusun secara faktorial, yaitu : Faktor I Konsentrasi Bakteri A. rhizogenes G0 = Kontrol (tanpa A. rhizogenes) G1 = 509 (OD600 = 0.7) G2 = 509 (OD600 = 1.0) G3 = 07-20001(OD600 = 0.7) G4 = 07-20001(OD600 = 1.0) G5 = ATCC15834 (OD600 = 0.7) G6 = ATCC15834 (OD600 = 1.0) G7 = R-1000 (OD600 = 0.7) G8 = R-1000 (OD600 = 1.0) G9 = A4 (OD600 = 0.7) G10 = A4 (OD600 = 1.0)

Faktor II Umur Bibit Manggis T1 = Bibit manggis umur 3 minggu T2 = Bibit manggis umur 6 minggu T3 = Bibit manggis umur 9 minggu Kombinasi perlakuan 11 x 3 = 33 dengan 8 ulangan sehingga terdapat 264 satuan percobaan. Data hasil pengamatan dianalisis dengan menggunakan sidik ragam (uji F). Apabila dalam sidik ragam tersebut terdapat pengaruh perlakuan, analisis dilanjutkan dengan uji Duncan’s Multiple Range Test (α=0.05).

d). Inokulasi A. rhizogenes pada Bibit Manggis Bibit manggis umur 9, 6, dan 3 minggu telah disiapkan sebelumnya, dipilih yang seragam dan sehat. Ujung akar dipotong sepanjang 1 cm dengan pisau steril, lalu direndam dalam berbagai suspensi A. rhizogenes sesuai perlakuan konsentrasi A. rhizogenes dan di vakum selama 30 menit.

Bibit

dipindahkan ke kertas merang steril yang telah dibasahi dengan larutan hogland steril dan disimpan selama 2 hari pada suhu 28oC, dalam kondisi gelap kemudian dipindahkan ke kotak pembibitan (Gambar 7), pemeliharaan bibit dilakukan seperti percobaan B. g). Pengamatan Peubah-peubah yang diamati pada percobaan ini adalah ; (1). Pertambahan tinggi tanaman, diukur mulai dari permukaan tanah sampai titik tumbuh. (2). Jumlah daun, dihitung daun yang telah membuka sempurna, berwarna hijau atau masih merah. (3). Diameter batang, diukur pada ketinggian 1 cm di atas permukaan tanah. Peubah 1, 2, dan 3 diamati 1 bulan sekali dimulai sejak bibit berumur 1 bulan setelah inokulasi sampai umur 15 bulan. (4). Pengamatan perakaran dilakukan pengukuran panjang akar tampak yang dilakukan 1 bulan sekali dimulai sejak akar telah tampak pada bagian depan dan belakang wadah pembibitan sampai umur 15 bulan. Pada akhir penelitian, yaitu 15 Bulan Setelah Inokulasi (BSI) dilakukan pengamatan terhadap;

(5). Bobot kering tajuk, (6). Panjang akar primer, jumlah akar sekunder, dan jumlah akar tersier, (7). Anatomi akar bibit manggis Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi beberapa strain A. rhizogenes dilakukan dengan menggunakan metode Nakamura (1995). Tahap 1 dilakukan dengan pengambilan akar tanaman manggis dan dipotong sepanjang 5 mm. Tahap 2, akar difiksasi selama 24 jam dalam larutan FAA (5 ml formaldehid, 5 ml asam asetat glasial dan 90 ml ethanol 70%), kemudian dilanjutkan perlakuan Tahap 3–7, yaitu perlakuan dehidrasi dengan waktu perendaman untuk masing-masing tahap selama 1 jam. Potongan akar manggis direndam dalam larutan Tahap 3 ( 40 ml nButanol, 30 ml etanol pekat dan 30 ml akuades); Tahap 4 (55 ml nButanol, 25 ml etanol pekat dan 20 ml akuades); Tahap 5 (70 ml nButanol, 20 ml etanol pekat dan 10 ml akuades); Tahap 6 (85 ml nButanol dan 15 ml etanol pekat) dan ; Tahap 7 (100 ml n-Butanol). Tahap 7 diulang 2 kali setelah itu ditambahkan parafin cair ke dalam botol yang kemudian botol ditutup dan disimpan dalam suhu ruang selama 12 jam. Setelah

perlakuan

dehidrasi

selesai

dilanjutkan

dengan

perlakuan infiltrasi, yaitu dengan membuka tutup botol yang berisi spesimen akar manggis dan botol dimasukkan dalam oven parafin suhu 58oC selama 1 hari. Kemudian parafin cair yang terdapat dalam botol dituang dan diganti dengan parafin cair baru. Botol selanjutnya dimasukkan ke dalam oven parafin suhu 56 oC selama 3 hari. Perlakuan Embedding. Tempat blok dioleskan dengan gliserin pekat secara merata, kemudian parafin cair dituangkan ke dalam tempat blok dan spesimen berupa akar manggis diatur posisinya dimana posisi spesimen tidak sampai tenggelam harus berada di tengah parafin). Setelah diatur posisinya, permukaan spesimen ditiup agar sedikit mengeras. Tempat blok berisi parafin dan spesimen akar manggis diletakkan di telapak tangan dan dicelup ke dalam air, dibiarkan selama 3 menit, setelah itu permukaan disiram perlahan dengan air dan biarkan tenggelam dalam wadah berisi air.

Parafin dan spesimen akar manggis

dengan sendirinya akan lepas dari tempat blok kemudian diambil dan dikeringkan dengan tisu diberi label dan selanjutnya direndam selama 1

bulan dalam larutan Gifford (20 ml asam asetat glasial, 80 ml etanol 60% dan 5 ml gliserin). Membuat Sayatan. Sebelum disayat spesimen akar manggis terlebih dahulu ditempelkan pada holder, dengan cara ; holder bagian atasnya dilapisi dengan paraplast menggunakan spatula yang dipanaskan, kemudian spesimen akar manggis dengan cepat dilekatkan pada holder. Setelah itu spesimen dibentuk prisma dengan cara memanaskan spatula. Spesimen didiamkan selama 24 jam. Spesimen yang telah dilekatkan pada holder disayat dengan mikrotom putar setebal 10 µm. Sayatan direkatkan pada gelas obyek yang telah diolesi dengan albumin-gliserin (1 : 1) dan ditetesi air. Gelas obyek berisi pita parafin dipanaskan pada hot plate dengan suhu 45oC selama 3-5 jam. Perlakuan Pewarnaan. Dilakukan pewarnaan ganda safranin 2% dalam air dan fastgreen 0.5% dalam etanol 95%. Berturut turut gelas obyek direndam ke dalam larutan berikut : Xilol I (5 menit), xilol II (5 menit), etanol absolut (3 menit), etanol 95% (3 menit), etanol 70% (3 menit), etanol 50% (3 menit), etanol 30% (3 menit), akuades (3 menit), safranin 2% (3 hari), akuades (3 menit), etanol 30% (5 menit), etanol 50% (5 menit), etanol 70% (5 menit), etanol 95% (5 menit), fast green 0.5% (2 menit), Etanol I (5 menit) Etanol II (5 menit), xilol I (5 menit) dan xilol II (5 menit). Selanjutnya dilakukan penutupan, dimana bahan diberi media canada balsam dan ditutup dengan gelas penutup. Kemudian pada sisi kiri gelas obyek diberi label. Pengamatan dilakukan terhadap : rata-rata diameter pembuluh xilem (µm), jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang, luas serapan permukaan sayatan melintang ([rata-rata diameter xilem / 2]2 x

π

x jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang), total luasan 2 sayatan melintang (π r ), dan rasio (luas serapan permukaan sayatan melintang / total luasan sayatan melintang) (Leuschner & Hertel 2003) (Lampiran 1).

(8). Pengamatan rambut akar bibit manggis Pengamatan rambut akar dari akar sekunder bibit manggis dilakukan

berdasarkan

mikroskop

inverted

dan

pengamatan Scanning

mikroskopik Electron

menggunakan

Microscop

(SEM).

Pengamatan rambut akar secara mikroskopik, dilakukan dengan pengamatan langsung sampel akar dibawah mikroskop inverted. Pengamatan rambut akar dengan Scanning Electron Microscop (SEM) dilakukan dengan cara :

sampel berupa akar sekunder yang

berukuran 0.5 cm dicuci di dalam larutan bufer sodium cacodilat selama 2 jam pada suhu 4oC, kemudian akar dicuci ulang dengan larutan bufer sodium cacodilat pada alat getar ultrasonic sonycation selama 5 menit pada suhu kamar.

Selanjutnya sampel difiksasi dengan glutaral dehid

2.5% selama 2 jam pada suhu 4oC. Kemudian direndam dalam 2% tannic acid pada suhu 4oC selama 2 hari. Selanjutnya cuci dengan larutan bufer sodium cacodilat sebanyak 4 kali masing-masing tahap berlansung 15 menit suhu 4oC. Kemudian cuci dengan akuades pada suhu 4oC sebanyak 2 kali. Proses dehidrasi dilakukan dengan seri etanol, yaitu pertama-tama sampel direndam dalam alkohol 50 % selama 5 menit suhu 4oC sebanyak 4 kali, alkohol 75% selama 20 menit suhu 4oC, alkohol 80% selama 20 menit suhu 4oC, alkohol 94% selama 20 menit suhu ruang dan dalam etanol absolut 10 menit suhu ruang sebanyak 2 kali. Selanjutnya rendam sampel dalam t-Butanol selama 10 menit pada suhu ruang, freezer drying (-20oC) sampai t-Butanol hilang. Kemudian sampel akar diletakkan pada speciment holder untuk dilapisi dengan logam emas dan siap untuk diamati dengan SEM (Lampiran 2). (9). Uji konfirmasi T-DNA melalui teknik Polymerase Chain Reaction (PCR) Konfirmasi adanya integrasi T-DNA, yaitu daerah TL dan TRDNA dari A. rhizogenes terhadap sel tanaman manggis dilakukan dengan teknik Polymerase Chain Reaction (PCR).

Sebagai kontrol positif

digunakan DNA plasmid A. rhizogenes dan sebagai kontrol negatif digunakan DNA akar bibit manggis yang tidak diinokulasi, sedangkan DNA uji adalah DNA dari akar bibit manggis yang diinokulasikan dengan A. rhizogenes.

Isolasi DNA Plasmid A. rhizogenes. Isolasi DNA plasmid dilakukan dengan menggunakan modifikasi metode Sambrook et al. (1989) yang dimodifikasi. Strain A. rhizogenes dikulturkan pada media YMB dan LB cair, diletakkan pada mesin pengocok dengan kecepatan 100 rpm selama 24 jam. Kultur dituang ke dalam tabung Eppendorf 1,5 ml dan disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga membentuk pelet. Pelet yang terbentuk dilarutkan dengan bufer TELT (50 mM Tris-Cl pH 7.5, 82 mM EDTA, 2.5 M LiCl, 0.4% Triton X100), kemudian ditambah 50 µl lisozim 10 mg/ml lalu dihomogenkan dan diinkubasi pada 37oC selama 1 jam. Setelah itu ditempatkan pada air mendidih selama 1-2 menit dan dimasukkan ke dalam air es beberapa saat. Selanjutnya ditambahkan 50 µl SDS 10% dan dibolak-balik sampai terjadi lisis dan terlihat berlendir. Kemudian disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit pada suhu ruang. Supernatan yang terbentuk dipindahkan pada tabung baru dan ditambahkan 2-3 volume etanol absolut dingin.

Untuk memurnikan DNA ditambahkan 0.1 volume Na

asetat 3 M dan disimpan pada suhu -20 oC selama 30 menit. Selanjutnya campuran disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit sehingga membentuk pelet DNA. Pelet DNA dicuci dengan alkohol 70% lalu dikeringkan dengan vakum dan dilarutkan dengan akuabides steril, dan selanjutnya dapat digunakan untuk uji PCR. Isolasi DNA Akar Bibit Manggis. Isolasi dilakukan dengan menggunakan metode CTAB yang dimodifikasi (Castillo et al. 1994). Akar manggis sebanyak 0.5 g dimasukkan ke dalam mortar, lalu ditambahkan nitrogen cair dan PVPP, kemudian digerus sampai halus. Hasil gerusan dimasukkan ke dalam tabung Eppendorf yang telah berisi 1 ml bufer CTAB 2% dan 5 µl merkaptoetanol. Campuran diinkubasikan pada suhu 60oC selama 30 menit dan dibiarkan mencapai suhu ruang. Selanjutnya untuk memurnikan DNA ditambahkan 700 µl kloroform : isoamilalkohol (24:1) dan dikocok, disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.

Supernatan dipindahkan ke dalam tabung baru dan diekstraksi

kembali dengan penambahan 1 ml kloroform : isoamilalkohol (24 :1) dan dikocok, selanjutnya disentrifuse dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Supernatan dipindah ke tabung baru dan ditambahkan 1 ml

isopropanol dingin lalu dibolak-balik perlahan sampai homogen dan disimpan pada suhu 4oC selama 30 menit, selanjutnya disentrifus dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit. Cairan dibuang dan endapan dilarutkan dengan menambahkan 250 µl bufer TE lalu dihomogenkan, dan untuk menghilangkan RNA, ditambahkan 25 µl RNAse kemudian diinkubasi pada suhu 37oC selama 2 jam. Selanjutnya ditambahkan 25 µl natrium asetat 3 M pH 5,2 dan 500 µl etanol absolut dingin, dikocok hingga homogen. Selanjutnya disimpan dalam freezer selama 30 menit, kemudian disentrifus kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5 menit.

Endapan dicuci dengan etanol 70%, keringkan dan dilarutkan

dengan bufer TE pH 8. DNA siap digunakan untuk uji PCR. Analisis DNA dengan PCR. Hasil isolasi DNA plasmid A. rhizogenes dan DNA akar bibit manggis dianalisis dengan PCR menggunakan metode Aoki et al. (1997) yang dimodifikasi. Pereaksi PCR berupa bufer TrisHCl 1 mM + dNTP 0.2 mM mix yang telah berisi MgCl2 200

µM + primer TL 10 pmol + enzim Taq DNA Polymerase 1 unit.

Volume reaksi untuk PCR adalah 25 µl dengan penambahan 50 ng DNA dan H2O. Reaksi PCR dilakukan dengan menggunakan Thermolyne Amplitron I dengan kondisi denaturasi 94oC selama 1 menit, annealing 55oC selama 1 menit dan polimerasi 72oC selama 2 menit sampai 35 siklus reaksi. Hasil PCR difraksinasi melalui gel elektroforesis dengan konsentrasi

0.8%

agaros

dengan

penambahan

loading

dye

bromphenolblue sebagai pemberat. Elektroforesis dilakukan dengan arus 36 mA, 100 volt selama 60 menit. Sebagai marker digunakan DNA 1 kb lader. Hasil elektroforesis dilihat dengan menggunakan UV laminar dan didokumentasi dengan menggunakan kamera (Lampiran 3). Primer TL berupa rol B1 sekuen ( 5’ ATGGATCCCAAATTG CTATTCCCCCACG 3’) dan rol B2 sekuen ( 5’ TTAGGCTTCTTTCATTCG GGTTTACTGCAGC 3’ ) (Hamill et al. 1991).

(10). Serapan hara N, P, dan K daun bibit manggis Penetapan kandungan nitrogen dengan metode Semi-mikro Kjeldahl dan penetapan kandungan P dan K daun dengan metode pengabuan kering (Lampiran 4).

(11). Kandungan hormon IAA akar bibit manggis Pengukuran kandungan hormon akar bibit manggis dilakukan dengan metode (Ergűn et al. 2002), sebanyak 1 g akar segar bibit manggis yang telah dihaluskan, dimasukkan dalam 60 ml larutan ekstrak (MeOH: CHCl3: 2N NH4OH, 12:5:3 v/v/v). Larutan ekstrak tersebut dibuat satu hari sebelum dipergunakan dan disimpan pada 20oC. Campuran akar dan larutan ekstrak tersebut diaduk selama 1 jam kemudian disaring dengan kertas saring sampai didapatkan cairan yang bersih. Cairan tersebut ditambahkan 25 ml akuades diaduk dan biarkan sampai terbentuk dua fase, fase kloroform dibuang sedangkan fase air di atur pH-nya menjadi 2.5 kemudian diekstrak 3 kali dengan 15 ml etil asetat. Fase air dan etil asetat dipisahkan. Fase etil asetat selanjutnya dipergunakan untuk pengukuran IAA bebas sedangkan fase air di pH kembali sampai menjadi pH 11 yang selanjutnya diinkubasikan pada suhu

70oC selama 1 jam dan

dibiarkan mencapai suhu ruang.. Prosedur yang sama dilakukan untuk mengisolasi

IAA

dalam

bentuk

terikat.

Etil asetat

dievaporasi

menggunakan alat rote-evaporator system (Büchi Instruments). Thin-layer chromatography (TLC) dikerjakan menggunakan silika gel GF254 (Merck) sebanyak 30 g dilarutkan dalam 75 ml akuades kemudian dituangkan di atas glass plaque dan disimpan dalam inkubator selama 2.5 jam, kemudian 10 µl IAA bebas, terikat dan standar ditetes di dalam tabung

atas glass plaque tersebut selanjutnya diletakkan

kaca

yang

telah berisi

larutan

eluen

TLC

(i-

PrOH:NH4OH:H2O 10:1:1 v/v/v) selama 3 jam setelah itu dilarutkan dengan 2 ml

metanol kemudian disaring dan diukur dengan

spektrofotometer pada panjang gelombang 222 nm (Lampiran 5).

HASIL PENELITIAN

Percobaan A.

Seleksi Strain Agrobacterium rhizogenes Spesifik Penginduksi Perakaran Bibit Manggis (Garcinia mangostana L.)

Perkembangan akar bibit manggis diamati pada 24 minggu setelah inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes adalah panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan jumlah akar tersier.

Faktor berbagai strain A.

rhizogenes dan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap panjang akar primer dan jumlah akar sekunder bibit manggis umur 24 minggu setelah inokulasi (MSI) sedangkan interaksi antara berbagai strain A. rhizogenes dan metode inokulasi tidak berpengaruh nyata. Tabel 1 menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834, 07-20001, A4, 509, dan R1000 pada akar bibit manggis menghasilkan panjang akar primer dan jumlah akar sekunder yang nyata lebih besar dibandingkan dengan bibit yang tidak di inokulasi (kontrol). Bibit yang diinokulasi dengan metode akar dipotong menghasilkan panjang akar primer dan jumlah akar sekunder

yang tertinggi dibandingkan metode akar

ditusuk. Tabel 1. Panjang akar primer (cm) dan jumlah akar sekunder (buah) bibit manggis umur 24 MSI. Strain A.rhizogenes Kontrol 07-20001 R1000 A4 509 ATCC-15834 MAFF 01-1724 ATCC-8196 510 511 A4-J

Panjang akar primer (cm) 6.03 c 11.65 a 9.42 ab 9.87 ab 10.22 ab 10.32 ab 5.72 c 6.52 c 5.73 c 6.18 c 7.55 bc

Jumlah akar sekunder (buah) 7.17 bc 11.50 a 8.33 ab 10.50 a 12.33 a 13.17 a 2.50 d 4.50 bcd 2.17 d 3.17 cd 5.17 bcd

Metode inokulasi A. rhizogenes Akar ditusuk 6.51 b 4.82 b Akar dipotong 9.71 a 9.82 a Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05).

Faktor strain A. rhizogenes, metode inokulasi dan interaksi antara strain A. rhizogenes dengan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap jumlah akar tersier bibit tanaman manggis umur 24 MSI. Inokulasi strain A4, 07-20001, ATCC-15834, dan 509 menghasilkan jumlah akar tersier yang nyata lebih banyak pada metode inokulasi akar dipotong dibandingkan dengan metode akar ditusuk (Tabel 2). Performansi akar bibit manggis setelah diinokulasikan dengan berbagai strain A. rhizogenes dapat dilihat pada Gambar 8. Pertumbuhan akar primer lebih panjang, jumlah akar sekunder dan tersier lebih banyak setelah diinokulasikan dengan strain A4, 07-20001, ATCC-15834, dan 509. Selanjutnya bibit yang diinokulasi dengan berbagai

strain A.

rhizogenes juga dapat meningkatkan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Perkembangan akar bibit manggis yang lebih baik setelah diinokulasi dengan strain ATCC15834, 07-20001, A4 dan 509 pada metode akar dipotong ternyata menghasilkan pertambahan diameter batang yang nyata lebih tinggi dibanding kontrol (Tabel 2).

Tabel 2. Jumlah akar tersier (buah) dan diameter batang (mm) bibit manggis umur 24 MSI Strain A. rhizogenes

Jumlah akar tersier (buah) Metode inokulasi

Pertambahan diameter batang (mm) Metode inokulasi

Akar Akar Akar Akar ditusuk dipotong ditusuk dipotong Kontrol 11.00 cd 0.480 bcde 0.350 ef 9.33 cd 07-20001 2.00 cd 0.357 ef 0.600 ab 91.67 a R1000 6.00 cd 38.00 b 0.407 def 0.543 bcd A4 14.33 cd 93.00 a 0.383 ef 0.600 ab 509 18.33 c 76.33 a 0.433 def 0.577 abc ATCC-15834 6.00 cd 79.00 a 0.427 def 0.693 a MAFF 01-1724 4.67 cd 5.67 cd 0.343 ef 0.533 bcd ATCC-8196 1.67 cd 9.33 cd 0.343 ef 0.453 bcd 510 2.33 cd 1.33 d 0.347 ef 0.357 cdef 511 2.67 cd 0.360 ef 0.330 f 3.33 cd A4-J 4.00 cd 6.00 cd 0.327 f 0.367 ef Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05).

Kontrol

2.5 cm

ATCC15834

2.5 cm

07-20001

2.5 cm

2.5 cm

R1000

2.5 cm

MAFF 01-1724

2.5 cm

A4

2.5 cm

ATCC 8196

2.5 cm

510

2.5 cm

A4 J

511

2.5 cm

509

2.5 cm

Gambar 8. Performansi akar bibit manggis umur 24 minggu setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes

Faktor berbagai strain A. rhizogenes dan metode inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap pertambahan jumlah daun bibit tanaman manggis umur 24 MSI, sedangkan interaksi keduanya tidak berpengaruh nyata.

Bibit yang

diinokulasi dengan strain ATCC-15834, 07-20001 dan A4 menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih banyak dibandingkan dengan kontrol. Metode inokulasi akar dipotong menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih besar dibandingkan dengan akar ditusuk (Tabel 3). Performansi bibit manggis hasil inokulasi berbagai strain A. rhizogenes dengan metode akar dipotong umur 24 minggu setelah inokulasi dapat dilihat pada Gambar 9. Bibit manggis yang diinokulasi A. rhizogenes memperlihatkan performansi lebih baik dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi. Tabel 3. Pertambahan jumlah daun (helai) dan tinggi (cm) bibit manggis umur 24 MSI. Pertambahan tinggi strain Pertambahan jumlah daun A. rhizogenes (helai) (cm) Kontrol 5.67 dc 4.60 d 07-20001 8.67 ab 7.18 ab R1000 7.00 bcd 6.67 bc A4 8.00 abc 7.20 ab 509 7.33 bcd 7.42 ab ATCC-15834 9.67 a 8.17 a MAFF 01-1724 7.00 bcd 4.87 d ATCC-8196 5.67 dc 6.52 bc 510 5.67 dc 4.98 d 511 5.67 dc 4.57 d A4-J 5.33 dc 5.75 cd Metode inokulasi A. rhizogenes Akar ditusuk 6.12 b 5.66 b Akar dipotong 7. 64 a 6.68 a Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05).

Berdasarkan Tabel 3 juga terlihat bahwa faktor berbagai strain A. rhizogenes dan

metode

inokulasi berpengaruh sangat nyata terhadap

pertambahan tinggi bibit tanaman manggis umur 24 MSI, sedangkan interaksi keduanya

tidak

berpengaruh

nyata.

Metode

inokulasi

akar

dipotong

menghasilkan pertambahan tinggi bibit yang nyata lebih besar dibandingkan dengan metode akar ditusuk. Inokulasi strain ATCC-15834, 07-20001, A4 dan 509 menghasilkan pertambahan tinggi yang nyata lebih besar dibanding kontrol.

Kontrol

ATCC 15834

07-20001

509

R1000

Gambar 9.

A4

Performansi bibit manggis umur 24 minggu setelah dinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes dengan metode akar dipotong

Metode inokulasi strain A. rhizogenes pada akar bibit manggis juga berpengaruh terhadap persentase hidup bibit tanaman manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong menghasilkan persentase bibit manggis yang hidup lebih tinggi dibandingkan metode inokulasi dengan cara akar ditusuk setelah 6 bulan diinokulasi (Gambar 10).

Gambar 11 menunjukkan bahwa

inokulasi dengan A. rhizogenes strain ATCC 15834, 509, 07-20001, A4, dan kontrol memperlihatkan 100% bibit tanaman manggis dapat tumbuh dengan baik sampai umur 6 bulan setelah inokulasi. Jadi secara umum dapat dikatakan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4 dan 509

merupakan strain-strain A.

rhizogenes yang lebih efektif dalam menginokulasi akar bibit manggis pada metode akar dipotong dibandingkan inokulasi dengan strain ATCC-8196, MAFF 01-1724, 511, 510 dan R1000.

% Tanaman Hidup

100 90 80 Akar Dipotong

70

Akar Ditusuk

60 50 1

2

3

4

5

6

Umur (Bulan)

Gambar 10. Persentase tanaman yang hidup pada perlakuan metode inokulasi akar ditusuk dan dipotong umur 6 bulan setelah inokulasi

80 60

Akar dipotong

40

Akar ditusuk

A4-J

511

510

ATCC- 8196

MAFF 01-1724

ATCC-15834

509

A4

Kontrol

0

R1000

20 0720001

%Tanaman Hidup

100

Strain A. rhizogenes

Gambar 11.

Persentase tanaman hidup setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes umur 6 bulan setelah inokulasi

Berdasarkan hasil percobaan ini didapatkan A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4 dan 509 yang spesifik penginduksi perakaran bibit manggis dengan metode akar dipotong. Untuk meningkatkan keefektivan dari strain tersebut dilakukan percobaan B dengan jumlah tanaman yang lebih banyak dan pengamatan yang lebih teliti.

Percobaan B. Pengembangan Protokol Inokulasi A. rhizogenes yang Efektif untuk Menginduksi Perakaran Bibit Manggis Perkembangan Akar Bibit Manggis Inokulasi strain A. rhizogenes pada konsentrasi OD600 = 0.7 dan 1.0 pada berbagai umur bibit manggis berpengaruh terhadap perakaran manggis. Pada Tabel 4 terlihat bahwa umur bibit manggis saat diinokulasi nyata mempengaruhi panjang akar primer, jumlah akar lateral dan panjang akar tampak sedangkan konsentrasi strain A. rhizogenes dan interaksinya tidak berpengaruh nyata terhadap panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan panjang akar tampak bibit manggis umur 15 Bulan Setelah Inokulasi (BSI). Tabel 4. Panjang akar primer (cm), jumlah akar sekunder (buah) dan panjang akar tampak (cm) bibit manggis umur 15 BSI Perlakuan umur bibit manggis (minggu) 3

Panjang akar primer (cm) 11.53 b

Jumlah akar sekunder (buah) 13.66 c

6

13.72 a

22.64 a

11.57 a

9

15.01 a

17.39 b

3.63 b

Panjang akar tampak (cm) 3.42 b

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05).

Panjang akar primer terbesar dihasilkan bibit manggis yang diinokulasi pada umur 9 minggu (15.01 cm) dan tidak berbeda nyata dengan bibit yang diinokulasi umur 6 minggu (13.72 cm), sedangkan inokulasi pada umur 3 minggu menghasilkan panjang akar primer terkecil (11.53 cm).

Untuk jumlah akar

sekunder terbesar (22.64 buah) dan panjang akar tampak terbesar (11.57 cm) dihasilkan pada bibit yang diinokulasi umur 6 minggu. Berdasarkan Tabel 5 terlihat bahwa interaksi konsentrasi strain A. rhizogenes dengan umur bibit berpengaruh nyata terhadap jumlah akar tersier. Bibit manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC15834 pada umur 3 dan 6 minggu konsentrasi OD600=1.0 menghasilkan jumlah akar tersier yang terbesar. Inokulasi pada umur 9 minggu konsentrasi OD600=1.0 dengan strain 509 menghasilkan jumlah akar tersier yang terbesar. Sedangkan strain ATCC-15834

yang diinokulasikan pada bibit manggis umur 3 minggu konsentrasi OD600=0.7 menghasilkan jumlah akar tersier yang paling kecil. Tabel 5. Jumlah akar tersier (buah) bibit manggis umur 15 BSI Konsentrasi strain A. rhizogenes (OD600)

Jumlah akar tersier (buah) Umur bibit manggis saat inokulasi

Kontrol

3 minggu 12.67 cE

6 minggu 31.50 bG

9 minggu 51.33 aC

R1000 (0.7)

12.00 cE

60.33 aE

32.33 bF

R1000 (1.0)

19.33 cD

127.33 aC

53.33 bC

A4 (0.7)

35.50 aB

35.33 aF

35.33 aF

A4 (1.0)

11.67 cE

67.00 bD

76.00 aB

509 (0.7)

25.67 bC

20.67 cH

44.33 aD

509 (1.0)

27.00 bC

28.67 bG

93.33 aA

07-20001 (0.7)

37.00 bB

18.00 cH

41.00 aE

07-20001 (1.0)

36.33 bB

163.00 aB

34.00 bF

ATCC-15834 (0.7)

7.33 cF

69.00 aD

25.00 bG

ATCC-15834 (1.0)

103.33 bA

189.00 aA

21.67 cH

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, dan angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05)

Selanjutnya Tabel 6 menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834 dan 07-20001 konsentrasi OD600=1.0 pada bibit manggis umur 3 minggu menghasilkan jumlah akar kuarter terbesar, untuk bibit yang diinokulasi umur 9 minggu jumlah akar kuarter terbesar terdapat pada bibit yang diinokulasi dengan strain A4 konsentrasi OD600=1.0.

Dari berbagai umur inokulasi tersebut dan

konsentrasi A. rhizogenes yang digunakan, ternyata inokulasi bibit manggis dengan strain ATCC-15834 konsentrasi OD600=1.0 pada umur 6 minggu memperlihatkan perkembangan akar yang lebih besar dibandingkan dengan inokulasi

pada umur 3 dan 9 minggu.

Sementara hasil inokulasi strain A4

konsentrasi OD600=1.0 pada bibit manggis umur 3 minggu menghasilkan jumlah akar kuarter yang lebih kecil dibandingkan kontrol.

Tabel 6. Jumlah akar kuarter (buah) bibit manggis umur 15 BSI Konsentrasi strain A.rhizogenes (OD600) Kontrol

Jumlah akar kuarter (buah) Umur bibit manggis saat inokulasi 3 minggu 6 minggu 9 minggu 1.17 bB 4.00 aF 1.50 bB

R1000 (0.7)

2.33 cB

11.00 aD

5.00 bB

R1000 (1.0)

1.33 cB

27.00 aC

3.00 bB

A4 (0.7)

1.17 cB

9.00 aE

3.67 bB

A4 (1.0)

0.00 cB

5.33 bF

16.00 aA

509 (0.7)

3.33 aB

3.67 aF

3.67 aB

509 (1.0)

1.33 cB

7.67 aE

4.67 bB

07-20001 (0.7)

4.67 aB

5.67 aF

1.33 bB

07-20001 (1.0)

6.33 bA

33.00 aB

3.33 bB

ATCC-15834 (0.7)

0.67 cB

7.33 aE

5.00 bB

ATCC-15834 (1.0)

6.00 bA

40.33 aA

2.33 cB

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, dan angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05)

Anatomi Akar Bibit Manggis Berdasarkan hasil analisis di atas, didapat strain A.rhizogenes yang paling efektif menginfeksi akar bibit manggis adalah ATCC 15834 konsentrasi OD600=1.0 yang diinokulasikan pada bibit manggis umur 6 minggu. Untuk melihat lebih jauh keefektivan dari strain-strain A. rhizogenes konsentrasi OD600=1.0 yang diinokulasikan pada akar bibit manggis umur 6 minggu dalam peningkatan perakaran bibit manggis, maka dilakukan pengamatan anatomi akar bibit manggis. Dari hasil sayatan melintang akar bibit manggis terlihat bahwa akar manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem (7.167µm), luas serapan permukaan sayatan melintang (3266.9 µm2), dan total luasan pembuluh xilem (1344.97µm2) yang nyata lebih besar dibandingkan kontrol (Tabel 7). Sayatan melintang akar bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dengan strain A.rhizogenes dapat dilihat pada Gambar 12. Sayatan melintang akar bibit manggis yang diinokulasi dengan A.rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD600=1.0 pada umur 6

minggu memperlihatkan perkembangan xilem yang lebih baik dibandingkan dengan kontrol. Tabel 7. Anatomi akar bibit manggis umur 15 BSI

Kontrol

Rata-rata diameter pembuluh xilem (µm) 3.80 d

Luas serapan permukaan sayatan melintang (µm2) 301.9 d

R1000

5.02 c

675.9 c

511.82 c

A4

5.09 c

963.5 bc

833.15 b

509

3.53 d

304.3 d

495.07 c

07-20001

5.93 b

1159.4 b

577.76 c

ATCC-15834

7.17 a

3266.9 a

1344.97 a

strain A. rhizogenes

Total luasan pembuluh xilem (µm2) 445.88 c

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05)

Inokulasi A. rhizogenes ternyata mampu merangsang terbentuknya rambut akar yang berkembang lebih baik pada akar sekunder bibit manggis. Berdasarkan hasil pengamatan dengan mikroskop inverted, inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 umur 6 minggu pada konsentrasi OD600=1.0 memperlihatkan perkembangan rambut akar yang lebih baik

dibandingkan

inokulasi dengan strain 07-20001, 509, A4 dan R1000, pada akar bibit manggis yang tidak diinokulasi (kontrol) tidak ditemukan adanya pertumbuhan rambut akar. Rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dapat dilihat pada Gambar 13. Rambut akar tersebut sangat halus, dinding selnya tipis, dan transparan. Pengamatan rambut akar lebih lanjut dengan Scanning Electron Microscop (SEM) pada akar sekunder bibit manggis, juga memperlihatkan keadaan yang sama dimana pertumbuhan rambut akar dapat berkembang lebih baik setelah diinokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 umur 6 minggu pada konsentrasi OD600=1.0. Rambut akar tersebut sangat halus, ukuran panjang rambut akar 50 μm, dan berbentuk tabung memanjang (silinder). Hasil Scanning Electron Microscop rambut akar dari akar sekunder bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi dengan A. rhizogenes dapat dilihat pada Gambar 14. Rambut

akar yang muncul merupakan pemanjangan sel epidermis dalam bidang yang tegak lurus permukaan akar.

20 µm

20 µm A

A B C

C

D D

Kontrol 20 µm

B

R1000 20 µm

A

A

C

D

A4 20 µm

B 509

B

C

20 µm

A B

C

D A B

C

07-20001

D

ATCC 15834

D

Gambar 12. Sayatan melintang akar bibit manggis umur 15 bulan setelah diinokulasi dengan strain A.rhizogenes, dimana A= jaringan pembuluh, B= floem, C= xilem, dan D= endodermis.

R1000

Kontrol

A4

50µm

50µm

509

50µm

07-20001

ATCC 15834

50µm

50µm

Gambar 13. Rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi R1000

Kontrol

A4

C

D

50 µm 509

07-20001

50 µm

50 µm

ATCC- 15834

50 µm

50 µm

Gambar 14. Hasil Scanning Electron Microscop (SEM) rambut akar dari akar sekunder bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi

Pertumbuhan Tajuk Bibit Manggis

Bibit manggis yang diinokulasi oleh berbagai strain A. rhizogenes pada berbagai umur bibit manggis dan konsentrasi A. rhizogenes selain dapat meningkatan

perkembangan

akar

ternyata

juga

mampu

meningkatkan

pertumbuhan tajuk bibit manggis. Pertumbuhan tajuk yang diamati setelah 15 bulan setelah inokulasi adalah pertambahan tinggi, jumlah daun, diameter batang dan berat kering tajuk. Berdasarkan Tabel 8 terlihat bahwa pertambahan tinggi bibit manggis 15 bulan setelah inokulasi nyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis sedangkan interaksinya tidak berbeda nyata. Bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834, 07-20001, 509 dan R1000 pada konsentrasi OD600=1.0 menghasilkan pertambahan tinggi yang nyata lebih besar dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi (kontrol).

Bibit yang

diinokulasi saat umur 6 minggu menghasilkan pertambahan tinggi yang nyata lebih besar dibandingkan inokulasi pada saat bibit umur 3 dan 9 minggu. Pertambahan jumlah daun bibit manggis juga nyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis, sedangkan interaksinya tidak berbeda nyata. Dari Tabel 8 terlihat bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD600=1.0 pada bibit umur 6 minggu menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih besar dibandingkan tanaman kontrol. Inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis umur 6 minggu menghasilkan pertambahan jumlah daun yang nyata lebih besar dibanding inokulasi saat umur 3 dan 9 minggu.

Tabel 8. Pertambahan tinggi (cm) dan jumlah daun (helai) bibit manggis umur 15 BSI Konsentrasi strain A. rhizogenes (OD600) Kontrol

Pertambahan tinggi (cm)

Pertambahan jumlah daun (helai)

3.43 d

7.00 bcde

R1000 (0.7)

3.85 bcd

7.08 bcde

R1000 (1.0)

4.37 abc

7.50 abcd

A4 (0.7)

3.66 bcd

6.25 cde

A4 (1.0)

4.06 bc

8.08 abcd

509 (0.7)

3.57 bcd

6.33 cde

509 (1.0)

4.86 ab

9.00 abc

07-20001 (0.7)

3.71 bcd

6.50 bcde

07-20001 (1.0)

4.30 abc

8.25 abcd

ATCC-15834 (0.7)

3.81 bcd

6.67 bcde

ATCC-15834 (1.0)

5.62 a

9.50 a

Umur bibit manggis saat inokulasi 3 minggu

3.13 b

5.59 c

6 minggu

5.18 a

9.02 a

9 minggu

3.79 b

7.31 b


Selanjutnya pertambahan diameter batang nyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis. Tabel 9 menunjukkan bahwa

bibit manggis yang diinokulasi pada umur 6 minggu dengan strain

ATCC-15834 pada konsentrasi OD600=1.0 menghasilkan pertambahan diameter batang yang nyata lebih besar dibandingkan kontrol, untuk bibit yang diinokulasi pada umur 3 minggu strain 07-20001 pada konsentrasi OD600=0.7 menghasilkan pertambahan diameter batang yang lebih besar, sementara inokulasi A. rhizogenes strain 07-20001 dan A4 konsentrasi OD600=0.7 pada umur 9 minggu menghasilkan

pertambahan

diameter

batang

yang

nyata

dibandingkan dengan kontrol dan strain A. rhizogenes lainnya.

lebih

kecil

Tabel 9. Pertambahan diameter batang (mm) bibit manggis umur 15 BSI Konsentrasi strain A. rhizogenes (OD600) Kontrol

Pertambahan diameter batang (mm) Umur bibit manggis saat inokulasi 3 minggu 6 minggu 9 minggu 1.463 cB 1.750 bC 1.913 aA

R1000 (0.7)

1.700 bB

1.700 bC

2.163 aA

R1000 (1.0)

1.575 bB

2.413 aB

1.800 bA

A4 (0.7)

1.575 bB

1.888 aC

1.613 bB

A4 (1.0)

1.775 cB

2.113 bC

2.150 aA

509 (0.7)

1.665 aB

1.638 aC

1.875 aA

509 (1.0)

1.438 cB

1.988 bC

2.038 aA

07-20001 (0.7)

2.025 aA

1.963 aC

1.638 bB

07-20001 (1.0)

1.525 bB

2.325 aB

1.800 aA

ATCC-15834 (0.7)

1.800 bB

2.050 aC

1.825 bA

ATCC-15834 (1.0)

1.725 bB

2.713 aA

2.013 aA

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, atau angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05)

Berat kering tajuk bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi ternyata dipengaruhi oleh konsentrasi strain A. rhizogenes dan umur bibit manggis. Tabel 10 menunjukkan bahwa bibit yang diinokulasi strain ATCC15834 konsentrasi OD600=1.0 pada saat umur 6 minggu menghasilkan berat kering tajuk yang terbesar dibandingkan dengan kontrol. Inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis umur 3 minggu dengan strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD600=1.0

dan 0.7 menghasilkan berat kering tajuk

besar dan berbeda nyata dengan kontrol.

yang lebih

Sedangkan inokulasi A. rhizogenes

pada akar bibit manggis umur 9 minggu menghasilkan berat kering tajuk yang tidak berbeda nyata dengan bibit yang tidak diinokulasi (kontrol).

Tabel 10. Berat kering tajuk (g) bibit manggis umur 15 BSI Konsentrasi strain A. rhizogenes (OD600) Kontrol

Berat kering tajuk (g) Umur bibit manggis saat inokulasi 3 minggu 6 minggu 9 minggu 2.41 aD 2.64 aE 2.25 aA

R1000 (0.7)

2.04 cE

4.47 aB

2.90 bA

R1000 (1.0)

3.29 bC

5.12 aB

2.97 bA

A4 (0.7)

2.83 bC

2.55 cE

3.90 aA

A4 (1.0)

2.78 cC

4.86 aB

3.50 bA

509 (0.7)

3.38 aC

3.09 aD

3.60 aA

509 (1.0)

3.75 bB

4.59 aB

3.02 cA

07-20001 (0.7)

3.39 aC

1.79 bF

3.34 aA

07-20001 (1.0)

3.08 cC

5.43 aB

3.15 bA

ATCC-15834 (0.7)

4.22 aA

3.93 aC

4.10 aA

ATCC-15834 (1.0)

4.55 bA

6.54 aA

3.70 cA

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf kecil yang sama pada baris yang sama, atau angka yang diikuti huruf besar yang sama pada kolom yang sama menunjukkan tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05)

Performansi bibit manggis 15 bulan setelah inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes pada berbagai umur dan konsentrasi tertera pada Gambar 15. Bibit manggis yang diinokulasi A. rhizogenes umur 6 minggu pada konsentrasi OD600=1.0 memperlihatkan perkembangan akar dan pertumbuhan tajuk yang lebih baik dibandingkan inokulasi pada saat umur 3 dan 9 minggu. Inokulasi strain ATCC 15834 umur 6 minggu pada konsentrasi OD600=1.0 menghasilkan pertumbuhan bibit manggis yang lebih baik dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi (kontrol).

1). Bibit yang diinokulasi umur 3 minggu



Gambar 15. Performansi bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi (I) OD600 = 1.0 dan (II) OD600 = 0.7 dimana ; (A) kontrol, (B) 07-20001, (C) ATTC-15834, (D) R1000, (E) 509, dan (F) A4

Verifikasi Hasil Inokulasi A. rhizogenes

Selanjutnya untuk melihat lebih jauh peranan dari akar bibit manggis yang telah diinokulasi A. rhizogenes terhadap pertumbuhan bibit, maka dilakukan analisis hara daun dan analisis hormon IAA akar bibit manggis. Hasil analisis hara menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes mampu meningkatkan serapan hara bibit manggis. Inokulasi strain ATCC-15834 dan 07-20001 mampu menghasilkan serapan hara N dan P daun yang nyata lebih besar dibandingkan strain 509, A4, R1000 dan kontrol. Sedangkan serapan hara K terbesar dihasilkan bibit tanaman manggis yang diinokulasi strain ATCC-15834 (75.82 mg), dan tidak berbeda nyata dengan strain 07-20001, 509 dan kontrol (Tabel 11).

Tabel 11. Serapan hara daun (mg) bibit manggis umur 15 BSI strain A. rhizogenes

Serapan hara (mg) P 1.56 bc

Kontrol

N 31.48 b

K 61.88 ab

R1000

19.56 b

1.08 c

22.54 c

A4

17.36 b

1.57 bc

30.41 bc

509

22.61 b

1.82 bc

36.46 abc

07-20001

50.86 a

2.86 ab

56.37 ab

ATCC-15834

53.16 a

4.05 a

75.82 a

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom dan peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05).

Inokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes pada akar bibit manggis juga berpengaruh terhadap konsentrasi auksin endogen bibit tanaman manggis umur 15 bulan setelah inokulasi. Tabel 12 menunjukkan bahwa inokulasi strain ATCC-15834 pada akar bibit manggis menghasilkan konsentrasi hormon IAA dalam bentuk terikat dan total IAA yang nyata lebih tinggi dibandingkan bibit manggis yang tidak diinokulasi (kontrol). Sedangkan untuk konsentrasi hormon IAA yang berada dalam keadaan bebas tidak berbeda nyata antara bibit yang diinokulasi A. rhizogenes dengan bibit manggis yang tidak diinokulasi (kontrol).

Tabel 12. Konsentrasi hormon IAA (µg/ml) akar bibit manggis umur 15 BSI

Kontrol

IAA bebas 4.450 a

Konsentrasi hormon IAA (µg/ml) IAA terikat 14.214 c

Total IAA 18.664 c

R1000

3.316 a

12.367 d

17.197 c

A4

6.275 a

16.902 b

23.177 b

509

4.374 a

14.398 c

18.772 c

07-2001

5.828 a

12.639 d

18.467 c

ATCC-15834

6.464 a

23.892 a

30.356 a

strain A.rhizogenes

Keterangan : Angka yang diikuti oleh huruf yang sama pada kolom dan peubah yang sama tidak berbeda nyata pada taraf uji DMRT (α = 0.05).

Berdasarkan penjelasan di atas ternyata akar bibit manggis yang diinokulasi dengan A. rhizogenes pada konsentrasi OD600=1.0 saat umur 6 minggu menghasilkan perkembangan akar dan pertumbuhan tajuk yang nyata lebih baik dibandingkan kontrol. Untuk melihat lebih jauh keberhasilan inokulasi A. rhizogenes pada akar bibit manggis tersebut, maka dilakukan analisis molekuler yang bertujuan untuk mengetahui keberadaan gen (T-DNA) yang telah ditransfer ke dalam genom tanaman hasil inokulasi. Teknik yang umum digunakan adalah menggunakan metode PCR (Polymerase Chain Reaction) dengan sepasang primer spesifik untuk gen yang ditransfer. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR pada akar bibit manggis yang diinokulasi pada saat umur 6 minggu terlihat bahwa strain ATCC-15834 OD600=1.0 dapat mentransferkan T-DNAnya yang berasal dari plasmid Ri A. rhizogenes pada sel akar tanaman bibit manggis umur 15 bulan setelah inokulasi, yang ditunjukkan adanya pita DNA ukuran 780 bp tetapi tidak ditemukan pita DNA pada strain 07-20001, A4, 509, R1000 dan kontrol (Gambar 16).

M

1

2

3

4

5

6

7

8

9

bp

10.000 2000 1500 780 500 250

Gambar 16. Hasil PCR akar bibit manggis yang diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes (M) Marker 1 kb, (1-2) kontrol negatif, (3-4) kontrol positif, (5) R1000, (6) A4, (7) 509, (8) 07-20001 dan (9) ATCC-15834.

PEMBAHASAN Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa inokulasi strain A. rhizogenes tertentu mampu meningkatkan pertumbuhan bibit manggis baik perkembangan akar maupun pertumbuhan tajuk. Strain A. rhizogenes dan metode inokulasi sangat menentukan keberhasilan infeksi A. rhizogenes pada akar bibit manggis. Setelah 24 minggu perlakuan terlihat bahwa inokulasi strain ATCC-15834, 0720001, A4, 509, dan R1000 dengan metode akar dipotong lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis. Peningkatan panjang akar primer, jumlah akar sekunder, jumlah akar tersier, diameter batang dan tinggi yang dihasilkannya lebih besar dibanding kontrol. Inokulasi Agrobacterium dimulai dengan adanya pelukaan pada akar tanaman sasaran. Metode pelukaan diduga mempengaruhi keberhasilan dari inokulasi Agrobacterium, jika pelukaan yang dilakukan kurang tepat dapat menyebabkan kegagalan proses inokulasi Agrobacterium dan bahkan dapat mematikan tanaman sasaran. Dari penelitian ini diperoleh hasil bahwa metode inokulasi strain A. rhizogenes pada akar bibit manggis berpengaruh terhadap persentase hidup bibit tanaman manggis. Metode inokulasi dengan cara akar

ditusuk menghasilkan persentase bibit manggis yang hidup lebih rendah dibandingkan metode inokulasi dengan cara akar dipotong.

Diduga metode

inokulasi dengan cara akar ditusuk menyebabkan kerusakan pada jaringan pembuluh akar sehingga banyak akar bibit manggis yang mengalami pembusukan setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes. Akar bibit manggis yang diinokulasi dengan strain A. rhizogenes 0720001, ATCC-15834, A4, 509 dan R1000 menghasilkan persentase tanaman hidup lebih tinggi dibanding inokulasi dengan strain ATCC-8196, 510, 511, A4-J, dan MAFF 01-1724. Hal ini mengindikasikan strain A. rhizogenes ATCC-15834, 07-20001, A4, 509 dan R1000 lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis. Efektifitas masing-masing strain A. rhizogenes dalam menginfeksi bibit tanaman manggis dalam penelitian ini terlihat bervariasi. Keadaan ini disebabkan tidak semua strain A. rhizogenes dapat meningkatkan perakaran bibit tanaman manggis. Menurut Hiei et al. (1997) keberhasilan Agrobacterium dalam menginfeksi tanaman ditentukan oleh banyak faktor diantaranya adalah jenis dan perkembangan jaringan yang akan diinfeksi serta strain Agrobacterium yang digunakan. memperhatikan

Untuk optimalnya pemanfaatan A. rhizogenes maka harus strain

yang

digunakan,

sebab

kemampuan

inokulasi

Agrobacterium terhadap tanaman berbeda-beda dalam efektivitas transper TDNAnya. Hal ini berhubungan dengan virulensi strain Agrobacterium yang dipakai dan kerentanan spesies tanaman (Owen et al. 1988). Winan (1992) juga mengungkapkan bahwa keberhasilan proses inokulasi dan transfer T-DNA tergantung dari kompatibilitas antara spesies dan strain Agrobacterium yang dipakai. Kompatibilitas ini ditunjukkan dengan kemampuan Agrobacterium untuk menerima isyarat dari tanaman peka yang luka dan diikuti dengan terinduksinya faktor virulensi yang diperlukan dalam proses inokulasi. Strain A. rhizogenes sering juga diklasifikasikan berdasarkan opin yang dikandungnya seperti agropin, manopin atau cucumopin. Bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, A4-J, 509, 510, dan 511 merupakan bakteri dengan tipe agropin, sedang strain ATCC-8196 dan MAFF 01-1724 merupakan tipe manopin. Bakteri dengan tipe agropin mempunyai kedua DNA transfer yaitu left T-DNA (TL-DNA) dan right T-DNA (TR-DNA), sedangkan bakteri dengan tipe manopin hanya memiliki TL-DNA saja sehingga tidak memberikan sandi genetik untuk biosintesis auksin (van der Salm et al. 1996). Opin merupakan turunan

asam amino yang diproduksi oleh tanaman terinfeksi A. rhizogenes dan dipergunakan bakteri sebagai sumber karbon dan nitrogen. Peningkatan pertumbuhan tajuk maupun perakaran bibit manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834, A4, 07-20001, 509, dan R1000 diduga karena A. rhizogenes tersebut mampu menginfeksi akar bibit manggis sehingga dapat mentransfer T-DNA pada genom sel tanaman.

Tanaman yang telah

mengalami integrasi T-DNA dapat mengekspresikan enzim baru, mensintesis zat pengatur tumbuh auksin endogen. Zat pengatur tumbuh tersebut diperlukan tanaman untuk meningkatkan sintesis protein dan memacu pertumbuhan primodia akar sehingga meningkatkan pertumbuhan rambut akar.

Inokulasi A.

rhizogenes pada tanaman lain telah dilakukan juga oleh Strobel et al. (1988) yaitu inokulasi pada tanaman olive dengan strain 323, Lambert & Tepfer (1991) inokulasi strain A4 pada apel dan Bassil et al. (1991) pada Hazelnut (Corylus avellana

L.),

inokulasi

A.

rhizogenes

tersebut

mampu

meningkatkan

pertumbuhan akar dan produksi tanaman. Pada penelitian ini ditemukan juga cukup banyak bibit manggis hasil inokulasi yang mati . Hal ini diduga disebabkan waktu perendaman bibit manggis dalam suspensi bakteri A. rhizogenes selama 30 menit terlalu lama sehingga terjadi persaingan antara tanaman dan kecepatan bakteri yang tumbuh serta infeksi bakteri A. rhizogenes yang terlalu banyak menyebabkan sel/jaringan tanaman menjadi stres dan tidak bisa tumbuh.

Mihaljević et al. (1996) juga

melaporkan bahwa perendaman eksplan Pinus nigra dalam suspensi A. rhizogenes lebih lama dapat menyebabkan penurunan persentase tanaman yang berakar dan terjadinya pengeringan pada daerah perlukaan. Menurut Purnamaningsih (2006), tanaman dikotil sangat sensitif terhadap infeksi Agrobacterium sedangkan tanaman monokotil lebih sulit diinfeksi oleh Agrobacterium sehingga biasanya tanaman monokotil membutuhkan waktu perendaman yang lebih lama dalam suspensi bakteri. Di samping itu juga tidak diketahui berapa kepadatan atau konsentrasi dari strain-strain A. rhizogenes yang dipergunakan saat inokulasi dilakukan. Hal ini menunjukkan bahwa bakteri A. rhizogenes menghendaki kondisi yang spesifik (kepadatan tertentu) agar dapat lebih efektif menginokulasi akar bibit manggis. Berdasarkan hasil percobaan ini strain A. rhizogenes yang spesifik penginduksi perakaran bibit manggis, adalah strain ATCC 15834, 07-20001, 509,

A4 dan R1000 (A. tumefaciens) dengan metode akar dipotong. Untuk memastikan bahwa strain A. rhizogenes tersebut mampu menginokulasi akar bibit manggis, maka dilakukan percobaan B yaitu pengembangan protokol inokulasi A. rhizogenes yang efektif untuk menginduksi perakaran bibit manggis dengan jumlah tanaman contoh yang lebih banyak dan pengamatan yang lebih teliti. Inokulasi A. rhizogenes pada berbagai konsentrasi dan umur bibit manggis ternyata dapat meningkatkan perakaran dan pertumbuhan bibit manggis. Inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibanding kontrol. Dalam hal ini berarti bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 paling efektif menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan strain 07-20001, 509, A4 dan R1000 konsentrasi 1.0 dan 0.7.

Perbedaan keefektivan yang terjadi dari masing-masing strain tersebut

disebabkan adanya perbedaan kemampuan dalam menginfeksi akar bibit manggis, disamping itu diduga setiap strain A. rhizogenes yang digunakan dalam penelitian ini memiliki preferensi yang berbeda terhadap eksudat yang dikeluarkan oleh bibit tersebut. Menurut Tan (1997) eksudat yang dikeluarkan oleh tanaman seperti senyawa fenolik sangat mempengaruhi efektivitas dari bakteri Agrobacterium yang digunakan. Giri et al. (2001) juga menemukan adanya perbedaan efektivitas berbagai strain A. rhizogenes dalam menginduksi akar pada tanaman Artemisia annua. Inokulasi A. rhizogenes pada bibit manggis saat umur 6 minggu memperlihatkan pertumbuhan akar yang lebih baik dibandingkan dengan inokulasi pada saat umur 3 dan 9 minggu. Keadaan ini diduga karena tingkat sensitifitas jaringan yang berbeda dari ketiga umur bibit manggis tersebut, dimana bibit manggis umur 6 minggu sistem perakarannya lebih peka dibandingkan umur 3 dan 9 minggu. Menurut Him et al. (1987) bahwa umur jaringan tanaman sangat mempengaruhi keberhasilan inokulasi A. rhizogenes pada akar wortel. Hasil penelitian Jacobsen (2003) juga menunjukkan, bahwa keberhasilan inokulasi A. rhizogenes pada Pinus contorta sangat dipengaruhi oleh umur bibit saat inokulasi.

Kerapatan densitas (OD) bakteri yang digunakan untuk menginokulasi tanaman juga berpengaruh terhadap proses infeksi. Konsentrasi A. rhizogenes pada OD600=1.0 (setara dengan 109 sel/ml) lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan konsentrasi A. rhizogenes pada OD600=0.7 (setara dengan 106 sel/ml). Menurut Siswanto et al. (1997) bahwa kepadatan bakteri A. rhizogenes juga merupakan faktor yang tidak kalah penting dalam proses infeksi. Jumlah bakteri yang diperlukan dalam proses infeksi suatu sel tanaman harus tepat, artinya tidak kurang dan tidak berlebihan

jika kurang

jumlah bakterinya, maka proses infeksi tidak akan efektif dan juga sebaliknya jika jumlah terlalu banyak (berlebihan) maka terjadi pertumbuhan bakteri yang sangat tinggi sehingga pertumbuhan tanaman dapat terhambat atau mati akibat proses infeksi yang tidak efektif. Selanjutnya bibit manggis yang diinokulasi strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD600=1.0 menunjukkan total luasan pembuluh xilem dan luas serapan permukaan sayatan melintang akar bibit manggis yang lebih besar dibandingkan inokulasi dengan strain 07-20001, A4, 509, dan R1000.

Luas

serapan permukaan sayatan melintang (daya penghantar air) merupakan salah satu fungsi penting dari akar tanaman seperti uptake ion (penyerapan ion) yang berperan di dalam akar. Jaringan yang berperan menyerap air dan unsur hara adalah jaringan xilem, dimana luas serapan

permukaan sayatan melintang

sangat ditentukan oleh diameter xilem. Jika diameter xilem pada suatu tanaman rata-rata menunjukkan angka yang besar, maka daya penghantar air oleh xilem lebih cepat prosesnya dibandingkan xilem yang kecil. Xilem merupakan jaringan pengangkut air yang utama pada tumbuhan berpembuluh. Xilem juga terlibat dalam pengangkutan hara mineral, gudang makanan dan penguat struktur batang. Xilem dalam akar bersambung dengan xilem dalam batang (Harran & Tjondronegoro 1992). Strobel et al. (1987) juga menemukan bahwa tanaman olive yang telah ditransformasi A. rhizogenes strain 232 memiliki struktur anatomi akar yang berkembang lebih baik dibandingkan dengan tanaman olive yang tidak ditransformasi. Menurut Cox (1988) lambatnya pertumbuhan tanaman manggis antara lain disebabkan oleh buruknya sistem perakaran karena tidak mempunyai rambut akar pada setiap tahap pertumbuhannya, keadaan ini dapat dilihat pada akar yang tidak diinokulasi A. rhizogenes (kontrol) sedangkan pada akar bibit

manggis

yang

terintegrasi

A.

rhizogenes

strain

ATCC-15834

mampu

merangsang terbentuknya rambut akar pada akar sekunder bibit manggis yang lebih baik dibandingkan inokulasi strain 07-20001, 509, A4, dan R1000. Hal yang sama juga terlihat pada percobaan yang dilakukan Ermayanti et al. (2002) pada Artemisia annua dimana, akar hasil transformasi strain bakteri ATCC-15834 pertumbuhan rambut akar tidak merata pada akar utamanya, namun pada akar cabang pertumbuhan rambut akarnya lebih lebat dan merata dari ujung akarnya. Rambut akar merupakan pelebaran lateral dari sel-sel epidermis yang berbentuk tabung memanjang sehingga dapat menyerap hara mineral lebih banyak (Fahn 1995). Gilroy & Jones (2000) melaporkan bahwa hara mineral yang dapat diserap oleh rambut akar antara lain Ca2+, K+, NH4+, NO3-, Mn2+, Zn2+, Cl- dan H2PO4- yang diperlukan tanaman untuk pertumbuhan tanaman. Pertumbuhan dan perkembangan rambut akar ditentukan oleh keberadaan auksin

yang

terdapat dalam

tanaman

pembelahan sel (Waisel 2002).

yang

diperlukan

Rambut akar terbentuk

dalam proses karena adanya

pembelahan sel yang tidak seimbang pada sel epidermis muda mengawali pembentukan

rambut

akar

dan

sel

epidermis

biasa.

Pembelahan

ini

menghasilkan trikoblas (sel di sebelah atas lebih kecil) dan atrikoblas (sel di sebelah bawah yang lebih besar), trikoblas berkembang menjadi rambut akar (Salisbury & Ross 1995). Poerwanto et al. (1989) menemukan bahwa, akar satsuma mandarin (Citrus unshiu Marc. Cv. Okitsu Wase) yang memiliki rambut akar yang lebih panjang dan banyak ternyata juga menghasilkan total panjang akar dan berat kering akar yang nyata lebih besar. Hal ini juga terjadi pada bibit manggis setelah diinokulasi A. rhizogenes. Selain meningkatkan serapan air, ternyata luas serapan permukaan sayatan melintang akar yang semakin besar ini juga meningkatkan serapan hara N dan P daun bibit manggis. Di mana unsur hara tersebut memiliki peranan yang khusus, pada fase bibit dibutuhkan N lebih banyak untuk sintesis klorofil, asam amino, protein dan senyawa asam nukleat. Fosfor berfungsi sebagai penyusun metabolit dalam senyawa kompleks, sebagai aktivator, kofaktor atau penyusun enzim serat dan berperan dalam proses fisiologi (Soepardi 1983). Jika kekurangan unsur-unsur tersebut dapat menimbulkan gangguan metabolisme, termasuk perubahan-perubahan dalam aktivitas enzim, laju reaksi metabolik dan konsentrasi metabolit. Sedangkan serapan kalium tidak memperlihatkan

perbedaan antara tanaman yang diinokulasi dengan kontrol. Sebab unsur K merupakan unsur hara yang bersifat sangat mobil pada semua tingkat pertumbuhan, baik di sel dan jaringan, serta pada transpor jarak jauh melalui xilem dan floem (Marscher 1995). Kandungan hormon IAA pada akar manggis juga meningkat, hal ini terjadi karena terintegrasinya sebagian fragmen DNA yaitu T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel akar tanaman manggis. Pada T-DNA tersebut terdapat 2 daerah yaitu left T-DNA (TL-DNA) dan right T-DNA (TR-DNA). TRDNA

mengandung gen-gen iaaM dan iaaH yang berfungsi untuk biosintesis

auksin dan juga membawa gen-gen untuk menyandi sintesis senyawa opin (Giri & Narasu 2000). Sedangkan TL-DNA mengandung gen-gen rol (root loci) yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD (Slightom et al. 1986). Hasil pengujian White et al. (1985) menunjukkan bahwa protein produk dari berbagai gen rol berperan dalam meningkatkan sensitivitas sel tanaman terhadap auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorong tanaman inang untuk mensintesis auksin sehingga mengakibatkan terjadinya pembentukan akar. Proses pembentukan akar terjadi karena di dalam T-DNA terdapat gen penyandi protein yang berperan dalam proses biosintesis fitohormon yaitu auksin.

Hormon IAA adalah auksin endogen yang dihasilkan oleh tanaman

dapat ditransportasikan dan digunakan langsung oleh tanaman, akan tetapi apabila ketersediaannya berlebih maka IAA dapat diikat oleh senyawa-senyawa tertentu menjadi IAA asam aspartat, IAA-mioinositol dan IAA glukosa. Senyawasenyawa tersebut tidak aktif sebagai auksin kecuali bila dihidrolisis kembali menjadi IAA bebas (Wattimena 1988; Davies 2004). Berdasarkan hasil penelitian ini didapatkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 pada umur 6 minggu pada akar bibit manggis juga dapat meningkatkan perumbuhan tajuk bibit manggis, hal ini sejalan dengan perkembangan akar bibit manggis yang semakin baik ternyata juga mampu meningkatkan perkembangan diameter batang, tinggi, jumlah daun dan berat kering tajuk. Strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 yang diinokulasikan pada bibit umur 6 minggu memiliki potensi yang paling baik untuk memacu pertumbuhan bibit manggis. Keberhasilan inokulasi masing-masing strain A. rhizogenes dalam menginfeksi akar bibit manggis dapat diketahui dari terintegrasinya T-DNA ke

dalam sel akar tanaman manggis menggunakan polymerase chain reaction (PCR) dengan primer spesifik yaitu primer yang susunan nukleotidanya tertentu dan merupakan komplemen dari cetakan DNA yang akan dianalisis yaitu primer rolB1 dan rolB2. Hasil analisis molekuler dengan teknik PCR pada akar bibit manggis yang diinokulasi pada umur 6 minggu pada konsentrasi OD600=1.0 terlihat bahwa strain ATCC-15834 dapat menstransfer T-DNA dalam sel akar tanaman manggis, yang ditunjukkan adanya pita DNA ukuran 780 bp. tetapi tidak ditemukan pita DNA pada strain 07-20001, A4, 509, R1000 dan kontrol. Hal tersebut mengindikasikan terintegrasinya TL-DNA A. rhizogenes strain ATCC15834 pada akar bibit manggis. Churiyah (2005) juga menemukan adanya pita DNA ukuran 780 bp pada tanaman Cucurbitaceae yang berhasil diinokulasi dengan A. rhizogenes strain ATCC-15834. Menurut Ermayanti et al. (2002), deteksi adanya pita TL-DNA ini diperlukan untuk konfirmasi terjadinya transfer TDNA antara bakteri terhadap sel tanaman.

SIMPULAN Inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, dan 509 mampu meningkatkan pertumbuhan panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi tanaman, dan jumlah daun tanaman bibit manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan akar ditusuk. Bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 konsentrasi OD600 = 1.0 dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis umur 6 minggu. Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibandingkan bibit yang tidak diinokulasi. Serta menghasilkan serapan hara (N dan P) daun, dan kandungan total hormon IAA yang paling tinggi. Hasil verifikasi inokulasi A. rhizogenes dengan amplifikasi PCR menunjukkan bahwa strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada elektroforesis.

Induksi Akar Manggis (Garcinia mangostana L.) dengan Agrobacterium rhizogenes Secara In Vitro

Abstrak Perbanyakan bibit manggis dengan perkecambahan biji menghadapi berbagai kendala seperti biji hanya tersedia pada musim tertentu ketika musim berbuah (1-2 kali setahun) dan setiap buah hanya menghasilkan 1-2 biji yang berukuran besar dan layak untuk dijadikan benih. Perbanyakan manggis dengan cara in vitro diharapkan dapat menyediakan bibit manggis secara masal, seragam, dan sepanjang tahun. Kendala utama dalam perbanyakan tanaman manggis secara in vitro adalah dalam merangsang perakarannya. Tujuan penelitian adalah mempelajari pengaruh penggunaan media dasar (WPM dan MS) dan ZPT (BAP dan kinetin) terhadap kecepatan multiplikasi tunas manggis dalam kultur in vitro dan mendapatkan strain A. rhizogenes yang paling baik dalam menginduksi perakaran manggis secara in vitro dengan A. rhizogenes. Percobaan ini dilakukan dalam 2 tahap yaitu : multiplikasi tunas manggis dan induksi perakaran eksplan dengan A. rhizogenes . Rancangan yang digunakan untuk multiplikasi tunas adalah Rancangan Acak Lengkap yang terdiri dari empat perlakuan yaitu; M1 (WPM + 5 mg/l BAP), M2(MS+5 mg/l BAP), dan M3(WPM +10 mg/l Kinetin), untuk induksi akar dengan A. rhizogenes percobaan juga ditata dalam Rancangan Acak Lengkap dengan satu faktor, yaitu strain A. rhizogenes : G0= (WP + 5 mg/l IBA), G1(509), G2( ATCC-15834), G3(ATCC8196), G4(01-1724), G5 (A4), G6 (07-2001), dan G7(R-1000). Hasil penelitian menunjukkan bahwa : Penggunaan media WPM + 5 mg/l BAP menghasilkan persentase perkecambahan dan presentase pembentukan tunas majemuk yang lebih baik dibandingkan biji yang ditanam pada media MS + 5 mg/l BAP dan WPM + 10 mg/l Kinetin. Perlakuan inokulasi berbagai strain A. rhizogenes (509, 07-20001, ATCC-15834, R1000, A4 dan ATCC-8196) dapat menginduksi perakaran pada semua eksplan manggis tanpa biji, sedangkan pada eksplan manggis dengan biji akar hanya muncul pada strain 509, 07-20001, ATCC15834. Eskplan manggis dengan biji yang berhasil berakar setelah inokulasi A. rhizogenes berhasil tumbuh pada tahap aklimatisasi, sedangkan eksplan manggis tanpa biji tidak ada yang berhasil tumbuh setelah 2 minggu aklimatisasi. Inokulasi A. rhizogenes strain 509 pada kultur in vitro menghasilkan anatomi akar (rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan dan total luasan sayatan melintang) yang lebih besar dibandingkan kontrol.

Kata Kunci : Aklimatisasi, anatomi, A. rhizogenes, eksplan, multiplikasi

In Vitro Root Induction in Mangosteen (Garcinia mangostana L.) Using Agrobacterium rhizogenes

Abstract

Mangoteen propagation using seed germination faces some obstacle such as seeds availability where which only available during harvesting season (one or twice a year) with 1-2 seeds only for each fruits that can be used for propagation. In vitro mangosteen propagation, therefore is expected to be able provide uniform propagules in a huge amount all along the year. Root induction, however, is a major problems of mangosteen in vitro propagation. This research is focused on shoot multiplication prior to finding the best strain of Agrobacterium rhizogenes for mangoteen in vitro root induction. Randomized Complete Design was applied to shoot multiplication set of experiment, consisted of M1(WPM + 5 mg/L BAP); M2(MS + 5 mg/L BAP) and M3(WPM + 10 mg/L Kinetin). The design was also applied to root induction experiment consisted of a single factor only, A. rhizogenes with : G0= (WP + 5 mg/l IBA), G1(509), G2( ATCC-15834), G3(ATCC8196), G4(01-1724), G5 (A4), G6 (07-2001), dan G7(R-1000). The result showed that M1 medium produced more germinated seed and higher number of multiple shoot than other media. While root induction experiment showed that all strains used induced root formation of cotyledonless explants. When complet seedling was subjected to the strains, strain 509, 07-20001, ATCC-15834 induced root formation. Explant with cotyledon that were root formation were induced were able to survive at acclimation stage, but none for cotyledoneless explants. Anatomy observation showed that 509 resulted in higher xylem diameter, total number of xylem, conductivity, and higher ration of conductivity/total root trasversal area in comparation to other control.

Key words : Acclimation, anatomy, A. rhizogenes, explant, multiplication

PENDAHULUAN Ketersediaan bibit yang bermutu dalam jumlah banyak, cepat, dan seragam merupakan langkah awal untuk menunjang pengembangan tanaman manggis. Ketersediaan bibit tersebut ditempuh melalui cara mikropropagasi secara in vitro. Kultur tanaman secara in vitro sudah sangat berkembang dan digunakan dalam berbagai penelitian mutakhir maupun secara komersial. Triatminingsih et al. (2001) melaporkan bahwa pembibitan manggis secara kultur in vitro dari satu eksplan (yang berasal dari eksplan biji) setelah disubkulturkan dapat menghasilkan 30 tunas dalam waktu enam bulan. Planletplanlet yang dihasilkan belum merupakan planlet intak (planlet sempurna) karena belum mempunyai akar. Kendala utama dalam perbanyakan tanaman manggis secara in vitro adalah dalam merangsang perakarannya. Pengakaran tunas perlu diupayakan untuk menghasilkan bibit dengan sistem perakaran yang baik. Sehingga pertumbuhan planlet manggis dapat dipacu untuk tumbuh lebih cepat. Hasil penelitian perakaran manggis telah dilaporkan oleh Goh et al. (1990),

yaitu

dengan

penambahan

IBA

20

mg/l,

penambahan

NAA

menghasilkan persentase eksplan yang berakar lebih rendah daripada penambahan IBA.

Hasil penelitian Pertamawati (1997) menunjukkan bahwa

media MS + 2iP 15 ppm + IBA 0.5 ppm memberikan persentase tertinggi bagi eksplan yang berakar, sedangkan Roostika et al. (2005) menyatakan bahwa persentase tertinggi diperoleh dari perlakuan ¼ MS + IBA 5 mg/l. Hasil yang diperoleh

dari

berbagai

percobaan

tersebut

memperlihatkan

bahwa

pertumbuhan planlet manggis dapat dipacu untuk tumbuh lebih cepat, tetapi percepatan pertumbuhan yang terjadi tidak terlalu besar, sehingga planlet dianggap masih tetap tumbuh lambat. Oleh karena itu perlu dicari upaya lain yang mampu mempercepat pertumbuhan planlet manggis secara signifikan. Penggunaan bakteri Agrobacterium rhizogenes untuk mengatasi masalah pengakaran pada tanaman buah-buahan dan tanaman tahunan berkayu telah banyak percobaan yang dilakukan. Bakteri A. rhizogenes dapat menginduksi pembentukan akar pada tanaman yang terinfeksi.

Akar yang

terbentuk dapat tumbuh dengan cepat dan biasanya tidak memerlukan hormon pertumbuhan eksogen. Pada kultur in vitro, A. rhizogenes strain A4 dan 232 berhasil menginduksi perakaran eksplan tunas apel ’Golden delicious’ (Patena et

al. 1988). Strain A4 juga dapat menginduksi akar pine (Pinus) dan Larch (Larix) spp (McAfee et al. 1993). Infeksi A. rhizogenes strain 1855, dengan dan tanpa penambahan hormon pada kultur in vitro almond, apel, plum, pyrus pyraster dan dua hibrid rootstocks, Citation (plum X peach) dan GF677 (almond X peach) menghasilkan tiga respon, yaitu : genotif yang berakar tanpa auksin, genotif yang berakar hanya dengan auksin dan genotif yang berakar setelah diinfeksikan A. rhizogenes (Damiano & Monticelli. 1998). Induksi akar dengan A. rhizogenes strain LBA9402 ternyata lebih efektif dalam meningkatkan persen akar dan jumlah akar pada eksplan radiate pine (Pinus radiata) dibandingkan strain A4T (Li & Leung 2003). Sampai sejauh ini pemanfaatan bakteri A. rhizogenes

untuk

menginduksi akar eksplan manggis belum pernah dilaporkan. Oleh karena itu perlu diteliti lebih lanjut peranan bakteri A. rhizogenes

dalam menginduksi

perakaran eksplan manggis. Tujuan penelitian ini adalah mempelajari pengaruh penggunaan media dasar (WPM dan MS) dan ZPT (BAP dan kinetin) terhadap kecepatan multiplikasi tunas manggis dalam kultur in vitro dan mendapatkan strain A. rhizogenes

yang paling efektif menginduksi perakaran eksplan

manggis.

Bahan dan Metode

Penelitian dilaksanakan dari Maret 2006 – Maret 2007, kegiatan penelitian dilakukan di laboratorium kultur jaringan dan rumah kaca Pusat Kajian Buah-Buahan Tropika LPPM-IPB, Bogor.

Percobaan A. Multiplikasi tunas tanaman manggis melalui kultur in vitro Percobaan ini bertujuan untuk mempelajari pengaruh penggunaan media dasar (WPM dan MS) dan ZPT (BAP dan kinetin) terhadap kecepatan multiplikasi tunas manggis dalam kultur in vitro.

a). Rancangan percobaan dan pengamatan Percobaan ditata dalam Rancangan Acak Lengkap yang terdiri atas empat perlakuan yaitu :

M1

= WPM + 5 mg/l BAP

M2

= MS

M3

= WPM + 10 mg/l Kinetin

+ 5 mg/l BAP

Terdapat 3 kombinasi perlakuan dengan 20 kali ulangan. Setiap satuan unit percobaan terdiri atas 5 botol kultur. Kultur dipelihara dalam ruang kultur yang bertemperatur 26oC dengan intensitas cahaya sekitar 1000 lux selama 16 jam. b). Bahan dan Alat Bahan utama yang digunakan dalam penelitian berupa biji manggis asal Purwakarta yang berpenampilan baik, tidak cacat atau terbelah-belah serta mempunyai berat minimum 1,2 g. penelitian berupa

zat pengatur

Bahan kimia yang digunakan dalam tumbuh BAP,

media WPM (Lioyd &

McCown1981) dan MS (Murashige & Skoog 1962), agar (Oxoid) sebagai pemadat, desinfektan (benlate, alkohol 70%, sodium hypoklorid dan aquades steril), cefotaxime dan media YMB (Yeast Monithol Broath) dan LB (Luria Broth). c). Pembuatan media kultur Media untuk inisiasi dan multiplikasi tunas pucuk yang dipergunakan adalah media dasar WPM dan MS yang mengandung 5 mg/l BAP dan 10 mg/l kinetin. Media dipadatkan dengan penambahan 7 g/l agar (Oxoid). Media diatur pH-nya menjadi sekitar 5,8 kemudian disterilkan dengan menggunakan otoklaf selama 15–20 menit dengan suhu 120oC menggunakan tekanan 1 atmosfer. d). Sterilisasai eksplan Buah manggis dikupas, bijinya dibersihkan dari selaput berserat tempat menempelnya daging buah, kulit aril dan serat-seratnya dibuang kemudian biji dicuci bersih dengan air kran mengalir, selanjutnya biji dicuci dengan deterjen selama 5 menit, dibilas dengan air steril dan direndam dalam larutan benlate selama 30 menit. Biji kemudian dibilas dengan air steril dan direndam dalam larutan alkohol 70% dan dibilas dengan air steril. Setelah itu biji direndam dalam larutan sodium hypoklorit 10%, 20%, dan 30% masing-masing selama 20, 15 dan 10 menit lalu dibilas dengan air steril.

Biji yang telah steril ini dibelah

menjadi empat bagian dan siap ditanam dalam media perlakuan.

f). Pengamatan Peubah yang diamati meliputi saat munculnya tunas, jumlah tunas yang tumbuh dan persentase yang bertunas. Pengamatan dalam percobaan ini dilakukan tanpa mengeluarkan eksplan dari botol kultur.

Tunas-tunas yang

tumbuh tersebut digunakan untuk percobaan induksi perakaran eksplan tunas manggis secara in vitro.

Percobaan B. Induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan Agrobacterium rhizogenes melalui kultur in vitro Percobaan ini bertujuan untuk mendapatkan strain A. rhizogenes yang dapat menginduksi perakaran eksplan tunas manggis secara in vitro.

a). Rancangan percobaan Percobaan ditata dalam Rancangan Acak Lengkap (RAL) perlakuan berupa transformasi beberapa strain A. rhizogenes pada ekspan manggis, yaitu : G0 = Kontrol (WPM + 5 mg/l IBA) G1 = 509 G2 = ATCC-15834 G3 = ATCC-8196 G4 = 01-1724 G5 = A4 G6 = 07-2001 G7 = R-1000 Setiap perlakuan diulang 10 kali, masing-masing botol kultur terdiri atas 3 eksplan dan setiap satuan percobaan terdiri atas 3 botol kultur. Kultur dipelihara dalam ruang kultur yang bertemperatur 26oC dengan intensitas cahaya sekitar 1000 lux selama 16 jam. b). Pemilihan tunas manggis Tunas manggis dari media multiplikasi in vitro, dipilih yang berukuran tinggi

≥ 2,5 cm, berdaun sepasang dan bobot basah sekitar 1 g, dipotong

bagian pangkalnya kemudian siap diinokulasi dengan A. rhizogenes.

c). Inokulasi Bakteri A. rhizogenes terhadap Tunas Manggis Tunas manggis yang terpilih diinokulasikan dengan bakteri A. rhizogenes menurut metode (Damiano et al. 1995) yang dimodifikasi Charity (2002). Eksplan manggis tanpa biji diinokulasi dengan cara, bagian dasar batang manggis dicelupkan dalam 0.5 ml suspensi bakteri A. rhizogenes ((OD600 = 1.0) yang ditumbuhkan seperti Penelitian I, kemudian di vakum selama 15 menit. Untuk tunas manggis dengan biji inokulasi dilakukan dengan cara pangkal batang ditusuk menggunakan jarum steril yang sudah dicelupkan dalam suspensi bakteri A. rhizogenes. Setelah itu tunas dikeringkan dengan kertas saring dan dikulturkan dalam medium WPM disimpan selama 2 hari di ruang gelap, kemudian dicuci dengan akuades steril 5 kali, dikeringkan dengan kertas saring, direndam dalam 250 mg/l cefotaxime selama 10 menit dan dikulturkan pada media WPM

yang mengandung 500 mg/l cefotaxime.

Konsentrasi

cefotaxime diturunkan secara bertahap menjadi 250 dan 100 mg/l pada masingmasing subkultur sampai tidak terjadi kontaminasi. d). Pembuatan media aklimatisasi Media aklimatisasi berupa campuran pasir dan tanah steril dengan perbandingan 1 : 1, yang dimasukkan ke dalam pot berukuran diameter 10 cm dan tinggi 10 cm. e). Penanaman dan pemeliharaan planlet pada media aklimatisasi Planlet dipindahkan dari media perakaran ke dalam pot yang sudah disiapkan, kemudian ditempatkan pada tempat teduh dan diberi sungkup plastik yang telah diberi lubang.

Planlet dipelihara dengan melakukan penyiraman

menggunakan hara steril. Masa aklimatisasi berlangsung selama 3 bulan. f). Pengamatan Peubah-peubah yang diamati pada induksi akar secara in vitro adalah ; (1) mulai muncul akar, (2) persentase tanaman yang berakar, dan (3) jumlah akar, yang diamati 1 minggu sekali sampai umur 12 minggu untuk eksplan tanpa biji dan 7 minggu untuk eksplan dengan biji.

Pengamatan dilakukan tanpa

mengeluarkan eksplan dari botol kultur. Pada akhir pengamatan dilakukan pengamatan terhadap : (1) tinggi eksplan, (2) diameter batang, (3) panjang akar,

dan (4) jumlah daun, dihitung daun yang telah membuka sempurna, berwarna hijau atau masih merah. Peubah Peubah yang diamati pada saat aklimatisasi adalah : (1) persentase planlet yang mampu tumbuh, (2) pertambahan tinggi, (3) diameter batang, (4) jumlah daun tanaman yang diamati setiap 1 minggu. Pada akhir penelitian dilakukan pengamatan : (1) panjang akar primer, (2) jumlah akar sekunder, dan (3) jumlah tersier.

HASIL PENELITIAN Percobaan A. Multiplikasi tunas tanaman manggis melalui kultur in vitro Proses perkecambahan benih manggis mulai terlihat satu minggu setelah perlakuan (1 MSP), yaitu ditandai dengan munculnya tonjolan kecil berwarna merah pada bagian ujung benih dan sebuah akar yang berumur pendek muncul dari ujung yang lainnya. Sebanyak 408 eksplan yang ditanam, hingga 8 MSP terdapat 16.18% eksplan yang tidak berkecambah sehingga pada akhir pengamatan eksplan yang asenik dan mampu berkecambah sebesar 83.82%. Biji yang diinduksi dengan WPM + 5 mg/l BAP mempunyai persentase perkecambahan yang relatif lebih baik dibandingkan biji yang diinduksi MS + 5 mg/l BAP dan WPM + 10 mg/l Kinetin. Sampai dengan 6 MSP persentase perkecambahan biji yang diinduksi WPM + 5 mg/l BAP, MS + 5 mg/l BAP dan WPM + 10 mg/l Kinetin mencapai 86.76%, 83.09% dan 81.62% (Tabel 13). Tabel 13. Persentase bertunas dan pembentukan tunas majemuk dari 1 MSP sampai 8 MSP

Waktu MSP

1 2 3 4 5 6

WPM (10 mg/l Kinetin)

Komposisi Media WPM (5 mg/l BAP)

MS (5 mg/l BAP)

% Bertunas

% Tunas majemuk

% Bertunas

% Tunas majemuk

% Bertunas

% Tunas majemuk

29.41 34.56 68.38 72.79 80.15 81.62

0 3.68 6.62 15.44 16.91 18.38

31.62 53.68 84.56 84.56 86.03 86.76

0 8.09 14.71 19.85 26.47 27.21

25.74 36.76 69.85 74.26 81.62 83.09

0 6.62 12.50 16.91 22.06 24.26

Persentase perkecambahan yang tinggi ini juga diikuti oleh daya multiplikasinya dalam membentuk tunas majemuk dimana pemberian WPM + 5 mg/l BAP,

MS + 5 mg/l BAP dan

WPM + 10 mg/l Kinetin menghasilkan

pembentukan tunas majemuk secara berturut-turut 27.21%, 24.26% dan 18.38% (Tabel 13, Gambar 17 dan 18).

A

C

B

Gambar 17.

Induksi tunas manggis secara kultur in vitro menggunakan media (A) WPM + 10 mg/l Kinetin, (B) WPM + 5 mg/l BAP, dan (C) MS + 5 mg/l BAP umur 8 MSP.

Berdasarkan hal tersebut maka penggunaan media WPM + 5 mg/l BAP sangat membantu proses perkecambahan dan merangsang pembentukan tunas majemuk relatif lebih baik bila dibandingkan dengan media MS + 5 mg/l BAP dan media WPM + 10 mg/l Kinetin. Berdasarkan hasil pengamatan, diperoleh bahwa perlakuan WPM + 5 mg/l BAP dapat menginduksi pembentukan tunas lebih banyak dari seluruh eksplan yang ditanam yaitu 15 tunas, disusul MS + 5 mg/l

BAP

sebanyak

13

tunas

hanya

saja

tunas

yang

terbentuk

perkembangannya sangat lambat, dan terakhir WPM 10 mg/l Kinetin sebanyak 3 tunas (Gambar 18).

A

B

C

Gambar 18. Tunas terbanyak yang berhasil diinduksi secara kultur in vitro menggunakan media (A) WPM + 10 mg/l Kinetin (3 tunas), (B) WPM + 5 mg/l BAP (15 tunas), dan (C) MS + 5 mg/l BAP (13 tunas) umur 8 MSP.

Percobaan B. Induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan Agrobacterium rhizogenes melalui kultur in vitro Eksplan manggis dengan biji Berdasarkan Tabel 14 terlihat bahwa pada eksplan manggis dengan biji, akar adventif mulai terbentuk ditempat infeksi pada umur 4 minggu setelah inokulasi. Eksplan yang diinokulasi dengan strain ATCC 15834 muncul akar pada minggu ke-4 (2 eksplan), minggu ke-5 (1 eksplan) dan minggu ke-6 (1 eksplan), 509 muncul akar minggu ke-4 (2 eksplan) dan minggu ke-6 (2 eksplan), 07-20001 muncul akar minggu ke-4 (1 eksplan) dan minggu ke-6 (2 eksplan), sedangkan eksplan yang diinokulasi dengan strain R1000, A4, ATCC 8196 dan induksi dengan hormon IBA (kontrol) sampai minggu ke-7 belum ada akar yang muncul. Tabel 14. Pengaruh inokulasi beberapa strain A. rhizogenes terhadap kecepatan terbentuknya akar eksplan pucuk manggis dengan biji Strain A. rhizogenes Kontrol

4 0

5 0

6 0

7 0

% Eksplan berakar 0.00

ATCC-15834

2

1

1

0

26.67

1.28 a

509

2

0

2

0

26.67

1.87 a

R1000

0

0

0

0

0.00

0.00 b

07-20001

1

0

2

0

20.00

1.55 a

A4

0

0

0

0

0.00

0.00 b

ATCC 8196

0

0

0

0

0.00

0.00 b

Jumlah kultur berakar minggu ke-

Rata-rata panjang akar (cm) 0.00 b

Sebanyak 105 eksplan tunas yang diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes, hingga minggu ke-7 setelah inokulasi baru terdapat 10.48% eksplan yang berhasil membentuk akar. Inokulasi A. rhizogenes strain 509 dan ATCC-15834

menghasilkan persentase pembentukan akar yang tertinggi,

kemudian diikuti oleh eksplan yang diinokulasi dengan strain 07-20001. Inokulasi strain 509, ATCC-15834 dan 07-20001 menghasilkan panjang akar yang tidak berbeda nyata, namun ada kecendrungan inokulasi dengan strain 509 menghasilkan rata-rata panjang akar yang terbesar. Performansi akar

planlet manggis umur 6 minggu setelah inokulasi dapat dilihat pada Gambar 19. Akar adventif muncul dibagian batang yang diinokulasi dengan A. rhizogenes sedangkan pada kontrol tidak muncul akar. Inokulasi dengan strain 509 menghasilkan akar yang lebih panjang dibandingkan dengan strain ATCC-15834 dan 07-20001.

Akar adventif

Kontrol

509

Akar adventif

Akar adventif

ATCC 15834

07-20001

Gambar 19. Performansi akar planlet manggis umur 6 minggu setelah inokulasi Minggu ke-7 setelah inokulasi, eksplan yang berhasil berakar setelah diinokulasi A. rhizogenes di aklimatisasi, dan 75 % berhasil tumbuh dengan baik sampai umur 3 bulan setelah diaklimatisasi. Berdasarkan Tabel 15 terlihat bahwa

pertumbuhan

bibit

yang

diinokulasi

A.

rhizogenes

strain

509

menghasilkan penambahan diameter batang terbesar dan penambahan jumlah daun terbesar dihasilkan strain 07-20001 sedangkan untuk penambahan tinggi tanaman tidak berbeda nyata antara bibit hasil inokulasi A. rhizogenes dengan kontrol. Performansi bibit yang tumbuh pada media aklimatisasi, umur 3 bulan setelah tanam dapat dilihat pada Gambar 20. Bibit hasil inokulasi dengan A.

rhizogenes menghasilkan pertumbuhan yang lebih baik dibandingkan dengan bibit yang tidak diinokulasi (kontrol). Tabel 15. Penambahan diameter batang (mm), tinggi (cm) dan jumlah daun (helai) tanaman manggis setelah diaklimatisasi, umur 3 bulan setelah tanam Strain Penambahan Penambahan Penambahan A rhizogenes diameter batang tinggi tanaman jumlah daun (mm) (cm) (helai) Kontrol 0.28 b 2.50 a 2.67 b 509

1.94 a

2.50 a

2.67 b

07-20001

0.29 b

2.50 a

4.00 a

ATCC-15834

0.20 b

2.23 a

3.33 b


Kontrol

509

07-20001

ATCC 15834

Gambar 20. Performansi bibit yang tumbuh pada media aklimatisasi, umur 3 bulan setelah tanam

Umur 3 bulan setelah tanam pada media aklimatisasi dilakukan pembongkaran bibit tanaman manggis. Performansi bibit manggis umur 3 bulan setelah aklimatisasi dapat dilihat pada Gambar 21. Akar yang muncul dari hasil inokulasi dengan A. rhizogenes setelah 3 bulan diaklimatisasi dapat tumbuh dan berkembang dengan baik yang ditandai dengan terbentuknya akar sekunder dan tersier yang lebih banyak, sedangkan pada tanaman kontrol muncul akar pada bagian biji dari bibit manggis tersebut namun

belum terbentuk akar tersier

setelah 3 bulan diaklimatisasi. Tabel 16 menunjukkan bahwa tidak terdapat perbedaan yang nyata terhadap panjang akar primer antara bibit hasil inokulasi A. rhizogenes dengan kontrol. Keadaan yang sama juga terjadi pada jumlah akar sekunder dimana tidak terdapat perbedaan yang nyata antara bibit hasil inokulasi A. rhizogenes dengan kontrol. Ada kecendrungan bahwa bibit hasil inokulasi dengan strain 509 menghasilkan jumlah akar sekunder yang tertinggi dibandingkan kontrol. Sedangkan untuk bibit hasil inokulasi dengan strain 509 dan 07-20001 tidak terdapat perbedaan yang nyata terhadap jumlah akar tersiernya tapi berbeda dengan kontrol. Tabel 16. Panjang akar primer (cm), jumlah akar sekunder (buah) dan jumlah akar tersier (buah) tanaman manggis setelah diaklimatisasi, umur 3 bulan setelah tanam Strain A rhizogenes Kontrol

Panjang akar primer (cm) 3.50 a

Jumlah akar sekunder (buah) 2.0 a

Jumlah akar tersier (buah) 0.0 b

509

5.75 a

13.5 a

5.5 a

07-20001

8.25 a

7.0 a

4.5 a

ATCC-15834

2.25 a

2.5 a

0.0 b


2 cm

2 cm

Kontrol

2 cm

509

2 cm

07-20001

ATCC 15834

akar akar akar

Kontrol

509

07-20001

Gambar 21. Performansi bibit manggis umur 3 bulan setelah aklimatisasi

akar

ATCC 15834

Untuk melihat lebih jauh apakah akar yang dihasilkan dari Inokulasi A. rhizogenes dapat berfungsi untuk menyerap air dan hara maka dilakukan pengamatan anatomi akar bibit manggis. Hasil sayatan melintang akar bibit manggis pada umur

3 bulan setelah diaklimatisasi memperlihatkan bahwa

inokulasi dengan strain 509 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang, total luasan sayatan melintang dan rasio (luas serapan/total luasan sayatan melintang) yang paling besar dibandingkan kontrol (Tabel 17). Sayatan melintang akar bibit manggis umur 3 bulan setelah aklimatisasi dapat dilihat pada Gambar 22. Akar hasil inokulasi dengan A. rhizogenes memperlihatkan perkembangan xilem yang lebih baik dibandingkan kontrol. Akar hasil inokulasi dengan strain 509 memperlihatkan jumlah xilem yang banyak serta ukuran yang relatif seragam.

Tabel 17.

Strain A.rhizogenes

Rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang, total luasan sayatan melintang dan rasio (konduktivitas/ total luasan sayatan melintang), umur 3 bulan setelah tanam Rata-rata diameter pembuluh xilem (µm)

Jumlah total pembuluh xilem (buah)

Luas serapan permukaan sayatan melintang 2 (µm )

Kontrol

5.333

30.667

684.674

509

6.153

119.000

07-20001

5.990

ATCC-15834

5.580

Total luasan sayatan melintang (µm2)

Rasio = luas serapan / total Luasan sayatan melintang

99.957

6.849

3536.637

164.850

21.454

78.000

2196.939

128.217

17.135

90.333

2207.926

154.383

14.302

en

en

x

f

f

x 20 µm

Kontrol en

20 µm en

x

x

f 20 µm

509

f

07-20001

20 µm

ATCC 15834

Gambar 22. Sayatan melintang akar bibit manggis umur 3 bulan setelah aklimatisasi, dimana x = xilem, f = floem, dan en = endodermis

Eksplan manggis tanpa biji Pengakaran tunas perlu diupayakan untuk menghasilkan bibit dengan sistem perakaran yang baik. Sebanyak 140 eksplan tunas yang diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes, hingga 12 MSP baru terdapat 10.71 % eksplan yang berhasil membentuk akar. Terbentuknya akar ditandai dengan membengkaknya bagian pangkal tunas sehingga pada bagian tunas tersebut terlihat ada tonjolan (Gambar 23).

Primodia akar

Gambar 23. Primodia akar yang terbentuk pada eksplan manggis tanpa biji umur 6 minggu setelah diinokulasi dengan A. rhizogenes

Tabel 18 memperlihatkan bahwa eksplan tunas manggis baru mulai muncul akar 6 minggu setelah inokulasi.

Eksplan yang di inokulasi dengan

strain ATCC-15834 muncul akar pada minggu ke-6 (3 eksplan) dan minggu ke10 (1 eksplan), 509 muncul akar minggu ke-6 (3 eksplan) dan minggu ke-8 (1 eksplan), strain R1000 mulai berakar pada minggu ke 7 (2 eksplan), 07-2001 berakar pada minggu ke 8 (1 eksplan), A4 mulai berakar pada minggu ke-8, 10 dan 12 masing-masing sebanyak 1 eksplan, sedangkan inokulasi dengan strain ATCC 8196 dan kontrol baru muncul akar minggu ke-12 masing-masing sebanyak 1 eksplan.

Inokulasi A. rhizogenes strain 509 dan ATCC-15834

menghasilkan persentase pembentukan akar (20.00%), kemudian A4 (15.00%), R1000 (10.00%), 07-20001, ATCC 8196 dankontrol (5.00%). Dari Tabel 19 terlihat bahwa inokulasi A. rhizogenes strain 509, ATCC 15834 dan A4 pada eksplan manggis umur 12 MSP menghasilkan diameter batang terbesar dan tinggi tanaman yang terbesar dihasilkan eksplan yang diinokulasi dengan strain 509 dan A4. Sedangkan untuk jumlah daun dan panjang akar tidak berbeda nyata antara kontrol dengan eksplan yang diinokulasi dengan A. rhizogenes. Namun ada kecendrungan bahwa inokulasi dengan strain 509, ATCC 15834 dan A4 menghasilkan jumlah daun dan panjang akar yang lebih tinggi dibanding kontrol.

Tabel 18.

Pengaruh inokulasi beberapa strain A. rhizogenes terhadap kecepatan terbentuknya akar eksplan pucuk manggis tanpa biji


Jumlah kultur berakar minggu ke-

% Eksplan berakar

Kontrol

6 0

7 0

8 0

9 0

10 0

11 0

12 1

ATCC-15834

3

0

0

0

1

0

0

20.00

509

3

0

1

0

0

0

0

20.00

R1000

0

2

0

0

0

0

0

10.00

07-20001

0

0

1

0

0

0

0

5.00

A4

0

0

1

0

1

0

1

15.00

ATCC 8196

0

0

0

0

0

0

1

5.00

5.00

Tabel 19. Pertumbuhan kultur setelah diinokulasi dengan berbagai strain A. rhizogenes umur 12 MSP Strain A. Diameter Tinggi tanaman Jumlah daun Rata-rata rhizogenes batang (cm) (helai) panjang akar (mm) (cm) Kontrol

0.20 bc

1.98 c

2.50 a

0.05 a

ATCC-15834

0.29 a

2.75 bc

3.75 a

1.25 a

509

0.30 a

3.93 a

4.50 a

0.80 a

R1000

0.23 bc

2.55 bc

3.00 a

0.53 a

07-20001

0.22 bc

2.38 bc

3.00 a

0.38 a

A4

0.25 ab

3.13 ab

4.00 a

0.90 a

ATCC 8196

0.19 c

2.53 bc

3.00 a

0.13 a


Berdasarkan Gambar 24 terlihat bahwa eksplan manggis pada umur 12 minggu setalah inokulasi dengan A. rhizogenes strain 509, R1000 dan 0720001 menunjukkan tanda-tanda ujung daun yang berwarna kecoklatan. Gejala tersebut terjadi pada eksplan manggis yang diinokulasi dengan bakteri A. rhizogenes

yang

memiliki

pertumbuhan

yang

sangat

cepat

sehingga

pertumbuhan bakteri A. rhizogenes pada media in vitro sangat susah dihilangkan. Aklimatisasi dilakukan pada umur 12 minggu setalah inokulasi dan 2 minggu setelah diaklimatisasi ternyata semua planlet manggis tidak berhasil tumbuh.

Kontrol

R1000

1.5cm

1.5cm

07-20001

1.5cm

ATCC15834

1.5cm

A4

509

1.5cm

1.5cm

ATCC8196

1.5cm

Gambar 24. Eksplan manggis tanpa biji umur 12 minggu setelah inokulasi

PEMBAHASAN Perbanyakan manggis dengan cara in vitro diharapkan dapat menyediakan bibit manggis secara masal, seragam, dan sepanjang tahun. Hasil multiplikasi tunas dari biji manggis yang dibelah empat mulai bertunas sekitar satu minggu setelah tanam, hasil yang serupa juga diperoleh pada perkecambahan biji utuh.

Menurut Nakasone & Paull (1999) waktu yang

dibutuhkan untuk perkecambahan biji manggis adalah sekitar 10–54 hari. Sebanyak 408 eksplan yang ditanam, hingga 6 minggu setelah perlakuan terdapat 16.18% eksplan yang tidak berkecambah sehingga pada akhir pengamatan eksplan yang asenik dan mampu berkecambah sebesar 83.82%. Menurut Cox (1988) keberhasilan perkecambahan biji dari buah segar mencapai 83.73-85.71% dan dari buah yang mulai membusuk hanya berkecambah 71.43%.

Benih yang diinduksi dengan WPM + 5 mg/l BAP mempunyai persentase perkecambahan yang relatif lebih baik dibandingkan benih yang diinduksi MS + 5 mg/l BAP dan WPM + 10 mg/l Kinetin. Sampai dengan 6 MSP persentase perkecambahan benih yang diinduksi WPM + 5 mg/l BAP, MS + 5 mg/l BAP dan WPM + 10 mg/l Kinetin

mencapai 86.76, 83.09 dan 81.62%.

Berdasarkan hal tersebut maka penggunaan media WPM + 5 mg/l BAP sangat membantu proses perkecambahan dan merangsang pembentukan tunas majemuk relatif lebih baik bila dibandingkan dengan media MS + 5 mg/l BAP dan media WPM + 10 mg/l Kinetin. Hormon BAP adalah salah satu sitokinin sintetis yang mempunyai peran fisiologis untuk mendorong pembelahan sel, sehingga penambahan BAP ke dalam media dapat merangsang pembentukan tunas majemuk. Menurut Wattimena (1988) bahwa pengaruh sitokinin pada berbagai proses fisiologis diduga pada tingkat pembuatan protein mengingat kesamaan struktur sitokinin dengan adenin yang merupakan komponen dari DNA dan RNA. Selanjutnya, Lakitan (1995) menambahkan, bahwa sitokinin merangsang pembelahan sel melalui peningkatan laju sintesis protein, beberapa di antara protein ini dapat berperan sebagai enzim yang dibutuhkan untuk terjadinya mitosis. Perlakuan WPM + 5 mg/l BAP dapat menginduksi pembentukan tunas lebih banyak dari seluruh eksplan yang ditanam yaitu 15 tunas, disusul MS + 5 mg/l

BAP

sebanyak

13

tunas

hanya

saja

tunas

yang

terbentuk

perkembangannya sangat lambat, dan terakhir WPM 10 mg/l Kinetin sebanyak 3 tunas. Dibandingkan dengan percobaan in vitro, hasil perkecambahan di lapang pada umumnya hanya satu tunas dan jarang yang lebih dari satu tunas (hanya 10%), yaitu dari biji yang bersifat poliembrionik (Cruz 2001). Namun demikian, dari sekian banyak tunas in vitro yang muncul tidak seluruhnya dapat lansung diinduksi akarnya karena ukurannya masih kecil (tinggi kurang dari 2 cm), hanya 3 tunas dari setiap biji yang dapat lansung diinduksi perakarannya. Roostika et al. (2005) juga melaporkan bahwa secara umum jumlah tunas manggis hasil kultur in vitro yang dapat langsung disubkultur ke media perakaran sebanyak 35 tunas dari setiap biji yang ditumbuhkan, sedangkan yang lain harus dipindahkan ke media pertumbuhan. Berdasarkan penelitian Harahap (2005) diperoleh hasil bahwa perlakuan biji dibelah empat menghasilkan tunas lebih banyak dibandingkan biji

utuh, namun tinggi tunasnya lebih rendah dibandingkan biji utuh. Biji manggis yang diletakkan tertelungkup dengan bagian luka menempel pada media secara umum memberikan pengaruh yang lebih baik dalam menginduksi pembentukan tunas adventif. Penggunaan media Woody Plant Medium (WPM) untuk menginduksi tunas manggis relatif lebih baik dibandingkan media Murashige dan Skoog (MS). Media WPM ini umum digunakan untuk tanaman berkayu karena merupakan media dengan konsentrasi ion yang rendah tetapi memiliki kandungan sulfat yang tinggi (Gunawan 1988).

Hasil penelitian Triatminingsih et al. (1995),

melaporkan bahwa media multiplikasi tunas terbaik terjadi pada media WPM + 2 ppm BAP + 0.1 ppm NAA mampu menghasilkan eksplan bertunas sebanyak 65%. Triatminingsih et al. (2001) melaporkan secara kultur in vitro satu eksplan manggis (yang berasal dari eksplan biji) dapat menghasilkan 30 tunas dalam waktu enam bulan setelah disubkulturkan. Berdasarkan uraian tersebut di atas terlihat bahwa penggunaan WPM + 5 mg/l BAP dapat menginduksi pembentukan tunas lebih banyak dari seluruh eksplan yang ditanam selanjut tunas-tunas yang dihasilkan tersebut digunakan untuk percobaan B, yaitu induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan Agrobacterium rhizogenes melalui kultur in vitro Hasil percobaan induksi perakaran dengan bakteri A. rhizogenes menunjukkan bahwa inokulasi pada eksplan manggis dengan biji mampu menginduksi perakaran manggis lebih cepat yaitu pada minggu ke-4 setelah inokulasi sedangkan pada eksplan manggis tanpa biji akar mulai terbentuk pada minggu ke-6 setelah inokulasi. Keadaan ini lebih baik dibandingkan dengan induksi akar menggunakan hormon IBA (kontrol), dimana akar mulai terbentuk pada minggu ke-12 setelah perlakuan. Lukman (1996) melaporkan bahwa, sebagian besar eksplan tunas manggis yang diinduksi dengan IBA 1000 mg/l akan berakar pada 14-17 minggu setelah perlakuan. Persentase eksplan manggis yang berakar setelah diinokulasi dengan A. rhizogenes juga lebih tinggi dibandingkan eksplan yang diinduksi dengan hormon IBA (kontrol). Hal ini menunjukkan bahwa A. rhizogenes cenderung lebih efektif dibandingkan hormon IBA dalam menginduksi perakaran eksplan manggis.

McAfee et al. (1993) melaporkan bahwa persentase tunas yang

berakar pada pine (Pinus) dan Larch (Larix) spp yang diinokulasi A. rhizogenes

nyata lebih tinggi dibandingkan dengan induksi hormon NAA. Selanjutnya hasil penelitian (Damiano & Monticelli 1998) menunjukkan bahwa tunas almon tidak dapat berakar pada media yang ditambahkan auksin, setelah

diinokulasikan

dengan

A.

rhizogenes.

dan hanya berakar

Banyak

faktor

yang

mempengaruhi aktifitas auksin sintetik untuk merangsang inisiasi primordia akar, yaitu : kesanggupan senyawa tersebut untuk menembus lapisan kutikula atau epidermis berlilin, sifat translokasi di dalam tanaman, perubahan auksin menjadi senyawa yang tidak aktif di dalam tanaman, interaksi dengan hormon tumbuh lainnya, spesies tanaman, fase pertumbuhan, dan lingkungan (Wattimena, 1988). Perlakuan inokulasi berbagai strain A. rhizogenes dapat menginduksi perakaran pada semua eksplan manggis tanpa biji sampai umur 12 minggu setelah perlakuan.

Akar yang terbentuk lansung dari pangkal pucuk dan

merupakan satu kesatuan dengan pangkal pucuknya. Valpuesta (2002) mengatakan bahwa perakaran tanaman dapat diperbaiki dengan menginokulasi A. rhizogenes pada bagian dasar kultur in vitro yang telah dipotong. Masih

rendahnya

persentase

eksplan

manggis

yang

dapat

menghasilkan akar lebih dari satu. Hal ini diduga karena tanaman manggis ini memiliki sifat pertumbuhan yang sangat lambat. Di samping itu juga bakteri A. rhizogenes masih tetap tumbuh di media kultur in vitro sampai 12 minggu setelah perlakuan, walaupun media telah ditambahkan cefotaxime (250 mg/l) dan disubkultur setiap 2 kali seminggu. McAfee et al. (1993) melaporkan bahwa sampai 28 minggu setelah inokulasi pine (Pinus) dan Larch (Larix) spp, bakteri A. rhizogenes masih tetap tumbuh pada media yang telah ditambahkan cefotaxime (500 mg/l). Menurut Yusnita (2003) bahwa penggunaan antibiotik dalam media akan menyebabkan terjadinya keracunan pada tanaman. Hal ini juga terjadi pada eksplan manggis setelah 12 minggu perlakuan, dimana ujungujung daun menjadi kuning dan sistem perakaran kurang berkembang dengan baik sehingga penyerapan nutrisi menjadi lambat.

Setelah 2 minggu di

aklimatisasi semua tanaman yang berakar dari inokulasi A. rhizogenes tidak dapat tumbuh dan akhirnya mati karena akar membusuk dan daun menguning semua. Selanjutnya inokulasi A. rhizogenes pada eksplan manggis dengan biji muncul akar pada daerah inokulasi, yaitu pada strain ATCC-15834, 509 dan 07-20001

sedangkan inokulasi dengan strain R1000, A4, ATCC 8196 dan

induksi dengan hormon IBA (kontrol) sampai minggu ke-7 belum ada akar yang muncul. Keadaan ini disebabkan tidak semua strain A. rhizogenes dapat efektif menginduksi perakaran manggis.

Perbedaan keefektivan yang terjadi dari

masing-masing strain A. rhizogenes tersebut disebabkan adanya perbedaan kemampuan dari masing-masing strain untuk menginfeksi eksplan manggis tersebut.

Hasil penelitian Jacobsen (2003) menunjukkan bahwa adanya

perbedaan efektivitas strain A. rhizogenes dalam menginduksi perakaran tunas P. contorta.

Perbedaan efektivitas ini diduga karena adanya perbedaan

struktural dari gen vir pada masing-masing strain A. rhizogenes. Inokulasi A. rhizogenes dengan strain 509 menghasilkan panjang akar terbesar kemudian strain 07-20001 dan ATCC 15834. Secara visual akar yang dihasilkan dari kultur in vitro merupakan akar tunggal tanpa percabangan dan tanpa rambut-rambut akar pada planlet di botol yang sudah siap diaklimatisasi. Hasil yang serupa juga diperoleh Goh et al. (1990). Planlet yang berhasil berakar pada eksplan manggis dengan biji, ternyata 75% dapat tumbuh dengan baik pada media aklimatisasi sampai umur 3 bulan setelah tanam. Ketika tanaman dibongkar tampak akar mampu berkembang lebih baik dengan munculnya akar sekunder dan tersier pada strain 509 dan 07-20001. Hal ini menunjukkan bahwa strain A. rhizogenes tersebut dapat digunakan untuk induksi akar manggis secara in vitro. Keadaan ini membuktikan bahwa akar yang dihasilkan dari inokulasi A. rhizogenes dapat berfungsi dalam menunjang pertumbuhan dan perkembangan bibit manggis. Hasil

anatomi akar

juga memperlihatkan bahwa inokulasi A.

rhizogenes menghasilkan luas serapan permukaan sayatan melintang yang tinggi dibandingkan kontrol. Hal ini menunjukkan bahwa daya penghantar air oleh xilem lebih cepat prosesnya sehingga penyerapan air dan unsur hara dapat berjalan dengan baik, karena pada tumbuhan berpembuluh pengangkutan air serta zat yang terlarut di dalamnya dilakukan oleh jaringan pembuluh yaitu xilem (Hidayat 1995). Caboni (1996) melaporkan anatomi akar adventif yang dihasilkan setelah inokulasi dengan A. rhizogenes pada eksplan walnut, memperlihatkan sistem jaringan pembuluh yang sinambung antara akar dengan batang dan berhasil tumbuh dengan baik setelah dipindahkan ke media aklimatisasi.

Permasalahan

perakaran

pada

tanaman

buah-buahan

yang

diperbanyak secara kultur in vitro telah bisa diatasi dengan menggunakan bakteri A. rhizogenes (Damiano & Monticelli 1998).

Akar dapat terangsang

terbentuk lebih baik karena terjadi transfer sebagian fragmen DNA yaitu T-DNA dari Agrobacterium ke dalam sel tanaman yang terlibat dalam proses induksi akar adventif pada tempat infeksi. Namun dari uji konfirmasi T-DNA menggunakan polymerase chain reaction (PCR) dengan primer spesifik belum muncul produk DNA-nya. Hal ini diduga karena T-DNA yang ditransfer berada pada level (jumlah kopi) yang rendah. Hasil yang serupa diperoleh (Li & Leung (2003) pada radiata pine (Pinus radiata D. Don) yang diinokulasi dengan strain A4 dan LBA9402. Hasil penelitian Damiano & Monticelli (1998) menunjukkan bahwa hanya 6.8% yang dikonfirmasi sebagai akar transgenik hasil inokulasi A. rhizogenes. McAfee et al. (1993) mengatakan bahwa keberadaan A. rhizogenes disekitar

perakaran

sangat

bermanfaat

karena

bakteri

tersebut

dapat

memodifikasi lingkungan disekitar perakaran seperti meningkatkan kandungan asam organik yang diperlukan untuk perkembangan akar. Menurut Wattimena (1988) bahwa asam amino triptofan untuk biosintesis IAA berasal dari proses antolisa sel yang terjadi pada waktu pembentukan jaringan xilem dan floem. Pada waktu pembentukan jaringan xilem dan floem, sel-sel meristimatik ini mengalami antolisis dan hasil antolisis menjadi tersedia untuk bahan-bahan metabolisma selanjutnya untuk sel-sel sekitarnya. SIMPULAN Penggunaan media WPM + 5 mg/l BAP menghasilkan persentase perkecambahan dan pembentukan tunas majemuk yang lebih tinggi. Induksi perakaran eksplan tunas manggis dengan A. rhizogenes mampu menginduksi terbentuknya akar adventif pada tempat infeksi setelah diinokulasikan dengan strain 509 dan ATCC-15834, 07-20001 serta mampu tumbuh hingga 75% pada tahap aklimatisasi. Inokulasi A. rhizogenes strain 509 pada kultur in vitro menghasilkan anatomi akar (rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan sayatan melintang) yang paling besar dibandingkan kontrol.

PEMBAHASAN UMUM Potensi Bakteri A. rhizogenes untuk Peningkatan Perakaran Bibit Manggis Hasil penelitian yang telah dilaksanakan menunjukkan bahwa bakteri A. rhizogenes yang dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis mampu meningkatkan perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Peningkatan perakaran ditandai dengan meningkatnya panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan jumlah akar tersier. Sedangkan peningkatan pertumbuhan tajuk bibit manggis ditandai dengan meningkatnya diameter batang, tinggi tanaman dan jumlah daun. Adanya peningkatan perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis

ini disebabkan karena tertransfernya sebagian DNA (T-DNA) dari

Agrobacterium ke dalam sel tanaman. Fragmen DNA yang ditransfer ke dalam sel tanaman merupakan daerah TR dan TL-DNA. Plasmid Ri yang terdapat pada A. rhizogenes mempunyai satu atau dua macam T-DNA yaitu left T-DNA (TL-DNA) dan right TDNA (TR-DNA).

Berbeda dengan TL-DNA, TR-DNA mempunyai persamaan

dengan T-DNA A. tumefaciens.

TR-DNA mengandung dua gen sintesis

manopin (mas 1 dan mas2) dan satu gen sintesis agropin (ags). Selain itu TRDNA juga terdapat gen yang membentuk auksin yaitu IaaM dan IaaH. IaaM menyandi pembentukan triptofan 2 monooksigenase yang akan mengkatalisis perubahan L-triptofan menjadi senyawa indol-3-asetamida.

Sedangkan IaaH

menyandi enzim amino hidrolase yang mengubah indol-3-asetamida menjadi asam indol-3-asetat (IAA) (Jeng-seng 2001). Sedangkan TL-DNA mengandung gen-gen rol (root loci) yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD yang berperan dalam menginduksi akar rambut, rolA, rolB, rolC dan rolD ini merupakan open reading frame (ORF) dari TL-DNA yang ditransfer dan diekspresikan bersama-sama (Chriqui 1996). Gen rolA berfungsi untuk mereduksi kandungan asam giberelin, gen rolB mengkode ß–glukosidase yang menghidrolisa indol ß-glukosida, yang berfungsi untuk melepas IAA dalam tanaman dari indol-3-asetil ß-glukosidase yang tidak aktif dan menaikkan konsentrasi IAA intraseluler. Gen rolB merupakan kunci utama untuk induksi akar rambut. White et al. (1985) juga melakukan pengujian pada empat gen rolA, rolB, rolC dan rolD, hasil pengujian menunjukkan bahwa protein produk dari berbagai gen rol tersebut berperan

dalam meningkatkan sensivitas sel tanaman terhadap adanya auksin. Selain itu produk gen rol juga diduga mendorong tanaman inang untuk mensintesis auksin sehingga mengakibatkan terjadinya pembentukan akar. Pemanfaatan A. rhizogenes telah berhasil untuk meningkatkan perakaran pada tanaman buah-buahan, seperti pada kiwi (Rugini et al., 1991), apel (Sutter & Luza 1993; Damiano & Monticelli 1998), almond (Damiano et al., 1995), walnut (Caboni et al. 1996) dan pada beberapa tanaman tahunan berkayu, seperti pada pinus (McAfee et al. 1993; Li & Leung 2001), Larix (McAfee et al. 1993) dan Eucalyptus (MacRae & Staden 1993).

Dari hasil

penelitian tersebut dilaporkan bahwa kemampuan berakar, jumlah akar, dan massa akar meningkat

jika T-DNA dapat tertransfer dan terintegrasi dalam

genom tanaman. Berbagai gen pada T-DNA yang ditransfer dan terintegrasi dalam genom tanaman, akan terekspresi di dalam sel sehingga mengakibatkan terjadinya produksi fitohormon endogenous atau reaksi hipersensitif sel tanaman terhadap fitohormon. Pada penelitian tahap satu didapat hasil

bahwa inokulasi A.

rhizogenes strain ATCC-15834, 509, 07-20001, A4, dan R-1000 mampu meningkatkan perkembangan akar, yaitu : panjang akar primer, jumlah akar lateral dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi, dan jumlah daun tanaman yang lebih baik dibanding strain MAFF 01-1724, 510, 511, A4-J dan kontrol. Keadaan ini diduga karena adanya perbedaan keefektivitas dari masing-masing strain dalam proses transfer T-DNAnya. Hal ini biasanya berhubungan dengan virulensi strain Agrobacterium dan kerentanan dari sel tanaman. Proses transfer T-DNA ke sel tanaman memerlukan beberapa faktor, antara lain; adanya T-DNA yaitu materi genetik yang akan ditransfer dan adanya faktor virulensi yaitu berbagai gen yang diperlukan pada proses transfer T-DNA (Gelvin 2003).

Proses transfer T-DNA akan berhasil apabila terdapat

kompatibilitas antara Agrobacterium dengan sel tanaman. Sel tanaman yang peka, apabila terluka akan mengeluarkan suatu metabolit yang berfungsi sebagai isyarat bagi Agrobacterium, dan sebagai penginduksi ekspresi faktor virulensi dari Agrobacterium. Sebaliknya Agrobacterium yang virulen akan menangkap isyarat yang diberikan oleh tanaman yang peka, dan dapat

mengekspresikan berbagai gen yang diperlukan dalam proses transfer T-DNA (Winans 1992; de la Riva et al 1998) (Gambar 25). Satu atau beberapa molekul T-DNA dapat ditransfer dan berintegrasi dalam genom tanaman, sehingga dalam kromosom tanaman bisa terdapat satu atau beberapa utas T-DNA yang dapat berintegrasi pada satu situs atau pada beberapa situs yang terpisah.

Situs integrasi T-DNA pada genom tanaman

bersifat acak. Sekali terintegrasi di dalam genom tanaman, semua gen yang terdapat pada T-DNA akan terekspresikan (Gelvin 2003).

Gambar 25. Proses transfer T-DNA Agrobacterium (Sumber : de la Riva et al. 1998)

Pada penelitian ini hasil verifikasi inokulasi

A. rhizogenes dengan

amplifikasi PCR menunjukkan bahwa strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit

manggis yang dibuktikan dengan

terdeteksinya gen rolB pada 780 bp. Perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis hasil inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 secara umum memang relatif lebih baik dari kontrol dan bahkan dengan hasil yang di inokulasi A. rhizogenes strain 509, 07-20001, A4, dan R-1000 yang juga diduga efektif untuk menginfeksi bibit manggis. Meningkatnya perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis hasil inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 karena telah terintegrasinya gen rolB pada bibit manggis. Bibit manggis yang telah terintegrasi T-DNA selanjutnya akan mengekspresikan enzim baru, mensintesis fitohormon sehingga terjadi produksi

fitohormon.

Fitohormon

tersebut

diperlukan

tanaman

untuk

meningkatkan sintesis protein dan memacu pertumbuhan akar primordia yang meningkatkan pertumbuhan akar.

Rugini et al. (1991) melaporkan bahwa

kemampuan perakaran, jumlah akar dan masa akar meningkat ketika gen rolABC terekspresi pada tanaman kiwi. Zhu (2001) juga melaporkan bahwa gen rolB yang terintegrasi ke sel tanaman mampu meningkatkan perakaran dan pertumbuhan tanaman apel. Menurut Jeng-Sheng (2001) gen rolB berperan meningkatkan kandungan auksin aktif dalam tanaman dengan menghidrolisis konjugat IAA inaktif dan mengatur sensivitas sel terhadap IAA. TL-DNA mengandung gen-gen rol (root loci) yaitu : rolA, rolB, rolC dan rolD yang berperan dalam menginduksi akar rambut dan meningkatkan sensivitas sel tanaman terhadap adanya auksin. Indole Acetic Acid (asam indol asetat = IAA) merupakan fitohormon endogen yang dihasilkan oleh Agrobacterium, dimana jalan pembentukan IAA melalui senyawa indole-3-asetamid (IAM).

Menurut Davies (2004) bahwa jalur

pembentukan IAA melalui senyawa intermediat indole-3-pyruvate (IPA) dan indole-3-acetamide (IAM) biasa dilakukan oleh mikroorganisme, sedangkan jalan yang lain terdapat dalam tanaman. Ekspresi gen yang terdapat pada T-DNA tersebut membawa konsekuensi síntesis fitohormon dan síntesis opin. Opin adalah turunan asam amino yang berfungsi sebagai sumber karbon untuk pertumbuhan bakteri Agrobacterium. Macam dari senyawa opin yang dihasilkan dapat dipakai untuk

membedakan jenis strain A. rhizogenesnya, karena strain yang berbeda akan mensintesis senyawa opin yang berbeda pula, sehingga dalam beberapa percobaan transformasi genetik tanaman, karakteristik ini sering digunakan sebagai marker (Zambryski et al. 1989). Inokulasi A.rhizogenes pada manggis dilakukan pada akar bibit tanaman manggis dengan beberapa metode, yaitu metode akar ditusuk dan metode akar dipotong. Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode inokulasi akar dipotong secara umum menghasilkan peningkatan

perakaran dan

pertumbuhan tajuk yang lebih baik dari pada metode akar yang ditusuk. Metode inokulasi ini juga berpengaruh terhadap persentase hidup bibit tanaman manggis dimana metode inokulasi dengan cara akar dipotong menghasilkan persentase bibit manggis yang hidup lebih tinggi dibandingkan dengan metode inokulasi dengan cara akar ditusuk. Dari fakta tersebut dapat disimpulkan bahwa metode inokulasi pada akar bibit manggis dengan cara akar dipotong lebih efektif untuk digunakan dibandingkan dengan metode akar ditusuk. Banyaknya bibit manggis yang mati setelah diinokulasi dengan A.rhizogenes

disebabkan karena banyaknya akar bibit manggis yang

mengalami pembusukan setelah diinokulasi. Hal ini diduga karena terjadinya infeksi bakteri yang terlalu banyak sehingga menyebabkan sel/jaringan tanaman menjadi stress dan tidak bisa tumbuh.

Selain itu terjadi persaingan antara

tanaman dan bakteri untuk tumbuh (Gambar 26). Menurut Winan (1992) terdapat beberapa strain Agrobacterium yang dapat menyebabkan pembusukan akar pada tanaman yang rentan, strain ini tidak menstransfer T-DNAnya tetapi mengeluarkan satu enzim pengurai yaitu pektinase.

Gambar 26.

Bibit dan akar manggis hasil inokulasi A. rhizogenes yang mengalami pembusukan.

Setiap strain A. rhizogenes memiliki tingkat keefektivan yang bervariasi terhadap tanaman inangnya, demikian juga dengan tanamannya memberikan tanggap yang berbeda terhadap inokulasi strain A. rhizogenes. Hasil penelitian ini menunjukkan bahwa ada perbedaan keefektivan dari masing-masing strain A. rhizogenes saat diinokulasikan pada akar bibit tanaman manggis. Pada penelitian tahap ke dua dilakukan optimasi inokulasi strain A. rhizogenes.

Hasil

menunjukkan

bahwa

inokulasi

strain

ATCC-15834

menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik dibandingkan inokulasi dengan strain 07-20001, A4, 509, R1000, dan kontrol. Dalam hal ini berarti bibit yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 konsentrasi 1.0 paling efektif menginfeksi akar bibit manggis umur 6 minggu dibandingkan dengan strain 0720001, 509, A4 dan R1000 konsentrasi 1.0 dan 0.7. Perbedaan keefektivan yang terjadi dari masing-masing strain tersebut diduga adanya perbedaan virulensi bakteri Agrobakterium yang digunakan. Virulensi dari bakteri Agrobakterium dipengaruhi oleh eksudat atau metabolit yang disekresikan tanaman. Beberapa metabolit yang disekresikan tanaman yang rentan, yang tidak dijumpai pada tanaman resisten, akan

menginduksi faktor virulensi. Metabolit tersebut adalah asetosiringon, hidroksi asetosiringon, koniferil alkohol, koniferin dan etil firulat yang diperlukan dalam proses infeksi (Winans 1992). Dengan demikian efektivitas inokulasi sangat tergantung kepada strain A. rhizogenes yang digunakan, karena perbedaan strain bakteri mempengaruhi efisiensi transfer gen.

Sehingga penting untuk

menguji lebih dari satu strain A. rhizogenes dalam pekerjaan awal inokulasi. Bakteri A. rhizogenes juga mampu menginduksi perakaran eksplan manggis secara in vitro, baik pada eksplan tanpa biji maupun pada eksplan dengan biji.

Hal ini dapat dibuktikan dengan tumbuhnya akar adventif pada

tempat yang diinokulasi (Gambar 22). Akar adventif ini dapat berkembang dan berfungsi sebagaimana

akar yang normal lainnya. Hanya saja persentase

tanaman yang mampu menghasilkan akar lebih dari dua masih sangat rendah, serta masih sulitnya menghilangkan kontaminasi bakteri A. rhizogenes pada media kultur in vitro. Keadaan ini menyebabkan akar tidak dapat berkembang dengan baik, diduga karena adanya persaingan antar eksplan dan bakteri A. rhizogenes untuk tumbuh. Sebagaimana telah dijelaskan sebelumnya bahwa hasil uji konfirmasi T-DNA dari akar hasil inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834 secara in vivo menggunakan polymerase chain reaction (PCR) dengan primer spesifik dapat terdeteksi adanya pita DNAnya pada 780 bp. Hal ini menandakan telah terjadinya transfer T-DNA bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 ke dalam akar bibit manggis.

Sedangkan hasil uji konfirmasi T-DNA dari akar hasil

inokulasi berbagai strain A. rhizogenes

secara in vitro

menggunakan

polymerase chain reaction (PCR) dengan primer spesifik belum terlihat adanya pita DNA atau tidak muncul produk DNA-nya. Hal ini diduga karena T-DNA yang ditransfer berada pada level yang rendah atau jumlah kopi (copy number) TDNA yang terdapat pada sel akar bibit manggis tersebut masih sedikit. Hasil yang serupa diperoleh Li dan Leung (2003) pada radiata pine (Pinus radiata D. Don) yang diinokulasi dengan strain A4 dan LBA9402. Sedangkan hasil penelitian Damiano dan Monticelli (1998) menunjukkan bahwa hanya 6.8% yang dikonfirmasi sebagai akar transgenik hasil inokulasi A. rhizogenes. Hasil anatomi akar memperlihatkan bahwa akar hasil inokulasi

A.

rhizogenes mampu menghasilkan jumlah dan luas serapan permukaan sayatan melintang xilem yang tinggi dibandingkan dengan induksi akar menggunakan

hormon IBA (kontrol). Hal ini dapat menyebabkan penyerapan air dan unsur hara dapat berjalan dengan baik. Fakta ini menguatkan potensi dari inokulasi bakteri A. rhizogenes untuk meningkatkan perakaran bibit manggis.

Pola Hubungan antara Inokulasi A. rhizogenes dengan Anatomi Akar dan Fisiologi Bibit Tanaman Manggis Pertumbuhan akar yang lebih baik setelah diinokulasi A. rhizogenes, merupakan salah satu indikasi terjadinya proses transfer T-DNA dari A. rhizogenes ke dalam kromosom sel tanaman. Di dalam T-DNA yang di transfer oleh strain A. rhizogenes terdapat berbagai gen penyandi protein yang mengatur proses biosintesis auksin endogen yang diperlukan untuk menginduksi pembentukan akar. Beberapa fungsi auksin adalah diperlukan dalam proses pembelahan sel dan inisiasi akar (Davies 2004). Efek lain dari auksin selain merangsang

pemanjangan

sel

untuk

pertumbuhan

primer,

auksin

mempengaruhi pertumbuhan sekunder dengan cara menginduksi pembelahan sel pada kambium pembuluh dan dengan mempengaruhi diferensiasi xilem sekunder. Auksin juga meningkatkan aktivitas pembentukan akar adventif dari suatu batang tanaman (Campbell 2003). Hasil penelitian ini mendapatkan inokulasi A.rhizogenes yang dapat menginfeksi akar bibit manggis. Pada bibit manggis yang terinfeksi serta dapat tumbuh dengan baik, terjadi peningkatan perakaran dan pertumbuhan tajuk bibit manggis. Berdasarkan hasil penelitian ini didapatkan bahwa akar sekunder, tersier dan kuarter bibit manggis yang diinokulasi dengan strain ATCC-15834 menunjukkan perkembangan yang lebih baik dibandingkan inokulasi dengan strain A .rhizogenes lainnya. Auksin merangsang pembentukan akar-akar lateral dan adventif, meskipun pemanjangan akar primer dihambat oleh konsentrasi auksin lebih besar dari 10-8 M, inisiasi akar-akar lateral (cabang) dan akar-akar adventif distimulasi oleh level auksin yang tinggi. Akar-akar lateral umumnya didapatkan di atas daerah pemanjangan dan daerah akar-akar rambut dan berasal dari sejumlah kecil sel dalam perisikel. Auksin juga menstimulasi sel-sel perisikel untuk membelah. Pembelahan sel-sel secara gradual ke dalam apeks akar, dan pertambahan akar lateral melalui korteks akar dan epidermis (Taiz & Zeiger 2002).

Auksin mempunyai kemampuan untuk meningkatkan kecepatan pemanjangan sel diikuti dengan pembesaran sel dan meningkatnya bobot basah akibat meningkatnya pengambilan air oleh sel tersebut serta mempengaruhi proses fisiologis lainnya.

Akar primer dan inisiasi pembentukan akar lateral

dirangsang oleh auksin, di samping itu pertumbuhan serta perkembangan sistem perakaran merupakan hasil interaksi yang kompleks antara akar dengan tajuk serta antara akar dengan lingkungan. Inokulasi A. rhizogenes ini dapat mempercepat perkembangan akar lateral dan merangsang kerapatan dan panjang rambut-rambut akar bibit tanaman manggis, sehingga bibit mampu tumbuh dan berkembang lebih baik diakibatkan adanya peningkatan penyerapan hara dan air dengan semakin besarnya luas permukaan serapan.

Hasil analisis hara menunjukkan bahwa

inokulasi A. rhizogenes mampu meningkatkan serapan hara bibit manggis. Inokulasi strain ATCC-15834 dan 07-20001 mampu menghasilkan serapan hara N dan P daun yang nyata lebih besar dibandingkan kontrol.

Unsur hara N

dibutuhkan tanaman untuk sintesis klorofil, asam amino, protein dan senyawa asam nukleat (Salisbury & Ross 1995). Fosfor merupakan salah satu unsur hara makro yang penting dalam pertumbuhan dan perkembangan tanaman. Unsur tersebut berfungsi sebagai penyusun metabolit dalam senyawa kompleks, sebagai aktivator, kofaktor atau penyusun enzim serat dan berperan dalam proses fisiologi (Soepardi 1983) dan juga merupakan komponen struktural dari sejumlah senyawa penting, molekul pentransfer energi ADP dan ATP (Marschner 1997).

Menurut Harran &

Tjondronegoro (1992) ATP merupakan senyawa penting bagi reaksi metabolit yaitu reaksi biosintesis pembentukan senyawa penting bagi pemeliharaan sel pertumbuhan termasuk protein dan asam nukleat. Selain itu ATP diperlukan untuk sintesis cadangan makanan seperti lemak dan polisakarida serta diperlukan dalam proses transpor aktif dan aliran protoplasma.

Fosfor juga

merupakan unsur yang sangat kritikal bagi pertumbuhan tanaman, selain itu kekurangan P mengakibatkan tanaman tidak mampu menyerap unsur-unsur lain. Sebagai unsur yang penting dalam pembentukan energi bagi pertumbuhan tanaman maka ketersediaan P yang cukup akan memperbaiki pertumbuhan tanaman.

Serapan Kalium pada bibit manggis tidak berbeda antara bibit yang diinokulasi dengan kontrol. Sebab unsur K merupakan unsur hara yang bersifat sangat mobil pada semua tingkat pertumbuhan.

Fungsi unsur K adalah

mengatur mengatur aktivitas sel penjaga stomata untuk meningkatkan pengikatan CO2, pengatur aktivitas enzim, sintesis protein, pergerakan stomata, dan mengatur keseimbangan anion-kation (Marschner 1995).

Jika energi yang

tersedia dalam jumlah yang cukup maka semua proses metabolisme dapat berlangsung dengan baik, sehingga tanaman akan lebih mampu menghadapi keadaan lingkungan yang beragam dan mampu tumbuh dengan baik.

Aplikasi Praktis Inokulasi A. rhizogenes

Tertransfernya T-DNA dari A. rhizogenes ke dalam sel tanaman dapat menyebabkan penambahan satu jalur untuk produksi hormon auksin secara endogen dalam tanaman, karena T-DNA yang berasal dari Agrobacteium tersebut memiliki elemen-elemen pengatur seperti yang terdapat pada tanaman. Auksin endogen yang dihasilkan oleh tanaman dapat ditransportasikan dan digunakan langsung oleh tanaman, akan tetapi apabila ketersediaannya berlebih maka IAA dapat diikat oleh senyawa-senyawa tertentu menjadi IAA asam aspartat, IAA-miaoinositol dan IAA glukosa. Senyawa-senyawa tersebut tidak aktif sebagai auksin kecuali bila dihidrolisis kembali menjadi IAA bebas. Pengaturan ini penting bagi tanaman untuk mengatur ketersediaan IAA di dalam tanaman sesuai dengan kebutuhan tanaman (Wattimena 1998; Davies 2004). Sedangkan penambahan auksin eksogen sering menghambat pertumbuhan akar. Penghambatan ini sebagian disebabkan oleh etilen, karena semua jenis auksin akan merangsang berbagai sel tumbuhan untuk menghasilkan etilen, terutama bila auksin diberikan dalam jumlah besar. Etilen menghambat pertumbuhan akar dan juga batang (Lakitan 1995). rhizogenes

disekitar

perakaran

tanaman

Keberadaan bakteri A.

ternyata

dapat

meningkatkan

kandungan asam organik tanah yang berguna untuk perkembangan akar tanaman (Leyval & Berthein 1989 dalam McAfee et al 1993).

Bakteri A.

rhizogenes dapat membantu memperbaiki pertumbuhan tanaman.

Apabila

keunggulan bakteri ini dapat dimanfaatkan dengan baik, diharapkan masalah perakaran pada tanaman yang sulit berakar dapat teratasi.

Hasil penelitian ini dimenunjukkan bahwa bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 yang dapat menginfeksi akar bibit tanaman manggis umur 6 minggu pada konsentrasi A. rhizogenes OD600 = 1.0.

Dengan terinfeksinya

strain ATCC-15834 pada akar bibit manggis, serapan hara (N dan P) daun, dan kandungan hormon IAA meningkat, serta menghasilkan perkembangan rambut akar yang lebih baik. Hal ini menunjukkan bahwa telah tertransfernya T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes ke sel akar bibit manggis. Keadaan seperti ini sangat menguntungkan karena akar transgenik tersebut dapat ditumbuhkan pada medium kultur jaringan menjadi tanaman lengkap pada medium sederhana tanpa manipulasi zat pengatur tumbuh (ZPT). Tanaman yang dihasilkan tersebut telah membawa T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes sehingga tidak perlu lagi untuk menginokulasikan bakteri A. rhizogenes ke bibit tanaman manggis.

T-

DNA dari Ri plasmid A. rhizogenes tersebut tidak akan hilang dari tanaman manggis yang sudah terintegrasi selama tanaman itu hidup. Berdasarkan penelitian Han et al. (1997) telah berhasil meregenerasikan tanaman Populus dari akar hasil transformasi A. rhizogenes menjadi tanaman lengkap dengan pertumbuhan yang normal. Akar bibit manggis yang telah tertransformasi T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes dapat berintegrasi dengan DNA kromosom dari sel akar bibit manggis melalui proses rekombinasi. Sehingga berbagai gen pada T-DNA dari Ri-plasmid A. rhizogenes yang ditransfer dan terintegrasi dalam sel akar bibit manggis, akan terekspresi di dalam sel akar sehingga mengakibatkan terjadinya produksi

fitohormon

pembentukan akar.

endogenous

yang

diperlukan

untuk

menginduksi

Keadaan ini menandakan adanya perubahan secara

genetis pada tanaman manggis, sehingga diperoleh bibit manggis dengan sistem perakaran yang lebih baik dibandingkan menggunakan hormon tumbuh secara eksogen. Akar yang dihasilkan setelah diinokulasi dengan bakteri A. rhizogenes merupakan kimera transgenik sedangkan pada batang, daun dan buahnya tidak trangenik. Maka inokulasi A. rhizogenes dapat diaplikasikan setiap kali akan melakukan pembibitan manggis karena T-DNA yang telah tertransfer ke sel akar bibit manggis tidak diturunkan.

Kendala-Kendala yang Dihadapi dalam Penelitian

Kendala dalam pelaksanaan penelitian inokulasi A. rhizogenes pada bibit manggis baik secara in vivo maupun in vitro adalah ; sulitnya membuat koloni tunggal dari bakteri A. rhizogenes tersebut karena pertumbuhan dari strain-strain A. rhizogenes cepat sekali sehingga dibutuhkan suatu ketrampilan khusus untuk bisa mendapatkan koloni tunggal

dari A. rhizogenes.

Koloni

tunggal ini sangat diperlukan karena dapat menjamin kemurnian dari strain yang akan diaplikasikan ke tanaman. Bakteri A. rhizogenes ini setiap satu bulan sekali harus diremajakan ke media yang baru, agar pertumbuhannya tetap baik. Hanya saja pemindahan setiap bulan ini dapat menyebabkan efektivitas dari bakteri A. rhizogenes menjadi berkurang. Untuk mengatasi hal tersebut dilakukan pengawetan bakteri A. rhizogenes dalam bentuk serbuk sehingga dapat bertahan lama, namun itu semua dibutuhkan biaya yang cukup mahal. Aplikasi A. rhizogenes pada media kultur jaringan cukup sulit karena pertumbuhan bakteri A. rhizogenes dimedia kultur jaringan ini susah untuk dihilangkan walaupun telah ditambahkan antibiotik xefotaxime dalam media.

500 mg/l ke

Pada penelitian ini setiap 3 hari sekali dilakukan subkultur ke

media yang telah ditambahkan antibiotik sampai minggu ke-12 dan bakterinya masih belum bisa dihilangkan. Keadaan ini sangat menganggu pertumbuhan tanaman, bahkan akar yang tadinya telah terbentuk lama-kelamaan mengalami pembusukkan. SIMPULAN DAN SARAN UMUM Simpulan

1. Inokulasi A. rhizogenes strain ATCC-15834, 07-20001, A4, 509, dan R-1000 mampu meningkatkan pertumbuhan panjang akar primer, jumlah akar sekunder dan tersier serta pertumbuhan tajuk, yaitu : diameter batang, tinggi tanaman, dan jumlah daun tanaman bibit manggis. Metode inokulasi dengan cara akar dipotong lebih efektif dalam menginfeksi akar bibit manggis dibandingkan dengan akar ditusuk.

2. Di antara kelima strain A. rhizogenes tersebut, strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD600=1.0 dapat menginokulasi akar bibit tanaman manggis umur 6 minggu. Strain ATCC-15834 dapat mentransfer daerah TL-DNAnya pada akar bibit manggis yang dibuktikan dengan terdeteksinya gen rolB 780 bp pada gel elektroforesis. 3. Anatomi akar bibit manggis hasil inokulasi strain ATCC-15834 menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang dan total luasan xilem akar yang lebih besar serta menghasilkan pertumbuhan rambut akar yang lebih baik serta serapan hara (N dan P) daun, dan kandungan hormon IAA, semakin tinggi. 5.

Induksi perakaran eksplan tunas manggis secara in vitro dengan A. rhizogenes mampu menginduksi terbentuknya akar adventif pada tempat inokulasi. Strain

509, 07-20001, dan ATCC-15834 yang diinokulasikan

pada eksplan manggis dengan biji dapat menginduksi terbentuknya akar dan mampu tumbuh hingga 75 % pada tahap aklimatisasi. Sedangkan eksplan manggis tanpa biji yang diinokulasi A. rhizogenes strain 509, 07-20001, ATCC-15834, R1000, A4 dan ATCC-8196 dapat menginduksi perakaran tetapi tidak mampu tumbuh pada tahap aklimatisasi. 6. Hasil anatomi akar menunjukkan bahwa inokulasi A. rhizogenes strain 509 pada kultur in vitro menghasilkan rata-rata diameter pembuluh xilem, jumlah total pembuluh xilem, luas serapan permukaan sayatan melintang, total luasan sayatan melintang dan rasio (luas serapan / total luasan sayatan melintang) yang lebih besar dibandingkan dengan bibit manggis yang tidak diinokulasi (kontrol).

Saran 1. Bakteri A. rhizogenes strain ATCC-15834 pada konsentrasi OD600=1.0 dapat memperbaiki sistem perakaran bibit

manggis dan berpotensi untuk

diaplikasikan dengan diinokulasi pada saat bibit manggis umur 6 minggu dengan metode akar dipotong. Sedangkan untuk induksi perakaran secara in vitro A. rhizogenes yang berpotensi digunakan adalah strain 509. 3. Bibit manggis yang telah terintegrasi T-DNA dari A. rhizogenes perlu diamati lebih lanjut untuk mengetahui bagaimana pertumbuhan bibit manggis tersebut setelah dipindahkan ke lapangan.

DAFTAR PUSTAKA

Aoki T, Matsumoto H, Asako Y, Matsunaga Y, Shimomura K.1997. Variation of alkaloid productivity among several clones of hairy roots and regerated plants of Atropa belladonna transformed with Agrobacterium rhizogenes 15834. Plant Cell Rep 16. 282-286. Anwaruddin MJ, Soetarto I, Soegito Y. 1991. Stimulasi pertumbuhan semai manggis (Garcinia mangostana L.). J Hort 2 : 8-12. Armitage P, Walden R, Draper J. 1987. Plant genetic transformation and gene expression. University of Leicester. p 1-38 Bassil NH, Proebsting WM, Moore LW, Lightfoot DA. 1991. Propagation of Hazelnut Stem Cutting Using Agrobacterium rhizogenes. Hort Sci 26(8) : 1058-1060. Brandl M, Clark EM, Lindaow SE. 1996. Characterization of the indole-3-acetic acid (IAA) biosynthetic pathway in an epiphytic strain of Erwina herbicola and IAA production in vitro. Can. J. Microbiol. 42:586-592. Caboni E, Lauri P, Tonelli M, Falasca G, Damiano C. 1996. Root induction by Agrobacterium rhizogenes in walnut. Plant Sci 118:203-208. Campbell NA, Reece JB, Mitchell LC. 2000. Biologi. Jilid II. Penerbit Erlangga. Castillo CO, Chalmers KJ, Waugh R, Powell W. 1994. Detection of genetic diversity and selective gene introgression in coffee using RAPD markers. Theor. Appl. Genet. 87 : 934-938. Charity JA, Holland L, Donaldson SS, Grace L, Walter C. 2002. Agrobacterium-mediated transformation of Pinus radiata organogenic tissue using vacuum-infiltration. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. Vol 70 (1). 51-60. Chriqui D, Anne SE, Walter SE, Els P, Henry VO. 1996. Rol Genes and Root Initiation and Development. J. Plant and Soil 187:47-55. Churiyah. 2005. Protein bioaktif dari bagian tanaman dan akar transgenik Cucurbitaceae dan aktivitas antiproliferasi galur sel kanker in vitro. [Disertasi]. Program Pascasarjana. IPB. Cox JEK. 1988. Garcinia mangostana-Manggosteen. p 361-375. In Gardner, R.J and S.A. Chaudori (eds.). The Propagation of Tropical Fruit Trees. FAO and CAB, England.

Cruz FSD. 2001. status report on genetic resources of mangosteen (Garcinia mangostana L) in Southeast Asia. IPGRI. India Cutter EG, Feldman LJ. 1970. Trichoblasts in Hydrocharis, origin, differentiation, dimensions and growth. Am. J. Bot. 57: 190-201. Damiano C, Archilletti T, Caboni E, Lauri P, Falasca G, Mariotti D, Ferraiolo G. 1995. Agrobacterium-mediated transformation of almond: in vitro rooting through localized infection of A. rhizogenes. W.t. Acta Hort 392:161-169. Damiano C, Monticelli S. 1998. In vitro fruit trees rooting by Agrobacterium rhizogenes wild type infection. Plant Biotechnol Vol 1 No 3. Davies PJ. 2004. Plant hormones Biosynthesis, signal transduction, action. Kluwe Academic Publishers. de la Riva G, Gonzàlez-Cabrera R, Vázquez-Padrón R. 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. Electronic Journal of Biotechnology Vol.1 No.3. Departemen Pertanian. 2005. Ekspor komoditas utama subsektor hortikultura. Pusat Data dan Informasi Pertanian. http//www. deptan.go.id. Ergűn N, Topcuoğ ŞF, Yildiz A. 2002. Auxin (Indole-3-acetic acid), gibberellic acid (GA3), Abscisic Acid (ABA) and cytokinin (Zeatin) production by some species of mosses and lichens. Turk J Bot (26) : 13-18. Ermayanti TM, Imelda M, Tajuddin T, Kubota C, Kozai T. 1999. Growth promotion by controlling the in vitro environment in the micropropagation of tropical plant species. Proceedings of the Tokyo International Forum on Conservation and Sustainable Use of Tropical Bioresources. November 9-10. NED, JBA. Japan. p 10-25. Ermayanti TM, Al Hafiizh E, Rahmawati S, Aryanti. 2002. Transformasi Artemisia cina dan Artemisia annua dengan Agrobacterium rhizogenes. Makalah Seminar MIPA III. FMIPA-ITB. Bandung. 21-22 Oktober 2002. Fahn A.1995. Anatomi tumbuhan. Gadjah Mada University Press. Gelvin SB, Schilperoort RA, Verma DPS. 1988. Kluwer Academic Publishers. Dordrecht.

Plant molecular biology.

Gilroy S, Jones DL. 2000. Through form to function: root hair development and nutrient uptake. Trends in plant science. Reviews. Vol. 5 No. 2 : 56 -60. Giri A,

Narasu ML. 2000. Transgenic hairy root : Recent trends and applications. Biotechnology Advances 18 : 1-22.

Goh HKL, Rao AN, Loh CS. 1990. Direct shoot bud formation from leaf explants of seedings and mature mangosteen (Garcinia mangostana L) trees. Plant Sci 68:113-121. Gunawan LN. 1988. Teknik kultur jaringan. PAU Bioteknologi, IPB. Bogor. Hamill JD, Rounsley S, Spenser A, Todd G, Rhodes MJC. 1991. The use of polymerase chain reaction in plant transformation studies. Plant Cell Reports. 10 : 221-224. Han KH, Gardon MP, Strauss SH. 1997. High-Frequency Transformation of Cottonwoods (Genus Populus) by Agrobacterium rhizogenes. Can. J. For. Res. 27:464-470. Harahap F. 2005. Induksi variasi genetik tanaman manggis (Garcinia mangostana L.) dengan radiasi sinar gamma. [Disertasi] Bogor. Sekolah Pasca Sarjana. Institut Pertanian Bogor. Harran S, Tjondronegoro PD. 1992. Dasar-dasar fisiologi tumbuhan. Antar Universitas Ilmu Hayat. IPB. 427 p.

Pusat

Hidayat EB. 1995. Anatomi Tumbuhan Berbiji. Penerbit ITB Bandung. 275 p. Hidayat R, Poerwanto R, Yahya S, Winata LW. 1999. Studi aplikasi IBA dan Triakontanol terhadap pertumbuhan bibit semai manggis dan fukugi. Comm. Ag. 4(2): 74-79. Hidayat R. 2003. Kajian ritme pertumbuhan tanaman manggis (Garcinia mangostana L.) dan faktor-faktor yang mempengaruhi. [Disertasi]. Bogor. Program Pascasarjana, Institut Pertanian Bogor. Hiei Y, Komari T, Kubo T. 1997. Transformation of rice mediated by Agrobacterium tumefaciens. Plant Mol. Biol. 35:205-218. Him KWR, Rudi JS, Gary AS. 1987. Factors influencing root formation in dicot by Agrobacterium rhizogenes. Can. J. Bot. Vol. 66 : 642-644. Jacobsen S. 2003. Molecular and in situ characterization adventitious of root development in pinus contorta. Thesis Ph.D. http://www.mcdb.ucla.edu /research /Jacobsen/ AVH % 200124. html (20/8/2003). Jeng-Sheng H. 2001. Plant pathogenesis and resistance. Kluwer Academic Publishers. London. 261-265 Klee H, Horsch R, Rogers S. 1987. Agrobacterium mediated plant transformation and its further application to plant biology. Plant Physiol 38 : 467-486 Lakitan B. 1995. Fisiologi pertumbuhan dan perkembangan tanaman. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta. p 218

Lambert C, Tepfer D. 1991. Use of Agrobacterium rhizogenes to Create Chimeric Apple Trees Through Genetic Grafting. Biotechnology. Vol 9. January 1991. Leuschner C, Hertel D. 2003. Pelatihan fisiologi tumbuhan bagi dosen PTN dan PTS se-Jawa, Sumatera dan Sulawesi. Kerjasama antara FMIPA-IPB dan Bagian Proyek Peningkatan Kualitas Sumberdaya Manusia. Direktorat Jenderal Pendidikan Tinggi. Departemen Pendidikan Nasional. Bogor, 1-11 Oktober 2003. Leyval C, Berthelin J. 1989. Influence of acid-producing Agrobcterium and Laccaria laccata on pine and beech growth. Nutrient uptake and exudation. Agr. Ecosys. Environ. 28: 313-319. Li M, Leung DWM. 2003. Root induction in radiate pine using Agrobacterium rhizogenes. Plant Biotechnol Vol 6 No 3. Lukman R. 1996. Pengaruh kinetin, lama induksi dalam IBA dan konsentrasi sukrosa terhadap pertumbuhan dan perkembangan akar eksplan tunas manggis (Garcinia mangostana L.) dalam kultur in vitro. [Skripsi] Bogor. Jurusan Budidaya Pertanian. IPB. p 59 McAfee BJ, White EE, Pelcher LE, Lapp MS. 1993. Root induction in pine (Pinus) and Larch (Larix) spp. Using Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell, Tissue and Organ Culture. 34:53-62. Macrae S, Staden JV. 1993. Agrobacterium rhizogenes mediated transformation to improve rooting ability of eucalypts. Tree Physiol 12: 411-418. Manulis S, Chesner AH, Brandl MT, Lindow SE, Barash I. 1998. Differential involvement of indole-3-acetic acid biosynthetic pathways in pathogencity and epiphytic fitness of Erwinia herbicola pv. Gypsophilae. Molec. PlantMicrobe Interac. 11:623-642. Masri M, Azizah H, Razi IM, Mamat AS. 1998. Arbuscular mycorrhiza enhances growth and reduces the nursery period of mangosteen (Garcinia mangostana L.) seedlings. J Trop Agric and Fd Sc 26 (1) :7-15 McAfee BJ, White EE, Pelcher LE, Lapp MS. 1993. Root inducion in pine (Pinus) and larch (Larix) spp. Using Agrobacterium rhizogenes. Plant Cell Tissue Organ Cult 34: 53-62. Mihaljević S, Stipković S, Jelaska S. 1996. Increase of root induction in Pinus nigra explants using agrobacteria. Plant Cell Reports 15: 610-614. Muas I, Anwaruddin MJ, Herizal Y. 2002. Pengaruh inokulasi cendawan mikoriza arbuskula terhadap pertumbuhan bibit manggis. J Hort 12 (3):165-171.

Nakamura. 1995. Method for cell and tissues observation. P 15-21. In T. Hasiba and K. Hinata (Eds). A Manual Experiment for Plant Biology. Tokyo:Soft science publication. Nakasone HY, Paull RE. 1999. Tropical Fruits. Crop Production Science in Horticulture. p 359 – 369. Nilson O, Olsson O. 1997. Geeting to the root : The role of Agrobacterium rhizogenes rol genes in the formation of hairy roots. Physol Plant 100 : 463-473. Owens LD, Smigocki AC. 1988. Transformation of soybean cell using mixed strains of Agrobacterium tumefasciens and phenolic compounds. Plant Physiol 88 : 570 – 573. Patena L. Sutter EG, Dandekar AM. 1988. Root induction by Agrobacterium rhizogenes in a difficult-to-root woody species. Acta Hort. 227: 324-329. Pertamawati. 1994. Pengaruh IBA dan Phloroglucinol terhadap pertumbuhan dan perkembangan pucuk manggis (Garcinia mangostana L.) dalam kultur in vitro. [Tesis]. Program Pascasarjana IPB. p 74. Pertamawati. 2003. Kajian pertumbuhan planlet manggis (Garcinia mangostana L.) yang dikulturkan secara in vitro dan semiaseptik dalam keadaan fotoautotrof. [Ringkasan Disertasi]. Program Pascasarjana. IPB. 27 p. Poerwanto R, Inoue H, Kataoka I. 1989. Effect temperature on the morphology and physiology of root of trifoloate orange budded with satsuma mandarin. J. Japan. Soc. Hort. Sci. 58(2) : 267-274. Poerwanto R, Darusman LK, Sari CID. 1998. Screening of mycorrhizae to enhance the growth rate of mangosteen seedling. Paper presented in the symposium and 1998 spring meeting of Japanese Society for Horticultural Science in Commemoration of 75th Universary, Tokyo, Japan. 10 p. Poerwanto R. 2000. Teknologi Budidaya Manggis. Makalah. Diskusi Nasional Bisnis dan Teknologi Manggis. Bogor. 15-16 Nov. Powell BS, Morel P, Huang Y, Kado C. 1989. An Agrobacterium positif regulatory DNA-binding protein is phosphorylated in vitro. In Molecular Biology Plant Pathogen. 14 p. Purnamaningsih R. 2006. Intoduksi gen DefH9-iaaM dan DefH9-RI-iaaM melalui vektor Agrobacterium tumefaciens untuk meningkatkan produksi tanaman tomat. [Disertasi] Bogor. Sekolah Pascasarjana. IPB. 156 p. Rais M, Mansyah E, Lukitariati S, Anwaruddin MJ. 1996. Peningkatan efisiensi teknologi usahatani manggis. Pusat Penelitian Buah. Pusat Penelitian dan Pengembangan Pertanian, Departemen Pertanian. 40 p.

Ramlan MF, Mahmud TM, Hasan BM, and Karim MZ. 1992. Studies on photosynthesis on young mangosteen plants grown under several growth conditions. Acta. Hort. 321: 482-489. Riva GA, González-Cabrera J, Vázquez-Padrón R, Ayra-Pardo C. 1998. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. EJB Electronic Journal of Biotechnology Vol. 1. No. 3. Roostika I, Sunarlim N, Mariska I. 2005. Mikropropagasi tanaman manggis (Garcinia mangostana). J. AgroBiogen. 1(1) : 20-25. Rugini E, Pellegrineschi A, Mencuccini M, Mariotti D. 1991. Increase of rooting ability in the woody species kiwi (Actinidia deliciosa A. Chev.) by transformation with Agrobacterium rhizogenes rol genes. Plant Cell Rep. 10:291-295. Salisbury FB, Ross CW. 1995. Fisiologi tumbuhan. Penerbit ITB. Bandung. 343 p Sambrook JE, Frits T, Maniatis. 1989. Molecular cloning. A Laboratory Manual. New York. Siswanto, Budiani A, Chaidamsari T, Darussamin A. 1997. Ekspresi gen transien GUS pada tahap awal transformasi genetik tanaman kopi melalui Agrobacterium tumefaciens. Prosiding Seminar Perhimpunan Bioteknologi Pertanian Indonesia. Surabaya. Hal : 149 -157. Slightom JL, Durand-Tardif M, Jouanin L, Tepfer D. 1986. Nucleotide sequence analysis of the TL-DNA of Agrobacterium rhizogenes agropin type plasmid. J.Biol.Chem. 261:108-121. Strobel GA, Nachmias A. 1985. Agrobacterium rhizogenes promoter the initial growth of bare root stock almond. J. of General Microbiology 131, 1245 – 1249. Strobel GA, Nachmias A, Hess W M. 1988. Improvements in the growth and yield of olive trees by transformation with the Ri plasmid of Agrobacterium rhizogenes. Can. J. Bot. 66: 2581-2585. Suastuti. 1998. Pemanfaatan hasil samping industri pertanian (molase dan limbah cair tahu) sebagai sumber carbón dan nitrogen untuk produksi biosurfaktan oleh Bacillus sp. Galur comercial dan local. [Tesis] Bogor. Program Pascasarjana. IPB. 70 p Suhartono MT, Suwanto A, Likuma MY. 1994. Identification by pulsedfield gel electrophoresis of protease-producing bacteria isolated from liquid tofuwaste. Asia Facific Journal of Molecular Biol and Biotechnol. 2 (3): 193-199. Sutter EG, Luza J. 1993. Developmental anatomy of roots induced by Agrobacterium rhizogenes in Malus pumila ‘M26’ shoot grown in vitro. Int J Plant Sci 154:59-67.

Taiz L, Zeiger E. 2002. Plant physiology. Sinauer Associates, Inc. Sunderland, Massachusetts. Tan F. 1997. Transformasi kentang kultivar Atlantic dengan gen protein selubung potato virus y dan kloning gen protein selubung potato virus x. [Disertasi] Bogor. Program Pascasarjana. IPB. Tirtawinata MR, E Wijaya , Tuherkih. 2000. Pembibitan dan pembudidayaan manggis. Penebar Swadaya. Jakarta. Te-chato S. 1997. Tissue culture of mangosteen (Garcinia mangostana L) Pawa (G. speciosa Wall) and Somkhag (G. atroviridis Griff.) Songklanakarin. J Sci. Technol. 19(2) : 147-155. Triatminingsih R. Karsianah dan E Nazir. 1995. Pertumbuhan dan perkembangan beberapa macam eksplan manggis (Garcinia mangostana L.). Prosiding seminar hasil penelitian Bioteknologi II. Puslitbang Bioteknologi LIPI, Cibinong. Bogor. 84–90 p. Valpuesta V. 2002. Fruit and vegetable biotechnology. CRC Press. Boca Raton Boston New York Washington, DC. 338 p. van der Salm T P M, Hänisch ten Cate C H, Dons H J M.1996. Prospects for application of rol genes for crop improvement. Plant Molecular Biology Reporter 14: 207-228. Verheij EWM. 1992. Garcinia mangostana L. p: 177-181 in E W M Verheij dan R E Coronel (Edt.) Edible fruit and nuts. PROSEA 2. Bogor. 446 p. Waisel Y, Eshel A, Kafkafi U. 2002. Plant roots : the hidden half. Marcel Dekker, Inc. New York. Wattimena GA. 1988. Zat pengatur tumbuh tanaman. Pusat Antar Universitas. Institut Pertanian Bogor. 145 p Wattimena GA. 2006. Kecendrungan marjinalisasi peran kultur jaringan dalam pemuliaan tanaman. Orasi Purnabakti, Guru Besar Fakultas Pertanian. Institut Pertanian Bogor. Bogor. Werbrouck SPO, Debergh PC. 1994. Apllied aspect of regeneration. 6A. Micropropagation. Di dalam: Dixon RA, Gonzales RA, editor. Plant cell culture. A practical approach. Oxford University Press. 127-135 p. White FF, Taylor BH, Huffman GA, Gordon MP, Nester EW. 1985. Molecular genetic analysis of the transferred DNA regions of the root inducing plasmid Agrobacterium rhizogenes. J Bacteriol 164 (1) : 33-44. Whiteman RH, Scheffer R, Strobel GA. 1988. Foctors influencing root formation in dicots by Agrobacterium rhizogenes. Can. J. Bot. 66 : 642 – 644.

Wible J, Chacko EK, Downtown WJS. 1992. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) A Potential Crop for Tropical Northern Australia. Acta Hor 321:132137. Winans SC. 1992. Two-way chemical signaling in Agrobacterium-plant interaction. Microbiologcal Reviews 56 (1): 12-31 Yaacob O, Tindall HD. 1997. Mangosteen cultivation. Diterjemahkan oleh Anwarudin MJ, Muas I dan Mansyah E. Balai Penelitian Tanaman Buah Solok. 100 p. Yusnita. 2003. Kultur jeringan cara memperbanyak tanaman secara efisien. Agromedia Pustaka. 105 p. Zambryski P, Tempe J, Schell J. 1989. Transfer and function of T-DNA genes from Agrobacterium Ti and Ri plasmid in plants. Cell 56:193-201. Zhu LH. 2001. Transformation of the apple rootstocks M.9/29 with the rolB gene and its influence on rooting and growth. Plant Sci. 160:433-439.

Lampiran 1. Metode Perhitungan Anatomi Akar Bibit Manggis


(1)

(2)

(3)

(4)

Rata-rata diameter pembuluh xilem*) (µm)

Jumlah total pembuluh xilem pada sayatan melintang*)

Luas serapan permukaan sayatan melintang (µm 2)

Total luasan sayatan melintang**)

Rasio = (3) (4)

Perhitungan :

Luas serapan = permukaan sayatan melintang (3)

rata-rata diameter xilem

2

x π x total pembuluh pada sayatan penampang melintang (2)

2

Total luasan sayatan melintang (4) =

2

πr

à π = 3.14 r = jari-jari sayatan melintang

Rasio =

perhitungan (3) Total luasan sayatan melintang

Keterangan :

*)

Perbesaran 40X

**)

Perbesaran 10X

Lampiran 2. Pembuatan larutan Scanning Electron Microscop (SEM)

Pembuatan larutan stok bufer cacodilat 0.2 M Melarutkan sebanyak 42 8 g sodium cacodilat trihidrat (Na (CH,)2As2O3 dengan akuades sehingga volume larutan menjadi 1000 ml Pembuatan working solution Sebanyak 50 ml larutan stok + 5,4 ml 0 1 M HCI dan ditambahkan akuades sehingga volume menjadi 200 ml, sehinga, didapat larutan ber pH 7,4. Formula Larutan Glutaraldehid 2%. 9 ml tarutan bufer sodium cacodilat + I ml glutaraldehid Larutan glutaraldehid harus dibuat segar, dari larutan stok glutaraldehid 20%. Formula Larutan Tannic Acid 2% Ditimbang 2 g tannic acid kemudian ditambahkan bufer sodium cacodilat sehingga volume larutan menjadi 100 ml Larutan tannic acid harus dibuat dalam keadaan segar

Lampiran 3. Komposisi larutan dan bahan-bahan yang digunakan untuk isolasi DNA, PCR dan elektroforesis (Sambrook et al. 1989). I. Ekstraksi/isolasi DNA 1. Larutan CTAB 10 % NaCl 4,1 gr. CTAB 10 gr Larutkan dengan aquades hingga 100 ml. 2. Buffer tris-Hcl 1 M pH 8,0 Tris base 12,11 gr HCl pekat 4,2 ml Akuades 80 ml Atur pH larutan hingga 8,0 volume total 100 ml dan sterilisasi (otoklaf) 3. Larutan EDTA 0,5 M pH 8,0. EDTA 18,61 ml NaOH 2,0 ml Akuades 80 ml Atur pH larutan hingga 8,0 volume total 100 ml dan sterilisasi (otoklaf) 4. NaCl 5 M NaCl 29,22 gr Larutkan dengan aquades hingga volume 100 ml dan sterlisasi dengan otoklaf. 5. Etanol 70% Etanol 70 ml Akuades 30 ml Simpan dalam lemari es. 6. Isopropanol dingin. 7. Buffer ekstrak (Doyle dan Doyle, 1987) Larutan CTAB 10 % 5 ml Larutan EDTA 0,5 M pH 8,0 = 1 ml. Buffer tris-HCl 1 M pH 8,0 = 2,5 ml NaCl 5 M = 7,5 ml. Akuades steril = 8,35 ml Mercaptoetanol = 0,75 ml 8. Kloroform : isoamil alkohol ( 24 : 1) Kloroform 48 ml Isoamil alkohol 2 ml. 9.Natrium asetat

3 M pH 5,2

10. Buffer phenol. 0,2 gr hidroquinon dalam 20 ml phenol, Kloroform : isoamil alkohol (24 : 1) Kedua bahan dicampur dengan perbandingan 1 : 1

II. Pembuatan RNAse 10 mg/ml (dalam Na asetat 0,01 M pH 5,2) Timbang 0,01 g RNAse (SIGMA) masukan kedalam tabung 1,5 ml kocok dan panaskan pada suhu 100 oC selama 15 menit. Dinginkan pada suhu kamar dan tambahkan 100 µl ( 1/10 v) Tris-Cl pH 7,4 simpan pada suhu – 20oC. III. Pereaksi PCR 1. PCR kit ( PCR core system ) ( PROMEGA) Buffer reaksi MgCl2 25 nM PCR nukleotida (dNTP) 2,5 mµ Tag DNA polimerase 2.Primer 1 dan 2 3.DNA sampel 50 ng 4.H 2O (bebas ion) 5.Mineral oil 20 µl IV. Elektroforesis. 1. Buffer TAE 50 X Tris base : 24,2 g Asam asetat glacial : 5,7 ml EDTA 0,5 M pH 8,0 : 1 ml Larutkan dengan akuades hingga 100 ml 2. Ethidium bromida 1% Et br 1 ml Akuades 99 ml 3. Pembuatan gel agarose 0.8%

Lampiran 4. Penetapan kandungan nitrogen dengan metode semi-mikro kjeldahl

Pereaksi

:

1. 2. 3. 4.

H 2SO4 99% Campuran selen (K2 SO 4 : Cu SO4 : selenium = 50 : 10 :1) H3BO 3 4% Indikator con way (0,3 g Bromoresol hijau + 0,2 gr metil merah) + etanol 90%. 5. NaOH 50 %.

Cara kerja :

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

Masukan 0,2 contoh kedalam kjeldahl Tambahkan 0,2 g campuran selenium Tambahkan 5 ml H2SO 4 99% Tambahkan parafin cair 5 tetes Destruksi pada suhu 300oC sampai berwarna jernih kehijauan. Dinginkan dan tambahkan 50 ml akuades. Masukan kedalam labu penyuling (labu didih), tambahkan 20 ml NaOH 50 %. Kemudian disuling segera Hasil sulingan (amoniak) ditampung dengan 10 ml H3BO 3 4%, ditambahkan 5 tetes indikator con way Titrasi sampai titik akhir dengan 0,3 N HCl

Perhitungan : Kadar N total = (Vc – Vb) x N x 14 mg contoh

x 100 %

Keterangan : Vc . Vb = ml peniter contoh dan blangko. N = kenormalan. 14 = berat atom nitrogen.

Lampiran 5. Penetapan kandungan P dan K dengan metode pengabuan. Pereaksi

:1. HCl 12 N dan 1 N. 2. Pelarut Pb (a) larutan 3,8 g amoniak molibdat dalam 30 ml pada suhu 60 oC dinginkan, saring. (b) larutkan 5 g H3BO 3 dalam 500 ml air lalu ditambahkan 75 ml HCl. (c) campurkan a dan b kemudian encerkan menjadi 1000 ml. 3. Larutkan pereduksi : campuran dan giling bersama-sama 2,5 g 1-amino-2-napthal-4-sulfanic acid, 5 g Na2So 4 dan 146 gr Na2S2O5 hingga menghasilkan serbuk pereduksi. Ambil 8 gr serbuk pereduksi tersebut kemudian masukan kedalam 50 ml air panas, biarkan selama 16 jam hingga menghasilkan larutan pereduksi.

Cara kerja

: 1. Masukan 1 g contoh kedalam cawan porselin. 2. Masukan ke alat pemanas “muffle” pemanas pada suhu 550 oC selama 2 jam sejak panas konstan. 3. Dinginkan kemudian tambahkan 5 tetes HCl pekat 12 N, aduk sampai rata, diamkan sampai kering. Ulangi sebanyak 3 kali. 4. Tambahkan 10 ml HCl 1 N kocok sampai kering. 5. Pipet 1 ml, masukan ke dalam labu ukur 50 ml. 6. Untuk penetapan kandungan K, ambil 5 ml kemudian ukur dengan alat flame fotometer. 7. Untuk penetapan kandungan P, ambil 5 ml tambahkan pelarut (b) 5 ml tambahkan larutan pereduksi 5 ml kemudian kandungan P diukur dengan alat spektrophotometer uv-vis.

Lampiran 6. Prosedur analisis hormon IAA ( Ergün et al. 2001)

1 g akar segar diekstrak (60 ml) (MeOH : CHCl3 : 2N NH4OH, 12 : 5 :3 v/v/v) + 25 ml aquades

Fase kloroform Dibuang

Fase air

Atur pH 2.5 dan ekstrak 3x dengan etil asetat (15 ml)

etil asetat (IAA bebas)

Evaporasi Fase air TLC (sistem pelarut : i-PrOH : NH4OH: H2O 10 : 1: 1 v/v/v)

Atur pH 11, dihidrolisis 1 jam suhu 70oC

Fase air

Dilarutkan dgn metanol Spektrofotometer 222 nm / 280 nm

Fase air Atur pH 2.5 dan ekstrak 3x dengan etil asetat (15 ml)

etil asetat (IAA terikat)

Evaporasi Fase air (dibuang)

TLC (sistem pelarut : i-PrOH : NH4OH: H2O 10 : 1: 1 v/v/v) Dilarutkan dgn metanol Spektrofotometer 222 nm / 280 nm

PENINGKATAN PERAKARAN BIBIT MANGGIS (Garcinia mangostana L.) MELALUI INOKULASI Agrobacterium rhizogenes L I Z A W A T I

Recommend Documents