ISSN 0216 - 3128
94
Gina Mondrida, dkk.
OPTIMASI PENANDAAN CA 15.3 DENGAN NA125I PRODUKSI PRR SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 15.3 Gina Mondrida, Puji Widayati, Siti Darwati, Sutari, Agus Ariyanto, V. Yulianti, W. Lestari. Pusat Radioisotop dan Radiofarmaka – BATAN, Kawasan PUSPIPTEK Serpong
ABSTRAK OPTIMASI PENANDAAN CA 15.3 DENGAN Na125I PRODUKSI PRR SEBAGAI PERUNUT KIT IRMA CA 15.3. Perunut CA15.3 (CA15.3-125I) merupakan salah satu pereaksi utama dalam Kit IRMA CA15.3 yang digunakan pada deteksi dini kanker payudara. Kanker payudara merupakan penyebab kematian nomor dua untuk perempuan di Indonesia. Sebenarnya, kanker payudara merupakan salah satu jenis kanker yang dapat dideteksi secara dini. Salah satu cara yang dapat digunakan untuk deteksi dini kanker payudara adalah dengan menggunakan kit IRMA (immunoradiometricassay) CA 15.3. Agar dapat memproduksi perunut CA15.3 (CA15.3-125I) yang bermutu baik sebagai salah satu komponen pereaksi Kit IRMA CA15.3, pada penelitian ini telah dilakukan penandaan CA15.3 dengan Na125I produksi PRR (hasil reduksi), menggunakan oksidator Kloramin-T. Terhadap masing-masing hasil penandaan dilakukan penentuan yield (% penandaan), aktivitas jenis, kemurnian radiokimia, dan immunologi (B/T). Perunut CA15.3 (CA15.3-125I) yang didapat dari hasil penandaan monoklonal CA15.3 jenis M37901M dengan Na125I PRR (hasil reduksi) mempunyai kualitas yang baik dengan yield (% penandaan) sebesar 47,03%, aktivitas jenis 22,57 µCi/µg, kemurnian radiokimia 97,5% dan immunologi (B/T) sebesar 19,86% yang dapat digunakan sebagai perunut kit IRMA CA 15.3. Kata kunci: immunoradiometricassay, kanker payudara, tumor marker, CA-15.3, perunut.
ABSTRACT CA 15.3 LABELING OPTIMATION WITH Na125I PRODUCTED BY PRR AS CA 15.3 IRMA KIT TRACER. CA 15.3 tracer (CA 15.3-125I) is one of the main reagents in the CA 15.3 IRMA kit used in early detection of breast cancer. Breast cancer is the second cause of death for women in Indonesia. Actually, breast cancer is one type of cancer that can be detected early. One method that can be used for early detection of breast cancer is by using CA 15.3 IRMA (immunoradiometricassay) Kit. For producing a good quality CA15.3 tracer (CA 15.3-125I) as one component of reagent CA 15.3 IRMA Kit, in this research the CA 15.3 are labeled with Na125I produced by PRR (result of reduction) employing Cloramin-T oxidator. The yield of labeling process (%), specific activity radiochemical purity and immunological (B/T) of CA 15.3-125I tracer were obtained from the results of labelling monoclonal CA15.3 of M37901M with Na125I PRR (the reduction) have good quality, the yield (of labeling) was 47.03%, specific activity was 22.57 µCi/µg, radiochemical purity was 97.5% and immunological (B/T = 19.86%) can be used as a tracer of CA 15.3 IRMA Kit. Key word: immunoradiometricassay, breast cancer, tumor marker, CA-15.3, tracer .
PENDAHULUAN
B
erdasarkan data dari Yayasan Kanker Indonesia (YKI), kanker payudara merupakan penyebab kematian nomor dua untuk perempuan di Indonesia, pada hal kanker payudara adalah salah satu jenis kanker yang dapat dideteksi secara dini. Namun tingkat kesadaran masyarakat yang rendah untuk melakukan deteksi dini telah menyebabkan jenis kanker ini lebih sering ditemukan pada stadium lanjut yang sulit untuk ditangani [1]. Senyawa Carbohydrate Antigen 15.3 (CA 15.3) dengan berat molekul antara 300.000-450.000 dalton adalah gabungan glycoprotein heterogeneous. Senyawa ini ditemukan dalam serum individu normal dengan konsentrasi di bawah 35 U/mL, sedangkan pada penderita kanker konsentrasi senyawa ini
meningkat lebih tinggi dibadingkan dengan individu normal. Senyawa ini dapat bereaksi dengan monoklonal antibodi CA 15.3. Oleh sebab itu senyawa CA 15.3 dapat digunakan sebagai tumor marker yang penentuan kadarnya dapat dilakukan dengan teknik IRMA (Immunoradiometricassay) [2,3]. Dalam IRMA hasil reaksi yang terjadi antara antigen dan antibodi diukur dari radiasi yang dipancarkan oleh radioisotop penanda antibodi [3]. Secara teoritis molekul yang ditandai akan mempunyai sifat immunoreaktif yang sama dengan molekul aslinya. Sebagai radioisotop penanda pada umumnya digunakan 125I yang mempunyai beberapa keuntungan, antara lain: mudah berikatan dengan molekul organik terutama yang mengandung gugus tirosil seperti protein maupun molekul yang lebih
Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2011 Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 19 Juli 2011
Gina Mondrida, dkk.
ISSN 0216 - 3128
kecil seperti tiroksin pada peptida dan hasil penandaan yang diperoleh dapat mempunyai kemurnian serta aktifitas jenis yang tinggi. Selain itu 125 I merupakan pemancar γ berenergi rendah (35keV) yang dapat dideteksi dengan kebanyakan alat cacah dengan efisiensi tinggi, serta waktu paruhnya cukup panjang, yaitu 60 hari [4]. Penandaan CA15.3 dengan 125I dilakukan secara langsung dengan menggunakan oksidator kloramin-T. Pada iodinasi secara langsung dengan menggunakan oksidator tersebut akan terjadi oksidasi 125 I menjadi kation 125I+, yang dalam suasana basa lemah segera bereaksi dengan gugus tirosil pada rantai polipeptida. Atom iodium akan mengisi posisi orto dari gugus fenol pada gugus tirosil. 125 125 + I I + 2e
95
Tujuan penelitian ini adalah untuk mendapatkan perunut CA15.3 (CA15.3-125I) sebagai salah satu komponen kit IRMA CA15.3 dengan mutu yang baik, yang dapat digunakan untuk deteksi dini kanker payudara.
TATA KERJA Bahan dan peralatan Bahan yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah monoklonal CA 15.3 (Biodesign International USA), Human CA 15.3 antigen calibrator grade (Biodesign International USA), kit IRMA CA 15.3 (CIAE China), NaH2PO4.H2O dan Na2HPO4 (Merck), kolom kromatografi PD-10 (Pharmacia), Na125I (PRR, BATAN), tabung reaksi polipropilen (NUNC Swedia) dan Bovin Serum Albumin, BSA ( Sigma ), Alat yang digunakan dalam penelitian ini diantaranya adalah pencacah Gamma (600 Gammatec II The Nucleus dan Mini Assay tipe G 20), berbagai ukuran pipet (Eppendorf) beserta tipnya, pH meter (Fisher Accumet model 810), pengaduk (Vortex), incubator (Soft Incubator SL 16000), timbangan analitik (Mettler AE 160)
Penandaan monoklonal antibodi CA 15.3 dengan Na125I menggunakan metode Kloramin-T. Gambar 1. Reaksi radioiodinasi langsung. Kondisi oksidasi 125I- tidak boleh terlalu kuat karena beberapa ikatan asam amino akan turun teroksidasi dan rantai peptida terputus, sehingga perunut akan cepat rusak. Penambahan dapar diperlukan untuk menetralkan larutan Na125I yang pada umumnya diberikan dalam larutan NaOH. Penggunaan salah satu oksidator pada penandaan mempunyai kelebihan atau kekurangan dari oksidator lain. Sebagai contoh oksidator iodogen mempunyai daya oksidasi lebih lemah dari kloramin-T[5]. Perlu diketahui bahwa iodium jarang terdapat secara alami dalam molekul protein, dan adanya sebuah atom iodium yang sama besar dengan satu cincin benzen dapat mempengaruhi sifat fisiologi dan imunologi dari protein tersebut. Dalam beberapa hal protein yang ditandai dengan iodium mempunyai kecendrungan kurang stabil bila dibanding dengan protein aslinya[5]. Kualitas dan stabilitas dari hormon / protein yang ditandai dengan 125I dapat dipengaruhi oleh beberapa faktor antara lain kemurnian hormon / protein yang akan ditandai, kondisi pada waktu proses iodinasi, prosedur pemurnian setelah iodinasi dan penyimpanan hasil penandaan.
Optimasi penandaan CA 15.3 dilakukan dengan variasi jenis monoklonal yang digunakan (M37552M dan M37901M). Ke dalam tabung iodinasi yang berisi larutan 3,5 µL larutan monoklonal anti CA 15.3 ditambahkan 20 µL dapar fosfat 0,5 M pH 7,4 dan 3,3 µL Na+125I (aktivitas ~ +H 1000 µCi). Selanjutnya ditambahkan 10 µL Kloramin-T (1 mg dalam 1 mL dapar fosfat 0,25 M pH 7,4). Campuran kemudian dikocok selama dua menit dengan vortex yang diikuti dengan penambahan 10 µL larutan Na2S2O5 (1 mg Na2S2O5 dalam 1 mL dapar fosfat 0,25 M pH 7,4). Selanjutnya campuran dikocok dengan vortex selama dua menit. Hasil penandaan kemudian dimurnikan dengan menggunakan kolom PD-10 yang telah dikondisikan dengan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4 dan dijenuhkan dengan 1 mL larutan BSA 10%. Produk monoklonal anti CA 15.3 bertanda 125I (selanjutnya disebut perunut ) dielusi dari kolom PD-10 dengan larutan dapar fosfat 0,01 M pH 7,4 dan fraksi eluat ditampung per fraksi dalam tabung reaksi masingmasing sebanyak 500 µL per fraksi (25 fraksi). Tiap fraksi kemudian diukur radioaktivitasnya dengan alat pencacah Gamma (Gamma Management System, GMS).
Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2011 Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 19 Juli 2011
ISSN 0216 - 3128
96
Penentuan penandaan)
yield
(rendemen
hasil (3)
Fraksi yang mengandung antibodi bertanda kemudian dikumpulkan dan dihitung rendemen penandaannya dengan rumus sebagai berikut: (1)
Uji kemurnian radiokimia Uji kemurnian radiokimia antibodi bertanda ditentukan dengan kromatografi lapisan tipis (KLT) dengan fasa diam kertas whatman 1 dan fasa gerak campuran Ethanol: Butanol: NH4OH dengan perbandingan 3:2:1. Rf antibodi bertanda = 0,0. (2)
Penentuan penandaan
Gina Mondrida, dkk.
aktivitas
jenis
hasil
Protocol Assay Tabung coated tube (CT) diberi nomor dan ditambah pengencer standar CA 15.3 sebanyak 150 µL. Sejumlah 50 µL larutan standar 0, 15, 50,125 dan 250 mIU/mL dan sampel ditambahkan ke masing–masing tabung CT yang telah diberi nomor. Vortek hingga homogen dan diinkubasi dua jam pada temperatur 37 oC. Cairan dibuang dan dicuci dengan aquademin dua kali 1000 µL. Sejumlah 200 µL larutan perunut dengan aktivitas ± 200.000 cpm ditambahkan ke masing-msing tabung CT, vortek hingga homogen dan diinkubasi 3 jam pada suhu ruangan. Cairan dibuang dan dicuci dengan aquademin dua kali 1000 µL, kemudian didekantasi. Tabung diukur dengan alat pencacah Gamma selama 1menit
Aktivitas jenis hasil penandaan ditentukan dengan cara sebagai berikut:
HASIL DAN PEMBAHASAN
Gambar 2. Kromatogram hasil penandaan monoklonal antibodi CA 15.3 M37901M dan Ca15.3 M37552M dengan Na125I PRR (hasil reduksi) menggunakan oksidator kloramin-T dan kolom PD-10 serta eluen dapar fosfat 0,01M pH 7,4. Dari hasil penandaan monoklonal CA15.3 jenis M37552M dengan Na125I PRR (belum direduksi) menggunakan oksidator kloramin-T, diperoleh hasil penandaan yang sangat rendah (gagal) dengan kemurnian radiokimia serta aktivitas
jenis yang rendah juga, seperti yang terlihat pada Tabel 1. Hal ini disebabkan karena Na125I yang digunakan masih mengandung iodat, periodat dan sangat encer (aktivitas 34,3 µCi/µL). Sebaiknya dalam pembuatan perunut untuk Kit RIA/IRMA,
Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2011 Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 19 Juli 2011
Gina Mondrida, dkk.
ISSN 0216 - 3128
97
Na125I yang digunakan untuk penandaan harus Dari hasil penandaan monoklonal anti mempunyai kemurnian radiokimia yang tinggi dan CA15.3 jenis M37901M dan M37552M dengan tidak terlalu encer. Jadi untuk penandaan selanjutnya Na125I PRR (hasil reduksi) menggunakan oksidator 125 Na I digunakan, setelah melalui proses reduksi kloramin-T seperti yang terlihat pada Tabel 3, (peningkatan kemurnian kimia iodida) dan diperoleh hasil penandaan tertinggi pada percobaan pemekatan. no.2 sebesar 47,03% dengan kemurnian radiokmia Dari hasil penandaan monoklonal CA15.3 97,5% dan aktivitas jenis 22,57 µCi/µg serta uji jenis M37901M dengan Na125I PRR (hasil reduksi) immunologi (%B/T) = 19,86%. Pada percobaan no.4 dengan menggunakan oksidator kloramin-T, diperoleh hasil penandaan sebesar 27,48% dengan diperoleh hasil penandaan tertinggi 47,03% dengan kemurnian radiokmia 95,8% dan aktivitas jenis 13,19 kemurnian radiokmia 97,5% serta aktivitas jenis µCi/µg serta uji immunologi (%B/T) = 6,61%. Hasil 22,57%, seperti yang terlihat pada Tabel 2. Pada penandaan no.4 lebih rendah dibanding dengan no.2, percobaan no.1 dan no.2 diperoleh hasil penandaan meskipun sudah menggunakan volume Na125I yang yang sangat rendah sebesar 2,2% dan 2,6%. Hal ini sama sebesar 3 µL. Hal ini disebabkan percobaan disebabkan karena Na125I yang digunakan pada no.4 menggunakan monoklonal anti CA15.3 jenis percobaan no.1 dan no.2 masih encer (aktivitas 30 M37552M, yang mempunyai paring yang berbeda µCi/µl dan 34,3 µCi/µL). Dari Tabel 2 terlihat, dengan monoklonal anti CA 15.3 jenis M37901M, semakin pekat Na125I yang digunakan, hasil dimana monoklonal jenis M37552M khusus untuk penandaan akan semakin tinggi. Jadi dalam coated tube, sedangkan monoklonal jenis M37901M pembuatan perunut untuk Kit RIA/IRMA, sebaiknya khusus untuk labelling, sehingga hasil penandaan volume Na125I yang digunakan untuk penandaan <10 tidak optimal. µL dengan aktivitas >100 µCi/µL Tabel 1. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 15.3 jenis (M37552M) dengan Na125I PRR (belum direduksi) menggunakan Oksidator Kloramin-T dengan memvariasikan jumlah monoklonal anti CA 15.3 (M37552M). CA 15.3 Na125I Hasil Penandaan Aktivitas Jenis Kemurnian No (µg ) µCi (35µL) (%) (µCi/µgr) Radiokimia (%) 1 5 1200 2,19 5,26 85,10 2
10
3
15
4
20
5 6
25 30
1200
2,79
3,35
86,25
2,65
2,12
87,13
2,61
1,56
91,99
1200
2,39
1,15
90,81
1200
2,14
0,86
90,44
1200 1200
Tabel 2. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 15.3 jenis (M37901M) dengan 1,2 mCi Na125I menggunakan Oksidator Kloramin-T dengan memvariasikan konsentrasi Na125I yang di gunakan. CA 15.3 VolumNa125I Hasil Penandaan Aktivitas Jenis Kemurnian No (µg ) (µL ) (%) (µCi/µgr) Radiokimia(%) 1 25 40 2,2 1,06 86,4 2 3 4 5
25 25 25 25
35
2,6
1,25
87,6
15
16,0
7,68
89,7
6
39,3
18,86
95.2
3
47,03
22,57
97,5
Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2011 Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 19 Juli 2011
Gina Mondrida, dkk.
ISSN 0216 - 3128
98
Tabel 3. Hasil Penandaan monoklonal anti CA 15.3 M37901M dan CA 15.3 M37552M dengan 1,2 mCi Na125I PRR (hasil reduksi) menggunakan Oksidator Kloramin-T. Vol Na125I Hasil Penandaan Aktivitas Jenis Kemurnian Immunologi No Jenis CA15.3 (µL) (%) (µCi/µgr) Radiokimia(%) (%B/T) 1 M37901M 35 2,60 1,25 87,6 5,51 2 3 4
M37901M M37552M M37552M
3
47,03
22,57
97,5
19,86
35
2,39
1,14
85,9
1,09
3
27,48
13,19
95,8
6,61
KESIMPULAN Hasil penandaan monoklonal antibodi CA 15.3 jenis M37901M dengan Na125I PRR (hasil reduksi) memberikan hasil yang baik, dengan rendemen hasil penandaan 47,03%, aktivitas spesifik 22,57 µCi/µg, kemurnian radiokimia 97,5% dan uji immunologi 19,86%. Monoklonal antibodi CA 15.3 jenis M37901M merupakan bahan dasar yang baik untuk pembuatan perunut dibandingkan monoklonal jenis M37552M, yang hanya memberikan rendemen hasil penandaan 27,48%, aktivitas spesifik 13,19 µCi/µg, kemurnian radiokimia 95,8% dan uji immunologi 6,61%. Perunut CA15.3 (CA15.3-125I) yang didapat hasil dari penandaan CA 15.3 jenis M37901M dengan Na125I PRR (hasil reduksi) yang telah dipekatkan dan dimurnikan mempunyai kualitas yang baik dan dapat digunakan sebagai perunut Kit IRMA CA 15.3.
DAFTAR PUSTAKA 1.
2.
3.
ANONIMOUS, Kurang kesadaran dan rendahnya kewaspadaan terhadap kanker payudara, Yayasan Kanker Indonesia (YKI), 2007. G.BANFI, P. PARMA, M. PONTILLO, 1997, Stability of Tumor Marker CA 19.9, CA 125, and CA 15.3 in Serum Obtained from plain Tubes and Tubes containing Thxotropic Gel Separator, Clinical Chemistry, 43: 2430-2431. DE LA LANDE B, HACENE K, FLOIRAS J L, at all, 2002, Prognotic value of CA 15.3 kinetic for metastatic breast cancer, Service de Radiotherapie, Centre Rene Huguenin de Luttle
4.
5.
Contre le Cancer, saint-Cloud, France, OctDec:17(4):231-8. WAYAN RADIATNING S, SUKIYATI DJ,2000, Immunoradiometricassay (IRMA) Dalam Deteksi Dan Pemantauan Kanker, Jurnal Radioisotop dan Radiofarmaka, P2RR-BATAN, Serpong, Vol.3, No 1, halaman 55-70. R.S.WAYAN, Dasar - dasar RIA dan IRMA, Pusdiklat BATAN, Jakarta, 1993.
TANYA JAWAB Maiyesyi - PRR Parameter apa saja yang dioptimasi? Bagaimana dengan sebelum dioptimasi? Gina Mondrida Parameter yang dioptimasi adalah” 1. Jumlah (µg) monoclonal CA15.3 yang digunakan 2. Volume (µl)Na 125I yang dipakai 3. Jenis monoclonal CA15.3 yang digunakan Kondisi sebelum dioptimasi menghasilkan yield penandaan yang rendah (±2%) dengan kemurnian radiokimia yang rendah pula, sehingga perunut yang diperoleh tidak bisa digunakan. Setelah dioptimasi menghasilkan yield penandaan yang tinggi (47,03%) dan kemurnian radiokimia sebesar 97,5%. Perunut yang diperoleh setelah dioptimasi, dapat digunakan sebagai perunut Kit IRMA CA15.3
Prosiding Pertemuan dan Presentasi Ilmiah Penelitian Dasar Ilmu Pengetahuan dan Teknologi Nuklir 2011 Pusat Teknologi Akselerator dan Proses Bahan - BATAN Yogyakarta, 19 Juli 2011
