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CODA-CERVA Centrum voor Onderzoek in Diergeneeskunde en Agrochemie Centre d’Etude et de Recherches Vétérinaires et Agrochimiques

SOP/TRA/ANA/04 Vnr : 02 Datum/Date : 18/06/14 Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS

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Doel / Objet : Dit werkvoorschrift heeft tot doel anorganisch arseen te bepalen. Van de gekende arseen species zijn de anorganische vormen het meest schadelijk voor de gezondheid. Cette instruction a pour objet la détermination de l’arsenic inorganique. Parmi ces composés d’As connus, les formes inorganiques sont les plus dangereuses pour la santé.

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ie

Toepassingsgebied / Domaine d’application : Dit werkvoorschrift wordt toegepast op voeding (inclusief dranken) en voeders van plantaardige oorsprong (landplanten). Cette instruction s’applique aux denrées alimentaires (y inclus des boissons) et aliments pour animaux d'origine végétale (plantes terrestres). Bestemmelingen / Destinataires : zie distributielijst / Voir liste de distribution

Aantal copies in omloop / Copies en circulation : 5

Historiek / Historique

Vnr

Datum vrijgave Date d’application

01 02

27/03/13 18/06/14

Reden(en) wijziging / Motif(s) de changement

Eerste editie / Première édition Uitbreiding voor voeders en dranken / Extension pour des aliments pour animaux et boissons

Auteur Naam / Nom

Ruttens A.

Kwaliteitsverantwoordelijke Responsable Qualité Knapen K.

Technisch verantwoordelijke Responsable technique Ruttens A.


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Vnr : 02

Datum/Date : 18/06/14

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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS

1.Doel Dit werkvoorschrift heeft tot doel anorganisch arseen te bepalen. Van de gekende arseen species zijn de anorganische vormen het meest schadelijk voor de gezondheid.

2.Toepassingsgebied


3.Definities, afkortingen, referenties en normen

ie

Dit werkvoorschrift wordt toegepast op voeding (inclusief dranken) en voeders van plantaardige oorsprong (landplanten).

3.1. Afkortingen Ar As AsB AsIII AsV Asi MMA DMA milliQ – water H20bidi CRI CRI-gas CRM g kg HPLC ICP-MS L mL RBS 25 VAR TUNE µg µL

argon arseen arsenobetaine arseniet arsenaat anorganisch arseen monomethyl arsonate dimethyl arsinate ultrazuiver water home made bigedestilleerd water “Collision Reaction Interface”; dit systeem laat toe om via de introductie van bepaalde gassen isobare interferenties te elemineren bij metingen op de ICP-MS gas gebruikt door het CRI-systeem: H2 = waterstof gecertifieerd referentiemateriaal gram kilogram hoge performantie vloeistofchromatografie massaspectrometer gekoppeld aan een inductief plasma liter mililiter professioneel detergent VAR-TS-MS Varian©multi-element oplossing gebruikt voor de optimalisatie van het signaal van de ICP-MS waarin volgende elementen aanwezig zijn: Ba, Be, Ce, Co, In, Mg, Pb, Th, Tl microgram microliter

3.2. Referenties

Directive 2002/657/EC of 12/08/2002 (publication date: 17/08/2002), concerning the performance of analytical methods and the interpretation of results, and implementing Council Directive 96/23/EC. Official Journal of the European Communities L221/8 (2002) SOP/TRA/PRE/01 : Voorbereiding van de stalen voor het bepalen van spoorelementen PRO/5.5/01 : Interne controles PRO/5.1/04 : Afvalverwijdering SOP/TRA/ANA/03 : Arseenspeciatie in granen en graanproducten

4.Principe 4.1. Voorbereiding De voorbereiding en de homogenisering van de stalen is beschreven in de SOP/TRA/PRE/01. Na homogenisatie worden de stalen overgebracht in extractiebuizen en wordt de extractieoplossing -die bestaat uit een mengels van een zuur en een oxidant (0.1 M HNO 3 in 3% H2O2)- - en een magnetisch roerstaafje toegevoegd. Vervolgens worden de extractiebuizen hermetisch afgesloten en in de houder van de microgolfoven geplaatst.


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1.Objet Cette instruction a pour objet la détermination de l’arsenic inorganique. Parmi ces composés d’As connus, les formes inorganiques sont les plus dangereuses pour la santé.

2.Domaine d’application


3.Définitions, abréviations, références et normes

ie

Cette instruction s’applique aux denrées alimentaires (y inclus des boissons) et aliments pour animaux d'origine végétale (plantes terrestres).

3.1. Abréviations Ar As AsB AsIII AsV Asi MMA DMA CRI

Eau milliQ H20bidi g Gaz CRI HPLC ICP-MS kg L mL MRC RBS 25 VAR TUNE µg µL

argon arsenic arsenobetaine arsenite arsenate anorganisch arseen monomethyl arsonate dimethyl arsinate « Collision Reaction Interface », ce dispositif permet, par l’introduction de certaines gases, d’éliminer des interférences isobariques lors de mesures en ICP-MS eau ultra pure home made eau bidistillée gramme gaz employé dans le dispositif CRI : hydrogène (H2) chromatographie liquide à haute performance spectromètre de masse couplé à un plasma inductif kilogramme litre millilitre matériau de référence certifié détergent professionnel solution multi-élémentaire (VAR-TS-MS Varian©) employée pour l’optimisation de l’ICP-MS et contenant les éléments chimiques : Ba, Be, Ce, Co, In, Mg, Pb, Th et Tl microgramme microlitre

3.2. Références

Directive 2002/657/EC de 12/08/2002 (date de publication: 17/08/2002), concernant la performance des méthodes analytiques et l’interprétation des résultats, implementing Council Directive 96/23/EC. Official Journal of the European Communities L221/8 (2002). SOP/TRA/PRE/01 : Préparation des échantillons pour le dosage des éléments traces PRO/5.5/01 : Contrôles internes PRO/5.1/04 : Elimination des déchets SOP/TRA/ANA/03 : Spéciation de l’arsenic dans les céréales et produits céréaliers

4.Principe 4.1. Préparation La préparation et l’homogénéisation des échantillons sont décrites dans la SOP/TRA/PRE/01. Les échantillons homogénéisés sont introduits dans des récipients d’extraction. Après ajout de la solution d’extraction acide et oxydante (HNO3 0.1M dans 3% H2O2), et après l’ajout des puces magnétiques, les récipients sont hermétiquement fermés et placés dans le four à micro-ondes.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS Het gebruik van een doeltreffend opwarmingsprogramma en het roeren van de stalen m.b.v. een magnetische roerstaaf, verzekert vervolgens de extractie van As uit het staal. De oxiderende omgeving zorgt ervoor dat het aanwezige As III omgezet wordt in AsV, zodat al het anorganisch As in het extract aanwezig is als AsV. Na het doorlopen van het opwarmingsprogramma, en na afkoeling van de buizen, is het extract klaar voor analyse met HPLC-ICP-MS.


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4.2. Meting De blanco’s, de ijkstandaarden evenals de oplossingen van de stalen worden in de carrousel van de monsterwisselaar van de HPLC geplaatst. De keten HPLC-ICP-MS en de analyse worden gestuurd door de programma’s ICP_MS expert en Galaxie en laten de controle van alle functies van het meetapparaat toe met inbegrip van de programmering van de chromatografische scheiding van species in de stalen evenals de interpretatie, de behandeling en de archivering van de ruwe data.

5.Validatieparameters Zie validatiedossier

6.Goederen

6.1 Klein Laboratoriummateriaal

Maatkolven Pipetpunten Filters voor injectiespuiten (porositeit 0.45 µm) Injectiespuiten van 10ml Extractiebuizen van de microgolfoven Handschoenen Spatel Vortex Magnetische roerstaafjes Conische buizen van 50 mL (aangepast voor centrifugatie op 10.000 t/min) Conische buizen van 15 mL met schroefdop Gegradueerde polypropyleen buizen 50 ml (PP tubes), klasse A geijkt Destillatie systeem voor aanmaak van dubbel gedestilleerd water Monsterwisselaar ICP-MS HPLC: Monsterwisselaar HPLC Vials voor de monsterwisselaar van de HPLC Anionenuitwisselingskolom (Hamilton PRP-X100, 250x46 mm, deeltjes 10 µm) Prekolom (Hamilton PRP-X100 guard kolom) HPLC-pompen Controller voor kolomoven Oven voor de kolom 6.2. Specifieke reactieven

Alle reactieven worden bewaard bij omgevingstemperatuur (20±5 °C) tenzij anders is aangeduid. 

  

VAR-TUNE 5ppb: Optimalisatieoplossing VAR-TS-MS Varian©multi-elementoplossing, verdund tot 5 µg.L-1. Om deze oplossing te bereiden moet de stockoplossing VAR-TS-MS (10 mg.L-1) verdund worden.Daartoe wordt 25µL stockoplossing en 2 mL geconcentreerd HNO3 in een PP tube van 50 mL gebracht en aangevuld met dubbel gedistilleerd water tot de maatstreep. Indien een grotere tube of maatkolf wordt gebruikt dienen de hoeveelheden verhoudingsgewijs aangepast te worden. Ammoniakoplossing NH3 25%, p.a. Ammoniumcarbonaat poeder (CH6N2O2 * CH5NO3 (1:1)), p.a. Ammoniumcarbonaatoplossing van 40mM op pH 9.4. Om deze oplossing te bereiden moet 6.28 g/L ammoniumcarbonaat opgelost worden in milliQ-water, en aangepast worden met NH3 25% (~4.5ml per liter) tot pH 9.4.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS L’application d’un programme de chauffe adéquat et l’agitation des échantillons au moyen d’une puce magnétique, assure ensuite l’extraction de l’As de l’échantillon. Le milieu oxydant entraine l’oxydation de l’ AsIII en AsV. De ce fait tout l’arsenic inorganique dans l’extrait sera présent sous forme d’AsV. Après la fin du programme de chauffe et refroidissement des tubes, les échantillons sont prêts à être analysés par HPLC-ICP-MS.


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4.2 Mesure Les blancs, les étalons et les solutions d’échantillons sont placés dans le carrousel du passeur d’échantillons de l’HPLC. Le système HPLC-ICP-MS et l’analyse sont gérés par les logiciels ICP-MS_expert et Galaxie. Ils permettent de piloter et de contrôler toutes les fonctions de l’appareil de mesure, la programmation de l’élution des échantillons ainsi que l’interprétation, le traitement et l’archivage des résultats bruts.

5.Paramètres de validation Voir dossier de validation

6.Fournitures

6.1. Petit matériel de laboratoire

Ballons jaugés Tips pour pipettes Seringues de 10ml Filtres pour seringue (porosité 0.45 µm) Récipients d’extraction du four micro-onde Gants Spatule Vortex Puces magnétiques Tubes coniques de 50 mL (adapté pour la centrifugation à 10.000 tr/min) Tubes coniques de 15 mL avec bouchon Des tubes en polypropylène, gradués (tubes PP), jaugés classe A Système de distillation pour la production de l’eau distillée Echantillonneur ICP-MS HPLC : Echantillonneur HPLC Vials pour l’échantillonneur HPLC Colonne échangeuse d’anions (Hamilton PRP-X100, 250x46 mm, particules 10 µm) Précolonne (Hamilton PRP-X100 guard column) Pompes HPLC Four pour la colonne Contrôleur four colonne 6.2. Réactifs spécifiques Sauf mention contraire, tous les réactifs sont conservés à température ambiante (20±5°C) 

  

VAR-TUNE 5ppb: solution d’optimisation VAR-TS-MS Varian©multi-element diluée à 5 ppb/L. Pour préparer cette solution, il faut diluer la solution mère VAR-TS-MS (10 mg/L). Pour ce faire, mettre 25 µL de solution mère et 2 mL HNO3 concentré dans un tube PP de 50 mL et compléter jusqu’au trait avec de l’eau bidistillée. Si un tube ou un ballon jaugé plus grand est utilisé, les quantités à pipeter doivent être ajustées proportionnellement. Solution d’ammoniac NH3 25%, p.a. Carbonate d’ammonium en poudre (CH6N2O2 * CH5NO3) p.a. Carbonate d’ammonium, solution de 40mM à pH 9.4. Pour préparer la solution il faut dissoudre 6.28 g/L de carbonate d’ammonium dans de l’eau MQ et ajuster le pH avec NH3 25% (~4.5ml per liter) jusque pH 9.4.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS pH buffers (pH4 en pH7) voor kalibratie pH meter Aceton, technical Methanol, HiPerSolv CHROMANORM, for HPLC gradient grade Waterstof peroxide oplossing (30%), p.a RBS 25 Salpeterzuur HNO3 conc (68%), kwaliteit extra pur. Salpeterzuur oplossing HNO3 0.11 M (bereiding: 7.26 ml HNO3 conc in 1L milliQ-water) Salpeterzuur oplossing HNO3 0.1 M in 3% H2O2 (bereiding: 650 µl HNO3 conc en 10 mL H2O2 30% aanlengen tot 100 mL met milliQ-water)


6.3. Referentiematerialen

ie

       

CRM: “NMIJ 7503 a, Rice flour” of analoge CRM. NMIJ 7503 a: gecertificeerd totaal As gehalte: 98 ± 7 µg/kg; gecertificeerde concentratie AsIII: 71.1 ± 2.9 µg/kg; gecertificeerde concentratie AsV: 13.0 ± 0.9 µg/kg. Som anorganisch arseen 84.1 ± 3 µg/kg. Wordt bewaard bij <28°C. AsV: arsenic (V) oxide hydrate in H2O 1000 mg/L, wordt bewaard bij 20±5°C . AsB: arsenobetaine, wordt bewaard bij 5±3 °C. DMA: dimethylarsinic acid, wordt bewaard bij 5±3 °C. MMA: monosodium methyl arsonate, wordt bewaard bij 5±3 °C.

7.Uitrustingen

ICP-MS (VARIAN 820) met computerprogramma’s : Varian ICP-MS_expert en Varian Galaxie Analytische balans Microgolfoven voor de extractie Pipetten met regelbaar volume pH meter Koelkast (5±3 °C) Milli-Q system Centrifuge

8.Werkwijze 8.1. Reiniging 

Extractiebuizen: 15 mL HNO3 (25 %) in de buizen brengen, ze sluiten en in de carrousel van de microgolfoven plaatsen. Het verwarmingsprogramma “Wash 180C 270710” toepassen. Na afkoelen, de mineralisatiebuizen en de stoppen 1 maal spoelen met dubbel gedistilleerd water en 1 maal met milliQ-water. De buizen zijn dan na drogen klaar voor de extractie. In het geval er vet achterblijft in de buizen na de extractie van bepaalde stalen, de binnenkant van de buizen reinigen met RBS 25 en/of aceton vooraleer over te gaan tot de hogerbeschreven reiniging.



Magnetische roerstaafjes: minstens 12 uur in 10% HNO3 laten weken, daarna 3 maal spoelen met milliQ-water en laten drogen.



PP tubes : de gegradueerde tubes die gebruikt worden voor de bereiding van de standaarden, worden vóór het gebruik gespoeld met milliQ-water.



Pipetpunten: de punten van 5 en 10 mL moeten gespoeld worden met de oplossing die moet gepipetteerd worden vooraleer ze te gebruiken voor het bereiden van de oplossingen.



Anionenuitwisselingskolom: voor elk gebruik moet de kolom gereinigd worden met milliQ-water gedurende één uur minimum aan een debiet van 0,5 mL/min.


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  

Tampons pH pour la calibration du pH mètre (pH4 en pH7) Solution de peroxide d’hydrogène (30%) Acide nitrique HNO3 (68%), qualité extra pur Acide nitrique HNO3 dilué 0.11 M (préparation: 7.26 ml HNO3 conc dans 1L eau milliQ) Acide nitrique HNO3 dilué 0.1 M contentant 3% H2O2 (préparation: 650 µl HNO3 ajuster jusque 100 mL avec de l’eau milliQ) Acetone, technical Méthanol, HiPerSolv CHROMANORM, for HPLC gradient grade RBS 25

et 10 mL H2O2 30%


6.3. Matériaux de référence

conc

ie

    

MRC : “NMIJ 7503 a, Rice flour” ou analogue. NMIJ 7503 a: concentrations certifiées : arsenic total: 98 ± 7 µg/kg; AsIII: 71.1 ± 2.9 µg/kg; AsV: 13.0 ± 0.9 µg/kg. Arsenic inorganique = A sIII+AsV = 84.1 ± 3 µg/kg. Est stocké à <28°C. AsB: arsenobetaine p.a., est conservé à 5±3 °C. DMA: dimethylarsinic acid, est conservé à 5±3 °C. MMA: monosodium methyl arsonate, est conservé à 5±3 °C. AsV: arsenic (V) oxyde hydrate dans H2O 1000 mg/L, conservé à 20±5°C.

7.Equipements

ICP-MS (Varian 820) avec les logiciels : VARIAN ICP-MS_expert et VARIAN Galaxie Balance analytique Four micro-onde pour extraction Pipettes à volume réglable pH mètre Frigo (5±3 °C) MilliQ system Centrifuge

8.Instruction

8.1. Nettoyage 

Récipients d’extraction : ajouter 15 mL d’HNO3 à 25%, fermer les tubes, les placer dans le carrousel du microonde. Appliquer le programme de chauffe « Wash 180C 27071». Après refroidissement, rincer une fois les récipients et les bouchons à l’eau bidistillée et 1 fois à l’eau milliQ. Les récipients qui sont ainsi, après séchage, prêt pour l’extraction. En cas de dépôt graisseux, nettoyer l’intérieur des récipients au RBS 25 et/ou à l’acétone avant de procéder au nettoyage décrit.



Puces magnétiques : mettre pendant au moins 12 heures dans du HNO3 10% et ensuite rincer 3x à l’eau milli-Q et laisser sécher.



Tubes PP : les tubes gradués utilisés pour la préparation des solutions étalons doivent être rincés à l'eau milliQ avant utilisation.



Pointes pour micropipettes : les pointes de 5 et 10 mL doivent être rincées avec la solution à transférer avant de les utiliser pour préparer des solutions.



Colonne échangeuse d’anions : avant chaque utilisation, la colonne doit être nettoyée avec de l’eau milliQ pendant une heure au minimum à un débit de 0,5 mL/min.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 

De prekolom: Een spoeling van de prekolom met een 1 % oplossing van salpeterzuur kan nodig zijn indien de gemeten druk te sterk varieert, of abnormaal hoog is (cf. C:\Documents and Settings\CODA\My Documents\general\logbooks). Vooraleer de spoeling aan te vatten moet de prekolom verplicht van de kolom afgekoppeld worden.

Gedetailleerde informtie i.v.m het onderhoud en het gebruik van de kolommen en prekolommen is terug te vinden in het document : “SOP/TRA/ANA/03/DOC01” ‘Reinigen en onderhoud van de kolom, pre-kolom en chromatografiesysteem’(zie SOP/TRA/ANA/03).

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8.2. Voorbereiding van de stalen (Extractie)

Een deel van het gehomogeniseerde staal (zie SOP/TRA/PRE/01) afwegen in een extractiebuis (in tweevoud). Dit gewicht is afhankelijk van het staal. Als richtlijn wordt maximum ± 2 g vers materiaal afgewogen en ± 0.5 g droog materiaal, voor vloeistoffen is dit maximum ± 1mL. Het juiste afgewogen gewicht wordt genoteerd op het document “SOP/TRA/ANA/04/DOC02 : Formulier voor de registratie van de technische parameters” (in bijlage 2) ten einde de verdunningsfactor te kunnen berekenen. Na toevoegen van 9mL HNO3 0.11 M en 1 ml H202 30%, waarbij zoveel mogelijk materiaal dat op de wanden plakt naar beneden wordt gespoeld, wordt een magnetische roerstaaf toegevoegd, wordt de buis gevortext (om materiaal te bevochtigen) en worden de extractiebuizen gesloten en in de carrousel geplaatst. De resulterende verdunningsfactor ligt typisch tussen 6=(2+10)/2 en 68=(0,15+10)/0,15. De procedureblanco’s en de CRM(s) (ook in 2 herhalingen) worden op dezelfde manier behandeld als de stalen.

2.

De extractiebuizen worden per 16 of per 24 buizen in de carrousel van de microgolfoven geplaatst en dit zo symmetrisch mogelijk om een zo gelijkmatig mogelijke temperatuurverdeling, die gemeten wordt met IR cellen, te verkrijgen. De carrousel wordt in de microgolfoven geplaatst, de deur wordt gesloten en het verwarmingsprogramma met roerfunctie wordt opgestart. Het programma is “MAE As 90.27” (temperatuurstijging tot 90 °C gedurende 7 minuten waarna de temperatuur op 90 °C gehouden wordt gedurende 20 minuten; roersnelheid op 3).

3.

Na afkoelen worden de extractiebuizen geopend en wordt de oplossing in een conisch buisje (voor centrifugatie) van 50 mL gebracht. De oplossing wordt zo gecentrifugeerd gedurende 10 minuten bij een snelheid van 12500 g (10000 rpm op Juan centrifuge). Het supernatans wordt overgebracht in een spuit waarvan voordien de zuiger werd verwijderd en waarop een filter werd geplaatst (porositeit 0.45 µm). De oplossing wordt aldus gefiltreerd en het filtraat wordt in buizen van 15 mL gebracht die afgesloten worden met een stop en in de koelkast (5±3°C) bewaard worden tot de analyse aanvangt.


1.

8.3. IJking, ijkstandaarden en procedureblanco’s

HPLC is een kwalitatieve en kwantitatieve analysemethode. De identificatie van de in het staal aanwezige verbindingen gebeurt door vergelijking van de retentietijden van de verschillende geëlueerde species met de retentietijden van de As species aanwezig in de standaardoplossing die naast AsV, ook de organische species AsB, DMA en MMA bevat omdat deze frequent aanwezig zijn in de betreffende matrices en zo, ten informatieve titel, tevens informatie over deze species kan bekomen worden. De concentratie van de aanwezig species kan bepaald worden met behulp van een calibratiecurve op vijf niveau’s (0; 0,5; 1; 2 en 5 µg.L-1). In het kader van dit proefschrift is enkel de kwantificatie van AsV verplicht. Een intermediaire oplossing (‘SolB As b’) die de 4 As-species bevat aan 250 µg/L, wordt bereid door verdunning van individuele geconcentreerde ijkstandaarden van 1000 µg/L. De bereiding van de afzonderlijke ijkstandaarden van 1000 µg/l wordt in detail weergegeven in tabel 1. As V wordt als oplossing (1000 µg/L) aangekocht.

afwegen (mg) aanlengen tot (ml)

AsB

DMA

MMA

arsenobetaine 47,5 20

dimethylarsinic acid 170,56 100

monosodium methylarsonate 109,73 50

conc opl (ppm) 1000 1000 1000 Tabel 1 : Bereiding van de individuele standaarden van 1000 mg/L


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Pré-colonne : un rinçage de la pré-colonne avec une solution d’acide nitrique 1% peut s’avérer nécessaire si la pression mesurée varie de manière importante, ou est anormalement élevée (cf. C:\Documents and Settings\CODA\My Documents\general\logbooks). Il faut impérativement déconnecter la pré-colonne de la colonne avant de procéder au nettoyage.

Des informations détaillées sur l’entretien et l’utilisation des colonnes et pré-colonnes sont décrites dans le document “SOP/TRA/ANA/03/DOC01 : Nettoyage et entretien colonne, pré-colonne et système chromatographique” (voir SOP/TRAANA/03).

ie

8.2. Préparation des échantillons (Extraction)


1. Peser une partie de l’échantillon homogénéisé (voir SOP/TRA/PRE/01) dans le récipient d’extraction (2 répliques par échantillon). Le poids dépend du type d’échantillon : un maximum de ± 2 g pour les échantillons frais, un maximum de ± 0.5 g pour les échantillons secs et un maximum de ± 1 mL pour les boissons. Le poids exacte est noté dans le document “SOP/TRA/ANA/04/DOC02 : Formulaire pour l’enregistrement des paramètres techniques » (cf. annexe 2) afin de pouvoir calculer le facteur de dilution exacte. Ajouter 9,00 mL HNO3 0.11 M et 1 ml H202 30%, en forçant le matériel qui est resté attaché aux parois à descendre vers le fond du tube. Puis ajouter une puce magnétique, fermer les récipients et les placer dans le carrousel. Le facteur de dilution est compris entre 6=(2+10)/2 et 68=(0,15+10)/0,15. Préparer les blancs procédé et les MRC, en 2 répliques, de la même manière. 2. Les récipients sont placés dans le carrousel du micro-onde au nombre de 16, 24 ou 40 de manière symétrique dans le souci d’assurer une mesure homogène de la température par les cellules IR de la sonde. Introduire le carrousel dans le four à micro-onde, fermer la porte et enclencher le programme de chauffe « MAE As 90.27 » qui correspond à une montée en température jusqu'à 90°C pendant 7 minutes, ensuite la température est maintenue à 90°C durant 20 minutes (vitesse d’agitation : niveau 3). 3. Après refroidissement, ouvrir les récipients et transférer la solution dans un tube conique de 50 mL, destiné à la centrifugation. Ces tubes sont ensuite centrifugés pendant 10 minutes à une vitesse de 12500 g (10000 rpm sur centrifuge Juan). Les surnageants sont transférés dans une seringue préalablement séparée de son piston et munie d’un filtre (porosité : 0.45 µm). La solution filtrée sera directement récupérée dans des tubes coniques de 15 mL, fermés par un bouchon, et stockés au frigo (5±3°C) en attendant d’être analysés. 8.3. Etalonnage, étalons, « blancs procédé »

L’HPLC est une méthode d’analyse qualitative et quantitative. L’identification des espèces est rendue possible grâce à la comparaison des temps de rétention des espèces présentes dans l’échantillon avec celles d’une solution étalon éluée dans les mêmes conditions. La solution d’étalon utilisée contient en plus de l’AsV, les espèces organiques AsB, DMA et MMA qui peuvent être présentes dans les matrices concernées. Ceci permet, à titre informatif, d’obtenir en même temps des informations sur les concentrations de ces espèces. La quantité de chaque espèce est déterminée au moyen d’une courbe de calibration qui est construite à partir de cinq solutions étalons (0 ; 0,5 ; 1 ; 2 et 5 µg.L-1). Dans le cadre de cette instruction seulement la quantification d’As V est exigée. A cet effet, une solution intermédiaire (‘SolB As b’) qui contient les quatre espèces d’intérêt à 250 µg/L, est préparée par la dilution d’étalons individuels concentrés (1000 µg.L-1). La préparation de ces étalons est détaillée dans le tableau 1. AsV est acheté en solution (1000 µg/L).

afwegen (mg) aanlengen tot (ml)

AsB

DMA

MMA

arsenobetaine 47,5 20

dimethylarsinic acid 170,56 100

monosodium methylarsonate 109,73 50

conc opl (ppm) 1000 1000 1000 Tableau 1 : Préparation des étalons individuels à 1000 mg/L


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS Om de ‘SolB As b’ te bereiden wordt 62,5 µl van elke ijkstandaard aan 1000 mg/L genomen en overgebracht in een maatkolf van 250 mL. Na aanlenging tot de maatstreep met MilliQ water bedraagt de uiteindelijke concentratie van elke species 250 ppb. Deze oplossing mag maximaal gedurende 35 dagen gebruikt worden en dient gestockeerd te worden in de koelkast (5±3°C).

ie

Het gamma van werkstandaarden wordt bereid door opeenvolgende verdunningen van de intermediaire oplossing ‘SolB As b’. De bereiding van deze standaarden is weergegeven in Tabel 2 voor gebruik van PP tubes van 50 mL. Indien andere formaten worden gebruikt moeten de hoeveelheden proportioneel worden aangepast. Elke dag wanneer analyses uitgevoerd worden moeten de ijkstandaarden vers bereid worden.


Volume van de oplossing Volume HNO3 68% Volume H202 30% ‘B inorganic’ (µL) (µL) (µL) Calibratie blanco 0 326 5000 Standaard 1. 0,5 µg.L-1 100 326 5000 Standaard 2. 1,0 µg.L-1 200 326 5000 -1 Standaard 3. 2,0 µg.L 400 326 5000 Standaard 4. 5,0 µg.L-1 1000 326 5000 Tabel 2: Bereiding van de 4 niveau’s van standaardoplossingen in tubes van 50 mL Een onafhankelijke controlestandaard van 5 µg/l (QC) zal op dezelfde wijze gemaakt worden als beschreven in Tabel 2, en vertrekkende vanaf een intermediaire oplossing ‘SolB As b ctrl’ die niet degenene is waarmee de standaarden van de calibratiereeks werden gemaakt. Deze onafhankelijke standaard zal gemeten worden aan het begin en aan het einde van de reeks stalen. Nadat de maatkolven aangevuld zijn tot de maatstreep worden de oplossingen overgebracht in vials voor de meting. De “procedureblanco’s” zijn bedoeld om de verschillende stappen in de voorbereiding van de stalen te controleren. Ze omvatten dan ook alle behandelingen, het wassen en de gebruikte reactieven gedurende de extractie, maar dan zonder staal. De “procedureblanco’s” worden uitgevoerd in twee herhalingen ten einde een representatief resultaat voor de procedure te bekomen en de afwezigheid van contaminaties na te gaan. In het geval de concentratie in een extract hoger is dan de geldende calibratierange (zei validatiedossier) moet deze worden verdund voor analyse. Deze verdunning gebeurt met de oplossing gebruikt als ‘calibratie blanco’ (zie tabel 2). 8.4. Meting en export van resultaten 8.4.1. Opstarten van het apparaat. 8.4.1.1. ICP-MS

Omwille van de stabiliteit en het behoud van de luchtledigheid in de ICP-MS spectrometer, blijft het toestel steeds onder spanning en blijven de vacuumpompen in werking.       

Opstarten van de koeler (temperatuurregeling op 20°C) De toevoer van de gassen controleren: Ar: 7 bar (minimum 6,0 - maximum 8,3), H2 :4 bar (minimum 2,75 - maximum 4,8) Nagaan van de toestand van de leidingen van de peristaltische pomp en deze vervangen indien er zichtbare slijtage wordt waargenomen (aanvoerleidingen zwart-zwart en afvoerleidingen blauw-blauw of grijs-grijs) Indien nodig het reservoir met spoelvloeistof (HNO 3 2%) aanvullen Het niveau van de vloeistof in het reservoir voor de afvalvloeistoffen controleren en indien nodig ledigen De autosampler van de ICP-MS aanschakelen Opstarten van de computer en het programma ICP_MS Expert.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS Pour la préparation de la solution ‘SolB As b’’, on prélève 62,5 µL de chaque étalon à 1000 mg/L que l’on transfère dans un ballon jaugé de 250 mL. Après mise au trait avec de l’eau milliQ, la concentration finale pour chaque espèce est de 250 ppb. Cette solution peut être utilisée au maximum pendant 35 jours et doit être stockée au frigo (5±3°C).

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Les solutions étalons utilisées pour la calibration sont obtenues par la dilution de la solution ‘SolB As b’ dans des ballons jaugés de 25 mL. La préparation des étalons est détaillée dans le tableau 2, pour des tubes PP de 50 mL. Si des autres formats sont employés, les quantités doivent être ajustées proportionnellement. Ces solutions doivent être préparées lors de chaque nouvelle journée d’analyse.


Volume à prélever Volume HNO3 68% Volume H202 30% de la solution ‘B inorganic’ (µL) (µL) (µL) Blanc d’étalonnage 0 326 5000 Etalon 1. 0,5 µg.L-1 100 326 5000 Etalon 2. 1,0 µg.L-1 200 326 5000 -1 Etalon 3. 2,0 µg.L 400 326 5000 Etalon 4. 5,0 µg.L-1 1000 326 5000 Tableau 2 : Préparation des quatre solutions étalons pour des tubes de 50 mL Une solution étalon indépendante de concentration 5 µg/l (QC) sera préparée comme décrit dans le tableau 2, au départ d’une solution intermédiaire ‘SolB As b ctrl’ qui n’est pas celle avec laquelle l'étalonnage a été réalisé. Cette solution indépendante sera mesurée au début et à la fin de la séquence d’analyse. Après avoir porté les solutions au trait avec de l’eau milliQ, celles-ci sont transvasées dans des vials pour l’analyse. Les blancs procédé sont censés représenter l’ensemble des étapes de la préparation de l’échantillon. Ils comprennent donc toutes les manipulations, la vaisselle et les réactifs utilisés dans le procédé sans que l’échantillon intervienne. Les blancs procédé sont réalisés en deux répétitions afin d’assurer une réelle représentativité du procédé et pour vérifier l’absence des contaminations. Quand la concentration d’un extrait est plus haute que la courbe de calibration valide (cf dossier de validation), il faut le diluer pour l’analyse. Cette dilution est faite avec la solution utilisée comme ‘blanc d’étalonnage’ (cf. tableau 2). 8.4. Mesures et exportation des résultats 8.4.1. Mise en route de l’appareillage 8.4.1.1 ICP-MS

Pour des raisons de stabilité et de conservation du vide dans les spectromètres ICP-MS, le spectromètre reste toujours sous tension, pompes à vide en fonction.       

Mettre sous tension le refroidisseur (température set à 20°C). Vérifier les alimentations en gaz : Ar : 7 bars (minimum 6,0 - maximum 8,3 bars) H2 : 4 bars (minimum 2,75 - maximum 4,8 bars) Vérifier l’état des tuyaux de la pompe péristaltique et les changer en cas d’usure visible (tuyau d’arrivée noir-noir et tuyau d’évacuation bleu-bleu). Compléter si besoin le bidon de rinçage du passeur (HNO 3 2%). Vérifier le niveau de liquide dans le bidon de récupération, si nécessaire procéder à l’évacuation du trop-plein. Allumer le passeur d’échantillon de l’ICP-MS. Démarrer le système informatique et le logiciel ICP-MS_Expert.


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Indien zich een probleem voordoet tijdens de ontsteking, op de oranje noodstopknop drukken die vooraan op de spectrometer is aangebracht. Nadien nogmaals op dezelfde knop drukken om de ontsteking van het plasma opnieuw mogelijk te maken. Het CRI-gas openzetten en de leidingen spoelen door op ‘Actions’ – ‘CRI gas supply purge’ – ‘Test’ te clicken. Het werkblad « speciationAs.MSWS » inladen en er de optimalisatieparameters van een vorige analysedag in copiëren (C:\Program Files\Varian\ICP-MS Expert\Run\My Results\Speciation\jaar (jaar in omloop)). Indien deze file beschadigd is kan een gelijkaardige file geopend worden vanaf een template met dezelfde naam via ‘Filenew- from template’. Het document “SOP/TRA/ANA/03/DOC02 : Het opmaken van een nieuw werkblad voor anorganisch As (ICPMS_expert)” (zie SOP/TRA/ANA/03) beschrijft hoe dergelijk werkblad nieuw kan aangemaakt worden. De bemonsteringssonde wordt in water of in aangezuurd water gedompeld en men laat het apparaat opwarmen gedurende 30 minuten. Gebruik de knop ‘Instrument’ en vervolgens ‘Autosampler control’ om de positie van het buisje aan te geven. Nagaan of het pompen van de vloeistof correct verloopt : aankomst (aan de nebulizer) en afvoer (aan het afvalvat). Het document “SOP/TRA/ANA/03/DOC03 : Voorzorgen en onderhoudsacties voor de ICP-MS” (zie SOP/TRA/ANA/03) beschrijft bijkomende acties en voorzorgsmaatregelen die regelmatig dienen genomen te worden om voortdurend een goede functionaliteit van de ICP-MS te garanderen.

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Het plasma ontsteken via het icoon

8.4.1.2. HPLC      

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De autosampler, 2 HPLC-pompen en de kolomoven aanschakelen De fles die bedoeld is voor het spoelen van de injector vullen met H20bid De prekolom installeren in de houder en het geheel handvast aanschroeven De kolom verbinden met de prekolom en de schroef die het geheel samenhoudt voldoende aanvijzen. Indien er tijdens het gebruik lekken ontstaan kan het nodig zijn ze lichtjes verder aan te spannen of om de ferrule te vernieuwen. De blauwe leiding die van de autosampler komt aansluiten aan de prekolom en de rode leiding die naar de ICPMS gaat aansluiten aan de uitgang van de kolom. Vervolgens de kolomoven aanschakelen. De solventenflessen die bestemd zijn voor pomp A en B bijvullen: Solvent A is een ammoniumcarbonaatbuffer van 40 mM op pH 9.4 en solvent B is milliQ-water. Bereid een voldoende hoeveelheid van elk solvent om te voorkomen dat de kolom droog komt in de loop van de analyse (risico op ingang van lucht in het systeem en afname van de analytische performantie van de kolom). Elk staal zal ongeveer 11 mL verbruiken van solvent A. Het niveau van het solvent in de afvalflessen controleren. Indien er te veel vloeistof aanwezig is wordt de fles afgevoerd naar de kelder (zie PRO/5.1/04 : afvalverwijdering). Het niveau controleren in de fles met dubbel gedistilleerd water voor de spoeling van de pompkoppen. Indien de fles die onderaan staat vol is wordt ze overgegoten in of verwisseld met de bovenste fles; regel de druppelsnelheid om een zo laag mogelijk debiet te bekomen. Opstarten van het programma “Galaxie” In de balk “Systems” klikt met op het het vakje “LC System” waardoor de pompen geïnitialiseerd worden. Deze worden vanaf dan gecontroleerd door het programma Galaxie via de bovenvermelde weg en m.b.v het volgende ikoon : Een spoeling van het chromatografiesysteem met milliQ-water is noodzakelijk bij de aanvang van elke analyse. Het debiet wordt geregeld op 0,5 mL/min, de samenstelling van het eluens op 100 % milliQ-water (solvent B), en de tijd om tot het gewenste debiet te komen wordt op 5 minuten ingesteld. Deze spoeling (om het bewaarsolvent uit de kolom te verwijderen) moet minstens 1 uur duren. Wanneer de spoeling met milli-Q water beëindigd is, moet de kolom gespoeld worden met de mobiele fase met 100% solvent A bij een debiet van 1 mL/min gedurende minimum 30 minuten. Wanneer de kolom voldoende geëquilibreerd is met het mengsel van de solventen dient het uiteinde van de rode leiding die aangesloten is op de uitgang van de kolom verbonden te worden aan de verstuiver van de ICP-MS. De aanvoerleiding op de peristaltische pomp van de monsterwisselaar van de ICP-MS wordt afgekoppeld. De 2 peristaltische pompen die dienen voor de evacuatie van de spray-chamber worden aangezet en de tubings worden erop gelegd.


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En cas d’allumage incorrect, appuyer sur le bouton orange d’arrêt d’urgence sur la face avant du spectromètre. Ne pas oublier d’appuyer à nouveau sur le bouton orange sinon il n’est pas possible d’allumer le plasma. Ouvrir l’arrivé des gaz CRI et purger le système en cliquant sur ‘Actions’ - ‘CRI gaz supply purge’-‘Test’. Charger la feuille de travail « speciationAs.MSWS » et y copier les paramètres d’optimisation d’une journée d’analyse précédente (C:\Program Files\Varian\ICP-MS Expert\Run\My Results\Speciation\AAAA (année en cours)). Si ce fichier est endommagé, un fichier similaire, peut être ouvert à partir d’un template portant le même nom, via ‘File-new-from template’. Le document « SOP/TRA/ANA/03/DOC02: Configurer une nouvelle feuille de travail pour détermination de l’As inorganic (ICP-MS_expert)» (voir SOP/TRA/ANA/03) décrit comment créer une telle feuille de travail. Plonger la sonde dans une solution d’eau ou d’eau acidifiée, et laisser chauffer l’appareil pendant 30 min. Utiliser l’onglet ‘Instrument’ et ensuite ‘Autosampler control’ afin d’indiquer la position du tube. Vérifier l’efficacité des pompages : arrivée (côté nébuliseur) et sortie (côté déchet). Le document «SOP/TRA/ANA/03/DOC03: « Actions de précaution et maintenance pour l’ICP-MS” (voir SOP/TRA/ANA/03) décrit des actions et précautions additionnelles à prendre régulièrement au niveau de l’ICPMS pour garantir en continu un bon fonctionnement.

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Allumer le plasma via l’icône suivante :

8.4.1.2 HPLC      

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Mettre sous tension l’échantillonneur, les deux pompes pour HPLC et le four pour la colonne Vérifier que la bouteille destinée au rinçage de l’injecteur soit remplie de H20bidi Installer la pré-colonne dans son support, serrer l’ensemble mais pas de manière excessive Connecter la colonne avec la pré-colonne, serrer suffisamment la vis qui maintient l’ensemble. Si éventuellement lors de l’utilisation, des fuites apparaissent, resserrer légèrement ou remplacer la ferrule. Connecter le tuyau bleu (sortant de l’échantillonneur) à la pré-colonne et le tuyau rouge à la sortie de la colonne puis installer la colonne dans le four thermostaté. Allumer ensuite le four à colonne Remplir les récipients pour les éluants avec les solvants suivant : le solvant A est une solution tampon de carbonate d’ammonium 40 mM à pH 9.4 et le solvant B est de l’eau milliQ. Préparer une quantité suffisante de chaque phase mobile afin d’éviter à la colonne de sécher en cours d’analyse (risque de laisser entrer de l’air dans le système et de dégradation des performances analytiques). Chaque échantillon consommera 11 mL du solvant A.

Contrôler le niveau du solvant dans les bouteilles de déchet, si nécessaire évacuer la bouteille vers la cave (voir PRO/5.1/04 : élimination des déchets). Contrôler le niveau de solvant dans les bouteilles contenant l’eau bidistillée pour la lubrification pour les têtes de pompes. Si la bouteille du bas est remplie, transvaser son contenu dans (ou échanger avec) la bouteille du haut et régler le goutte à goutte pour obtenir un débit le plus faible possible. Démarrer le logiciel Galaxie Dans l’onglet « Systems », cliquer sur la case à cocher « LC System », ce qui a pour conséquence d’initialiser les pompes, elles sont désormais contrôlées par le logiciel Galaxie via l’onglet « Systems », dans le sous menu symbolisé par l’icône suivante : Un rinçage du système chromatographique par de l’eau milliQ est nécessaire avant toute analyse préalable. Régler le débit sur 0,5 mL/min, la composition de l’éluant sur 100% d’eau milliQ (100 % solvant B), à atteindre sur une durée de 5 min. Ce nettoyage doit durer au minimum une heure pour éliminer le solvant utilisé lors du stockage de la colonne. Lorsque le rinçage est terminé, il faut équilibrer la colonne en faisant passer de la phase mobile avec la composition suivante : 100% du solvant A à un débit de 1 mL/min pendant au minimum trente minutes. Lorsque la colonne a été suffisamment conditionnée avec le mélange d’éluants. connecter le tuyau rouge au nébuliseur de l’ICP-MS. Relâcher le tuyau de l’échantillonneur de l’ICP-MS de la pompe péristaltique de l’ICP-MS. Les 2 pompes péristaltiques pour l’évacuation de la chambre de nébulisation sont misent en marche et les tubings sont fixés.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 8.4.2. Voorbereiding van de werkprogramma’s en van de analyse. 8.4.2.1. ICP-MS  

Neem de file “speciationAs.msws” Plaats de sonde in de VARTUNE 5 ppb en bekijk het signaal door op ‘start’ te klikken in het blad “optimization” van het “Methode” menu. Wijzig eventueel de parameters in het menu, om het signaal te optimaliseren.

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Er wordt aangeraden om minstens volgende waarden te bekomen:

In115 Th232 Be9 As75

Benaderende intensiteit van het signaal (in c/s) > 1,5.106 > 1,5.106 > 4.104 < 4.102

Fractie oxiden en dubbele ladingen Ce/CeO Ba/Ba++

< 3% < 3%


Element (massa)

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Na optimalisatie van het systeem, het aparaat nog gedurende 30 minuten laten stabiliseren met de parameters van de dag, vooraleer de analyse te starten. De ICP-MS is nu correct geconfigureerd en klaar voor de analyse van de stalen. Controleer of er geen meetgegevens geregistreerd zijn in het deel ‘worksheet’ van de file. Indien dit wel het geval is dienen de aanwezige cijfers uitgeveegd te worden gebruik makend van het menu “Edit/erase worksheet data” anders zal de analyse niet opstarten.

BELANGRIJKE OPMERKINGEN

 Zorg ervoor dat er slechts één werkblad geopend is op het ogenblik van de analyse.  Het plasma zal niet automatisch uitgaan, wat ook de gekozen regelingen zijn. Voor een langdurige analysesequentie is het aan te raden een tijdvenster te kiezen dat moet toelaten verspilling van Ar te voorkomen. 8.4.2.2. HPLC  

Maak een nieuwe analysereeks in Galaxie aan via het menu “Files”, “new”, “new sequence”. Geef een naam aan de analysereeks en kies de optie “Arsenic” als analyse folder. Begin met het invullen van het veld “method” met de analysemethode « SOP04_As Inorganic_SolA jjmmdd.METH » (C:\Galaxie\Data\Arsenic), die de datum draagt verwijzend naar de aanmaak van de individuele geconcentreerde standaardoplossingen. Het document “SOP/TRA/ANA/04/DOC01 : Het opmaken van een nieuwe methode file voor As-speciatie in Galaxie” (in bijlage 1) beschrijft hoe een nieuwe file voor de analysemethode kan aangemaakt worden voor het geval hogergenoemde methodefiles verloren of beschadigd zijn. Het volstaat een enkel veld in te vullen met de methode en vervolgens op de hoofding van de kolom te klikken en ten slotte op het ikoon klikken om automatisch al de andere velden “method” voor de andere stalen in te vullen. Opgelet, op het einde van een analysereeks moeten 2 ‘shutdown’ stalen (vials gevuld met milliQ-Water) toegevoegd worden en ingesteld worden met de respectievelijke methoden “lowflow0.2_20A80B_A.Meth” en “lowflow02_20A80B_B.meth”. Deze twee methoden dienen om het debiet aan mobiele fase te verminderen eens de analyse beëindigd is.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 8.4.2. Préparation des programmes de travail et d’analyse 8.4.2.1 ICP-MS Accéder au fichier “speciationAs.msws” Placer la sonde dans la solution VAR TUNE 5 ppb et regarder le signal qui en découle en cliquant sur ‘start’ dans la feuille ‘Optimization’ dans le menu ‘Method’. Modifier éventuellement les paramètres du menu pour optimiser le signal. Il est conseillé d’avoir au moins les valeurs suivantes:

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Intensité approximative du signal (en c/s)

In115 Th232 Be9 As75

> 1,5.106 > 1,5.106 > 4.104 < 4.102

O C ng op ek ie on no tr n ole co er nt de rô k lé op e Elément (masse)

Fraction des oxydes et des doubles charges Ce/CeO Ba/Ba++

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< 3% < 3%

Après optimisation du système, laisser encore l’appareil se stabiliser pendant 30 minutes avec les conditions du jour, avant de démarrer les analyses. L’ICP-MS est correctement configuré et prêt pour analyser les échantillons. Vérifier que la feuille de travail ne contienne aucune donnée dans la partie ‘worksheet’. Dans le cas contraire effacer ces valeurs au moyen du menu “Edit/Erase worksheet data ” ou sinon l’analyse ne pourra par démarrer.

REMARQUE IMPORTANTES  

veiller à ce qu’une seule feuille de travail dans ICP-MS_expert soit ouverte au moment où l’analyse commence Le plasma ne s’éteindra pas automatiquement quel que soit les réglages choisis. Pour de longue séquence d’analyse, il est conseillé de choisir un créneau horaire permettant d’éviter le gaspillage de l’Ar

8.4.2.2 HPLC  

Créer une nouvelle séquence d’analyse dans Galaxie, via le menu “Files”-“new”-“new sequence”. Attribuer un nom à la séquence et choisir l’option “LC Arsenic” comme dossier d’analyse. Commencer par remplir le champ « method » avec la méthode d’analyse « SOP04_As Inorganic_SolAjjmmdd.METH qui porte la date de la préparation des standards individuelles concentrées » (C:\Galaxie\Data\Arsenic) Le document « SOP/TRA/ANA/04/DOC01 : Configurer une nouvelle méthode chromatographique pour la spéciation (Galaxie)» (en annexe 1) décrit comment configurer une méthode d’analyse pour la spéciation). Il suffit de remplir un seul champ avec le nom de la méthode puis de cliquer sur l’entête de la colonne et enfin sur l’icône pour remplir automatiquement tous les autres champs « method ». A la fin d’une séquence, deux échantillons ‘low flow’ (vial contenant de l’eau milliQ) doivent être ajoutés et réglés respectivement sur les méthodes “ lowflow0.2_20A80B_A.Meth” et “ lowflow02_20A80B_B.meth.meth”. Ces deux méthodes permettent de réduire le débit de la phase mobile une fois l’analyse terminée.


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De velden “Run Name (prefix)” invullen met de namen van de stalen. Een typsiche sequentie begint met twee vials gevuld met de extractie-oplossing (0.1M HNO3 3 %H2O2=BG;background)) (ten einde de achtergrondruis en de aanwezigheid van eventuele verontreinigingen te evalueren), vervolgens komen de procedureblanco’s, de As ijkstandaarden (in stijgende concentratie) en het QC-staal (5ppb); tenslotte een oplossing van 1 % salpeterzuur, een BG-staal en een milliQ_water, )gevolgd door de CRM(S) en de stalen. Op het einde van de sequentie, vlak voor de “low flow” oplossingen wordt de onafhankelijk ijkstandaard van As (5 ppb) opnieuw gemeten om de stabiliteit van het signaal na te gaan. Het veld “Run Id postfix” invullen. Het eerste veld van de kolom kiezen en daarin het getal 1 invullen. Klikken op de hoofding van de kolom en het ikoon kiezen, waardoor een venster verschijnt dat toelaat om de rest van de velden automatisch in te vullen. De analysereeks (sequentie) opslaan. De autosampler van de ICP-MS (SPS-3) uitschakelen.


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In de balk “Systems”, het ondermenu ICP kiezen dat wordt vorgesteld met volgend ikoon en op de knop “connect” drukken. Deze actie koppelt de HPLC aan de ICP-MS. In dit stadium is het systeem klaar om de verwerving van gegevens te beginnen.

8.4.2.3. Instellen van de monsterwisselaar van de HPLC

Het laatste apparaat dat moet geconfigureerd worden is de monsterwisselaar van de HPLC. Hiertoe dienen een aantal parameters ingegeven te worden via het controlepaneel van het apparaat. Na aanzetten van de autosampler dient op de knop die overeenkomt met het commando ‘auto page’ gedrukt te worden en kunnen de volgende gegevens ingegeven worden:  Het nummer van de eerste te analyseren vial (in principe 1)  Het nummer van het laatste te analyseren vial (in principe gelijk aan het totaal aantal vials aanwezig in de carrousel)  De analysetijd per staal: 10 minuten Deze tijd stemt overeen met de tijd voor verwerving van een chromatogram, + 2 minuten voor het spoelen van de naald van de injector en om naar het volgende staal te gaan.  Het injectievolume (in principe 60µL)  Het aantal injecties per vial (in principe 1) 8.4.2.4. Start van de analyse

Om de analyse te starten volstaat het om op de groene pijl te klikken aanwezig boven de analysereeks. Het systeem maakt zich dan klaar om de analyse te starten (before run, prerun, stabilisaton delay: zichtbaar als stappen in Galaxie). Als “waiting for injection” verschijnt in Galaxie, dan “start auto” op autosampler indrukken. Het geheel van de verwerving en de controle gebeurt volledig en automatisch door de Galaxie-software. 8.4.3. Einde van de analyse 8.4.3.1. ICP-MS  

Op het einde van de analysereeks wordt het plasma manueel gedoofd door te klikken op het icoon Na het doven van het plasma: -wachten tot het einde van het aftellen van 120 s wat moet toelaten om de cones volledig te laten afkoelen. -de leidingen van de peristaltische pomp losmaken -de stalenwisselaar uitschakelen -de toevoer van H2 afsluiten; nooit de Ar aanvoer afsluiten


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Remplir les champs “Run Name (prefix)” avec les noms des échantillons. Typiquement une séquence commencera par deux vials contenant la solution d’extraction (HNO3 0.1 M dans 3% H2O2 =BG (background)) (afin d’évaluer le bruit de fond ainsi que la présence d’éventuelles impuretés), puis par les blancs procédés, les solutions étalons (par ordre croissant de concentration) puis la solution étalon indépendante (5 ppb) (QC) et enfin une solution de rinçage de 1% en acide nitrique suivi d’unautres BG et un vial contenant de l’eau milliQ avant les MRC et les échantillons. A la fin de la séquence, avant les deux échantillons ‘shutdown’, un vial contenant de la solution étalon indépendante (5 ppb) sera ajouté de nouveau pour évaluer la stabilité du signal. Remplir le champ « Run Id postfix », sélectionner le premier champ de la colonne et y introduire le chiffre « 1 ». Cliquer sur l’entête de la colonne et choisir l’icône : une fenêtre apparait vous permettant de numéroter automatiquement le restant des champs. Enregistrer la séquence. Eteindre l’autosampler de l’ICP-MS (SPS-3) et appuyer sur le bouton ‘connect’. Dans l’onglet « Systems », sélectionner le sous menu ICP


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Cette action couple l’HPLC à l’ICP-MS. A ce stade le system est prêt à commencer l’acquisition des données

8.4.2.3. Configuration de l’échantillonneur de l’HPLC

Le dernier instrument à configurer est l’échantillonneur de l’HPLC, cette étape nécessite d’introduire certains paramètres via le panneau de contrôle de l’appareil. Après allumage de l’appareil, appuyer sur le bouton correspondant à la commande ‘auto page’ et entrer les informations suivantes :  Le numéro du premier vial à analyser (par défaut : 1)  Le numéro du dernier vial à analyser (par défaut : le nombre total de vial présent dans le carrousel)  La durée d’analyse par échantillon: 17 minutes Cette durée correspond au temps d’acquisition, défini dans la méthode, augmenté de deux minutes, c’est le temps nécessaire pour rincer l’aiguille de l’injecteur et aspirer l’échantillon suivant  Le volume d’injection (par défaut : 60 µL)  Le nombre d’injections par vial (par défaut : 1) 8.4.2.4. Démarrage de l’analyse

Pour démarrer l’analyse il suffit de cliquer sur la flèche verte présente au-dessus de la séquence d’analyse. Le système se prépare alors pour commencer l’analyse (before run, prerun, stabilisaton dealy: visible comme étapes dans Galaxie). Quand ‘waiting for injection’ se montre dans Galaxie, le bouchon « start auto » sur l’autampler doit être activé. L’ensemble de l’acquisition et du contrôle est totalement et automatiquement géré par Galaxie. 8.4.3. Fin de l’analyse 8.4.3.1 ICP-MS  

A la fin de la séquence d’analyse, éteindre le plasma en cliquant sur l’icône Après l’extinction du plasma : - Attendre la fin du compte à rebours de 120 secondes permettant le refroidissement complet des cônes - Relâcher les tuyaux de la pompe péristaltique - Eteindre l’échantillonneur de l’ICP-MS - Fermer la vanne d’arrivé d’H 2, ne jamais couper l’arrivée d’Ar


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 8.4.3.2. HPLC  

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De analysesequentie opslaan en sluiten De chromatogramen zijn automatisch opgeslagen in een dossier dat de datum draagt van de analyse (C:\Galaxie\Data) De leiding die de uitgang van de kolom met de verstuiver verbindt losmaken en in de afvalfles brengen. De carrousel uit de monsterwisselaar nemen en eventueel de “vials” bewaren in de koelkast. Het spoelen van de kolom uitvoeren door er een aangepast solvent door te sturen gedurende 1 uur aan een snelheid van 0,5 mL/min . Het type aangepast solvent is afhankelijk van de verwachte duur dat de kolom nadien niet gebruikt zal worden: -indien de verwachte duur minder dan 3 dagen bedraagt, dient de kolom gespoeld te worden met milliQ-water -indien de verwachte duur meer dan 3 dagen bedraagt, moet de kolom gespoeld worden, eerst met MilliQ-water en dan met een oplossing van minstens 50% methanol, om de groei van bacteriën in de kolom te verhinderen Eens de spoeling is beëindigd, het debiet op 0 mL/min brengen op een tijd van 5 minuten. Niet vergeten om voor het stockeren van de kolom, de 2 plastiek doppen erop te vijzen om te verhinderen dat het solvent verdampt tijdens de stockage en de kolom zo uitdroogt. De peristaltische pompen uitschakelen, evenals de kolomoven, de monsterwisselaar en de HPLC-pompen.

8.5. Behandeling van gegevens

8.5.1. Integratie van de pieken

De integratie en identificatie van elke piek die gedetecteerd wordt in een chromatogram gebeurt automatisch en afhankelijk van de parameters in de methode die gebruikt wordt voor de chromatografische scheiding van het staal. Een menselijke interventie is soms nodig om tot correcte resultaten te komen, bijvoorbeeld wanneer onbekende pieken zich zeer dicht bij één van de te quantificeren pieken bevinden. De corrigerende maatregelen zijn bvb. een manuele toewijziging van de integratielimieten van de pieken en een check of de identificatie van de betrokken species juist is verlopen. Om de integratielimieten van de pieken te corrigeren kunnen de groene en rode merkers die respectievelijk het begin en het einde van de integratie aanduiden verschoven worden met behulp van de knop De cursor van de muis verandert dan van vorm, een klik op de merker zet hem in de veranderingsmodus, en en tweede klik valideert de gekozen positie als nieuwe positie van de merker. Na het behandelen van de chromatogrammen, dienen deze bewaard en gesloten te worden. 8.5.2. Calibratiecurve

De concentratie van anorganisch As wordt berekend aan de hand van een calibratiecurve van AsV (lineair model); door gebruik van het mengsel van HNO3 en H2O2 als extractiemiddel, wordt AsIII immers ook omgezet tot AsV. Deze rechte resulteert uit de chromatogrammen van de 5 standaardoplossingen. Vooraleer de calibratiecurve op te maken, dienen de chromatogrammen van de standaarden correct geïntegreerd te zijn en zo bewaard te worden (via ‘File- save chromatogram’).


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 8.4.3.2 HPLC  

 


ie

  

Sauver et fermer la séquence d’analyse Les chromatogrammes sont automatiquement sauvegardés dans un dossier (C:\Galaxie\Data) comportant la date d’analyse. Retirer le tuyau qui relie la sortie de la colonne au nébuliseur de l’ICP-MS et le raccorder à la bouteille de déchets Sortir le carrousel de l’échantillonneur et au besoin stocker les vials au frigo Procéder au rinçage de la colonne en faisant passer le solvant adéquat pendant une heure à un débit de 0,5 mL. Le type du solvant adéquat est fonction de la durée d’inutilisation : - Si la durée prévue est inférieure à 3 jours, la colonne doit être rincée avec de l’eau milliQ - Si la durée prévue est supérieure à 3 jours, la colonne doit être rincée, d’abord avec eau MilliQ et après avec une solution contenant au moins 50% de méthanol, ceci afin de prévenir la croissance de bactéries à l’intérieur de la colonne Une fois le rinçage terminé, amener le débit à 0 mL/min sur une durée de 5 minutes. Ne pas oublier avant de stocker la colonne, de visser les 2 embouts plastiques qui empêcheront l’évaporation du solvant en dehors de la colonne et le séchage de la colonne. Eteindre les pompes péristaltiques, le four pour la colonne et enfin l’échantillonneur et les pompes HPLC

8.5. Traitement des données 8.5.1. Intégration de pics

Par défaut, l’intégration et l’identification sont automatiques pour tout pic détecté dans un chromatogramme et dépendent des paramètres de la méthode choisie pour l’élution de l’échantillon. Une intervention humaine est parfois nécessaire pour obtenir des résultats corrects, par exemple si des pics inconnus sortent très près d’un pic à quantifier. Les mesures correctives possibles sont une assignation manuelle des limites d’intégration des pics et la vérification de l’identification correcte des composés d’intérêt présent dans le chromatogramme. Pour corriger les limites d’intégration des pics, des marqueurs de couleurs vertes et rouges indiquant respectivement le début et la fin de l’intégration d’un pic peuvent être déplacés à l’aide du bouton suivant : Le curseur de la souris change alors de forme, un clic sur un marqueur le place en mode édition et un second clic valide la position choisie comme nouvelle position du marqueur. Après le traitement des chromatogrammes, ils doivent être sauvegardés et fermés. 8.5.2. Courbe de calibration

La concentration d’arsenic inorganique est calculée au moyen de la droite d’étalonnage d’AsV. Par l’utilisation du mélange HNO3 et H2O2 dans la solution d’extraction, l’AsIII est convertie également en AsV. La droite d’étalonnage est construite à partir des chromatogrammes des 5 solutions étalons. Avant de créer la courbe de calibration, les chromatogrammes des étalons doivent avoir été correctement intégrés et sauvés (via ‘File-save chromatogram’).


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS Voor het opmaken van de calibratiecurve dient alsvolgt gewerkt te worden:


ie

1. Open de chromatogrammen van de standaarden, evenals de methode SOP04_As Inorganic_SolAjjmmdd.METH , die de datum draagt (jjmmdd) verwijzend naar de preparatie van de gebruikte geconcentreerde individuele ijkstandaarden . 2. Ga naar het gedeelte “Calibration” van de methode en verander de naam van de calibratiefile (“Calibration Curve File”) door de analysedatum en een referentie die verband houdt met de geanalyseerde stalen en kies de folder met de datum van de dag als opslaglokatie. 3. Save de methode in de folder met de datum van de analysedag met een nieuwe naam die begint met REPR_SOP04_SolAjjmmdd_x.METH en die tevens een verwijzing draagt naar de geanalyseerde stalen (x) (en sluit ze. Selecteer een chromatogram en klik op de “reprocess” knop die zich in de menubar bevindt. Selecteer vervolgens de volgende opties: Voor de balk Parameters -in de optie “Method file” kies de methode “REPR_SOP04_SolAjjmmdd_ref. i.vm. stalen.METH “ -“Sample type” = “Standard” -“Calibration mode”=”Clear old points”, voor de eerste standaard en “add” voor de volgende standaarden -“Level” voor de volgorde van de standaarden (1 voor de 0,5ppb standaard; 2 voor de 5,0 ppb; etc.) Voor de balk Opties -duidt alleen de optie “Calibration” aan

5. Klik op de knop “ reprocess” 6. Volg dezelfde procedure voor de 4 overige standaard chromatogrammen

Wanneer de calibratiecurve is opgesteld, dient ze nog geassocieerd te worden met de chromatogrammen van de stalen. Dit kan in één keer gebeuren voor alle stalen. Hiertoe dient een “Reprocessing list” aangemaakt te worden” in Galaxie (via “File” –“new” –“new Reprocessing list”). Hierin plaatst men, de chromatogrammen van de te behandelen stalen evenals de de methode ‘REPR_SOP_04_SolA_jjmmdd_ref. i.v.m stalen.METH’, waarin de betrokken calibratiecurve werd opgeslagen Zoals voor de analysereeks (sequentie), volstaat het om alle chromatogrammen te sluiten en op de groene pijl te klikken die zich boven de lijst bevindt om de berekeningen te starten. Wanneer de berekeningen gebeurd zijn dienen de chromatogrammen van de stalen geopend te worden om de integratie van de pieken na te kijken en indien nodig aan te passen (vb. start en stop van de piek, basislijn). 8.6. Uitvoer van de resultaten naar een Excel file.

In Galaxie kunnen de chromatogrammen op drie manieren worden voorgesteld:   

Het chromatogram alleen Het chromatogram samen met een tabel die de verschillende integraties van pieken samen brengt evenals de basislijn die de gebruiker kan toevoegen in functie van de resultaten van de scheiding. Het chromatogram en een tabel, waarbij alle gegevens voor elke piek die op het chromatogram gedetecteerd werden, worden voorgesteld. Zo vindt men dan ondermeer de naam van de As-species (indien deze kon geïdentificeerd worden), de retentietijd, de oppervlakte, de concentratie van de species (na calibratie).

Om de gegevens verbonden met de pieken te exporteren volstaat het rechts op de tabel te klikken en de optie “copy” te kiezen en vervolgens een excel file te openen en de gegevens er in te plakken.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS Procédure pour la création d’une courbe de calibration :


ie

1. Ouvrir les chromatogrammes des étalons ainsi que la méthode « SOP04_As Inorganic_SolAjjmmdd.METH» qui porte la date de la préparation des standards individuels concentrés. 2. Dans la partie « Calibration » de la méthode, modifier le nom du fichier de calibration (« Calibration Curve File ») et le remplacer par la date d’analyse et une référence liée aux échantillons analysés. Choisir le dossier avec la date du jour comme endroit de stockage. 3. Enregistrer le méthode dans le fichier qui porte la date du jour d’analyse avec un nouveau nom qui commence par « REPR_SOP04_SolAjjmmdd_x_.METH » et qui porte également une référence liée aux échantillons analysés (x) , puis fermer la méthode 4. puis fermer la méthode 5. Sélectionner un chromatogramme puis cliquer sur le bouton « reprocess » situé dans la barre de menu puis sélectionner les options suivantes : Pour l’onglet Parameters : - choisir l’option « Method file » et indiquer la méthode « SOP04_As Inorganic_SolAjjmmdd_ref lié aux échantillons.METH » - « Sample Type » = « Standard » - « Calibration mode » = « Clear old points » pour le premier étalon pour les autres choisir l’option « add » - « Level » pour l’ordre du standard (1 pour l’étalon 0,5 ppb ; 2 pour le standard 5,0 ppb etc.). Pour l’onglet Options : - Ne cocher que l’option « Calibration »

6. Appuyer sur le bouton « reprocess » 7. Effectuer la même procédure pour les 4 chromatogrammes restant

Lorsque que la courbe de calibration est terminée, il faut encore l’associer avec les chromatogrammes des échantillons. Il est possible d’effectuer cette manipulation en une fois pour tous les chromatogrammes. Pour cela on crée un fichier de ‘reprocessing list’ dans Galaxie (via ‘File’ – ‘new’ – ‘new reprocessing list’). On indique alors la méthode contenant la courbe de calibration correspondant à l’analyse (REPR_SOP_04_SolA_jjmmdd_ref. lié aux échantillons .METH’) et puis les chromatogrammes des échantillons à traiter. Comme pour la séquence d’analyse, il suffit de fermer tous les chromatogrammes et d’appuyer sur la flèche verte située au-dessus de la liste pour démarrer le traitement des chromatogrammes. Quand les calculs sont faits, les chromatogrammes des échantillons doivent être ouverts et l’intégration doit être vérifiée et ajustée si nécessaire (p.ex. start et stop du pic, ligne de base). 8.6. Exportation des résultats vers un fichier Excel

Dans le programme Galaxie les chromatogrammes peuvent être présentés de trois manières possibles:   

Le chromatogramme seul Le chromatogramme accompagné d’un tableau qui regroupe les différents évènements d’intégration des pics et de détection de la ligne de base que l’utilisateur peut ajouter en fonction des résultats de l’élution Le chromatogramme et un tableau reprenant les informations pour chaque pic détecté dans le chromatogramme parmi ces informations on retrouve le nom de l’espèce (si elle a pu être identifiée), son temps de rétention, son aire, la concentration de l’espèce (après calibration).

Pour exporter les données liées aux pics, il suffit de faire un clic droit sur le tableau et de choisir l’option « copier» puis d’ouvrir un fichier Excel et d’y « coller » les données.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 8.7. Technische moeilijkheden en/of defecten 8.7.1. ICP-MS Indien er een probleem optreedt, wordt dit onmiddellijk op het scherm ICP-MS EXPERT weergegeven onder de vorm van een foutmelding die de details van de anomalie weergeeft en de mogelijkheden om het op te lossen.


9.Specifieke voorschriften (veiligheid, bioveiligheid en milieu)

ie

8.7.2. HPLC De hulp van Galaxie is minder duidelijk en in het merendeel van de gevallen betreft het een overschrijding van de maximum druk waarna een melding verschijnt.

Bij de verschillende stappen in de voorbereiding van de stalen moeten de operatoren handschoenen dragen (bescherming tegen zuren en vermijden van contaminaties). Bij het gebruik van de microgolfoven moet de afzuiging van de trekkast in werking zijn (eventuele toxische dampen). Voor het bereiden van de bufferoplossing (loopmiddel A), moeten een beschermingsmasker, een veiligheidsbril en handschoenen verplicht gedragen worden. De samenstelling is irriterend bij contact, ingestie en inademing. Geconcentreerd salpeterzuur kan ernstige brandwonden veroorzaken. Voorkom huidcontact en inademing van dampen. Tijdens de metingen met de ICP: de afzuiging van de gassen moet aangekoppeld zijn (toxische dampen en koeling van het systeem). Hoge concentraties anorganisch As kunnen toxisch zijn en potentieel kankerverwekkend. Draag handschoenen bij de prepartie en manipulatie van geconcentreerde standaarden (≥1000mg/L) of poeders.

10.Interne controle

Bij de aanvang van elke reeks van analysen, wordt een CRM die representatief is voor de te meten stalen (plantaardige voedingsmatrices) 2 maal gemeten. Om de stabiliteit van het meetsignaal van het apparaat te controleren wordt aan het begin en op het einde van de analysereeks een onafhankelijke ijkstandaard (QC) gemeten. De QC aan het begin van de meetreeks mag maximum 5% afwijken ten opzichte van de 5 ppb standaard gebruikt voor de kalibratie. De QC op het einde van de meetreeks mag maximum 15% afwijken ten opzicht van de initiële QC. Wanneer een afwijking wordt vastgesteld tijdens een analysecyclus of wanneer de resultaten voor de CRM(s) buiten de grenzen liggen die vastgelegd zijn in de file ‘Accept CRM’ of (zie ook de acceptatiecriteria in de PRO/5.5/01/DOC02), dan worden de analyses hernomen na een nieuwe tuning en stabilisatie van het apparaat.

11.Rapportering

Het intern rapport wordt opgemaakt in Excel. De naam van de excel file heeft de vorm Jaarjaarmaandmaanddagdag_Asi_accred_referentie i.v.m. stalen_DATA en wordt bewaard onder ‘71/ICP-MS VARIAN/Inorganic As/jaar/. Het intern rapport omvat: -Excel Sheet ‘Cal’: de calibratiecurve van AsV (in te voeren in excel via een ‘print screen’ van de calibratiefile), -Excel Sheet ‘Standards’: de chromatogrammen en data van de standaarden gebruikt voor de calibratiecurve, -Excel Sheet ‘Resolution’: Op basis van het chromatogram van de 5ppb ijkstandaard zal voor het piekenpaar AsV-MMA de piekresolutie berekend worden aan de hand van de formule Rs= 2(Tr2-Tr1)/W1+W2), met Tr2 en Tr1 de retentietijden van de twee opeenvolgende pieken, en W2 en W1 de piekwijdte van de overeenkomstige pieken aan de basis. Zoals beschreven in het validatiedossier is deze piekwijdte equivalent aan de piekwijdte bij 13.4% van de piekhoogte. Zowel de retentietijden als de piekbreedte bij 13.4% van de piekhoogte worden in Galaxie weergegeven in het ‘results’ scherm van een chromatogram. Het volstaat om dit results-scherm van de 5ppb ijkstandaard, via copy-paste, in deze excel sheet te copiëren (inclusief het chromatogram) en vervolgens de nodige Rs berekening te maken.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS 8.7. Difficultés techniques et/ou pannes 8.7.1 ICP-MS Si un problème survient, il est directement affiché sur l'écran ICP-MS_EXPERT sous forme d’un message d'erreur contenant des détails sur l'anomalie identifiée et les solutions possibles.


9.Mesures spécifiques (sécurité, biosécurité et environnement)

ie

8.7.2 HPLC L’aide de Galaxie est moins explicite et dans la plupart des cas c’est essentiellement en cas de dépassement de la limite de pression maximum qu’un message apparait.

Lors des étapes de préparation, les opérateurs doivent porter des gants (protection aux acides et minimisation des contaminations). Lors de l’utilisation du minéralisateur à micro-ondes la hotte d’aspiration doit être en fonctionnement (vapeurs toxiques éventuelles). L’acide nitrique concentré peut causer des brulures en cas de contact avec la peau. Eviter le contact direct avec la peau et l’inhalation des vapeurs. Lors de la préparation de la solution tampon (éluant A), le port d’un masque de protection et de lunette de sécurité est obligatoire, ce composé est irritant par contact, ingestion et inhalation. Lors des mesures en ICP-MS : l’évacuation des gaz doit être branchée. Les concentrations élevées en arsenic inorganique peuvent être toxiques, carcinogènes. Le port de gants en nitrile est donc obligatoire pour manipuler les standards concentrés (concentration ≥ 1000 ppm ou poudre).

10.Contrôle interne

Au début de chaque série d’analyses, un CRM considéré comme représentatif du reste des échantillons est mesuré en 2 répliques. Pour assurer le contrôle de la stabilité de la réponse de l’appareillage, toute séquence analytique comprendra au début et à la fin un passage d’une solution étalon (QC). Le QC au début du passage peut dévier de maximum 5% par rapport à l’étalon de 5 ppb utilisé pour la calibration. Le QC à la fin du passage peut dévier de maximum 15 % par rapport au QC initial. En cas de dérive ou quand les résultats pour ce(s) CRM sont en dehors des limites fixées dans le fichier ‘Accept CRM’ (voir également critères d’acceptation dans le PRO/5.5/01/DOC2), les mesures seront recommencées après un nouveau tuning et stabilisation du système.

11.Rapport interne

Le rapport interne est fait en Excel. Le nom du fichier Excel est du type suivant ‘ Jaarjaarmaandmaanddagdag_Asi_accred_reference lié aux échantillons_DATA. et est sauvé sous ‘71/ICP-MS VARIAN/inorganic As/année’ Le rapport interne inclut: - Feuille Excel « Cal… » : les courbes de calibration d’AsV mesurées (importées par une copie d’écran du fichier de calibration) -Feuille Excel ‘Standards’ : les chromatogrammes et données des standards utilisés pour la courbe de calibration - Feuille Excel « Resolution » : à partir du chromatogramme de la solution étalon de 5 ppb, on calculera la résolution de la paire de pics AsV-MMA au moyen de la formule Rs = 2(Tr2 – Tr1)/(W1+W2) où Tr2 et Tr1 sont les temps de rétention de deux pics consécutifs, W2 et W1 la largeur des pics à la base. Comme décrit dans le dossier de validation, la largeur d’un pic, W, peut être estimée en mesurant la largeur du pic à une hauteur égale à 13,4% de la hauteur du pic. Tout comme le temps de rétention, la largeur (à h = 13,4%) est donnée par Galaxie en cliquant sur le bouton ‘results’ des chromatogrammes. La feuille resolution doit donc regrouper les éléments suivants : une copie du chromatogramme de la solution étalon 5ppb, une copie du tableau des résultats et le calcul des différentes résolutions Rs par paire de pics.


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Titel/Titre : Bepaling van anorganisch arseen via HPLC-ICP-MS / Détermination de l’arsenic inorganique via HPLC-ICP-MS -minstens 1 chromatogram als voorbeeld voor elke staal, de CRM(s) en de procedure-blanco -de concentratie AsV in de procedure-blanco; -de verdunningsfactoren van de stalen, -de concentratie AsV in de oplossing en in de matrix, zowel voor de stalen als voor de CRM(s), -Excel Sheet ‘Summary’ (uit te printen voor de technisch verantwoordelijke): -het dossiernummer, -het staalnummer, -de concentratie AsV (en eventueel ook van andere aanwezige species) in de 2 replica’s van de CRMs en van de stalen, -de begin- en eindwaarden van de onafhankelijke ijkstandaard + het procentueel verschil tussen beide -de berekende piekresolutie voor het piekenpaar MMA-AsV.


ie

-Excel Sheet ‘Results’:

Een pagina met de registratie van de technische parameters (SOP/TRA/ANA/04/DOC02 : Formulier voor de registratie van de technische parameters zie template in bijlage 2) dient zowel in de labomap ‘Extracties’ te worden geplaatst als bewaard te worden onder ‘71/ICP-MS VARIAN/Inorganic As/jaar/Extractie (technische parameters). De naam van deze file heeft de vorm Jaarjaarmaandmaanddagdag_Asi_accred_referentie i.v.m. stalen_TP. Wekelijks wordt een back-up van de in Galaxie gegenereerde files gemaakt op een externe harde schijf. Na het maken van een back-up dient dit geregistreerd te worden op SOP/TRA/ANA/03/DOC06 (zie SOP/TRA/ANA/03).

12.Bijlagen

Bijlage 1: SOP/TRA/ANA/04/DOC01/V01 : Het opmaken van een nieuwe methode file voor de bepaling van anorganisch As (Galaxie) Bijlage 2: SOP/TRA/ANA/04/DOC02/V02 : Formulier voor de registratie van de technische parameters


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ie

- Feuille Excel « Results » : - au moins 1 chromatogramme par échantillon comme exemple, le(s) MRC(s)et le blanc -la concentration d’AsV dans le blanc (quantité ppb) ; -le facteur de dilution des échantillons, -la concentration d’AsV présentes dans l’extrait et dans la matrice, aussi bien pour les échantillons que pour le(s) MRC(s), - Feuille Excel « Summary » (à imprimer pour le responsable technique) comprenant :  le numéro du dossier  le numéro de l’échantillon  La concentration des espèces présentes dans les 2 répliques pour le(s) MRC et pour les échantillons,  les valeurs de la solution étalon indépendante (début et fin de séquence) et la différence en pourcentage entre les deux  la résolution calculée de la paire de pics MMA-ASV. Une page avec l’enregistrement des paramètres techniques (SOP/TRA/ANA/04/DOC02: Formulaire pour l’enregistrement des paramètres techniques en annexe 2) sera ajoutée dans la farde ‘extractions’ et sera sauvé sous ‘71/ICP-MS VARIAN/InorganicAs/jaar/Extractie (technische parameters)’. Le nom de ce file est du type suivant ‘ Jaarjaarmaandmaanddagdag_Asi_accred_reference lié aux échantillons_TP. Une fois par semaine, une sauvegarde des fichiers Galaxie générés est effectuée sur un disque dur externe. Ces back-ups sont enregistrés sur le document SOP/TRA/ANA/03/DOC06 (zie SOP/TRA/ANA/03).

12.Annexes

Annexe 1 : SOP/TRA/ANA/04/DOC01/V01 : Configurer une nouvelle méthode chromatographique pour la spéciation de l’As (Galaxie) Annexe 2 : SOP/TRA/ANA/04/DOC02/V02 : Formulaire pour l’enregistrement des paramètres techniques

BIJLAGE 1 :

SOP/TRA/ANA/04/DOC01/V01 : Het opmaken van een nieuwe methode file voor As-speciatie (Galaxie) p1/2 Creëer een nieuwe methode in het programma Galaxie gebruik makend van het menu « File » en vervolgens het submenu “New Method”. Een configuratievenster wordt geopend en daarin kan worden nagegaan of de “Project name” wel degelijk overeenkomt met “Arsenic”. Op “volgende” klikken. Vervolgens de naam van de method ingeven evenals een beschrijving en vervolgens op OK klikken. De aldus gemaakte methode verschijnt in het kader « Data » dat zich bevindt onderaan links in het belangrijkste venster van Galaxie. Op de method klikken en er verschijnt een lijst in het kader dat zich er onmiddellijk onder bevindt. 1. Control - Pump - Elution Pressure Constant (bar) 3231.0

Compressiblity compensation

46.0

3231.0

ja

Time (min) Prerun 8.00

Flow (mL/min) 1.000 1.000

%A 100.000 100.000

%B

0 0

Equilibration Time (min) : 1.00 Hold Time (min) : 0.00

2. Control - Pump – Miscellaneous Start mode End of Sequence On Manual Run Abort

Inject Trigger on pimp A Leave pump On Stop gradient immediately

3. Control - Pump – Pressure Min. pressure (Bar) Max. pressure (Bar)

0 275

4. Control – ICP-MS

Scan Interval (s) Use current ICPMS Method 5. Acquisition

Acquisition parameters Acquisition length 8 (min) Injection Volume 60 (µL)

Refill Time (msec) 125

ie

Compressibility (1/Mbar) 46.0


Solvent Ammoniumcarbonaat 60 mM pH9 milliQ -water

0 ja (de methode zoekt het actieve blad in ICP-MS_expert)

125

p2/2 6. Integration events Used   

RT (min) 0.00 0.00 3.5

Name Set Peak Width Set Threshold Set Threshold

On/Off

Value 0.700 1,000.000 1.000

7. Peak identification Peak Name AsV

RT (min) 6.20

Abs. Window (min) 1.00

Window % 0.00

External Standard ppb naam van de directory voor de ijkcurve (te wijzigen voor elke nieuwe analysereeks op gevaar af de oude directory te schrappen) Area


Type Standard Unit Calibration curve file

Mode Nearest

ie

8. Calibration

Cal yes

Response Options

Factors curve

Response unit curve unit

Unknown compounds identical none Use references neen 1 / RF neen Define Qty intervals neen Level number 4 Average levels neen Component Model (0,0) ? AsV

Linear

Add (0,0) ?

Weighting

Level 1

Level 1

Level 2

None

Calibratieblanco

standaard 1

standaard 2

Level 3

Level 4

standaard standaard 3 4

ANNEXE 1 :

SOP/TRA/ANA/04/DOC01/V01 : Configurer une nouvelle méthode chromatographique pour la spéciation de l’As (Galaxie) p1/2 Créer une nouvelle méthode dans Galaxie en utilisant le menu « File » puis le sous-menu « New » et enfin l’option « New Method ». Une fenêtre de configuration s’ouvre vérifier que « Project Name » correspond bien à « Arsenic », cliquer sur suivant. Entrer ensuite le nom de la méthode et accessoirement une description, cliquer sur Ok. La méthode ainsi crée apparaît dans l’onglet « Data » située dans la partie inférieur gauche de la fenêtre principal de Galaxie. Cliquer sur la méthode, une liste de propriétés apparaît alors dans le cadre situé immédiatement en dessous.

Compressibility (1/Mbar) 46.0

Pressure Constant (bar) 3231.0

Refill Time (msec) 125

46.0

3231.0

125


Solvent Carbonate d’ammonium 60 mM pH9 Eau milliQ

ie

1. Control - Pump - Elution

Compressiblity compensation

oui

Time (min) Prerun 8.00

Flow (mL/min) 1.000 1.000

%A 100.000 100.000

%B

0 0

Equilibration Time (min) : 1.00 Hold Time (min) : 0.00

2. Control - Pump – Miscellaneous Start mode End of Sequence On Manual Run Abort

Inject Trigger on pimp A Leave pump On Stop gradient immediately

3. Control - Pump – Pressure Min. pressure (Bar) Max. pressure (Bar)

0 275

4. Control – ICP-MS

Scan Interval (s) Use current ICPMS Method

0 oui (la méthode cherchera donc la feuille active dans ICP-MS_expert)

5. acquisition Acquisition parameters identifier Acquisition length Injection Volume autoscale

8(min) 60 (µL)

6. integration events

p2/2 Used oui oui oui

RT (min) 0.00 0.00 3.5

Name Set Peak Width Set Threshold Set Threshold

On/Off

Value 0.700 1,000.000 1.000

7. Peak identification Peak Name AsV

RT (min) 6.20

Abs. Window (min) 1.00

Window % 0.00

Cal yes

Mode Nearest

External Standard ppb nom du fichier pour la courbe de calibration (à modifier pour chaque nouvelle série d’analyse, sous peine d’écraser l’ancien fichier) Area


Type Standard Unit Calibration curve file

ie

8. Calibration

Response Options

Factors curve

Response unit curve unit

Unknown compounds identical none Use references non 1 / RF non Define Qty intervals non Level number 4 Average levels non Component Model (0,0) ? AsV

Linear

Add (0,0) ?

Weighting

Level 1

Level 1

Level 2

None

Calibratieblanco

standaard 1

standaard 2

Level 3

Level 4

standaard standaard 3 4

BIJLAGE 2 / ANNEXE 2 SOP/TRA/ANA/04/DOC02/V02 : Formulier voor de registratie van de technische parameters Formulaire pour l'enregistrement des paramètres techniques

As-inorganic (SOP04):

 EXTRACTIE  nr naam tube

p 1/2

nr extractie

gewicht [mg]

VF

opm

1.0

3

1.0

4

1.0

5

1.0

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24


2

ie

1

1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

staat van de monsters:

matrix:

balans:

NA0,11M -

HNO3 0,11M: 3,63 ml HNO3 conc aanlengen tot 500ml met H2O Milli-Q + 9ml HNO3 0,11M + 1ml H2O2 30%

gebruikte pipetten:

vortexen + magnetische roerstaafje microwave:

prgrm:

centrifugeren:

centrifuge:

filtreren: tubes wassen in microwave:

datum extractie:

prgrm.:

operator:

p 2/2

ANALYSE  Calibratiestandaardreeks: As Mix stock 250ppb lotnr.:

solB As b -

V H2 O2 30% (µl) aanlengen to t [ml]

conc [ppb] 0 0.5 1 2 5

datum bereiding 250ppb: datum v bereiding ijkreeks: V HNO3 (µl )

0 100 200 400 1000

326 326 326 326 326

50 50 50 50 50


5000 5000 5000 5000 5000

ie

Vpi p v s tock 250ppb[ul ]

Quality check: QC: As Mix 5 ppb datum bereiding 250ppb:

stock 250ppb lotnr.:

solB As b -

datum v bereiding:

Vpi p v s tock 250ppb[ul ]

V HNO3 (µl )

500

163

V H2 O2 30% (µl) aanlengen to t [ml]

2500

25

Mobiele fasen:

datum bereiding:

A: 40 mM (NH4)2CO3

12,56 mg afwegen en aanlengen tot 2 L met H2O MilliQ

pH adjusteren tot 9,4 met NH3 25%

Analytische kolom:

gebruikte pH meter:

PRP-X100 Hamilton + guard: GA-1 Anion (Grace)

Serienummer:

Druk op kolom:

datum analyse:

OPMERKINGEN  operator:

bar

operator:

conc [ppb] 5

ctrl

Ongekontroleerde kopie Copie non contrôlée

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