Microbiologische methoden (E. coli) Gertjan Medema, Leo Heijnen
Ideale methode
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
2
Monsterneming bacteriologisch onderzoek
Monsterneming
3
Ideale methode Besmetting in distributienet
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
4
5
Kweekmethoden
Groei van bacteriën
6
7
E.coli methode Membraanfiltratie
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
8
Legionella methode Membraanfiltratie
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
9
10
Omstandigheden veranderen, ander resultaat
NEN 6265 BCYE medium pH 6,9 37ºC: Legionella pneumophila, anisa, bozemanii, gormanii, micdadei, jordanis, longbeachae BYCE pH 7,35 40ºC: Legionella pneumophila
11
Kweekmethode met enzymreactie
Colilert
12
E.coli Kweekmethode enzym activiteit
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
13
Kweekmethode en enzymactiviteit Colilert Quantitray
14
E.coli Kweekmethode enzym activiteit
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
15
E.coli Kweekmethode enzym activiteit (Hach)
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
16
E.coli Enzym activiteit (Coliguard)
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
17
Microscopische methoden
18
19
E.coli FISH
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
20
E.coli mRNA of DVC FISH
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
21
DNA methode: PCR (Polymerase Chain Rection)
PCR
22
E.coli /Legionella PCR
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
23
E.coli/Legionella PCR
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
24
Snelle detectie van L. pneumophila met Real-time PCR 0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Dagen -->
Kweken bij 37 ºC
Bevestiging (kweek)
Kweken bij 37 ºC
PCR
Q-PCR <4h
Selectief, snel, kwantitatief, gevoelig ! 25
12
E.coli NASBA
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
26
BTO E.coli NASBA
Behoefte Snelle detectie van fecale verontreiniging van water, snelle goedkeuring van reparaties Opzet Ontwikkeling gentechnologie (real-time NASBA) voor detectie van E. coli Resultaat NASBA toont in 3 – 4 uur levende E. coli aan, met zelfde gevoeligheid als bestaande methode.
Implementatie drinkwaterpraktijk Onderzoek werking bij reparatiemonsters Methode implementeren bij drinkwaterlabs Verbeteren robuustheid
27
BTO E.coli sensor
Behoefte Snelle on-line detectie van fecale verontreiniging van water Opzet Combinatie enzymtest met optische sensor voor detectie van E. coli Resultaat Sensorsysteem toont in 7 uur levende E. coli aan, met zelfde gevoeligheid als bestaande methode.
1
Implementatie drinkwaterpraktijk Onderzoek loopt nog
2
28
Detectiemethoden parasitaire protozoa
Cryptosporidium
Giardia 29
Detectie van parasitaire protozoa Concentratie/zuivering
30
Cryptosporidium en Giardia
Zuivering
31
Detectie van parasitaire protozoa Visualisatie
32
Fingerprinting: 18S rRNA gen sequenties van Cryptosporidium in water
0.02 substitutions/site
Twentekanaal 31/08 C. andersoni (AF093496) 82 100 100
72
C. serpentis (AF093499) 100
C. baileyi Bird (AF093495) C. felis (AF159113) C.canis (AF112576)
96
100 78 62
100
Biesbosch 14/11
Biesbosch 18/07 B Rhine 28/02
C. suis (AF108861) C. meleagridis (AF112574) 100 C. hominis (AF093491) C. hominis (AF093489) C. parvum Mouse (AF112571) C. wrairi (AF115378)
Nieuwe Dam 04/12 Nieuwe Dam 09/10 Biesbosch 07/11 Biesbosch 14/05 Biesbosch 19/03 Meuse 15/05b Biesbosch 25/04 Biesbosch 21/11 C. parvum Bovine (Iowa)
88
A
(Spike strain)
C. parvum Bovine (Iowa) (Spike strain) C. parvum Bovine (Iowa, AF164102) )
33
D
C.muris mouse (X64343)
100 99
Meuse 21/02 Meuse 15/05a Meuse 15/05 Spike
C
Crypto/Giardia Methode
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
34
Detectiemethodn virussen
Rotavirus Enterovirus
Hepatitis A virus
SRSvirus 35
Adenovirus
Detectie van kweekbare virussen (Van Olphen et al. 1984)
10-2000 L
Virus adsorptie aan negatief geladen filters bij lage pH Virus elutie met beefextract bij hoge pH
1.6 L
Ultrafiltratie (M 10,000) onder hoge druk 20-30 mL
Virus elutie BGM monolaag plaque assay
36
Detectie van kweekbare virussen (Van Olphen et al. 1984)
10-2000 L
Virus adsorptie aan negatief geladen filters bij lage pH Virus elutie met beefextract bij hoge pH
1.6 L
Ultrafiltratie (M 10,000) onder hoge druk
Info RIVM 20-30 mL
Virus elutie BGM monolaag plaque assay
37
Detectie van kweekbare virussen
38
Opbrensgt methode voor virussen
Info RIVM
39
Detectie van niet-kweekbare virussen (Lodder et al. 1999)
Filter adsorptie-elutie methode
(Van Olphen et al. 1984)
Twee- fase scheidingsmethode
RNA extractie met silica beads
Cloning
(Pöyry et al. 1988)
(Boom et al. 1990)
RT-PCR (Vinjé et al. 1996; Hussain et al. 1992)
Sequencing Phylogenetische analyses (Neighbour-Joining method) 40
Celkweek PCR voor virussen
Info RIVM
41
Celkweek vs PCR voor virussen
Info RIVM
42
Virus Methode
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
43
Ideale methode
Specifiek (geen vals -)
Reproduceerbaar
Simpel
Selectief (geen vals +)
100% recovery
Snel
Gevoelig
Levend/Infectieus
Goedkoop
Geen remming
Kwantitatief
Automatiseerbaar
44
