Mery (Psyllidae) jako přenašeči chorob v jabloňových sadech se zaměřením na druh Cacopsylla picta

Mendelova zemědělská a lesnická univerzita v Brně Zahradnická fakulta v Lednici

Mery (Psyllidae) jako přenašeči chorob v jabloňových sadech se zaměřením na druh Cacopsylla picta

Vedoucí bakalářské práce

Vypracoval

Ing. Marie Borkovcová, Ph.D.

Lukáš Lutr Lednice 2006 -1-

Prohlášení Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci na téma: „Mery (Psyllidae) jako přenašeči chorob v jabloňových sadech se zaměřením na druh Cacopsylla picta“ vypracoval samostatně a použil jen pramenů, které cituji a uvádím v přiloženém soupisu literatury. Souhlasím, aby práce byla uložena v knihovně Zahradnické fakulty Mendelovy zemědělské a lesnické univerzity v Brně a zpřístupněna ke studijním účelům.

V Lednici, dne: 19.6.2006 Podpis bakaláře: Lukáš Lutr

-2-

Poděkování -

panu RNDr. Pavlu Lautererovi za pomoc při determinaci nasbíraného materiálu a konzultaci

-

pracovníkům Katedry buněčné biologie a genetiky, PřF UP Olomouc za analýzu dodaných vzorků

-3-

OBSAH 1. Úvod

6

2. Cíl práce

7

3. Literární přehled

8

3.1. Rod Cacopsylla

8

3.1.1. Systematické zařazení

8

3.1.2. Všeobecná charakteristika rodu

8

3.1.3. Fytopatologický význam rodu Cacopsylla ve výsadbách jabloní

9

3.1.4. Ovocnářsky významné druhy

10

3.1.4.1. Cacopsylla melanoneura

10

3.1.4.1.1. Výskyt

10

3.1.4.1.2. Popis

11

3.1.4.1.3. Bionomie

11

3.1.4.2. Cacopsylla mali

13

3.1.4.2.1. Výskyt

13

3.1.4.2.2. Popis

14

3.1.4.2.3. Bionomie

15

3.1.4.3. Cacopsylla picta

17

3.1.4.3.1. Výskyt

17

3.1.4.3.2. Popis

18

3.1.4.3.3. Bionomie

18

3.1.4.4.Vektoři fytoplazmy proliferace jabloně z čeledi Psyllidae 3.2. Fytoplazmy

19 20

3.2.1. Popis, charakteristika a původ

20

3.2.2. Identifikace a diagnostika fytoplazem

21

3.2.2.1. Biologická charakteristika, biologické testy na indikátorech

21

3.2.2.2. Barvení DNA v sítkovicích

21

3.2.2.3. Metody molekulární biologie

22

3.2.2.4. Sérologické metody

22

3.2.3. Fytoplazma proliferace jabloně (fytoplazma AP)

22

3.2.3.1. Mezinárodní označení a klasifikace

22

3.2.3.2. Geografické rozšíření

22 -4-

3.2.3.3. Biologie fytoplazem

23

3.3. Jabloň (Malus ssp.) jako hostitel fytoplazmy AP

23

3.3.1. Příznaky napadení

23

3.3.2. Výzkum odrůd jabloní napadených fytoplazmou AP v ČR

25

3.3.3. Oblasti výskytu napadení fytoplazmou v ČR

26

3.4. Vztah vektor (Psylla) – fytoplazma AP- jabloň (Malus)

27

4. Experimentální a praktická část

28

4.1. Metodika sběru vzorků zástupců Psyllidae

28

4.2. Seznam nasbíraných vzorků zástupců Psyllidae v jednotlivých termínech

29

4.3. Výsledky analýzy dodaných vzorků metodou PCR

30

5. Závěr

30

6. English summary

31

7. Použitá literatura

32

-5-

1 Úvod Proliferace jabloně je považována za jednu z nejobávanějších chorob jabloní v Evropě. Původcem choroby je fytoplazma proliferace jabloně (AP) náležející ke skupině, která zahrnuje karanténní fytoplazmy rozšířené v evropském regionu jako jsou fytoplazma chřadnutí hrušně (PD) a fytoplazma Evropské žloutenky peckovin (ESFY). Zdá se, že mery (Psyllidae) hrají klíčovou roli v přenosu fytoplasmy do cévních svazků jabloní (Seemüller et al. 1998). Vektorem fytoplazmy AP je dle nejnovějších výzkumů mera Cacopsylla picta (Foerster), na níž je zaměřena tato práce. Frisinghelli et al. (2000) a Jarausch et al. (2003) potvrzují, že Cacopsylla picta (mladší synonymum Cacopsylla costalis) (Flor) je vektor fytoplazmy AP v severovýchodní Itálii a Německu. Ke zjištění, zda je mera schopna infikovat jabloň fytoplazmou je třeba sběr dospělců, výjimečně larev a následná analýza vzorků pomocí PCR metody. Jiný druh mery, Cacopsylla melanoneura, byl rovněž po molekulární analýze nasbíraných vzorků odhalena jako přenašeč fytoplazmy AP (Tomasi et al. 2000; Poggi Pollini et al. 2002; Tedeschi et al. 2003). Přes intenzívní výzkum bionomie se stále spekuluje o místě přezimování výše uvedených mer. Tato znalost by mohla umožnit případnou efektivní ochranu proti těmto přenašečům a omezit přenos infekce. Mezi další vektory fytoplasmy AP patří Philaenus spumarius (Linné) (Homoptera: Cercopoidea), Artianus interstitialis (Germar) (Homoptera: Cicadelidae), přičemž se infekce podařila uměle přenést z celeru na semenáče jabloní (Hegab a El-Zohairy 1986). Fieberiella florii (Stål) (Homoptera: Cicadellidae) je též považován jako přenašeč v Německu (Krczal et al. 1988) i když výsledky této práce jsou zpochybňovány (Lauterer, ústní sdělení).

-6-

2 Cíl práce -

zpracování literárních podkladů týkajících se mer škodících v jabloňových sadech se zaměřením na druh Cacopsylla picta a jeho možnosti infikovat jabloně fytoplazmou AP

-

sběr a determinace bezobratlých se zaměřením na čeleď Psyllidae zvláště pak na meru Cacopsylla picta v extenzivních sadech

-

ve spolupráci s katedrou buněčné biologie a genetiky PřF UP v Olomouci analyzovat pomocí PCR metody a zhodnotit nasbírané vzorky Cacopsylla picta z hlediska jejich možnosti infikovat jabloně fytoplazmou AP.

-7-

3 Literární přehled 3.1 Rod Cacopsylla 3.1.1 Systematické zařazení Říše

ŽIVOČICHOVÉ

Animalia ( Linneaus, 1758 )

Podříše

Eumetazoa ( Butschli, 1910 )

Oddělení

Bilateria ( Hatschek, 1888 )

Pododdělení

PRVOÚSTÍ

Prostostomia

Kmen

ČLENOVCI

Arthropoda

Podkmen

ŠESTINOZÍ

Hexapoda

Třída

HMYZ

Insecta

Podtřída

KŘÍDLATÍ

Pterygota

Infratřída

NOVOKŘÍDLÍ

Neoptera

Kohorta

Paraneoptera

Řád

Hemiptera

Podřád

Sternorrhyncha

Nadčeleď

MERY

Psylloidea

Čeleď

MEROVITÍ

Psyllidae

Rod

MERA

Cacopsylla

3.1.2 Všeobecná charakteristika rodu Cacopsylla Je to drobný hmyz o velikosti 1,0 – 5,5, který se podobá křísům (Pokorný a Jiskra 1996). Na rozdíl od nich ale mají dlouhá nitkovitá tykadla a oba páry křídel jsou blanité, často průhledné. V klidu jsou křídla složena střechovitě přes zadeček. Třetí pár nohou je zesílený a umožňuje odskakování mer od podkladu, na které navazuje let na krátkou vzdálenost (Kazda et al., 2003). Larva prochází u všech druhů mer pěti larválními instary, které se od sebe navzájem liší velikostí těla a tvarem zejména křídlových pochev. Larvy mer jsou steno až monofágní a jsou

-8-

málo pohyblivé vzhledem ke stavbě svého těla (dorsoventrální zploštění, přichycení k podkladu pomocí přizpůsobených nohou) (Vondráček, 1957). K přezimování dochází buď v podobě dospělého jedince (C. picta, C. melanoneura), vajíčka (C. mali) nebo v určité fázi larválního vývoje, jenž je pro určitý druh mery a klimatické podmínky neměnný a charakteristický. Larvy na rozdíl od dospělých jedinců při přezimování nikdy neopouštějí živnou rostlinu. Zůstávají na ní ukryté po celé zimní období. U některých druhů po imaginálním svlékání dochází k migraci na sekundární živnou rostlinu (C. mali, C. picta, C. melanoneura). K opětovnému návratu na primární živnou rostlinu dochází u C. mali v pozdním létě, u C. picta a C. melanoneura až po přezimování, kdy na ni samičky nakladou snůšky vajíček. Migrace jako taková slouží nejen k přezimování, ale také k rozšíření plošného areálu druhu (Vondráček, 1957). Výskyt, popis a bionomie jednotlivých druhů mer, jež se podařilo autorovi této práce nasbírat v lokalitě Těšetice budou zmíněny v následující kapitole (viz kapitola 3.1.4 Ovocnářsky významné druhy). 3.1.3 Fytopatologický význam rodu Cacopsylla ve výsadbách jabloní Na jaře vylíhlé larvy druhu Cacopsylla mali škodí sáním na pupenech, poupatech a květech. Sání na stopkách květních poupat a květech jabloní způsobuje často jejich zasychání a opad. Později sají na mladých listech, které se značně deformují. Silně napadené jabloně zaostávají při rašení v růstu a dřevo špatně vyzrává.. Jabloně pravidelně napadané tímto škůdcem jsou charakteristické hustou korunou, velkým množství suchých větví a malou násadou plodů. Mery dávají přednost uzavřeným polohám chráněným před větrem a vyhovují jim stromy s hustou korunou. Škodlivé výskyty bývají především v neudržovaných nebo neošetřovaných sadech a jejich opakovaná přítomnost oslabuje stromy (Kazda et al. 2003). Druhy Cacopsylla melanoneura a Cacopsylla picta jsou vektory karanténní fytoplazmy proliferace jabloně. Ochranná opatření jsou zpracována zatím jen pro druh Cacopsylla mali. Dobře provedený pozdní zimní (předjarní) postřik jejich vajíčka spolehlivě ničí. V místech výskytu se doporučuje při minimalizaci chemických ochranných opatření postřik nejméně každý druhý rok (Jiskra a Pokorný, 1996).

-9-

3.1.4 Ovocnářsky významné druhy 3.1.4.1 Cacopsylla melanoneura 3.1.4.1.1 Výskyt Druh Cacopsylla melanoneura se vyskytuje všude kde se nachází jeho hostitel Crataegus sp.. Krom nejsevernějších oblastí v Norsku a východní Skandinávie je přítomný po celé Evropě. Výjimečně však byl zaznamenán i za polárním kruhem v Norsku a Švédsku. (Ossiannilsson 1992). Jižní hranice jeho výskytu prochází Španělskem, Itálii (nevyskytuje se na Sicílii), Řeckem, Zakavkazskem (Gruzie, Arménie a Ázerbájdžán) a Středním východem (Tádžikistán a Uzbekistán). Nachází se i na Sibiři, v Mongolsku, Číně, Rusku na Dálném východě a Japonsku. V České republice, zejména na Moravě, je to jeden z nejčastěji se vyskytujících zástupců mer. Přezimuje ve stádiu dospělce a má jednu generaci do roka. Forma taurica (Lazarev, 1972) nemá žádnou taxonomickou hodnotu, jelikož se vyskytuje na jabloních a je synonymní se svojí typickou formou (Gegechkori & Loginova 1990). Cacopsylla melanoneura je široce oligofágní na Crataegus spp. (C. monogyna, C. oxyacantha, C. maximowiczii, atd). V některých regionech žijí a způsobují škody na jabloních (Malus spp.) případně i hrušních (Pyrus spp.) nebo mišpuli (Mespilus germanica ) (Lauterer 1999). Na Moravě se tento druh vyskytuje od nejnižších nadmořských výšek (159 metrů) se stejnou hustotou výskytu až do výšky 450 metrů nad mořem. V rozmezí výšek 450 až 700 metrů nad mořem byl výskyt velmi řídký. Nad tímto výškovým intervalem se druh vyskytoval jen ojediněle. Nejvýše položená lokalita výskytu se nacházela ve výšce 1060 metrů nad mořem. V tomhle ohledu se liší bionomie na Moravě od populací stejného druhu v jižní Evropě, kde jeho přezimování a aestivace probíhá na kosodřevinách ve vyšších nadmořských výškách. V lokalitách na Moravě se nejčastěji vyskytuje v teplých biogeografických jednotkách oblasti panonika. Zatímco ve studenějších oblastech hercynia nebyl jeho výskyt zaznamenán tak v jeho teplejších částech byl relativně hojný. Hojný výskyt byl zaznamenán v oblastech východního karpatika zejména v jeho nejteplejších biogeografických jednotkách a opět méně ve studenějších. Toto je jen částečně způsobeno tím, že tento druh je relativně termofilní. Je třeba také zohlednit rozdíly ve složení vegetace. Keře hlohu jsou relativně málo zastoupeny na

- 10 -

mezích a okrajích lesů v chladnějších biogeografických regionech a velice řídké v oblastech jedlových lesů. Cacopsylla melanoneura často přezimuje spolu se zvláštní skupinou mer (skupina Cacopsylla saliceti) a s Cacopsylla affinis. Na svých hostitelských rostlinách se vyskytuje spolu s Cacopsylla affinis, Cacopsylla peregrina a fenologicky zpožděnou Cacopsylla crataegi. Cacopsylla melanoneura se ve sběrech hojně vyskytovala a byla identifikována a prostudována ve 211 nasbíraných vzorcích. Nejstarší uchované vzorky tohoto druhu pocházející z Moravy jsou dva exempláře z roku 1906 z lokality Michálkovice nasbírané Šulcem. Ve svých pracích se jak Šulc tak i Vondráček zmiňují pouze o obecném výskytu tohoto druhu na celém území, ale bez udání detailnějších informacích. Ve sběrech uskutečněných Lautererem a jinými autory na území Moravy, byl od roku 1955 pozorován hojný a stabilní výskyt v každém roce bez významných výkyvů. Předpokládá se, že tato tendence bude pokračovat i do budoucna (Lauterer, 1999) 3.1.4.1.1 Popis Larvy Cacopsylla melanoneura jsou zelené, křídlové pochvy hnědavé, tykadla zelená a konce některých článků nahnědlé. (Lauterer, ústní sdělení ). Dospělci po posledním svlékaní jsou rezaví se zelenými abdomeny s výjimkou terminálií. Brzy poté se jejich zbarvení mění na rezavě hnědé po celém těle. Před přezimováním se barva mění na tmavě hnědou, během přezimování na tmavě černou a to jak na těle tak i na křídlech. Výjimky se téměř nevyskytují. (Lauterer.1999) 3.1.4.1.3 Bionomie Na Krymu byla zkoumána populace jedinců žijících na jabloni a pokud byla přemístěna na hloh, nevyvíjela se a uhynula během pár dní (Lazarev 1974). Na Moravě byly zkoumány populace jen na Crataegus spp., zatímco Lazarev (1974) studoval bionomii krymské populace na jabloních (Malus spp.). Zde dospělci žijí 9 až 10 měsíců na jedli (Pinus spp.) ve výšce kolem 250 – 1400 metrů nad mořem. Z těchto oblastí migrují na značnou vzdálenost na jabloně (Malus spp.). Na jabloně přelétají kolem března a dubna během periody 9 – 23 dní, přičemž masový přelet je limitován 5 – 6 dny. Dospělci se přemístí na rašící pupeny, kde každá samička naklade kolem 200 vajíček. Embryonální vývoj trvá 7 – 20 dní a larvy se

- 11 -

líhnou v době květu na jabloních. Larvy se vyvíjí kolem jednoho měsíce a dospělci se objevují v 1. a 2. dekádě května. Na konci května a v červnu, po kompletní sklerotizaci (tj. 5 dní po jejich posledním svlékání) dospělci migrují do vyšších nadmořských výšek s výskytem jedlí. Pátý instar larev se vyskytoval až do 19. července. Lauterer našel první generaci čerstvě vyvinutých dospělců na konci května. U tohoto druhu mohou být rozlišeny tři migrační fáze místo obvyklých dvou. Na konci září a v říjnu se

Cacopsylla melanoneura nejhojněji

vyskytuje ze všech druhů mer na okenních tabulích. Během těchto migrací mery často vyhledávají zdroje světla a mrtvé jsou pak nacházeny ve špatně utěsněných pouličních lampách (Lauterer a Malenovský 1997). Pokusy o kopulaci a kopulace samotné u dospělců byly pozorovány během června. Oplození však neproběhne pokud kopulace neproběhnou v termínu od března do května po přezimování. Asi týden po posledním svlékání a kompletní sklerotizaci dospělci vstupují do dormance typu parapauzy s aestivací, později typu diapauzy během přezimování. Celková reaktivace a vývoj pohlavních orgánů proběhne až po absolvování studené fáze zimy (Lauterer 1999). Na Moravě, v asociaci Querceto-carpinetum a částečně v nivních lesích většina populace přezimuje vzhledem k nedostatku jehličnanů na opadavých stromech, ukryta pod kůrou a na výhonech. Sezonní migrace na delší vzdálenosti do vyšších nadmořských výšek jsou u mladých dospělců po ukončené sklerotizaci omezeny na teplejší části jižní Evropy. V podmínkách střední Evropy probíhají migrace na kratší vzdálenosti. Na začátku jara nebo i v zimě, kdy se vyskytnou dny s vyššími teplotami, dochází na území Moravy k aktivaci populace dospělců. Lauterer pozoroval už na konci února a začátkem března migrace na hostitele dlouho před rašením pupenů. První nález mery po přezimování učinil 23. ledna. V tomto období se mery vyskytovaly jak v krytech na jižních svazích tak v podrostech nivních lesů. V posledně zmiňovaných oblastech se vyskytovala čistá populace bez příměsí Cacopsylla affinis, která se často vyskytuje s Cacopsylla melanoneura na slunných stanovištích. Téměř zralá vajíčka byla nalezena 14. března a starší larvální instary mezi první dekádou a koncem května. Larvy byly popsány Whitem a Hodkinsonem (1982) a podrobněji Ossiannilssonem (1992). První zástupci nové generace dospělců na Moravě se objevili ve druhé dekádě května (první dva vzorky 12. května a tři následující v dalších dnech). Hojně se vyskytovali ve třetí dekádě května (26 nasbíraných kusů). Masový výskyt nových dospělců byl

- 12 -

zaznamenán v první dekádě června, načež jejich počet rapidně poklesl a ke konci června se vyskytovali už jen vzácně. V červenci byl zaznamenán počet 14 kusů a v srpnu nebylo nalezeno nic. V polovině září a v listopadu se vyskytl ve sběrech jeden kus. Ve větších počtech pak ve fázi migrace v měsíci říjnu ze sekundárních na primární hostitele před hibernací (8 kusů). Brzká migrace ze sekundárních na jiné hostitele souhlasí s pozorováním Lazareva (1974). V rozporu s jeho výsledky pozorování se však na území Moravy objevila migrace nejprve na přechodné hostitele a až poté na jehličnany pokud se vůbec tato možnost naskytla (Lauterer, 1999) 3.1.4.2 Cacopsylla mali 3.1.4.2.1 Výskyt Cacopsylla mali je nejvíce rozšířenou merou na území České republiky a patří k nejhojněji se vyskytujícím druhům v Evropě z tohoto rodu. Je široce rozšířena od Irska až po Japonsko a od severní Skandinávie (nejsevernější lokality ležící v okolí Narviku, Norsko, poloostrov Kola, Rusko) až po centrální Španělsko a Itálii, Bulharsko, Anatolii a Zakavkazsko (Gruzie, Arménie a Ázerbájdžán), Kazachstán, Sibiř a Dálný východ. Do Severní Ameriky byla zavlečena na svých hostitelských rostlinách (Kanada), rovněž tak do Austrálie a údajně i do Jižní Afriky (Miller, 1956). Je to důležitý škůdce všech známých odrůd jabloní zvláště ve středních zeměpisných šířkách. Je zmiňován jako škůdce i na jihu Evropy i když se považuje jeho výskyt v Itálii za řídký a nepotvrzují v současnosti nějaké významnější škody způsobené tímto druhem (Conci et al., 1993). Gegechkori a Loginova (1990) zaznamenali významné škody na Kavkaze. Žije na. Malus domestica, Malus sylvestris, Malus pumila a dalších druzích rodu Malus. Napadány jsou především vyšlechtěné odrůdy. V období migrace ho lze však najít na širokém spektru hostitelů jako je Acer platanoides, Alnus glutinosa, Alnus incana, Ballota nigra, Berberis vulgaris, Betula verrucosa, Buxus sempervirens, Carpinus betulus, Coryllus avellana, Cosinus coggygria, Crataegus spp., Elaeagnus angustifolia, Fagus sylvatica, Fraxinus excelsior, Hippophae rhamnoides, Malus spp., Mycelis muralis, Padus laurocerasus, Pyrus communis, Populus alba, Populus nigra, Populus pyramidalis, Prunus domenstica, Primus insititia, Quercus cerris, Quercus petraea, Quercus robur, Rhamnus cathartica, Rosa canina, Salix alba, Salix babylonica, Salix fragilit, Salix purpurea, Salix

- 13 -

viminalis, Sorbus aucuparia, Tilia cordata, Trifolium pretense, Ulmus minor, Ulmus laevis (Lauterer 1999). Při systematických sběrech na Moravě učiněných Lautererem se tento druh masově vyskytoval do výšky 400 metrů nad mořem (nalezeno 333 kusů), v rozmezí 400 až 500 metrů nad mořem (nalezeno 52 kusů), v rozmezí 500 až 600 metrů nad mořem (nalezeno 45 kusů), v rozmezí 600 až 700 metrů nad mořem (nalezeno 15 kusů) a od výšky 700 metrů nad mořem (nalezeny 3 kusy). Nejvýše položený vzorek byl nalezen výšce mezi 1020 až 1080 metry nad mořem. Hodnoty uvedených nálezů ve výše zmíněných výškových intervalech jsou poznamenány vyšší četností sběrů v níže položených oblastech. Nelze z nich tedy objektivně usuzovat na přesnější poměry ve velikostech populací. Cacopsylla mali se vyskytuje na Moravě ve všech biogeografických jednotkách s výjimkou nejvýše položených, zalesněných oblastí v okolí Jeseníků a Beskyd. I tam se však vyskytuje v blízkosti lidských obydlí. Vzhledem k její vyvinuté schopnosti migrace se vyskytuje i ve společnosti jiných druhů mer (Lauterer 1999). 3.1.4.2.2 Popis Larvy Cacopsylla mali jsou zelené. Dospělci jsou světle zelení, jejich thorax dostává v srpnu žlutý nádech. Na začátku záři nebo po jeho polovině se barva thoraxu, abdominálních tergitů a občas i hlavy mění na červenou, přecházející přes červenohnědou až po tmavě hnědou. Později se hlava a výběžky zbarvují červenohnědě až okrově a spodní strana těla zůstává okrova. Samičky se stávají tmavější dřív než samečci, později často zůstávají okrové až do října. Přechod do tmavějšího odstínu nastává dříve v chladnějších oblastech a ve vyšších nadmořských výškách, kde je i délka života mer kratší (Lauterer 1999). 3.1.4.2.3 Bionomie Bionomie a morfologie tohoto druhu byla podrobně zkoumána mnoha autory vzhledem ke svému ekonomickému významu v ovocnářství. V této zemi se touto problematikou zabýval zejména Blatný et. al (1943). Druhy rodu Cacopsylla si jsou podobné jak v morfologii tak i v bionomii. Cacopsylla mali nebyla jednoznačně rozlišena od druhů jako je Cacopsylla sorbi a Cacopsylla peregrina do roku 1950. Vajíčka jsou kladena v průběhu září a října na letorosty speciálně v místech kde je kůra zvrásněna, především v okolí brachyblastů a po stranách - 14 -

pupenů. Méně často jsou kladena mezi dozrávající výhony. Tato vajíčka jsou pak chráněna před chemickým postřikem. Samičky kladou vajíčka na místa s dobrou nabídkou potravy a s tenkou kůrou, kde ještě neproběhla suberinizace rostlinné tkáně. Vajíčka jsou kladena tak, že jejich osa leží ve směru zvrásnění kůry, což znamená v pravém nebo šikmém úhlu vzhledem k orientaci růstu mladých větví. Chitinozní obal vajíček (chorion) má síťovitou texturu a proto jsou vajíčka vnímavější k insekticidům. Jsou kladena jednotlivě, často nepříliš daleko od sebe, kde jich ve skupině může být až deset nebo v krátkých liniích. Závisí na podkladu, na který jsou vajíčka kladena. Jejich barva je nejprve krémově bělavě žlutá, později tmavě žlutá až okrová, přičemž neoplodněná vajíčka zůstávají bělavě žlutá. Na jaře jsou některá špinavě bílá, což indikuje vysátí obsahu vajíčka predátorem Typhlodromus pyri. Přítomnost embrya signalizuje červenooranžová kulatá skvrna, jež prosvítá skrz chorion vajíčka. Většina vajíček je kladena na spodní plochu níže položených větví, odkud padají na zem. Chorion je pravděpodobně propustný pro vodu (permeabilní). Speyer (1930) pozoroval zvrásnění chorionu během periody největších mrazů, přičemž v době tání se stává opět pružným. Není známo zda je voda přijímána prostřednictvím pedicelu nebo celého povrchu vajíčka. Vzhledem k rozšířenosti tohoto druhu lze usuzovat na to, že vajíčka jsou značně mrazuvzdorná a to až do teploty -40°C. Larvy se líhnou v poslední dekádě března nebo na začátku dubna při rašení jabloní nebo i o několik dní dříve. Koncentrují se v blízkosti pupenů a čekají na objevení se prvních listů. Uvnitř pupenů se soustřeďují na mladé výhony, květní stopky a listy. Mladší instary jsou pohyblivější, starší jsou méně pohyblivé. Maximální počet larev může být až sto kusů na jeden rozvíjející se pupen. Jako silné napadení se považuje průměrný počet 18 – 20 kusů (Blatný et al. 1943). Napadení 1 – 2 kusy larev na jedno květenství obyčejně nezpůsobuje vážné škody. Tento druh má jednu generaci do roka a přezimuje ve stádiu vajíčka (Lauterer,1999). Od konce května do začátku června se larvy pátého instaru přemisťují na spodní části listů, kde se mění na dospělce. Na území Čech trvá přeměna na dospělce zhruba 50 dní (Blattný et al. 1943). Larvy produkují na cukry bohaté výměšky, tzv. medovici obsahující 30 % sacharozy a 20 % glukozy, (Miller 1956). Výměšky jsou pokryty vrstvou vosku, jež je vylučován perianálními žlázami a modře se leskne. Rozkládají se na malé kapičky o průměru 1 milimetru. Pokud jsou larvy přítomny uvnitř rozvíjejících se pupenů, na květních stopkách či

- 15 -

řapících tak tyto kapičky po spojení můžou mít až 4 milimetry v průměru. Pokud praskne krycí vrstva vosku, medovice se rozšíří po ploše listu a jiných částech rostliny. Tím se omezí transpirace a na povrchu listu se objeví černý povlak hub, které náleží k čeledi Capnodiaceae. Medovice je pak atraktantem pro další hmyz (Lauterer,1999). Lauterer pozoroval starší larvální instary od 10. května do 18 června, přičemž pozdější výskyt než tento ještě nebyl spatřen a to ani na Vysočině. Ve Švédsku Ossiannilsson (1992) pozoroval larvy do 13. července. Na Moravě byli nalezeni první dospělci 14. května. Koncem druhé dekády května bylo nalezeno 7 kusů a ve třetí 26 kusů. V červnu byl nasbírán maximální počet o 190 kusech, v červenci počet nálezů klesl na 99 kusů a v srpnu na 88 kusů. V září bylo nalezeno už jen 30 a v říjnu 8 kusů. Poslední nálezy byl učiněny 28. a 31. října. Po sklerotizaci dospělců (během června) nastává doba migrací, kde část populace přelétá na příležitostné hostitele na relativně velké vzdálenosti. Většina populace však zůstává a přesouvá se do vyšších pater ovocných stromů na mladé letorosty (Lauterer, 1999). Blattný et al. (1943) vypozoroval, že množství vajíček se v období od poloviny června až do poloviny července zvýšilo až 600 krát. Zatímco kopulace proběhly krátce po kompletní sklerotizaci tak jako fenologický indikátor nejsou podstatné. Do konce srpna nebyl nalezen náznak vývoje vaječníků (8 kusů mezi 19. a 26. srpnem) a u světle zbarvené samičky pouze jedno zakrnělé vajíčko z 15. září. U tmavě zbarvené samičky bylo nalezeno první, téměř zralé vajíčko 1. záři, dále pak 12. a 22. září (7 kusů) a až do konce října. Z tohoto důvodu by bylo vhodné přehodnotit data poskytnuté Blattným (1943) a zjistit zda tento druh nevstupuje do pravé dormance parapausního typu v období od června do poloviny srpna, kdy se nevyvíjejí pohlavní orgány. Názor, že samečci umírají krátce po kopulaci je chybný. Tito se pravidelně vyskytovali ještě do poloviny října. Přelet na jiné hostitele od pozdního června do druhé poloviny srpna je pro tento druh typický. Z tohoto důvodu se může Cacopsylla mali vyskytovat na nejrůznějších druzích rostlin (viz kapitola 3.1.4.2.1. Výskyt) Cacopsylla mali patří mezi nejdůležitější škůdce jabloní. Je to způsobeno i nízkou účinností přirozených nepřátels jako jsou parasitoidé (Aphididae, Encyrtidae, Tachinidae) a predátorů (Syrphidae, Chrysopidae, Hemerobidae, Vespidae, Arachnoidea atd) a především roztoči živící se jejími vajíčky. Aplikace insekticidních přípravků (hlavně na jaře a v zimě) zničí

- 16 -

velkou část populace největších predátorů (roztočů) a vede jen ke krátkodobému řešení situace. Nedochází proto k trvalejšímu poklesu ve velikosti populace (Lauterer 1999). 3.1.4.3. Cacopsylla picta 3.1.4.3.1 Výskyt Tento druh je více znám pod jménem Cacopsylla costalis (Flor). Nedávno označen jako synonymum Cacopsylla picta (Foerster 1848) Lautererem a Burckhardtem.Je to evropský a maloasijský druh, s ojedinělým výskytem v západních a severních částech těchto regionů, ale hojný v Bulharsku a Anatolii, kde je považován za škůdce. Hodkinson a White (1979) tento druh ve Velké Británii nenalezli. Předpokládali, že dřívější data o výskytu této mery v této zemi se zakládala na chybné identifikaci a vymazali ji proto ze seznamu britské fauny. Jelikož ale Foersterovy vzorky pocházejí z oblastí Velké Británie tak by měl být tento druh do britské fauny znovu zahrnut. Vyskytuje se navíc i v izolovaných oblastech jižního Švédska a Finska, dále pak ve Francii, Švýcarsku, Německu, Rakousku, České republice, Litvě, Lotyšsku, Moldávii, Ukrajině, Rusku a Itálii a hojná je ve zmiňovaném Bulharsku a Turecku. Conci, Rapisarda a Tamani (1993) její výskyt považují za velmi řídký a Lauterer se domnívá, že toto zhodnocení platí pro většinu evropských zemí. Vyskytuje se na Malus domestica, Malus sylvestris a Prunus armeniaca. Přezimuje hlavně na jehličnanech (Picea abies a jiné druhy) a v Bulharsku na různých listnáčích jako je Prunus, Pirus, Persica, Amygdalus, Malus, Ulmus atd. Tamtéž byli pozorována na přechodných, bylinných hostitelích (Brassica, Menta, Phaseolus, Pisum, Vicia atd.) a trávách (Avena sativa) (Harisanov 1966). Na území Moravy se vyskytuje v rozmezí výšek 209 až 450 metrů nad mořem. Jediné dřívější záznamy o jejím výskytu na tomto území pocházejí z období mezi lety 1953 a 1961. V létě se objevuje spolu s Cacopsylla mali. Je vysoce pravděpodobné, že populace Cacopsylla picta je omezována aplikací insekticidů v ovocných sadech na jaře a v zimě (Lauterer 1999). 3.1.4.3.2 Popis Na první pohled je Cacopsylla picta těžko rozeznatelná od obvykle hojně se vyskytující Cacopsylla mali, žijící rovněž na jabloni a tak mohou být snadno chybně identifikováni a

- 17 -

přehlédnuti. Larvy jsou zelené, přičemž apikální část tykadel je černá. Dospělci po posledním svlékání a před přezimováním jsou světle zelení až šedozelení. Apikální část tykadel dospělců je černá a po přezimování až sytě černá (Lauterer 1999). 3.1.4.3.3 Bionomie Tato mera má do roka jednu generaci a přezimuje ve stádiu dospělce. V Bulharsku dospělci migrují na jabloně na jaře mezi 15. březnem a 25. dubnem. Na začátku dubna kladou vajíčka, přičemž jedna samička naklade přibližně 160 vajíček. Larvy se líhnou od poloviny dubna do začátku června a dospělci se vyskytnou mezi mezi 15. květnem a začátkem června. Během 10 až 15 dnů po ekdyzi dospělci opouštějí jabloně a migrují nejprve na byliny, trávy a poté se přesunují na výše zmíněné ovocné stromy, kde přezimují (viz kapitola 3.1.4.3.1 Výskyt). Přechodné migrace na byliny jinými autory u rodu Cacopsylla nebyly pozorovány (Harisanov 1966). V severní Evropě byla k nalezení na jehličnanech a to již od srpna a během celé zimy, přičemž od května do července se vyskytovala na jabloních (Ossiannilsson 1992). Omezený výskyt Cacopsylla poicta na území Moravy zatím neposkytuje významné podklady nutné pro studium bionomie tak jako v Bulharsku a Švédsku (Lauterer 1999). 3.1.4.1 Vektoři fytoplazmy proliferace jabloně z čeledi Psyllidae Jak již bylo uvedeno v úvodu, nejnovější výzkumy odhalily význam zástupců z čeledi Psyllidae jako vektorů fytoplazmy proliferace jabloně (dále jen AP fytoplazmy) jež je původce závažné choroby proliferace jabloně. Pomocí metody polymerázové řetězové reakce (dále jen PCR), jejíž principy budou uvedeny v příslušné kapitole, byla prokázána přítomnost AP fytoplazmy na merách Cacopsylla picta a Cacopsylla melanoneura. Tyto pokusy s nasbíranými vzorky hmyzu (Cacopsylla melanoneura) odhalily možnost hostit fytoplazmu AP v těle tohoto vektora (Tomasi et al. 2000, Poggi Pollini et al. 2002, Tedeschi et al. 2003). Vektorem AP fytoplazmy v Německu a severozápadní Itálii je Cacopsylla picta (Förster) (syn. Cacopsylla costalis) (Frisinnghelli et al. 2000, Jarausch et al. 2003). V oblasti jihozápadního Německa byly sesbírány vzorky druhů C. melanoneura, C picta a C. mali ve čtyřech sadech, které se lišily stupněm ochrany před těmito škůdci. V komerčně orientovaném sadu byla díky integrované ochraně zjištěn nižší počet škůdců. V ostatních třech sadech s nižší intenzitou - 18 -

ochrany byla logicky zaznamenána vyšší přítomnost škůdců, zejména C. mali. Fytoplazma proliferace jabloně byla přenášena přezimujícími dospělci C. picta. Tedeschi a Alma 2001 zaznamenali přenos fytoplazmy AP jak přezimovavšími imagy C. melanoneura tak i larvami toho druhu.

- 19 -

3.2 Fytoplazmy 3.2.1 Popis, charakteristika a původ Choroby způsobované fytoplazmami byly však známy již od roku 1926, kdy L. O. Kunkel popsal žloutenku astry, ale za jejího původce byly považovány viry. Teprve až Doi et al. 1967 popsal jednoduché oválné organismy jako mykoplazmy v rostlinách aster vykazujících příznaky žloutenky. Buňky fytoplazem, charakteristické nepřítomnosti buněčné stěny a obalené pouze buněčnou membránou, vyznačující se specifickým metabolismem a prakticky nekultivovatelné in vitro, byly zařazeny do řádu nejjednodušších bakteríí Mollicutes. Mohou nabývat nejrůznější tvar od kulovitého přes oválný nebo činkovitý až po tvar spirálovitý. Tato vlastnost se nazývá pleiomorfie a je důvodem taxonomického zařazení fytoplazem do výše zmíněné třídy Mollicutes (= s měkkou pokožkou). Vzhledem k absenci buněčné stěny nejsou citlivé na penicilin, ale pouze na tetracyklin, který blokuje syntézu nukleových kyselin. Žijí pouze ve floemu napadených buněk a množí se dělením buněk (Jiskra, 2003) Pro označení zástupců tohoto řádu je běžně používán výše uvedený termín “mykoplazmy“ odvozený od původního názvu taxonomické jednotky Mycoplasmas. Mykoplazmy infikující rostliny se však liší od ostatních přenosem a způsobem života. Na rozdíl od živočišných mykoplazem se přenášejí hmyzími vektory a jsou intracelulárními parazity. Především pro tato odlišení jsou obdobné organismy parazitujících na rostlinách řazeny do “umělé“ skupiny mykoplazmám podobných organismů (MLOs, mycoplasma like organism). V současnosti jsou tyto organismy nazývány fytoplazmami. Často diskutovanou otázkou je fylogenetický původ fytoplazem. V poslední době převládá názor, že se jedná o monofyletickou skupinu příbuznou rodu Acheloplasma. Zároveň jsou však publikovány údaje podporující polyfyletický vývoj fytoplazem v rámci Mollicutes (Navrátil 1997).

- 20 -

3.2.2 Identifikace a diagnostika fytoplazem Relativně nízká koncentrace fytoplazem, jejich nerovnoměrná distribuce a změny v koncentraci v průběhu roku jsou problémem pro přesnou diagnostiku. Identifikace a diagnostika fytoplazem je v současnosti založena na hodnocení biologických i genetických vlastností (Navrátil 1997) 3.2.2.1. Biologická charakteristika, biologické testy na indikátorech Fytoplazmy vyvolávají celou řadu anatomických a morfologických změn na infikovaných rostlinách. Jejich charakteristika umožňuje usuzovat na původce choroby. Řada příznaků (vizualních symptomů) je však nespecifická a může být vyvolána např. klimatickými podmínkami,

herbicidy,

ale

i

virovou,

bakteriální

nebo

houbovou

infekcí.

Ze

symptomatologických projevů můžeme nejčastěji pozorovat sterilitu květů, virescenci (vývoj zelených květů nebo jejich částí, zráta charakteristické barvy květů), fylodii (vývoj květních částí do listové struktury), proliferace bočních pupenů a vznik metlovitosti, zakrslost, žloutenky listů, nekrózy lýka, odumírání výhonů až celých rostlin. Určení dalších biologických charakteristik, jako např. asociace s hmyzím vektorem nebo okruhu hostitelů je značně komplikované a v současnosti je předmětem výzkumu. Přes uvedené problémy je praktická diagnostika fytoplazem dřevin založena na indikátorových hostitelích. Testy jsou však pracné a vyhodnocení zdlouhavé, v případě proliferace jabloní trvají až 2 roky (Navrátil 1997). 3.2.2.2 Barvní DNA v sítkovicích Mezi metodami nespecifické diagnostiky doporučovanými metodikami EPPO patří barvní DNA fytoplazem v infikovaných sítkovicích pomocí fluorochromu DAPI (4,6-diamidino-2 phenylindole.2HCl). Metodika je vhodná pro orientační stanovení fytoplazem. (Navrátil 1997).

- 21 -

3.2.2.3 Metody molekulární biologie Současný rozvoj molekulárně biologických technik jako jsou DNA hybridizace, polymerázová řetězová reakce (PCR) a analýza délkového polymorfismu restrikčních fragmentů (RFLP), poskytl prostředky pro spolehlivou a rychlou identifikaci fytoplazem. (Navrátil 1997). 3.2.2.4 Sérologické metody Využití sérologických technik v diagnostice fytoplazem je omezeno dostupností specifických protilátek Prozatím se podařilo připravit dostatečně afinitní a specifické protilátky pouze proti fytoplazmě žloutenky aster a „Grapevine flavescencee dorée phytoplasma“, které však nejsou komerčně dostupné (Navrátil 1997). 3.2.3 Fytoplazma proliferace jabloně (fytoplazma AP) 3.2.3.1 Mezinárodní označení a klasifikace Taxonomie: Bacteria: Tenericutes: Mollicutes: Phytoplasmas Zahraniční označení:

Apple proliferation (anglicky) Maladie des proliferations du pommier (francouzsky) Triebsucht des Apfels (německy) Proliferaciones del manzano (španělsky)

Kód EPPO: APPXXX 3.2.3.2 Geografické rozšíření Fytoplazma AP byla zaznamenána v regionech EPPO, ačkoliv existují nepotvrzené informace o výskytu v Indii a Jižní Africe (Seemőller, 1990). Z evropských států jsou to Rakousko, Bulharsko, Česká republika, Francie, Německo, Řecko, Italie, Polsko, Slovensko, Slovinsko, Španělsko, Švýcarsko, Anglie, Ukrajina a Jugoslávie (Davies et al. 1986).

- 22 -

3.2.3.3 Biologie fytoplazem Přirozené podmínky přenosu jsou částečně neznámé a jsou stále předmětem výzkumu. Mery byly označeny jako vektoři fytoplazmy (Seemőller, 1990). Nebyl zjištěn přenos pylem či semenem. Přenos fytoplazmy byl zjištěn při roubování z jabloně na jabloň. Existuje zpráva o přenosu fytoplazmy z jabloně na hrušeň při roubování, avšak následující experimenty toto nepotvrdily. Fytoplazmy jsou často rozšířeny v roubech a na stromech se pak mohou vyskytovat zdánlivě zdravé, avšak infikované pupeny. Distribuce fytoplazem ve stromech během roku není konstantní. V zimě hladina fytoplazem kolísá díky degradaci sítkovic a proto se nalézají v kořenovém systému. Během dubna a května fytoplazmy rekolonizují kmen z kořenů a dostávají až k vrcholkům výhonů v pozdním létě nebo na začátek podzimu (Seemőller et al., 1984). Výskyt fytoplazmy je ovlivněn také teplotou. Ve Francii mohou být nalezeny na celém stromě při 21-25°C, vykazující symptomy napadení. Při teplotách 29-32°C jsou symptomy napadení potlačeny a fytoplazmy se nacházejí pouze v kořenovém systému ale rekolonizují opět kmen pokud sazenice byly skladovány při nižších teplotách (Ducrocquet et al., 1986). 3.3 Jabloň (Malus ssp.) jako hostitel fytoplazmy AP 3.3.1 Příznaky napadení Na stromech – napadené stromy postrádají vitalitu, výhony jsou úzké a kůra má červeno hnědou barvu. Na kůře se objevují nekrotické oblasti a některé větve můžou zcela uschnout. Postižený strom může i odumřít, ale při mírné infekci se může zotavit a po přihnojení opět produkuje standartní kvalitu ovoce. Na pupenech – pozdní růst terminálních pupenů na podzim je obvykle první poznatelný symptom. Skupina nahloučených listů na konci letorostu, často napadených padlím, se vyvíjí namísto normálního pupenu. Nejběžnějším symptomem je však předčasný vývin postranních pupenů, během 2 až 3 let probíhající infekce, které zapřičiňují zvýšený nárůst vedlejších letorostů a vzniká tak ona typická metlovitost. Úhel mezi vedlejším a hlavním výhonem je ostrý a tím

- 23 -

dává stromu „gotický vzhled“. Metlovitost se vyskytuje na různých částech nebo celém stromě spíš než že by se objevovala opakovaně na stejné větvi. Na listech -

vyskytují se dříve než normálně a jsou nepravidelně zoubkované a menší. V mnoha případech, hlavně na vápenitých půdách, se vyskytuje chloroza a červenání listů. Vyskytuje se i předčasný opad listů. Je však nutno připomenout, že chloroza a červenání listů může být zapříčíněna jinými původci než fytoplazmou.

Na květech -

většina květ; na infikovaných stromech jsou normální. Mohou se však vyskytovat různé květní anomalie.

Na plodech -

značná redukce velikosti a hmotnosti plodu (až 75% ztráta hmotnosti v porovnání se zdravým plodem). Slabá chuť, snížená cukernatost a kyselost. Stopky jsou delší a tenčí a semena menší (Blumer & Bovey 1957; Schuh 1962; Bovey 1972).

- 24 -

3.3.2 Výzkum odrůd jabloní napadených fytoplazmou AP v ČR Ve spolupráci se Státní rostlinolékařskou zprávou byly zahájeny vizuální kontroly ve vybraných ovocnářských oblastech na východě Čech, střední a jižní Moravě v průběhu let 1999 až 2002. Jabloně z intenzivních sadů, školek i soukromých zahrad byly podrobeny zkouškám ohledně výskytu proliferačních symptomů. Byly odebrány vzorky během vegetace ze všech stromů s těmito symptomy. Pro odběr vzorků bylo vybráno několik stromů i s příznaky gumovitosti a několik náhodně vybraných stromů bez příznaků. Tyto stromy byly rovněž zahrnuty do studie (viz Tab.1). Tab. 1 - Testování vybraných stromů metodou PCR užívající primery R16F1/R0 a R16F2/R2 (Navrátil, 2003). odrůda jabloně/symptom Ontario 1/ P Neznámá 1/ P Neznámá 2/ P Neznámá 3/ P Parména / P James Grieve / P Rubín 1 / RW Rubín 2 / RW Rubín 3 / RW Rubín 4 / RW Rubín 5 / RW Šampion 1 / RW Šampion 2 / RW Šampion 3 / RW Rubín 6 / no Rubín 7 / no Lord Lambourne 5 / no Šampion 5 / no Ontario 2 / no

Legenda:

září 1999 p p p nt p nt p p p n n n n n p n n n n

květen 2000 p p p p nt nt p p n n n n n n n n n n n

Datum sběru srpen 2000 p p p p n nt n n n n n n n n n p nt n n

P = jabloň s příznaky proliferace RW = jabloň s příznaky gumovitosti no = jabloň bez příznaků p = PCR pozitivní test pro výskyt fytoplazmyAP n = PCR negativní test pro výskyt fytoplazmyAP

- 25 -

říjen 2000 p nt nt p nt p n n n p n n n n n n nt n n

září 2001 p p p p p p nt p nt nt p n n n n p n n n

K velmi náchylným odrůdám náleží Boskoopské, Golden Delicious, Jonathan, Starkrimson Delicious, a z vegetativních podnoží M IV. (Hluchý et al., 1997). 3.3.3 Oblasti výskytu napadení fytoplazmou v ČR Výše zmiňovaná studie (viz. Kap 3.3.2) se týkala nasledujících oblastí podezřelých z výskytu fytoplazmy v jabloňových sadech v ČR: •

Jičín

•

Hradec Králové

•

Olomouc

•

Přerov

•

Blansko

•

Prostějov

•

Brno

•

Znojmo

•

Břeclav

•

Hodonín

•

Uherské Hradiště

Z těchto oblastí to byly Jičín, Blansko a Prostějov kde výzkum prokázal aktuální přítomnost fytoplazmy AP ve vybraných sadech (Navrátil 2003).

- 26 -

3.4 Vztah vektor (Psylla) – fytoplazma AP - jabloň (Malus) Byl proveden experimentální přenos fytoplazmy AP na zdravou jabloň pomocí mery C. melanoneura. Byli vyhodnoceni jak přirozeně , tak i laboratorně infikovaní jedinci. Byla testována i kapacita přenosu fytoplazmy v jednotlivých stádiích vývoje. Přezimující jedinci nasbíraní v sadech byly schopni přenést fytoplazmu s různou efektivitou, závisející na hladině infekce hostitelské rostliny (viz Tab.2). Experimentálně infikované larvy a čerství dospělci uspěli v přenosu fytoplazmy. Efektivita přenosu ovšem byla ovlivněna krátkou dobou sání a laboratorními podmínkami, které nemohly vystihnout komplexně životní cyklus mer (viz Tab.3). Tyto skutečnosti výrazně ovlivnily výsledky pokusu (Tedeschi a Alma 2004). Tab. 2 - Experimentální přenos fytoplazmy přirozeně infikovanou merou C. melanoneura, sbíranou v Itálii Rok

region

Testované jabloně

Stadium

se symptomy/očkováno (%) 1999

Piedmont

přezimující dospělec

2000-2001 Aosta Valley

detekce fytoplazmy/očkováno (%)

8/9 (88.9)

8/9 (88.9)

7/17 (41.2)

5/17 (29.4)

2000-2001 Aosta Valley

larva

5/13 (38.5)

0/13 (0)

2000-2001 Aosta Valley

dospělec

8/14 (57.1)

1/14 7.(1)

Tab. 3 - Experimentální přenos fytoplazmy laboratorně infikovanou merou C. melanoneura v roce 2001 testované jabloně

Stádium

mery

se symptomy/očkováno (%)

detekce fytoplazmy/očkováno (%)

detekce fytoplazmy\testováno

larvy

3/12 (25)

2/12 (16.67)

5\24

dospělci

9/16 (56.25)

2/16 (12.5)

9\20

- 27 -

4 Experimentální a praktická část Praktická část práce spočívala ve sběru zástupců čeledi Psyllidae, se zaměřením na druh Cacopsylla picta. Tento materiál pak po determinaci docentem Lautererem byl podroben molekulární analýze metodou PCR pracovníky PřF UP v Olomouci. Touto metodou lze bezpečně zjistit přítomnost fytoplazmy AP v těle vektora. Ke sběru byla vybrána lokalita Těšetice v oblasti střední Moravy v extensivním sadu bez chemické ochrany, kde bylo možné usuzovat na bohatý výskyt hmyzu. V výše zmíněném sadu se vyskytují odrůdy jabloní James Grieve, Golden delicious, Melba, Spartan a další, blíže neurčené. 4.1 Metodika sběru vzorků zástupců čeledi Psyllidae Ke sběru byl zkonstruován speciální sběrač vyrobený z igelitového pytle a odmontovatelnou lahvičkou, která velmi usnadňovala práci. Tento sběrač se umístil pod větev a použitím omotané tyče se provedlo 50 sklepů. Bylo nutné neustále při sběru uzavírat lahvičku neboť mery jsou velmi pohyblivé. Lahvička s nasbíraným hmyzem se zamrazila a po určité době se vyselektovali zástupci Psyllidae do lahvičky se 100% alkoholem připravených k determinaci. Tuto náročnou práci musí vykonávat odborník s důkladnou znalostí v oblasti entomologie. Této práce se zhostil doc. Lauterer, který se specializuje na zástupce z čeledi Psyllidae. Tito determinovaní jedinci pak mohou být podrobeni analýze.

- 28 -

4.2 Seznam nasbíraných vzorků zástupců Psyllidae v jednotlivých termínech Lokalita: Těšetice u Olomouce Datum

zástupci

počet/pohlaví

3.4.2004

C. melanoneura

4/M 11/F př.

C. picta

5/M 8/F př.

C. pruni

1/F př.

C. melanoneura

2/M 4/F př.

C. picta

9/M 10/F př.

C. melanoneura

1/F př.

C. picta

2/M 4/F př.

23.4.2004

C. picta

2/M 7/F př.

30.4.2004

C. melanoneura

2/F př.

C. picta

3/M 8/F př.

C. pruni

1/F př.

8.5.2004

C. picta

1/M 6/F př.

16.5.2004

C. picta

2/F př.

22.5.2004

C. mali

1/M n.g.

C. picta

4/F př.

1.6.2004

C. picta

2/F

10.6.2004

C. picta

2/L4 2/L5 = (larvy 4. a 5. instaru)

21.6.2004

C. melanoneura

1/F n.g. dobře sklerotisovaná

C. picta

4/M 5/F n.g., některé krátce po imaginálním svlékání

C. pruni

1/F n.g., dobře sklerotisovaná

9.4.2004

17.4.2004

Legenda:

F = samička M = sameček př = dospělec po přezimování n.g. = nová generace

- 29 -

4.3 Výsledky analýzy dodaných vzorků metodou PCR Ve spolupráci s Katedrou buněčné biologie a genetiky, PřF UP Olomouc a s jejich souhlasem publikovat poskytnutá data byly získány tyto výsledky: Výsledky PCR detekce fytoplazem u vzorků DNA izolované z C. picta ze sběrů Těšetice jabloně 2004

sběr materiálu 17. 4. 2004

počet testovaných jedinců 19

z toho AP pozitivních 13

8. – 22.5. 2004

13

4

1. – 21. 6. 2004

15

1

5 Závěr V literárním přehledu byly shromážděny informace týkající se rodu Cacopsylla. V lokalitě Těšetice byl proveden systematický sběr zástupců rodu Cacopsylla. Nasbírané vzorky tohoto hmyzu byly předány docentu Lautererovi k determinaci. Byly rozpoznány druhy Cacopsylla picta a Cacopsylla melanoneura, které jsou považovány za vektory fytoplazmy AP. Byla zjištěna i přítomnost druhu Cacopsylla mali, u té však není schopnost přenosu fytoplazmy AP známa. Hlavním výstupem této práce je analýza materialu metodou PCR, která potvrdila přítomnost fytoplazmy v nasbíraných vzorcích. Tato zjištěná skutečnost tedy potvrzuje zahraniční výzkumy týkající se přenosu fytoplazem merou Cacopsylla picta na jabloně.

- 30 -

6. English summary There are reports from Germany and Italy about transmission of Apple Proliferation Phytoplasma by Psyllids. (Cacopsylla melanoneura, Calcopsylla picta). Apple Proliferation Phytoplasma causes apple proliferation which is one of the most serious diseases in Europe. This study tries to confirm this hypothesis with special view to a Calcopsylla picta in Czech republic and her ability to carry Apple Proliferation Phytoplasma. The first part sumarizes the information about Psyllidae, phytoplasmas with a special view to an Apple Proliferation Phytoplasma and description of regions in Czech republic, where AP phytoplasma appaered. The most susceptible cultivars are mentioned too. The last capitol of teoretical part contents informations about relationship between vector – phytoplasma – apple tree which is very important in succes of transmission of AP phytoplasma. The second part is more practical and in colaboration with doc. Lauterer were determined Psyllidae, which were collected in Těšetice. Determined members of Cacopsylla picta were tested by PCR method. This molecular analysis confirmed presence of AP phytoplasma in Cacopsylla picta.

- 31 -

7. Použitá literatura Blattný C., Starý B., Herbert V., Skočdopole K., Kozák J. & Macek J., Sviluška ovocná a Mera jabloňová. Sbírka lepší hospodaření. Praha: 1943, č.37 Bovey, R. Apple proliferation. Virus diseases of apples and pears, 1963, č. 30, s. 63 – 67 Burkhardt D., Hodkinson I. D., A revision of thewest palaearctic pear psyllids (Hemiptera: psyllidae), Bulletin Of Entomological Research, 1986, č. 76, s. 119 - 132 Conci C., Rapisarda C., Tamanini L., Annotated catalogue of the Italian Psylloidea, first part (Insecta Homoptera), Atti del Academia Rovertana degli Agiati. Roverto, 1992, s. 33 - 136 Ducroquet, J.P., Dosba F., Lansac, M., Mazy K. Effect of temperature on symptom expression of apple proliferation. Agronomie, 1986, č. 6, s. 897 – 903 Fialová, R., Navrátil, M., Válová P., Phytoplasma occurence in apple trees in the Czech republic. Plant Protection Science, 2003, č. 39, s. 7-12 Harisanov A., Biologische Untersuchungen őber den sődlichen Apfelblattfloh – Psylla costalis (Flor). Wissenschaftliche Arbeiten, Landswirtschaftliche Hochschule “Vasil Kolarov”. Fakultät főr Wein und Gartenbau. Plovdiv, 1966, č. 15, s. 261 - 270 Hodkinson I. D., White I. M., Homoptera: Psylloidea, Handbooks for the Identification of British insects. London, Royal Entomological Society of London, 1979, vol.2, č.5, s. 98 Jiskra, K., Pokorný V. Hmyzí škůdci zahradních rostlin predátoři a paraziti. Praha: Květ, 1996. 91 s. Kazda, J., Jindra, Z., Kabíček, J., Prokinová, E., Ryšánek, P., Stejskal, V. Choroby a škůdci polních plodin ovoce a zeleniny. Praha: Zemědělec, 2003. 158 s. Lauterer, P., Results of investigations on Hemiptera in Moravia, made by the Moravian museum (Psylloidea 2). Acta Musei Moraviae, Scientiae biologicae, 1999, č. 84, s. 71 - 151 Navrátil, M., Kozelská, S., Využití nových metod k diagnostice fytopatogenních organismů. Sborník přednášek, Katedra buněčné biologie a genetiky, PřF UP Olomouc, 1997, s.26 - 28 Tedeschi, E. Alma, A. Transmission of Apple Proliferation Phytoplasma by Cacopsylla melanoneura (Homoptera: Psyllidae). Journal of Economic Entomology, 2004, č.97, s. 8-13 Vondráček, K., Mery – Psylloidea. Praha: ČSAV, 1957, 430 s. - 32 -

- 33 -