1
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola „Onkológia” program
Melanoma malignum progressziójának követése tumormarkerekkel
dr. Bánfalvi Teodóra Doktori értekezés (Ph.D.)
Témavezeto: prof. dr. Tímár József Programvezeto: Prof. dr. Jeney András Országos Onkológiai Intézet Budapest, 2003
2
Tartalom I. Bevezetés 1. Melanoma malignum
3
2. Tumormarkerek általános jellemzoi
7
3. Melanoma malignum keringo tumormarkereinek áttekintése
8
4. Melanoma malignum szöveti immmunhisztokémiai markerei (S-100B protein, AMFR)
26
II. Célkituzések 1. Az S-100B protein és 5-S-ciszteinildopa szérum szintjének értékelése melanoma malignum valamennyi stádiumában
29
2. A laktátdehidrogenáz szérum koncentrációjának elemzése S-100B proteinhez és 5S-Ciszteinildopához viszonyítva melanóma malignumban
29
3. Szérum S-100B protein értékek és szöveti S-100B expresszió közti össszefüggés analízise 4. AMF receptor expresszió vizsgálata primér melanomában
29 30
III. Anyag és módszer 1. S-100B protein meghatározás lumineszcens immunesszével
31
2. 5- S-ciszteinildopa mérés nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával
31
3. LDH meghatározás enzimatikus módszerrel
32
4. S-100B protein immunhisztokémiai vizsgálat
32
5. AMFR expresszió vizsgálata immunhisztokémiával
32
6. Beteganyag
34
7. Statisztikai analízis
40
IV. Eredmények
42
V. Megbe szélés
74
VI. Rövidítések jegyzéke
85
VII. Irodalom
86
VIII. Publikációk és absztraktok jegyzéke
103
IX. Egyéb közlemények
107
X. Köszönetnyilvánítás
110
3
I.
Bevezetés
1. Melanoma malignum A melanoma malignum a neuroektodermalis eredetu melanocitákból kiinduló legrosszabb
indulatú
bordaganat.
Incidenciája
évente
3-7%-kal
növekszik
(49,110,132,140). Az epidemiológiai vizsgálatok rendkívül eltéro eredményeket mutatnak. Az elofordulási gyakoriság Ausztrália egyes tartományaiban a 12- 28 szélességi kör között a legmagasabb (53,5/100000 lakos évente), míg az egyenlítotol távolodva csökken 30,3/100000-re (36). Európában, Észak-Amerikában ennél jóval kevesebb daganatot számlálnak, 8-10/100000 lakos/évente (110). Magyarországon a Nemzeti Rákregiszter 1288 új esetet észlelt 2000- ben (132). Etiológiájában fo szerepet játszik a nevus pigmentosusok nagy száma, diszplasztikus nevusok jelenléte, idoszakos intenzív napsugárzás, napégés (8,49,161). Bár az új betegek száma folyamatosan és jelentosen növekszik (hazánkban is), összességében a többi daganatos megbetegedéshez viszonyítva a melanoma malignum a ritkább tumorok közé sorolható. Mivel klinikailag, megtekintéssel
jól
diagnosztizálható,
azonnal
felmerül
a
szurovizsgálatok
szükségessége. Válogatás nélküli, nagy beteganyagot felölelo szurovizsgálat azonban a fentiek alapján valószínuleg nem lenne igazán hatékony. Megkísérelheto azonban célcsoportok, vagyis várhatóan magas rizikójú egyének számára szurést szervezni. Ide tartoznak azok, akiknek családjában melanoma fordult elo, a bortípusuk alapján (szoke haj, kék szem, hajlam a napégésre) veszélyeztetettek, azok, akiknek korábban más típusú bordaganatuk volt, valamint egyes statisztikák alapján az 50-70 év közötti férfiak. A felvilágosító kampányok során ma már elsosorban az általános fénykerülést javasolják, mivel a fényvédo krémek alkalmazásának elonyei megkérdojelezodtek (21,180). A melanoma prognózisa korai stádiumban, megfelelo biztonsági zónával eltávolítva, rendkívül kedvezo. A sokszínu klinikai kép, a megjelenési formák igen nagy változékonysága miatt a diagnosztikus biztonság jól képzett, 10 éves szakmai gyakorlattal rendelkezo, szakambulancián dolgozó borgyógyász-onkológus esetében is csak 70-80%, mely az utóbbi idoben igen elterjedt dermatoszkóp alkalmazásával, különösen a korai formák esetében néhány százalékkal emelheto (9). A késon diagnosztizált betegek 5 éves túlélése azonban 50%-ra csökkenhet (54,76,109).
4
A melanoma stádium beosztása 2001- ben megváltozott. A továbbiakban a tumorvastagságot törtszámok helyett milliméterekben fejezik ki, a primér tumor ulcerációja bekerült a besoroló tényezok közé, szükséges a nyirokcsomó státusz patológiai felmérése, külön csoportba került az
in transit/satellita áttét fogalma,
besorolási faktorként szerepel az emelkedett LDH szint (128). Prognosztikus szempontból primér daganatnál elsosorban a tumor Breslow szerinti vastagsága, továbbá az exulceráció, a limfocitás infiltrátum megléte/hiánya, a szentinel nyirokcsomó pozitivitás/negativitás, a betegek neme, a primér tumor lokalizációja mérvadó. Regionális érintettségnél a nyirokcsomók száma, a tokáttörés és a környezo szövetek következményes infiltrációja, a blokkdisszekció utáni tünetmentes idoszak hosszúsága jelentos a túlélés szempontjából (56). Disszeminált esetekben elsosorban a metasztázis helye és száma, valamint az abnormális LDH érték korrelál a rövidebb túléléssel (17,48,56,94,98,109). Az elméleti kutatások kapcsán a szöveti prognosztikus markerekkel (AMF, NM23, CD44, MMP2,) kimutatott összefüggések és következtetések sokszor igen ígéretesek, sajnos azonban a klinikai gyakorlatba még nem épültek be (51, 167). A melanoma malignum terápiás stratégiájában az utóbbi 10 évben jelentos változás tapasztalható. A primér tumor ellátásánál a korábbi radikális sebészet megoldás (altatásban kivitelezett mutétek, körkörös 5 cm-es biztonsági zónával) helyett mára a helyi érzéstelenítésben elvégzett, a várható Breslow szerinti vastagságtól függoen megválasztott, 1-2-3 cm-es biztonsági zóna alkalmazása került elotérbe. Világossá vált, hogy a szélesebb excíziós szél csak a lokális recidívák kialakulásának gyakoriságát csökkenti (36). Áttöro újdonság a primér melanoma sebészi ellátásában a néhány évvel ezelott bevezetett szentinel technika. A módszer a korábban széles körben alkalmazott elektív blokkdisszekció hátrányainak kiküszöbölésére szolgál. Igazolódott, hogy a primér tumor nyirokrégiójának megfelelo, nem tapintható nyirokcsomók eltávolítása nem növeli szignifikánsan az átlagos túlélést, és lényegében egyetlen elonye a pontosabb stádium
meghatározás.
A
mutéti
beavatkozás
veszélyei
azonban
fennállnak,
szövodményei (pl. limfodema) kialakulhatnak. Ezek után a szentinel technika térhódítása viharos gyorsasággal ment végbe. A módszer lényege a szentinel, azaz orszem nyirokcsomó feltérképezése vitális kék festék és izotóptechnika együttes
5
alkalmazásával. A primér tumort és a 99 mTechnéciummal és vitális kék festékkel jelzett nyirokcsomót dinamikus limfoscintigráfiát követoen egy lépésben, sokszor helyi érzéstelenítésben távolítják el. Amennyiben a kérdéses nyirokcsomóban, nagyon gondos szövettani revíziót követoen (sorozatmetszet, immunhisztokémia) daganatsejteket észlelnek, komplett blokkdisszekció következik. Ha a szentinel nyirokcsomó tumormentes, a tapasztalatok szerint a régió többi nyirokcsomója körülbelül 95%-os biztonsággal érintetlen.
Ezzel a technikával pontos stádium meghatározás szintén
lehetséges, és a beteg mentesül a nagyobb mutéti megterheléstol (36,140). Az adjuváns kemoterápia pozitív hatása az átlagos és tünetmentes túlélésre ugyancsak megkérdojelezodött. Napjainkban egyre inkább az interferon kezelés válik elfogadottá. Jelenleg is kérdéses azonban az interferon alfa adagolásának módja. Két, egymásnak ellentmondó szemlélet érvényesül, a rövidebb ideig tartó nagydózisú, és a közepes vagy alacsony adagú elhúzódó terápia állnak szemben egymással (36,140). A regionális nyirokcsomók ellátásában jelenleg is a sebészi megoldás, a blokkdisszekció elvégzése az elsodleges. Egyes irányzatok szerint, amennyiben a nyirokcsomó(k)ban a daganat áttörte a tokot, posztoperatív irradiáció válik szükségessé. A kemoterápia létjogosultsága ebben a stádiumban is kétségessé vált, a DTIC monoterápia mellett egyre inkább az interferon alfa alkalmazása kerül elotérbe. A melanoma progressziója során távoli metasztázis bárhol kialakulhat. A disszeminált melanoma terápiásan jelenleg hatásosan nem befolyásolható. Számos citosztatikus kezelési séma ismert. A DTIC monoterápián kívül leggyakrabban alkalmazott terápiás kombinációk a következok: DTIC-interferon alfa, DTIC-interferon alfa-interleukin-2, DTIC-BiCNU-bleomycin-vincristin
kombináció,
DTIC-platidiam,
valamint
egy
összetett kezelése séma, azaz kombinált kemoterápia és bioterápia (interleukin-2 és interferon alfa) felváltva történo adagolása. Egyes szerzok szerint a kemoterápia és bioterápia együttesen 20%-ban hatékony a disszeminált betegeknél (56). A hepatikus áttéteknél, ahol a szisztémás terápia hatékonysága 1% körül mozog, alkalmazható kemoembolizáció vagy kemoperfúzió, melyet leggyakrabban ciszplatin, vagy az elobb említett citosztatikum és vinblastin, vincristine, dacarbazin különbözo kombinációjával végeznek (17). Végtagokon, többszörös boráttétek esetén szintén megkísérelheto végtagperfúzió (63).
6
Sugárkezelés alkalmazható irrezekábilis primér tumor esetében, mérlegelendo regionális nyirokcsomó érintettségnél tokáttörés kapcsán, és elotérbe kerül cerebrális, osseális, cutan, és extraregionalis nyirokcsomó metasztázis ellátásásánál (36). A palliatív terápia megválasztásánál a többi disszeminált daganatos betegség kezeléséhez hasonló elvek érvényesülnek (fájdalomcsillapítás, roborálás). Bár egyes esetekben, meghatározott áttéti lokalizációkban, mint a pulmonális, cutan vagy extraregionalis nyirokcsomó áttétek, megfelelo kezeléssel átmeneti remisszió, sot hosszabb rövidebb ideig tartó tünetmentes idoszakok is elérhetok, ennek ellenére a belso szervi metasztásisban szenvedo betegek túlélése rövid (17,76). Megfeleloen érzékeny, specifikus, olcsó, könnyen kivitelezheto és reprodukálható tumormarkerek alkalmazása nagy segítséget nyújthatna a pontosabb prognózis meghatározásában, elosegítené a metasztázis korai kiszurését, lehetové tenné a korai szisztémás kezelést, a terápia monitorozását és a betegek jobb követését. Azonban mindezidáig a keringo tumormarkerek alkalmazása melanoma malignumban nehézkes, az értékelés sokszor bizonytalan, a vizsgálatok a klinikai onkológiai, borgyógyászati gyakorlatba nem épültek be. Az értekezés a tumormarkerek szerepét vizsgálja a felvetett kérdések szempontjából.
7
2. A tumormarkerek általános jellemzoi
Tumormarkernek nevezünk minden olyan anyagot, amelynek megjelenése vagy koncentrációjának megváltozása a szervezetben daganat kialakulását, progresszióját jelzi. A tumormarkerek képzodhetnek a daganatos sejtekben, ekkor „tumor-derived” markerekrol beszélünk. Kialakulhatnak azonban nem rosszindulatú, a tumor elleni immunitásban részt vevo sejtekben, amikor is „tumor associated” markerekrol van szó. Kimutatásukra számos, különféle módszer használatos. A kimutatás helye szerint megkülönböztetünk cellularis markereket, melyeket a daganatszövetbol azonosítunk, és keringo vagy extracellularis markereket, melyeket testnedvekbol izolálunk. Klinikai szempontból szurésre, differenciáldiagnózisra, stádium besorolásra, a prognózis jelzésére, terápia monitorozásra, betegkövetésre alkalmasak. A tomormarkerek jellemzoi: Szenzitivitás: meghatározott daganatnál az emelkedett marker koncentráció átlagos valószínuségét adja meg. Értéke függ a betegek számától, a stádiumtól és a cut off szinttol. Specificitás: megmutatja, hogy a marker mennyire képes kiválogatni a betegeket az összes közül. Pozitív prediktív érték : a kóros eredmény hátterében meghúzódó malignus folyamat valószínuségére utal. Negatív prediktív érték: jelzi, hogy egy normál eredmény mögött milyen valószínuséggel nincs malignus folyamat. A számítások alapjául szolgáló képleteket az anyag és módszer fejezetben ismertetem. Cut off érték : koncentrációs küszöbérték. Egy adott vizsgálatban nagysága megválasztható, általában a 95% specificitáshoz tartozó koncentrációt fogadják el. A tumormarkerek klinikai értéke a specificitásuktól, (fals pozitív eredmény lehetoleg nincs), valamint a szenzitivitásuktól (fals negatív leletek minél kisebb számban) függ. A pozitív és negatív prediktív érték szintén fontos faktor, melyet számításba kell vennünk egy marker alkalmazásánál. A tumormarkerek szérum analízise számos daganat kezelésében beépült a klinikai gyakorlatba. Prostata rákban a prostata specifikus antigén, colorectális daganatokban a
8
carcinoembrionalis
antigén
széles
körben
használt.
A
tumormarkerek
egyik
legsikeresebb alkalmazása a csírasejtes daganatok kezelésének monitorozása és a beteg utókövetése. Sajnos, a borgyógyászati onkológiában jelenleg nincsen olyan ideális tumormarker, mely minden stádiumban megfeleloen specifikus és kelloen szenzitív lenne.
3. Melanoma malignum keringo tumormarkereinek áttekintése 3.1. Melanomához asszociált antigének a. Melanoma inhibitory activity (MIA) 11 kDa molekulasúlyú protein, melyet HTZ-19 melanoma sejtvonalból izoláltak 1989ben (23). A növekedés gátló, az invázió és disszemináció szabályozásában feltehetoen részt vevo, a melanoma sejtek és az extracellularis mátrix kapcsolódását a fibronectin és laminin megkötésével akadályozó proteint melanocitás nevusok alacsony szinten, normál bor melanocitái, keratinociták, nem melanocitás tumorok azonban egyáltalán nem expresszálják (29). Nem tumoros szövetekben a MIA foleg fejlodo és érett porcszövetben található meg (27). Magas értéket észleltek még az esetek egy részében ovarium, emlo, pancreász, colon rosszindulatú daganatban. A proteint a 19q13.32- 33 génszakasz kódolja és a DNS szekvencia teljes egészében ismert (26,101). A szérum koncentráció meghatározása MIA ELISA teszttel történik (27,28). Emelkedett szérum koncentráció a malignus melanociták fokozott expressziója következtében megfigyelheto melanoma malignumban, emellett elorehaladott emlo és colon carcinomában, glia-sejtes tumorokban (71). Klinikai értékelése kapcsán melanoma malignumban Bosserhof III-as és IV-es stádiumban 100% - os szenzitivitást észlelt, továbbá S-100B proteinnel és sICAM-1 koncentrációkkal 462 betegen összehasonlítva a legérzékenyebb markernek találta. Azonban I-II-es stádiumban a MIA pozitiv betegek nem mutattak korrelációt a Breslow szerint mért tumorvastagsággal (27). Késobbi munkájában terápia monitorozásra és metasztázis kimutatásra egyaránt alkalmasnak tartotta (28). Stahlecker 326 beteget elemzo közleményében melanomában Stádium IIIIV-ben szintén magas 60-89,5% szenzitivitást észlelt, betegkövetésre és metasztázis diagnosztizálására szintén megfelelonek találta (160).
9
A MIA meghatározásra újabban kifejlesztett RT-PCR technika segítségével figyelemre méltó pozitivitás (26,8%) mérheto melanomás betegeknél már stádium I-II-ben is. A IIes és IV-es stádiumban a MIA RT-PCR pozitivitás tünetes betegekben magasabbnak (34%) bizonyult, mint a tünetmentesekben (10%), stádium III-IV-ben pedig korrelált a tumortömeggel. Ugyanakkor az áttét diagnosztizálására nem volt alkalmas a teszt (121). A módszer értékelhetoségét befolyásolja, hogy alacsony szintu MIA RT- PCR pozitivitás azonban egészségesekben is kimutatható. Bár viszonylag kevés számú közlemény áll rendelkezésre MIA-val kapcsolatban, az eredmények jobbak vagy hasonlóak S-100B proteinéhez és korrelálnak az LDH szinttel IV-es stádiumú betegeken (27,28,29,46,71,113,152).
b. Lipidhez kötött sziálsav, gangliozid (LKSZ) A lipidhez kötött sziálsav sejtmembrán gangliozidnak (glikolipid) felel meg, mely a szérum lipoprotein frakciójához kötodik. A sejt és extracellularis mátrix kapcsolatban, a sejtmotilitásban,
az
áttétképzodésben,
a
tumorimmunitásban
szerepet
játszó
gangliozidokban különösen a neuroektodermális eredetu és daganatosan átalakult sejtek gazdagok. A LKSZ a sejtmembránról könnyen leválik, a szérumban lipoproteinhez kötve kering. Tumormarkerként való alkalmazására irányuló klinikai vizsgálatok 1958ban kezdodtek, amikor Winzler, majd több szerzo, köztük Katopodis 1982-ben a LKSZ szintjét különbözo malignus tumorokban (pl. emlo és colorectalis carcinoma) emelkedettnek találta (183). Reintgen szerint az LKSZ használható markerként a progresszió megítélésére melanomában (139). Melanomában az elso nagyobb számú vizsgálatot (165 beteg/244 mérés) Gilde végezte. Vizsgálataikkal a LKSZ szint kóros emelkedését csak a melanoma áttétes formájában találták szignifikánsnak. Multiplex belsoszervi metasztázisnál magasabb arányú kóros értéket észleltek, mint többszörös boráttét esetén, amely ellene szól annak a hipotézisnek, hogy a LKSZ szintje a tumormassza nagyságát tükrözné (64). Ezzel szemben Buzaid 240 beteg vizsgálata kapcsán úgy találta, hogy a LKSZ szérum szintje korrelál a melanomás betegekben elorehaladott esetekben észlelt tumormasszával (37). A gyulladásos folyamatokban szerepet játszó akut fázis proteinek sziálsav gazdagsága miatt a meghatározásnak inkább a prognosztikus értéke van, diagnózisra és szurésre nem javasolt (33,72,143).
10
c. Neuronspecifikus enoláz (NSE) Az
enolázok
a
glikolízis
enzimjei,
melyek
a
2-foszfoglicerátot
alakítják
foszfoenolpiruváttá. Három, immunológiailag különbözo alegységbol állnak: alfa, beta, gamma. A neuron specifikus enoláz a gamma-gamma és alfa-gamma formát tartalmazza. A NSE-t 1965- ben Moore és McGregor írta le eloször (119). Megtalálható neuronokban, a periferiás neuroendokrin szövetekben, az APUD sejtekben, így a kissejtes tüdorákban és neuroblastomában. Az NSE kimutatható még egyes tumorokból, mint melanoma, seminoma, carcinoid, Merkel sejtes tumor (134). 1982-ben Prince javasolta serum markerként történo használatát neuroendocrin tumorokban (134). Azóta számosan megerosítették alkalmazhatóságát kissejtes tüdorákban, seminomában, neuroendocrin tumorokban (44). Kimutatása rádioimmunesszével történik monoklonalis antitest felhasználásával. Melanomában eloszor Lorenz és Dippold közöltek emelkedett szérum értékeket (108). Hornef szerint magasabb szérum koncentráció csak stádium IV- es melanomás betegekben észlelheto (83). Wibe vizsgálatai alapján az NSE pozitív betegek túlélése szignifikánsan rövidebb, mint az NSE negatívaké, de Bonfrer szerint a szenzitivitás az S-100B proteiné alatt marad (22,182). Klinikai alkalmazhatósága kérdéses, különösen alacsony specificitására való tekintettel.
d. Tumor asszociálta antigén (TA-90 immunkomplex) A melanomás betegek szérumában a tumor asszociálta TA-90 antigen ELISA módszerrel meghatározható. Egy amerikai munkacsoport összesen 114 I-II-III-as stádiumú (AJCC stádium) melanomás beteget vizsgált. Közleményük alapján a TA- 90 immunkomplex szintje korrelál a túléléssel. Multivariációs analízissel a legerosebb független prognosztikus faktornak bizonyult, mind az átlagos, mind a tünetmentes túlélést vizsgálva. A marker 78% szenzitivitással és 77% specificitással jelzi továbbá a szubklinikus metasztázisokat (99).
e. S-100B protein Az S- 100 protein 21000 Dalton molekulasúlyú, savas, Ca-köto kapacitással rendelkezo fehérje. 1965-ben Moore marhaagyból izolálta (119). Nevét telített ammónium sulfát
11
oldatban neutralis pH-nál történo 100%-os oldódásáról kapta. Az S-100 dimer fehérje, mely alfa és beta egységek különbözo kombinációiban (homo és heterodimer) fordul elo. Kezdetben neurospecifikusnak tartották, azonban fiziológiásan elofordul számos szövetben, így az ? ? dimér harántcsíkolt és szívizomban, vesében, makrofágokban, monocitákban és melanoma sejtekben. A ? ? dimér megtalálható a központi idegrendszer glia és Schwann sejtjeiben, az epidermalis Langerhans sejtekben. Az ? ? forma glia sejtekben és melanomában észlelheto. A 91 aminosavat tartalmazó szekvenciát Isobe 1978-ban határozta meg (87). Az S-100 proteinek a legnagyobb alcsaládot képviselik a Ca köto proteinek között. A családot kódoló génszakaszt 1995-ben izolálták az 1q21 kromoszóma régióban (77,148). Ezután még kilenc különbözo S-100 proteint meghatározó gént fedeztek fel. Ezt követoen a nómenklatúra megváltozott, a korábban S-100 alfa most S- 100A, az S100 beta pedig S-100B nevet kapta (77,148). A sejtekben az S-100B kálciumot tartalmazó homo és heterodimer formában található meg, intracellulárisan, alapvetoen membránhoz kötötten. Az S100 protein család 19 tagja ismert, funkciójuk azonban ma sem teljesen tisztázott. Az elso megállapítások egyike, hogy érzékenyen jelzi az idegrendszer sérüléseit (57). Nagy valószínus éggel az intracellularis kálcium metabolizmusban játszanak szerepet. A sejtdifferentációban, motilitásban, endo- és exocitózisban, membrán permeábilitásban, apoptózisban is részt vehetnek. Baudier 1992- ben felfedezte, hogy az S-100B befolyásolhatja a tumorszupresszor protein p53-at. Az S-100B ugyanis akadályozza a p53 kalciumdependens foszforilációját in vitro. Ez vezethet a p53 tumorszupressziós funkciójának gátlásához (33). Gaynor 1980-ban mutatta ki az S100 protein jelenlétét humán melanoma sejtvonalakban. Felfedezését a melanociták neuroectodermalis eredetével magyarázta (61). A kimutatáshoz komplementfixációs tesztet használt. Napjainkban az S-100B proteint immunhisztokémiai vizsgálatok során széles körben alkalmazzák a melanoma diagnosztizálására és más malignus tumoroktól való megkülönböztetésül. A szérum S100B
meghatározás
korábban
rádioimmunesszével,
ma
már
lumineszcens
immunesszével (LIA-mat Sangtec 100) történik, mely a beta alegységet detektálja, azaz mind az ? ? mind a ?? dimért észleli (24,65). Ezért tünetmenetes melanomás betegen az S-100B protein a központi idegrenszer sérüléseinek következtében is emelkedhet.
12
Egyszerusége, reprodukálhatósága, radioaktivitásmentessége, megfelelo szenzitvitása miatt napjainkban általában a LIA-mat módszert alkalmazzák. A klinikai vizsgálatok során Fagnart 1988-ban észlelte, hogy a szérum S-100B érték disszeminált melanomában emelkedett (57). Ezt követoen keringo tumormarként való felhasználásának lehetoségeit számosan vizsgálták (175). A tanulmányok azonban, melyek a szérum S-100B szintet elemzik, az IRMA és LIA-mat módszert egyaránt alkalmazták, különbözo stádium beosztásokat használtak, változó cut -off értékkel számoltak kezelt és kezeletlen, tünetmentes és tünetes beteganyagon egyaránt. A legtöbb közlemény által alkalmazott IRMA módszer alsó határértéke 0,2 g/l volt, míg a LIA immunesszének a funkcionális alsó határa ennél tízszer alacsonyabb, 0,01 g/l. Ezért a különbözo eredmények összehasonlítása nehézkes. Egy német és egy svájci munkacsoport határozott meg eloször 126 és 73 beteg elemzése kapcsán stádiumfüggo emelkedett marker koncentrációkat. A szenzitivitás stádium I-II: 1,3/4%, stádium III: 8,7/21,4%, stádium IV: 74/79%-nak bizonyult (65,78). Az eredményeket egy svéd közlemény is megerosítette, 643 beteg eredményeinek feldolgozásával. Kifejezett korrelációt találtak a szérum koncentrációk és a túlélés között. Ennek alapján az S-100B megfelelo cut off érték esetén stádiumtól független prognosztikus markernek bizonyult melanomában (153). Egy késobbi közleményben ezt megerosítették, és javasolták, hogy az S100 kerüljön be a klinikai "staging"-be (154). Hauschield 1999-ben 412 melanomás beteg 1339 szérum mintájából hasonló eredményeket publikált. Cut off értékként 0,2 g/l-t alkalmazva stádium I-II-ben (primer tumor) 1,7%, stádium III-ban (locoregionális érintettség) 19,2%, stádium IV-ban 68% szenzitivitást észlelt. A cut off szintet meghaladó S- 100B protein koncentrációjú betegek átlagos túlélése stádiumtól függetlenül szignifikánsan rövidebbnek bizonyult a többi betegénél (73). Wollina 371 mintában a stádium III és IV betegek értékei között szignifikáns különbséget észlelt. A marker 97% specificitással és 65% szenzitivitással különböztette meg a tünetmentes betegeket a tünetesektol (186). Bonfrer vizsgálatai során a kapott eredményeket erosen specifikusnak, de különösen kezdeti stádiumban alacsony szenzitivitásúnak észlelte, ezért további vizsgálatokat szorgalmazott (24). Hanson a magas rizikójú esetek kiszurésére és terápia monitorozásra tartotta alkalmasnak a vizsgálatot, és szoros összefüggést észlelt a túléléssel (68). A legnagyobb számú vizsgálatot Martenson végezte 1007 betegen. Eredményei alapján azt tapasztalta,
13
hogy az S-100B protein szint független prognosztikus faktor a klinikai II-es és III-as stádiumban, míg I-es stádiumban csak 12%-ban észlelt emelkedett értékeket (112). Guo 1995-ben eloször jelentette ki, hogy a vizsgálat metasztatikus melanomás betegeknél terápia monitorozásra alkalmas, amit a késobbiekben Henze ugyancsak alátámasztott (65,78). Kisszámú betegen ugyan, de Henze és Bonfrer hasonló eredményeket publikáltak. Bonfrer szerint 0,16 g/l cut off értéknél a betegek 63%- ában a marker 99%-os biztonsággal képes jelezni a daganatot (25). Hauschield nagyobb számú beteget felölelo közleményében korreláció mutatkozik a terápiás válasz és a szérum koncentrációk között. A kezelésre nem reagáló betegek szérum szintjei magasabbak voltak a terápia megkezdése elott, mint a javuló betegek koncentrációi (73). Számos szerzo szerint a terápia alatt az emelkedo S- 100B protein értékek progresszióra utalnak, míg a csökkeno koncentráció a terápiás választ jelzi (65,74,78). Ez a megállapítás gyakorlati jelentoségu, mivel befolyásolhatja a terápiás stratégiát. A betegkövetés kapcsán a szérum S-100B koncentráció a klinikailag vagy eszközös vizsgálatokkal észlelheto metasztázis elott megemelkedhet. A közlemények ezzel kacsolatban rendkívül eltéro eredményeket közölnek. Schlagenhauf 411 monitorozott betegnél 41 esetben észlelt progressziót és 19,5%-ban az S-100B emelkedése volt e metasztatizáció elso jele (151). A szérum koncentráció kis számú esetben ugyan, de közel 50%-ban megelozte az áttét kimutatását Bonfrer vaccinával kezelt betegeiben (25). Jury melanoma monitorozása kapcsán 11 (85%!) esetben a 13 újonnan észlelt disszeminált melanomás beteg közül az S-100B emelkedése 5-23 héttel megelozte az áttét konvencionális módszerekkel történo kimutatását (92). Összehasonlító vizsgálatok során Miliotes a lipidhez kötött sziálsavat és az S-100B protein koncentrációkat értékelte közleményében. Az S-100B protein emelkedése szignifikáns korrelációt mutatott a recidíva megjelenésével és a túléléssel, szemben a lipidhez kötött sziálsavval (115). Berking az S-100B proteint tartja a legérzékenyebbnek (IV-es stádiumban szenzitivitás 80%) a metasztázis kialakulásának jelzésére, szemben a multimarker RT PCR-ral vizsgált tyrosinase, Melan-A, MAGE-3, gp-100 45,5%-os szenzitivitási értékeivel (20). Tofani 53 betegen elvégzett vizsgálata alapján I- II-es stádiumban csak NSE emelkedést észlelt. Összességében azonban NSE emelkedést 26%-ban, míg kóros S-100B proteint 30%-ban mért, stádium IV-ben pedig a szenzitivitás NSE esetén 34%-nak, míg S-100B proteinnél 55%-nak bizonyult (169).
14
Bonfrer 251 beteget felölelo az S-100B proteint és NSE-t értékelo munkájában az Sl00B protein 79%- os szenzitivitással szignifikánsan jobb markernek bizonyult a neuronspecificus enolase 42%-os pozitivitásánál (24). Djukanovic munkájában 65 beteg 271 mintáját elemezve S-100B protein esetében 81,5%-ban, míg MIA-nál 73,8%- ban észlelt korrelációt a markerkoncentrációk és a betegség lefolyása között. MIA esetében azonban a fals negatív eredmények száma 32,5% volt, szemben az S100B-vel kalkulált 20%-kal (50). Az S- 100B protein és LDH közti összefüggést a LDH fejezetben elemzem. A legújabb közlemények már a klinikai gyakorlatba próbálják illeszteni az S-100B protein
méréseket.
Vizsgálják
például,
alkalmas-e
az
S-100B
koncentráció
mikrometasztázisok jelzésére a szentinel nyirokcsomóban. A nemleges válasz a fentiek alapján tulajdonképpen várható, hiszen a szenzitivitás az AJCC III-as stádiumban szinte minden korábbi értékelésben igen alacsonynak bizonyult (1). Elemzik továbbá a fals pozitív eredmények lehetséges okait: más tumorok máj metasztázisaiban, valamint primér májrákban, májcirrhozisban ugyancsak emelkedett értékeket észleltek. Egészséges egyéneknél bizonyos vesebetegségek állhatnak a fals pozitivitás hátterében (118). Vizsgálatok tárgyát képezte továbbá, a szérum S-100B eredete és fél életideje. A sejtelhalás következtében a keringésbe kerülo tumormarker fél életidejét 30 percben határozták meg izolált végtagperfúzió során (63). Gyermekekben, mivel az idegszövet és a porcszövet, amelyekben az S-100B protein szintén
kimutatható,
még
jelentosen
fejlodik,
megfelelo
referencia
értékek
meghatározása szükséges (85). A vizsgálatok értékelése kapcsán problémát jelenthet esetleges központi idegrendszeri sérülés, mely szintén növelheti a szérum S- 100B protein szintet. Továbbá, hogy egészségesekben is mértek már magasabb szérum értékeket (X,XI,170). Összefoglalva elmondhatjuk, hogy az S-100B protein a legjobban vizsgált tumormarker. Klinikai alkalmazása legcélszerubb stádium II-III-IV-ben prognosztikus célból, terápia monitorozásra és betegkövetésre.
15
3.2. A melanin szintézis enzimjei és metabolitjai
a. Tirozináz A tirozináz a melanin bioszintézis egyik kulcsenzime. Megfelelo lenne melanomában tumormarkernek, mivel a melanociták expresszálják. Sonesson egyik tanulmányában emelkedettnek észlelte a szérum tirozináz aktivitást elorehaladott melanomában (159). Az RT-PCR technika használata a melanocita sejtekre specifikus tirozináz mRNA meghatározásával lehetové tette a tirozináz pozitív, azaz keringo melanoma sejtek kimutatását a perifériás vérben (158). Azonban Reinhold és munkatársai szerint a keringo melanoma sejtek közül csak néhány életképes és tartja meg proliferációs képességét. Az in vivo metasztázis képzo tulajdonság számos egyéb faktortól is függ, mint például a célszövetben való megtapadás, növekedési potenciál, a szervezet immunválasza. A tanulmány szerint kevesebb mint 0,01%-a ezeknek a keringo tumorsejteknek vezet végül metasztázis kialakulásához (98,138). A keringo melanoma sejtek inkább a meglévo mikrometasztázist jelzik, mint a szisztémás betegség lehetséges kifejlodését prognosztizálják (138). A nagyszámú megjelent publikációban IV-es stádiumban a módszer szenzitivitása rendkívül széles skálán mozog. Brossart 1993-ban 100%-os szenzitivitást észlelt disszeminált betegeknél, ezt azonban a késobbiekben megismételni nem sikerült (34). Tsao 127 közleménybol válogatott és végül is 23 publikációt és 1799 beteget tartalmazó rendkívül rés zletes elemzése alapján a specificitást 100%-nak találta. A szenzitivitás azonban a stádiumtól függoen változik. Stádium I/II-ben 18/29%, míg stádium III- ban 30% stádium IV-ben is csak 45% átlagosan (170). A legújabb vizsgálatok alapján disszeminált betegek esetében a szenzitivitás IV-es stádiumban 60-70% között mozog, az RT-PCR emelkedés egyértelmuen rövidebb túléléssel jár (135,137). Amennyiben az RT- PCR pozitivitás metasztatikus képességgel bíró keringo melanoma sejteket jelez, úgy stádium III-ban 60-70%, stádium IV-ben 100%-os pozitivitást kellene észlelnünk. Ez segítene meghatározni az adjuváns vagy agresszív, kombinált kemoterápia bevezetését. A módszert kérdésessé teszi, hogy a melanoma sejtek megjelenése a keringésben nem folyamatos, hanem intermittáló, amit a metasztázisok
16
random kialakulása is alátámaszt. Valamint, hogy a melanoma sejtek csak átmenetileg perzisztálnak a véráramban (138). A vizsgált közlemények egymástól jelentosen eltérnek, mind a beteganyag kiválasztásában, mind az elért eredményekben. A tirozináz RT-PCR módszer megítélését ára és idoigényesssége is jelentosen befolyásolja.
b. Alfa-melanocita stimuláló hormon (alfa-MSH) A hipofízis alfa-MSH hormonja felelos a melanociták megnövekedett melanin szintéziséért, ennek következtében a bor sötétebbé válásáért. Szérum alfa MSH meghatározással igen kevés tudományos munka foglalkozik. Emelkedett értékeket mértek terheseknél, PUVA terápia kapcsán és egy tanulmányban a melanomás betegek 34%-ánál, stádiumtól függetlenül. Az IRMA-val meghatározott szérum szintek tükrözték a terápiás választ. A szerzok véleménye szerint a megnövekedett szérum koncentráció pozitív feedback következtében létrejött centrális hormontermelés fokozódás következménye lehet, a bor irradiációjához hasonló módon, nem pedig a daganatos szövet megnövekedett szekréciójának eredménye (62).
c. 6-hidroxi-5-methoxiindol-2-karbolsav (6H5M12C) Indol derivatum, a barnásfekete eumelanin metabolitja. Horikoshi szerint a 6H5MI2C koncentráció korrelálhat a borszínnel. Mind Karnel mind Horikoshi melanomás betegeken csak végstádiumban észlelték az érték emelkedését, akkor azonban kiugróan magas koncentrációkat mértek, vizeletben és szérumban egyaránt (81,96).
d. 5-S-ciszteinildopa (5-S-CD) Az 5-S-ciszteinildopa a melanocitákban és melanoma sejtekben zajló melanin szintézis köztiterméke. A tirozinból kiinduló melaninképzodés kapcsán DOPA, dopaquinone majd 5-S-ciszteinildopa keletkezik, mely a vörösesbarna feomelanin képzodést eredményezi (1. ábra). A folyamatban jelentos szerepet játszik a tirozináz enzim, az elso két lépés katalizásával, melynek során a tirozint dopavá hidroxilálja, ezt a követoen dopaquinonná oxidálja. A reakcióhoz cisztein jelenléte is szükséges (18,19,136). A pigmentképzodés során három különbözo kémiai szerkezetu köztitermék jön létre: fenol (Dopa, azaz 3-4 dihidroxifenilalanin), fenol-tiol konjugátum (5-S-ciszteinildopa) és
17
indol (5,6 dihidroxiindol). Mivel e fenti köztitermékek a melanin szintézishez kapcsolódnak, a melanocitákra és melanocitás léziókra erosen specifikusaknak kellene lenniük. Tirozin DOPA
tirozináz
DOPAquinon
cisztein
5-S-CISZTEINILDOPA
5,6 dihidroxiindol eumelanin
feomelanin
1. ábra A pigmentképzodés folyamata. A tirozinból kiinduló pigmentképzodés során cisztein jelenlétében a tirozináz katalizálta reakcióban eumelanin és feomelanin képzodik.
Az 5-S-CD keletkezésének másik lehetséges módja, hogy glutation hozzáadásával a dopa-kinonból glutation-dopa képzodik, mely 5-S-CD-vé alakulhat a gamma glutamil transzpeptidáz segítségével (117). Westerhof munkája alapján az 5- S-CD egy peroxidáz katalizálta reakcióban is képzodhet, nem csak melanocitákban. Ez a tény magyarázhatná esetleg az 5-S-CD mérhetoségét albinókban (181). Az 5-S-ciszteinildopa jelenlétét 1973-ban Rorsman mutatta ki fluorimetriával szövetekbol és vizeletbol (142). Az 5-SCD szérumból és vizeletbol egyaránt mérheto (2,3,4,67,93). A szérum 5-S-ciszteinildopa kimutatására szolgáló, és az utóbbi idoben általánosságban használt magas nyomású folyadékkromatográfiát Hansson publikálta 1978- ban, majd Kagedal alkalmazta vizelet értekek meghatározására 1983- ban (67,88,93). Immunhisztokémiai meghatározásra is lehetoség nyílott 1993-tól a Liu által kifejlesztett monoclonalis antitesttel (107). Az 5-S-CD eredmények értékelése során bizonyos speciális, csak erre a markerre jellemzo tulajdonságokat is figyelembe kell vennünk (164). Például, a szérum 5-S-CD koncentráció nem korrelál a korral, nemmel, fajjal, haj- és borszínnel, annak ellenére, hogy a marker keletkezése szorosan kapcsolódik a pigmentképzodéshez (127,162). Megfigyelheto azonban az 5-S-CD szérum szintjének bizonyos szezonális ingadozása (127). Wakamatsu közleményében az egyedi értékek nem emelkednek a normálérték fölé, noha a kora nyári 5-S-CD átlagértékek a téliekének a kétszeresei (177). Bizonyos fiziológiás, illetve patológiás körülmények között azonban, amikor a melanocita aktivitás növekszik, az 5-S-CD szint is emelkedhet. Pszoriázisos betegek PUVA kezelése, UV-A és UV-B irradiáció, gyulladásos folyamatok esetén az 5-S-CD
18
koncentrációja egyértelmuen növekedhet. A vizsgálatok alacsony betegszáma, a statisztikai elemzések hiánya (volt-e az egyes értékek között szignifikáns különbség) miatt azonban még ezen tanulmányok eredményei sem meggyozoek a szérumszint ingadozásának tekintetében (165,166). Ellentmondásos az amelanotikus daganatok és az 5-S-CD kimutathatóságának megítélése. A legtöbb szerzo szerint szerint a pigment képzodés a melanocitákban zajlik, míg mások egyéb lehetoséget sem tartanak kizártnak. A tanulmányok többsége alapján amelanotikus daganatok esetében az érték nem emelkedik, ezt állatkísérletek is alátámasztják (80,84). Ezzel szemben Wimmer nem talált különbséget a szérum koncentrációkban a IV-es stádiumú amelanotikus és melanotikus metasztázissal bíró betegeinél (184). Eloször a vizelet 5-S-CD koncentráció és a melanoma kapcsolata képezte a kutatások, klinikai vizsgálatok tárgyát (2,3,4,90,96,162). B16 melanómás egereken végzett állatkísérletekben a vizelet 5-S-CD értéke jól korrelált a tumortömeggel (89). Az elso, nagyobb beteganyagot felölelo közlemény Agruptól származik, aki 5 éves tapasztalata alapján (571 beteg) a magas vizelet 5-S-CD értékeket betegeinél prognosztikus jelentoségunek tartotta a metasztatizáció és túlélés vonatkozásában (4). Meyerhoffer nagyméretu, kongenitális nevusos gyermekeknél a nevus növekedésének, esetleges malignizálódásának monitorozására ajánlja a vizelet 5-S-CD szint mérést (114). Sasaki vizsgálatai (50 beteg) szerint az emelkedett vizelet 5- S- CD szint melanomás betegeknél távoli metasztázisra utal és prognosztikus információt hordoz (146). Karnell 430 beteget elemzo, 2000-ben megjelent közleményében a vizelet 5-S-CD szenzitivitását IV-es stádiumban 83%-nak találta. Szoliter távoli metasztázis esetében a betegek 50%- ában emelkedtek az értékek, míg többszörös szervi áttétet minden esetben megnövekedett szérum koncentráció kísért (95). A szérum és vizelet 5-S-CD értékek összehasonlítása kapcsán állatkísérletekben Wakamatsu úgy találta, hogy a szérum 5-S-CD jobban korrelált a tumortömeggel, mint a vizelet értékek (176). Ezt megállapitást human kísérletekben is sikerült megerosítenie (178). A szérum 5-S-CD vizsgálatok elemzése késobb került az érdeklodés eloterébe, és jelenleg sem áll nagyszámú közlemény rendelkezésre. A tanulmányok általában kevés beteget vizsgálnak. Állatkísérletekben, melanoma modell rendszerben a plasma 5-S-CD szint korrelált a primer tumor nagyságával. Az emelkedett 5-S-CD koncentráció
19
kapcsolatban volt a pigmentációval, azaz amelanotikus melanománál nem észlelték a marker szintek emelkedését (84). Peterson diszplasztikus nevus szindrómás és különbözo stádiumú melanomás betegek koncentrációinak összehasonlításával vizsgálta az 5-S-ciszteinildopa szinteket. A diszplasztikus nevus szindrómás betegek értékei a normáltartományban mozogtak, míg a melanomás betegeké a stádiummal és prognózissal korrelált (133). Tünetmentes melanomás betegek esetében a szérum és vizelet értékek a kontrollokéhoz hasonlóak. Metasztázis kialakulásakor azonban a szérum koncentráció emelkedése néhány esetben (7/9) már az áttét megjelenése elott észlelheto volt (82). Hasegawa kisszámú beteganyagában is alkalmazhatónak tartja a szérum 5-S-CD meghatározást korai metasztázis észlelésre más markerekkel kombináltan (69). Hirai csak a IV-es stádiumú betegeinél észlelt emelkedett 5-S-CD szintet (80). Wimmer melanomás betegeinél az 5-S-CD-t kemoimmunterápia monitorozásra használta. Alkalmasnak találta a szérum 5-S-CD értékek változását a kemoimmunterápiára reagáló és nem reagáló betegcsoport elkülönítésére, terápia monitorozásra. Ezenkívül megfelelo prognosztikus faktornak tartotta a túlélés idejének megítélésére is. (184). Érdekes részeredmény, hogy a primér tumor jelenlétében mért emelkedett szérum koncentráció a mutéti kezelés után visszatért a normálisra, de nem bizonyult elég érzékenynek a következményes metasztatizáció megítélésére. Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a közlemények szerint a szérum 5-S-CD szint stádiumtól függoen emelkedik, kifejezetten azonban csak IV-es stádiumban (80,81). A magasabb 5-S-CD szint progressziót jelezhet, néha az eszközös vagy fizikális vizsgálatoknál korábban (69,80,82,133), valamint alkalmas terápia monitorozásra is (70,184). Összehasonlító vizsgálatok során Hirai szoros korrelációt észlelt a szérum 5-S-CD és sICAM-1 között. Mindkét marker jól korrelált a progresszióval, azonban az 5-S-CD szint csak IV- es stádiumban emelkedett (80). Hasegawa párhuzamosan végzett 30 betegen 5-S-CD, sICAM-1 és sIL-2 vizsgálatokat. A progresszió megítélésre az 5-SCD-t tartotta a legalkalmasabbnak (69). Horikoshi négy melanin metabolitot értékelve az 5-S-CD-t találta a legmegfelelobb markernek progresszív melanomában. A szérum 5S-CD emelkedés megelozte a metasztázis hagyományos módszerekkel történo kimutatását (81). Karnell szérum S-100B protein, vizelet 5-S-ciszteinildopát és 5-
20
hidroxi-6-metoxiindol-2-karbolsav
párhuzamos
eredményeit
elemezve
arra
következtetésre jutott, hogy mind az S-100B protein, mind az 5-S-CD jól korrelál az átlagos túléléssel (95). Érdekes kérdésként merül fel, vajon lehetséges-e a melanoma kezelése a melanogenezisen keresztül, azaz tirozin analógokból eloállított citotoxikus anyagokkal? Ígéretes próbálkozásnak bizonyultak a 4-S-ciszteaminilfenollal, valamint aktivált formájának a 4-S- ciszteaminilkatekollal melanoma sejtvonalakon végzett in vitro és in vivo vizsgálatok. Az utóbbi vegyület citotoxikus hatása a melanocitákra a tirozináz aktivitástól függ. Sajnos azonban ezek az anyagok általában primeren toxikusak és farmakokinetikájuk kedvezotlen (86,141).
3.3. Citokinek
Interleukin-2, interleukin-6, interleukin-8, interleukin-10 Alapveto immunológiai és nem immunológiai folyamatok specifikus regulátorai, melyek melanoma sejtekben is termelodnek (30,149). szempontjából
pro-inflammatorikus
(IL-2)
és
Hatásmechanizmusuk
anti- inflammatorikus
(IL-10)
különböztetünk meg. Kimutatásuk ELISA teszttel történik.
a. Interleukin 2 Boyano különbözo stádiumú melanomás betegeket vizsgálva arra a következtetésre jutott, hogy az IL- 2R szint valamennyi stádiumban szignifikánsan különbözik a normál kontrolloktól, továbbá korrelál a progresszióval. Összesen 172 I-III stádiumú melanomás beteg monitorozása kapcsán távoli disszemináció kifejlodése során a betegek 57%-ában emelkedett meg az IL-2R érték. A magas IL-10 koncentráció rosszabb prognózisra utalt (30).
b. Interleukin 6, interleukin 8 Scheibenbogen disszeminált melanomás betegeknél 21/56 esetben mért magasabb szérum IL-8 szintet ELISA teszttel. Szignifikáns korrelációt észlelt a tumortömeggel, a metasztázis helye azonban indifferensnek bizonyult (149). Mouawad vizsgálataiban az IL-6 szint stádium IV-ben szintén magasabb volt (120).
21
c. Interleukin 10 Nemunaitis 41 disszeminált melanomás és 50 egészséges önkéntes szérum IL- 10 összehasonlító vizsgálata alapján úgy találta, hogy a marker alkalmas a két csoport elkülönítésére és az emelkedett IL-10 szint rossz prognózist jelzett (126). Dummer IVes stádiumú melanomás betegeknél 72%-ban (29/42) talált pozitív IL- 10 tesztet (52). Vuoristo 50 elorehaladott melanomás betegénél megállapította, hogy több szervi metasztázis (elsosorban hepar és csont) magasabb szérum
IL-10 és IL-6
koncentrációkkal jár. Ennek alapján a tumortömeg mérésére illetve a metasztázis helyének jelzésére szolgáló markerek lehetnének (173). A melanoma sejtekbol származó citokinek és adhéziós molekulák szerológiai meghatározásával lehetoség nyílik a tumor és a szervezet immunviszonyának vizsgálatára, prognosztikus következtetések levonására (30,120). A fellelheto közlemények általában alacsony betegszáma, a vizsgált különbözo stádiumú beteganyag, az interleukinok gyulladásos és autoimmun folyamatokban a való részvétele, a gyakran alkalmazott immunterápia, az eltéro következtetések miatt általánosságban azt mondhatjuk, hogy melanomában tumormarkerként egyelore nem alkalmazhatók.
3.4. Metalloproteinázok
A különbözo tumorok invazív képessége többek között függ a metalloproteináz enzimektol, melyek cink dependens endopeptidázok, és a tumorsejtek környezo szövetbe történo migrációját segítik elo, így szerepet játszanak az invázióban és tumor metasztatizációban. A meghatározás ELISA tesztekkel történik. Az MMP-2 (mely gelatinázként ismert) expresszálódik humán melanomában. Wollina 337 mintát elemzett, összehasonlítva az adatokat a stádiummal, a metasztázis meglétével valamint S-100B és sICAM- 1 koncentrációkkal. A mért szérum értékek között szignifikáns korrelációt tapasztalt. Ennek ellenére az egyes stádiumok és a metasztatizáló/nem progrediáló betegek szérum szintjei között a különbség nem volt szignifikáns (185). Vuoristo 50 távoli disszeminációban szenvedo, kemoimmunterápiában részesülo
22
beteget vizsgált. A kiindulási értéket nem találta prognosztikus szempontból alkalmazhatónak. A mért szérum koncentrációk nem voltak jellemzoek a metasztázis helyére és a túlélésre (174). Az eredmények azt mutatják, hogy ezek a vizsgálatok melanomában tumormarkerként való alkalmazásra nem megfeleloek.
3.5. Adhéziós molekulák
a. Intracellularis adhéziós molekula (ICAM-1) Az adhéziós molekulák sejtmembrán proteinek, melyek alapvetoen fontosak a sejt-sejt és a sejt-környezethez való kapcsolatában. Immunológiai, gyulladásos, sebgyógyulási és metasztázis képzo folyamatokban vesznek részt. ELISA tesztekkel határozhatók meg, specificitásuk alacsony, mivel sokféle folyamatban játszanak szerepet. Citokinekkel (interferon, interleukin) kezelt betegek sICAM- 1, sVCAM-1 monitorozása nem célszeru, mivel ezek képesek másodlagosan az adhéziós molekulák szintjét növelni (72). A közlemények eredményei ellentmondásosak. Míg Altomonte stádiumtól függoen a melanomás betegek 95%-ában észlelt emelkedett ICAM-1 koncentrációt, Viac nem talált különbséget a primer tumoros és disszeminált betegek szérum értékei között, Vuoisto szerint pedig a magas sICAM- 1 szint hepatikus áttétre utal (5,172,173). Schadendorf vizsgálata során 34 betegnél a marker korrelált a tumortömeggel és a melanoma progressziójával (147).
b. Vascularis sejt adhéziós molekula (VCAM-1) Francke 97 IV-es stádiumú beteget elemzo tanulmányában a sVCAM-1 független prognosztikus faktornak bizonyult az emelkedett LDH-val együtt és korrelált a túléléssel. A magasabb sVCAM-1 és LDH koncentráció alapján a betegek különbözo rizikócsoportba sorolhatók (60).
23
3.6. Szérum réz és cink, ceruloplasmin
Ros- Bullon 35 különbözo stádiumú melanomás beteg és egészséges kontroll személy szérum réz koncentrációinál alapveto különbségeket nem észlelt. Ezzel szemben a szérum cink szint szignifikánsan emelkedett a melanomás betegeknél. A módszer szenzitivitását átlagosan 86,5%-nak találta (144). A szérum ceruloplazmin szintet a fenti szerzo 64 melanomás betegnél valamint egészségesekben értékelte. Az eredmények alapján a két csoport egymástól a szérum ceruloplazmin szint alapján elkülönítheto (145).
3.7. Laktátdehidrogenáz (LDH)
A laktátdehidrogenáz a tejsavas erjedés befejezo lépését (melynek során a tejsavból nikotinsavamin-adenin-dinukleotid
jelenlétében
piröszolosav
és
redukált
NAD
képzodik) katalizálja mindkét irányban. A különbözo szövetekben öt izoenzim fordul elo, melyek négy alegységbol épülnek fel (tetramerek). A tetramerek kétfajta monomer kombinációból alakulnak ki. Az egyes szervekben a monomerek különbözo arányban szintetizálódnak, ennek következtében alakul ki az egyes szervekre jellemzo izoenzim spektrum. Az összes laktátdehidrogenáz aktivitás 40-60%-át a máj eredetu ötös izoenzim fejti ki, ugyancsak 40-60% származik a szívizom eredetu egyes és kettes izoenzimbol. Az LDH-nak prognosztikus értéke van számos tumorban, így kis sejtes és nem kis sejtes tüdorákban, limfómákban, prosztat arákban, leukémiában. Az emelkedett szérum LDH és a melanoma kapcsolata már az 1950-es években felmerült Hill közleményében (79). Ezután számos szerzo elemezte az LDH, mint melanoma marker értékét. 1974-ben nagy beteganyag értékelése kapcsán Einhorn úgy találta, hogy szinte minden, ultrahanggal igazolt metasztázisban a szérum LDH koncentráció megemelkedett. Ezzel szemben, a magasabb LDH koncentrációjú összes betegnél csak az esetek 46%-ában sikerült igazolni hepatikus érintettséget. Ez felvette, hogy az LDH esetleg más szövetekbol került a keringésbe. A másik lehetoség, hogy az UH vizsgálat esetenként fals negatív eredményt ad (54). 1983-ban Finck 121 klinikai II-es stádiumú melanomában szenvedo beteget követett sorozatos LDH vizsgálatokkal. Az LDH a progressziót és a hepatikus
24
érintettséget 72/95% szenzitivitással és 97/82% specificitással jelezte. Az esetek 12,5%ában az emelkedett LDH érték utalt eloször a metasztázisra (58). Magas LDH koncentrációt észleltek melanomás betegekben multiplex nyirokcsomó, valamint hiláris és mediastinális érintettség esetében is (94). Egy olasz tanulmány I-es stádiumú melanomában 20% LDH szenzitivitást említ. A magas LDH-val rendelkezo betegek túlélése szignifikánsan rövidebb volt (38). Ezt a tényt uveális melanomában, hepatikus metasztázis esetében is megerosítették (17). Elorehaladott regionális vagy távoli metasztázisnál a normálértéket meghaladó LDH független prognosztikus faktornak bizonyult (157). Egy norvég tanulmány, mely az LDH- t mint prognosztikus markert vizsgálta, megállapította, hogy agyi metasztázis esetében, melyet 450 U/l-nél nagyobb LDH érték, leukocitózis és gyorsult süllyedés kísér, az átlagos túlélés várhatóan 3 hónapnál rövidebb. Az emelkedett LDH szint korrelált a hepatikus érintettséggel, valamint a tumortömeggel (76). Manola vizsgálatai alapján metasztatikus melanomában az áttét helyének és a magas LDH értékeknek van prognosztikus szerepe a túlélés szempontjából (109). Az utóbbi években már összehasonlító vizsgálatok eredményeit is közölték. Buer szerint IV-es stádiumban többváltozós analízissel a szérum S-100B-nek nincs további prognosztikus értéke az LDH-hoz képest (35). Francke 97 áttétes melanomás betegen az sVCAM-1, sICAM-1 és LDH szérum koncentrációk értékelése kapcsán úgy találta, hogy az LDH és a sVCAM-1 dominálóan visceralis és tüdometasztázisban független prognosztikus faktor, és az emelkedett kezelés elotti szérum szint kedvezotlen prognózist jelez (60). Krahn 373 különbözo stádiumú melanomás beteg S- 100B, MIA, albumin és LDH értékeit összehasonlítva szérum S-100B proteint találta a legmegfelelobb markernek 86%-os szenzitivitása miatt, szemben a MIA 80% illetve az LDH 48%-os szenzitivitásával. Specificitás szempontjából azonban az LDH (98%) kissé megelozte a 91%-os S-100B- t és a 62%-os MIA-t (103). Deichmann 71 disszeminált melanomás betegénél ugyancsak a szérum S-100B, MIA és LDH méréseket
végzett.
Hasonló
eredményeket
kapott.
Az
LDH
bizonyult
a
legspecifikusabbnak (92%), azonban S-100B-val 91%, MIA-val 88% szenzitivitást észlelt. Mindhárom mar ker emelkedése a betegség progressziójára utal, de a legjelentosebbnek az LDH- t tartja (46). A IV-es stádiumú betegeken az LDH képes megkülönböztetni a progrediáló betegeket a nem progrediálóktól, míg a terápia elotti S-
Megjegyzés: ez mi?
25
100B szint a leginformatívabb a betegség kimenetelét illetoen (46). Egy másik tanulmánya szerint az S-100B és a MIA multivariációs analízissel nem bizonyult jobbnak az LDH-nál metasztatikus melanómában (47). Hauschield 64 disszeminált melanomás beteg szérum mintáinak analízise kapcsán az S-100B-t hasonlította össze a hagyományos, vérbol meghatározott parameterekkel. Multivariációs analízissel csak az S-100B bizonyult szignifikáns független prognosztikus faktornak (75). Összefoglalóan elmondhatjuk, hogy a számos elemzés elsosorban disszeminált melanomában észlelt emelkedett LDH értékeket. A magasabb szérum LDH szint tükrözheti a tumortömeget, a betegség aktivitását, és prognosztikus faktorként szolgálhat. Nem elhanyagolható szempont azonban, hogy szöveti sérülések kapcsán, például miokardiális infarktusban, hemolízisben az LDH koncentráció szintén növekedhet.
A fenti irodalmi áttekintés alapján valamennyi, jelenleg vizsgált tumormarkernek minosítheto anyag elorehaladottabb stádiumban magasabb koncentrációban mérheto. Legígéretesebbnek, mind prognosztikus szempontból, mind a terápiás válasz tekintetében az S-100B protein, a MIA, a tirozináz RT-PCR illetve IV-es stádiumban az LDH bizonyult.
26
4. Tumorszöveti immmunhisztokémiai markerek (S-100B protein, AMF receptor) Az S-100 proteint Gaynor 1980- ban mutatta ki human melanoma sejtvonalakból (M12, M14, M15, M19, M29) komplement fixációs teszttel. A melanociták neuroektodermális eredetuek, ez adta az ötletet glia sejtekben már felfedezett S-100 protein vizsgálatára (61). Korábban számos agytumorban (astrocitoma, glioblastoma, oligodendroglioma, akusztikus neurinoma) észleltek komplement fixációval különbözo mennyiségu S-100 proteint. A meningeoma, medulloblastoma azonban általában negatív eredményt adott. 1982-ben Nakajima immunhisztokémiai módszerrel eloször melanomában és pigmentált nevusokban határozta meg az S-100 proteint. A lentigo maligna melanoma és a melanocita eredetunek tartott kék nevusok alig vagy egyáltalán nem tartalmaztak S-100 proteint. Ezzel szemben a nodularis melanoma és a junkcionális, kompaund és intradermális nevusok, amelyek nevocitás eredetuek, változatos immunreaktivitást mutattak. Vizsgálatai során az S- 100 protein intenzitása a melanin pigment jelenlétével fordítottan volt arányos (123). Más szerzok, így Cochran eredményei ezt nem erosítették meg, o az S-100 protein mennyiségét függetlennek találta a primér tumor melaninizációjától (43). Nakajima ezt követoen különbözo tumorokon végzett immunhisztokémiai vizsgálatokat. Kimutatta, hogy az S- 100 protein nem specifikus az idegszövetre és tumoraira, hanem számos más tumor így carcinoidok, chordoma, chondrosarcoma, nyálmirigy pleiomorf adenoma, emlorák ugyancsak pozitív eredményt adhat (124). Cochran 1985- ben megjelent közleményében az S-100 proteint tartalmazó tumorok széles skáláját ismerteti (42). Böni vizsgálatai alapján az S100B megtalálható az epidermis melanocitáiban, Langerhans sejtjeiben, a dermisben a hajfolliculusokban, Schwann sejtekben, melanocitás léziókban mint nevusok, melanoma, és áttétei. Az S100A6 szintén jelen van számos, a legtöbb említett képletben (31). Napjainkban az immunhis ztokémiai módszert széles körben használják nemcsak a melanoma diagnózisában, hanem differenciáldiagnosztikai célra is (22,41,66). A monoklonális anti S -100 alfa pozitivitás a melanocitás nevusok aktivitásának jelzoje, míg a monoklonális beta reaktivitás a szuperficiálisan terjedo és a lentigo maligna melanoma vertikális progressziójára utal (41). Az S-100 protein meghatározása nem csak diagnosztikus szempontból fontos, hanem alkalmazható a tumor vastagságának mérésére, a periférián a szélek daganatmentességének
27
megítélésére (55). A melanoma azonban heterogén tumor, mind a melaninizáció, mind a különbözo
proteinek,
beleértve
az
S-100B- t
is,
expressziója
szempontjából
(7,22,41,53,66). Amerikai szerzok akrális lokalizációjú, ismételten S-100 negatív melanomákat is publikáltak (7,66). A melanoma malignum differenciáldiagnózisa számos protein mint például az S- 100B, a HMB 45, a napjainkban bevezetett MART1/MelanA expresszióján alapul (22,41,66,130). Az S-100B különösen megfelelo, mivel a melanin képzodéstol független (42,43). Összehasonlító vizsgálatokban, melyek az S-100B, a HMB 45, T311 (anti-tirozináz) és a Melan-A/MART-1 immunhisztokémiai értékét vizsgálták, az S-100B maradt a melanocita differenciáció
legérzékenyebb
markere
(22,40,129,130).
Melanoma
malignum
diagnózisára és differenciáldiagnosztikájára rutinszeruen poliklonális S-100 antitestek használatosak, melyek szenzitívek, de nem specifikusak a melanocitás léziókra. Számos közlemény az immunhisztokémiai festodés megítélésében szemikvantitatív (eros, közepes, gyenge)
módszert
használ,
míg
mások
az
immunpozitív
sejtek
számát
négyzetmilliméterenként rögzítik (66,100,104). Az immunhisztokémiai vizsgálatok kapcsán nincs eltérés a primer és a metasztatikus szövet festodése között (66). Kernohan 215 bormelanomában vizsgálta meg az S-100 protein festodés és túlélés esetleges összefüggését. Érdekes módon, az eros immunhisztokémiai reakció jobb túléléssel járt együtt (100). A primér melanoma S-100B protein expressziójának és a szérum S- 100B szintjének viszonyát eddig még nem vizsgálták (XV).
A melanoma metasztatikus potenciálja összefüggésben van a primér tumor nagyságával (Breslow szerinti vastagság milliméterben, vertikális vagy radiális növekedési fázis). Biológiailag a tumor heterogén, a prognozis megítélésében az egyik legfontosabb meghatározó tényezo mindmáig a primér tumor vastagsága. A melanoma invazívvá, metasztatikussá válásában potenciális szerepet játszó molekuláris markerek kutatását kifejezett érdeklodés
övezi. A progresszió markerének tekintheto a p16/INK4 alfa
elvesztése és a kíséro Ki- 67 növekedés, az adhéziós molekulák közül az integrin ? ? ??a proteázok körében a MMP-2, a motilitással kapcsolatos faktorok, a c-met receptor (167). Mindezek ellenére, a melanoma inváziójának molekuláris részletei még mindig
28
hiányosak, és a kutatómunkák egy megfeleloen érzékeny prognosztikus markerek felfedézésére irányulnak. A tumorsejt motilitása a tumor progressziójának meghatározó lépése, melyet parakrín és autokrín motilitási kémiai jelek szabályoznak (105,156). A legjobban ismert autokrín motilitási faktor napjainkban az AMF/NLK/PHI, egy 55 kD glikoprotein, amelyet rágcsáló melanomából izoláltak 1986-ban, egy kemokin receptor család tagjaként (106,122,150,179). Az AMF egy, a tumorsejt által sekretált citokin, mely befolyásolja az ot képzo sejt migrációját. Az AMF szabályozza a sejtmotilitást in vitro, valamint az inváziót és metasztázis képzodést in vivo. Az AMF stimulálja az integrin közvetítette B16a sejt adhéziót, terjedést és inváziót. Az AMF aminosav analízise magas szerin, glicin és glutaminsav tartalmat tárt fel. A tanulmányok szerint az egér és a humán AMF megfelelnek a korábban már kódolt géntermékeknek: a neuroleukinnak (NLK) és foszfohexózizomeráznak (PHI). A PHI katalizálja a glukóz 6-foszfát izomerizációját fruktóz 6-foszfáttá és mindkét cukorra specifikus. Az AMF a sejtmotilitást receptorán keresztül szabályozza. Az AMF receptor egy 78 kD sejtfelszíni glycoprotein, melyet B16-F1 melanoma sejteken határoztak meg.. AMFR elleni monoklonális antitest stimulálja a sejtmotilitást in vitro és a metasztatikus képességet in vivo, azaz hatásai az AMF-ral megegyeznek. Az AMF/AMFR rendszert számos kísérleti modellben és néhány human tumorban (epehólyag-, gatrointestinális-, nyelocsodaganat) is vizsgálták (111,125,131). A megnövekedett AMFR expresszió korrelált a recidivák számával és a túléléssel a közleményekben. Az értekezés humán primér melanomában kutatja az AMF/AMFR metasztázisképzo potenciális szerepét (CLXVIII).
29
II. Célkituzések I. Szérum S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa koncentrációk értékelése nagyszámú beteganyagon melanóma malignumban, valamennyi stádiumban 1. a: tünetmentes és tünetes betegeken valamint kontrollcsoportban b: AJCC stádiumokban c: disszeminált betegek marker koncentrációinak ér tékelése d: szervi metasztázis sal rendelkezo melanómás betegek marker értékei e: progrediáló és nem progrediáló melanómás betegek vizsgálata 2. A markerek specificitásának, szenzitivitásának vizsgálata. 3. Az S- 100B protein és az 5- S- CD prognosztikai faktor szerepének vizsgálata 4. Az S- 100B protein és az 5- S- CD közti korreláció vizsgálata 5. A túlélés vizsgálata cut off feletti és alatti marker koncentrációk függvényében 6. A markerek függetlenségének vizsgálata 7. Melanómás betegek követése, terápia monitorzás
II. A laktátdehidrogenáz szérum szintjének elemzése S- 100B proteinhez és 5-SCiszteinildopához viszonyítva melanóma malignumban 1. Az S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa és LDH általános jellemzoinek meghatározása (átlag, medián, szignifikáns különbségek) a: stádium III-ban és stádium IV- ben b: szoliter és multiplex áttétes betegeknél c: pulmonális metasztázisban d: hepatikus metasztázisban 2. Specificitás, szenzitivitás vizsgálata. 3.A LDH, S-100B protein és az 5-S-CD független prognosztikus faktor szerepének vizsgálata. 4. A LDH, S-100B protein és az 5-S- CD közti korreláció vizsgálata. 5. A túlélés vizsgálata cut off feletti és alatti marker koncentrációk esetén 6. A LDH, S-100B protein és az 5-S-CD függetlenségének vizsgálata
30
III. Szöveti S-100B expresszió és szérum S-100B protein koncentráció összehasonlító vizsgálata melanoma malignumban 1. Szérum S-100B koncentráció mérése az egyes stádiumokban 2. Szöveti S-100B protein expresszió meghatározása 3. Szöveti S-100B protein intenzitás vizsgálata
IV. Az autokrín motilitási faktor receptor expresszió analízise primér melanomában 1. Az AMFR expresszió a tumorvastagság függvényében 2. Az AMFR expresszió a szövettani típus tükrében
31
III. Anyag és módszer 1. S- 100B protein meghatározás
Az
S- 100B
protein
laboratóriumában
méréseket
muködo
az
Országos
tumormarker
Onkológiai
laboratórium
Intézet
végezte
központi
monoklonális
lumineszcens immunesszével. A LIA-mat Sangtec-100 esszé megkülönbözteti az alfa1 és
beta alegységet, az utóbbi mérésére alkalmas. Szolid fázisként monoklonalis
antitesttel (SMST 12, SMSK 25 és SMSK 28) fedett polisztiren csövek szolgálnak. Az elso inkubáció alatt a beteg szérumában lévo S-100B reagál az antitesttel. A kötetlen anyagot egy mosási lépés kapcsán eltávolítják. A második inkubáció során a hozzáadott jelzett antitest reagál az immobilizált S-100B proteinnel. A cso falához megkötött jelzett antitest-S-100B protein komplexet fényreakcióval értékelik. A fényintenzitás arányos a mintában lévo S-100B protein mennyiségével. A normálérték az irodalmi adatoknak megfeleloen 0,01-0,12 µg/l között változott.
2. 5-S-Ciszteinildopa mérés
A szérum 5-S-Ciszteinildopa meghatározás az Országos Onkológiai Intézet Biokémiai Osztályán készült. A mérésekhez Merck Hitachi gyártmányú nagynyomású folyadékkromatográfot (L- 6200A típusú Intelligens Pumpát, D-2500 Chromatointegratort, AS 2000A Autosamplert és LaChrom 3500A típusú amperometrikus detektort)
használtak.
A
szérum
5-S-Ciszteinildopa
tartalmát
megfelelo
mintaelokészítési lépéseket (szilárd fázisú extrakció, stb.) követoen Supelcosil LC-18 (25 cm x 4.6 mm, ???? fordított fázisú oszlopon választották el 35 C-on. Az áramló fázis (pH=2,2) 10 g/l foszforsavat, 0,1 mmol/l Na2 EDTA-t valamint ionpárképzo reagensként 7 g/l metánszulfonsavat tartalmazott. Az alkalmazott áramlási sebesség 0,7 ml/perc volt. A kiértékeléshez 5-S-CD standarddal felvett kalibrációs görbét (belso standardként alfa metildopát alkalmazva) használtak. A normálérték az irodalmi adatokkal összhangban 1 - 10 nmol/l között mozgott.
32
Mindkét markervizsgálat minden alkalommal azonos körülmények között készült. A mintákat mínusz 20o C-on tárolták. Az értékelést a mintavétel után két hónapon belül, a klinikai adatok ismerete nélkül végezték.
3. LDH vizsgálat
Az LDH vizsgálatokat az Országos Onkológiai Intézet Központi Laboratóriuma végezte, optimalizált UV kinetikus módszerrel. Lényege: Piruvat + NADH + H* ??Laktát + NAD Raegensek:1. piruvat 0,6 mmol/l, tris 50 mmol/l, 2. NADH 0,18 mmol/l 7,5-ös pH- nál. A vizsgálat menete: Összekeverünk 5 térfogatrész reagens 1-et egy térfogatrész reagens 2-vel, valamint a hemolízismentes szérummal. Az adszorbanciát 30 másodperc majd 1, 2, és 3 perc után olvassuk le. Normálérték felnotteknél 37 C-on 240-460 U/L.
4. S- 100B protein expresszió szöveti vizsgálata
A primér tumor és nyirokcsomó áttét mintákat a szövettani vizsgálatra való elokészítéshez formalinban fixálták és paraffinba ágyazták. Az S-100B meghatározás DAKO monoklonalis S-100B ellenes antitesttel történt. Az antitest- S-100B potein kötodést egy órás inkubálás után jelzett streptovidin- biotin komplexxel detektálták (DAKO, LSAB2 HRP rendszer). Az enzim komplexet EAC (vörös) chromogénnel hívták elo. A metszeteket két patológus vizsgálta, egymástól függetlenül, a klinikai adatok ismerete nélkül. A reakciók értékelésénél a következo kritériumokat alkalmaztuk: D: Diffúz pozitív reakció az egész lézióban H: heterogén, azaz jól kifejezett pozitív/negatív festodés a tumor különbözo részein F: fokális reakció, csak néhány tumorsejt festodik (2. ábra). A festodés intenzitását szemikvantitatív módszerrel értékelve magas (+++), közepes (++) és alacsony (+) intenzitás típust határoztunk meg.
33
2.ábra. S -100 protein expresszió.
A
B
C
34
5. AMFR szöveti kimutatása
A vizsgálathoz izopentánban és folyékony nitrogénben fagyasztott friss tumorszövetet használtunk. A fagyasztott metszeteket –20 C-on acetonban fixálták, PBS -sel mosták és 1:2 arányban PBS -ben oldott nem immunizált kecskeszérummal blokkolták. Az AMF receptort nyúlban termelt antitesttel detektálták (1:50, 1 óra), melyet 3x5 percig tartó PBS -ben történo mosás követett.
Azután biotinnal konjugált anti nyúl IgG -t
alkalmaztak. A második mosási lépés után a biotin conjugátumot Streptavidin-FITC (1:100, 30 perc)-vel határozták meg. A negatív kontrollokban a pimér antitestet kihagyták. A metszeteket MRC-1024 konfokális mikroszkóppal vizsgáltuk. A reakció típusát három csoportba osztottuk. Az alacsony AMFR expressziójú daganatok elsosorban AMFR negatív tumorsejt populációt tartalmaztak, és elszórtan gyengén pozitív sejteket. A heterogén típusú tumorokban negatív és erosen pozitív tumorsejtek egyenlo arányban fordultak elo. A harmadik csoportot az eros és diffúz gp78 expresszáló tumorok alkották. 6. Beteganyag 1. Az Országos Onkológiai Intézet Borgyógyászati Osztályán melanoma malignummal kezelt betegek körében 1996. júniusától 2000. decemberéig folyamatosan végeztük a markervizsgálatokat. A vizsgálatba bevont betegek körében ismételt mérések is készültek, számosat folyamatosan, néhányukat 2001. júniusáig monitoroztuk. Az értékelést két hónappal késobb végeztük. Összesen 475 betegnél (férfi: 257 no: 218 Stádium I: 22, Stádium II: 158, Stádium III: 135, stádium IV: 160) készült párhuzamosan S-100B protein és 5- S-CD meghatározás (1. táblázat).
Betegszám KOR Átlag Medián Minimum Maximum NEM Férfi No
Stádium I 22
Stádium II Stádium III Stádium IV 158 135 160
52 50,2 27,7 82
61,2 60,4 18,2 88,5
57,1 61,4 21,9 89,2
57,2 61,8 23,0 87,8
10 12
79 79
67 68
77 83
1. táblázat. A demográfiai adatai.
betegek
35
Az értékelés kapcsán a stádiumbeosztásnál az AJCC stádiumokat használtuk. Stádium Ibe a primér tumoros betegek tartoztak, 1,49 mm-nél kisebb Breslow vastagsággal. Stádium II-be soroltuk szintén a primér tumoros betegeket, ha a Breslow érték a 1,5 mm- t meghaladta (32,39). A stádium III tartalmazta a lokális recidívát, in tranzit és régionális nyirokcsomó metasztázist. A stádium IV-be a disszeminált betegek kerültek (6). A vérvételek I-es, II-es és III-as stádiumban lehetoség szerint a sebészi terápia elott történtek. A melanoma diagnózisát szövettani vizsgálattal, a metasztázist képalkotó vizsgálatokkal (mellkas rtg, hasi UH, MR, CT, csontscintigraphia) igazoltuk (32,102). A szövettani típus alapján a primer tumoros betegek között 7 lentigo maligna melanomát, 78 szuperfíciálisan terjedo, 47 nodularis és 2 akrolentiginózus melanomát észleltünk. Negyvenhat esetben a szövettani típus meghatározására nem volt lehetoség, mert a mutétet más intézményben végezték. A vizsgálat során az átlag/medián követési ido: 24/15,5 hónap volt. A disszeminált betegek körében a vérvételkor 43 pulmonális, 29 hepatikus, 13 cután, 7 cerebrális, 19 extraregionális nyirokcsomó, 2 osszeális, és egyéb áttétet diagnosztizáltunk. Összesen 39- en szenvedtek multiplex többszervi szervi áttéttol és nyolcukat tünetmentesnek találtunk.
Betegszám
Progrediáló betegek követése Stádium II 158
Stádium III 135
Progresszió helye a betegkövetés során Loc. rec., in transit met. 4 3 Regionális nyirokcsomó áttét 24 6(loc. rec) Tüdo 5 13 Máj 3 11 Bor 1 7 Agy 1 6 Csont 1 3 Nyirokcsomó 2 2 Több szerv 1 29 Egyéb 0 1 Összesen 42 71 Progresszió ideje (hónap) Átlag 32,4 25,9 Medián 26 19.3
2. táblázat. A vizsgálatba való bevonáskor stádium II-III-ban szenvedo betegek követése kapcsán kialakult áttétek helye és a metasztázis képzodés átlag/medián ideje hónapokban.
36
A betegeket stádiumuktól függoen egy-négyhavonta ellenoriztük, az osztályos protokollnak megfeleloen, fizikális és/vagy képalkotó vizsgálatokkal. A megfigyelési ido alatt stádium II- III-ban 113 betegnél észleltünk progressziót: in transit, regionális nyirokcsomó metasztázis, pulmonális, hepatikus, agyi, osszeális, távoli nyirokcsomó, bor vagy egyéb, szokatlan lokalizációjú metasztázist (2. táblázat). Stádium IV-ben 145 esetben a betegség rosszabbodott. Betegeink közül 197-et veszítettünk el. A vizsgálat végén 218-an voltak tünetmentesek, azaz a melanoma vonatkozásában fizikális és eszközös vizsgálatokkal tumort nem tudtunk kimutatni. (3. táblázat). 3. táblázat. A 475 beteg Betegszám Progresszió Exitus Tünetes Tünetmentes kórlefolyásának Stádium I 22 0 0 0 22 legfontosabb jellemzoi. A Stádium II 158 42 23 9 126 betegkövetés kapcsán Stádium III 135 71 56 24 55 észlelt progressziók Stádium IV 160 145 118 27 15 száma, az exitusok száma, valamint a vizsgálat végén tünetmentes (azaz fizikális és eszközös vizsgálattal melanómára utaló jel nem kimutatható) és tünetes melanómás betegek száma az egyes stádiumokban.
Az átlag/medián túlélés stádium II- ben 46,40/30,40, stádium III-ban 34,78/14,23, stádium IV-ben 16,82/7,46 hónapnak bizonyult (3.ábra). 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 Stádium II
0.1
Stádium III 0.0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Stádium IV
Idõ (nap)
3. ábra Kaplan -Meier túlélési görbe stádium II-III-IV-ben melanóma malignumban. Egyes stádiumban valamennyi beteg életben volt a vizsgálat lezárásakor. A többi stádium túlélése egymástól szignifikánsan különbözött (Cox-Mantel vizsgálat, p<0,05).
37
Összesen 160 betegnél (stádium I: 2, stádium II: 76, stádium III: 82) a kezelés megkezdése után sorozatvizsgálat készült.
2. Az S- 100B protein és 5-S-CD meghatározással párhuzamosan 183 betegnél LDH mérést (Stádium III: 35, Stádium IV: 148, férfi: 89 no: 94) is végeztünk. A szérum S-100B proteint és 5-S-CD-t valamint az elobbi két markert és a LDH-t összehasonlító vizsgálatokban a kontrollcsoportot hatvanhárom beteg (13 egészséges és 50 egyéb borbetegségben szenvedo) alkotta.
A végleges értékelésnél nem vettük figyelembe azoknak a betegeknek az adatait, akik a kiértékelésnél nem voltak elérhetoek, nem jelentek meg kontrollvizsgálatokon vagy korábban, más betegségben meghaltak. Nem vontuk be az értékelésbe a primér nyálkahártya és uvea melanomás betegeket. Ugyancsak melloztük az exitus elott két hónapon belül meghatározott, sokszor extrém magas adatokat, mivel alapvetoen befolyásolták volna a levonható következtetéseket. Az S-100B protein és 5-S-CD eredményeket általában a vizsgálat után több héttel kaptuk meg, az értékelés retrospektíven készült.
A betegeket I-II-es stádiumban általában immunterápiával (interferon alfa-2) kezeltük. Blokkdisszekció után, azaz hármas stádiumban monokemoterápiát (DTIC) vagy kemoimmunterápiát alkalmaztunk. Távoli disszemináció esetén DTIC kezelést vagy kombinált kemoterápiát vezettünk be. Leggyakrabban bleomycin-vincristin-lomustinedacarbazine vagy cisplatin-BICNU-dacarbazine-tamoxifen kombinációt adtunk, négy vagy hathetente.
3. A tanulmány harmadik részében 1997. január és 1999. júliusa között 59 korai stádiumú (Stádium I -II-III) beteg preoperatív szérum S-100B koncentrációit hasonlítottunk össze a primer tumorban és nyirokcsomó metasztázisban észlelheto S100B expressszióval. A betegeket a szokásos módon AJCC stádiumba soroltuk, stádium I-II-ben 37, stádium III-ban 22 beteget vizsgálva. A betegek átlagéletkora 57 év (23-82) volt. A klinikai állapot értékelését minden betegnél a diagnózis szövettani igazolása
38
után 14 hónappal végeztük. A betegek részletes adatait, a primér tumorok szövettani típusát, a klinikai állapotot a megfigyelési ido végén a 4. táblázat tartalmazza. 4. Az értekezés negyedik részében 54 sebészileg eltávolított primér melanomát vizsgáltunk (no: 31, férfi 26, életkor: 40-85 év, SSM: 35, LM: 1, NM: 18) az immunhisztokémiai AMFR expresszió szempontjából.
39
40
7. Statisztikai analízis
Az adatokat Microsoft-Excel programban rögzítettük. A markerek átlagkoncentrációi közötti szignifikancia vizsgálatokat (két minta középértékének összehasonlítása) MannWhitney teszttel végeztük. Szignifikánsnak tartottuk a különbséget p<0,05 esetében, azaz 95% szignifikancia szintet választottunk. Az átlag és medián értékeket box-plot ábrákon illetve oszlopdiagramokon jelenítettük meg, a SE-t (az átlag hibáját) is feltüntetve). A túlélést Kaplan-Meier túlélési függvényekkel ábrázoltuk. A görbék közti eltéréseket (szignifikancia) Mantel-Cox teszttel vizsgáltuk. Az egyes markerek független prognosztikai faktor szerepének megállapítására Cox többváltozós regressziós analízist végeztünk. A markerek közötti korreláció vizsgálatára Spearman log rank korrelációs próbát kiviteleztünk. Az eredményeket scatterplot ábrákon mutattuk be. A markerek függetlenségének vizsgálatára chi négyzet próbát alkalmaztunk. A felhasznált statisztikai programok: BMDP statistical software.inc., az ábrák Excel és StatSoft.inc. programban készültek. A s zenzitivitás , s pec if ic itás, pozití v és negatí v pr ediktív érték s zámí tás ának alapjául s zolgáló képletek:
Szenzitivitás
valódi pozitív - -- - --- - -- -- - --- - -- -- - --- - -- -- - -valódi pozitív + álnegatív
Specif icitás
valódi negat ív - --- - -- -- - --- - -- -- - --- - -- -- - --- - -- x 100 valódi negatí v + álpozitív
P ozitív predik tív index
Negatív prediktív i ndex
x 100
valódi pozitív - - -- -- - --- - -- -- - --- - -- -- - --- - -- -- - x 100 valódi pozitív + álpozitív valódi negatív - -- --- --- - -- --- --- - -- --- --- - -- --- -- x 100 valódi negatív + fals negatív
41
Tünetes beteg cut off feletti értékét valódi pozitívnak, a küszöbkoncentráció alattit fals negatívnak tartottam. Tünetmentes betegnek a cut off felett fals pozitivitást, alatta valódi negativitást állapítottam meg. A tünetmentes és tünetes elnevezés a markervizsgálatok idopontjára vonatkozik. Tünetmentesnek (a melanóma szempontjából fizikális és eszközös vizsgálattal tumor nem kimutatható) tartottam a betegeket a primer tumor, regionális nyirokcsomó metasztázis eltávolítása után, egyéb kemoterápiával vagy irradiációval sikeresen kezelt áttét esetén (in transit metasztázis, bor, pulmonális, cerebrális metasztázis), amennyiben két hónapon belül progresszió nem alakult ki. Primér tumor és nyirokcsomó metasztázis mutéti megoldása után a vérvételek 1-3 héten belül történtek. A tünetes betegeknél a marker vizsgálat klinikai vagy eszközös vizsgálattal kimutatott primer tumor, regionális nyirokcsomó metasztázis, szoliter vagy multiplex áttét esetében készült. A fals negatív és fals pozitív esetek újravizsgálatára nem volt lehetoség, mivel a markervizsgálatok eredményeit általában hetekkel késobb kaptuk meg, valamint az értékelés, tehát a markervizsgálatok eredményeinek és a betegek állapotának összehasonlítása a vizsgálat retrospektív jellegébol adódóan hónapokkal késobb készült.
42
IV. Eredmények I. A szérum S- 100B protein és 5-S-Ciszteinildopa koncentrációk összehasonlító vizsgálata melanóma malignumban
1. Az S-100B protein és 5-S- Ciszteinildopa szérum szintjének értékelése
Az 1996. júniusa és 2000. decembere között 475 melanomás betegnél készült párhuzamosan S-100B protein és 5-S-CD meghatározás szérumból. Az elemzés során betegeinket meghatározott szempontok alapján csoportokba soroltuk.
A. S-100B protein
és 5-S-Ciszteinildopa
szérum szintjének értékelése a
kontrollcsoportban, tünetes és tünetmentes melanómás betegekben Kontrollcsoport vizsgálata A kontrollcsoportot alkotó 63 multiplex nevusos és egyéb borbetegségben vagy nem melanoma típusú borrákban szenvedo beteg átlag/medián 5-S-CD értéke: 11,54/9,22 nmol/l. Fals pozitív esetek száma: 12 (19%). Ebben a csoportban az S-100B protein átlag/medián koncentrációja: 0,05/0,03 ? g/l. Fals pozitív eredményt 2 (3,1%) betegnél kaptunk. A kontrollcsoportban a nyári (áprilistól-szeptember végéig: 35 eset) és téli (októbertol március végéig: 28 eset) átlag értékek között sem 5-S-CD sem S-100B protein esetében nem találtunk szignifikáns különbséget. Azonban a nyári fals pozitív esetek száma 8/35 (22,8%) közel a kétszerese volt a téliekének 5-S-CD-nél 4/28 (14,2%).
Tünetmentes és tünetes betegek melanómás betegek vizsgálata Tünetmentes (a melanóma fizikális és eszközös vizsgálattal nem mutatható ki) a beteg a primer
tumor,
regionális
nyirokcsomó
metasztázis
eltávolítása
után,
egyéb
kemoterápiával vagy irradiációval sikeresen kezelt áttét esetén (in transit metasztázis, bor, pulmonális, cerebrális metasztázis), amennyiben két hónapon belül progresszió nem alakult ki. Tünetes betegnél a marker vizsgálat klinikai vagy eszközös vizsgálattal kimutatott primer tumor, regionális nyirokcsomó metasztázis, szoliter vagy multiplex áttét esetében készült.
43
A tünetmentes csoportban a 124 beteg S-100B protein átlag/medián értéke 0,08/0,05 (szórás: 0,01-0,09) ? g/l, az 5-S-CD esetében 13,27/8,09 (szórás: 0,74-105,45) nmol/l volt. A tünetes csoport a 351 betegének S-100B protein átlag/medián értékét 0,64/0,11 (0,01-23,00) ?g/l-nek, az 5-S-CD-ét 37,91/10,53 (0,14-971,20) nmol/l -nek találtuk. A különbség mindkét markernél szignifikáns (p<0,05) a tünetmentes és tünetes csoport
S-100B protein ug/l
között. 4-5. ábra.
Átlag Szórás 2.5 Kontroll 0.05 0.049 Tünetmentes 0.09 0.07 2 Tünetes 0.64 0.78 1.5 Stádium II p<0,05 0.09 0.061 0.29 0.288 1Stádium III Stádium IV 1.09 1.224 0.5
4. ábra. S -100B p rotein átlagkoncentrációk (és SE) a kontrollcsoportban, tünetmentes és tünetes valamint stádium II-III-IV melanómás betegek esetében.
5-S-CD nmol/l
Kontroll 160 Tünetmentes 140 Tünetes 120 Stádium IV
IV Stá diu m
III
II
Stá diu m
Stá diu m
Tü ne tes
Tü ne tm en tes
Ko ntr oll
0
átlag SE 11.45 5.67 13.27 7.97 37.97 41.33 p<0,05 67.47 76.48
5 ábra. 5-S-CD protein átlagkoncentrációk (és SE) a kontrollcsoportban, tünetmentes és tünetes valamint stádium IV melanómás betegek esetében.
100 80 60 40 20 0 Kontroll
Tünetmentes
Tünetes
Stádium IV
Stádiumokra lebontva azonban, ez a szignifikancia az alacsonyabb tumortömeggel bíró I-II-es stádiumban még nem észlelheto. Stádium III-ban S-100B protein esetében a két csoport közti eltérés (39 tünetmentes, 96 tünetes beteg) már megjelenik, míg IV-es
44
stádiumban mindkét markernél erosen szignifikánsak az eredmények, p<0,001 (5. táblázat).
Betegszám Átlag Medián Szórás
Tünetmentes Tünetes S-100B 5-S-CD S-100B 5-S-CD Stádium III 39 96 0,095* 11,79 0,321* 14,50 0,05 7,26 0,098 10,18 0,01-0,927 0,74-60,10 0,01-5,00 0,63-102,82 Stádium IV
Betegszám Átlag Medián Szórás
8 0,05* 0,04 0,01-0,105
8,58** 7,74 6,06-12,87
152 1,087* 65,47** 0,232 13,97 0,01-12,86 0,14-971,2
5. táblázat. Tünetmentes és tünetes melanómás betegek S -100B protein és 5 -S-Ciszteinildopa koncentrációja stádium III-IV-ben. A különbség a tünetes és tünetmentes betegekben meghatározott markerek átlagkoncentrációi között stádium III-ban S-100B protein esetében (*gal jelöltem) már kimutatható.
A tünetmentes betegcsoportban a normálértékektol való eltérés, azaz fals pozitivitás S100B proteinnél 12 (9,6%), 5-S-CD- nél 34 (27,4%) esetben fordult elo. A tünetes betegcsoportban az értékek az átlagnál jóval magasabbak. Ugyanakkor ebben a csoportban is található nor mál marker szinttel (fals negatív) bíró beteg. S-100B proteinnél 228 (64,9%) esetben, 5-S-CD-nél 234 (66,6%) betegnél észleltünk cut off alatti eredményt. Megvizsgáltunk a tünetmentes betegek nyári-téli átlagértékeit mindkét marker esetében. Az 5-SCD-nél a nyári vizsgálatok (75 beteg) átlagkoncentrációi szignifikánsan különböztek a téliekétol (49 eset). Nyáron a fals pozitív esetek száma 23/75 (30,6%), míg télen 6/49 (12,2%)-nak bizonyult (6-7. ábra). S100B protein, ug/l
Box Whisker Plot
0.28
0.22
6. ábra. S-100B protein átlagértékek télen-nyáron a kontrollcsoportban, a tünetmentes és tünetes melanómás betegeknél. Szigni fikáns különbséget a csoportok között nem észleltünk.
0.16
0.10
0.04
-0.02
-0.08 S-100B k nyár
S-100B k tél
S-100B tm nyár
S-100B tm tél
Átlag+SD Átlag-SD Átlag+SE Átlag-SE Átlag
45
7. ábra. 5- SCiszteinildopa átlagértékek télennyáron a kontrollcsoportban, a tünetmentes és tünetes melanómás betegeknél. 5-SCiszteinildopánál a tünetmentes begek nyári-téli átlag koncentrációi egymástól szignifikánsan eltértek.
Box Whisker Plot
5-S-CD, nmol/l 32
26
20
14
8 Átlag+SD Átlag-SD
2
Átlag+SE Átlag-SE
-4 5-SCD k nyár
5-SCD k tél
5-SCD tm nyár
Átlag
5-SCD tm tél
Érdekes és váratlan részeredmény, hogy a marker vizsgálat idopontjában tünetmentes betegek átlag/medián túlélése (45,37/34,15 hónap) erosen szignifikánsan különbözött tünetes társaikétól (28,77/23,33 hónap) 8. ábra. Ez a tény leginkább azzal magyarázható, hogy a tünetes betegek közel 70%-a (Stádium III: 92/351, stádium IV: 152/351) a vizsgálat kezdetekor már nyirokcsomó- illetve távoli áttétben szenvedett.
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2
0
200
400
600
800
1000
Idõ (napok)
1200
1400
1600
1800
tünetmentes tünetes
8. ábra. A markervizsgálat idopontjában tünetmentes és tünetes melanómás betegek túlélése (Kaplan-Meier görbe). A görbék között a különbség Cox Mantel vizsgálattal szignifikáns. p<0,05
46
B. AJCC stádiumokba sorolt betegek marker koncentrációinak elemzése. Részletesen elemeztük az egyes stádiumokba tartozó betegek S-100B protein és 5-SCiszteinildopa átlag-medián koncentrációjának egymáshoz való viszonyát. A mérési eredmények megoszlását a 9-10. ábra mutatja. Scatterplot 14 12
9. ábra. Szérum S 100B protein koncentrációk megoszlása stádium I-II-III-IV-ben. Jelentos szórás látható a mérési eredményekben.
S-100B (ug/l)
10 8 6 4 2 0 -2 I
II
III
IV
Stádium
Scatterplot 1100
900
5-SCD (nmo/l)
700
500
300
100
-100 I
II
III Stádium
A kapott eredmények a következok:
IV
10. ábra. Szérum 5S-Ciszteinildopa koncentrációk megoszlása stádium I-II-III-IV-ben. Az adatok jelentos szórást mutatna, a magas értékek stádium IV-re jellemmzoek..
47
I-es stádium: 22 betegnél az S- 100B protein átlag/medián érték 0,10/0,04 (0,01-0,07) ? g/l, valamint 5-S-CD-nél 13,14/9,96 (1,50-39,41) nmol/l. II- es stádium: 158 beteg, az átlag/medián érték S- 100B proteinnél 0,09/0,06 (0,010,083) ? g/l és 5-S-CD-nél 11,95/8,15 (0,34-105,45) nmol/l. III-as stádium: 135 beteg, átlag/medián érték S-100B proteinnél 0,62/0,09 (0,01-5,05) ? g/l és 5-S-CD-nél 14,67/9,60 (0,63-102,83) nmol/l. IV-es stádium: 160 beteg, átlag/medián érték S-100B proteinnél 1,10/0,20 (0,01-12,84) ? g/l és 5-S-CD-nél 68/13 (0,10-971) nmol/l.
Szignifikáns különbséget észleltünk az átlag szérum koncentrációk között mindkét tumormarker esetében a következo csoportokban: Stádium II és stádium IV között Stádium III és IV között S-100B proteinnél az I-II -es stádium is szignifikánsan eltért a III-as és a IV-es
S-100B protein ug/l
stádiumtól (11- 12. ábra).
átlag medián átl.elt. 2.5 Stádium I 0.1 0.04 0.078 0.09 0.09 0.061 2Stádium II Stádiump<0,05 III 0.29 0.09 0.288 1.09 0.218 1.224 1.5Stádium IV 1 0.5 0 Stádium I
Stádium II átlag
Stádium III medián
Stádium IV
11. ábra. S-100B protein átlagmedián koncentrációk (és SE) stádium I-IIIII-IV-ben. A nyilak szignifikáns különbségeket jeleznek az egyes stádiumok között, p<0,05.
A kontrollcsoport átlagértékei S-100B protein esetében szignifikánsan különböztek a stádium II-III-IV-es és a tünetes, míg 5- S-CD-nél csak a IV-es stádiumú betegek marker koncentrációitól. (4-5. ábra)
48
átlag Stádium I 160.00
5-S-CD nmol/l
Stádium II 140.00 Stádium III Stádium IV
120.00 100.00
12.85 11.91 14.2 67.47
medián átl.elt 9.77 6.97 p<0,05 8.93 6.78 9.47 8.52 12.6 76.48
80.00 60.00 40.00 20.00 0.00 Stádium I
Stádium II átlag
Stádium III
Stádium IV
medián
12. ábra. 5-SCiszteinildopa álag-medián koncentrációk(és SE) stádium I-IIIII-IV-ben. A nyilak szignifikáns különbségeket jeleznek az egyes stádiumok között, p<0,05.
C. Disszeminált betegek marker koncentrációinak értékelése
Részletesen megvizsgáltam a tumormarkerek szérum szintjeit a disszeminált tünetes melanómás betegek esetében. C/1. Szoliter metasztázis esetén (38 beteg) az S-100B protein átlag/medián 0,51/0,11 (0,01-5,18) ? g/l-nek, az 5-S-CD 19,99/10,24 (0,14-194) nmol/l-nak bizonyult. C/2. Multiplex távoli disszemináció esetén (114 beteg) az átlag/mediánt S-100B proteinnél 1,4/0,38 (0,01-12,9) ? g/l-nek 5-S-CD-nél 88,73/21,9 (0,16-971,2) nmol/l- nek mértük. Szignifikáns volt a különbség a szoliter és multiplex szervi metasztázisos betegek között mindkét markernél (p<0,05).
D. Szervi metasztázissal rendelkezo melanómás betegek marker értékei
D/1. Pulmonális metasztázisban (44 beteg) az átlag/medián S-100B proteinnél 0,66/0,19 (0,01-5,70) ? g/l, 5-S-CD-nél 26,47/11,06 (0,14-216,2) nmol/l- nek bizonyult. A szoliter pulmonális metasztázis 20 betegének S-100B protein 0,31/0,15 (0,01-2,04) ? g/l volt az átlag-medián értéke, 5-S-CD-nél 11,68/9,36 (0,14-42,30) nmol/l.
49
Multiplex pulmonális metasztázisos 24 betegnél az S-100B proteint 0,96/0,23 (0,035,70)? g/l, az 5-S-CD-t 38,55/19,15 (5,38-216,20) nmol/l-nek mértük. A tüdoben kialakult szoliter és multiplex áttéttel rendelkezo betegeknél a két csoport közti különbség mindkét markernél szignifikáns volt (p< 0,05).
D/2. Hepatikus metasztázisban (29 beteg, 26 többszörös áttét, 3 esetben szoliter metasztázis) az S-100B protein átlagértéke 0,85/0,22 (0,01-5,18) ?g/l-nek az 5-S-CD-é 108,40/32,13 (2,00-705,05) nmol/l-nek mutatkozott. A kevés számú szoliter metasztázisos beteg adatai nem befolyásolták jelentosen a multiplex áttétes betegek eredményeit. Multiplex áttét esetén S-100B protein 0,71/0,26 (0,03-3,58) ? g/l, 5-S-CD 118,72/33,79 (3,06-705,05) nmol/l. 5-S-CD-nél a pulmonális (44 beteg) és hepatikus (29 beteg) áttétes betegek átlagos marker koncentrációi egymástól szignifikánsan eltértek, míg S- 100B proteinnél ugyanezt nem észleltük.
D/3. Célul tuztük ki a szoliter agyi metasztázisos betegek vizsgálatát is, tekintettel arra, hogy az S- 100B protein változása az idegrendszer számos más megbetegedésében kórjelzo. 10 betegnél készült markervizsgálat. Mind S-100 protein, mind 5-S-CD esetében két betegnél észleltünk a normálisnál emelkedettebb értéket, ok a vizsgálatot követoen 4 hónapon belül elhaláloztak. A többiek marker értékei, valamint valamennyi LDH eredmény a normál határokon belül mozgott. A kis betegszám ellenére meghatároztuk az átlag /medián értékeket. S- 100B protein: 0,20/0,05(0,01-0,90) ?g/l 5S-CD: 16,94/10,51 (5,46-50,88) nmol/l. Agyi metasztázis esetében az átlag/medián túlélés 10,3/8,0 hónapnak bizonyult.
Összefoglalva: Disszeminált melanómában
a szoliter és multiplex áttétes betegek
átlagos marker koncentrációi szervektol függetlenül különböztek egymástól. A részletesebb elemzés során pulmonális metasztázisban a szoliter és multiplex áttétes betegek markerkoncentrációi között hasonlóan szignifikáns különbséget kalkuláltunk. Az
5-S-Ciszteinildopa
átlagos
markerkoncentrációk
hepatikus
szignifikánsan magasabbak a pulmonális áttéténél. 6. táblázat
metasztázisban
50
Metasztázis lokalizációja
S-100B protein átlag medián 0,51* 0,11 1,04* 0,38 0,66 0,19 0,31** 0,15 0,96** 0,23 0,85 0,22 0,71 0,26
Szoliter (összes) Multiplex (összes) Tüdo (összes) Tüdo (szoliter) Tüdo (multiplex) Máj (összes) Máj (multiplex)
5-S-Ciszteinildopa átlag medián 19,99* 10,24 88,73* 21,9 26,47*** 11,06 11,68** 9,36 38,55** 19,15 108,40*** 32,13 118,72 33,79
6. táblázat. S-100B protein és 5 -S-Ciszteinildopa átlag/medián koncentrációk disszeminált betegek esetében, szoliter illetve multiplex áttét kapcsán. A * szignifikáns eltérést jelez az egyes S-100B protein és 5 -S-Ciszteinildopa átlagkoncentrációk között.
E. Progrediáló és nem progrediáló melanómás betegek vizsgálata A megfigyelési ido alatt (2001. augusztusáig) progrediáló (lokális recidíva,
új
metasztázis megjelenése) 258 betegnél (stádium II-III: 113, stádium IV: 145) az 5-S-CD kezdeti szérum szintjének átlag/mediánját 45,47/10,90 nmol/l-nek számítottuk. S-100B proteinnél 0,74/0,12 ? g/l-t találtunk. A progrediáló betegek marker eredményei szignifikánsan S-100B protein ug/l
átlag 2 nemprogr. progr. 1.5
SE 0.18 0.743 p<0,05
medián SE 0.17 0.06 0.88 0.121
különböztek progrediáló
a
nem 217
beteg 5-S-CD és S-
1
100B
0.5
protein
koncentrációitól:
0 nemprogr. átlag
progr.
12,31/8,41 nmol/l és 0,18/0,06 ? g/l. 13-14.
medián
ábra.
5-S-CD nmol/l
13.ábra. S-100B protein átlag/medián koncentrációk (és SE) a progrediáló és nem progrediáló betegeknél. Szignifikáns különbség észlelheto a két csoport között.
120nemprogr. 100progr.
átlag
medián SE 12.28 8.4 6.97 45.48 10.9 50.72 p<0,05
80 60 40 20 0 nemprogr.
progr. átlag
medián
14. ábra. 5 -SCiszteinildopa átlag/medián koncentrációk ( és SE) a progrediáló és nem progrediáló betegeknél. Szignifikáns különbség (p<0,05) észlelheto a két csoport között.
51
2. A vizsgált markerek specificitásának, szenzitivitásának értékelése
Az eredményeket a valódi pozitív-negatív, fals pozitív-negatív betegszámok alapján kalkuláltuk. A stádiumokra lebontott értékeket a 7. táblázat tartalmazza. Disszeminált betegeknél a valódi pozitív esetek száma magasabb, míg a fals pozitívaké kevesebb.
Stádium IV-ben az S-100B protein kiemelkedik a 100%-os specificitással és pozitív prediktív értékkel, míg szenzitivitása csak közepesnek bizonyult. Az 5-S- Ciszteinildopa szenzitivitása, specificitása körülbelül 10%-kal alacsonyabb, míg pozitív prediktív értéke megközelíti az S-100B proteint.
3. Az S-100B protein és az 5-S-CD prognosztikai illetve rizikófaktor szerepének vizsgálata
Az elemzés során a kor, a nem, a stádium, a primér tumor lokalizációja és Breslow szerint mért vastagsága, az 5-S-CD, az S-100B protein, és a metasztázis lokalizációjának szerepét elemeztük Cox multivariációs regressziós analízissel. A túlélés szempontjából független prognosztikus faktornak bizonyult a stádium, az S100B protein, a Breslow érték és a metasztázis lokalizációja abban a bontásban, mely megkülönböztette a szoliter áttétet a multiplextol, valamint egy további, részletesebb vizsgálatban, mely a tünetek szervek szerint i lokalizációját (primér tumor, regionális nyirokcsomó metasztázis, pulmonális, hepatikus, cutan, agyi, extraregionalis és többszervi áttét) is figyelembe vette (8. táblázat ). Az 5-S-Ciszteinildopa szérum koncentrációja nem bizonyult független prognosztikus faktornak.
52
53
54
4. Az S- 100B protein és az 5-S-CD közti korreláció vizsgálata melanómában A 475 beteget tartalmazó 5-S-CD-t és
S-100B proteint értékelo Spearmen rank
korreláció vizsgálat kapcsán az S-100B protein és 5- S-CD között korrelációt észleltünk. r = 0,3361 (15. ábra). Az értékelés során az S-100B és a tünetek lokalizációja között (primér tumor, regionális nyirokcsomó metasztázis, szoliter ill. multiplex többszörös áttét) szintén hasonló korreláció mutatkozott, r = 0,3273. p<0,05. 14.0
S-100B protein ug/l
12.0
10.0
8.0
6.0
4.0
2.0
0.0 0.00
100.00
200.00
300.00
400.00
500.00
600.00
700.00
800.00
900.00
1000.00
5-S-CD nmol/l
15. ábra. Az S-100B protein az 5-SCiszteinildopa függvényében. Szignifikáns korreláció észlelheto a markerek között. p<0,05
Tekintettel arra, hogy a IV-es stádiumban észlelt szérum koncentrációk szignifikánsan különböznek mindkét markernél a többi stádiumtól, a korrelációt csak IV-es stádiumban is megvizsgáltuk. Feltételezésemmel szemben a két marker szintje közötti korreláció ebben a csoportban sem növekedett. 5.
Melanómás
betegek
túlélésének
vizsgálata
a
marker
koncentrációk
függvényében. Mindkét marker esetében a normál tartomány felso határának másfélszeresét választottuk cut off-ként, mely S- 100B proteinnél 0,18 ? g/l, 5-S-CD-nél 15 nmol/l. a. S-100B protein A normál marker értékkel bíró 341 betegbol (Stádium I: 20, Stádium II: 145, Stádium III: 101, Stádium IV: 75) Stádium II-III-ban 87 esetben észleltünk progressziót: 3 in transit, 24 regionális nyirokcsomó, 10 pulmonális, 10 hepatikus, 5 cerebrális, 4 ossealis, 7 cutan és 11 multiplex, 13 egyéb áttét alakult ki. A 341 betegbol a megfigyelési idoszak végére 102-t elveszítettünk, de 195-en tünetmentesnek bizonyultak. Az átlag/medián túlélést 38,77/17,2 hónapnak számítottuk. Emelkedett S-100B protein esetében (134 beteg, Stádium I: 2, Stádium II: 13, Stádium III: 34, Stádium IV: 85) harminc beteg esetében alakult ki progresszió (stádium II-III-
55
ban). Egy in transit, 4 regionális, 7 pulmonális, 3 hepatikus, 4 cerebralis és 11 multiplex szervi áttétet észleltünk. Összesen 95 beteget veszítettünk el, és csak 23-an voltak tünetmentesek a vizsgálat lezárásakor. Az átlag/medián túlélés 18,87/7,6 hónapnak bizonyult. b. Az 5-S-CD A cut off érték alatt 323 beteget (Stádium I: 16, Stádium II: 127, Stádium III: 94, Stádium IV: 86) találtunk. Kilencvenkét esetben észleltünk progressziót stádium II-IIIban (6 in transit, 17 regionális, 15 pulmonális, 13 hepatikus, 6 cerebrális, 3 ossealis, 25 multiplex, 7 egyéb metasztázis). Bár összesen 118 beteget elvesztettünk, de 165-en tünetmentesek maradtak a megfigyelési ido végén. Az átlag/medián túlélés 36,15/16,43 hónapnak bizonyult. Az 5- S-CD cut off értéke feletti 152 betegnél (Stádium I: 6, Stádium II : 31, Stádium III: 42, Stádium IV: 74) 25 esetben alakult ki progresszió (9 regionális nyirokcsomó, 4 távoli nyirokcsomó, 3 hepatikus, 2 pulmonális, 5 multiplex, 2 cerebrális áttét), Összesen 79-en haltak meg, és csak 53-an maradtak tünetmentesek. A túlélés átlag/medián idejét 26,61/16,69 hónapnak számítottuk. Mindkét marker esetében Mantel- Cox vizsgálattal szignifikáns különbséget (p<0,05) észleltünk az emelkedett és normál 5-S-CD és S-100B protein értékkel bíró betegek túlélési görbéi között. Az emelkedett S-100B protein és cut off érték feletti 5-S-CD túlélési görbék között a különbség szintén szignifikáns. Magas S-100B protein szintnél a túlélés a cut off feletti 5- S-Ciszteinildopáénál rövidebbnek bizonyult (16. ábra).
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0
200
400
600
800
1000
Idõ (nap)
1200
1400
1600
1800
5SCD > 5SCD < S100 > S100 <
16. ábra. Melanómás betegek túlélése (KaplanMeier görbe) a szérum marker koncentrációk (normál és emelkedett S-100B protein és 5-SCiszteinildopa) függvényében.
56
Cut off érték S-100B proteinnél: 0,18 ug/l, 5-S-CD-nál 15 nmol/l. Amennyiben mind az S-100B protein, mind az 5-S-CD a normál határokon belül mozgott (261 beteg, Stádium I: 16, Stádium II: 115, Stádium III: 75, Stádium IV: 55), az értékelés végén 150 tünetmentes beteget találtunk és 78- an (29,8%, stádium II: 18, stádium III: 32, stádium IV: 28) haltak meg. Átlag/medián túlélés: 36,23/48,90 hónap. Együttesen emelkedett S-100B protein és 5-S-CD esetében (72 beteg, Stádium I: 2 Stádium II: 1, Stádium III: 15, Stádium IV: 54) 11 alkalommal alakult ki progresszió stádium II- III-ban. A vizsgálat végén 8-an tünetmentesek voltak, de 56-an (76,7%) már korábban meghaltak. Az átlag/medián túlélést 15,32/5,93 hónapnak kalkuláltuk (17. ábra).
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 0
200
400
600
800
Idõ (napok)
1000
1200
1400
1600
S-100> 5-S-CD> S-100,5-S-CD>
17. ábra. Túlélés a marker koncentrációk függvényében (Kaplan-Meier analízis) magas S100B protein és 5 -SCiszteinildopa valamint mindkét marker emelkedett koncentrációja esetén. Cut off érték S-100B proteinnél 0,18 ug/l, 5-S-CD-nál 15 nmol/l.
Külön értékeltük azokat az eseteket, ahol az S-100B protein és az 5-S-CD ellentétesen változott. Normál S-100B és emelkedett 5-S-CD esetében (79 beteg, Stádium I: 4 Stádium II: 30, stádium III: 26, stádium IV: 19) a megfigyelés során 23 (29,1%) beteg halt meg és 45 maradt tünetmentesek. A túlélési ido 36,66/27,97 hónapnak bizonyult. Fordított esetben emelkedett S-100B protein és normál 5-S-CD szérum szinteknél (63 beteg, stádium II: 12, stádium III: 20, stádium IV: 31) a vizsgálat végén 15-en voltak tünetmentesek, elvesztettünk viszont 41 (65%) beteget. A túlélési idot 22,26/13,18 hónapnak számítottuk.
57
Ellentétesen változó marker értékeknél szignifikáns különbséget észleltünk a túlélésben a két csoport között. A túlélés magas S-100B protein és normál 5-S-Ciszteinildopa esetén bizonyult rövidebbnek. Ez arra utal, hogy az S-100B protein emelkedése érzékenyebben jelzi a melanóma progresszióját, mint az 5-S-Ciszteinildopa.
6. S- 100B protein és 5- S-CD markerek függetlenségének vizsgálata
A markerek jelentos százalékban együtt változnak, noha a fentiekben meghatározott korreláció nem igazán eros. A mérések több mint felében mindkét marker közösen magasnak bizonyult. 9. táblázat. Az S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa független 5-S-CD marker szerepének vizsgálata <15 chi négyzet próbával. Az S -100B S-100B <0.18 261(76,5%) protein és az 5-S-Ciszteinildopa S-100B >0.18 62(46,3%) a vizsgálatok során 76,5%-ban Összes 323 együttesen alacsony, míg a mérések 53,7%-ban közösen haladják meg a cut off értéket.
5-S-CD >15 80(23,5%) 72(53,7%) 152
Összes 341 134 475
A kapott számszeru eredményeket a 9. táblázat mutatja. Chi négyzet 40,51, p<0,001
58
7. Melanómás betegek követése, terápia monitorozás szérum marker vizsgálatok segítségével. A. Betegkövetés elemzése A vizsgálat, hasonlóan a korábbiakhoz retrospektív elemzést tartalmaz. 1997. január és 2001. júliusa között 160 tünetmentes betegnél (Stádium I-II: 78, stádium III: 82 eset, no: 75, férfi: 85 beteg) végeztünk sorozatos markervizsgálatokat. S-100B protein meghatározás 1533 alkalommal, 5-S-CD mérés 1162-szer készült. Csak azokat a beteget vontuk be az értékelésbe, akiknél legalább 3 vizsgálat készült, maximum három hónap alatt. Az egy betegnél elvégzett vizsgálatok száma 3-26 között változott. Az értékelés során a kezelés esetleges hatását a marker szintekre nem vettük figyelembe. A vizsgálat elején 5-S- CD- nél 32 esetben (stádium II: 12, stádium III: 20) észleltünk cut off feletti értéket. S-100B proteinnél 31 alkalommal (stádium II: 10, stádium III: 21) mértünk emelkedett szérum szintet. 2001. augusztusig összesen 76 beteg progrediált. A progresszió idejében 5-S- CD-nél 35/76 (46%) esetben, míg S-100B proteinnél 43/76 (56,6%) betegnél észleltünk emelkedett szérum marker koncentrációt. A 10. táblázat tartalmazza a monitorozás alatt észlelt áttétek
szervek szerinti
lokalizációját. Áttét Helye In transit Reg. ny.cs.met. Tüdo Máj Bor Agy Csont Nyirokcsomó Multiplex Egyéb
Összes
Száma 5-S-CD* S-100B* Együtt* 5 0 0 0 20 7 8 6 14 6 4 3 7 4 5 3 8 1 1 1 5 0 1 0 3 0 0 0 4 2 1 2 8 1 0 1 2 1 3 0
76
22/76
23/76
10. táblázat. Monitorozott betegeknél kialakult metasztázisok lokalizációja, száma. *A metasztázis diagnózisát megelozve emelkedo markervizsgálatok száma, lokalizációja. Az S-100B protein 23, az 5 -S-Ciszteinildopa 22, mindkét marker 16 betegnél elobb emelkedik, mint ahogyan az áttétet diagnosztizáltuk.
16/76
Ugyanebben a táblázatban tüntettük fel azokat az eseteket, ahol az S-100B protein vagy az 5-S-CD vagy mindkét marker együttesen elobb emelkedett, mint ahogyan az áttétet fizikális vagy eszközös vizsgálattal kimutattuk. 29 betegnél az S-100B 23 (30,2%), az 5-S-CD 22 (28,9%) alkalommal megelozte a más módszerekkel a rutinszeru
59
kontrollvizsgálatok kapcsán felállított
diagnózist. A markerek 16 (21%) esetben
közösen változtak. A monitorzás kapcsán 42 betegnél S-100B protein esetében 88/1533 (5,7%) alkalommal, míg 5-S-CD-nél 73/1162 (6,3%) esetben cut off feletti marker koncentrációt (fals pozitivitás) észleltünk, áttétképzodés kialakulása nélkül. Az értékelés retrospektiív jellegébol adódóan nem állítható teljes biztonsággal, hogy az emelkedett markerkoncentráció elso észlelésekor elvégzett eszközös vizsgálatok nem tudták volna kimutatni az áttétet már a markerkoncentráció növekedésének kezdetén.
B. Terápia monitorozás szérum markerek segítségével
A tumormarkerek használatának rendkívül hasznos területe a kezelés hatékonyságának ellenorzése. Belsoszervi disszemináció es etén rutinszeruen eszközös vizsgálat általában 2-3 havonta történik. Ezzel szemben marker vizsgálatot akár minden héten végezhetünk. A gyakorlati alkalmazás azonban legalább 1 héten belül eredményt igényel. Mivel technikai okok miatt a markervizsgálatokat néha hónapokkal a vérvétel után kaptuk meg, és az adatokat csak a vizsgálat lezárása után dolgoztuk fel egészében, így aktív, a kezelést befolyásoló terápia monitorzást nem végezhettünk. Bemutatjuk azonban egy beteg sorozatos marker vizsgálatokkal kapott koncentrációs S100B protein és 5-S-Ciszteinildopa görbéjét, melyen látható, hogy az S-100B protein kisfokú emelkedéssel ugyan, de jelezte a regionális nyirokcsomó metasztázist és a pulmonális metasztázis diagnózisa elott is magasabb értékeket mértünk.
Az 5-S-
Ciszteinildopánál kezdetben alacsony értékeket mértünk és távoli disszemináció esetén sem követte megbízhatóan a betegség lefolyását (18.a,b. ábra). Ábrázoltam továbbá néhány pulmonális áttétes beteg összesített marker vizsgálati görbéit, azokban az esetekben, ahol ismételt vizsgálat történt (19.a,b. ábra). Az S-100B protein koncentrációk egymás közelében találhatók, azonos nagyságrendben. Ugyanakkor 5-SCiszteinildopánál számos kiugró, eltéro eredményt is kaptam.
60
61
62
II. A laktátdehidrogenáz szérum szintjének elemzése S-100B proteinhez és 5-Sciszteinildopához viszonyítva 1.a. A tanulmány második részében 183 betegnél (87 férfi, 96 no, átlag/medián életkor: 61,5/59,8 év) párhuzamosan végeztünk szérum S-100B protein, 5- S- CD, LDH meghatározásokat. Az egyes stádiumokban mért átlag és medián értékeket, szórást a 11. táblázat tartalmazza. Stádium III-ban LDH vizsgálat 35 betegnél készült, átlag/medián: 453/353 (264-1753) U/l. Stádium IV-ben LDH meghatározást 148 betegnél végeztünk, átlag/medián: 576/438 (104-3675) U/l. Az LDH mérések megoszlását a 20. ábrán látjuk. Scatterplot 4000 3500
20. ábra. LDH szérum koncentrációk stádium III-IV melanómás betegeken.
3000
LDH (U/l)
2500 2000 1500 1000 500 0 -500
III
IV Stádium
Szignifikáns különbséget észleltünk a stádium III és IV marker koncentrációk között S100B protein és LDH esetében, míg 5-S-CD vizsgálatnál a stádiumok közti különbség nem érte el a szignifikancia határát, p=0,077. 11. táblázat.
LDH (U/l) S-100B (? g/l) 5-S-CD(nmol/l)
átlag 359* 0,35** 13,91
Stádium III medián szórás 349 220-655 0,07 0,01-5,00 12,04 0,65-34,67
átlag 612* 1,41** 71,42
Stádium IV medián szórás 447 104-4585 0,27 0,01-24,49 13 0,14-825,03
11. táblázat. S-100B protein, 5-S-Ciszteinildopa és LDH átlag/medián koncentrációk 183 párhuzamosan vizsgált betegnél. Szignifikáns volt a különbség a stádium III és IV-es marker koncentrációk között S-100B protein és LDH esetében, melyet *-gal jeleztem. 5-S-CD vizsgálatnál a p=0,077.
63
b. A disszeminált betegek szervi metasztázisához kapcsolódó LDH koncentrációk elemzése során a következo eredményeket kaptuk: Szoliter metasztázis esetén 38 betegnél az átlag medián LDH koncentráció 398/386 (234-654) U/l-nek bizonyult. Multiplex távoli disszemináció esetén 114 betegnél, az átlag/mediánt LDH-nál 648/470 (104-3675) U/l-nek tapasztaltuk. c. Pulmonális metasztázisban (44 beteg) az LDH átlag/medián értéke 601/417 (1383657) U/l volt. A 20 szoliter pulmonális metasztázisos betegnél 385-386 (276-505) U/l, míg a multiplex pulmonális metasztázisos
24 betegnél 745/466 (138-3675) U/l
átlag/medián LDH koncentrációt kaptunk. d. Hepatikus metasztázisban (29 beteg, 26 többszörös áttét, 3 esetben szoliter metasztázis) az LDH átlag/medián koncentrációja 664/473 (104-1993) U/l- nek mutatkozott. A kevés számú szoliter metasztázisos beteg adatai nem befolyásolták alapvetoen a multiplex áttétes esetek eredményeit. Többszörös áttét esetén az LDH átlag/medián koncentrációja 695/517 (104-1993) U/l volt. A szoliter és multiplex szervi áttétes betegek átlagos LDH koncentrációi valamint a pulmonális szoliter és többszörös metasztázissal rendelkezo betegek LDH értékei közti különbség szignifikánsak bizonyult (p<0,05). Az LDH vizsgálatoknál a pulmonális és hepatikus áttétes betegek szérum koncentrációi között az eltérés nem szignifikáns. Az eredeti, 475 beteget tartalmazó csoportban az S-100B protein és 5-S-CD stádiumokra és szervi metasztázisokra vonatkozó számításokat már megadtam, az eredetibol származó, de kisebb beteganyagon az ugyanezen a szemponton alapuló elemzéseket még egyszer értelemszeruen már nem végeztem el. A korábbi adatok a 1112. ábrán és a 6. táblázatban láthatók.
64
2. Az LDH, S-100B protein és 5-S-CD specificitásásának, szenzitivitásának, pozitív és negatív prediktív értékének vizsgálata
Az értékelés a 475 beteg elemzésével megegyezoen készült, a valódi pozitív és negatív, valamint fals pozitív és negatív eset számok felhasználásával a megadott képletek alapján (12. táblázat). Stádium IV-ben az S-100B protein és az 5-S-Ciszteinildopa kiemelkedik a 100% specificitással, és 100% pozitív prediktív értékével, míg szenzitivitásuk csak közepes. Az LDH szenzitivitása (41,6%) az 5- S- Ciszteinildopáéval közel azonos (45,6%). Valódi pozitív Fals negatív Valódi negatív LDH Stádium III Stádium IV Stádium III-IV S-100B Stádium III Stádium IV Stádium III-IV 5-S-CD Stádium III Stádium IV Stádium III-IV LDH Stádium III Stádium IV Stádium III-IV S-100B Stádium III Stádium IV Stádium III-IV 5-S-CD Stádium III Stádium IV Stádium III-IV
Fals pozitív
5 65 70
22 76 98
7 5 12
1 2 3
8 83 91
19 58 77
7 7 14
1 0 1
9 68 77 Szenzitivitás
18 73 91 Specificitás
3 7 10 Poz. pred. érték
5 0 5 Neg. pred. érték
18,5 46 41,6
87,5 71,4 80
83,3 97 95,9
24,1 6.1 10,9
29,6 58,8 54,1
87,5 100 93,3
88,8 100 98,9
24,1 10,7 15,3
33,3 48,2 45,8
37,5 100 66,6
64,2 100 93,9
14,2 8,7 9,9
12. táblázat. Valódi pozitív és negatív, valamint fals pozitív és negatív eredményeinek száma stádium III-IV-ben 183 melanómás betegnél.
65
3. Az S-100B protein, az 5-S-CD és az LDH prognosztikus faktor szerepének vizsgálata
A 183 beteget tartalmazó beteganyag elemzése során a nem, kor, stádium, 5-S-CD, S100B protein, LDH koncentrációk és a metasztázisok számának és a lokalizációjának szerepét értékeltük Cox többváltozós regressziós analízissel. A túlélés szempontjából független prognosztikus faktornak bizonyult a LDH és a áttétek lokalizációja abban a bontásban, mely megkülönböztette a szoliter áttétet a multiplextol (13. táblázat ).
66
67
4. A szérum S-100B protein, az 5-S-Ciszteinildopa és az LDH közti korreláció vizsgálata melanómás betegekben
A Spearmen rank korreláció vizsgálat kapcsán a legerosebb korrelációt észleltük az LDH és az S-100B protein (r= 0,4586) között, ezt követte az S-100 és az 5-S-CD (r= 0,3670), valamint a LDH és az 5-S-CD (r= 0,3433) között észlelt korreláció (21. ábra). Az értékek közepes korrelációra utalnak. Az értékelés során ezek az adatok stádium IVben is hasonlóak.
5. A melanómás betegek túlélésének vizsgálata cut off érték feletti és alatti LDH koncentrációk esetén A normál és emelkedett LDH koncentrációjú betegek túlélését kétféle cut off értékkel is összehasonlítottuk. Elsoként a normálérték felso határát (460 U/l) választottuk cut off értéknek. Cut off alatti értéket észleltünk 110 betegnél (Stádium III: 29, Stádium IV: 81). Közülük 53 (48%) beteg halt meg és 25- en maradtak tünetmentesek. A progresszió helye: 4 regionális lokális recidíva, 3 pulmonális, 5 hepatikus, 1 cerebrális, 3 multiplex szervi és 4 egyéb áttét. Az átlag/medián túlélést 24,30/19,0 hónapnak számítottuk. Cut off feletti LDH esetében (73 eset, Stádium III: 6, Stádium IV: 67) 63 (86,3%) beteg exitált, hárman bizonyultak tünetmentesnek. Átlag/medián túlélés: 10,42/5,1 hónap. Elemeztük az adatokat 690 U/l cut off értéknél is. Ez az az eset ugyanis, amikor mindhárom markernél a cut off értek az 5-S-CD és az S-100B protein összehasonlító vizsgálathoz hasonlóan a normál koncentráció felso határértékének másfélszerese volt. Ebben az esetben cut off alatti értéket észleltünk 153 betegnél (St III: 34, Stádium IV: 119). Elhaláloztak 86- an (56,2%) és a vizsgálat végén tünetmentesek voltak 67-en. A stádium III-ból kialakult progresszió helye: 4 regionális lokális recidíva, 3 pulmonális, 5 hepatikus, 1 cerebrális, 3 multiplex szervi és 4 egyéb áttét. Az átlag/medián túlélés 13,5/10,2 hónapnak bizonyult. Cut off feletti LDH esetében (30 eset, Stádium III: 1, Stádium IV: 29) valamennyi beteg exitált. Náluk már a vizsgálat kezdetekor multiplex egy- vagy többszervi áttétet diagnosztizáltunk. Átlag/medián túlélés: 4,1/2,3 hónap.
68
Szignifikáns különbséget észleltünk a betegek túlélésének elemzése kapcsán mindkét cut off érték esetében a „normál” és „emelkedett” marker szintu betegek között, valamint az LDH > 460 U/l és LDH < 690 U/l túlélési görbék között is (22. ábra). 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0.0 -0.1 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
LDH LDH LDH LDH
> < < >
690 690 460 460
22. ábra. KaplanMeier túlélési görbe emelkedett és normál LDH koncentrációknál (cut off: 460 U/l és 690 U/l). Mindkét cut off érték esetén szignifikáns a különbség a túlélési görbék között.
Idõ (nap)
Átlag/medián túlélés stádium III-IV-ben emelkedett S- 100B proteinnél: 9,6/5,1 hónap, 5-S-Ciszteinildopánál: 14,5/6,13 hónap. Az LDH- hoz hasonlóan az emelkedett szérum szintek szignifikánsan rövidebb túléléssel jártak (23. ábra).
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3
5-S-CD<
0.2
5-S-CD> S-100<
0.1
S-100>
0.0 0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
LDH< LDH>
23. ábra. A túlélés összefüggése a markerkoncentrációkkal. Kaplan-Meier túlélési görbék normál és emelkedett S-100B protein (cut off: 0,18 ug/l), 5-S-Ciszteinildopa (cut off:15 nmol/l) és LDH (cut off 460 U/l) koncentrációknál. A görbék közti különbség mindhárom markernél szignifikáns.
Idõ (napok)
Abban a speciális esetben, amikor mind az S-100B protein mind az 5-S-CD meghaladta a számukra választott cut off szintet (azaz a normálérték felso határának másfélszeresét) az LDH fenti szempontok alapján történo összehasonlításánál mindkét cut off érték esetében (460 U/l és 690 U/l) a normál és emelkedett LDH koncentrációjú betegek
69
túlélési görbéi közötti szignifikáns különbség változatlanul megmaradt. Azonban, az LDH>460 és LDH<690 túlélési görbék között szignifikancia már nem volt kimutatható. Mindhárom marker cut off alatti koncentrációjánál az átlag medián túlélést 35,8/14,3 hónapnak kalkuláltuk. Mindhárom marker emelkedett koncentrációjánál 33 beteg esetében (S-100B protein>0.18 ? g/l, 5-S-CD>15 nmol/l, LDH>460 U/l) az átlag/medián túlélés 4,95/4,23 hónapnak bizonyult.
6. A LDH, S-100B protein és az 5-S-CD függetlenségének vizsgálata
A részletes eredményeket a 14. táblázat mutatja. LDH és S-100B protein vizsgálata során Pearson chi négyzet 19,697, p<0,001. A LDH és 5-S-CD elemzésekor
Chi
négyzet 7,962, p<0,0048. Meglepo módon mind az S-100B protein, mind az 5-SCiszteinildopa a mérések 63,6%-ában bizonyult közösen alacsonynak, míg a vizsgálatok 69,9%-ában az LDH az S-100B proteinnel együttesen emelkedett. Közösen magas LDH és 5-S-Ciszteinildopa ennél 10%- kal ritkábban fordult elo.
LDH <460 U/l LDH >460 U/l Összes eset
LDH <460 U/l LDH >460 U/l Összes eset
5-S-CD <15 nmol/l 70(63,6%) 31(42,5%) 101 S-100B <0,18 ug/l 70(63,6%) 22(30,1%) 92
5-S-CD Összes >15 nmol/l eset 40(36,4%) 110 42(57,5%) 73 82 183 S-100B <0,18 ug/l 40(36,4%) 110 51(69,9%) 73 91 183
14. táblázat. Az LDH, S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa független marker szerepének értékelése chi négyzet próbával. A számítások szerint az LDH, az S-100B protein és az 5 -SCiszteinildopa a vizsgálati anyagban ugyanolyan százalékban maradt a cut off érték alatt. Az LDH és az S-100B protein együttesen gyakrabban emelkedett, mint az LDH és az 5S-Ciszteinildopa.
70
III. Szöveti S-100B expresszió és szérum S-100B protein koncentráció összehasonlító vizsgálata stádium II-III melanómában
Az értekezés harmadik részében elemeztük a cután primér melanómák és a nyirokcsomó áttétek immunhisztokémiai vizsgálata során kapott S-100B protein expresszió és S-100B protein intenzitás valamint a szérum S-100B protein szintek közti összefüggéseket.
1. Szérum S-100B koncentráció meghatározás A szérum S-100B átlag/medián értéke I-II-es stádiumban a vizsgált 37 betegben a normál tartományban maradt (0,116/0,09 ? g/l, szórás: 0,010-0,533 ? g/l). Stádium IIIban (22 beteg) a szérum S-100B koncentráció szignifikánsan magasabbnak (0,248/0,150 ? g/l, range: 0,041-1,020 ?g/l bizonyult (24. ábra). Az alkalmazott, viszonylag alacsony 0,12 ?g/l cut off szint mellett stádium I-II-ben 73%-ban, míg stádium III- ban 41%- ban észleltünk normálértékeket.
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
0.020 0.075 0.100 0.130 0.142 0.010 0.027 0.030 0.033 0.034 0.035 0.048 0.050 0.055
1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 2 Stádium I-II 2
0.041 3 0.048 3 0.050 3 0.056 3 0.060 3 0.066 p<0,05 3 0.070 3 0.080 3 0.083 3 0.126 3 0.145 3 0.154 3 0.155 3 0.180 3
Stádium I-II Stádium III
24. ábra. Szérum S-100B protein átlagkoncentrációk 59 immunhisztokémiával is vizsgált melanómás betegnél. A primér tumoros és regionális nyirokcsomó metasztázisos betegek átlagkoncentrációi között a különbség s szignifikáns, p<0,05.
Stádium III
2. Szöveti S-100B protein expresszió Elemeztük a primér tumorok és a nyirokcsomó áttétek S-100B expresszióját immunhisztokémiai módszerrel. Az esetek felét (31/59) diffúz pozitivitás jellemezte. A tumorok jelentos részében (18/59) heterogén festodés volt megfigyelheto, míg néhány esetben (10/59) csak fokális jelölodést tapasztaltunk. Az intracellularis S-100B expresszió az I-II-III-as stádiumban hasonlónak bizonyult.
71
A tumorok intracellularis S-100B festodésének és a szérum koncentrációk közti összefüggés elemzése céljából összehasonlítottuk a normál és az emelkedett szérum koncentrációjú daganatok immunhisztokémiával észlelt festodését. Stádium I-II- ben amikor az esetek nagy részét a normál szérum szint (27/37) jellemezte, a leggyakoribb festodési forma a diffúz volt, melyet a heterogén és fokális követett. Stádium III-ban bár az esetek nagyobb részét az emelkedett szérum S-100B szint jellemezte, a tumorok festodési típusa a normál és emelkedett szérum koncentrációjú csoportban hasonló arányú volt, akárcsak az I-II-es stádiumban. Tehát a három különbözo intracelluláris megoszlási S-100B protein típus stádium I-II-III-ban hasonlónak bizonyult (25. ábra). 60 Betegek (%)
50 40 Stádium I-II
30
Stádium III
20 10 0 F
H
D
25. ábra. S-100B protein expresszió (fokális, heterogén és diffúz) Stádium I-II-III-ban immunhisztokémiai vizsgálattal. Nincs lényeges eltérés az expresszió típusában (F,H,D) az egyes stádiumokban (XV).
Stádium I-II- ben a fokális, diffúz és heterogén festodési típusú tumoroknál mért szérum koncentrációk egymáshoz közel álltak. Stádium III-ban a fokális festodés korrelált a legalacsonyabb, bár normál értéket meghaladó szérum szinttel. Heterogén és diffúz festodés f H 0.6 0.100 0.033
S-100B protein
0.5 0.100 0.4
0.110 0.113 0.191
0.30.030167 0.097 0.2
D
F
0.030 0.035 0.055 0.066 0.080 0.080 0.100 0.105 0.110 0.138
0.010 0.027 0.034 0.048 0.050 0.056 0.063 0.067 0.076 0.098
0.142
0.114
0.10025 0.109
Stádium I-II 0.533
0.136
0.060 0.083 0.126 0.145 0.281 0.863
0.260
0.1 0
szignifikánsan
H 0.041 0.066 0.199 0.309
Stádium III
esetében emelkedett
(p<0,05) szérum szinteket kalkuláltunk (26. ábra). F H D
26. ábra. Szérum S-100B protein koncentráció összefüggése a fokális, heterogén és diffúz immunhisztokémiai S-100B protein expresszióval melanomában. Stádium III-ban a heterogén és diffúz expressziót magasabb szérum koncentráció kísérte (XV).
72
3. Szöveti S-100B protein expresszió intenzitásának értékelése
Az S-100B festodési típusa mellett az expresszió szintje, az intenzitás is tükrözodhet a szérum koncentrációkban. Az esetek 40-45%-ában (28/59) eros expressziót (+++) észleltünk, melyet a tumorok 30- 40%- ában (20/59) talált közepes (++) intenzitás követett, míg az alacsony expressziós szint (+) relatíve ritkábbnak kb. 20% (11/59) bizonyult. A viszonylag kis tumortömeggel jellemzett stádium I-II-ben csak a +++ csoport mutatott cut off (0,12 g/l) feletti értéket. Azonban III-as stádiumban, nyirokcsomó metasztázisos betegekben az er os S-100B intenzitás az emelkedett szérum szinttel bíró betegekben fordult elo gyakrabban. Mind ++ és +++ intenzitás csoportban az S-100B protein szint szignifikánsan (p<0,05) emelkedett, összehasonlítva az alacsony (+) intenzitás csoporttal. A közepes (++) és magas (+++) intenzitás csoport nem különbözött egymástól ebben a tekintetben (27. ábra).
*
0.7 S-100B protein ug/l
0.6 0.5 0.4
** 0.1 0.010 0.027 0.035 0.110
0.3 0.03888 0.2 0.1 0
0.05348
***
*
0.020 0.130 0.142 0.030 0.033 0.034 0.066 0.067 0.113
0.075
0.138 0.153 Stádium I-II 0.191
0.098 0.100 0.100
0.048 0.050 0.055 0.056 0.063 0.076 0.080 0.080
**
***
0.041 0.080 0.155 0.199 0.309
0.048 0.050 0.066 0.070 0.083 0.145 0.380 0.863 1.002
0.07776 0.06516
0.29837 0.301
0.056 0.060 0.126 0.154 * 0.180 ** 0.281 *** 0.490 0.619
0.163 0.246
Stádium III
27. ábra. Szérum S-100B protein koncentráció összefüggése az immunhisztokémiai vizsgálat során észlelt S-100B protein expresszió intenzitásával melanomában (XV).
Megvizsgáltuk, vajon összefügg-e a túlélés ebben az anyagban a stádiummal, az S-100B protein szöveti expressziójával és az intenzitással. Nem észleltünk szignifikáns különbséget sem a stádiumok, sem a szöveti expresszió illetve intenzitás vonatkozásában. Ez feltehetoleg az alacsony betegszámmal magyarázható.
73
IV. AMFR expresszió vizsgálata primér humán melanómában 54 primér bormelanómában
analizáltuk konfokális mikroszkóppal az AMFR
immuncitokémiai expresszióját. A vizsgálandó anyagot a Breslow szerinti tumorvastagság alapján csoportokba soroltuk. Összesen 24 vékony (< 1,5 mm), 16 közepes vastag (1,5-3,9 mm) és 14 vastag (> 4 mm) tumort dolgoztunk fel az AMFR expresszió szempontjából. A vékony tumor kategóriában gyenge és heterogén AMFR expressziót észleltünk elsosorban. Ezzel szemben a közepesen vastag valamint a vastag tumorok között az eros AMFR expresszió dominált (28. ábra). A különbség a vékony és vastag melanomák között szignifikáns volt. 60
Esetek %
50 40 Gyenge 30
Heterogén Eros
20 10 0 < 1,5
1,5-3,9
> 4,0
28. ábra. Az AMFR/PHI/gp78 expresszió típus bormelanomában különbözo Breslow szerinti vastagságnál. A 4 mm-nél vastagabb tumoroknál az eros AMFR expresszió dominált (CLXVII).
Meghatároztuk az AMF expressziót 21 szuperficiális vertikális növekedésu (SSM-V), 13 superficiális horizontális növekedési fázisú (SSM) és 19 noduláris melanomában (NM). A noduláris melanoma elsosorban diffúz festodést mutatott és a vertikális formához hasonlított, míg a horizontális növekedésu csoportot a gyenge és heterogén mintázat jellemezte (29. ábra).
70
Esetek %
60 50 SSM SSM-V
40 30
NM
20 10 0 Gyenge
Heterogén
Eros
29. ábra. Az AMFR/PHI/gp78 expressziós mintázat SSM vertikális és horizontális növekedési fázisában és noduláris melanomában. (CLXVII).
74
V. Megbeszélés A melanoma malignum elofordulási gyakorisága az utóbbi 50 évben megtízszerezodött (36,49,110,132). Magyarországon az 1999 óta muködo Nemzeti Rákregiszter évente 1288 új primér melanómát jelez, mely kissé magasabb, mint a térségre jellemzo nemzetközi adatok (132). A betegség kezelésének egyik kihívása a daganat korai észlelése. Mára a kezdeti stádiumban felállított diagnózis gyakoribbá vált, a betegek várható túlélése javult. Ennek ellenére a másik alapveto kérdés, a disszemináció minél korábbi felfedezése és kezelése változatlan probléma. A túlélés meghosszabbítását minden stádiumban a korai felismerés segítené elo. A tumormarkerek legfontosabb alkalmazási területe a daganat szurése, a diagnózis felállítása, a prognózis becslése, a tünetmentes beteg követése és a terápia monitorozása. A primer melanoma szurésére a tumormarkerek szükségtelennek tunnek. A daganat a borön, némely esetben a még a nyálkahártyákon is jól látható. A diagnózis nem igényel eszközös vizsgálatot, eltekintve az utóbbi években alkalmazott, nonivazív dermatoszkóp mára rendszeressé vált használatától, mely a diagnosztikus biztonságot megfelelo tapasztalat birtokában kétségtelenül javítja. Azonban szövettani vizsgálatra, mely egyrészt elengedhetetlen
kontroll a klinikus számára, másrészt nélkülözhetetlen a
prognózis megítélése szempontjából, feltétlenül szükség van. A tumormarkereknek melanoma esetében potenciális szerepe a prognózis felállításában, a betegkövetésben és a terápia monitorozásban lehet.
Az S- 100B protein értékelése melanóma malignumban
Az S- 100B proteint vizsgáló közleményekben emelkedett szérum koncentrációt mértek már melanomában valamennyi stádiumban (33,72). Számos elemzés I-II-es stádiumban alacsony szenzitivitást (1,3%, 4%, 10%, 14%) észlelt, amely azonban a betegség progressziója során növekszik (stádium III: 8,7-19,2-21%, stádium IV: 73,9-67,979,9%). (X,XI,63,76,70,96,108). Ezt az értekezés saját eredményei (S- 100B proteinnél szenzitivitás stádium II-ben: 9%, stádium III-ban: 30,3% és stádium IV- ben: 56%) is megerosítették. Bár a primer tumoros betegeink többsége a daganat jellemzoit tekintve a rossz prognózisú betegcsoportba tartozott, értékeik a normáltartomány közelében helyezkedtek el (X,XI,XIII).
75
A statisztikai vizsgálatok során észlelt szignifikáns különbségek közül legjelentosebb a II- es és III-as, valamint a III-as és IV-es stádiumok közti eltérés, mivel a belsoszervi metasztázisok kimutatására alkalmazott diagnosztikus vizsgálatok a stádiumnak megfeleloen elore tervezettek és idoszakosan végezhetok (X,XI,XII). Így a betegkövetés során néha már csak nagyméretu metasztázist tudunk diagnosztizálni. Az áttétek korai felfedezésében a markerek jelentos szerepet játszhatnak. Szignifikáns különbséget tapasztaltunk továbbá S- 100B protein esetében a primer tumoros és a pulmonális, valamint a primer tumoros és a hepatikus metasztázisos betegek átlagértékei között (XI). Mivel a melanoma igen gyakran metasztatizál a tüdobe, melanoma áttét vagy új tüdodaganat differenciáldiagnózisában (kivéve a kissejtes tüdorák, mely S-100 pozitiv lehet) az emelkedett értékek diagnosztikus segítséget nyújthatnak. Ocularis melanoma elsosorban a májba ad áttétet, így a sorozat S-100B protein vizsgálat a tünetmentes betegnél informatív lehet. A szérum S-100B protein folyamatos emelkedése progressziót, szisztémás betegség kialakulását jelzi (65,91). A betegkövetés kapcsán az egyszeru és viszonylag olcsó markervizsgálatok gyakrabban végezhetok, az emelkedo szérum marker érték az eszközös vizsgálatok korábbi bevetésére serkenthet. A markervizsgálatok számos szerzo és saját tapasztalatom alapján is néha 2-3 hónappal az eszközös vizsgálatok elott jelzik a metasztázis kialakulását (XIV,25,92). Anyagunkban a tünetmentes betegek követése kapcsán az S-100B protein koncentrációjának növekedése
az esetek 1/3- ában
megelozte a betegek stádiumának megfeleloen tervezett és kivitelezett képalkotó vagy fizikális vizsgálatokkal felállított metasztázis diagnózisát. Az értékelés azonban retrospektíven készült, így nem állítható biztonsággal, hogy az emelkedett markerkoncentráció észlelésének pillanatában, ha van lehetoség azonnali további vizsgálatokra, a progresszió még nem lett volna kimutatható. A prognózis megállapítására stádiumonként különbözo, sokféle paraméter áll rendelkezésre (54,76,109). Mégis az individuális esetekben nem várt, ezen faktoroknak ellentmondó tünetmentes vagy átlagos túlélés tapasztalható. Ezekben az esetekben a tumormarkerek vizsgálata elotérbe kerül. Primér tumoros betegeknél általában a kor, nem, lokalizáció, Breslow szerinti vastagság, esetleg egyéb szövettani paraméterek (szövettani típus, exulceráció) kerülnek feldolgozott paraméterek közé.
76
Számos betegnél disszeminált daganatos állapot alakul ki. A klinikai onkológiában széles köru kutatás folyik a daganatos recidívák és mikrometasztázisok korai észlelésével kapcsolatban. A daganat inazívvá, metasztatikussá válásában potencális szerepet játszó molekuláris markerek kutatását kifejezett érdeklodés övezi. Jelenleg úgy tunik, hogy a p16/INK4 alfa elvesztése és a kíséro Ki-67 növekedés a progresszió markerének tekinthetok. A metasztázis képzéshez a tumorsejtek számára szükséges a matrix felismerése, degradáció és invázió képessége. Melanómában az adhéziós molekulák közül az integrin ??3, a proteázok körében a MMP-2, a matrix degradáló enzimek családjából a uPA és a katepszinek expressziója hozható összefüggésbe a metasztázis képzéssel. Továbbá, a motilitással kapcsolatos faktoroknak (AMF) szintén lehet diagnosztikus értéke. A c-met receptor és a metasztatizáló uveális melanoma közti korreláció már ismert. A MART -1 MAGE3 kimutatásával szitén közelebb kerülünk a biztos prognózishoz (168). Mindezek ellenére, a melanoma invásiójának molekuláris részletei még mindig hiányosak, és a kutatómunkák egy megfeleloen érzékeny prognosztikus markerek felfedézésére irányulnak. A távoli áttétes betegek túlélésével klinikai szempontból számos faktor függ össze: a metasztázis helye (bor és tüdoáttét szemben a cerebrális és hepatikus áttéttel), a metasztázisok száma, LDH érték, a beteg általános állapota. Az élettartam ezektol a faktoroktól függoen 4 hónap és közel két év körül várható (54,56,76,109). A mikro- és makrometasztázisok észlelése a tumormarkerek alkalmazhatóságának is érdekes területe. Áttétes melanomában az S-100B protein abszolút értéke korrelál a betegség aktivitásával, és képes elore jelezni a progressziót (XIV,46,65,91,92,97,116). A legmagasabb értékeket máj és izom metasztázisban észlelték (74, 116). Stádium IVben az
S- 100B protein a közlemények alapján független prognosztikai faktornak
fogadható el, mellyel saját eredményeink is korrelálnak (XIV,73,112,153). Jelen vizsgálatom során a 475 beteget tartalmazó anyagunkban független prognosztikus faktornak bizonyult a Breslow szerinti tumorvastagság, a stádium, a szérum S-100B protein, a metasztázisok száma és lokalizációja (XIV). Az S-100B protein szérum szintje tükrözi továbbá a betegség aktivitását, megkülönböztetve a tünetes és tünetmentes betegeket (X,XI,116,155). Vizsgálatunkban is szignifikáns volt a különbség a két csoportban. Számos tumormarkerrol ismert, hogy szérum koncentrációja a tumortömeggel korrelál.
77
Anyagunkban Stádium IV- ben a tünetmentes és tünetes beteg átlag/medián értékei egymástól jelentosen eltértek, ami a tumortömeget tükrözo hipotézist támasztja alá (112). A különbözo szervi áttétek esetében észlelt eltéro S-100B protein koncentrációk azonban ennek a koncepciónak ellene szólnak (112). Amennyiben az S-100B protein valóban a tumortömeget tükrözi, a betegség progressziója kapcsán az értékek emelkedése várható. Ellenkezo esetben, terápiás válasz esetén a regressziót-remissziót a szérum koncentrációk csökkenése kíséri. Ennek alapján a tumormarkerek alkalmasak a melanoma progressziójának megítélésére és kezelésének monitorzására (65,74,78). Saját vizsgálataim alapján az S-100B és a tumortömeg kapcsolata valószínusítheto. Mivel az S-100B protein a tumorból származik, valószínuleg létezik egy minimális tumortömeg, mely az S-100B detektálható emelkedéséhez vezet. A tumorok növekedésük különbözo idoszakában feltehetoen különbözo mennyiségben szekretálják az S-100B proteint. A tumor erezettsége nyilvánvalóan szintén befolyásolja az S-100B protein megjelenését a keringésben. A fals negatív eredmények hátterében (anyagunkban 475 beteg adatai alapján 48%) a melanoma ismert biológiai heterogenitása, a kis tumortömeg, inaktív betegség, vagy más ismeretlen faktor is állhat. A heterogenitás szempontjából talán legérzékenyebb a primér tumor (stádium I-II). Még vastag tumor esetében is, ha az im munhisztokémiai S-100B expresszió alacsony, a szérum koncentráció nem emelkedik (XV). Saját eredményeink alapján a tumortömeg és az S-100B protein közti kapcsolatot megerosíti egyrészt a betegség progressziója során észlelt átlag/medián szérum koncentráció növekedés, valamint a stádium III-IV- ben tünetmentes és tünetes betegek marker szint között kimutatott szignifikáns különbség. S100B protein esetében Kaskel tanulmányában a pozitív prediktív érték, mely a magasabb
marker
koncentráció
hátterében
meghúzódó
daganatos
betegség
valószínuségére utal, 65% volt, míg beteganyagunkban az értekezésben 91.8% (97). A szérum S-100B protein szint korrelál a daganatellenes terápiában részesülo betegeken a progresszióval és a regresszióval (65,74,78,91,97). A közlemények a kontrollcsoportban általában 4% fals pozitivitást észlelnek (97). Saját 3%-os (2/63) eredményünk a kontrollcsoportban, valamint a 2,3% fals pozitivitás a 475 beteget tartlamazó beteganyagban a módszer megbízhatóságát jelzi.
78
Ugyanakkor tünetmentes betegek fals pozitivitása szubklinikus metasztázist jelezhet. Munkámban tünetmentesnek tartottuk azokat a betegeket, akiknél 2 hónapon belül áttét, recidíva nem alakult ki. Ezekben az esetekben a késobbi progresszió átlag/medián ideje 15,3/11 hónapnak bizonyult, mely elég hosszú ahhoz, hogy az emelkedett értéket más faktorokkal, mérési hiba, egyéb ismeretlen tényezovel magyarázzam.
Az 5-S- Ciszteinildopa értékelése
Vizsgálatunk 475 beteggel a legnagyobb esetszámot képviseli a szérum 5-S-CD potenciális marker szerepét elemzo munkák között az irodalomban (XII,XIII, XIV,80,81,133,184). A publikációk alapján az 5-S-Ciszteinildopa szérum koncentrációja a stádiumtól függoen
emelkedik
legkifejezettebben
(XII,XIII,XIV,81,133,184).
A
marker
szérum
szintje
stádium IV-ben növekszik (XII,XIII,XIV,80,81,133,184). Saját
anyagom alapján az átlagkoncentráció stádium IV-ben valamennyi többi stádiummal szemben szignifikánsan magasabb. Az 5-S-Ciszteinildopa szenzitivitása stádium IVben anyagunkban 48,6%-nak, míg a specificitás 88,8%-nak bizonyult. A tünetmentes betegek szérum koncentrációi az egészséges kontrollokéhoz hasonlóak. A pulmonális és hepatikus áttétes betegeknél mért 5-S-Ciszteinildopa átlagos szérum koncentrációk közti szignifikáns különbség egyrészt a tumortömegtol független szérum marker koncentráció elvét támasztaná alá, másrészt azonban a hepar érdús szerkezetének szerepe sem zárható ki egyértelmuen. Ugyanakkor az emelkedett 5-S-CD szint korai stádiumban progressziót jelezhet, korábban, mint a konvencionális képalkotó technikák (XIII, XIV,81,133). Az értekezésben 160 betegünk monitorozása során a retrospektív elemzésben az 5-S-CD emelkedése az esetek 1/3-ában megelozte a metasztázis rutinszeruen elvégzett, a stádiumnak megfelelo gyakorisággal kivitelezett fizikális vagy eszközös vizsgálattal történo kimutatását. Bár korábbi munkámban egyváltozós Cox regressziós módszerrel az 5- S-CD koncentrációja stádium IV-ben rizikófaktorként jelent meg, multifaktoriális analízissel azonban jelen vizsgálataink során az 5-S-CD nem bizonyult önálló prognosztikus tényezonek (XIV).
79
Ellentmondásosak az eredmények amelanotikus melanomában. Több közlemény nem észlelt emelkedett 5- S-CD szintet stádium IV-ben, míg Wimmer Suenagához hasonlóan nem talált különbséget amelanotikus és melanotikus áttétes betegeinek szérum koncentrációi között, az értékek mindkét esetben emelkedtek (69,80,82,163,184). A megfigyelést azzal magyarázza, hogy az amelanotikus szövetben a pigmenttermelésben valószínuleg az 5-S-CD képzodés után jön létre defektus (184). Eredményei korrelálnak Peterson megfigyeléseivel, aki az amelanotikus és melanotikus beteg szérum 5-S-CD koncentrációi között nem talált szignifikáns különbséget (133). Továbbá tirozináz pozitív és negatív albínó beteg szérum 5-S-CD koncentrációi a kontrollokéhoz rendkívül hasonlónak mutatkoztak (4,90). Egyik kisebb beteganyagot elemzo közleményünkben az 5-S-CD szenzitivitása néhány százalékkel emelkedett, ha az amelanotikus primér tumoros betegeket kizártuk (XII). Az értekezés beteganyagát képezo 475 betegnél Stádium IV- ben a tünetes betegek között 48/152 (31,6%) fals negativitást észleltünk az 5-S-Ciszteinildopa vizsgálatok során. Ezen esetekben a hozzáférheto szövettani leletek alapján amelanotikus esetet nem találtunk. Tekintet tel arra, hogy a melanoma a pigmentképzodés szempontjából is heterogén tumor (amelanotikus primér tumor metasztázisa is lehet pigmenttartalmú és fordítva) valamint hogy a teljes mértékben amelanotikus tumor igen ritka, nem gondolom, hogy a tumorok pigmenttartalma az 5-S-CD mérések szenzitivitását nagyszámú beteg elemzése kapcsán értékelhetoen befolyásolná. Emelkedo 5-S-CD koncentráció megfigyelheto citosztatikus kezelés alatt, terápia rezisztenciára utalva (70,184). Ebben a munkában terápia monitorozásra nem volt lehetoség. Saját eredményeim közül érdekesnek tartom a szezonális ingadozás vizsgálatát. Japán szerzok szerint a nyári és téli értékek közti eltérés kimutatható, de a normál határokon belül marad (177). Beteganyagunkban tünetmentes betegeken az 5-SCD-nél a nyári-téli vizsgálatok átlagkoncentrációi között a különbség szignifikáns. Nyáron a fals pozitív esetek száma a téliekének két és félszerese. Ezzel szemben a kontrollcsoportban, noha feltételezném, a nyári és téli 5- S-CD átlagkoncentrációk között nincs szignifikáns különbség. A fals pozitív esetek száma azonban ebben a vizsgálati csoportban is közel a kétszerese volt a téliekének, azaz az eltérés a tünetmentes betegekhez hasonlóan alakult.
80
A szérum minták könnyebben vizsgálhatók mint a vizelet koncentrációk, mivel nincs szükség 24 órás vizeletgyujtésre, az eredmény nem függ a vesefunkciótól. Így az értékelés megbízhatóbbnak tunik (178).
A laktátdehidrogenáz értékelése
Az irodalomban elsoként végeztünk melanoma malignumban keringo LDH, 5-S-CD és S-100B protein összehasonlító vizsgálatot. Továbbá, az értekezés a legnagyobbb betegszámú összehasonlító LDH és S-100B protein elemzést tartalmazza (XVI ). Az LDH a legtöbb tanulmányban melanomában stádium IV-ben a legerosebb prognosztikus faktornak bizonyult (35,46,47,60,103). Ez nem meglepo, mivel korábban számos más tumorban ismertettek hasonló megfigyeléseket: kis és nem kissejtes tüdorákban, Hodgkin és non Hodgkin limfómában, Ewing sarcomában, prostata rákban, multiplex myelomában. Az LDH emelkedése nemcsak kizárólag hepatikus áttéthez kötött. Más szervi lokalizációjú betegeinknél is észleltünk magas LDH koncentrációt. Így az LDH szint inkább a nekrózist tükrözi (157). Az a tény, hogy az LDH szinte csak a disszeminált betegeknél emelkedett, vizsgálati anyagunkban a szenzitivitás stádium III-ban 24%, stádium IV-ben 46%, szintén a tumortömeggel való összefüggésre utal. Ugyanakkor okozhatja a megváltozott sejtkinetika is, amit az a megfigyelés támaszt alá, hogy az azonos szervi metasztázisban szenvedo, de gyorsabb lefolyású, agresszívebb tumoros esetekben a mért értékek magasabbaknak bizonyultak (157). A pulmonális és hepatikus áttétes betegek átlagos LDH koncentrációi egymáshoz rendkívül közeli értéket mutattak, szemben az 5-S-Ciszteinildopánál tapasztaltakkal. Saját tapasztalataim alapján az LDH független prognosztikus faktornak bizonyult, a metasztázis számával (szoliter vagy multiplex) együtt. A közlemények változó eredményeket közölnek, egyes esetekben az S- 100B protein, máskor az LDH domináns prognosztikus szerepét hangsúlyozva (35,46,60,75,103). A szenzitivitás, specificitás eredményei stádium IV-ben egymáshoz igen közel állnak. Hasonlóan más szerzokhöz az S-100B protein és az LDH között jelentos, az 5-S-CD és az LDH között kevésbé kifejezett korreláció figyelheto meg (35,46). A magas LDH értékkel bíró betegek túlélése rendkívül közel áll az emelkedett S-100B proteinnel rendelkezo betegekéhez,
81
már 460 U/L cut off érték esetén is, azaz LDH esetében nyugodtan választhatjuk cut off-ként a normálérték felso határát.
Szérum S-100B protein koncentráció és szöveti S-100B protein expresszió összehasonlító vizsgálata (XV).
A melanocitás tumorok differenciáldiagnózisa számos protein, köztük az S- 100 protein, a HMB-45 a MART-1/MELAN-A összehasonlítása során az S-100 maradt a melanocita differenciáció legérzékenyebb markere (22,41,66,130). Közismert azonban, hogy a melanoma heterogén tumor, mind a melaninizáció mind a tumor antigének expressziójának szempontjából (7,66). A prospektív tanulmányban a kezdeti stádiumú (Stádium I-II-III) melanomás betegek szérum S-100B koncentrációit határoztuk meg és összehasonlítottuk a megfelelo primér tumor és nyirokcsomó metasztázis S-100B protein expressziójával. I-II-es stádiumban az átlagos szérum S- 100B érték a normáltartományban maradt, azonban stádium III-ban szignifikánsan emelkedett. Ennek ellenére stádium I-II-ben is az esetek 27%-ában emelkedett szérum értéket észleltünk, míg stádium III-ban a betegek 41%-át normál szérum S-100B koncentráció jellemezte, ami heterogén, individuális expressziót sugall. Ezt megerosítette a tumorok S-100B immunhisztokémiai festodésének vizsgálata. Diffúz, heterogén és fokális eloszlást észleltünk, az anyag egészében a diffúz megoszlás (52,2%) dominált. Érdekes, hogy a festodési típus hasonlónak bizonyult I-II-III-as stádiumban, még metasztázisos szövetben is, jelezve, hogy az adott daganat expresszió típusa nagy valószínuséggel állandó. Míg a szérum marker koncentráció a normál határok között mozgott Stádium III- ben a különbözo festodési csoportokban, stádium III-ban a heterogén és diffúz megoszlás szignifikánsan emelkedett S-100B protein szérum szinttel járt, utalva a két tényezo közti kapcsolatra. Továbbá, stádium I-II-ben a szérum koncentráció (normál határokon belül) arányos az S-100B protein intenzitásának erosségével. Stádium III- ban az alacsony festodési intenzitású tumoroknál tapasztaltunk alacsony szérum koncentrációt, mely feltevésünket tovább erosítette. Megpróbáltunk magyarázatot adni az immunhisztokémiai festodés, intenzitás és a szérum S-100B protein szintje között tapasztalható összefüggésekre-ellentmondásokra.
82
A tumorsejtekben képzodo S-100B protein a szérumban különbözo mennyiségben jelenik meg. Ennek magyarázata során a tumortömeg lehetne az egyik kulcs tényezo (a primér tumor vastagsága, a nyirokcsomó metasztázis mérete). Mivel a melanoma, azaz a primér tumor csak néhány mm nagyságú, nem meglepo, hogy stádium I-II- ben a szérum koncentrációk foként a normáltartományban mozognak. Azt a nézetet valljuk, hogy a nagyobb mennyiségu tumormassza, mint például egy metasztázis, több S-100B proteint bocsáthat a keringésbe (45,46,57,65). Másrészrol azonban, a melanoma az S-100B expresszió szempontjából heterogén tumor, ezt mi is megfigyeltük ebben a tanulmányban és mások is észlelték korábban (22,41,66). Eszerint tehát fokális immunhisztológiai festodésu és alacsony intenzitású (+) tumor még elorehaladottabb stádiumban vagy disszeminált formában is csak kis mennyiségu markert bocsát a keringésbe. A tanulmány alapján két további szempont merül fel. Egyrészt érdemes lenne megvizsgálni egyazon betegbol, de különbözo stádiumból származó szövettani anyagot a melanoma S- 100B protein festodési típusának és intenzitásának állandóságának vagy változékonyságának, azaz a heterogenitás további bizonyításának szempontjából. Továbbá a 475 beteget tartalmazó, szérum koncentrációk szempontjából feldolgozott beteganyag azon részébol, akik fals negatívak (tünetesek, de a marker koncentráció a cut off érték alatt marad) immunhisztokémiai vizsgálatot végezni a festodés típusának és az intenzitásnak megítélésére. Megfigyeléseink és a korábbi adatok alapján javasoljuk melanomában és különösen metasztázisban az S-100B expresszió meghatározását immunhisztokémiával. Fokális és heterogén festodés valamint alacsony intenzitásnál a szérum S-100B monitorozás valószínuleg nem lesz megbízható, csak rendkívül elorehaladott, nagy tumortömeggel járó esetekben. Ezt számos korábbi megfigyelés is alátámasztja, mely kezdeti stádiumban alacsony szenzitivitást észlelt (45,93,112). Ilyen esetekben célszeru más markereket is használni az S-100B protein mellett.
AMFR expresszió értékelése primér melanomában (CLXXVII)
A humán melanoma az egyik leginvazívabb daganattípus. A biológiai viselkedését szabályozó molekuláris mechanizmusok megvilágítása közelebb vinne általában az
83
áttétképzodés megértéséhez. A tumorsejt motilitást motilitási citokinek szabályozzák, abban az esetben, ha receptoraikkal párhuzamosan expresszálódnak. Az AMF/PHI/gp78 általánosan eloforduló motilitási citokin, melynek megfelelo AMFR receptor számos tumorban expresszálódik (105,156,122). A PHI (foszfohexózizomeráz) szérum koncentrációja is meghatározható, amire magunk is tettünk már kísérletet kisebb beteganyagon. Prospektív tanulmányunkban 54 primér melanoma AMFR protein expresszióját vizsgáltuk immunhisztokémiával. Gyenge, eros és heterogén AMF expressziót tapasztaltunk. A vékony tumorokban a gyenge/heterogén, míg a vastag tumorokban az eros AMF expresszió dominált. A melanoma vastagsága a klinikai stádium beosztás alapja és a potenciális metasztatizáló képesség becslésére szolgál. Eredményeink világosan utalnak az AMFR expresszió és a metasztatizáció közti kapcsolatra. A feltételezett összefüggést megerosíti továbbá, hogy a szuperficiális vertikális növekedésu tumorok az AMFR-t erosebben expresszálják mint a horizontális növekedési fázisban lévok (CLXVII). Az AMFR expresszió és a tényleges progresszió közti össszefüggés értékeléséhez legalább 5 éves megfigyelési ido szükséges. Anyagunkat ebbol a szempontból még nem tudtuk feldolgozni.
84
Az értekezés eredményeit és új megállapításait az alábbiakban foglaljuk össze
1. A szérum S- 100B protein Stádium II-III -IV-ben alkalmazható prognosztikus markerként. Szérum koncentrációja független rizikótényezo a túlélés szempontjából. Megfelelo tünetmentes beteg követésére, korai metasztázis kiszurésére. 2. Az S-100B protein szérum koncentrációk és immunhisztokémiai vizsgálatok összehasonlítása során normál szérum koncentrációknál a fokális és heterogén festodési típus és alacsony intenzitás figyelheto meg elsosorban. 3. A szérum koncentrációk elemzése során észlelt fals negatív eredmények viszonylag magas száma miatt célszeru immunhisztokémiával a szöveti S-100B megoszlást és intenzitást megvizsgálni monitorozás elott. 4. Bár az 5-S-CD szérum koncentrációja nem bizonyult független prognosztikus faktornak, a marker betegkövetésre szintén ajánlható. 5. Az S-100B protein és 5-S-Ciszteinildopa összehasonlítása során az S-100B protein bizonyult
szenzitívebbnek
és
specifikusabbnak.
Együttes
alkalmazásuk
biztonságosabbnak tunik a túlélés megítélésnek szempontjából. 6. 5- S-ciszteinildopánál a kontrollcsoportban és a tünetmentes betegeknél nyáron a fals pozitív esetek száma kétszerese a téliekének. 7. Disszeminált betegeknél az S-100B protein bizonyult a legspecifikusabbnak és a leginkább szenzitívnek, azonban a három marker közül az LDH-t találtam független prognosztikai tényezonek. 8. LDH esetében 460 U/l, azaz a normálérték felso határát elegendo cut off értékként választani. 9. Az immunhisztokémiai AMFR expresszió erossége összefügg a tumorvastagsággal és a SSM verticális növekedésével, így a daganat metasztatikus képességére utal.
85
VI. Rövidítések jegyzéke 1. alfa MSH: alfa melanocita stimuláló hormon 2. AMF: autokrin motolitási faktor 3. AMFR: autokrin motolitási faktor receptor 4. betaa : beta alsó 5. betaf: beta felso 6. IL: interleukin 7. LDH: laktátdehidrogenáz 8. LKSZ: lipidhez kötött sziálsav 9. met.: metasztázis 10. MIA: melanoma inhibitory activity 11. MMP: metalloproteináz 12. mpx.: multiplex 13. NM: noduláris melanoma 14. NSE: neuronspecifikus enoláz 15. PHI: foszfohexózizomeráz 16. reg.met.: regionalis nyirokcsomó metasztázis 17. regr. koeff. beta: regressziós koefficiens 18. RR: relativ rizikó 19. RRa : relatív rizikó alsó 20. RRf: relatív rizikó felso 21. SE: standard error 22. SD: standard deviáció 23. sICAM-1: solubilis intracellularis adhéziós molekula 24. sVCAM-1: vascularis sejt adhéziós molekula 25. SSM: szuperficiálisan terjedo melanoma 26. solit.: soliter 27. TA-90: tumor asszociálta antigén 28. 5- S-CD: 5-S-Ciszteinildopa 29. 6H5MI2C: 6- hidroxi-5-metoxiindol-2-karbolsav
86
VII. Irodalom 1. Acland K, Evans V, Abraha H, Healy C.M.J, Roblin P, Calonje E, Orchard G, Higgins E, Sherwood R, Russel-Jones R: Serum S-100B concentrations are not useful in predicting micrometastatic disease in cutaneous malignant melanoma. Br J Dermatol 2002;146,5:832-834 2. Agrup G, Falk K, Fyge K, Rorsman H, Rosegren AM, Rosengren E: DOPA and 5-SCD in the urine of healthy humans. Acta Dermatovener (Stockholm) 1973;53: 453457 3. Agrup G, Falck B, Jacobsson S, Rorsmann H, Rosengreen AM, Rosengreen E: 5-Scysteinyldopa in melanomas of Caucasians. Acta Dermatovener (Stockholm) 1974;54:21-24 4. Agrup G, Agrup P, Andersson T, Hafström L, Hansson C, Jacobsson S, Jönsson PE, Rorsman H, Rosegren AM, Rosengren E: 5 years experience of 5-S-cysteinyldopa in melanoma diagnosis. Acta Derm Venereol (Stockh) 1979;59:381- 388. 5. Altomonte M, Colizzi F, Esposito G, Maio M: Circulating intercellular adhesion molecule-1 as marker of disease progression in cutaneous melanoma. N Eng J Med 1992;327:959 6. American Joint Committee on Cancer IN: Beahrs O.H: Manuel for Staging of Cancer. Ed-3, pp.143-148 Philadelphia, J.B. Lippincott Co., 1988 7. Argenyi ZB, Cain C, Bromley C, Nguyen AV, Abraham AA, Kersel R, LeBoit PE: S-100 protein negative malignant melanoma: fact or fiction. A light microscopic and immunohistochemical study. Am J Dermatopathol 1994;16:233-240 8. Bánfalvi T, Malmos E: A napfény és a rosszindulatú bordaganatok. Orvosképzés 1993;68:72-75 9. Bánfalvi T, Oberna F, Kiskoszegi A: A klinikai diagnózis megbízhatósága melanoma malignumban. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 1997;73:3-7 10. Bánfalvi T, Gilde K, Boldizsár M., Kremmer T, Ottó Sz: Serum levels of S-100B protein and 5-S-cysteinyldopa as markers of melanoma progression. Pathol Oncol Res 1999;5:218-223 11. Bánfalvi T, Gilde K, Bezzegh A, Schumann B, Fejos Zs, Liszkay G, Ottó Sz: Clinical significance of S- 100B protein assay in malignant melanoma. J Tumour Marker Oncol 1999;14:5-12.
87
12. Bánfalvi T, Gilde K, Boldizsár M , Fejos Z, Horvath B, Liszkay G, Beczassy E, Kremmer T: Serum concentration of 5-S-cysteinyldopa in patients with melanoma. Eur J Clin Invest 2000;30:900-904 13. Bánfalvi T, Gilde K, Édesné Boldizsár M, Gergye M, Kremmer T: Clinical significance of
5- S- CD monitoring in patients with malignant melanoma.
Neoplasma 2002;49,2,121-124 14. Bánfalvi T, Gilde K, Boldizsár M, Gergye M, Kremmer t, Ottó Sz: Use of serum S100B protein and 5- S-cysteinyldopa to monitor the clinical course of patients with malignant melanoma. Eur J Cancer 2003;39:164-169 15. Bánfalvi T, Udvarhelyi N, Orosz Zs, Beczássy E, Gilde K, Tímár J: Heterogenous S-100B protein expression patterns in malignant melanoma and association to the serum protein levels. Oncology (Basel) elfogadva 16. Bánfalvi T, Boldizsár M, Gergye M, Gilde K, Kremmer T, Ottó Sz: Comparison of prognostic significance of serum 5-S-Cysteinyldopa, LDH and S-100B protein in Stage III-IV malignant melanoma. Pathol Oncol Res 2002;8/3:183-186 17. Bedikian AZ, Legha SS, Mavligit G: Treatment of uveal melanoma metastatic to the liver. Cancer 1995; 76:1665-1670 18. Benathan M: Modulation of 5-S-cysteinyldopa formation by tyrosinase activity and intracellular thiols in human melanoma cells. Melanoma Res 1996;6:183-189. 19. Benathan M, Labidi F: Cysteine dependent 5-S-CD formation and its regulation by glutathion
in
normal
and
epidermal
melanocytes.
Arch
Dermatol
Res
1996;288(11):697-702 20. Berking C, Schlupen EM, Schrader A, Atzpodien J, Volkenandt M: Tumor markers in peripherial blood of patients with malignant melanoma: multimarker RT- PCR versus
a
luminoimmonometric
assay
for
S-100.
Arch
Dermatol
Res
1999;291(9):479-484 21. Bigby
M:
The
sunscreen
and
melanoma
controversy.
Arch
Dermatol
1999;135(12):1526-1527, Comment: Arch Dermatol 2000;136(3):423 22.Blessing K, Sanders DS, Grant JJ: Comparison of immunohistochemical staining of the novel antibody melan-A with S-100 protein and HMB-45 in malignant melanoma and melanoma variants. Histopathol 1998;32:139-46
88
23. Bogdahn U, Apfel R, Hahn M, Gerlach M, Behl C, Hoppe J, Martin R: Autocrine tumor cell growth inhibiting activities from human malignant melanoma. Cancer Res 1989;49:5358-5363 24. Bonfrer JMG, Korse CM, Nieweg OE, Rankin EM: The luminescens iommunassay S100: a sensitive test to measure circulating S 100B: its prognostic value in malignant melanoma Br J Cancer 1998;77(12):2210-2214 25. Bonfrer, JMG, Korse CM: Monitoring malignant melanoma with the S-100B tumour marker. Recent Result in Cancer Res 2001;158:150-157 26. Bosserhoff A, Hein R, Bogdahn U, Buettner R: Structure and promoter analysis of the gene encoding the human melanoma inhibiting protein MIA. J Biol Chem 1996;5,271:4904- 95 27. Bosserhoff A, Kaufmann M, Kaluza B, Bartke I, Zirngibl H, Hein R, Stolz W, Buettner R: Melanoma inhibiting activity, a novel serum marker for progression of malignant melanoma. Cancer Res 1997; 57:3149-3153 28. Bosserhoff A, Dreau D, Hein R, Landtahler M, Holder WD, Buettner R: Melanoma inhibitory activity (MIA) a serological marker of malignant melanoma. Rec Res Cancer Res 2001;158: 158-168 29. Bosserhoff A, Echtenacher B, Hein R, Buettner R: Functional role of melanoma inhibitory avtivity in regulation and invasion and metastasis of malignant melanoma cells in vivo. Melanoma Res 2001;11,4:417- 421 30. Boyano MD, Garcia-Vazquez MD, Lopez-Michelena T, Gardeazaba T, Bilbao J, Canavante ML, Galdeano Ag, Izu R, Diaz-Ramon L, Raton K, Diaz- Perez JL: Soluble interleukin-2 receptor, intracellular adhesion molecule and interleukin- 10 serum levels in patients with melanoma. Br J Cancer 2000;83(7):847-852 31. Böni R, Burg G, Doguoglu A, Ilg EC, Schafer BW, Müller B, Heizmann CW: Immunhistochemical localization of the Ca binding S-100 proteins in normal human skin and melanocytic lesions. Br J Dermatol 1997;137:39-43 32. Breslow A: Measurement of tumor thickness. Hum. Pathol 1978;9:1238-239 33. Brochez L, Naeyaert JM: Serological markers for melanoma. Br J Drematol 2000;143:256-268
89
34. Brossart P, Keilholz U, Willhauck M, Scheibenbogen C, Mohler T, Hunstein W: Hematogenous spread of malignant melanoma cells in different stages of disease. J Invest Dermatol 1993;101:887-889 35. Buer J, Probst M, Franzke A: Elevated serum levels of S-100B and survival in metastatic malignant melanoma. Br J Cancer 1997;75:1373-76 36. Burton CR: Malignant melanoma in the year 2000. CA Cancer J Clin 2000;50:209213 37. Buzaid AC, Sandler AB, Hayden CL, Scinto J, Poo WJ, Clark MB, Hotchkiss S: Correlation between lipid associated sialic acid and tumor burden in melanoma. Int J Biol Mar 1994;9,4:247-250 38. Campora E, Repetto l, Giuntini P: LDH in the follow up of stage I malignant melanoma. Eur J Cancer Clin Oncol 1988;2:277-288 39. Clark WH Jr, From L, Bernardino EA, Mihm MC: The histogenesis and biologic behaviour of primary human malignant melanomas of the skin. Cancer Res 1991;29:705- 726 40. Clarkson KS, Sturdgess IC, Molyneux AJ: The usefulness of tyrosinase in the immunohistochemical assessment of melanocytic lesions: a comparison of the novel T311antibody (antityrosinase) with S-100, HMB 45, and A103 (anti-melan A). J Clin Pathol 2001;54:196-200 41. Cho
KH,
Hashimoto
K,
Taniguchi
J,
Pietruk
T,
Zarbo
R,
An
T:
Immunhistochemical study of melanocytic nevus and malignant melanoma with monoclonal antibodies against S-100 subunits. Cancer 1990;66:765-771 42. Cochran AJ, Wen DR: S-100 protein as a marker for melanocytic and other tumours. Pathology 1985;17(2):340-345 43. Cochran A., Wen D, Herschman H, Gaynor R: Detection of S-100 protein as an aid to the identification of melanocytic tumours. Int J Cancer 1982;30:295-297 44. Cooper EH: Neuron-specific enolase. Int J Biol Markers 1994;9,4:205-210 45. Curry BJ, Farrelly M, Hersey P: Evaluation of S-100B assay for the prediction of recurrence and prognosis in patients with AJCC stage I-III melanoma. Mel Res 1999;9:557-567
90
46. Deichmann M, Benner A, Bock M, Jackel A, Uhl K, Waldmann V, Naher H: S100beta, MIA, LDH discriminate progressive from nonprogressive AJCC on Cancer Stage IV melanoma. J Clin Oncol 1999;17:1891-1896 47. Deichmann M, Benner A, Kuner N, Wacker J, Waldmann V, Naher H: Are responses to therapy of metastatized melanoma reflected by decreasing serum values of S-100 beta or MIA? Melanoma Res 2001;11:291-296 48. De Vit Pej, van Muijen GNP, de Vaal RMW: Pathology of malignant melanoma, including new markers and techniques in diagnosis and prognosis. Curr Op Oncol 1996;8:143-151. 49. Diepgen TL, Mahler V: The epidemiology of skin cancer. Br J Dermatol 2002;146 Suppl 61:1-6 50. Djukanovic D, Hofmann U, Sucker A, Rittgen W, Schadendorf D: Comparison of S-100 protein and MIA protein as serum markers in malignant melanoma. Anticancer Res 2000;20:2203- 2207 51. Döme B, Somlai B, Tamásy A, Péter L, Tóvári J, Horváth A, Tímár J: A cutan melanoma prognózisa és inváziós marker expressziója. Metasztázis asszociált gének. Orv hetilap 1999;140:235-240 52. Dummer W, Becker JC, Schwaaf A, Leverkus M, Moll T, Bröcker EB: Elevated serum levels of interleukin 10 in patients with metastatic malignant melanoma. Melanoma Res 1995;5:67-68 53. Duray PH, Palazzo J, Gown AM, Ohuchi N: Melanoma cell heterogeneity. A study of two monoclonal antibody compared with S-100 protein in paraffin sections. Cancer 1988;15:61(12):2460-2468 54. Einhorn LH, Burgess MA, Vallejos C: Prognostic correlations and response to treatment in advanced melanoma. Cancer Res 1974;34:1997-2004 55. Eng W, Tschen JA: Comparison of S-100 versus hematoxylin and eosin staining in evaluating dermal invasion and peripheral margins by desmoplastic malignant melanoma. Am J Dermatopathol 2000;22(1):26-29 56. Eton O, Legha S, Moon T, Buzaid AC, Papadopoulos NE, Plager C, Burgess A, Bedikian A, Ring S, Dong Q, Glassman A, Balch C, Benjamin R: Prognostic factors for survival of patients treated systemically for disseminated melanoma. J Clin Oncol 1998;16:1103-1111
91
57. Fagnart O, Sindic Ch, Laterre Ch: Particle counting immunoassay of S-100 protein in serum. Possible relevance in tumors and ischemic disorders of the central nervous system. Clin Chem 1988;34/7:1387-1391 58. Finck SJ, Giuliano AE, Morton DL: LDH and melanoma. Cancer 1983;51(5):840843 59. Flügge G, Rassner G: Darstellung von S-100 Protein in malignen melanomen der Haut. Hautarzt 1989; 40:290-295 60. Franzke A, Probst-kepper M, Buer J, Duensing S, Hoffmann R, Wittke F, Volkenandt M, Ganser A, Atzpodien J: Elevated pretreatment serum levels of soluble vascular cell adhesion molecule 1 and lactate dehydrogenase as predictors of survival in cutaneous metastatic malignant melanoma. Br J Cancer 1998;78(1):40-45 61. Gaynor R, Irie R, Morton D, Herschmann H: S-100 protein is present in cultured human malignant melanomas. Nature 1980;286:400-401 62. Ghanem G, Lienard D, Hanson P, Lejeune F, Frühling J: Increased serum alpha melanocyte stimulating hormone in human malignant melanoma. Eur J Cancer Clin Oncol 1986;22,4:535- 536 63. Ghanem G, Loir B, Morandini R, Sales F, Lieneard D, Eggermont A, Lejeune F: On the release and half life of serum S-100B protein in the peripherial blood of melanoma patients. Int J Cancer 2001;94(4): 586- 590 64. Gilde K, Terstyánszki E, Somlai B, Pulay T: Szérum lipidhez kötött sziálsav mérések melanomás gondozott betegeken. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 69:14:419-423 65. Guo HB, Stoffel- Wagner B, Bierwirth T, Mezger J, Klingmuller D: Clinical significance of serum S-100 in metastatic malignant melanoma. Eur J Cancer 1995;31A:1898-902 66. Hagen EC, Vennegoor C, Schlingemann RO, Van der Velde EA, Ruiter DJ: Correlation of histopathological characteristics with staining patterns in human melanoma assessed by monoclonal antibodies reactive on paraffin sections. Histopathology 1986;10:689-7000 67. Hansson C, Edholm L, Agrup G, Rorsman H, Rosengren AM, Rosengren E: The quantitative determination of 5-S-cysteinyl-dopa and dopa in normal serum and in
92
urine from patients with malignant melanoma by means of high performance liquid chromatography. Clin Chim Acta 1978;88,419-21 68. Hanson LO, Schoultz E, Djureen E, Hansson J, Nilsson B, Ringborg U: Prognostic value of serum S-100 protein b in malignant melanoma. Anticancer Res 1997;17: 3071-3074. 69. Hasegawa M, Takata M, Hatta N, Wakamatsu K, Ito S, Takehara K: Simultaneous measurement of serum 5-S-cysteinyldopa, circulating intercellular adhesion molecule-1 and soluble interleukin-2 receptor levels in Japanese patients with malignant melanoma. Melanoma Res 1997;7:243-251. 70. Hasegawa K, Inoue S, Wakamatsu K, Ito S, Fujita K, Ishihara K: Changes in plasma 5-S-CD concentration in B16 melanoma-bearing mice treated with interferon-beta or dacarbazine. Melanoma Res 1993;3(5):377-380 71. Hau P, Apfel R, Wiese P, Tschertner I, Blesch A, Bogdahn U: Melanoma inhibiting activity (MIA/CD-RAP) is expressed in a variety of malignant tumors of mainly neuroectodermal origin. Anticancer Res 2002; 22(2A):577- 583 72.Hauschield A: The use of serological tumor markers for malignant melanoma. Onkologie 1997;20:462-465 73. Hauschield A, Engel G, Brenner W, Glaser R, Monig H, Henze E, Christophers E: S-100B protein detection in serum is a significant prognostic factor in metastatic melanoma. Oncology 1999;56: 338-344 74. Hauschield A, Engel G, Brenner W, Glaser R, Monig H, Henze E, Christophers E: Predictive value of serum S 100B for monitoring patients with metastatic melanoma during chemoterapy and/or immunotherapy. Br J Dermatol 1999;140(6):1065-1071 75. Hauschield A, Michaelsen J, Brenner W, Rudolph P, Glaser R, Henz l, Christophers E: Prognostic significance of serum S- 100 detection compared to routin blood parameters in advanced metastatic melanoma patients. Melanoma Res 1999; 9, 155161 76. Heimdal K, Hannisdal E, Gunderson S: Metastatic malignant melanoma. Eur J Cancer 1989;25:1219-1223 77. Heizmann CW, Fritz G, Schafer BW: S-100 proteins: structure, functions and pathology. Front Biosci 2002;1(7):1356-1368
93
78. Henze G, Dummer R, Joller-Jemelka HI, Böni R, Burg G: Serum S-100 a marker for disease monitoring in metastatic melanoma. Dermatology 1997;194:208- 212 79. Hill BR, Levi C: Elevation of serum component in neoplastic disease. Cancer 1954;14:513- 515 80. Hirai S, Kageshita T, Kimura T, Tsujisaki M, Imai K, Wakamatsu K, Ito S, Ono T: Serum levels of s-ICAM, and 5-S-cysteinyldopa as markers of melanoma progression. Melanoma Res 1997;7:58-62 81. Horikoshi T, Ito S, Wakamatsu K, Onodera H, Eguchi H: Evaluation of melaninrelated metabolites as markers of melanoma progression. Cancer 1994;73:629-636 82. Horikoshi T, Ito S: Serum 5-S- CD as a marker of melanoma progression. J Dermatol 1992;19:809-813 83. Hornef S, Lux J, Ressner G: Neuronen spezifische Enolasen: ein geeigneter Tumormarker des Malignen Melanomes. Hautarzt 1992;43:77-78 84. Hu F, Woodward Wr, Peterson L: Plasma 5- S-CD correlates with tumour size in melanoma-bearing mice. Invest Dermatol 1988;90:149-151 85. Hunzelmann N, Kurschat P, Hani N, Jarisch A, Mauch C: Applicability of reference values for the determination of serum S-100B protein as a marker of malignant melanoma in children. Br J Dermatol 2002;146,3:536-539 86. Inoue S, Hasegawa K, Ito S, Ozeki H, Solano F, Jimenez-Cervantes C, Wakamatsu K, Fujita K: Antimelanoma effect of 4-S-cysteaminylcatechol, an activated form of 4-S- cyteaminylphenol. Cancer Res 1995;55:2603- 2607 87. Isobe T, Okuyama T: The amino acid sequence of S- 100 protein and its relation to the calcium binding proteins. Eur J Biochem 1978;89:379-388 88. Ito S, Kato T, Maruta K, Fujita K: Determination of DOPA, dopamine and 5-S-CD in plasma, urine and tissue samples by high performance liquid chromatography with electrochemical detection. J Chromatogr 1984;311:154-159 89. Ito S, Wakamatsu K, Inoue S, Fujita K: Correlation between urinary melanin related metabolites and tumour weight in melanoma-bearing mice. Acta Derm Venereol 1989;69(5):380-384 90. Ito S: Melanin related metabolites as markers of melanoma: a review. J Dermatol 1992;19:802- 805
94
91. Jackal A, Diechman M, Waldmann V: S-100B protein in serum a tumor marker in malignant melanoma-current state of knowledge and clinical experiences. Hautarzt 1999;50:250- 256 92. Jury CS, Mcalister EJ, Mackie RM: Rising levels of serum S-100 protein precede other evidence of disease progression in patients with malignant melanoma. Br J Dermatol 2000;143:269-274 93. Kagedal B, Petersson A: Determination of urinary 5-S-CD by high performance liquid chromatography. J Chromatogr 1983;11:272(2):287-297 94. Khansur T, Sandders J, Das SK: Evaluation of staging workup in malignant melanoma. Arch Surg 1989; 24:847-849 95. Karnell R, Kagedal B., Lindholm C, Nilsson B, Arstrand K, Ringborn M: The value of cysteinyldopa in the follow up of disseminated malignant melanoma. Melanoma Res 2000;Aug 10(4):363-369 96. Karnell R, von Schoultz E, Hansson LO, Nilsson B, Arstrand K, Kagedal B: S-100B protein, 5-S-CD and 6-H-5-MI-2-carboxylic acid as biochemical markers for survival, prognosis in patients with malignant melanoma. Melanoma Res 1997;7(5):393-399 97. Kaskel P, Berking C, Sander S: S-100B protein in peripherial blood: a marker for melanoma metastases: a prospective 2-center study of 570 patients with malignant melanoma. J Am Acad Dermatol 1999;41:962-969 98. Keilholz U, Martus P, Punt CJ, Kruit W, Mooser G, Schadendorf L, Lienard D, Dummer R, Koller J, Voit C, Eggermont AM: Prognostic factors for survival with long term remission in patients with advanced melanoma receiving cytokine-based treatments. Eur J Cancer 2002;38(11):1501-1511 99. Kelley MC, Gupta RK, Hsuec EC, Yee R, Stern S, Morton DL: Tumor associated TA 90 immun complex assay predicts recurrence and survival after surgical treatment of stage I-II melanoma. J Clin Oncol 2001;15,19(4):1176-1182 100. Kernohan NM, Rankin R: S-100 protein: a prognostic indicator in cutaneous malignant melanoma? Histopathology 1987;11,1285-1293 101. Koehler M, Bosserhoff A, von Beust G, Bauer A, Blesch A, Buettner R, Schlegel J, Bogdahn U, Schmied M: Assignment of the human melanoma inhibitoring activity
95
gene (MIA) to 19q13.4 by fluorescence in situ hybridization (FISH). Genomics 1996;35: 265-267 102. Kovács L, Szende B, Elek G, Lapis K.: Working experience with a new vacumaccelerated m icrovawe histoprocessor. J Pathol 1996;180:106-110. 103. Krahn G, Kaskel P, Sander S, Waizenhofer P, Wortmann S, Letier RU: S-100 beta is a more reliable tumor marker in peripherial blood of patients with newly occured melanoma metastases comparing to MIA, albumin and lactat dehydrogenase Anticancer Res 2001;21:1311- 1316 104. Lane H, Oloughlin S, Powel F, Magee H, Darvan PA: Quantitative immunohistochemical evaluation of lentigo maligna and pigmented solar keratosis. J Cutaneuos Pathology 1993;100,6:681-685 105. Liotta LA, Schiffmann E: Tumor motility factor. Cancer Surveys 1988;7:631-652 106. Liotta LA, Mandel R, Murano G: Tumor cell autocrin motility factor. PNAS 1986;83:3302-3306 107. Liu J, Jimbow K: Development and characterization of a murine monoclonal antibody against phaeomelanin and its precursors 5-S-cysteinydopa. Melanoma Res 1993;3(6):463-469 108. Lorenz J, Dippold W: Neuron specific enolase: a marker for malignant melanoma. J Natl Cancer Inst 1989;881:1754-1755 109. Manola J, Atkins M, Ibrahim J, Kirkwood J: Prognostic factors in metastatic melanoma: a pooled analysis of Eastern Cooperative Oncology Group trials. J Clin Oncol 2000;18,22:3782-3793 110. Marks R: The changing incidence and mortality of melanoma in Australia. Rec Res Cancer Res 2002;160:113-121 111. Maruyama K, Watanabe H, Shiozaki H: Expression of autocrin motility factor receptor in human esophageal squamous cell carcinoma. Int J Cancer 1995;64:316321 112. Martenson ED, Hansson LO, Nilsson B: Serum S 100b protein as prognostic marker in malignant cuteneous melanoma. J Clin Oncol 2001;19,824-831 113. Meral R, Duranyildiz D, Tas F, Camlica H, Yasasever V, Kurul S, Dalay N: Prognostic significance of melanoma inhibiting activity levels in malignant melanoma. Melanoma Res 2001;11(6):627-632
96
114. Meyerhoffer S, Lindberg Z, Hager A, Kagedal B, Rosdahl I: Urinary excretion of 5-S-cysteinyldopa and 6-hydroxy- 5-methoxyindole-2-carboxylic acid in children. Acta Derm Venereol 1998;78:31-35. 115. Miliotes G, Lyman GH, Cruse CW, Puleo C, Albertini, Rapaport D: Evaluation of new putative tumour markers for melanoma. Ann Surg Oncol 1996;3:558- 563. 116. Mohammed MQ, Abraha HD, Sherwood RA, Macrae K, Retsas S: Serum S100beta protein as a marker of disease activity in patients with malignant melanoma. Med Oncol 2001;18(2):109-120 117. Mojamdar M, Ichihashi M, Mishima Y: Gamma glutamyl transpeptidase, tyrosinase and 5-S-CD production in melanoma cells. J Invest Dermatol 1983;81(2):119-121 118. Molina R, Navarro J, Fiella X, Castel T, Ballesta AM: S-100 protein serum levels in patients with benign and malignant diseases: fals positive results related to liver and renal function. Tumour Biol 2002;23(1):39-44 119. Moore BW, McGregor T: Chromatorgaphic and electrophoretic fractination of soluble proteins of brain and liver. J Biol Chem 1965;240:1647-1653 120. Mouawad R, Benhammouda A, Rixe O, Antoine EC, Borel C, Weil M: Endogenous interleukin 6 levels in patients with metastatic malignant melanoma: correlation with tumour burden. Clin Cancer Res 1996;2:1405-1409 121. Mühlbauer M, Langenbach N, Stolz W, Hein R, Landtahler M, Bu ettner R: Detection of melanoma cells in the blood of melanoma patients by melanomainhibiting activity (MIA) reverse transcription-PCR. Clin Cancer Res 1999;5:10991105 122.Nabi IR, Watanabe H, Raz A: Identification of the B16a-F1 melanoma autocrin motility factor receptor. Cancer Res 1990;50:409-414 123.Nakajima T, Watanabe S, Sato Y, Kameya T, Shimosato Y, Ishihar T: Immunohistochemical demonstration of S-100 protein in malignant melanoma and pigmented nevus and its diagnostic application. Cancer 1982;50(5):912-918 124. Nakajima T, Watanabe S, Sato Y, Kameya T, Shimosato Y, Hirota T: An immunoperoxidase study of S- 100 protein distribution in normal and neoplastic tissues. Am J Surg Pathol 1982;6:715-727
97
125. Nakamori A, Watanabe H, Kameyama M: Expression of autocrin motility factor receptor in colorectal cancer as a predictor for disease recurrence. Cancer 1994;74:1855-62 126. Nemunaitis J, Fong T, Shabe P, Martineau D, Ando D: Comparison of serum interleukin 10 (IL-10) levels between normal volunteers and patients with advanced melanoma. Cancer Invest 2001;19(3):239-247 127. Nimmo JE, Grawkrodger DJ, O’Docherty CS, Going SM, Percy-Robb IW, Hunter JA: Plasma 5-S-CD as an index of melanogenesis. Br J Dermatol 1988;118(4):487495 128. Oláh J, Dobozy A: A melanoma malignum új TNM beosztása. Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 2002;78,2:49-50 129. Orchard GE: Comparison of immunohistochemical labelling of melanocyte differentation antibodies melan-A, tyrosinase and HMB 45 with NKIC3 and S-100 protein in evaluation of benign naevi and malignant melanoma. The Histochemical Journal 2000;32:475-481 130. Orosz Zs: Melan-A/Mart 1 expression in various melanocytic lesions and in nonmelanocytic soft tissue tumours. Histopathology 1999;6:517-525 131. Otto T, Birchmeier W, Schmidt U: Inverse relation of E-cadherin and autocrin motility factor receptor expression as prognostic factor in patients with bladder carcinomas. Cancer Res 1994;54:3120-3123 132. Ottó Sz., Kásler M: Rákmortalitás és incidencia hazánkban, az európai adatok tükrében. Magyar Onkológia 2002;46/2:111-118 133. Peterson L, Woodward W, Fletcher W, Palmquist M, Tucker M, Ilias A: Plasma 5S-cysteinyldopa differentiates patients with primary and metastatic melanoma from patients with dysplastic nevus syndrome and normal subjects. J Am Acad Dermatol 1988;19:509- 515 134. Prinz RA, Marangos PJ: Use of neuron specific enolase as serum marker for neuroendocrin neoplasms. Surgery 1982;97:887-889 135. Proebstle TM, Jiang W, Hogel J, Keilhloz U, Weber L, Voit C: Correlation of positive RT-PCR for tyrosinase in peripherial blood of malignant melanoma patients with clinical stage, survival, and other risk factors. Br J Cancer 2000;82(1):118-123
98
136. Prota G: Regulatory mechanism in melanogenesis. J Invest Dermatol 1993;100:156S-161S 137. Quereux G, Denis M, Khammari A, Lustenberger P, Dreno B: Prognostic value of tyrosinase reverse transciptase polymerase chaine reaction in metastatic melanoma. Dermatology 2001;203(3):221-225 138. Reinhold U, Ludtke- Handjery HC, Schnautz S, Kreysel HW, Abken H: The analysis of tyrosinase specific mRNA in blood samples of melanoma patients by RT-PCR is not useful test for metastatic tumor progression. J Invest Dermatol 1997;108:166-169 139. Reintgen DS, Cruse CW, Wells KE, Saba HI, Fabri PJ: The evaluation of putative tumor markers for malignant melanoma. Ann Plast Surg 1992;28:55-59 140. Rigel DS, Carucci JA: Malignant melanoma. Prevention, early detection and treatment in the 21 century. Ca Cancer J Clin 2000;50:215-223a 141. Riley PA: Melanogenesis: realistic target for antimelanoma therapy. Eur J Cancer 1991:27:1172- 1177 142. Rorsman H, Rosengreen AM, Rosengren E: A sensitive method for determination of 5- S- CD. Acta Dermatovener(Stockholm) 1973;53: 248-251 143. Ros-Bullon MR, Sanchez-Pedreno P, Martinez Liarte JH: Serum sialic acid in malignant melanoma patients an ROC analysis Anticancer Res 1999;19:3619-22 144. Ros-BullonMR, Sanchez Pedreno P, Martinez Liarte JH: Serum zinc levels are incerased in melanoma patients. Melanoma Research 1998;8(3):273-277 145. Ros-BullonMR, Sanchez Pedreno P, Martinez Liarte JH: Serum ceruloplasmin in melanoma patients. Anticancer Res 2001;21(1B):629-932 146. Sasaki Y, Shimizu H, Naka W, Takeshita E, Nishikawa T: Evaluation of the clinical usefulness of measuring urinary excretion of 5-S-cysteinyldopa in melanoma: ten years experience of 50 patients. Acta Derm Venerol 1998;77:379381. 147. Schadendorf D, Diehl S, Zuberbier T, Schadendorf C, Henz BM: Quantitative detection of soluble adhesion molecules in sera of melanoma patients correlates with clinical stage. Dermatology 1996;192:89-93 148. Schafer BW, Wicki R, EngelkampD, Mattei MG, Heizmann CW: Isolation of a YAC clone covering a cluster of nine S- 100 genes on a human chromosome 1q21
99
rationale for a new nomenclature of the S-100 calcium binding protein family. Genomics;25:638-643 149. Scheibenbogen C, Möhler T, Haefele J, Hunstein W, Keilholz U: Serum interleukin 8 is elevated in patients with metastatic malignant melanoma. Melanoma Res 1995;5:179-181 150. Shimizu K, Tani M, Watanabe H: The autocrin motility factor receptor gene encodes a novel type of seven transmembrane protein. FEBS 1999;456:295-300 151. Schlagenhauff B, Schittek B, Ellwanger U: Significance of serum protein S-100 levels in screening for metastasis: does protein S-100 enable early detection of melanoma recurrence? Melanoma Research 2000;10: 451-459 152. Schmitz C, Brenner W, Henze E, Christophers E, Hauschlied A: Comparative study on the clinical use of protein S-100B and MIA in melanoma patients. Anticancer Res 2000;20:5059- 63 153. Schoultz E, Hansson LO, Djureen E, Hansson J, Karnell R, Nilsson B, Stigbrand T, Ringborg U: Prognostic value of serum analyses of S 100 B protein in malignant melanoma. Melanoma Research 1996;6:133-137 154. Schultz ES, Diepgen TL, von den Dresch P: Clinical prognostic relevance of serum S-100b protein in malignant melanoma. Br J Dermatol 1998;38:426-430 155. Seregeni E, Massaron S, Martinetti A: S- 100 protein serum levels in cutaneous malignant melanoma. Oncol.Rep. 1998;5(3):601-604 156. Silletti S, Paku S, Raz A: Tumor cell motility and metastasis. Pathol Oncol Res 1997;3:230-254 157. Sir ott MN, Bajorin DF, Wong GYN: Prognostic factors in patients with metastatic malignant melanoma. Cancer 1993;72:3091-3098 158. Smith B, Selby P, Southgate J, Pittman K, Bradley C, Blair GE: Detection of melanoma cells in peripherial blood by means of reverse transcriptase and polymerase chain reaction. Lancet 1991;338:1227- 1229 159. Sonneson B, Eide S, Ringborg U, Rorsman H, Rosengren E: Tyrosinase activity in the serum of patients with malignant melanoma. Melanoma Res 1995;5:113-116 160. Stahlecker J, Gauger A, Boss A, Buttner R, Ring J, Heim R: MIA as a reliable tumor marker in the serum of patients with malignant melanoma. Anticancer Res 2000;20:5041-5044
100
161. Steiner U.: Melanocytes, moles and melanoma - a study on UV effects. Acta Derm Venereol Suppl (Stockholm) 1991;168:1-31 162. Stiener U, Rosdahl I, Augustson A, Kagedal B: Urinary excretion of 5-S-CD in relation to skin type, UVB induced erythema and melanocyta proliferation in human skin. J Invest Dermatol 1988;91:506-510 163. Suenaga Y, Katabuchi H, Okamura H, Kageshita T, Tomomochi O: Increased serum levels of 5-S-CD and intracellular adhesion molecule-1 in patient with uterine amelanotic metastasis from primary vaginal malignant melanoma. Gynecologic Oncology 1999;72,107-110 164. Takashi H, Horikoshi T, Wakamatsu K, Ito S, Parsons PG: Alteration of melanoma melanogenesis by phenotypic modifiers. J Dermatol 1992;19(11):814- 817 165. Tegner E, Rorsman H, Rosengren E: 5-S-Cysteinyldopa and pigment response to UVA light. Acta Dermatovener 1983;63:21 166. Tegner E, Agrup G, Rosengren E: The effect of UVB light on serum concentrations of 5-S-CD. Acta Derm Venereol 1982;63:149-152 167. Tímár J, Rásó E, Döme B, Ladányi A, Bánfalvi T, Gilde K, Raz A: Expression and function of the AMF receptor by human melanoma in experimental and clinical systems. Clin Exp Metastasis 2002;19(3):225-232 168. Tímár J, Csuka O, Orosz Zs, Jeney A, Kopper L: Molecular Pathology of tumor metastasis. Pathol Oncol Res 2002;8/3:204-216 169. Tofani A, Cioffi P, Sciuto R, Rea S, Festa A, Di Filippo F, Cavaliere R, Maini C: S-100 and NSE as serum markers in melanoma. Acta Oncologica 1997;36:761-767 170. Tronnier M, Missler U, Grotrian K, Kock N: Does ultraviolet radiation exposure influence S-100B protein plasma levels? Br J Dermatol 1998;138(6):1098-1102 171. Tsao H, Nadiminti U, Sober A, Bigby M: A meta- analysis of RT-PCR for tyrosinase mRNA as a marker for circulating tumor cells in cutaneuos melanoma. Arch Dermatol 2001;137:325-330 172. Viac J, Misery L, Schmitt D, Claudy A: Follow up of circulating ICAM-1 in malignant melanoma. Br J Dermatol 1996;134:604-605 173. Vuoristo MS, Laine S, Huhtala H, Parvinen LM, Hahka-Kemppinen M, Korpela M, Kumpulainen E,, Kellokumpu-Lehtinen P: Serum adhesion molecules and
101
interleukin-2 receptor as marker of tumor load and prognosis in advanced cutaneous melanoma. Eur J Cancer 2001;37(13):1629-1634 174. Vuoristo MS, Kellokumpu-Lehtinen P, Parvinen LM, Hahka-Kemppinen M, Korpela M, Kumpulainen E, Laine S: Serum matrix metalloproteinase-2 as a prognostic marker in advanced cutaneous melanoma. Acta Oncol 2000;39(7):877879 175. Vuoristo MS, Kellokompu-Lehtinen P, Laine S, Parvinen LM, Hahka-Kemppinen M, Korpela M, Kumpulainen E: The value of serum S-100B and interleukins as tumor markers in advanced melanoma. Melanoma Research 2000;10:237-241 176. Wakamatsu K, Ito S, Fujita K: Production, circulation and excretion of melanin related metabolites in B-16 melanoma-bearing mice. Acta Derm Venereol 1990;70(5):367-372 177. Wakamatsu K, Ito S: Seasonal variations in serum concentration of 5-Scysteinyldopa and 6-hydroxy-5-methoxyindole-2-carboxyl acid in healthy Japanese. Pigment Cell Res 1995;8:132-134. 178. Wakamatsu K, Ito S,Horikoshi T: Normal values of urinary excretion and serum concentration of 5-S-CD and 6-H-5MI- 2-carboxyl acid, biochemical markers of melanoma progression. Melanoma Res 1991;1(2):141-147 179. Watanabe H, Takehana K, Date M: Tumor cell autocrine motility factor is the neuroleukin/phosphohexose isomerase polypeptide. Cancer Res 1996;56:2960-2963 180. Westerdahl J, Ingvar C, Masback A: Sunscreen use and malignant melanoma. Int J Canc er 2000;87(1):145-150 181. Westerhof W, Pavel S, Kammeyer A, Beusenberg F, Cormane R: Melanin releated metabolites as markers of skin pigmentary system. J Invest Dermatol 1987;89,1:7881 182. Wibe E, Hannisdale E, Paus E, Aamdal S: Neuron specific enolase as prognostic factor in metastatic malignant melanoma. Eur J Cancer 1992;28A:1692-1695 183. Winzler RJ: Determinations of serum glycoproteins methods. Biochem Anal 1958,2:279-311 184. Wimmer I, Meyer CJ, Seifert B, Dummer R, Flace A, Burg G: Prognostic value of serum 5-S-cysteinyldopa for monitoring human metastatic melanoma during immunochemoterapy. Cancer Res 1997;57:5073-5076.
102
185. Wollina U, Hipler UC, Knoll B, Graefe T, Kaatz M, Kirsch K: Serum matrix metalloproteinase-2 in patients with malignant melanoma. J Cancer Res Clin Oncol 2001;127(10): 631-635a 186. Wollina U, Karte K, Hipler U: Serum protein S-100b in patients with malignant melanoma detected by an immunoluminometric assay. J Cancer Res Clin Oncol 2000;126:107-110
103
VIII. Az értekezéssel kapcsolatos közlemények 1. Bánf alvi T, Bezzegh A, Édesné Boldizsár M, Fejos Zs, Liszkay G, Schumann B, Kremmer T, Ottó Sz, Gilde K: S-100B protein és 5-S-ciszteinil-DOPA vizsgálata melanomás betegeken Orvosi Hetilap 1999;140,11,599-603 2. Bánfalvi T, Gilde K, Boldizsár M, Kremmer T, Ottó Sz: Serum levels of S-100B protein and 5-S-cysteinyldopa as markers of melanoma progression Pathology Oncology Research 1999;5,3,218-223 3. Bánfalvi T, Gilde K, Bezzegh A, Schumann B, Fejos Zs, Liszkay G, Ottó Sz.: Clinical significance of S-100B protein assay in malignant melanoma Journal of Tumor Marker Oncology 1999;14,4,5-12
IF: 0,326
4. Bánfalvi T, Gilde K, Édesné Boldizsár M, Fejos Zs, Horváth B, Liszkay G, Beczássy
E, Kremmer T:
Serum concentration of 5-S-cysteinyldopa in patients with melanoma Eur J Clin Invest 2000;30,900-904
IF: 2,071
5. Bánfalvi T, Gilde K, Édesné Boldizsár M, Gergye M, Kremmer T: Clinical significance of 5-S-CD monitoring in patients with malignant melanoma Neoplasma 2002;49,2,121-124
IF: 0,637
6. Bánfalvi T, Udvarhelyi N, Orosz Zs, Beczássy E, Gilde K, Tímár J.: Heterogenous S-100B protein expression patterns in malignant melanoma and association to the serum protein levels Oncology (Basel) – elfogadva
IF: 3,009
7. Bánfalvi T, Gilde K, Gergye M, Édesné Boldizsár M, Kremmer T, Ottó Sz.: Use of serum 5-S-CD and S-100B protein levels to monitor the clinical course of malignant melanoma European Journal of Cancer – 2003,39,164-169
3,460
8. Bánfalvi T, Boldizsár M, Gergye M, Gilde K, Kremmer T, Ottó Sz: Comparison of prognostic significance of LDH, serum 5-S-Cysteinyldopa and S100B
protein in Stage III-IV malignant melanoma
Pathology Oncology Research 2002,
104
9. Tímár J, Rásó E, Döme B, Ladányi A, Bánfalvi T, Gilde K, Raz A.: Expression and function of the AMF receptor by human melanoma in experimental and clinical systems Clin Exp Metastasis 2002, 19(3): 225-232
IF: 1,9
Az értekezéssel kapcsolatos eloadás és poszter 1. Bánfalvi T, Bezzegh A, Édesné Boldizsár M, Fejos Zs, Liszkay G, Schumann B, Kremmer T, Ottó Sz, Gilde K.: Tumormarker vizsgálatok melanoma malignumban Ifjú Dermatológusok Fóruma, Melanoma Symposium Kecskemét, 1998. április 2. Bánfalvi T, Fejos Zs, Liszkay G, Gilde K: Tapasztalataink S-100B proteinnel melanoma malignumban Magyar Dermatológiai Társulat Nagygyulése Budapest, 1998. december 11-12 3. Bánfalvi T, Gilde K, Schumann B, Liszkay G, Fejos Zs.: Serum S-100 Protein in Patients with Malignant Melanoma VII International Symposium on Biology and Clinical Usefullness of Tumor Markers Barcelona, 1999. február 3-6 4. Boldizsár M, Kremmer T, Bánfalvi T, Bezzegh A, Gilde K: Comparative Studies on Melanoma Markers 16th International Conference on Human Tumor Markers of IATMO Budapest, 1999. jún 13- 16 Journal of Tumor Marker Oncology 1999; 14:2:60 5. Bánfalvi T, Gilde K, Fejos Zs, Liszkay G: Measurement of tumor marker S-100 protein in sera of patients with malignant melanoma 16th International Conference on Human Tumor Markers of IATMO Budapest, 1999. jún 13- 16
105
Journal of Tumor Marker Oncology 1999; 14:2:48 6. Horváth B, Bánfalvi T, Boldizsár M, Schumann B Kremmer T, Gilde K: Correlation between the tumor mass and the S-100 protein and serum 5-S-CD levels in melanoma 16th International Conference on Human Tumor Markers of IATMO Budapest, 1999. jún 13- 16 Journal of Tumor Marker Oncology 1999; 14:2:48 7. Bánfalvi T, Boldizsár M, Kremmer T, Horváth B, Gilde K.: Serum 5-S-CD determination in patients with malignant melanoma The 27th Meeting of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine, ISOBM. Kyoto, Japan, 1999. october 31 - november 4 Tumor Biology 1999;20,S2:46 8. Édesné Boldizsár M, Kremmer T, Gilde K, Bánfalvi T, Tulok I.: 5-S-cysteinyldopa meghatározás melanomás betegek szerumában Magyar Onkológusok Társaságának 22. kongresszusa Magyar Onkológia 1997;41,244 9. Bánfalvi T, Gilde K, Fejos Zs, Liszkay G, Beczássy E.: S-100 beta monitoring in patients suffering from malignant melanoma 17th International Conference on Human Tumor Markers of IATMO Honkong, 2000. Journal of Tumor Marker Oncology 2000;15,1,49-50 10. Bánfalvi T, Udvarhelyi N, Orosz Zs, Beczássy E, Gilde K, Tímár J.: Serum concentration and tumoral expression of S-100B protein in patients with malignant melanoma 5-th World Melanoma Congress Velence, 2001. február 28 - márc 3 Melanoma Research 2001; 11, S 77 11. Bánfalvi T., Gilde K., Édesné B. M., Gergye M., Kremmer T., Ottó Sz.: Monitoring malignant melanoma with serum S 100B protein and 5-S-cysteinyldopa EADV Congress Bécs, 2001. szeptember 27-29 Zeitschrift für Hautkrankheiten 2001;76,526
106
12. Bánfalvi T, Édesné B. M, Gergye M, Horváth B, Fejos Zs, Liszkay G, Kremmer T, Gilde K, Ottó Sz.: Szérum marker vizsgálatok jelentosége melanoma malignumban Borgyógyászati Társulat Nagygyulése Budapest, 2001. december 13-15 13. Bánfalvi T., Édesné B. M., Gergye M., Horváth B., Fejos Zs, Liszkay G., Kremmer T., Gilde K., Ottó Sz: 5-S-CD és S 100 protein monitorozás melanoma malignumban Magyar Onkológusok Társaságának 24. kongresszusa Budapest, 2001. november 22-24 Magyar Onkológia 2001;45/3, 250 14. Tímár J, Bánfalvi T, Udvarhelyi N,Orosz Zs, Gergye M, Gilde K : Heterogeneity of the S-100B phenotype of primary malignant melanoma and the circulating protein levels in UICC stage I-III patients XXIVth International Congress of the International Academy of Pathology Amsterdam, 2002, okt. 5-10. Histopathology 2002;41(S), 46
107
IX. Egyéb közlemények:
1. Kapocsi J, Bánfalvi T, Juhász I, Farsang Cs.: Prazosin részlegesen gátolja az intravenasan adott clonidin antihipertenzív hatását Magyar Belorvosi Archívum 1982, 5, 123-124 2. Gubacs G, Nagy Á, Bodrogközi Cs, Bánfalvi T, Pálvölgyi I.: Dermatological Experience with Naksol Therapia Hungarica 1985, 1, 45-54 3. Marschalkó M, Bánfalvi T. : Klinikai tapasztalatok EAC kórban Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 1990, 66, 178-185 4. Bánfalvi T, Gonda G, Kiskoszegi A.: Szinkron multiplex melanoma Magyar Onkológia 1991, 35, l53-l6l 5. Bánfalvi T, Sápi Z, Kiskoszegi A.: Spinaliomás betegeink kezelése-gondozása kapcsán szerzett tapasztalataink Magyar Onkológia 1992, 46, 208-218 6. Bánfalvi T, Malmos E: A napfény és a rosszindulatú daganatok Orvosképzés 1993, 68, 72-75 7. Bánfalvi T, Szántó J, Udvarhelyi N.: Inoperabilis basalioma és spinalioma citosztatikus és irradiatiós kezelése Magyar Onkológia 1993, 37, 2 8. Bánfalvi T.: A dysplasticus naevus syndroma Magyar Onkológia l994, 4, l69-172 9. Bánfalvi T, Remenár É, Fodor J: Lokális recidiva fellépése a basalioma különbözo tipusú kezelése során Magyar Onkológia 1995, 39, 65-68 10. Récsán Zs, Bajcsay A, Bánfalvi T. : Irradiation in special cases of eyelid tumors Ophtalmos 1995, 6, 34-35
108
11. Bánfalvi T, Boér A, Remenár É.: A keloidok kezelése Orvosi Hetilap 1996, 34, 1861-1864 12. Bajcsay A, Récsán Zs, Bánfalvi T. : Recidiv vagy kiterjedten infiltráló szem körüli basaliomák sugárkezelése különbözo sugárfajtákkal. Szemészet 1996 133, 9-15 13. Bánfalvi T, Gilde K, Orosz Zs, Farkas E.: Basalioma-metastasis? Magyar Onkológia 1997, 41, 149-153 14. Bánfalvi T, Oberna F, Kiskoszegi A. A klinikai diagnózis megbízhatósága melanoma malignumban Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 1997, 73, 3-7 15. Bánfalvi T, Liszkay G, Fejos Zs, Gilde K: Ismeretlen primer tumor melanomás betegeknél Borgyógyászati és Venerológiai Szemle 1998, 74, 113-115 16. Bajcsay A, Bánfalvi T, Hajda M, Récsán Zs, Tóth J, Kontra G, Horváth Á, Németh Gy.: Szemészeti rosszindulatú daganatok külso sugárkezelése Szemészet 2000, 139: 137-147 17. Korányi K, Slowik F, Hajda M, Bánfalvi T: Primary orbital melanoma associated with oculodermal melanocytosis Orbit 2000, 19:1, 21-30
Könyvrészlet: 1. Bajcsay A, Bánfalvi T, Berta A, Hajda M, Német Gy, Récsán Zs, Salacz Gy, Süveges I, Tóth J: A szem és adnexumainak rosszindulatú daganatai Kásler M: Az onkoterápia irányelvei (2001) Poszter 1. K. Gilde, Zs. Fejos, T. Bánfalvi, G. Liszkay Metastatic malignant melanoma with regression of the primary Venice, 2001. február
109
Melanoma Research, 2001, 11, S 77 2.Gilde K., Banfalvi T., Fejos Zs., Liszkai G., Poller Somogyi A. Mucosal melanomas The 8th World Congress on Cancers of the Skin Zurich, July 18-21, 2001. 1st price
110
X. Köszönetnyilvánítás Prof. Dr. Kásler Miklós Prof. Dr. Ottó Szabolcs munkám támogatása Prof. Dr. Tímár József évenken keresztül rendszeres elméleti és gyakorlati segítség Prof. Dr. Jeney András számos jótanács, útmutatás Dr. Gilde Katalin az értekezés ötlete, témája Gaudi István idoigényes és magas színvonalú statisztikai vizsgálatok Dr.Gyergyai Fruzsina jóindulatú és segítokész opponensi vélemény Prof. Dr. Kremmer Tibor Édesné Boldizsár Mariann Dr. Gergye Mária Dr. Orosz Zsolt Dr. Udvarhelyi Nóra zökkenomentes, zavartalan, éveken keresztül tartó együttmuködés A borgyógyászati osztály novérei, asszisztensei, adminisztrátorai adatgyujtés, többezer vérvétel Byk Gulden, Jansen-Cilag, Roche, Schering-Plough cégek munkám támogatása
111
