MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA NÁZEV ÚSTAVU

NÁVRH A OPTIMALIZACE MIKROFLUIDNÍHO ČIPU PRO STUDIUM CHOVÁNÍ BUNĚK ZA PRŮTOKOVÝCH PODMÍNEK Bakalářská práce

Marek Černík

Vedoucí práce: Mgr. Jan Víteček, PhD.

Brno 2016

Bibliografický záznam Autor:

Název práce:

Marek Černík Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav biochemie Návrh a optimalizace mikrofluidního čipu pro studium chování buněk za průtokových podmínek

Studijní program:

Biochemie

Studijní obor:

Biochemie

Vedoucí práce:

Mgr. Jan Víteček, PhD.

Akademický rok:

2015/2016

Počet stran:

xi+40

Klíčová slova:

Mikrofluidika; PDMS; Povrchové modifikace; Smykové napětí; Silanizace; Endotelium;

Bibliographic Entry Author

Title of Thesis:

Marek Černík Faculty of Science, Masaryk University Department of Biochemistry Design and optimization of microfluidic chip for the study of the cells behaviour under flow conditions

Degree programme:

Biochemistry

Field of Study:

Biochemistry

Supervisor:

Mgr. Jan Víteček, PhD.

Academic Year:

2015/2016

Number of Pages:

xi+40

Keywords:

Microfluidics; PDMS; Surface modifications; Shear stress; Silanization; Endothelium;

Abstrakt Mikrofluidika je oblast fyziky zabývající se charakteristikami a manipulací kapalin v rozměrech pod jeden milimetr. Mikrofluidní přístup nalézá uplatnění v řadě aplikací, jednou z nich je výzkum cévního systému. Tato práce byla zaměřena na

přípravu

jednoduchého

cévního

modelu,

který

představuje

polydimethylsiloxanový (PDMS) čip, jehož kanálky jsou osazeny endoteliálními buňkami. Pro kanálky v čipu byl z důvodu fyziologické relevance zvolen kruhový průřez. Vzhledem k tomu, že nativní PDMS byl silně hydrofobní a neumožňoval adhezi buněk, byla testována řada povrchových modifikací: oxidace směsí kyseliny sírové a peroxidu vodíku (tzv. Piraňa solution), silanizace a oxidace plazmou. Úspěšnost povrchových modifikací byla kvantifikována pomocí měření úhlu smáčení. Jako nejúspěšnější se ukázala povrchová modifikace plazmou. Pomocí plazmy byl poté modifikován vnitřní povrch kanálků čipu. Na takto ošetřeném čipu bylo sledováno chování endoteliálních buněk.

Abstract Microfluidics is a branch of physics, which is focused on characterization and manipulation of fluids at submillimetre scale. The microfluidic approach is suitable for numerous applications one of them is vascular system research. This thesis is focused

on

preparation

of

simple

vascular

model

represented

by

a

polydimethylsiloxane (PDMS) chip with channels seeded by endothelial cells. Considering physiological relevance, the circular cross-section of channels was used. Because native PDMS is strongly hydrophobic it did not support cell adhesion. Thus several surface modifications were tested: oxidation by mixture of sulfuric acid and hydrogen peroxide (Piranha solution), silanization and oxidation by plasma. Effectivity of surface modifications was quantified by contact angle measurement. The plasma oxidation was shown to be the most efficient. That is why it was applied to inner surface of chip channels. Behaviour of endothelial cells was observed in a chip with such treated channels.

Poděkování Na tomto místě bych chtěl poděkovat především vedoucímu své bakalářské práce Mgr. Janu Vítečkovi, PhD. za ochotu, čas a cenné rady.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji bakalářskou práci vypracoval samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 13. května 2016

……………………………… Marek Černík

Obsah 1

Úvod ....................................................................................................................................... 1

2

Teoretická část ....................................................................................................................... 2 2.1

2.1.1

Smykové napětí ...................................................................................................... 2

2.1.2

Geometrie mikrofluidních čipů .............................................................................. 3

2.2

4

Materiály pro mikrofluidiku a jejich povrchové modifikace. ......................................... 3

2.2.1

Sklo a křemík .......................................................................................................... 3

2.2.2

PDMS a modifikace jeho povrchu .......................................................................... 4

2.2.3

Silanizace ................................................................................................................ 5

2.2.4

Charakterizace povrchů - Měření úhlu smáčení .................................................... 6

2.3

3

Mikrofluidika z pohledu fyziky ....................................................................................... 2

Biologie endotelu ........................................................................................................... 7

2.3.1

Obecná fyziologie ................................................................................................... 7

2.3.2

Vliv průtoku na fyziologii endoteliálních buněk ..................................................... 9

2.4

Využití mikrofluidiky pro studium cévního systému .................................................... 11

2.5

Cíle práce ...................................................................................................................... 13

Materiál a chemikálie ........................................................................................................... 14 3.1

Seznam použitých látek................................................................................................ 14

3.2

Použité přístroje ........................................................................................................... 15

3.3

Biologický materiál ....................................................................................................... 15

Metody ................................................................................................................................. 16 4.1

Povrchové modifikace PDMS disků .............................................................................. 16

4.1.1

Příprava PDMS...................................................................................................... 16

4.1.2

Příprava Piraňa solution a její užití pro modifikaci PDMS .................................... 16

4.1.3

Silanizace TEOS ..................................................................................................... 16

4.1.4

Měření úhlu smáčení............................................................................................ 17

viii

4.1.5 4.2

Příprava čipu ................................................................................................................ 17

4.2.1

Silanizace skla DCDMS .......................................................................................... 17

4.2.2

Odlévání polyuretanové pryskyřice ..................................................................... 18

4.2.3

PEG ....................................................................................................................... 18

4.2.4

Ošetření čipu plazmou ......................................................................................... 18

4.2.5

Prototyp 1............................................................................................................. 18

4.2.6

Prototyp 2............................................................................................................. 19

4.2.7

Zkouška těsnosti čipu ........................................................................................... 19

4.3

5

Oxidace plazmou .................................................................................................. 17

Práce s buňkami ........................................................................................................... 20

4.3.1

Pasážování ............................................................................................................ 20

4.3.2

Kultivace ............................................................................................................... 20

4.3.3

Stanovení viability a počtu buněk na průtokovém cytometru............................. 20

4.3.4

Kultivace buněk za průtokových podmínek ......................................................... 20

Výsledky ............................................................................................................................... 21 5.1

Úhel smáčení ................................................................................................................ 21

5.2

Povrchové modifikace PDMS disků .............................................................................. 22

5.3

Příprava čipu ................................................................................................................ 26

5.3.1

Prototyp 1............................................................................................................. 26

5.3.2

Prototyp 2............................................................................................................. 27

5.4

Kultivace buněk za průtokových podmínek ................................................................. 29

6

Diskuze ................................................................................................................................. 32

7

Závěr ..................................................................................................................................... 35

8

Seznam použité literatury .................................................................................................... 36

ix

Seznam použitých pojmů a zkratek BSA = hovězí sérový albumin (Bovine Serum Albumin) CAM = adhezivní molekuly buňky (Cell Adhesion Molecules) DCDMS = dichlordimethylsilan DMEM = Dulbecco´s Modified Eagle Medium EB = ethidium bromid EC = endoteliální buňka (Endothelial Cell) EDTA = kyselina ethylendiamintetraoctová (ethylenediaminetetraacetic acid) ET-1 = endotelin 1 FDA = diacetát fluoresceinu (fluorescein diacetate) HEMA = 2-hydroxyethylmethakrylát IAP = protein inhibující apoptosu (Inhibitor of Apoptosis Protein) ICAM-1 = mezibuněčná adhezivní molekula 1 (Intercellular Adhesion Molecule 1) IFN-α = interferon alfa IgSF = adheziny patřící do velké rodiny imunoglobulinů (Immunoglobulin Superfamily) IL-1 = interleukin 1 (analogicky IL-6 a IL-8) JNK = Janusova kinasa MTT = 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromidu PAF – faktor aktivující destičky (Platelet Activating Factor) PAI-1 = inhibitor aktivace plasminogenu (Plasminogen Activator Inhibitor) PBS = fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (Phosphate Buffered Saline) PDGF = růstový faktor odvozený z krevních destiček (Platelet-derived Growth Factor) PDMS = polydimethylsiloxan

x

PECAM-1 = adhezivní molekula krevních destiček a endotelia (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule) PEG = polyethylen glykol TEOS = tetraethyl ortosilikát TNF-α = tumor nekrotizující faktor alfa UV = ultrafialové (záření) VCAM-1 = adhezivní molekula cévních buněk 1 (Vascullar Cell Adhesion Molecule 1) VE-cadherin – vaskulární endoteliální cadherin VEGF – vaskulární endoteliální růstový faktor (Vascular Endothelial Growth Factor

xi

1 Úvod Mikrofluidika je oblast fyziky zabývající se charakteristikami a manipulací kapalin v rozměrech pod

jeden

milimetr.

Mikrofluidní

přístup

nachází

uplatnění

v mnoha

odvětvích.

Nejvýznamnějšími jsou organická syntéza, biochemie a biologie. V oblasti biologie cévního systému nachází mikrofluidní přístup přirozené uplatnění pro konstrukci cévních modelů. Použití mikrofluidních zařízení má řadu výhod. Mikrofluidní zařízení mají nízkou spotřebu reagencií a umožňují integraci několika druhů testů na jeden čip [1]. Významným počinem jsou „organs onchip“, tedy mikrofluidní zařízení kompletně a věrohodně napodobující veškeré funkce konkrétních orgánů. Tato zařízení nachází uplatnění při zkoumání vývoje tkání, fyziologie orgánů a etiologie nemocí. Mají také velký potenciál pro výzkum léčiv, zvláště pro objasnění molekulárního mechanismu působení léčiva, testy toxicity a identifikaci biomarkerů [2]. Tato práce byla zaměřena na přípravu jednoduchého cévního modelu, který představuje polydimethylsiloxanový (PDMS) čip, jehož kanálky jsou osazeny endoteliálními buňkami. To zahrnovalo řadu dílčích optimalizačních kroků jako povrchová modifikace disků z PDMS, příprava mikrofluidního čipu z PDMS, aplikace poznatků z povrchových modifikací PDMS disků pro modifikace vnitřního povrchu čipu a použití čipu pro kultivaci buněk. Pro přípravu čipu byly použity litografické metody. Úspěšnost povrchových modifikací byla hodnocena dle úhlu smáčení. Pro modifikaci vnitřního povrchu kanálků čipu byla využita povrchová oxidace plazmou. Pro experiment byly využity myší endoteliální buňky linie MS-1.

1

2 Teoretická část 2.1 Mikrofluidika z pohledu fyziky Díky malým rozměrům mikrofluidních zařízení (viz obrázek č. 1) dochází k převaze kapilárních sil a povrchového napětí nad silou gravitační. Právě převaha kapilárních sil tvoří ideální podmínky pro vznik laminárního proudění. Turbulentní proudění v mikrofluidních systémech v podstatě nemůže vzniknout. Přítomnost laminárního proudění umožňuje snadnou předpověď chování kapalin, protože k mísení kapalin dochází pouze pomocí difuze nikoliv pomocí konvektivního mísení. [1].

Obrázek č. 1: Mikrofluidní čip: kanálky mají průměr 0,42 mm a délku 3 cm. Čip byl připraven odlitím z PDMS.

2.1.1

Smykové napětí

Při průchodu kapaliny mikrofluidním systémem dochází díky laminárnímu proudění ke vzniku smykového napětí, které působí na stěny kanálku. Smykové napětí je důsledkem přítomnosti gradientu rychlosti proudění. Rychlost kapaliny u stěny kanálku je nulová, zatímco rychlost proudění ve středu kanálku je maximální. Velikost tohoto gradientu je přímo úměrná velkosti smykového napětí působícího na stěny kanálku [3]. Smykové napětí lze definovat jako sílu působící rovnoběžně s povrchem kanálku vztaženou na jednotku plochy. Smykové napětí tedy vyjadřujeme v Pascalech. V literatuře se často vyskytuje jednotka dyn cm-2, která nevychází ze soustavy SI. Převodní vztah je, že 10 dyn cm-2 se rovná 1 Pa. Protože smykové napětí je přímo úměrné toku a zároveň nepřímo úměrné rozměrům kanálků, malé toky v mikrofluidních zařízeních jsou dostačující pro napodobení vysokých smykových napětí v lidském těle. Smykové napětí bývá nejčastěji studováno ve spojitosti s prouděním krve. 2

Biologickou odpovědí na smykové napětí je tzv. mechanotransdukce endotelia [3]. Smykové napětí způsobuje například uvolnění oxidu dusnatého, který je významným vasodilatantem [4] (viz kapitola 2.3.1).

2.1.2

Geometrie mikrofluidních čipů

Původně byly používány čipy s kanálky obdélníkového průřezu. V současné době jsou preferovány kanálky kruhového průřezu, jelikož v nich působí podél stěn uniformní smykové napětí a věrohodně napodobují chování cév in vivo. Kdežto podél hran obdélníkového kanálku vznikají nerovnoměrnosti ve velikosti působícího smykového napětí. Tyto nerovnoměrnosti mají za následek nestandartní chování buněk v takovýchto kanálcích. Příkladem může být marginace leukocytů, která prvotně směřuje do rohů obdélníkového kanálku. Tento fakt má za následek zcela odlišné chování buněk v oblastech větvení jednotlivých kanálků s kruhovým a obdélníkovým průřezem [5].

2.2 Materiály pro mikrofluidiku a jejich povrchové modifikace. V rané fázi vývoje mikrofluidiky byly jako hlavní materiály využívány sklo a křemík. Tyto materiály stále nacházejí uplatnění při přípravě mikrofluidních čipů ale ze značné části byly později nahrazeny

plasty. Mezi nejpoužívanější plasty patří PDMS, polymethylmethakrylát,

polykarbonát, polyethylentereftalát, polyvinylchlorid, polyuretan a polyester [6]. V laboratorní praxi a pro přípravu prototypů mikrofluidních čipů je používán především PDMS kvůli snadné zpracovatelnosti a možnosti využití litografie (viz níže), avšak pro komerční výrobu není vhodný [3].

2.2.1

Sklo a křemík

Sklo a křemík jsou stále využívány, ovšem v menším množství než dříve. Křemík je používán k výrobě forem pro litografii. Sklo bylo upřednostňováno proto, že mikrofluidika se ve své rané fázi soustředila hlavně na kapilární elektroforézu, pro níž je sklo ideálním materiálem [1]. Dnes je sklo používáno například pro vytvoření uzavřeného mikrofluidního kanálku, kdy je PDMS odlitek přichycen na sklo, obvykle pomocí plazmy [3]. Sklo i křemík jsou křehké materiály, díky čemuž je velmi náročné vytvořit v nich mikrofluidní kanálky, a jejich výroba je náročná a nákladná [1]. Další limitací skla a křemíku oproti PDMS je neschopnost propouštět plyny, což značně limituje jejich použití pro práci se živými buňkami [7]. Nevýhodou křemíku je také to, že je neprůhledný pro viditelné světlo a ultrafialové (UV) záření, což ho činí nepoužitelným pro mikroskopické techniky [1].

3

2.2.2

PDMS a modifikace jeho povrchu

PDMS je elastomer, který je dnes nejpoužívanějším materiálem v mikrofluidice. Je upřednostňován díky své průhlednosti, elasticitě a také cenové dostupnosti. Díky své elasticitě umožňuje PDMS instalaci pump a dalších zařízení, která slouží k pohybu kapaliny uvnitř mikrofluidního zařízení [1]. Jeho výhodami, oproti sklu a křemíku, jsou propustnost pro plyny, nízká chemická reaktivita a nízká toxicita. Mezi další výhody patří také jednoduchost jeho přípravy. Zatímco sklo a křemík vyžadují výrobu v čistých prostorách a výroba mikrofluidních zařízení z těchto materiálů je časově náročná, PDMS je dnes často zpracováván litografií [6]. Tato metoda nemá tak striktní nároky na čistotu výrobních prostor, je možno ji provádět za běžných laboratorních podmínek. Je jednoduchá a efektivní. Litografií rozumíme tvorbu elastických odlitků z pevné formy. Proces začíná tvorbou pevné křemíkové formy o hloubce přibližně 5 mm, ve které je vytvořen negativ budoucích mikrofluidních struktur. Viskózní směs oligomerů PDMS společně se síťovacím činidlem je nalita na povrch formy, kde tuhne, dokud nevytvoří flexibilní vrstvu. Vrstva vytvrzeného PDMS je poté sloupnuta z povrchu křemíkové formy a přichycena ke sklu či dalšímu PDMS, aby vytvořila mikrofluidní zařízení. Před přichycením PDMS odlitku na jiný povrch v něm mohou být vytvořeny otvory, ze kterých po přichycení na povrch vzniknou přívodní kanálky. Vytvořená křemíková forma může poté být opakovaně používána pro přípravu odlitků [3]. Za hlavní nevýhodu PDMS je považován hydrofobní povrch. Hydrofobní povrch zapříčiňuje nespecifickou adsorpci, například proteinů, což může při jeho využití k analýze vést ke zkreslení či znehodnocení výsledků. Především pro bioanalytické účely musí být tedy povrch PDMS modifikován. Cílem povrchových modifikací je vytvoření hydrofilního povrchu, nicméně i přes úspěšnou modifikaci má povrch PDMS tendenci vracet se do původního hydrofobního stavu, protože modifikovaný hydrofilní povrch má, díky přítomnosti hydroxylových skupin, vyšší povrchovou energii než povrch nemodifikovaný. Dále jsou i ve vytvrzeném PDMS přítomny volné oligomery, jejichž migrace k povrchu napomáhá návratu do původního hydrofobního stavu [8]. Další z nevýhod tohoto materiálu je jeho botnání způsobené nepolárními organickými rozpouštědly jako například benzen, hexan, toluen či dichlormethan [9]. Botnání může způsobit změnu geometrie v postižené části mikrofluidního čipu. Botnání také mění vlastnosti povrchu PDMS a může způsobit rozpojení PDMS čipu přichyceného na sklo [9]. Nicméně výhody PDMS převažují nad jeho nevýhodami, proto je nejčastěji využívaným materiálem v oblasti mikrofluidiky.

4

Pro modifikaci povrchu lze využít i nespecifickou adsorpci molekul na hydrofobní povrch PDMS. Na povrch PDMS snadno adsorbují proteiny s vysokou molekulovou hmotností díky hydrofobní interakci [8]. Existuje také řada chemických metod, využívajících pro povrchové modifikace zpravidla směsi chemikálií [8]. Nejprve musí být povrch substrátu oxidován, aby došlo k jeho aktivaci. K oxidaci je často využívána směs kyseliny sírové a peroxidu vodíku v hmotnostním poměru 3:1 (tzv. Piraňa solution) [10] nebo plazma. Následně může být povrch silanizován (viz níže). Povrch modifikovaný silany je hydrofilní a navíc může sloužit jako styčná vrstva pro adhezi jiných molekul, kterými lze povrch dále modifikovat. Ovšem nejčastější povrchovou modifikací PDMS je povrchová oxidace plazmou, ať už jako součást chemických metod či samotná. Plazma je částečně ionizovaný plyn bohatý na radikály [11]. Modifikace povrchů pomocí plazmy využívá plyny jako kyslík, dusík a vodík, které disociují a reagují s povrchem substrátu, čímž vytvářejí chemické funkční skupiny [8]. Oxidace kyslíkovou plazmou je využívána především pro tvorbu hydrofilních povrchů, a dále také pro tvorbu vícevrstvých mikrofluidních zařízení, či pro spojování skleněných a PDMS částí mikrofluidních zařízení. Povrch PDMS modifikovaný plazmou se obnovuje do původní hydrofobní během několika hodin, svou hydrofilicitu si může zachovat v podstatě na neomezeně dlouho, pokud jej udržujeme v kontaktu s vodou či jinými polárními rozpouštědly [9]. Povrchovou oxidaci lze provést i pomocí UV záření. V porovnání s oxidací pomocí plazmy je modifikace pomocí UV záření téměř o řád pomalejší, co se týče časových nároků potřebných k dosažení stejného výsledku [12]. Nicméně výhodou povrchových modifikací pomocí UV záření je, že umožňují modifikovat PDMS více do hloubky a zároveň nevedou k praskání či mechanickému oslabování PDMS [13].

2.2.3

Silanizace

Silanizace je metoda používaná k vytvoření vrstvy polymerního siloxanu, eventuálně amorfního SiO2 na povrchu substrátu. Tato metoda slouží k dosažení definovaných vlastností povrchu (smáčivost, chemická reaktivita, atd.) Povrch substrátu silanizujeme deriváty silanu (SiH4) neboli hydridu křemičitého. Silany vznikají substitucí jednoho nebo více atomů vodíku. v molekule takového silanu jsou přítomny minimálně dvě reaktivní skupiny (ethoxy, methoxy, acetyl nebo chlor) umožňující vznik polymeru nebo zesíťování. Dále je obvykle přítomna funkční skupina, která dává vzniklé vrstvě siloxanu požadované vlastnosti jako hydrofilicitu/hydrofobicitu či chemickou reaktivitu [14].

5

Předpokládá se, že silany reagují s ionizovatelnými hydroxylovými skupinami vystavenými na povrchu substrátu (například izolované a geminální silanoly na povrchu skla) [15]. Při optimálních podmínkách vytváří silany na povrchu substrátu uniformní monovrtsvu [16]. Hydrolýza silanů je hnací silou přichycení silanu k substrátu, které vede k vytvoření siloxanových vazeb na povrchu substrátu. Základní funkční skupiny jako například aminy jsou schopny autokatalyzovat hydrolýzu na rozdíl od neaminovaných silanů. Počáteční krok hydrolýzy se může odehrát buď v roztoku, nebo na povrchu substrátu. Vše záleží na množství vody přítomné v systému. Nadbytek vody způsobuje nadměrnou polymerizaci, zatímco nedostatek vody způsobuje vznik nekompletní monovrstvy [17]. Silanizaci v mikrofluidice využíváme například k ošetření skleněných povrchů, na které naléváme nevytvrzený PDMS. Díky ošetření silanem lze PDMS po jeho úplném vytvrzení snadno ze skleněného povrchu vyjmout. Silanizace tedy brání vzniku vazeb, popřípadě vazebných interakcí mezi tuhnoucím PDMS a skleněným povrchem. Jak již bylo zmíněno, při optimálních podmínkách vytváří silany na povrchu substrátu uniformní monovrtsvu. Teoreticky toto uspořádání dovoluje (bio)molekulám nebo síťovacím činidlům přichycení k funkční polovině silanu podobným uniformním způsobem [16]. Proto může silanizace také sloužit pro vytvoření styčné vrstvy mezi povrchem PDMS a látkami, kterými jej chceme modifikovat [17]. Modifikace silany může sloužit k vytvoření hydrofilního či hydrofobního povrchu, záleží na konkrétním silanu. Silany se obvykle používají ve směsi s organickým rozpouštědlem a vodou. Voda slouží k iniciaci silanizační reakce. Pro získání optimální uniformity a reprodukovatelnosti silanizace, musí být povrch očištěn od jakýkoliv kontaminantů a reaktivní hydroxyly musí být aktivovány [16].

2.2.4

Charakterizace povrchů - Měření úhlu smáčení

Měření úhlu smáčení je jednoduchá metoda pro kvantifikaci smáčivosti konkrétního povrchu. Úhel smáčení kapky tekutiny na pevném povrchu je určen mechanickou rovnováhou kapky vystavené působení tří vektorů povrchového napětí působících na rozhraní pevné a kapalné, kapalné a plynné, pevné a plynné fáze [18]. Nejběžněji používanou metodou pro měření úhlu smáčení je tzv. metoda přisedlé kapky. Tato metoda je založena na zachycení bočního pohledu na rozhraní kapka-podklad zpravidla pomocí CCD kamery [18]. Takto zachycený obraz je poté podroben obrazové analýze. Před samotným měřením musí být povrch zkoumaného materiálu důkladně očištěn a odmaštěn. Tento krok je nezbytný, aby se zabránilo zkreslení výsledku kontaminací materiálu. Na povrch zkoumaného materiálu se nanáší kapka o velikosti, při které převládají povrchové síly (interakce) nad silou gravitační.

6

Kdyby kapka dosahovala většího objemu, byla by deformována gravitační silou, což by zkreslovalo výsledky. Proto je obvykle je používána kapka o objemu několika mikrolitrů.

Obrázek č. 2: Vektory povrchového napětí na pomezí fázových rozhraní mezi jednotlivými skupenstvími působící na kapku, převzato z [18]

2.3 Biologie endotelu 2.3.1

Obecná fyziologie

Endotelium je vrstva buněk, která tvoří vnitřní výstelku stěn cév a slouží jako selektivní bariéra mezi krví a ostatními tkáněmi a orgány. Je to metabolicky aktivní vrstva, která je neustále vystavována působení biochemických a biomechanických signálů [19]. Na endotelium je proto nutno pohlížet jako na dynamický systém, ve kterém jsou protichůdné funkce při fyziologických podmínkách striktně regulovány. Mezi hlavní funkce endotelia patří regulace hemostázy, regulace cévního tonu, regulace růstu a regulace zánětlivé odpovědi [20]. Zároveň je však endotelium schopno pozměnit podmínky do takové míry, že může dojít k patologickému stavu [21]. Endotelium je vysoce antitrombogenní díky produkci mnoha faktorů, které fungují buď jako antikoagulanty nebo jako aktivátory fibrinolýzy. Mezi tyto faktory patří například prostacyklin, oxid dusnatý či trombomodulin [20]. Při fyziologických podmínkách samozřejmě převládá antitrombogenní aktivita, ovšem prokoagulační aktivita může být rychle indukována působením prozánětlivých cytokinů či bakteriálních toxinů [22]. Díky produkci inhibitoru aktivace plasminogenu 1 (PAI-1) je endotelium schopno předejít aktivaci fibrinolytické kaskády [23]. Mezi další protrombogenní produkty endotelia patří koagulační faktory V a VIII a také receptory pro faktory IX a X [20].

7

Endotelium

produkuje

řadu

vasoaktivních

látek,

vasokonstriktorů

i vasodilatantů.

Z vasodilatačních látek jsou to oxid dusnatý a prostacyklin a z látek vasokonstrikčních je nutno zmínit endotelin-1 (ET-1) [20]. Oxid dusnatý hraje nepochybně významnou roli v udržování vasodilatační aktivity, která je životně důležitá, obzvláště co se krevního řečiště týče. Mnohé výzkumy dokazují, že dysfunkce endotelia jasně souvisí se ztrátou endoteliem indukované vasokonstrikce, příkladem může být aterosklerosa [24]. Endotelium je schopno syntetizovat růstové faktory stejně jako látky inhibující růst. Za fyziologických podmínek převládá produkce inhibičních faktorů, aby byla kontrolována proliferační aktivita. Nicméně některé cytokiny jako například tumor nekrotizující faktor alfa (TNF-α) jsou schopny indukovat syntézu a uvolnění růstových faktorů. Příkladem inhibitorů růstu je růstový faktor odvozený z krevních destiček (PDGF) [20]. Endotelium funguje jako centrální modulátor zánětlivé odpovědi. Tato funkce zahrnuje striktně kontrolované interakce mezi endoteliálními a krevním buňkami stejně jako mezi endoteliálními buňkami a mediátorovými kaskádami v plazmatické části krve [20]. Endotelium samo je schopno syntetizovat řadu vlastních prozánětlivých látek jako interleukin 1 (IL-1), IL-6, IL-8 a faktor aktivující krevní destičky (PAF). Zároveň je místem, kde se odehrává řada buněčných procesů jako marginace leukocytů, jejich rolování, adheze a emigrace ven z cévy [20]. Jelikož pro správnou fyziologickou funkci endotelia je nutná jeho integrita, je endotelium vybaveno řadou adhesivních molekul (CAM, cell adhesion molecules). Tyto adhesivní molekuly zprostředkovávají interakce mezi endoteliálními buňkami navzájem, mezi endoteliem a krevní buňkami a mezi endoteliem a bazální membránou. CAM jsou rozděleny do skupin na základě svých strukturních charakteristik [20]. Cadheriny primárně zajišťují interakce mezi endoteliálními buňkami, například vaskulární endoteliální cadherin (VE-cadherin), nicméně molekuly adhezinů patřících do velké rodiny imunoglobulinů (IgSF) jako například adhezivní molekula krevních destiček a endotelia 1 (PECAM1) jsou neméně důležité. Interakce endotelia s bazální membránou jsou zajišťovány integriny. Tyto transmembránové proteiny ukotvují cytoskelet endoteliálních buněk skrze plazmatickou membránu k extracelulární matrix a podílejí se na oboustranné transmembránové signalizaci [20]. Selektiny a IgSF jsou nejvýznamnějšími skupinami molekul podílejících se na interakci endotelia s krevními buňkami [25]. Nejvýznamnějšími zástupci IgSF jsou mezibuněčná adhezivní molekula 1 (ICAM-1), ICAM-2 a adhezivní molekula cévních buněk 1 (VCAM-1), tyto molekuly hrají zásadní roli při interakci endotelia s monocyty, granulocyty a lymfocyty [20].

8

ICAM-1 je trvale exprimován na endoteliu a jeho exprese může být zvýšena působením prozánětlivých cytokinů [26]. ICAM-1 zajišťuje adhezi leukocytů a jejich průchod endoteliem [20]. Samotné adhezi ovšem přechází tzv. rolování leukocytů, pro které jsou nezbytné E-selektin (endoteliální) a P-selektin (krevní destičky). E a P-selektin se také podílejí na kontrole tvaru endoteliálních monovrstev [27]. Endotelium se také významně podílí na angiogenezi, která je relevantní nejen pro běžné fyziologické funkce, ale také pro patogenezi mnoha nemocí. Tvorba nových kapilár je spjata s normálním růstem a vývojem, stejně jako s hojením ran. Nicméně angiogeneze je dnes také zkoumána z pohledu růstu a metastází nádorů a zánětlivých a metabolických chorob. Vývoj buněk s angiogenetickým fenotypem je složitý proces zahrnující schopnost endoteliálních buněk porušit vzájemné spojení, projít bazální membránou a mezibuněčnou hmotou, proliferovat a reorganizovat se tak, aby došlo k tvorbě nové cévy s jasně definovaným lumenem. Proces neovaskularizace je kontrolován mnoha molekulami, které lze obecně rozdělit do dvou skupin na angiogenní a angiostatické. Mezi látky angiogenní řadíme růstové faktory a cytokiny, například vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), IL-8 a E-selektin. Mezi látky angiostatické řadíme trombospondin, interferon alfa (IFN-α) a angiostatin [20].

2.3.2

Vliv průtoku na fyziologii endoteliálních buněk

Endotelium je umístěno mezi proudící krví a stěnou cév. Endoteliální buňky, které vystýlají cévy, jsou tedy vystaveny silovému působení kapalin v mnohem větším rozsahu než jiné savčí tkáně (buňky) [28]. Síly působící na cévy vyvolané prouděním krve mohou být rozděleny na dva hlavní vektory. Jeden působí kolmo na stěnu cév a reprezentuje krevní tlak. Druhý - působící rovnoběžně se stěnou cévy vytváří třecí sílu, tzv. smykové napětí, které působí na povrch endotelia. Ačkoliv stěny všech cév jsou vystaveny stahům jakožto důsledku tlaku pulzující krve, smykové napětí je vnímáno endoteliem [28]. Endotelium obsahuje řadu mechanosenzorických molekul, které mohou být aktivovány působením smykového napětí a podílí se na přenosu mechanických signálů [29]. Přenos signálu pomocí mechanosenzorických molekul se nazývá mechanotransdukce. Přenos, ať už jednotlivých signálů, či jejich kombinací určuje fyziologii a patologii kardiovaskulárního systému [19]. Mezi mechanosenzorické molekuly patří například integriny, iontové kanály či receptory spojené s Gproteiny [28].

9

Integriny jsou molekuly schopné převádět mechanické stimuly na biochemické signály [30]. Unikátní strukturní vlastnosti jim umožňují zprostředkovávat jak signalizaci zevnitř-ven, při kterém intracelulární signály modulují afinitu integrinů pro jejich extracelulární ligandy, tak signalizaci zvenku-dovnitř, při kterém extracelulární stimuly indukují intracelulární signální kaskádu prostřednictvím aktivace integrinů [31]. Aktivace integrinů smykovým napětím se projevuje jejich shlukováním [32]. Iontové kanály se podílejí hlavně na krátkodobých odpovědích (v řádu sekund až minut) a ovlivňují syntézu nebo uvolňování pro- a antikoagulantů, růstových faktorů a uvolňování regulátorů vasomotoriky [33]. Biomechanické síly produkující smykové napětí modifikující strukturu a funkce endotelia [19]. Smykové napětí má vliv na proliferaci, apoptosu, migraci, uspořádání endoteliálních buněk (EC) a také na propustnost endotelia [29]. Smykové napětí zvyšuje pevnost a viskozitu buněk [34]. Růst endoteliálních buněk je ovlivněn typem smykového napětí, kterému jsou vystaveny. Bylo prokázáno, že laminární smykové napětí snižuje proliferaci EC úměrně velikosti, konkrétně snižuje množství buněk vstupujících do buněčného cyklu zastavením buněk v G0 nebo G1 fázi cyklu [29, 35]. Toto tvrzení podporuje fakt, že EC vystavené laminárnímu smykovému napětí o dostatečné velikosti mají nižší úroveň syntézy DNA, než EC kultivované za statických podmínek [36]. Naopak EC vystavené narušenému (nelaminárnímu) proudění, v hraničních oblastech s nízkým smykovým napětí, ale s vysokým gradientem smykového napětí, mají vyšší úroveň proliferace a syntézy DNA, než EC kultivované za statických podmínek [29, 37]. Fyziologická úroveň laminárního smykového napětí napomáhá potlačení apoptosy EC indukované mnoha různými podněty, a tak významně napomáhá udržení integrity endotelia [29]. Příkladem může být indukce exprese proteinů inhibujících apoptosu (IAP). Přesný mechanismus účinku IAP není objasněn, ale je známo, že zabraňují buněčné smrti přímou vazbou na kaspasy, čímž způsobí jejich ubiqitinizaci a následnou proteasomální degradaci [29]. Smykové napětí má také ateroprotektivní efekt, zabraňuje odpovědi endotelia na stimulaci prozánětlivými cytokiny modulací aktivit Janusových kinas (JNK) [29]. Migrace EC je významným procesem v remodelaci endotelia. Studie prokázaly, že migrace EC během hojení ran je zvyšována laminárním smykovým napětím, kdežto narušené proudění (nelaminární) má na hojení ran mnohem menší efekt. Smykové napětí také zvyšuje interakce mezi EC a mezibuněčnou hmotou, tyto interakce tak podporují migraci EC [29].

10

Mezibuněčné spojení EC neumožňují za fyziologických podmínek prostup makromolekul endoteliem. Pro oblasti s nelaminárním prouděním (například větvení cév), které způsobuje zrychlený růst a odumírání buněk, je typické snížení těsnosti spojení EC [29]. Smykové napětí indukuje protažení a orientaci EC dle směru proudění [38]. Uspořádání EC reflektuje vektorový součet smykového napětí. V oblastech s narušeným prouděním se uspořádání EC výrazně mění k uspořádání bez preferované orientace [28]. Tvar EC a její orientace jsou určeny cytoskeletem, který mění své uspořádání v závislosti na proudění [28].

2.4 Využití mikrofluidiky pro studium cévního systému Pomocí standardních in vitro metod je téměř nemožné napodobit dynamické trojrozměrné in vivo mikroprostředí cév. Mikrofluidní technologie poskytuje jedinečné možnosti, jak tyto problémy překonat. Zásadní výhodou jsou malé rozměry mikrofluidních zařízení a tedy i menší spotřeba reagencií, kultivačního média a buněk. Velkou výhodou materiálů jako například PDMS pro kultivaci buněk je jeho propustnost pro plyny. Výhodou malých rozměrů je také to, že buňky mohou být během kultivačních experimentů kontrolovány pomocí běžných mikroskopických technik [3]. Další výhodou mikrofluidní technologie je možnost její kombinace s metodami s vysokou průchodností. Toho lze využít například pro porovnávací studii zkoumající efekty mnoha faktorů a parametrů ovlivňujících chování buněk v jednom experimentu. Tohoto způsobu se využívá například při screeningu látek, které mají vliv na mechanotransdukci endotelia. Dále mikrofluidní technologie umožňuje integraci několika kroků (kultivace, lyze a analýza buněk) na jeden čip, tento koncept se nazývá „lab-on-chip“ [39]. Nejjednodušší model cévního systému představuje kanálek osazený endoteliálními buňkami, protože endotelium se vyskytuje ve všech cévách od kapilár po velké tepny. Je ovšem nutné, aby médium cirkulovalo. V opačném případě dochází k rychlé spotřebě živin a k hromadění odpadních produktů buněk [3]. Mikrofluidní technologii lze využít pro studium migrace cévních buněk v závislosti na gradientech biochemické a fyzikální povahy. Studium a porozumění migraci buněk je důležité, protože to je proces zahrnutý v embryogenezi, hojení ran a tumorogenezi [3]. Mikrofluidní technologie byla použita například ke zkoumání vlivu vaskulárního endoteliálního růstového faktoru na migraci buněk [40] či ke zkoumání vlivu tuhosti podkladu na migraci buněk [41]. Dále lze in vitro zkoumat migraci buněk při hojení ran, kdy je pomocí trypsinu uměle vytvořeno poranění očištěním jedné strany kanálku od buněk [3].

11

Mikrofluidní technologie se také využívá pro studium mezibuněčných interakcí. Song a kol. studovali interakce mezi endoteliálními buňkami a cirkulujícími nádorovými buňkami, tento proces je zahrnut při vzniku metastází rakoviny [42]. Dalšími studovanými interakcemi je vazba leukocytů na endoteliální buňky (základní proces zánětu) a endoteliem zprostředkovaná aktivace krevních destiček, což je proces důležitý při zástavě krvácení [3]. Významnou oblastí výzkumu je transplantační medicína, hlavní výzvou je zde produkce vaskularizované tkáně pro implantaci. Zde nachází mikrofluidní technologie uplatnění při diferenciaci kmenových buněk v cévní buňky pomocí růstových faktorů a dále při organizaci buněk pro vytvoření sítě cév. Využívá se faktu, že kanálek osazený po celém svém obvodu endoteliálními buňkami může sloužit k tvorbě cévních systému, které jsou podobné těm in vivo. PDMS není biologicky odbouratelný materiál, vyvstává zde tedy problém jak nahradit PDMS funkční tkání. Jedním z možných řešení použití polymeru polyglycerol sebakátu, který je biologicky odbouratelný [43].

12

2.5 Cíle práce 

Navrhnout geometrii mikrofluidního čipu.



Vytvořit formu, která poslouží k přípravě čipu z PDMS.



Pomocí povrchových modifikací změnit hydrofobní povrch PDMS na hydrofilní.



Osadit čip buňkami a sledovat jejich chování při průtoku média.

13

3 Materiál a chemikálie 3.1 Seznam použitých látek Amoniak – Sigma-Aldrich, 26% p.a., kat. č. 05003 Dichlordimethylsilan (DCDMS) – Sigma-Aldrich, >=99.5%, kat. č. 440272 Médium – DMEM, Gibco, kat. č. 11995065 s přídavkem: 

Fetálního bovinního séra (10 % z celkového objemu), PAN Biotech



Penicilinu a Streptomycinu (6,74 IU ml-1), PAN Biotech

Fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) - 1 l destilované vody s přídavkem 0,2 g KH2PO4; 8 g NaCl; 2,3 g Na2HPO4 a 0,2 g KCl PBS + EDTA – PBS s přídavkem 0,4 g kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA) PDMS – Sylgard 184 silicone elastomer kit, Dow Corning Polyethylen glykol 20 000 (PEG) – Serva, kat. č. 33138.02 Peroxid vodíku – Sigma-Aldrich, 30%, kat. č. 216763 Smooth-Cast 300 - dvousložková polyuretanová odlévací pryskyřice, Smooth-On, Inc. Tetraethyl ortosilikát (TEOS) - Sigma-Aldrich, >=99.0%, kat. č. 86578 Trypsin – Sigma-Aldrich, kat. č. T-4799 Kolagen G1 – Matrix BioScience, 5 mg ml-1, kat. č. 50105 Lepidlo vytvrditelné UV zářením – Locite 3494 Ostatní použité chemikálie byly v čistotě p.a.

14

3.2 Použité přístroje Kima pumpa – model KIMA-CTRL 1507-02, Cellix Ltd Laminární box – model LabGard ES Air Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet, NuAire CCD kamera – model AD7013MTL, sw DinoCapture 2.0, Dino-Lite Plazmová komora - model Plasma system NANO, Diener electronic GmbH CO2 inkubátor – model MCO-18M, Schoeller Instruments, s.r.o. Invertované laboratorní mikroskopy – Nicon Eclipse TS 100, Zeiss AxioObserver Z1 Vysokofrekvenční zdroj elektrizačního přístroje PEP 12, výrobce ELFA s.r.o. Blatná Průtokový cytometr – CASY TT, Innovatis

3.3 Biologický materiál Linie 3T3 – myší fibroblasty, Sigma-Aldrich, kat. č. 93061524 Linie MS-1 – myší endoteliální buňky, Mile Sven 1, ATCC, kat. č. CLR-2279

15

4 Metody 4.1 Povrchové modifikace PDMS disků 4.1.1

Příprava PDMS

Pro přípravu byl použit kit Sylgard 184 (viz kapitola 3.1). Oligomery PDMS byly smíchány se síťovacím činidlem v hmotnostním poměru 10:1. Vzniklá směs byla důkladně promíchána. Tato směs byla následně odplyněna pod vakuem v exsikátoru. PDMS byl vytvrzován 48 hodin při pokojové teplotě. Pro účely povrchových testování povrchových modifikací byly z tenké vrstvy (1 mm) PDMS připraveny disky o průměru 15 mm pomocí korkovrtu.

4.1.2

Příprava Piraňa solution a její užití pro modifikaci PDMS

Veškeré nástroje používané při přípravě byly očištěny od organických látek, protože směs je labilní a nečistoty by mohly způsobit explozi. Před smícháním byly obě chemikálie důkladně vychlazeny na ledu. Při míchání byla nejprve nalita koncentrovaná kyselina sírová, do které byl přikapáván 30%ní peroxid vodíku za stálého chlazení a míchání. Během celé přípravy byla přichystána kádinka s vodou, která sloužila k likvidaci směsi při náznacích jakéhokoliv nestandardního chování. Povrch PDMS disků byl pokryt 200 µl takto připravené směsi. Disky se směsí byly inkubovány na termostatu v otevřených miskách při 50 °C po dobu 30 minut. Následně byly zbytky směsi opláchnuty destilovanou vodou a disky byly osušeny.

4.1.3

Silanizace TEOS

Pro silanizaci byly připraveny směsi TEOS ethanolu a aktivátoru v objemovém poměru 1:3:1. Jako aktivátor byla použita destilovaná voda, 1 mM HCl a 0,1 M HCl. Tato směs byla umístěna pod inertní atmosféru (argon) a preinkubována při 37 °C po dobu 18 nebo 42 hodin. PDMS disky bez modifikace a oxidované pomocí Piraňa solution (viz kapitola 4.1.2) byly umístěny do malé Petriho misky a vytemperovány na 90°C. Následně byl povrch disků pokryt silanizační směsí (200 µl). Disky byly inkubovány v uzavřené Petriho misce při 90°C po dobu 5 minut. Po skončení inkubace byla silanizační směs odstraněna a disky byly opláchnuty destilovanou vodou a osušeny.

16

4.1.4

Měření úhlu smáčení

Na zkoumaný povrch byla nanesena 5 µl kapka destilované vody. Kapka byla vyfocena pomocí CCD kamery za použití softwaru DinoCapture. Obrazový soubor získaný z programu DinoCapture byl následně podroben obrazové analýze v programu ImageJ, kde byl pomocí plug-inu Contact angle změřen úhel smáčení. Měření úhlu smáčení bylo provedeno manuálním vyhodnocením pomocí bodů, které byly vytyčeny po obvodu kapky (viz obrázek č. 3). Nejprve byla pomocí 2 bodů vytyčena základna kapky na zkoumaném povrchu. Poté byly zvoleny 3 body po obvodu kapky v pořadí podle směru hodinových ručiček. Takto vytyčenými body byla pomocí programu ImageJ opsána kružnice či elipsa (v závislosti na tvaru kapky) a byl vyhodnocen úhel smáčení (úhel mezi tečnou opsané kružnice či elipsy v bodě kontaktu a základnou kapky).

Obrázek č. 3: Vyznačení obvodu kapky pomocí bodů pro manuální vyhodnocení úhlu smáčení

4.1.5

Oxidace plazmou

Pro vytvoření plazmy byl použit generátor PEP 12. PDMS disky byly umístěny na vodivý podklad (alobal), ke kterému byla připojena zemnící elektroda. Pomocí pracovní elektrody umístěné 2 mm nad povrch PDMS byl generován koronový výboj. PDMS disk o průměru 15 mm byl takto modifikován po dobu 1 minuty.

4.2 Příprava čipu 4.2.1

Silanizace skla DCDMS

Sklo bylo nejprve opláchnuto teplou vodou s přídavkem detergentu a následně odmaštěno pomocí ethanolu. Pro silanizaci byl použit 1 ml DCDMS, který byl nanesen na očištěné sklo umístěné ve skleněné Petriho misce. Silanizace probíhala 5 minut v uzavřené misce. Po skončení silanizace byla silanizační směs odstraněna a sklo bylo opláchnuto destilovanou vodou a osušeno.

17

4.2.2

Odlévání polyuretanové pryskyřice

Forma pro odlévání byla důkladně očištěna a odmaštěna. Každá ze složek polyuretanové pryskyřice byla zvlášť nalita do plastového kelímku a odvzdušněna v exikátoru. Po odvzdušnění byly jednotlivé složky smíchány v poměru 1:1. Takto připravená směs byla nalita do formy pro odlitek a vytvrzována 10 minut.

4.2.3

PEG

PEG byl připraven jako 70% roztok rozpuštěním 700 mg PEG v 300 µl destilované vody. Takto připravená směs byla temperována při 80 °C, dokud nevznikla homogenní směs. Po celou dobu práce byla směs udržována při konstantní teplotě 80 °C, aby nedošlo k jejímu ztuhnutí.

4.2.4

Ošetření čipu plazmou

Čip byl modifikován za použití plazmy generované přístrojem PEP 12. Ošetření plazmou bylo prováděno na filtračním papíře. Do vstupního otvoru čipu bylo zavedeno přes hadičku s jehlou vakuum. Jehla zároveň sloužila jako elektroda. Druhou elektrodu tvořil ocelový drátek umístěný v hadičce, který byl zaveden do výstupního otvoru na druhém konci kanálku. Kanálek byl ošetřován plazmou 1 minutu.

4.2.5

Prototyp 1

Čip byl připraven z PDMS (podrobněji viz kapitola 4.1.1). Na přípravu formy čipu byla použita polyuretanová odlévací pryskyřice Smooth-Cast 300 (podrobněji viz kapitola 4.2.2). V delší stěně formy byly v pravidelných rozestupech vyvrtány otvory, do kterých byly umístěny entomologické špendlíky (průměr 0,42 mm) s ustřiženou hlavičkou. Konce špendlíků zasunuté ve vyvrtaných otvorech byly zafixovány 15% roztokem želatiny. Tyto špendlíky sloužily jako matrice kanálků. Usazené špendlíky končily 1 cm od protějšího okraje. Forma čipu byla přilepena pomocí PDMS k silanizovanému sklu (viz kapitola 4.2.1). PDMS použitý pro spojení formy se sklem byl vytvrzován 6 hodin při pokojové teplotě. Na špendlíky byly za použití 15% roztoku želatiny kolmo přilepeny 2 hřebínky s jehlami, které sloužily pro vytvoření vstupních otvorů. Hřebínky byly přichyceny 1 cm od delších stěn formy. Hřebínky byly vytvořeny z kvádrů vytvrzeného PDMS, do kterých byly v pravidelných rozestupech zapíchnuty jehly (průměr 0,45 mm) s ustřiženou špičkou. Místa styku jehel a špendlíků byly slepeny 15% roztokem želatiny. Do takto vytvořené formy byl nalit nevytvrzený PDMS. Po vytvrzení čipu byly otvory vzniklé po vytažení špendlíků zaslepeny PDMS. PDMS byl vytvrzen při 100 °C po dobu 35 minut. Kanálky čipu byly propláchnuty destilovanou vodou a vysušeny. 18

4.2.6

Prototyp 2

Primární forma byla sestavena na skleněném podkladě. Skleněné korálky (trojhran, strana podstavy 3 mm, výška 3 mm) byly použity pro vytvoření podpůrné struktury pro uložení matrice kanálků a vstupních otvorů. Tyto korálky byly přichyceny UV vytvrditelným lepidlem (viz kapitola 3.1) na čisté a odmaštěné sklo. Poté bylo sklo silanizováno pomocí DCDMS (viz kapitola 4.2.1). Okolo korálků byl vytvořen rámeček z moduritu. Do něj byl nalit nevytvrzený PDMS a tak byl vytvořen primární odlitek. Na základě primárního odlitku byla připravena sekundární forma odlitím z polyuretanové pryskyřice Smooth cast. Podpůrné struktury v sekundární formě byly zabroušeny na stejnou výšku a byla do nich vybroušena drážka, do hloubky 1 mm nad plochou formy, pro usazení matric kanálků. Jako matrice kanálku byly použity entomologické špendlíky (průměr 0,42 mm). Vstupní otvory byly vytvořeny pomocí jehel (průměr 0,3 mm) zavedených za oba konce entomologických špendlíků do podpůrných struktur. Místa, kde se jehly a špendlíky dotýkali, byla slepena pomocí 70% roztoku PEG. Na spodní polovinu formy byla přilepena pomocí nevytvrzeného PDMS část horní. PDMS byl vytvrzován 30 minut při 80 °C. Netěsnosti formy byly zastřeny 70% PEG. Do kompletní formy byl nalit nevytvrzený PDMS. Hotový čip (viz obrázek č. 1) byl ponořen do vody, aby byly rozpuštěny a vyplaveny zbytky PEG. Následně byl povrch i vnitřek čipu propláchnut, nejprve ethanolem, a následně destilovanou vodou. Poté byl čip vysušen. Dále bylo provedeno ošetření spodní plochy čipu plazmou (viz kapitola 4.1.5). Stejným postupem bylo plazmou ošetřeno podložní sklo. Povrchy ošetřené plazmou byly posléze přiloženy k sobě a ponechány 10 minut při 80 °C, aby bylo docíleno dokonalé adheze obou povrchů.

4.2.7

Zkouška těsnosti čipu

Těsnost čipu byla testována roztokem methylové červeni o koncentraci 0,5 mg ml-1. Čip byl podložen papírovou utěrkou, na které byly případné úniky kapaliny snadno pozorovatelné. Kapalina byla do čipu vháněna pomocí injekční stříkačky s jehlou, na kterou byla napojena hadička zakončená jehlou, která ústila do čipu. Jako vývod byla použita hadička s jehlou umístěná na dně misky.

19

4.3 Práce s buňkami 4.3.1

Pasážování

Inokulum buněk na misce bylo nejprve zkontrolováno pod mikroskopem. Zbytek práce byl prováděn v laminárním boxu. Pomocí odsávačky bylo odsáto médium. Buňky byly opláchnuty sterilním PBS s přídavkem EDTA. Následně byla provedena trypsinizace pomocí 500 µl roztoku trypsinu. Po 5 - 15 minutách byl trypsin inaktivován přidáním 1 ml média DMEM. Do nové sterilní misky bylo pipetováno 12 ml média DMEM (složení viz kapitola 3.1) a bylo do něj přeneseno 500 µl suspenze buněk.

4.3.2

Kultivace

Buňky byly kultivovány na plastových Petriho miskách (culture treated, TPP, Švýcarsko, kat.č. 93100) v médiu DMEM s přídavkem fetálního bovinního séra a streptomycinu a penicilinu (podrobněji viz kapitola 3.1) v CO2 inkubátoru za konstantních podmínek. Kultivace probíhala 3 – 4 dny při 37 °C. Vzduch v inkubátoru obsahoval 5 % CO2 a měl 100% vlhkost.

4.3.3

Stanovení viability a počtu buněk na průtokovém cytometru

Měřicí kapilára byla nejprve třikrát pročištěna pomocí funkce CLEAN. Poté bylo změřeno pozadí za použití 10 ml čistého fyziologického roztoku. Pro vlastní měření byla použita kyveta s 10 ml fyziologického roztoku, do kterého bylo vneseno 20 µl suspenze buněk v médiu DMEM. Před měřením byla kyveta třikrát převrácena, aby došlo k homogenizaci vzorku. Z měření byly získány údaje o viabilitě a počtu buněk.

4.3.4

Kultivace buněk za průtokových podmínek

Pro experiment byl použit čip, jehož kanálky byly modifikovány plazmou (viz kapitola 4.2.4). Veškerý následující postup byl prováděn v laminárním boxu ve sterilním prostředí. Kanálky čipu byly nejprve pročištěny a zároveň sterilizovány 70% ethanolem. Následně byl ethanol vypláchnut sterilním PBS. Do takto vyčištěných kanálků byl vnesen roztok kolagenu I v PBS o výsledné koncentraci 0,1 mg ml -1. Čip ošetřený kolagenem I byl hodinu ponechán v CO2 inkubátoru (37°C, 5% CO2 v atmosféře). Do kanálků ošetřených kolagenem I byla vnesena suspenze buněk v médiu DMEM (složení viz kapitola 3.1). Čip byl na hodinu umístěn do CO2 inkubátoru, aby došlo k adhezi buněk. Po půl hodině byl čip obrácen, aby byly buňky rozprostřeny rovnoměrně po obvodu kanálku. Kontrola adheze buněk byla provedena pomocí mikroskopu. Čip osazený buňkami byl poté zapojen na pumpu (viz obrázek č. 4), která zajišťovala cirkulaci média.

20

Obrázek č. 4: Čip vlastní přípravy připojený k pumpě

5 Výsledky 5.1 Úhel smáčení Úhel smáčení byl postupně změřen u celkem 17 kapek. Pro každé dílčí měření byl spočítán interval spolehlivosti s užitím hladiny spolehlivosti 0,05 a to vždy ze souboru hodnot zahrnující měření samotné a všechna měření jemu předcházející. Obrázek č. 5 ukazuje, že od 1 do 6 kapek hodnoty intervalu spolehlivosti výrazně klesaly. Od 6 vyhodnocených kapek se již hodnota prakticky neměnila. S ohledem na přesnost a časovou náročnost bylo v dalších experimentech vyhodnocováno 6 kapek pro danou variantu.

Interval spolehlivosti (°)

6 5 4 3 2 1 0 1

2

3

4

5

6

7

8

9

10 11 12 13 14 15 16 17

Počet kapek

Obrázek č. 5: Závislost velikosti intervalu spolehlivosti na počtu vyhodnocených kapek. Pro každé dílčí měření byl spočítán interval spolehlivosti (α= 0,05) pomocí funkce CONFIDENCE v MS Excel ze souboru hodnot zahrnující měření samotné a všechna měření jemu předcházející. 21

5.2 Povrchové modifikace PDMS disků Silanizační směsi obsahující různou koncentraci HCl byly preinkubovány 18 hodin a aplikovány na nativní PDMS a PDMS oxidovaný Piraňa solution (podrobněji viz kapitola 4.1.3). Obrázek č. 6 ukazuje, že inkubace s těmito silanizačními směsmi způsobila pokles úhlu smáčení o 13 až 20° oproti referenčním vzorkům (nativní PDMS a PDMS oxidovaný Piraňa solution; bez následné silanizace). Největší efekt byl pozorován v případě preinkubace silanizační směsi v prostředí 0,1 M HCl. Z grafu jasně vyplývá, že nejúspěšnější byly povrchová modifikace směsí obsahující 0,1 M HCl na disku aktivovaném Piraňa solution.

Úhel smáčení (°)

125 115 105

Nativní PDMS Piraňa

95 85 75 voda

1mM HCl

0,1M HCl

reference

Obrázek č. 6: Změna úhlu smáčení po působení silanizační směsi preinkubované po dobu 18 hodin. PDMS disky (nativní nebo oxidované pomocí Piraňa solution) byly ošetřeny po dobu 5 minut silanizačními směsmi (obsahujícími různé koncentrace HCl) preinkubovanými 18 hodin. Data jsou uvedena jako průměr±směrodatná odchylka, N=6.

Analogickým způsobem byly aplikovány silanizační směsi preinkubované 42 hodin. Obrázek č. 7 ukazuje, že inkubace s těmito silanizačními směsmi způsobila pokles úhlu smáčení o 4 až 6° oproti referenčním vzorkům (nativní PDMS a PDMS oxidovaný Piraňa solution; bez následné silanizace). Z grafu vyplývá, že delší preinkubace měla zanedbatelný vliv na úspěšnost povrchových modifikací.

22

úhel smáčení (°)

125 115 105

Nativní PDMS Piraňa

95 85 75 voda

1mM HCl

0,1M HCl

reference

Obrázek č. 7: Změna úhlu smáčení po působení silanizační směsi preinkubované po dobu 42 hodin. PDMS disky (nativní nebo oxidované pomocí Piraňa solution) byly ošetřeny po dobu 5 minut silanizačními směsmi (obsahujícími různé koncentrace HCl) preinkubovanými 42 hodin. Data jsou uvedena jako průměr±směrodatná odchylka, N=6.

Z výše uvedených silanizačních postupů se jako nejefektivnější ukázala aplikace silanizační směsi s 0,1 M HCl preinkubované po dobu 18 hodin na PDMS disky předem oxidované Piraňa solution. Dále byl testován příspěvek samotné oxidace pomocí Piraňa solution a silanizace. Obrázek č. 9 ukazuje, že kombinace oxidace pomocí Piraňa solution a následné silanizace způsobila pouze minimální rozdíl úhlu smáčení (3 °) oproti samotné oxidaci pomocí Piraňa solution. 125

Úhel smáčení (°)

115 105 95 85 75 piraňa

silanizace

piraňa, silanizace

reference

Obrázek č. 9: Srovnání příspěvku oxidace pomocí Piraňa solution a silanizace k celkovému efektu kombinace obou metod. PDMS disky byly oxidovány Piraňa solution, silanizovány (směs s 0,1 M HCl, preinkubace 18 hodin) nebo byla provedena kombinace obou postupů. Jako reference byl použit nativní PDMS.

23

Vzhledem k tomu, že pro účely buněčných kultur je třeba modifikovaný PDMS sterilizovat, byl testován účinek autoklávování na povrchovou silanizaci. Silanizované PDMS disky byly vystaveny standardnímu suchému autoklávování a následně byl vyhodnocen jejich úhel smáčení. Obrázek č. 10 ukazuje, že autoklávování za sucha způsobilo zvýšení úhlu smáčení o 30° oproti diskům, které nebyly autoklávovány. Tím se úhel smáčení prakticky dostal na úroveň nativního PDMS. 125

Úhel smáčení (°)

115 105 95 85 75 před autoklávem

po autoklávu

reference

Obrázek č. 10: Změna úhlu smáčení silanizovaného povrchu PDMS po autoklávování za sucha. PDMS disky aktivované Piraňa solution modifikované silanizační směsí (0,1 M HCl, preinkubace 18 hodin) byly zautoklávovány (121 °C, 20 minut). Úhel smáčení byl vyhodnocen před a po autoklávování. Jako reference sloužil nativní PDMS. Data jsou uvedena jako průměr±směrodatná odchylka, N=6.

Návrat modifikovaného povrchu PDMS je možné omezit vystavením tohoto povrchu polární kapalině [9]. Proto bylo testováno, jestli autoklávování silanizovaných PDMS disků v destilované vodě zachová jejich výchozí úhel smáčení. Obrázek č. 11 ukazuje, že tento postup způsobil zvýšení úhlu smáčení o 1 až 2° oproti diskům, které nebyly autoklávovány.

24

125

Úhel smáčení (°)

115 105 95 85 75 před autoklávem

po autoklávu

reference

Obrázek č. 11: Změny úhlu smáčení modifikovaných povrchů po autoklávování v destilované vodě. PDMS disky modifikované Piraňa solution, nejúčinnější silanizační směsí (viz Obrázek č. 15) preinkubovanou po dobu 22 hodin (podrobněji viz kapitola 4.1.3) a kombinací obou metod byly autoklávovány v uzavíratelných skleněných láhvích v 75 ml destilované vody.

Obrázek č. 12 ukazuje, že oxidace pomocí Piraňa solution a následná silanizace způsobila pokles úhlu smáčení o 22 °, zatímco ošetření plazmou způsobilo pokles úhlu smáčení o 69 °. 140

Úhel smáčení (°)

120 100 80 60 40 20 0 piraňa + 0,1 M HCl

plazma

reference

Obrázek č. 12: Srovnání účinnosti chemické oxidace a následné silanizace s modifikací plazmou. PDMS disky byly oxidovány Piraňa solution a následně silanizovány (směs s 0,1 M HCl, preinkubace 18 hodin) nebo ošetřeny plazmou. Jako reference byl použit nativní PDMS. Data jsou uvedena jako průměr±směrodatná odchylka, N=6.

25

5.3 Příprava čipu Celkem byly připraveny 2 prototypy čipu různými metodami (viz obrázky č. 13 – 18) a bylo provedeno testování průchodnosti kanálků a těsnosti čipu (viz kapitola 4.2.7).

5.3.1

Prototyp 1

Jelikož špendlíky vycházely z jednoho konce formy (viz obrázek č. 13), po jejich vytažení z připraveného čipu vznikly otvory, jejichž zaslepování se ukázalo jako poměrně komplikované a časově náročné. Odstranění želatiny tvořící spoje špendlíků s hřebínkem z připraveného čipu nebylo možno dokonale provést. Také příprava hřebínků a jejich usazení na formu (viz obrázek č. 14) bylo velmi nepřesné. Z těchto důvodů byl postup přípravy obtížně reprodukovatelný, proto byl připraven prototyp 2.

Obrázek č. 13: Horní polovina formy s usazenými špendlíky přichycená k silanizovanému sklu

Obrázek č. 14: Forma s usazenými hřebínky

26

5.3.2

Prototyp 2

Příprava prototypu 2 byla snadno reprodukovatelná a rychlejší než příprava prototypu 1. Časově nejnáročnějšími částmi přípravy čipu byly příprava primárního odlitku z PDMS (viz obrázek č. 15) a vytvrzování PDMS v kompletní formě (viz obrázek č. 18). Doba vytvrzování PDMS v obou případech byla 24 hodin. Odlévání sekundární formy (viz obrázek č. 16) z primárního odlitku bylo možné zvládnout během 15 minut. Zkompletování formy včetně usazení špendlíků a jejich slepení s jehlami pomocí PEG (viz obrázek č. 17) trvalo 1 hodinu. Velkou předností prototypu 2 byla možnost opakovaně používat stejnou formu, díky tomu bylo možno zvládnout přípravu 1 čipu za 24 hodin. Výhodou prototypu 2 bylo snadné zaslepení otvorů vzniklých odlitím podpůrných struktur pouze pomocí přilepení skla, nebylo zde nutno provádět složité zaslepování kanálků PDMS. Za drobnou nevýhodu lze považovat křehkost přilepeného podložního skla, kterou bylo možno opatrnou manipulací minimalizovat. Prototyp číslo 2 měl celkem 4 verze. Výše zmíněný postup (viz kapitola 4.2.6) popisuje verzi číslo 4, finální. Pro verzi číslo 1 byly použity korálky válcovitého tvaru. Tyto korálky byly velmi drobné a špatně se s nimi manipulovalo. Pro tuto verzi byl vyroben pouze primární odlitek z PDMS. Pro další verze proto byly použity korálky trojhranné. Pro ostatní 3 verze byl proveden celý postup a byl připraven čip. Pro verzi číslo 2 byl využit hřebínek shodný s hřebínkem u prototypu 1. Během vytvrzování došlo k posunu jehel, a tak byly vytvořeny nesourodé vstupní otvory. U obou verzí bylo vytahování špendlíků a jehel z vytvrzeného PDMS velmi obtížné, proto bylo použita povrchová modifikace špendlíků hovězím sérovým albuminem (BSA) o koncentraci 1 mg ml-1. Vytahování takto ošetřených špendlíků a jehel již bylo snadné. Pro verzi 3 byly vstupní otvory vytvořeny zabodnutím jehel do vytvrzeného PDMS. Umístění takto vytvořených vstupních otvorů bylo nerovnoměrné. Otvory byly špatně prostupné, proto při zavádění jehly během testu těsnosti (viz kapitola 4.2.7) často docházelo k poškození kanálků. Pro lepení spojů byl nejprve použit 80% PEG, ten ovšem tuhl už při transportu z vytemperované nádoby. Dále byl testován 60% PEG, který již při transportu netuhl, ovšem při nanesení na místo určení trvalo jeho tuhnutí velmi dlouho. Proto byl nakonec použit 70% PEG, který také při transportu netuhl a navíc při nanesení na místo určení ztuhl do 10 sekund. Odstranění PEG z připraveného čipu bylo snadno proveditelné za použití vody. U všech čipů spojených s podkladovým sklem pomocí ošetření povrchů plazmou (viz kapitola 4.2.6) byly zjištěny při zkoušce těsnosti (viz kapitola 4.2.7) úniky kapaliny, proto byla pro ošetření povrchů plazmou použita komerční plazmová komora (viz kapitola 3.2).

27

Obrázek č. 15: Primární odlitek z PDMS

Obrázek č. 16: Sekundární forma z polyuretanové odlévací pryskyřice

Obrázek č. 17: Spodní díl formy se špendlíky a jehlami

28

Obrázek č. 18: Kompletní forma čipu

Aby byla ověřena účinnost oxidace povrchu PDMS uvnitř kanálku mikrofluidního čipu, byl vytvořen čip s jedním kanálkem. Kanálek byl ošetřen plazmou dle výše zmíněného postupu (viz kapitola (4.2.4). Hydrofilicita byla semikvantitavně vyhodnocena pomocí zakřivení menisků destilované vody uvnitř kanálku (viz obrázek č. 19).

Obrázek č. 19: Menisky destilované vody v kanálku čipu z PDMS povrchově modifikovaném pomocí plazmy. Kanálek o průměru 0,42 mm byl ovlivněn plazmou po uvedenou dobu. Tmavá část kanálku představuje vzduch, světlá část představuje destilovanou vodu.

5.4 Kultivace buněk za průtokových podmínek Experiment byl proveden s využitím čipů vlastní přípravy (postup přípravy viz kapitola 4.2.6) v porovnání s komerčními čipy Vena8 Endothelial+ od firmy Cellix. Čipy byly osazeny myšími endoteliálními buňkami linie MS-1 a připojeny k pumpě.

29

Experiment byl nejprve proveden na čipech vlastní přípravy. Stav inokula buněk byl zkontrolován ihned po osazení. Adheze buněk v jednotlivých kanálcích byla ověřena po 1 až 3 hodinách od jejich osazení. Po této době byly kanálky zaplněny buňkami, z nichž některé již začaly adherovat, ovšem v některých kanálcích došlo po spuštění průtoku k vymytí většiny buněk (viz obrázek č. 19).

Obrázek č. 19: Snímky kanálků mikrofluidního čipu vlastní přípravy pořízené pomocí mikroskopu v porovnání se statickou kulturou. Na obrázku jsou ukázány reprezentativní snímky: kanálek ihned po osazení (A, E); kanálek po 2 hodinách od osazení (B, F); kanálek po 16 hodinách průtoku s částečně vymytými buňkami (C, G); obrázek buněk kultivovaných za statických podmínek na misce (D, H). Jednotková úsečka odpovídá délce 50 µm.

V čipech vlastní přípravy docházelo k nerovnoměrnému růstu buněk v jednotlivých kanálcích. V některých kanálcích docházelo k velmi dobrému pokrytí buňkami a tyto buňky se začaly orientovat podél proudění (viz obrázek č. 20A). Zároveň v některých kanálcích došlo k vymytí buněk. Kanálky komerčních čipů byly naopak pravidelně pokryty vrstvou buněk (viz obrázek č. 20B).

30

Obrázek č. 20: Vrstva přisedlých endoteliálních buněk uvnitř kanálku čipu: vlastní přípravy (A), komerčního (B). Jednotková úsečka odpovídá délce 50 µm.

31

6 Diskuze Kultivace buněk v mikrofluidních zařízeních vyžaduje, aby povrchy těchto zařízení, které jsou v kontaktu s buňkami, měly vhodnou smáčivost [44]. Vzhledem k tomu, že PDMS, který byl zvolen pro konstrukci mikrofluidního čipu je silně hydrofobní a neumožňuje adhezi buněk, byly testovány modifikace jeho povrchu. Tyto modifikace byly kvantifikovány pomocí měření úhlu smáčení, který byl měřen na přisedlých kapkách. Nejdříve byla provedena optimalizace tohoto postupu s ohledem na přesnost a časovou průchodnost. Jako optimální se jevilo měření úhlu smáčení na 6 kapkách, protože při větším počtu kapek již přesnost měření prakticky nevzrůstala, ale časová náročnost měření rostla. Pro modifikace povrchu byla zvolena oxidace pomocí směsi kyseliny sírové a peroxidu vodíku v hmotnostním poměru 3:1 (tzv. Piraňa solution) [10] a následná silanizace pomocí TEOS [45]. Obě metody jsou snadno aplikovatelné pro obtížně přístupné povrchy kanálků uvnitř mikrofluidního čipu. Nicméně pro účely testů byly kvůli proveditelnosti měření úhlu smáčení zvoleny PDMS disky. Povrch PDMS disků byl nejprve oxidován a bylo na něm testováno několik postupů silanizace pomocí TEOS založených na různém stupni hydrolýzy této látky. Toho bylo dosaženo kombinováním rozdílných koncentrací HCl a doby preinkubace silanizační směsi. Pro HCl byly testovány koncentrace 0 M (přidání destilované vody místo HCl), 1 mM a 0,1 M. Efekt se prohluboval s rostoucí koncentrací HCl. Z výsledků vyplývá, že nejúčinnější byla směs s přídavkem 0,1 M HCl. Dále se ukázalo, že kratší preinkubace přispívá k větší efektivitě silanizační směsi. Směsi preinkubované 18 hodin vykazovaly lepší výsledky než směsi preinkubované 42 hodin. Nejúčinnější byla silanizační směs obsahující 0,1 M HCl preinkubovaná 18 hodin. Tato směs spolu s oxidací pomocí Piraňa solution způsobila pokles úhlu smáčení o 13 až 20 °. Dále byl testován příspěvek jednotlivých postupů na silanizaci povrchu oxidovaného pomocí Piraňa solution. Bylo zjištěno, že silanizace povrchu oxidovaného pomocí Piraňa solution způsobila oproti samotné oxidaci povrchu pomocí Piraňa solution pouze malý pokles úhlu smáčení (3 °). Z toho vyplývá, že pro celkový efekt procedury je důležitější povrchová oxidace PDMS, avšak následná silanizace může přispívat ke stabilizaci polárního povrchu díky tvorbě tenké vrstvy amorfního SiO2 [14]. Dlouhodobá udržitelnost buněčných kultur vyžaduje striktně sterilní podmínky, proto bylo otestováno, jestli je výše uvedená modifikace odolná vůči autoklávování. Autoklávování za sucha způsobovalo ztrátu modifikace a návrat PDMS do původního hydrofobního stavu.

32

Modifikovaný povrch PDMS má vyšší povrchovou energii a zvýšená teplota při autoklávování pouze urychlila přechod do stabilnějšího stavu s nižší povrchovou energií. Dle literatury je tomu možno zabránit vystavením povrchu polárnímu prostředí, které stabilizuje modifikovaný povrch PDMS [9]. Proto bylo testováno autoklávování PDMS disků v destilované vodě. Tato strategie se ukázala jako úspěšná, protože prakticky zachovala smáčivost povrchu před autoklávováním. Povrchová silanizace PDMS s využitím Piraňa solution způsobovala pouze omezenou změnu úhlu smáčení (o 13 až 20°). Zároveň kombinovaný efekt chemické oxidace a následné silanizace byl téměř srovnatelný s účinkem samotné oxidace. Z těchto důvodů byl dále otestován vliv působení plazmy bez následných úprav na povrch PDMS. Výsledky ukázaly, že silanizace povrchu oxidovaného Piraňa solution způsobila změnu úhlu smáčení o 22 °, zatímco oxidace pomocí plazmy způsobila změnu úhlu smáčení o 69 °. Z důvodů větší účinnosti byla použita technicky náročnější oxidace pomocí plazmy. Celkem byly připraveny 2 prototypy čipu. Prototyp 1 měl špendlíky ukotvené v boční stěně formy, na něž byly usazovány hřebínky pro tvorbu vstupních otvorů. Usazování jak špendlíků, tak hřebínků, bylo velmi nepřesné. Celý postup přípravy byl technicky náročný a složitě reprodukovatelný, proto byl připraven prototyp 2. U prototypu 2 byla použita odlišná strategie přípravy založená na vytvoření sekundární formy na základě primárního odlitku vytvořeného pomocí primární formy, která zajistila technicky méně náročnou přípravu většího počtu kusů. Veškeré elementy pro tvorbu kanálků pevně kotveny do podpůrných struktur ve dně formy. Spoje špendlíků s jehlami byly lepeny PEG, který je snadno vymyvatelný vodou. Přilepení podložního skla na spodní část čipu umožňovalo snadné zaslepení otvorů po vytažení odlitku z formy. Aplikace plazmy je velice jednoduchá na volných površích, avšak uvnitř kanálků v mikrofluidním čipu představuje značnou technickou komplikaci. Uvnitř plazmových komor případně při manuálním ošetření plazmou (viz kapitola 4.2.4) je zde limitace difuzí plazmy pouze na omezenou vzdálenost. Smáčivost kanálků po působení plazmy byla ověřována hodnocením zakřivení menisků destilované vody uvnitř kanálků (viz kapitola 5.3.2). Jako nejoptimálnější se ukázalo ošetřování vnitřního povrchu kanálku pomocí plazmy po dobu 1 minuty. V čipech docházelo k nerovnoměrné adhezi buněk, jednotlivé kanálky se od sebe navzájem velmi lišily. I přes úspěšnou adhezi v některých kanálcích došlo zpravidla ke kompletnímu vymytí buněk z kanálků. Špatná adheze buněk mohla být způsobena chybou při pipetování kolagenu či jeho nerovnoměrnou adsorpcí na stěnu kanálků. Dále také mohlo dojít k nerovnoměrnému ošetření kanálku plazmou, tedy že účinnost plazmy byla odlišná v různých místech kanálků.

33

Kvůli výše uvedeným důvodům je do budoucna nutno provést další optimalizace vnitřního povrchu kanálků v čipu. V případech kanálků, kde došlo k úspěšné kolonizaci kanálků buňkami, se tyto buňky orientovaly podél toku, což je jeden z projevů jejich fyziologického chování [46].

34

7 Závěr 

Pro modifikaci povrchu PDMS byla použita oxidace pomocí Piraňa solution nebo kombinace tohoto postupu se silanizací pomocí TEOS. Dále bylo testováno ošetření povrchů plazmou. Jako nejefektivnější co se týká zvýšení hydrofilicity se ukázalo ošetření povrchu plazmou.



Z testovaných příprav čipů byl nejlepší postup založený na vytvoření primární formy, následně primárního odlitku a dále sekundární formy, do které byly uchyceny špendlíky a jehly slouží jako matrice kanálků a vstupních otvorů. Čip byl zkompletován přichycením odlitku k podložnímu sklu pomocí plazmy.



Bylo docíleno kolonizace kanálků mikrofluidního čipu endoteliálními buňkami. Pokrytí těmito buňkami nebylo rovnoměrné ve všech kanálcích.



Do budoucna je nutno provést další optimalizace vnitřního povrchu kanálků pro zlepšení adheze buněk.

35

8 Seznam použité literatury [1]

SACKMANN, Eric K, Anna L FULTON and David J BEEBE. The present and future role of microfluidics in biomedical research. Nature [online]. 2014, vol. 507, no. 7491, pp. 181–9. Retrieved z: doi:10.1038/nature13118

[2]

BHATIA, Sangeeta N and Donald E INGBER. Microfluidic organs-on-chips. Nature biotechnology. 2014.

[3]

VAN DER MEER, AD, AA POOT, MHG DUITS, J FEIJEN and I VERMES. Microfluidic technology in vascular research. BioMed Research International. 2009, vol. 2009.

[4]

KUCHAN, MJ and JA FRANGOS. ROLE OF CALCIUM AND CALMODULIN IN FLOW-INDUCED NITRIC-OXIDE PRODUCTION IN ENDOTHELIALCELLS. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY. 1994, vol. 266, no. 3, 1, pp. C628–C636. ISSN 0002-9513.

[5]

YANG, Xiaoxi, Omid FOROUZAN, Jennie M. BURNS and Sergey S. SHEVKOPLYAS. Traffic of leukocytes in microfluidic channels with rectangular and rounded cross-sections. LAB ON A CHIP [online]. 2011, vol. 11, no. 19, pp. 3231–3240. ISSN 1473-0197. Retrieved z: doi:10.1039/c1lc20293f

[6]

WONG, Ieong and Chih-Ming HO. Surface molecular property modifications for poly(dimethylsiloxane) (PDMS) based microfluidic devices. MICROFLUIDICS AND NANOFLUIDICS [online]. 2009, vol. 7, no. 3, pp. 291–306. ISSN 16134982. Retrieved z: doi:10.1007/s10404-009-0443-4

[7]

WHITESIDES, George M. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006, vol. 442, no. 7101, pp. 368–373.

[8]

ZHOU, Jinwen, Amanda Vera ELLIS and Nicolas Hans VOELCKER. Recent developments in PDMS surface modification for microfluidic devices. ELECTROPHORESIS [online]. 2010, vol. 31, no. 1, SI, pp. 2–16. ISSN 01730835. Retrieved z: doi:10.1002/elps.200900475

[9]

LEE, Jessamine Ng, Cheolmin PARK and George M WHITESIDES. Solvent compatibility of poly (dimethylsiloxane)-based microfluidic devices. Analytical chemistry. 2003, vol. 75, no. 23, pp. 6544–6554.

[10]

KOH, Kai-Seng, Jitkai CHIN, Joanna CHIA and Choon-Lai CHIANG. Quantitative studies on PDMS-PDMS interface bonding with piranha solution and its swelling effect. Micromachines. 2012, vol. 3, no. 2, pp. 427–441.

[11]

MAKAMBA, H, JH KIM, K LIM, N PARK and JH HAHN. Surface modification of poly(dimethylsiloxane) microchannels. ELECTROPHORESIS [online]. 2003, vol. 24, no. 21, pp. 3607–3619. ISSN 0173-0835. Retrieved z: doi:10.1002/elps.200305627

36

[12]

EFIMENKO, K, WE WALLACE and J GENZER. Surface modification of Sylgard-184 poly(dimethyl siloxane) networks by ultraviolet and ultraviolet/ozone treatment. JOURNAL OF COLLOID AND INTERFACE SCIENCE [online]. 2002, vol. 254, no. 2, pp. 306–315. ISSN 0021-9797. Retrieved z: doi:10.1006/jcis.202.8594

[13]

BERDICHEVSKY, Y, J KHANDURINA, A GUTTMAN and YH LO. UV/ozone modification of poly(dimethylsiloxane) microfluidic channels. SENSORS AND ACTUATORS B-CHEMICAL [online]. 2004, vol. 97, no. 2-3, pp. 402–408. ISSN 0925-4005. Retrieved z: doi:10.1016/j.snb.2003.09.022

[14]

VISTAS, Claudia R., Ana C. P. AGUAS and Guilherme N. M. FERREIRA. Silanization of glass chips-A factorial approach for optimization. APPLIED SURFACE SCIENCE [online]. 2013, vol. 286, pp. 314–318. ISSN 0169-4332. Retrieved z: doi:10.1016/j.apsusc.2013.09.077

[15]

VANDERVOORT, P and EF VANSANT. Silylation of the silica surface a review. JOURNAL OF LIQUID CHROMATOGRAPHY \& RELATED TECHNOLOGIES [online]. 1996, vol. 19, no. 17-18, pp. 2723–2752. ISSN 10826076. Retrieved z: doi:10.1080/10826079608015107

[16]

CRAS, JJ, CA ROWE-TAITT, DA NIVENS and FS LIGLER. Comparison of chemical cleaning methods of glass in preparation for silanization. BIOSENSORS \& BIOELECTRONICS [online]. 1999, vol. 14, no. 8-9, pp. 683–688. ISSN 09565663. Retrieved z: doi:10.1016/S0956-5663(99)00043-3

[17]

HOWARTER, John A. and Jeffrey P. YOUNGBLOOD. Optimization of silica silanization by 3-aminopropyltriethoxysilane. LANGMUIR [online]. 2006, vol. 22, no. 26, pp. 11142–11147. ISSN 0743-7463. Retrieved z: doi:10.1021/la061240g

[18]

KWOK, DY and AW NEUMANN. Contact angle measurement and contact angle interpretation. ADVANCES IN COLLOID AND INTERFACE SCIENCE [online]. 1999, vol. 81, no. 3, pp. 167–249. ISSN 0001-8686. Retrieved z: doi:10.1016/S0001-8686(98)00087-6

[19]

RESNICK, N, H YAHAV, A SHAY-SALIT, M SHUSHY, S SCHUBERT, LCM ZILBERMAN and E WOFOVITZ. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. PROGRESS IN BIOPHYSICS \& MOLECULAR BIOLOGY [online]. 2003, vol. 81, no. 3, pp. 177–199. ISSN 00796107. Retrieved z: doi:10.1016/S0079-6107(02)00052-4

[20]

KIRKPATRICK, CJ, M WAGNER, I HERMANNS, CL KLEIN, H KOHLER, M OTTO, TG VANKOOTEN and F BITTINGER. Physiology and cell biology of the endothelium: A dynamic interface for cell communication. INTERNATIONAL JOURNAL OF MICROCIRCULATION-CLINICAL AND EXPERIMENTAL [online]. 1997, vol. 17, no. 5, pp. 231–240. ISSN 0167-6865. Retrieved z: doi:10.1159/000179235

37

[21]

KIRKPATRICK, CJ, F BITTINGER, CL KLEIN, S HAUPTMANN and B KLOSTERHALFEN. The role of the microcirculation in multiple organ dysfunction syndrome (MODS): A review and perspective. VIRCHOWS ARCHIV-AN INTERNATIONAL JOURNAL OF PATHOLOGY. 1996, vol. 427, no. 5, pp. 461–476. ISSN 0945-6317.

[22]

NAWROTH, PP, DA HANDLEY, CT ESMON and DM STERN. INTERLEUKIN-1 INDUCES ENDOTHELIAL-CELL PROCOAGULANT WHILE SUPPRESSING CELL-SURFACE ANTICOAGULANT ACTIVITY. PROCEEDINGS OF THE NATIONAL ACADEMY OF SCIENCES OF THE UNITED STATES OF AMERICA [online]. 1986, vol. 83, no. 10, pp. 3460–3464. ISSN 0027-8424. Retrieved z: doi:10.1073/pnas.83.10.3460

[23]

FUJII, S, H SAWA, JE SAFFITZ, CL LUCORE and BE SOBEL. INDUCTION OF ENDOTHELIAL-CELL EXPRESSION OF THE PLASMINOGENACTIVATOR INHIBITOR TYPE-1 GENE BY THROMBOSIS INVIVO. CIRCULATION. 1992, vol. 86, no. 6, pp. 2000–2010. ISSN 0009-7322.

[24]

KANAZAWA, K, S KAWASHIMA, S MIKAMI, Y MIWA, K HIRATA, M SUEMATSU, Y HAYASHI, H ITOH and M YOKOYAMA. Endothelial constitutive nitric oxide synthase protein and mRNA increased in rabbit atherosclerotic aorta despite impaired endothelium-dependent vascular relaxation. AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY. 1996, vol. 148, no. 6, pp. 1949–1956. ISSN 0002-9440.

[25]

BEVILACQUA, MP and RM NELSON. ENDOTHELIAL-LEUKOCYTE ADHESION MOLECULES IN INFLAMMATION AND METASTASIS. THROMBOSIS AND HAEMOSTASIS. 1993, vol. 70, no. 1, pp. 152–154. ISSN 0340-6245.

[26]

SHARAR, SR, RK WINN and JM HARLAN. THE ADHESION CASCADE AND ANTIADHESION THERAPY - AN OVERVIEW. SPRINGER SEMINARS IN IMMUNOPATHOLOGY. 1995, vol. 16, no. 4, pp. 359–378. ISSN 0344-4325.

[27]

KAPLANSKI, G, C FARNARIER, AM BENOLIEL, C FOA, S KAPLANSKI and P BONGRAND. A NOVEL ROLE FOR E-SELECTIN AND P-SELECTIN SHAPE CONTROL OF ENDOTHELIAL-CELL MONOLAYERS. JOURNAL OF CELL SCIENCE. 1994, vol. 107, no. 9, pp. 2449–2457. ISSN 0021-9533.

[28]

DAVIES, PF. FLOW-MEDIATED ENDOTHELIAL MECHANOTRANSDUCTION. PHYSIOLOGICAL REVIEWS. 1995, vol. 75, no. 3, pp. 519–560. ISSN 0031-9333.

[29]

LI, YSJ, JH HAGA and S CHIEN. Molecular basis of the effects of shear stress on vascular endothelial cells. JOURNAL OF BIOMECHANICS [online]. 2005, vol. 38, no. 10, pp. 1949–1971. ISSN 0021-9290. Retrieved z: doi:10.1016/j.jbiomech.2004.09.030

38

[30]

INGBER, D. In search of cellular control: Signal transduction in context. JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY. 1998, no. 30-31, pp. 232–237. ISSN 0730-2312.

[31]

SCHWARTZ, MA, MD SCHALLER and MH GINSBERG. Integrins: Emerging paradigms of signal transduction. ANNUAL REVIEW OF CELL AND DEVELOPMENTAL BIOLOGY [online]. 1995, vol. 11, pp. 549–599. ISSN 10810706. Retrieved z: doi:10.1146/annurev.cellbio.11.1.549

[32]

WANG, YX, H MIAO, S LI, KD CHEN, YS LI, SL YUAN, JYJ SHYY and S CHIEN. Interplay between integrins and FLK-1 in shear stress-induced signaling. AMERICAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY-CELL PHYSIOLOGY [online]. 2002, vol. 283, no. 5, pp. C1540–C1547. ISSN 0363-6143. Retrieved z: doi:10.1152/ajpcell.00222.2002

[33]

NILIUS, B and G DROOGMANS. Ion channels and their functional role in vascular endothelium. PHYSIOLOGICAL REVIEWS. 2001, vol. 81, no. 4, pp. 1415–1459. ISSN 0031-9333.

[34]

SATO, M, N OHSHIMA and RM NEREM. Viscoelastic properties of cultured porcine aortic endothelial cells exposed to shear stress. JOURNAL OF BIOMECHANICS [online]. 1996, vol. 29, no. 4, pp. 461–467. ISSN 0021-9290. Retrieved z: doi:10.1016/0021-9290(95)00069-0

[35]

LEVESQUE, MJ, RM NEREM and EA SPRAGUE. VASCULAR ENDOTHELIAL-CELL PROLIFERATION IN CULTURE AND THE INFLUENCE OF FLOW. BIOMATERIALS [online]. 1990, vol. 11, no. 9, pp. 702–707. ISSN 0142-9612. Retrieved z: doi:10.1016/0142-9612(90)90031-K

[36]

MITSUMATA, M, RM NEREM, RW ALEXANDER and B BERK. SHEARSTRESS INHIBITS ENDOTHELIAL-CELL PROLIFERATION BY GROWTH ARREST IN THE G0/G1 PHASE OF THE CELL-CYCLE. FASEB JOURNAL. 1991, vol. 5, no. 4, 1, p. A527. ISSN 0892-6638.

[37]

CHIU, JJ, DL WANG, S CHIEN, R SKALAK and S USAMI. Effects of disturbed flow on endothelial cells. JOURNAL OF BIOMECHANICAL ENGINEERING-TRANSACTIONS OF THE ASME [online]. 1998, vol. 120, no. 1, pp. 2–8. ISSN 0148-0731. Retrieved z: doi:10.1115/1.2834303

[38]

DEWEY, CF, SR BUSSOLARI, MA GIMBRONE and PF DAVIES. THE DYNAMIC-RESPONSE OF VASCULAR ENDOTHELIAL-CELLS TO FLUID SHEAR-STRESS. JOURNAL OF BIOMECHANICAL ENGINEERINGTRANSACTIONS OF THE ASME. 1981, vol. 103, no. 3, pp. 177–185. ISSN 0148-0731.

[39]

EL-ALI, Jamil, Peter K. SORGER and Klavs F. JENSEN. Cells on chips. NATURE [online]. 2006, vol. 442, no. 7101, pp. 403–411. ISSN 0028-0836. Retrieved z: doi:10.1038/nature05063

39

[40]

BARKEFORS, Irmeli, Sebastien LE JAN, Lars JAKOBSSON, Eduar HEJLL, Gustav CARLSON, Henrik JOHANSSON, Jonas JARVIUS, Jeong Won PARK, Noo Li JEON and Johan KREUGER. Endothelial cell migration in stable gradients of vascular endothelial growth factor a and fibroblast growth factor 2 Effects on chemotaxis and chemokinesis. JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY [online]. 2008, vol. 283, no. 20, pp. 13905–13912. ISSN 00219258. Retrieved z: doi:10.1074/jbc.M704917200

[41]

ZAARI, N, P RAJAGOPALAN, SK KIM, AJ ENGLER and JY WONG. Photopolymerization in microfluidic gradient generators: Microscale control of substrate compliance to manipulate cell response. ADVANCED MATERIALS [online]. 2004, vol. 16, no. 23-24, p. 2133+. ISSN 0935-9648. Retrieved z: doi:10.1002/adma.200400883

[42]

SONG, Jonathan W., Stephen P. CAVNAR, Ann C. WALKER, Kathryn E. LUKER, Mudit GUPTA, Yi-Chung TUNG, Gary D. LUKER and Shuichi TAKAYAMA. Microfluidic Endothelium for Studying the Intravascular Adhesion of Metastatic Breast Cancer Cells. PLOS ONE [online]. 2009, vol. 4, no. 6. ISSN 1932-6203. Retrieved z: doi:10.1371/journal.pone.0005756

[43]

FIDKOWSKI, C, MR KAAZEMPUR-MOFRAD, J BORENSTEIN, JP VACANTI, R LANGER and YD WANG. Endothelialized microvasculature based on a biodegradable elastomer. TISSUE ENGINEERING [online]. 2005, vol. 11, no. 1-2, pp. 302–309. ISSN 1076-3279. Retrieved z: doi:10.1089/ten.2005.11.302

[44]

FUARD, D., T. TZVETKOVA-CHEVOLLEAU, S. DECOSSAS, P. TRACQUI and P. SCHIAVONE. Optimization of poly-di-methyl-siloxane (PDMS) substrates for studying cellular adhesion and motility. MICROELECTRONIC ENGINEERING [online]. 2008, vol. 85, no. 5-6, pp. 1289–1293. ISSN 01679317. Retrieved z: doi:10.1016/j.mee.2008.02.004

[45]

ABATE, Adam R, Daeyeon LEE, Thao DO, Christian HOLTZE and David A WEITZ. Glass coating for PDMS microfluidic channels by sol-gel methods. Lab on a Chip. 2008, vol. 8, no. 4, pp. 516–518.

[46]

WONG, Keith H K, Juliana M CHAN, Roger D KAMM and Joe TIEN. Microfluidic models of vascular functions. Annual review of biomedical engineering [online]. 2012, vol. 14, pp. 205–30. Retrieved z: doi:10.1146/annurev-bioeng-071811-150052

40