MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE. Diplomová práce

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE

Diplomová práce

Brno 2013

Lea Neumayerová

MASARYKOVA UNIVERZITA PŘÍRODOVĚDECKÁ FAKULT FAKULTA ÚSTAV BOTANIKY A ZOOLOGIE ZOOLOGIE

Asistovaná reprodukce: současné trendy trendy v hodnocení embryí

Diplomová práce

Lea Neumayerová

Vedoucí práce: RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.

Brno 2013

Bibliografický záznam Autor:

Bc. Lea Neumayerová Přírodovědecká fakulta, Masarykova univerzita Ústav botaniky a zoologie

Název práce:

Asistovaná reprodukce: současné trendy v hodnocení embryí

Studijní program:

Chemie

Studijní obor:

Učitelství chemie pro střední školy – Učitelství biologie pro střední školy

Vedoucí práce:

RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.

Akademický rok:

2012/2013

Počet stran: Klíčová slova:

87 Asistovaná reprodukce; Embryo; Zygota; Morfologie; Metabolomika; Genetická analýza; Kultivace; Médium; IVF; PGD

Bibliographic Entry Author:

Bc. Lea Neumayerová Faculty of Science, Masaryk University Department of botany and zoology

Title of Thesis:

Assisted reproduction: Contemporary Trends in Evaluation of Embryos

Degree programme:

Chemistry

Field of Study:

Chemistry with a view to education Biology with a view to education

Supervisor:

RNDr. Helena Nejezchlebová, Ph.D.

Academic Year:

2012/2013

Number of Pages:

87

Keywords:

Assisted reproduction; Embryo; Zygote; Morphology; Metabolomics; Genetic analysis; Cultivation; Medium; IVF; PGD

Abstrakt Tato práce se věnuje současným trendům v hodnocení embryí a jejich kultivací. Embrya můžeme hodnotit z mnoha hledisek. Hlavními metodami posouzení embryí jsou morfologie, monitoring kultivace, metabolomická a genetická analýza. Mezi nejstarší a také nejpoužívanější metodu patří posouzení morfologie embryí. Hodnocení kvality na základě morfologie se provádí v pevně stanovených bodech vývoje. Mezi nejběžnější typy morfologických hodnotících systémů patří Tesarikův, Scottův nebo Gardnerův. Morfologické zhodnocení využívá i time-lapse monitoring. Tento typ monitoringu umožňuje šetrnější a bezpečnější zhodnocení embryí. Mezi nejnovější metody hodnoceni kvality a viability embryí patří metabolomická a genetická analýza. Metabolomická analýza patří mezi nejnovější metody a prozatím je ve fázi experimentálního vývoje. Metabolomika ke svým účelům používá řadu analytických metod, mezi nejpoužívanější a nejperspektivnější metody patří nukleární magnetická rezonance (NMR) a blízká infračervená spektroskopie (NIR). NMR, NIR a měření embryonální respirace. Ke stanovení genetických defektů se používá preimplantační genetické diagnostiky (PGS) a preimplantační genetický screening (PGD). K úspěšnosti obou metod přispívá hojné využívání PCR, FISH a mikročipů. Mikročipy jsou v současnosti asi nejefektivnější metodou pro analýzu.

Abstract This thesis focuses on the current trends in the evaluation of embryos and their cultivation. Embryos can be evaluated from many aspects. Morphology, monitoring of cultivation, metabolomics and genetic analysis are the main methods of embryo viability evaluation. One of the oldest and the most widely used methods includes the assessment of embryo morphology. Quality evaluation based on morphology is performed at fixed points of development. The most common types of morphological evaluation systems are Tesarik’s, Scott’s or Gardner’s. Morphological evaluation is also used for time-lapse monitoring. This type of monitoring allows gentler and safer evaluation of embryos. Metabolomics and genetic analysis are among the newest methods of evaluating the quality and viability of embryos. Metabolomic analysis is one of the latest methods and for now it is at the stage of experimental development. Metabolomics for its purposes uses a number of analytical methods, the most common and the most promising methods include nuclear magnetic resonance (NMR), near infrared spectroscopy (NIR) and measurements of embryonic respiration. To determine the genetic defects, preimplantation genetic diagnosis (PGS) and preimplantation genetic screening (PGD) are used. PCR, FISH and microarrays contribute significantly to the succcess of both methods. At this time microarrays are probably the most effective method for the genetic analysis.

Poděkování Na tomto místě bych chtěla poděkovat RNDr. Heleně Nejezchlebová, Ph.D za odborné vedení mé diplomové práce, za cenné rady, ochotu a podnětnou kritiku, kterou mi poskytla při jejím zpracování. Dále bych ráda poděkovala mému příteli, sestře, rodičům a rodině mého přítele za podporu a trpělivost během celého studia.

Prohlášení Prohlašuji, že jsem svoji diplomovou práci vypracovala samostatně s využitím informačních zdrojů, které jsou v práci citovány.

Brno 13. května 2013

……………………………… Jméno Příjmení

1.

Obsah Úvod ........................................................................................................................ 14

2.

Rozmnožování a preimplantační vývoj člověka...................................................... 16

2.1 Progeneze .................................................................................................................. 16 2.1.1 Gametogenenze ...................................................................................................... 16 2.1.2 Meióza (redukční dělení) ....................................................................................... 16 2.1.3 Vývoj mužských pohlavních buněk (spermiogeneze) ........................................... 17 2.1.3.1 Spermiocytogeneze ............................................................................................. 18 2.1.3.2 Spermatohistogeneze .......................................................................................... 18 2.1.3.3 Stavba spermie .................................................................................................... 18 2.1.4 Vývoj ženských pohlavních buňek (oogeneze) ..................................................... 19 2.1.4.1 Stavba folikulů .................................................................................................... 20 2.1.4.2 Menstruační cyklus ............................................................................................. 21 2.1.4.3 Ovariální cyklus .................................................................................................. 22 2.1.5 Oplození ................................................................................................................. 22 2.1.6 Zygota .................................................................................................................... 22 2.2 Blastogeneze ............................................................................................................. 23 2.2.1 Rýhování ................................................................................................................ 23 2.2.2 Blastocysta ............................................................................................................. 23 3.

Asistovaná reprodukce ............................................................................................ 25

3.1 Metody asistované reprodukce ................................................................................. 25 3.1.1 Umělá inseminace .................................................................................................. 26 3.1.2 IVF a ET ................................................................................................................ 27 3.1.2.1 Provedení in vitro fertilizace............................................................................... 27 3.1.2.2 ICSI ..................................................................................................................... 28 3.1.2.2.1 Příprava a selekce spermií pro ICSI ................................................................ 28 3.1.2.2.2 Příprava a injekce spermie při ICSI ................................................................. 29 3.1.3 Kryokonzervace ..................................................................................................... 29 4.

Kultivace embryí ..................................................................................................... 30

4.1 Kultivační nádoby ..................................................................................................... 30 4.2 Kultivační prostředí .................................................................................................. 32

10

4.2.1 Složení a typy kultivačního média ......................................................................... 33 4.2.1.1 První skupina - jednoduché solné roztoky doplněné o energetický substrát...... 33 4.2.1.2 Druhá skupina - komplexní tkáňová kultivační média........................................ 33 4.2.1.3 Třetí skupina - jednoduchá optimalizovaná média (Simplex Optimized Media)33 4.2.1.4 Čtvrtá skupina - Sekvenční média ....................................................................... 34 4.2.2 Další složky kultivačního média ............................................................................ 36 4.2.2.1 Voda .................................................................................................................... 36 4.2.2.2 Ionty .................................................................................................................... 36 4.2.2.3 Sacharidy ............................................................................................................. 37 4.2.2.4 Aminokyseliny .................................................................................................... 37 4.2.2.5 Makromolekuly ................................................................................................... 38 4.2.2.6 Vitamíny .............................................................................................................. 39 4.2.2.7 Chelátory ............................................................................................................. 39 4.2.2.8 Antibiotika ........................................................................................................... 40 4.2.3 Kultivační podmínky .............................................................................................. 40 4.2.3.1 Koncentrace kyslíku ............................................................................................ 40 4.2.3.2 pH ........................................................................................................................ 41 4.2.3.2.1 pH a jeho indikátor ........................................................................................... 42 4.2.3.3 Osmolarita a teplota ............................................................................................ 42 5.

Morfologické hodnocení .......................................................................................... 43

5.1 Morfologické hodnocení zygot a embryí .................................................................. 43 5.1.1 Hodnocení zygot .................................................................................................... 44 5.1.1.1 Hodnocení zygot podle Tesarika ......................................................................... 44 5.1.1.2 Hodnocení zygot podle Scotta............................................................................. 45 5.1.2 Hodnocení embryí na začátku druhého dne ........................................................... 46 5.1.3 Hodnocení ve stáří dvou dnů .................................................................................. 46 5.1.3.1 Hodnocení embrya ve stáří dvou dnů podle počtu buněk ................................... 46 5.1.3.2 Hodnocení embrya ve stáří dvou dnů podle množství fragmentů ....................... 46 5.1.3.3 Hodnocení embrya ve stáří dvou dnů podle symetrie ......................................... 48 5.1.4 Morfologické hodnocení ve stáří tří dnů ................................................................ 49 5.1.4.1 První typ hodnocení ve stáří tří dnů .................................................................... 49 5.1.4.2 Druhý typ hodnocení embryí ve stáří tří dnů ...................................................... 50

11

5.1.5 Morfologické hodnocení ve stádiu blastocysty staré pět nebo šest dní ................. 50 5.2 Time-lapse monitoring .............................................................................................. 51 5.2.1 Srovnání morfologických a time-laps kategorií..................................................... 53 5.3 Poloautomatické hodnocení blastocyst ..................................................................... 54 6.

Hodnocení kvality embryí na základě metabolomiky ............................................. 55

6.1 Metabolomika jako vědní disciplína ......................................................................... 55 6.2 Metabolismus embrya jako známka reprodukčního potenciálu ............................... 56 6.2.1 Metabolismus pyruvátu.......................................................................................... 56 6.2.2 Metabolismus glukózy ........................................................................................... 57 6.2.3 Metabolismus aminokyselin .................................................................................. 58 6.2.4 Metabolismus kyslíku ............................................................................................ 58 6.2.5 Rozpustný antigen-G lidských leukocytů .............................................................. 60 6.2.6 Leptin ..................................................................................................................... 60 6.3 Metody metabolomické analýzy ............................................................................... 61 6.3.1 Vybrané analytické metody používané pro metabolomickou analýzu .................. 62 6.3.1.1 Ramanova spektroskopie .................................................................................... 62 6.3.1.2 Spektroskopie v blízké infračervené oblasti NIR spektrometrie ........................ 63 6.3.1.3 Metoda nukleární magnetické rezonance NMR ................................................. 64 7.

Preimplantační genetická diagnostika neboli PGD ................................................. 66

7.1 Historie a současnost PGD ....................................................................................... 66 7.2 PGD a preimplantační genetický screening PGS ..................................................... 66 7.3. Provedení PGD ........................................................................................................ 67 7.3.1 Biopsie ................................................................................................................... 68 7.3.2 Biopsie polárních tělísek ........................................................................................ 68 7.3.3 Biopsie blastomer .................................................................................................. 69 7.3.4 Analýza získaného materiálu ................................................................................. 70 7.3.4.1 Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) .................. 70 7.3.4.2 Fluorescenční in situ hybridizace - FISH ........................................................... 71 7.3.4.3 Srovnávací genomová hybridizace (comparative genomic hybridization - CGH) a microarray (mikročipy) ................................................................................................ 72 Závěr ............................................................................................................................... 74 Seznam použité literatury ............................................................................................... 76

12

Internetové zdroje ............................................................................................................ 84 Seznam použitých zkratek ............................................................................................... 86

13

1. Úvod

Každým rokem přibývá počet dětí narozených díky technikám asistované reprodukce. Podle kvalifikovaného odhadu odborníků měl v minulém roce počet dětí narozených s pomocí technik asistované reprodukce přesáhnout 5 milionů (URL 1). V roce 1989 bylo hlášeno ve světě 30 000 dětí, u nás to byly maximálně desítky (URL 2). V roce 2002 už čísla stoupla ke statisícům (okolo 200 000) a u nás se jednalo téměř o 3000 dětí. V přepočtu to znamená, že ze všech narozených dětí se až 3 % narodila po použití metod asistované reprodukce. A můžeme předpokládat, že tento trend bude dále eskalovat. Párům, kterým není dána možnost přirozeně otěhotnět, pomáhá ve většině případů metoda in vitro fertilizace (IVF). Ani tato metoda ovšem nezaručí otěhotnění partnerky, přestože se embrya vyhodnotila jako velice kvalitní. A proto je hlavním cílem oboru reprodukční medicíny zvýšit efektivnost metod, podle kterých se vybírají embrya vhodná pro přenos do dělohy. Proto je nutné zefektivnit výběrové metody embryí. Další problém spojený s metodami asistované reprodukce zůstává vyšší výskyt vícečetných těhotenství (URL 2). Tomu se však stále častěji čelí přenosem jediného embrya neboli singl embryo transfer (SET). SET se nejrychleji prosazuje v zemích s vyspělou reprodukční medicínou a také u nás průměrný počet transferovaných embryí již klesl pod 2 embrya. Konvenční metody hodnocení embryí na základě morfologie se jeví jako nedostatečné a vedou k vývoji nových hodnoticích systému nebo technik. Je možné sledovat růst počtu cyklů asistované reprodukce, který se celosvětově zvyšuje. Proto je cílem reprodukční medicíny všechna úskalí překonat a identifikovat nejlepší embryo za použití efektivnějších a pokud možno méně invazivních metod. Všechna tato úskalí vedla tedy k rozvoji nových hodnotících metod. Do popředí zájmů většiny výzkumů se dostala metabolomika nebo genetická analýza. Ke zdokonalování nedochází jen u selekčních procesů, ale i u metod zaměřujících se na samotnou kultivaci embryí. Hodnotí se jak podmínky kultivace, tak i jednotlivé komponenty kultivačního média. Cílem této práce je shrnout a zhodnotit novinky v oblasti hodnocení embryí. Tato rychle se rozvíjející oblast je v době metod asistované reprodukce nepostradatelná. A

14

díky svému vlivu se zařazuje mezi témata velice žádaná. Dalším ze záměrů této práce je zanalyzovat vývoj v této dynamicky se měnící oblasti.

15

2. Rozmnožování a preimplantační vývoj člověka

Vývoj jedince začíná oplozením, tedy splynutím ženské a mužské pohlavní buňky (ČECH et al., 2011). Ke spojení oocytu se spermií a vzniku zygoty nejčastěji dochází v ampulární části vejcovodu. Ale za opravdový počátek gravidity se obvykle považuje až uhnízdění zárodku v děložní sliznici. Podle Trávníka & Čecha (2011) i při dokonalých podmínkách u zdravých partnerů dochází ke vzniku těhotenství jen ve 24 až 30 % případů. Neúspěch většinou spadá právě do období před implantací. Celý preimplantační vývoj je tvořen procesem progeneze, gametogeneze a meiózou. Výsledkem jsou zralé pohlavní buňky, v případě ženských pohlavních buněk se jedná o vajíčka, u mužských buněk hovoříme o spermiích.

2.1 Progeneze Jako progeneze se označuje období zahrnující dva procesy, které probíhají před vlastním ontogenetickým vývojem, jedná se o gametogenezi a oplození (VACEK, 2006). Gametogeneze je proces, při kterém se vyvíjejí pohlavních buňky a zahrnuje jak vývoj spermií, spermatogenezi tak i vývoj vajíček, oogenezi (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003).

2.1.1 Gametogenenze Pro zralé gamety, spermie a oocyt, je typické, že obsahují poloviční, tedy haploidní počet chromosomů (KLIKA, 1985). Poloviční počet chromozomů je nepostradatelný, protože po splynutí spermie a vajíčka musí být zygota vybavena opět diploidním počtem chromozomů, jako je tomu u somatických buněk. Gamety, spermie a oocyt, mají tedy 23 chromozomů (MOORE et al., 2013). Zatímco somatické buňky mají dva páry, tedy 46 chromozomů. Gamety vznikají procesem zvaným meióza neboli redukční dělení ve specializovaných orgánech u mužů ve varlatech (testes) a u žen ve vaječnících (ovaria).

2.1.2 Meióza (redukční dělení) Meióza je mechanismus pohlavního rozmnožování, pomocí něhož se počet chromozomů v buňce zmenšuje na polovinu (ROSYPAL, 2003). Toto dělení probíhá ve

16

dvou fázích. První zrací dělení (heterotypi heterotypické) redukuje edukuje počet chromozomů na polovinu, a to díky párování homologních chromozomů v profázi I a jejich řazením v ekvatoriální riální rovině během metafáze I. Tento proces zajišťuje, ťuje, že se při oplození obnoví diploidní sada chromozomů (předchází tím zdvojování počtu chromozomů, k němuž by docházelo každým následným oplozením). Druhé zrací rací dělení (homotypické) dokončuje meiotické ké dělení, protože nedochází k dalšímu zdvojení genetického materiálu materiálu,, počet chromozomů zůstává stejný. Výsledkem jsou 4 buňky s polovičním počtem chromozomů. Celý proces meiózy je znázorněn na Obrázku 1.

Obr. 1 Hlavní fáze meiotického dělení A) Replikace DNA, DNA, B) Meióza I, C) Meióza II (URL 3).

2.1.3 Vývoj mužských pohlavních buněk (spermiogeneze) Spermiogeneze probíhá probíhá ve stočených kanálcích varlat již od pubertálního věku. Můžeme ůžeme ji dělit na dvě vývojové fáze, spermiocytogenezi a spermiohistogenezi (KLIKA, KLIKA, 1985). 1985 Spermiocytogenze zahrnuje opakovaná dělení semenných buněk, k nimž patří i redukční neboli meiotické dělení po kterém dochází ke vzniku spermatid. Spermatidy nejsou schopny se dále dělit, protože obsah jejich jader má poloviční (haploidní) počet chromozomů. Spermatohistogeneze zahrnuje mnoho diferenciačních procesů které vedou ke vzniku zralé spermie ze spermatid. Celá spermatogeneze trvá procesů, cca 64 dní a dalších 6 - 10 dní trvá funkční funkční zrání spermií v epididymis (ČECH et al., al 2011).

17

2.1.3.1 Spermiocytogeneze Spermiocytogneze má čtyři fáze, periodu rozmnožovací, periodu růstu, prvé a druhé zrací dělení (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003). V periodě rozmnožovací dochází k intenzivnímu mitotickému děleni. Mitoticky vzniklé dceřiné buňky se v G0 fázi buněčného cyklu diferencují na spermatogonie a v dalším buněčném dělení ve spermatogonie B a dále se diferencují. V růstové periodě má spermatogonie typu B během buněčného cyklu dlouhou S-fázi a diferencuje se na primární spermatocyt. Primární spermatocyt je největší buňkou v zárodečném epitelu varlete a obsahuje diploidní počet chromozomů. Prvé zrací dělení je redukční (meiotické) a má dlouhou profázi, která trvá až 22 dní. Během profáze probíhá hned několik stádií, jimiž jsou leptotene, zygotene, pachytene, diplotene, diakineze, metafáze I, anafáze I a telofáze I. Během telofáze se buňka rozdělí na dva sekundární spermatocyty (prespermatidy) s haploidním počtem chromozomů. Druhé zrací dělení následuje hned po prvém zracím dělení a probíhá obdobně jako mitóza. Výsledkem jsou pak čtyři spermatidy.

2.1.3.2 Spermatohistogeneze Při spermatohistogenezi již nedochází k dělení, ale dochází zde k transformaci spermatid ve zralou spermii (KLIKA, 1985). Zralá spermie je tedy řadou diferenciačních procesů přetvořena v buňku schopnou vniknout do vajíčka a docílit přenosu otcovských genů. K prvním transformačním procesům dochází u Golgiho komplexu, když se jeho centrální část přetváří v akrosomální váček. Ten se dále zvětšuje, oplošťuje a později vytváří akrosom. Jádro se prodlužuje, přestože se jeho objem výrazně zmenšuje a dochází k značné kondenzaci chromatinu. Samotné jádro se pak přemění v hlavičku spermie (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003).

2.1.3.3 Stavba spermie Zralá spermie je štíhlá pohyblivá buňka, skládající se z hlavičky, středního oddílu a bičíku (ČECH et al., 2011). Celková délka spermie se pohybuje v rozmezí 55 - 60 µm. Bičík je její nejdelší částí a měří 40 - 50 µm. Hlavička má oválný, oploštělý, při pohledu ze strany hruškovitý tvar (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003). Převážnou část hlavičky tvoří jádro s vysoce kondenzovaným chromatinem. Povrch hlavičky je kryt cytoplazmatickou membránou a pod ní se nachází akrosom vzniklý z Golgiho komlexu.

18

Akrosom je vakovitý útvar obsahující enormní množství lytických enzymů zejména hyaluronidázy, umožňující umožňují průnik průnik spermie do vajíčka. Střední oddíl se skládá z krčku a spojovacího oddílu (KLIKA, 1985). 1985). Krček je dlouhý cca 1 µm a skládá se z proximální centrioly a devíti příčně segmentovaných chord.. Převážnou část spojovací části tvoří spirální mitochondriální pochva pochva a hladké chordy. chordy Ve spojovací části je dále obsaženo osové vlákno, které je motorickým centrem bičíku. Hlavní oddíl bičíku má stejnou stavbu jako spojovací oddíl (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003). 2003). Ve vnější vrstvě se nachází nachází fibrózní pochva, která obsahuje obsahuje dvě poloobloukovitá žebra, žebra s nimiž splývají dvě chordy a poté tvořící podélné sloupce. Díky tomuto uspořádání dochází k vlnitému pohybu bičíku při kontrakci. Terminální část se skládá z axonemy a cytoplazmatické cytoplazmatické membrány.

Obr. 2 Stavba spermie (A) hlavička, B) B krček, C) C střední oddíl, D) D hlavní oddíl, E) E koncová část, 1) plazmatická membrána, 2) 2 vnější akrosomální membrána, 3) 3 akrosom, 44) vnitřní akrosomální membrána, 5) 5 jádro, 6) 6 proximální centriol, 7) 7 zbytek distální centrioly, 8) 8 silná vnější podélná vlákna, 9) 9 mitochondrie, 10) 10 axonema, 11) 11 anulus, nulus, 12 12) kruhová vlákna)) (URL 4).

2.1.4 Vývoj ženských pohlavních buňek (oogeneze (oogeneze) Oogeneze probíhá probíhá v kůře vaječníků (ČECH et al., 2011). Oocyty jsou součástí vaječných váčků – folikulů, které jsou zanořeny v kůře vaječníků. Vývojová stádia oocytů jsou analogická vývojovým ovým stádiím spermií.

19

Proces oogeneze je započat už ve vaječnících plodu, ještě před narozením. Na začátku procesu stojí oogonie. Proliferace oogónií začíná na přelomu druhého a třetího měsíce intrauterinního vývoje a ustává koncem šestého měsíce, kdy je jejich počet v rozmezí šesti až sedmi milionů. Postupně se kolem oogoníí vytvoří obal, pocházející z coelomové epitelu kryjící základ vaječníků. Tímto procesem vznikají primordiální folikuly. Takto obalené oogonie se již dále nedělí. Místo toho vstupují do profáze prvého meiotického dělení jako primární oocyt. Profáze prvého dělení probíhá až po diplotenní stádium, kde se vývoj přeruší a pozastaví až do nástupu puberty. Prodloužené diplotenní stádium může být někdy označováno za stádium diktyotenní (KLIKA, 1985). Po započnutí puberty se do periody růstové dostává vždy jen několik primárních oocytů a to v rámci každého ovariálního cyklu. Pro tuto periodu je charakteristické zvětšování objemu a zvýšení metabolické aktivity oocytu.

2.1.4.1 Stavba folikulů Po pubertě dochází k cyklickému dozrávání oocytů uložených ve folikulech (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003).

Dozrávaní folikulů probíhá přes několik

stádií. V první fázi se tvoří primordiální folikul (folliculus ovaricus primordialis). Primordiální folikul je tvořen oocytem o průměru 30 µm. Oocyt má ve své cytoplazmě četné inkluze. Tyto inkluze jsou označována jako žloutková zrna nebo vitelinní tělíska. Povrch oocytu pokrývají folikulární buňky. Tento typ folikulů se po narození už netvoří. Primordiální folikul se dále vyvíjí a mění se na folikul primární (folliculus ovaricus primarius). Velikost primárního folikulu může být až 400 µm. Buňky folikulu proliferují a vytváří vrstvy. Těchto vrstev může být několik, a proto se po té folikul označuje jako multilamelární. Folikulární buňky jsou malé, a proto se nazývají buňkami granulózními. Na povrchu oocytu se vytváří membrána zona pellucida sklovitého charakteru a z vaziva obklopující folikul se vytváří obal neboli theca folliculi. Dalším vývojem vzniká sekundární folikul. U tohoto typu folikulu dochází k dalšímu růstu a přibývá granulózních buněk. Granulózní buňky se nakonec rozestupují a vytvářejí dutinu a thekální obal, který se následně rozděluje na dva. Posledním stádiem vývoje folikulu je terciální (Graafův) folikul. Označujeme ho za zralý folikul, který má v průměru 10 – 15 mm. Takový folikul obsahuje velkou dutinu naplněnou likvorem. Vyzrálý folikul bývá umístěn na povrchu ovária, kde je

20

detekovatelný při ultrazvukovém vyšetření. Jako stigma bývá označováno místo, kde tenká stěna folikulu vyčnívá nad povrch ovaria.

1) theca interna a externa 2) bazální membrána mezi thecou a granulósními buňkami 3) granulozní buňky 4) folikulární tekutina 5) primární oocyt 6) cumulus oophorus 7) ovariální tkáň 8) tunica albuginea 9) abdominální prostor Obr. 3 Schéma Graafova folikulu a jeho vnitřní stavby (URL 5).

2.1.4.2 Menstruační cyklus Menstruační cyklus začíná v pubertě první menstruací (menarche) a končí v klimakteriu, kdy po poslední pravidelné menstruaci následuje menopauza (GRIM & DRUGA, 2005). Cyklus je řízen ovariálními hormony a průměrně trvá 28 dní. Menstruační cyklus má několik fází (VÁCHA et al., 2004). První proliferační fáze trvá od 5. do 14. dne cyklu, kdy narůstá děložní sliznice, ta se připravuje na přijetí oplozeného vajíčka (embrya) do dělohy. Tato fáze je ovlivňována hormony, zejména tzv. estrogeny, které jsou tvořeny ve vaječníku pod kontrolou luteinizačního (LH) a folikulostimulačního hormonu (FSH), jež jsou tvořeny v podvěsku mozkovém. Po 14 dnech vysoký obsah LH vyvolá ovulaci, dojde k prasknutí folikulu a vzniku žlutého tělíska. Druhá sekreční fáze navazuje 15. den cyklu a trvá do 26. dne cyklu. V děložní sliznici dochází k přestavbě žlázek, ukládají se v ní různé látky a produkuje se sekret. Sliznice se připravuje na uhnízdění embrya. Fáze je důležitá jak pro uchycení, tak pro další vývoj embrya v děloze. Tato fáze je ovlivňována hormony tzv. gestageny, které jsou tvořeny v tzv. žlutém tělísku (korpus luteum). Žluté tělísko je hormonálně aktivní, vzniklo v místě po uvolnění vajíčka z vaječníku. Třetí menstruační fáze nastává, pokud nedojte k otěhotnění, zaniká činnost žlutého tělíska, což vede ke změnám v děložní sliznici. Děložní sliznice ztrácí hormonální ochranu, dochází k vazokonstrikci, poklesu 21

cévního zásobení, což znamená nedostatek kyslíku a živin. Nastává odloučení odumřelých vrstev děložní sliznice spojeného s krvácením, jedná se o menstruační tzv. ischemickou fázi.

2.1.4.3 Ovariální cyklus Ovariální cyklus je označován jako časové rozmezí mezi dvěma ovulacemi (TRÁVNÍK & ČECH, 2011). Tento cyklus je řízen složitě, přes velkou řadu regulátorů, mezi které patří hypotalamus, adenohypofýza a ovarium s přispěním řady látek s endokrinní, parakrinní i apokrinní aktivitou.

2.1.5 Oplození Oplození je proces, při kterém dochází ke spojení vajíčka a spermie a probíhá v několika etapách (MALINSKÝ & LICHNOVSKÝ, 2003). Celé oplození začíná vstupem spermií do reprodukčních orgánů ženy. Při průchodu spermií dělohou a vejcovodem dochází ke kapacitaci přítomných spermií. Spermie pronikají do blízkosti vajíčka, které se po ovulaci nachází v blízkosti ampulární časti vejcovodu. Poté dochází k protržení akrosomální stěny a k uvolnění akrosomálních enzymů, hyalurodináz. Hyalurodinázy natravují obaly vajíčka, což jsou corona radiata a zona pellucida. Probíhá zde tzv. akrosomální reakce. Do cytoplazmy oocytu proniká přes oolemu jedna spermie. Po průniku spermie do vajíčka dochází ke kortikální reakci. Při této reakci dojde k vytvoření fertilizační membrány a to po splynutí cytoplazmatických granulí oocytu v perivitelinní prostoru s oolemou a částí zona pellucida. Fertilizační membrána brání průniku dalších spermií a tím ke vzniku polyspermie.

2.1.6 Zygota Výsledkem oplození je zygota s 46 chromozomy, které vznikla splynutí dvou pohlavních buněk (KLIKA, 1985). Pohlaví embrya je determinováno oplozením, závisí na typu spermie, jež oplodnila vajíčko. Oplození je podnět pro řadu dalších dělení, které mají mitotický charakter. Tento proces dělení se označuje jako tzv. rýhování.

22

2.2 Blastogeneze Období blastogeneze zachycuje období vývoje od vzniku zygoty, její rýhování v morulu, změnu moruly v blastocystu, až do doby diferenciace zárodečných listů (VACEK, 2006). Toto období je časově vymezeno mezi konec druhého týdne, od uplynutí fertilizace a několik málo hodin po fertilizaci. Nejedná se o přesný údaj, nýbrž o umělé rozdělení pro lepši didaktickou názornost.

2.2.1 Rýhování Po oplození vajíčka dochází k jeho rýhování. Při rýhování dochází k opakovaným mitózám. (VACEK, 2006). Na rozdíl od běžné mitózy, dceřiné buňky (blastomery), prodělávají velice krátkou interfázi a nabývají velikosti mateřské buňky. Toto rýhování má dva projevy, ekvální a totální (OBRUČNÍK, 1971). Jednotlivé blastomery jsou si tvarově a objemově dosti podobné. Rýhování oocytů není přesně stejné u všech blastomer. Rýhování vajíček probíhá od rozdělení zygoty na dvě blastomery až do konce šestého až osmého dne po oplození (MOORE et al., 2013). Blastomery mění svůj tvar po dosažení 9-buněčného stádia. Blastomery k sobě těsně přiléhají a vytváří kompaktní kouli procesem zvaným kompaktace. Pokud je lidský zárodek tvořen 12 – 15 buňkami, označujeme ho za morulu. Morula je tvořena vrstvami buněk vnitřní buněčné masy a zevní buněčné masy. Morula sférického typu vzniká asi 3 dny po oplození a v tomto stádiu vstupuje do dělohy.

2.2.2 Blastocysta Okolo čtvrtého dne po oplození se v centru moruly začíná vytvářet prostor, který je vyplněn tekutinou (MOORE & PERSAUD, 2008). Tento prostor nazýváme dutinou blastocysty neboli blastocel a obsahuje tekutinu, která pochází z děložní dutiny. Tato tekutina prochází skrz zona pellucida, tím zvětšuje celý objem blastocysty a rozděluje ji na dvě části, trofoblast a vnitřní buněčnou masu (Inter Cell Mass - ICM). Blastocysta stará přibližně pět dní má stále na svém povrchu obal zona pellucida a označuje se jako časná blastocysta (ČECH et al., 2011). Během následujícího dne až dvou dochází k degradaci (prasknutím) zona pellucida a vzniká zralá blastocysta. Proces degradace zona pellucida, se označuje „vyklubáním“ blastocysty. Zralá

23

blastocysta je nyní schopna implantace do děložní sliznice. Vlastní embryo pak vzniká z vnitřní buněčné masy a někdy se pro ni používá název embryoblast.

Obr. 4 Embryo ve stádiu blastocysty (URL 6).

24

3. Asistovaná reprodukce

U některých párů nelze dosáhnout oplodnění přirozenou cestou a pro ně jsou tu metody asistované reprodukce. Celý proces in vitro fertilizace (IVF) neboli oplodnění ve zkumavce může být provedeno několika možnými metodami uvedenými níže.

3.1 Metody asistované reprodukce Zahrnují především postupy, při nichž se v rámci léčby neplodnosti manipuluje s lidskými pohlavními buňkami (oocyty a spermiemi) a embryi (WEISS, 2010). Metody mají bohatou sadu postupů, jejichž názvy jsou odvozeny z anglické terminologie (uvedené níže) a jsou vybírány podle indispozice daného páru. •

IUI - Intra Uterine Insemination (umělé zavedení spermií do dělohy)

•

DIFI - Direct Intra Falopian Insemination (umělé zavedení spermií do vejcovodů)

•

DIPI - Direct Intra Peritoneal Insemination (umělé zavedení spermií do peritoneální dutiny)

•

GIGT - Gamet Intra Falopian Transfer (přenos gamet do vejcovodu)

•

ZIFT - Zygot Intra Falopian Transfer (přenos zygot do vejcovodu)

•

TET - Tubal Embryo Transfer (transfer embrya do vejcovodu)

•

POST - Peritoneal Oocyt and Sperm Transfer (přenos oocytů a spermií do peritoneální dutiny)

•

IVF ET - In Vitro Fertilizace and Embryo Transfer (mimotělní oplození a přenos embrya do děložní dutiny)

•

ED - Egg Donation (proces IVF ET provedený s oocyty dárkyně)

•

MESA - Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration (spermie získané aspirací z nadvarlat při mikrochirurgickém zákroku)

•

TESA - TEsticular Sperm Aspiration (spermie získané aspirací z varlat při mikrochirurgickém zákroku)

•

TESE - TEsticular Sperm Extraction (extrakce spermií z tkáně varlat, získané při mikrochirurgickém zákroku)

25

•

ICSI - IntraCytoplazmic Sperm Injection (mikromanipulační technika, při které se do oocytu aktivně vpraví spermie za pomoci mikroinjekce)

•

IMSI

-

Intracytoplazmic

Morfological

Selested

Sperm

Injection

(mikromanipulační technika, při které se do oocytu aktivně vpraví spermie za pomoci mikroinjekce, ale její výběr na rozdíl od ICSI se provádí pod velice výkonným mikroskopem při více než 6000násobném zvětšení) •

AH - Asissted Hatching (mikromanipulační technika, při které se do zona pellucida vytvoří otvory)

•

KET - KryoEmbryo Ttransfer (transfer embryí, která byla zmrazená)

•

IVM - In Vitro Maturation (dozrávání oocytů in vitro)

3.1.1 Umělá inseminace Tato metoda má poměrně dlouhou tradici sahající až za metody IVF, jelikož první pokusy o umělou inseminaci byly zaznamenány již v roce 1780 (DOHERTY & CLARK, 2006). Metoda je založena na vnášení spermií do pochvy, děložního čípku, dělohy, nebo dokonce vejcovodů. Tato metoda je poměrně úspěšná, pokud sperma obsahuje vysoký počet spermií a žena netrpí žádnou z anatomických vad čípku nebo neprůchodností vejcovodů. Spermie získané pro inseminaci mohou být od manžela (Artificial Insemination from Husband – AIH) nebo od dárce (Artificial Insemination from Donor – AID) (ŘEZÁBEK, 2008a). Před samotným zavedením spermatu do ženských pohlavních orgánů dochází k jeho přípravě, sperma se promývá (DOHERTY & CLARK, 2006). K procesu tzv. „promytí“ dochází až po zkapalnění spermatu, následované ponořením do speciální chemické látky, která izoluje nejaktivnější spermie. Nejaktivnější spermie jsou pak podrobeny centrifugaci. Dále dochází k čištění od cizorodých látek a bakterií, po té se přistupuje k vlastnímu přenosu spermií na děložní hrdlo nebo do pochvy (ŘEZÁBEK, 2008a). Pro maximální využití spermií se provádí spíše intrauterinní inseminace (IUI), tedy vstříknutí spermií do dělohy.

26

Obr. 5 Schéma provedení IUI (URL 7).

3.1.2 IVF a ET Princip této metody je oplodnění vajíčka mimo tělo ženy a jeho následný přenos do děložní dutiny (ŘEZÁBEK, 2011). Získávání oocytů z ženského těla a jejich kultivace v laboratorních podmínkách je velice náročný proces, a proto se podařilo dosáhnout otěhotnění tímto způsobem až v relativně nedávné době a to v roce 1978, kdy se narodila Louisa Brown jako první dítě po IVF. Základní indikací pro provedení IVF je neprůchodnost vejcovodů, které se právě obchází použitím oplození in vitro. Dalšími indikacemi jsou endometrióza, andrologický faktor, ovariální faktor, genetické příčiny nebo idiopatická příčina sterility (WEISS, 2010).

3.1.2.1 Provedení in vitro fertilizace In vitro fertilizace má určitý průběh, který se skládá z několika kroků (ŘEZÁBEK, 2008b). První krokem je samotná stimulace vaječníků. Cílem této stimulace je zisk potřebného množství vyzrálých folikulů. Potřebný počet se pohybuje mezi 7 až 12 vyzrálými folikuly.

Po úspěšné stimulaci dochází k dalšímu kroku, což je punkce

zralých folikulů. Odběr folikulů se provádí transvaginálně a celý proces probíhá za ultrazvukového monitoringu. Po punkci dochází k rychlému vyhledaní oocytů ve

27

folikulární tekutině. Dále dochází k přípravě spermií. Nejběžněji se spermie pro IVF získávají masturbací. Takovéto spermie se zbavují seminální plazmy a bakterií. V tomto kroku dochází i k odstranění nepohyblivých spermií ze vzorku. V dalším kroku dochází k „oplození ve zkumavce“ nebo ICSI. Po 18 hodinách od provedení inseminace se provádí kontrola oplození. Dalším krokem je sledování embryí, které v sobě zahrnuje výběr vhodného embrya pro ET. Konečným krokem je přenos vybraného embrya do děložní dutiny. Každý z předešlých kroků má však svá úskalí od krvácivých ranek na vaječnících nebo stěnách pochvy, které zde zanechala jehla, až po infekce břišní dutiny a projevů hyperstimulačního ovariálního syndromu (OHSS) (MRÁZEK, 2003). Ve vážné formě se OHSS může vyskytovat až u 1% žen podstupujících hormonální stimulaci vaječníků. Tato léčba umožňuje velkou nadprodukci tvorby folikulů, které enormně zvětšují velikost a povrch vaječníků a takto zvětšené vaječníky způsobují bolestivý tlak v oblasti podbřišku.

3.1.2.2 ICSI ICSI se provádí vždy ve spojení s procesem IVF (DOHERTY & CLARK, 2006). Při standardních postupech IVF jsou vajíčka smíchána se spermiemi v jedné misce a procesu oplození se dává volný průběh. Zatímco při ICSI se do vajíčka zavádí jenom jedna spermie, které podléhá kritériím přísného výběru. První dítě počaté za pomoci této metody přišlo na svět v roce 1993 v USA.

3.1.2.2.1 Příprava a selekce spermií pro ICSI Existuje více typů preparací spermií pro ICSI (MARDEŠIC, 1998). Nelze však vybrat jen jediný a označit ho za nejoptimálnější, ani takový, který by vykazoval největší úspěšnost při fertilizaci. Obecným pravidlem při postupech je zisk největšího počtu gamet a zároveň při tom neporušit buněčnou integritu. Osvědčenou laboratorní metodou separace je modifikovaný swim-up, ze kterého získáme spermie prosté všech příměsí. Dále se přistupuje k výběru spermie. Můžeme použít spermii získanou ejakulací nebo spermie po procedurách MESA či TESE, které jsou ovšem ve většině případů nezralé a tudíž nepohyblivé. Není-li ale jiná možnost, jsou i takové spermie injikovány.

28

3.1.2.2.2 Příprava a injekce spermie při ICSI U vhodných spermií dochází k imobilizaci opakovanými dotyky mikropipety na střední část bičíku (MARDEŠIC, 1998). Mechanické zhmoždění je nutné i u zcela nepohyblivých spermií, aby u nich došlo ke správnému průniku spermie do cytoplazmy oocytu. Takto připravená spermie se nasaje bičíkem napřed do injekční pipety a přistoupí se k injektování spermie do vajíčka. Při vpichu pipety dochází k vchlípení membrány dovnitř (Obr. 6), poté pracovník nasaje nepatrnou část cytoplazmy a spolu s ní vstříkne spermii do nitra oocytu.

Obr. 6 Obrázek dokumentuje vchlípení membrány při ICSI (URL 8).

3.1.3 Kryokonzervace Hlavním cílem kryokonzervačních procesů je zmrazení materiálu na teplotu kapalného dusíku (-196 °C) a jeho následné uchování (ŘEZÁBEK, 2011). Možnost doby setrvání ve zmrazeném stavu je velmi dlouhá, znatelný pokles životaschopnosti je odhadován asi po 300 letech. U většiny IVF cyklů se získá větší počet vajíček než je nakonec potřeba, protože po oplození získaných vajíček se do děložní dutiny obvykle zavadí jedno až dvě, méně často tři embrya (WEISS, 2010). Embrya se známkou vysoké kvality, která nebyla použita pro ET lze zamrazit a použít v dalším cyklu IVF. Při transféru zmrazených embryí pak mluvíme o kryoembryotransferu (KET). Úspěšnost KET ve srovnání s ET provedeným hned po oplození oocytů bez mrazení je poněkud nižší.

29

4. Kultivace embryí

K oplození oocytů dochází mimo ženské tělo. Poté dochází ke kultivaci embryí a jejich následnému přenosu do dělohy (ET) nebo kryokonzervaci. Kultivace je velice důležitá pro správný vývoj embrya a má svá přesná pravidla, která je nutné striktně dodržovat (TRÁVNÍK, 1990). Kultivační prostředí je většinou prezentováno jako tekuté kultivační médium saturované plynnou fází. Do kultivačního prostředí lze zahrnout i kultivační nádoby a všechny další nádoby a nástroje, které přijdou do styku s kultivačním médiem, spermiemi, oocyty nebo embryi. Kultivace bezprostředně navazuje na odběr vajíček (URL 9). Embrya jsou v laboratoři kultivována po dobu 2-6 dnů. První den se hodnotí oplození, druhý den se hodnotí dělení embryí, takto staré embryo by mělo mít 2 – 4 buňky. Třetí den je prvním dnem prodloužené kultivace a embryo by se mělo skládat z 6 – 8 buněk a stádia moruly by mělo nabýt čtvrtý den. Den pátý a šestý má embryo vzhled blastocysty. Šestý den je poslední den, kdy je možné provést embryotransfér.

4.1 Kultivační nádoby Velké nároky jsou kladeny jak na samotné prostředí, tak na kultivační nádobky (SWAIN & SMITH, 2011). Kultivační nádobky ve formě zkumavek a různých Petriho misek, jsou již zastaralé, ale pořád mají svá opodstatnění založená na laboratorních protokolech. Pro nynější metody jsou mnohem vhodnější tzv. „statické“ platformy, specializované mělké misky. Typy těchto platforem se rozdělují podle množství obsaženého média. Účelem těchto platforem je snížení objemu, které má vliv na embryo a jeho vývoj. Tyto nové platformy byly doposud používaný většinou u zvířecích embryí (zejména myších), u lidských embryí se zatím neprokázal pozitivní vliv, který plyne ze zmenšeného objemu média. Malý objem média má však také negativní, a to především na osmolaritu nebo pH média. Na překonání těchto překážek se stále pracuje, jelikož menší objem média může být využit pro velice citlivé analytické metody, které mohou sloužit pro hodnocení kvality embryí. Statické platformy ale nejsou zcela bez pohybu, k různým pohybům dochází např. při běžné manipulaci, které je zapotřebí při pozorování a hodnocení embryí. Proto se zkoumají i novější typy platforem – tzv. dynamické.

30

Obr. 7 Fotografie platforem používaných pro hlodavce, domácí zvířata, nehumánní primáty a pro lidské gamety a embrya. A) zkumavky, B) kultivační miska s centrální komůrkou, C) čtyř-komůrková Nunc kultivační miska, D) embryonální GPS kultivační miska, E) embryonální kultivační misky s ohrádkami (SMITH et al., 2012).

Pro dynamické platformy je typický kontrolovaný proud nebo pohyb médií (SWAIN & SMITH, 2011). Existuje více typů platforem, které se dělí podle typu pohybů na třesení (shaking), naklápění (tilting), vibrace (vibration) a řízený průtok kapaliny (controlled fluid flow). Dynamické platformy jsou zajímavé systémy, které v budoucnu sehrají jistě velkou roli v revoluci pěstování embryí in vitro. Prozatím mohou být v laboratorních podmínkách používány metody méně náročné na vybavení, jako jsou rotační a naklápěcí (tilting) zařízení, které však bohužel prozatím neexistuje v komerční podobě.

31

Obr. 8 Fotografie představující různé komponenty a funkce naklápěcích (tilting) kultivační embryonálních platforem (TECS) (SMITH et al., 2012).

4.2 Kultivační prostředí Trendem posledních dvaceti let bylo při procesu IVF a následném ET přenos většího počtu embryí ve stáří dvou nebo tří dnů (GARDNER & LANE, 1998). I v současné době se můžeme setkat s procesy IVF, kdy je přeneseno embryo staré dva dny (4buněčné stádium) nebo tři dny (8-buněčné stádium). Skóre implantace se pohybuje mezi 10 – 15 % a šance na porod živého dítěte je 10%. Je ale nutné poznamenat, že v tomto stádiu se embryo nachází ve vejcovodu (v anglické literatuře můžeme nalézt pod názvem Fallopian tube) a nikoliv v děloze (MEHTA, 2001). Proto se nyní přistupuje k transferu moruly či blastuly staré 4 - 6 dnů, které mají větší schopnost implantace (GARDNER & LANE, 1998). Odpovědí na otázku, proč nejsou vždy embrya transferována ve stavu blastocysty nebo kavitované moruly, je kvůli schopnosti některých embryí přežívat a správně proliferovat v kultivačním médiu pouze po několik dní (GARDNER & LANE, 1997). Výběr stáří embryí zvolených pro ET je i na pacientech, kteří v některých případech stále raději volí embrya ve stáří dvou dnů (VAN DER AUWERA, 2002). Ze strachu, že by nemuselo zbýt žádné vhodné embryo pro transfer po uplynutí pěti až šesti dnů.

32

4.2.1 Složení a typy kultivačního média V posledních čtyřiceti letech bylo trendem vytvořit optimální médium pro růst a vývoj embryí (MARKET-VELKER et al., 2010). Současná média bohužel stále nejeví požadovanou komplexnost jako tělu vlastní tubární tekutina. Média pro kultivaci savčích embryí většinou patří do jedné ze čtyř skupin.

4.2.1.1 První skupina - jednoduché solné roztoky doplněné o energetický substrát. Do první skupiny ředíme média, které byla původně určena pro kultivaci myších zygot (GARDNER & LANE, 2007). Některé z těchto médií ale našla uplatnění i u klinického IVF. Příklady některých médií patřící do této skupiny jsou M16, T6, Earle’s balance salt solution, CZB, HTF a P1 medium. Tato média proděla jen malé změny ve svém složení během posledních třiceti let. Jsou to jednouchá média doplněná o plnohodnotné sérum nebo sérový albumin. Použití těchto médií je omezeno pro embrya ve fázi rýhovaní od prvojaderných oocytů až po 8-buněčná stádia.

4.2.1.2 Druhá skupina - komplexní tkáňová kultivační média. Druhá skupina médií byla prvotně určena pro pěstování tkáňových kultur, tedy k růstu somatických buněk (GARDNER & LANE, 2007). Takovým médiem je Hamovo F-10 médium. Tato média jsou více komplexní díky svému obohacení o látky, jako jsou aminokyseliny, vitamíny, prekurzory nukleových kyselin a také některými přechodnými kovy. I tento typ média je poté doplněn o 5 – 20% sérum.

4.2.1.3 Třetí skupina - jednoduchá optimalizovaná média (Simplex Optimized Media) Ve třetí skupině můžeme najít média, která byla sestavena s pomocí počítačových programů (GARDNER & LANE, 2007). Počítačový program porovnával reakce myších embryí na složení jednotlivých médií. Složení takto vytvořeného média bylo dále testováno. Takto vytvořená média můžeme nalézt pod názvy SOM a KSOM. Dalšími úpravami v jiných laboratoří dalo vznik médiu nesoucí název KSOMAA. To je na rozdíl od SOM a KSOM obohaceno o aminokyseliny (BIGGERS, 2001).

33

4.2.1.4 Čtvrtá skupina - Sekvenční média Čtvrtou skupinou jsou fázově-specifická neboli „sekvenční“ média, která byla vytvořena na základě lepšího pochopení jak fyziologických požadavků embrya, tak složení tubární a děložní tekutiny (JONES et al., 2002). Jejich složení je tedy založeno na změnách fyziologických požadavků embrya (SMITH, 2002). Pro správný vývoj embrya se v těchto případech používá více typů médií. Většinou se přistupuje k dvoukrokovému schématu, kdy se první médium používá pro embrya do stáří tří dnů a jiné médium pro embrya ve stádiu moruly nebo blastocysty. Sekvenční média se snaží nejen reflektovat požadavky embryí, ale také se snaží, co nejvíce snížit škodlivý vliv média zejména tzv. kulturou indukované trauma, které je způsobeno nevhodným médiem (GARDNER & LANE, 2007). Prvním typem těchto médií bylo sekvenční médiu G1/G2 (JONES et al., 2002). Dalšími úpravami vznikala média jako univerzální IVF medium, M3 a P1 společně s médiem pro blastocysty (GARDNER & LANE, 2007). Hlavním cílem sekvenčních médií je podpořit růst embryí do stádia blastocysty. (SMITH, 2002). Všechna sekvenční média ale nemají obdobná složení. Příkladem je P1 médium, které neobsahuje glukózu, má vyšší osmolaritu a nižší pH. Zatímco G1 a další média určená pro rýhující se embrya obsahují pouze malé množství glukózy, ale za to na druhou stranu mají zase nižší osmolaritu i pH. Média pro pokročilejší stádia embryí, které jsou většinou odvozeny od HTF nebo Hamova média F-10, mají vetší rozsah pH a vyšší koncentraci glukózy. Obecně ale můžeme říci, že sekvenční média mají nižší koncentraci glukózy a fosfátů, a jako zdroj energie a osmolitů používají aminokyseliny. Ať vezmeme v potaz jakékoliv uměle vytvořené médium používané v dnešní době, takřka žádné se nevyrovná přirozenému prostředí (MARKET-VELKER et al., 2010). Tekutina ve vejcovodech je mnohem komplexnější sloučeninou než kterékoliv komerčně používané médium (ROBERTS, 2005). Tekutina obsahuje nejen potřebné metabolity, růstové faktory, které v médiu mohou zcela chybět nebo mohou být přítomny v odlišných koncentracích. Kromě tohoto musíme brát v potaz, že tato tekutina je dynamický systém, měnící se v celé délce ženského reprodukčního traktu, která má za úkol hlavně odrážet metabolické preference zárodku.

34

Složení Hamova F-10 média Složka koncentrace (mM) NaCl 126.60 KCl 3.82 MgSO4.7H20 0.62 Na2HPO4 1.31 KH2PO4 0.61 NaHCO3 14.28 CaCl.2H2O 0.30 CuSO4.5H2O 0.00001 FeSO4.7H2O 0.0030 ZnSO4.7H2O 0.0001 fenolová červeň 0.034 pyruvát sodný 1.00 mléčnan sodný 1.00 glukóza 6.11 alanin 0.10 arginin 1.21 asparagin 0.11 kyselina 0.10 asparagová cystein 0.26 glutamat 0.1 glutamin 1.0 glycin 0.1 histidin 0.14 izoleucin 0.02 leucin 0.10 lysin 0.20 metionin 0.03 fenylalanin 0.03 prolin 0.10 serin 0.10 treonin 0.03 tryptofan 0.003 tyrosin 0.12 valin 0.03 biotin 0.0001 ca pantothenat 0.0015 cholin clorid 0.005 kyanocobalamin 0.001 kys listová 0.003 inositol 0.003 nicotinamid 0.005 pyrydoxin 0.001 ryboflavin 0.001 thiamin 0.003 hypoxantin 0.03 lipoová kyselina 0.001 thymidin 3.00

Složení sekvenčního média Typ média G1.2 Složka koncentrace NaCl 90.08 KCl 5.5 Na2HPO4 0.25 MgSO4.7H20 1.0 CaCl.2H20 1.8 NaHCO3 25.0 pyruvát sodný 0.35 mléčnan sodný 10.5 glukóza 0.5 alanin 0.1 kyselina asparagová 0.1 asparagin 0.1 arginin cystin glutamat 0.1 alanyl-glutamine 1.0 glycin 0.1 histidin izoleucin leucin lysin metionin fenylalanin prolin 0.1 serin 0.1 taurin 0.1 treonin tryptofan tyrosin valin -

G2.2 (mM) 90.08 5.5 0.25 1.0 1.8 25.0 0.10 5.87 3.15 0.1 0.1 0.1 0.6 0.1 0.1 0.5 0.1 0.2 0.4 0.4 0.4 0.1 0.2 0.1 0.1 0.4 0.05 0.2 0.4

cholin clorid kys listová inositol nicotinamid pantothenate pyridoxal ryboflavin thiamin

-

0.0072 0.0023 0.01 0.0082 0.0042 0.0049 0.00027 0.00296

0.01 5 mg/mL

0.00 5 mg/mL

EDTA HSA

Tab. 2 Složení sekvenčního média G1.2 a G2.2 (GARDNER & LANE, 2007).

Tab. 1 Složení Hamova F-10 média (GARDNER & LANE, 2007).

35

4.2.2 Další složky kultivačního média Složení celkového systému embryonální kultur lze rozdělit na následující prvky jako je voda, ionty, sacharidy, aminokyseliny, makromolekuly, vitamíny, chelátory, antibiotika, prekurzory nukleových kyselin nebo hormony a růstové faktory.

4.2.2.1 Voda Hlavní složkou všech kultivačních médií je voda (GARDNER & LANE, 2007). Kultivační médium může být tvořeno vodou až z 99 %. Zdroj vody a její čistota jsou významné faktory, které je nutno brát v potaz při posuzování kvality médií (BRINSDEN, 2005). Schopnost embryonálního vývoje koreluje právě s kvalitou vody. Voda používaná pro přípravu médií nesmí obsahovat žádné endotoxiny, organické molekuly nebo mikroorganismy, a musí mít malou koncentraci iontů. Pokud chceme u vody dosáhnout potřebné kvality a čistoty, musíme zvolit vhodnou metodu čištění (TRÁVNÍK, 1990). Můžeme použít metody zahrnující deionizaci, adsorpci aktivním uhlím nebo až pětinásobnou destilaci. Některé laboratoře využívají reverzní osmózu nebo Milli-Q filtraci (FLOOD & SHIRLEY, 1991). Pokud zvolíme pro čištění vody jen samotný proces několikanásobné destilace, nezískáme tím potřebně čistou vodu. Voda může být stále kontaminována nežádoucími látkami, které jsou strhávány do nitra destilační aparatury spolu s vodní parou (TRÁVNÍK, 1990). Příkladem těchto látek můžou být ionty nebo pyrogeny skla (GARDNER & LANE, 2007). A proto se jako nejspolehlivější metoda pro čištění vody jeví ultrafiltrace, která produkuje vodu bez těchto látek.

4.2.2.2 Ionty Hned po vodě jsou rozpustné ionty nejhojnější složkou kultivačního média (JONES et al., 2002). Ionty jsou přítomny ve všech typech médií a každý svou měrou nějak přispívá ke správnému vývoji embrya do požadovaného stádia blastocysty. Vliv jednotlivých iontů však nebyl hlouběji zkoumán, výjimkou jsou pouze ionty anorganických fosfátů, které fungují jako inhibitory vývoje. Vysoké koncentrace draslíkových iontů se objevují snad u všech živočišných druhů včetně člověka, a jsou proto dalším důležitým faktorem, které by měl být brán v potaz při tvorbě kultivačního média (AGUILAR& REYLEY, 2005). Mezi specifické funkce iontů patří také jejich

36

schopnost zvyšovat osmotický tlak, tedy působit na osmolaritu média (GARDNER & LANE, 2001).

4.2.2.3 Sacharidy Sacharidy jsou přítomny v lumen i v celé délce pohlavní soustavy ženy. Jejich koncentrace se liší jak mezi vejcovody a dělohou, tak v rámci (ovulačního) cyklu. (GARDNER et al., 1996). Tak například, koncentrace glukózy v prasečí oviduktuální tekutině, klesá po ovulaci až desetkrát. Zatímco u lidí klesá koncentrace glukózy šestkrát, ale ne na konci cyklu, nýbrž v intervalu mezi koncem folikulární fáze a dobou spadající asi do poloviny cyklu (LEESE et al., 2001). Většina komerčních médií obsahuje sacharidy, jako jsou pyruvát, laktát a glukóza (GARDNER & LANE, 2007). V médiu však může chybět jedna i nebo více těchto komponent. Už během padesátých let minulého století bylo zjištěno, že glukóza není využívána při vývoji myších embryí až do doby 8-buněčného stádia (SUMMERS & BIGGERS, 2003). Základní otázkou tedy zůstává, proč je tedy ve většině médií jednou ze složek právě glukóza, když ji embrya na začátku svého vývoje vůbec nevyužívají (TRÁVNÍK, 1990). Odpověď je jednoznačná, glukóza je do kultivačního média přidávána kvůli spermiím. Jelikož spermie využívají glukózu jako svůj energetický zdroj.

4.2.2.4 Aminokyseliny Už v sedmdesátých letech minulého století bylo prokázáno, že aminokyselin včetně glutaminu, fenylalaninu, metioninu a izoleucinu podporují první buněčné dělení křeččích embryí (DERKVER, 2001). Dalšími studiemi byl prokázán vliv aminokyselin i na lidská embrya (FLEMING et al., 2004). Některé aminokyseliny mohou růst podporovat, jiné ho zase mohou inhibovat. Správná rovnováha aminokyseliny je velice důležitá, zejména z toho důvodu, že aminokyseliny, především glutamin, se můžou v médiu spontánně rozkládat. Při spontánním rozkladu aminokyselin může docházet k produkci amonných iontů, které mohou být škodlivé pro vývoj v krátkodobém i dlouhodobém měřítku. V tubární a děložní tekutině je obsaženo všech 20 aminokyselin nacházejících se v přírodě (AGUILAR & REYLEY, 2005). Charakteristickou vlastností této tekutiny je

37

vysoká hladina koncentrací aminokyselin alaninu, aspartátu, glutamátu, glycinu, serinu a taurinu (GARDNER & LANE, 2007). Nejčastěji se do kultivačního média, určeného pro časná až 8-buněčná embrya, přidávají neesenciální aminokyseliny. Následně jsou do média přidávány i esenciální aminokyseliny, které jsou určeny pro embrya větší než 8 buněk, tedy embrya ve stádiu moruly či blastocysty (HOUGHTON, 2002). Koncentrace aminokyselin v běžných médiích, se pohybuje na hranici mezi jednou třetinou a jednou polovinou celkové koncentrace aminokyseliny nalezených v lidském séru a folikulární tekutině (AGUILAR & REYLEY, 2005). Sacharidy jsou spolu s aminokyselinami hlavní energetické substráty, které embryo využívá.

4.2.2.5 Makromolekuly Makromolekuly jsou další látky, které jsou důležité pro embryonální růst a vývoj (SMITH, 2002). Nejdůležitějšími makromolekulami obsažené v tubulární tekutině jsou proteiny. Jejich koncentrace se v této tekutině pohybuje mezi 10 až 15 % (GARDNER & LANE, 2005). V historii IVF byl nejpoužívanějším proteinem přidávaným do kultivačního média plnohodnotné krevní sérum nebo plazma (BLAKE et al., 2002). V dnešní době je již nahrazeno albuminem nebo hyaluronanem, mající stejné fyziologické účinky. Na reprodukčních klinikách provádějících IVF bylo tedy ve většině případů sérum nahrazeno lidským sérovým albuminem (HSA- human serum albumin), nebo substitučním syntetickým sérem (SSS - synthetic serum substitutent), které se syntetizuje z HSA (SMITH, 2002). Od používání lidského nebo hovězího séra bylo upuštěno kvůli jeho možným embryotoxickým vlastnostem (GARDNER & LANE, 1997). Sérum také může přenášet virová onemocnění, jako jsou žloutenka typu B či virus HIV (BLAKE et al., 2002). Albumin a imunoglobulin-G jsou dva nejčastější proteiny, které můžeme nalézt v tubární tekutině (GARDNER & LANE, 2005). Albumin patří k proteinům krevní plazmy, tvoří až 60 % všech plazmatických bílkovin a má mnoho fyziologických funkcí (BLAKE et al., 2002). Ve většině případů se přidává do všech médií používaných při IVF, z čehož je patrné, že jej můžeme považovat za bezpečný a prospěšný. Albumin zastává několik významných rolí v kultivačním médiu. Může sloužit jako pH pufr,

38

surfaktant, nosič látek podporujících růst a pomáhá také k membránové stabilizaci a osmotické regulaci. Stejně jako sérum má mnoho užitečných vlastností, bohužel může být i přenašečem prionového neurodegenerativního onemocnění (Creutzfeldt-Jakobovi choroby). Choroba může být přenášena i po provedení purifikace, což bylo impulsem k dalšímu vývoji, jenž vedl k vytvoření netoxického rekombinačního albuminu (rAH) pod obchodním názvem Recombumin, a je tedy velice vhodnou náhradou za HSA.

4.2.2.6 Vitamíny Vitamíny se ukázaly jako klíčové součásti buněčného metabolismu a bylo prokázáno, že při kultivaci mají významný vliv na kvalitu králičích, myších a křeččích embryí (JONES et al., 2002). Navzdory přítomnosti vitamínů skupiny B v jednom z nejnověji vyvinutých sekvenčních médií, neexistují žádné informace, které by prokázaly účinky těchto vitaminů na lidské embryo. Ani kyselina askorbová (vitamin C) neměla žádný významný vliv na vývoj raných embryí nebo jejich morfologii. V současné době tedy vliv vitamínů na vývoj lidského embrya zůstává nejasný, ale jejich vliv nemůžeme zcela vyloučit (GARDNER & LANE, 2007).

4.2.2.7 Chelátory Nejběžnější chelátor používaný v embryonálních kulturách je EDTA (kyselina ethylendiamintetraoctová), který má schopnost izolovat dvojmocné kationty těžkých kovů (GARDNER & LANE, 1997). Do médií mohou být přidávány kromě EDTA také transferin nebo citrát, jež mají obdobné funkce jako EDTA (JONES et al., 2002). Do všeobecnějšího povědomí se dostalo EDTA díky své vlastnosti snižování glykolytické aktivity u myších embryí. Při snižování glykolytické aktivity dochází ke zpomalení vývoje blastocyst. Je nutné brát v potaz i stádium vývoje embrya (LANE & GARDNER, 2001). Embryo má prokazatelně jiné reakce na EDTA před a po kompaktaci.

Bylo prokázáno, že by embryo nemělo být vystaveno této látce po

dosažení 8-buněčného stádia. Inhibiční účinek EDTA byl prokázán až při koncentraci vyšší jak 200 mM, zatímco v rozmezí koncentrací mezi 10 mM a 150 mM má EDTA naopak stimulační účinek na vývoj blastocysty (GARDNER & LANE, 2007).

39

4.2.2.8 Antibiotika Antibiotika nejsou nutná pro nutriční výživu embryí (MAGLI et al., 1996). Do médií jsou však přidána, aby zabránila mikrobiální a plísňové kontaminaci. Mezi nejběžnější a nejužitečnější antibiotika patří penicilin, streptomycin a gentamycin. (GARDNER & LANE, 2007). Výše zmíněná antibiotika lze obecně považovat za bezpečné léky, jejichž doporučená koncentrace je 50 µg/ml (MAGLI et al., 1996). Při zachování daných koncentrací lze předcházet jejich toxickým účinkům. Pro správný vývoj embrya jsou ovšem lepší média bez antibiotik, což zpochybňuje přidávání antibiotik do kultivačních médií v běžné praxi. (GARDNER & LANE, 2007). Větší obavy ovšem panují z možné kontaminace kultur a proto byla zavedena nezbytná opatření, aby se minimalizovalo jakékoli riziko mikrobiální infekce. Došlo k rozvoji používání aseptických technik, které udržují média izolovaná od vnějšího prostředí pomocí oleje, kterým je kultura překryta. Díky těmto opatřením lze používat média bez použití antibiotik. U těchto médií je, ale nutné dbát zvýšené opatrnosti ze strany zdroje spermií, protože bakteriální a plísňové kontaminanty jsou často ve spermatu přítomny. A proto, na rozdíl od embryonálních kultur, jsou antibiotika přidávána do médií pro přípravu spermií povinně.

4.2.3 Kultivační podmínky Kromě složení kultivačního média má na průběh fertilizace a vývoje embrya vliv i mnoho dalších faktorů, mezi které patří koncentrace kyslíku a ostatních plynů v inkubátoru, pH, teplota a osmolalita kultury. Do této skupiny můžeme také zahrnout samotné podmínky oplodnění, vnitřní faktory embrya nebo také zdroj spermií a oocytů.

4.2.3.1 Koncentrace kyslíku Při měření koncentrace kyslíku v reprodukčním traktu u několika druhů savců byly naměřeny hodnoty v rozmezí od 1,5 – 8 %, což jsou hodnoty výrazně nižší, než je koncentrace v ovzduší (POOL, 2002). Navíc to vysvětluje zlepšení vývoje embrya při snížení koncentrace oproti atmosférickému. Při kultivaci savčích embryí se běžně používají plynné fáze obsahující buď atmosférické (~ 20%) nebo snížené (5%) kyslíkové (O2) koncentrace (DUMOULIN et al., 1999). Pro in vitro fertilizaci lidských embryí jsou tedy obě koncentrace kyslíku široce používané a u obou byly zaznamenány

40

podobné míry úspěšnosti vývoje. Avšak podmínky při kultivaci pod 5 % O2 zvyšují preimplantační životaschopnost embrya, avšak vliv na pozdější úspěšné těhotenství je marginální. Kyslík má v embryonálním metabolismu klíčovou úlohu, která představuje důležitou rovnováhu mezi prospěšnými a škodlivými účinky (CATT & HANMAN, 2000). Kyslík je spotřebováván, při oxidační fosforylaci a při tom jsou generovány i volné radikály. Volné radikály vznikají z energeticky bohatých elektronů, při průchodu skrz elektronový transportní řetězec. V důsledku toho jsou volné radikály velmi reaktivní redukční činidla a jsou velice nebezpečná pro biochemický aparát buněk. K odstraňování radikálů se používají látky, které můžeme vést pod jednotným názvem antioxidanty (GARDNER & LANE, 2007). Příkladem antioxidantů jsou superoxid dismutáza a glutation. Silným antioxidantem může být i pyruvát nebo aminokyselina taurin.

4.2.3.2 pH Většina kultivační médií používaných při procesech IVF používá jako základní složku hydrogenuhličitanový pufr (TRÁVNÍK, 1990) pro svou schopnost udržení fyziologické pH v rozsahu 7,2 - 7,4 (JONES et al., 2002). Většina komerčně vyráběných médií má tedy pH ve zmíněném rozsahu. Určení optimálního vnějšího pH je však velmi problematické (SWAIN, 2012). Je totiž velice obtížné při měření oddělit jednotlivé proměnné, jako oxid uhličitý a hydrogenuhličitanový aniont. Další komplikace při měření pH je i ovlivňování intracelulárního pH. Kultura s embryi může vykazovat odlišné intracelulární pH, přestože má stejné hodnoty pH extracelulárního. Všechny tyto jevy nijak neusnadňují nalezení správné hodnoty externího pH a možná i proto dosud nebyla tato hodnota stanovena. Když však vystavíme médium okolnímu vzduchu, dojde k dalšímu vystavení CO2, což vede k rapidnímu nárůstu pH v systému a dojde k narušení vývoje embrya (PRAKASH & GANGAL, 2012). Při použití fosfátového pufru toto narušení nehrozí, jelikož nevyžaduje přítomnost CO2 pro svou pufrační aktivitu, a proto i při vystavení vzduchu udržuje konstantní pH. Fosfát je ale důležitým substrátem pro samotný vývoj embrya, proto se koncentrace fosfátu v průběhu kultivace mění, což je hlavním

41

důvodem, proč se upřednostňuje jeho alternativa pufr pod zkratkou HEPES (kyselina 2[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethansulfonová), který má při 20°C pKa 7,55.

4.2.3.2.1 pH a jeho indikátor Ve většině tkáňových kultur je přítomna fenolová červeň, která slouží jako indikátor pH (MEHTA, 2001). Barva indikátoru se mění z růžové na bezbarvou až žlutou, a to vše souběžně se změnami pH z alkalického do kyselého. Jeho výhodou je tedy vizuální indikace kultivačního prostředí. Výhoda fenolové červeně v médiu pro kultury IVF je nyní zpochybňována kvůli možnosti kontaminace média těžkými kovy, které jsou toxické pro embrya. Někteří komerční výrobci fenolovou červeň z jejich médií zcela odstranili, zatímco jiní jen snížili její koncentrace pro nedostatek pádných důkazů.

4.2.3.3 Osmolarita a teplota Osmolarita kultivačního média by měla být v rozmezí 275 - 290 mmosmol/kg (PRAKASH & GANGAL, 2012). Lidská embrya i gamety jsou velice citlivé na změny teplot. Proto se využívá k jejich kultivaci inkubátorů, které udrží stálou vlhkost vnitřní teplotu na 37.0 - 37.5 °C. Tuto teplotu je nutné striktně dodržovat i menší zakolísání teplot má totiž neblahý vliv na raný vývoj embrya. Při výkyvech teplot dochází k retardaci růstu embrya in vitro. Například bylo prokázáno, že když vystavíme embryo pokojové teplotě, dochází u něj k poškození meiotického dělícího vřeténka. Většina embryonálních kultur se uchovává pod parafínovým olejem jako prevence před výparem kultivačního média. Při zamezení výparu se zachovává stálá osmolarita kultivačního média. Parafínový olej nejenže snižuje ztráty vody, ale také minimalizuje výkyvy pH, a teploty při vyjmutí z inkubátoru pro mikroskopickou evaluaci.

42

5. Morfologické hodnocení

V minulé kapitole bylo popsáno složení kultivačního média a podmínky prostředí mající vliv na vývoj a kvalitu embryí. Je tedy nutné položit si otázku, co je jedním z nejobtížnějších aspektů asistované reprodukční techniky. Která embrya jsou tedy nejvhodnější pro přenos do dělohy? Hlavním cílem dnešních metod asistované reprodukce je docílit přenosu jednoho kvalitního embrya, a předejít tak možným komplikacím, které jsou spjaty se vznikem vícečetného těhotenství. Ovšem i pro zkušeného embryologa není tento úkol právě jednoduchý. Kliničtí lékaři a embryologové jsou ale i v dnešní pokrokové době závislí na světelné mikroskopii, jako první linii pro přístup k hodnocení embryí (MACHTINGER & RACOWSKY, 2013). V první řadě se hodnotí rychlost vývoje, a pak přichází na řadu morfologické hodnocení. V této oblasti ale stále dochází k aktivnímu výzkumu, do něhož se vědci snaží zahrnout metody méně invazivní. Všechny metody však mají stejný cíl a to vyhodnotit a vybrat nejlepší embryo a zvýšit tak procento implantace, které poté vede k porodu zdravého dítěte. K usnadnění výběru nejlepšího embrya ze skupiny může embryologovi sloužit více metod a hodnotících systémů, mezi které patří sledovaní vývoje embrya, vývoje blastocysty, projevy prvojádra, orientace jadérka, neinvazivní posouzení metabolických produktů embryí vzniklých během vývoje, preimplantační genetická diagnostika, a morfologické posouzení (JONES et al., 2002). Těmto metodám se budeme věnovat v následujících kapitolách.

5.1 Morfologické hodnocení zygot a embryí Morfologické hodnocení se využívá již po mnoho let jako nástroje při určování kvality embryí. Posuzuje a hodnotí, které embryo má největší potenciál při implantaci do děložní sliznice. Zygoty jsou hodnoceny zejména na základě morfologie prvojader. Embrya jsou pak hodnocena na základě počtu buněk, vzoru a rozsahu fragmentace, cytoplazmatického zdrsnění, pravidelnosti blastomer a přítomnosti vakuol.

43

5.1.1 Hodnocení zygot K prvnímu hodnocení dochází po uplynutí osmnácti až dvaceti hodin od oplodnění (GUERIF, 2007). Při prvním hodnocení jsou zkoumány morfologické parametry, jako je počet, velikost a symetrie prvojader. Dále počet nukleolárních prekurzorových tělísek (nucleolar precursor bodies - NPB) a jejich distribuce v každém prvojádru (TESARIK& GRECO, 1999). Je nutné poznamenat, že zygotu v tomto stádiu nemůžeme považovat za embryo, protože ji chybí typická genetická integrita, která je jednou z mnoho charakteristik jedince.

5.1.1.1 Hodnocení zygot podle Tesarika Tesarik a Greco ve své studii z roku 1999 rozlišují 6 kategorii, podle kterých hodnotí zygoty staré jeden den (TESARIK & GRECO, 1999). Avšak bodovací systém Tesárika byl zrevidován a byl vesměs nahrazen novým Scottovým systém.

Kategorie

0

1

Popis

Schématické znázornění morfologie prvojader

normální zygota mající velký potenciál implantace v počtu NPB je velký rozdíl u obou prvojader

2

v prvojádru je malý počet NPB a jsou bez polarizace alespoň u jednoho z prvojader

3

v prvojádře je velký počet NPB (>7), s náznaky polarizace alespoň u jednoho z prvojader

4

počet NPB je velice malý (<3), alespoň u jednoho z prvojader

44

5

různorodá polarizace NPB v prvojádrech (polarizovaná u jednoho, nepolarizované u druhého)

Tab. 3 Bodovací systém zygot podle Tesarika (TESARIK & GRECO, 1999).

5.1.1.2 Hodnocení zygot podle Scotta Třídění podle Scotta, neboli Z – skóre, bylo přijato díky snadnějšímu používání a rychlejšímu vyhodnocování (SCOTT et al., 2000). Pro tyto vlastnosti se Scottův systém hojně využívá pro prakticky každodenní použití. Revidovaný systém vzal v úvahu velikost NPB jejich zarovnání, počet i distribuci. Tento hodnotící systém nebere v potaz velikost NPB, tudíž zygoty s velmi malými nebo s velmi velkými NPB byly jednotně zahrnuty do kategorie Z3. Stupně 2 a 4 byly rovněž sloučeny a zařazeny do kategorie Z3. Označení Z1 nebo Z2 nesou prvojádra s morfologií, která je obdobná morfologii kategorií 0, 1 nebo 3.

Kategorie

Z1

Z2

Z3

Z4

Popis

Schématické znázornění morfologie prvojader

Obě prvojádra mají stejnou velikost a stejný počet NPB, která jsou zarovnána do jedné roviny. Absolutní počet NPB se pohybuje mezi třemi až sedmi Obě prvojádra mají stejnou velikost a stejný počet NPB, která jsou ale volně rozptýlena. Absolutní počet NPB se pohybuje mezi třemi až sedmi. Prvojádra mají stejnou velikost. NPB se liší jak ve velikosti, tak v počtu jednotlivých prvojader. NPB mohou být zarovnána do roviny nebo mohou být rozptýlena. Absolutní počet NPB se pohybuje mezi třemi až sedmi. Prvojádra mohou mít odlišnou velikost nebo mohou být od sebe oddělena.

45

Tab. 4 Bodovací systém zygot podle Scotta neboli Z- skóre (SCOTT et al., 2000).

5.1.2 Hodnocení embryí na začátku druhého dne K prvnímu mitotickému štěpení dochází po uplynutí 25 - 27 hodin od oplodnění, tedy na počátku druhého dne embryonálního vývoje (GUERIF, 2007). Po uplynutí této doby dochází k dalšímu hodnocení. Embrya, která měla dvě buňky, byla označena za časně se rýhující (early-cleavage embryos), zatímco embrya s pozdnějším rýhováním (non-early-cleavage embryos). Do druhé skupiny spadají i embrya, která teprve dělením procházejí.

5.1.3 Hodnocení ve stáří dvou dnů Po uplynutí 44 až 46 hodin po inseminaci nebo provedení ISCI je další období pro hodnocení embrya (GUERIF, 2007). Hodnocení se odvíjí na základě počtu blastomer, fragmentaci anebo podle množství a přítomnosti vícejaderných blastomer.

5.1.3.1 Hodnocení embrya ve stáří dvou dnů podle počtu buněk Podle tohoto systému jsou embrya rozdělena do tří skupin, podle počtu buněk (GUERIF, 2007). Do první skupiny se řadí embrya obsahující méně jak čtyři buňky, druhou skupinu tvoří embrya, obsahující právě čtyři buňky a třetí skupina potom obsahuje embrya, která mají více než čtyři buňky.

5.1.3.2 Hodnocení embrya ve stáří dvou dnů podle množství fragmentů Další z nejčastějších morfologických znaků používaných při posuzování kvality embrya je fragmentace. Jako fragment se definuje malá část cytoplazmy, která je od ostatního prostoru oddělena cytoplazmatickou membránou a obvykle neobsahuje DNA (PRADOS et al., 2012). Tvorba fragmentů je obvyklá v průběhu buněčného dělení. Tyto fragmenty se mohou lišit v množství a velikosti od jednoho embrya k druhému. Nejideálnější jsou případy, kdy embryo nejeví žádný nebo minimální stupeň

46

fragmentace (URL 8). V krajním případě můžou fragmenty obsadit téměř celý prostor v zona pellucida. Tento systém třídění kvality embrya je založen na procentuálním obsahu fragmentů. U embryí ve stáří dvou dnů, která dosahovala nízkého skoré při implantaci, byl zjištěn rozsah fragmentace 10 – 50 % (JONES et al., 2002). Ovšem ne všechny typy fragmentací musejí nutně poškozovat vývoj embrya. Zásadní a rozhodující vliv má právě typ fragmentace. Při tvorbě velkých fragmentů u 2- a 4-buněčných stádií jsou poškození mnohem závažnější. Při tvorbě velkých fragmentů dochází totiž k vyloučení velkého množství buněčného materiálu z blastomer, a tím dochází k vyčerpání základních organel, jako jsou např. mitochondrie. Malé fragmenty nemají tak velký vliv na vývoj jako fragmenty velké a mohou vznikat při neúplné cytokinezi. Schopnost implantace embryí s malým obsahem fragmentů je srovnatelná s embryi bez známek fragmentace. Pokud dojde k fragmentacím během vývoje 1- nebo 2-buněčného stádia, může docházet k částečné ztrátě některých regulačních proteinů. Ztráty regulačních proteinů můžou vyvolat poruchy ve vývoji. Ke ztrátě regulačních proteinů dochází jen u některých typů fragmentací. Vztah mezi fragmentací a apoptózou není zatím zcela jasný. Fragmentace ovšem může fungovat jako spouštěč apoptózy. Existuje několik třídících systémů založených na fragmentaci raného embrya. Nejjednodušší z nich popisuje procentuální obsazení embrya fragmenty.

Skóre

Parametr fragmentace

0

0%

1

< 10%

2

10 - 25%

3

> 25%

Morfologické hledisko Žádné fragmenty mezi blastomerami. Méně než 10 % z celkového objemu embrya je obsazeno fragmenty. Více než 10 %, ale méně než 25 % objemu je obsazeno fragmenty. Více než 25 % objemu je obsazeno fragmenty.

Tab. 5 Přehled hodnocení fragmentace objevujících se u embryí (URL 10, MACHTINGER & RACOWSKY, 2013).

47

Známka

Popis

Schematické znázornění

Embryo je tvořeno čtyřmi velikostně 1

stejnými buňkami bez známek fragmentace. Embryo je tvořeno čtyřmi velikostně

2

stejnými buňkami s nepatrnými známkami fragmentace. Embryo je tvořeno velikostně

3

nestejnoměrnými buňkami bez známek fragmentace. Embryo může být tvořeno stejně velkými

4

buňkami i velikostně nesourodými buňkami s mírnými projevy fragmentace. U embrya se projevuje těžký případ

5

fragmentace a blastomery jsou nerozpoznatelné.

Tab. 6 Bodovací systém embryí ve stáří dvou dnů podle kvality blastomer a množství fragmentů (URL 11).

5.1.3.3 Hodnocení embrya ve stáří dvou dnů podle symetrie Symetrií se zabývá jen malé procento studií. Symetrie definuje velikost a tvar blastomer během raného vývoje embrya (MACHTINGER & RACOWSKY, 2013). Asynchronie ve vývoji jednotlivých blastomer může být důsledkem anomálního buněčného dělení nebo nerovnoměrného rozdělení organel mezi dvěma sesterskými buňkami. U asymetrických embryí bylo prokázáno nižší procento implantace. Snížené procento implantací bylo zjištěno i u vícejaderných embryí. Tedy přítomnost více než jednoho jádra uvnitř blastomery je považován za abnormální a u takovýchto embryí byl zjištěn i zvýšený výskyt chromozomálních aberací.

48

5.1.4 Morfologické hodnocení ve stáří tří dnů

5.1.4.1 První typ hodnocení ve stáří tří dnů Třetí den jsou embrya znovu hodnocena na základě dalších morfologických kritérií. Podle odpovídající kvality je embryu udělena známka v rozmezí bodování 1-5 (SCOTT et al., 2000). Známku 1 udělujeme embryím, která jsou tvořena osmi buňkami. Fragmnentace je nižší než 10 % a embryo nemá žádné vícejaderné blastomery a buňky jsou mezi sebou v kontaktu. Známku 2 udělujeme embryím, která jsou tvořena osmi buňkami, fragmentace se pohybuje v rozmezí 10 – 20 %. Embryonální buňky nemají mezi sebou adekvátní mezibuněčný kontakt. Embryo nemá žádné vícejaderné blastomery. Známku 3 udělujeme embryím, která jsou tvořena šesti, sedmi nebo osmi buňkami, fragmentace se pohybuje okolo 20 %. Jednotlivé blastomery se mohou lišit velikostně, nebo mohou obsahovat více jader. Známku 4 udělujeme embryím, která jsou tvořena více než osmi buňkami, nebo se jejich počet pohybuje v rozmezí 4 - 6 buněk. Můžeme sem řadit i embrya tvořená z osmi buněk, jejichž fragmentace je větší než 20 %. Jednotlivé blastomery se liší velikostně nebo mohou obsahovat více jader. Známku 5 udělujeme embryím, která jsou tvořena méně než čtyřmi buňkami. Fragmentace je vysoká nebo se více jak polovina blastomer nachází ve více jaderném stavu.

1

2

3

4

5

Obr. 9 Příklady hodnocení embryí známkami 1 až 5 (MOAYERI et al., 2008).

Systém hodnocení zůstává tedy v podstatě stejný jako u embryí starých dva dny (URL 11). Pro ET se nejčastěji používají embrya se známkou 1 nebo 2, která se vyvinula ze zygot s označením 1 nebo 2. 49

5.1.4.2 Druhý typ hodnocení embryí ve stáří tří dnů Další možný bodovací systém pro třetí den vývoje embryí je založen na označení embrya pomocí tří symbolů, které následuje níže (BĄCZKOWSKI et al., 2004). •

první symbol (číslo) odpovídá počtu buněk

•

druhý symbol (písmeno) odpovídá struktuře blastomer A- symetrické blastomery B - zřetelně asymetrické blastomery C – vady v cytoplazmě

•

třetí symbol (číslo) hodnotí fragmentaci 1 - žádná fragmentace 2 - fragmentace méně než 20 % 3 - fragmentace mezi 20 – 50 % 4 - fragmentace nad 50 %

Všechny hodnotící systémy se však shodnou na tom, že pro ET jsou vybírána taková embrya, která mají odpovídající počet blastomer, nejeví známky fragmentace nebo je jejich stupeň fragmentace zanedbatelný. Pro embryo staré dva dny je optimální množství blastomer 4 - 6, zatímco 8 - 12 blastomer odpovídá třetímu dni kultivace. Například optimální kvalita embrya by byla označena známkami 4A1 druhý den a 8A1 třetí dne kultivace. Hodnocení embrya čtvrtý den se většinou neprovádí a hodnotí se až embrya ve stádiu blastocysty (URL 10).

5.1.5 Morfologické hodnocení ve stádiu blastocysty staré pět nebo šest dní Nejpoužívanější

hodnotící

systém

pro

blastocysty

je

Garndnerův

systém

(GARDNER & LANE, 2007). Označení udávající kvalitu embrya ve stádiu blastocysty se skládá ze tří částí. První část je číslice udávající numerické skóre odvozující se od stupně vývoje daného embrya, které nabývá hodnot 1-6. Druhý a třetí symbol jsou velká písmena popisující stav vnitřní buněčné masy (ICM) a trofodermu. Zhodnocení prvních fází vývoje lze provést pomocí preparačním mikroskopu.

Při dalším hodnocení

blastocysty se využívá už mikroskopu inverzního. Blastocysty, které nabývají

50

numerických hodnot 3-6 jsou již tvořeny (ICM) a trofodermem, které je nutné rovněž zhodnotit, a to pomocí písmen A, B nebo C dle svého stupně vývoje.

Označení stupně vývoje: •

1 - raná blastocysta, blastocel je menší než polovina objemu embrya

•

2 - blastocysta, blastocel je větší nebo rovna polovině objemu embrya

•

3 - plná blastocysta, blastocel zcela vyplňuje embryo

•

4 – expandovaná blastocysta, objem blastocelu je nyní větší než na začátku vývoje embrya a zona pellucida se ztenčuje

•

5 - líhnoucí se blastocysta, trofoderm se protlačuje skrz zona pellucida

•

6 - blastocysta se vylíhnula a úplně se zbavila zona pellucida

Označení stavu ICM: •

A -dobře zabalené, obsahující mnoho buněk

•

B- volně seskupené, obsahující několik buněk

•

C- obsahující jen velmi málo buněk.

Označení stavu trofodermu •

A – tvořen z mnoha buněk, které tvoří pevně spletený epitel

•

B - tvořen několika buňkami

•

C - tvořen z velmi malého počtu buněk, které tvoří volný epitel

5.2 Time-lapse monitoring Morfologického hodnocení se používá i při tzv. time-lapse monitoringu (ZHANG et al., 2010). Při běžném morfologickém hodnocení se embrya musí vyjmut z inkubátoru a poté se zhodnotí pod mikroskopem. Celý proces hodnocení a manipulace se tedy odehrává mimo kontrolované prostředí inkubátoru. Z toho důvodu jsou embrya vystavena nežádoucímu prostředí, ve kterém dochází ke změnám základních parametrů, jako jsou teplota, vlhkost nebo pH. Další nevýhodou rutinního vyšetřování je získání jen omezené sumy informací, které máme možnost získat jen z několika statických měření (MACHTINGER & RACOWSKY, 2013). Tedy hlavní výhodou time-lapse monitoringu je možnost flexibilního a kontinuálního hodnocení embryí, bez potřeby vyjmutí embryí z inkubátoru (KIRKEGAARD, 2012). Jako další výhodu tohoto sledování je možné uvést schopnost předpovídat vývoj embrya do stádia blastocysty. 51

K tomuto zhodnocení dochází již po dvou dnech monitoringu, díky stanovení pouhých třech parametrů (WONG et al., 2010). Mezi tyto tři parametry patří délka první cytokineze, časový interval mezi první cytokinezí a začátkem první mitózy. Posledním časovým interval je rozmezí mezi druhou a třetí mitózou. Ale před samotným zavedením time-lapse monitoringu do klinické praxe musela být jeho bezpečnost prověřena a zdokumentována. Mezi prvními, kteří se zabývali bezpečností time-lapse monitoringu byl Takenaka et al. (2007) ale samotnou bezpečnost zkoumali další autoři (OH et al., 2007; OTTOSEN et al., 2007; NAKAHARA et al., 2010; CRUZ et al., 2011; KIRKEGAARD, 2012). Technika time-laps monitoringu patří tedy mezi relativně bezpečné (OH et al., 2007). I když je tato metoda neinvazivní, dochází při ní k expozici světlu, která je pro embryo nepřirozená. Tato expozice je ovšem nutná pro pravidelné získávání digitálního obrazu. Při time-lapse monitoringu se nejčastěji používá EmbryoScope (Unisense FertiliTech, Aarhus, Dánsko), je to tří plynový inkubátor s vestavěným mikroskopem, který může shromaždovat snímky až sedmdesáti dvou embryí najednou (MESEGUER et al., 2011). Tento zobrazovací systém používá červené světlo o nízké intenzitě a vlnové délce 635 nm. Ozáření embrya trvá jen velice krátkou dobu a to asi 30 ms, aby se minimalizovalo riziko poškození embrya. Ottosen

spolu se svým kolektivem

provedli porovnání doby expozice (OTTOSEN et al., 2007). Během třídenní kultivace v inkubátoru se zabudovaným mikroskopem se pořídí 1420 snímků a celková expozice trvá 57 s, což je relativně srovnatelné s expozicí světlu z mikroskopu při standardním hodnocení, jehož doba může být až 167s.

Obr. 10 Embryscope a externí počítač Embryo Viewer (URL 12). 52

5.2.1 Srovnání morfologických a time-laps kategorií Při porovnávání těchto dvou kategorií Meseguer et al. (2011) používají retrospektivní hodnocení transferovaných embryí. Retrospektivní analýza se prováděla ze získaných obrazů za pomoci externího počítače EmbryoViewer a softwaru pro analýzu obrazu. V této studii uvádějí dělení do pěti kategorií. Do kategorie 1 patří embrya, která obsahují dvě prvojádra nebo embrya obsahující dvě buňky po uplynutí 27 hodin od inseminace. Dále jsou sem zařazena embrya stará dva dny, která se skládají ze čtyř nebo osmi buněk. U žádného z těchto embryí se nevyskytovala vícejaderná forma a fragmentace je do 10 %. Kategorie 2 obsahuje embrya, která obsahují dvě prvojádra nebo embrya skládající se z jedné až dvou buněk po 27 hodinách od inseminace. Tato kategorie obsahuje embrya stará dva dny skládající se ze tří až čtyř buněk nebo embrya stará tři dny obsahující šest až osm buněk. Do této kategorie může spadat jen jedna varianta, tj. 1 buňka v průběhu 27 hodin, 3 buňky druhý den nebo 6 - 7 buněk třetí den. Blastomery jsou stejné velikosti u 2-, 4- a 8-buněčného stadia. U žádného z těchto embryí se nevyskytovala vícejaderná forma a fragmentace je do 20 %. Do

třetí

kategorie

spadají

embrya

mající

dvě

prvojádra

nebo

embrya

obsahující jednu až dvě buňky po 27 hodinách od inseminace. Tato kategorie obsahuje embrya stará dva dny skládající se ze dvou až čtyř buněk nebo embrya stará tři dny obsahující šest až osm buněk nebo taková, která jsou ve stádiu moruly. Embryo se může skládat z blastomer majících asymetrický tvar. Jsou sem zařazována i embrya, u kterých se vyskytují vícejaderné blastomery. Povelena je pouze jedna vícejaderná blastomera v každé fázi vývoje a fragmentace má stejné hodnoty jako kategorie 2 (20 %). Do kategorie 4 patří embrya s jedním nebo dvěma prvojádry a embrya skládající se z jedné až dvou buněk staré 27 hodin, dvou až šesti buněk druhý den vývoje nebo čtyř a více než osmi buněk, popřípadě může být ve stádium moruly. Embryo může mít asymetrické blastomery a být vícejaderné. Stupeň fragmentace je 50 %. Kategorie 5 je určena pro embrya stará 27 hodin, dva nebo tři dny se můžou skládat z libovolného počtu buněk. Blastomery mají různou velikost, projevuje se u nich asymetrie a vícejadernost. V této kategorii se může objevit jakýkoliv typ fragmentace.

53

Do této kategorie patří také všechna embrya, která se zastavila ve vývoji nebo embrya ve stádiu atrézie.

5.3 Poloautomatické hodnocení blastocyst Posouzení životaschopnosti a možnosti implantace většinou vychází z určitého bodovacího systému. A všechny prozatím používané systémy spoléhají především na subjektivní vizuální analýzu (SANTOS FILHO et al., 2012). Proto v roce 2012 Santos Filho et al. navrhli metodu pro poloautomatické hodnocení blastocyst. Používanými metodami v této studii je vymezení hranic (segmentace) v obalu zona pellucida, trofodermu a vnitřní buněčné mase (ICM), které se provádí pomocí pokročilých technik analýzy obrazu.

Obr. 11 Obrázek automatické segmentace vnitřní buněčné masy (ICM) s extrakcí charakteristického rysu. (A) ilustrace inicializačního algoritmu segmentací kruhem, (B) původní obraz ICM, (C) binární obraz provedený inicializací kruhu na obrázku těžiště, (D) další vstupní obraz, (E) segmentovaná verze obrazu (D), (F) maska použita jako vodítko pro výpočet texturních rysů, (G) okolí ICM masky sloužící jako vodítko pro výpočet texturních rysů (SANTOS FILHO et al., 2012).

54

6.

Hodnocení kvality embryí na základě metabolomiky

Metoda morfologického hodnocení embryí zůstává na prvním místě v hodnocení kvality a životaschopnosti embryí během IVF, ale díky svým skromným prediktivním vlastnostem a vysoké variabilitě v rámci hodnotících systémů omezuje svou výpovědní hodnotu (SINGH & SINCLAIR, 2007). Proto se do popředí výzkumu dostávají nové metody, které získávají informace na základě hodnocení nízkomolekulární metabolitů. Zmíněné metabolity představují koncové produkty buněčných regulačních procesů.

6.1 Metabolomika jako vědní disciplína Metabolomika je jednou z nejnovějších neinvazivních technik hodnocení vývoje embryí a patří do rodiny takzvaný „omických“ disciplín, které mají nezastupitelné místo v systémové biologii (MUSILOVÁ & GLATZ, 2011). I samotný obor systémové biologie je na vědním poli nováčkem a počátky tohoto oboru můžeme datovat na začátek 21. století. Systémová biologie se snaží pochopit a objasnit vztah mezi genotypem a fenotypem a s pomocí experimentální biologie a matematického modelování předpovídat chování buněk, které nemůže být zjištěno na základě pozorování jednotlivých komponent. Podstatou a oblastí zkoumání metabolomiky je metabolom (URL 13). Jako metabolom je označována skupina malých molekul, jimž říkáme metabolity. Metabolity jsou buňce dané na základě fyziologického stavu a stupně jejího vývoje. Metabolomika na rozdíl od jiných „omik“ více odráží aktuální stav buňky, který je vysoce dynamický. Hladina metabolitů, čili metabolický „pool“, přitom není odpovědí pouze genové exprese, ale i environmentálního a vývojového stimulu nebo je důsledkem genetické mutace. Například aktuální metabolický stav člověka je ovlivněn celou řadou vnitřních, ale i vnějších faktorů (WOJTOWICZ et al., 2013). Mezi vnitřní faktory můžeme zařadit genotyp, věk, zdravotní stav, denní cyklus apod. Pod vnější faktory zase spadají pojmy jako fyzická aktivita, výživa, léky, které však mají na genovou expresi jen nepatrný vliv. Můžeme tedy říct, že metabolom reflektuje aktuální stav organismu, nebo také to, co se s organismem v daném okamžiku právě děje (URL 13). Díky této schopnosti se

55

dostala metabolomika do povědomí medicínské veřejnosti a může sloužit jako indikátor různých chorob nebo jako důležitý nástroj pro hodnocení kvality embryí. Je možné rozlišovat endometabolom a exometabolom nebo jindy označován jako sekretom (NAGY et al., 2008). Za endometabolom můžeme označit všechny metabolity, které jsou přítomny uvnitř buněk. V případě embryí se jedná o obsah blastomer. K získání informací o obsahu metabolitů uvnitř blastomer, bychom museli přistoupit k invazivním metodám. K invazivním metodám se uchylujeme pouze tehdy, pokud nemáme jinou alternativu nebo mnohem bezpečnější cestu. Jinou a méně invazivní cestou je určování metabolitů z extracelulárního prostředí, kterými mohou být folikulární tekutina, seminální plazma nebo kultivační médium oocytů a embryí. Zdrojem určovaných metabolitů je extracelulární prostředí, naším zdrojem je tedy exometabolom neboli sekretom. Jednoznačným přínosem sekretomu je jeho neinvazivnost, schopnost odrážet fenotyp a funkci buněk.

6.2 Metabolismus embrya jako známka reprodukčního potenciálu V oblasti morfologického hodnocení jsou jistá úskalí, která chtějí vědci vyřešit s pomocí neinvazivních metod, mezi které patří již zmíněná metabolomika (BOTROS et al., 2008). Tato kapitola se bude zabývat metabolickými parametry panujících in vitro a parametry mající vztah k růstu a schopnosti implantace lidského embrya.

6.2.1 Metabolismus pyruvátu Pyruvát spolu s laktátem patří mezi hlavní energetické zdroje, které embryo využívá na počátku svého vývoje (BOTROS et al., 2008). Embryo potřebuje pro správný vývoj nejen tyto cukry, ale také ATP. ATP je tedy další důležitou složkou embryonálního buněčného vývoje. Buňky mohou k výrobě ATP použít dvou cest. První cestou je aerobní glykolýza, která je ve většině případů zastoupená cyklem trikarboxylových kyselin neboli Krebsovým cyklem. Druhá cesta, které vede k výrobě ATP je přes procesy anaerobní glykolýzy. Raná embrya především spoléhají na metabolismus spjatý s Krebsovým cyklem. Embrya na počátku preimlantačního vývoje potřebují ke svému růstu již zmíněný laktát a pyruvát, zatímco spotřeba glukózy je v těchto stádiích minimální. Díky schopnosti embrya spotřebovávat pyruvát z kultivačního prostředí, je

56

možné ho využívat jako indikačního markeru pro zjišťování životaschopnosti embryí. Z této spotřeby se dá zjistit i růstový potenciál embrya.

6.2.2 Metabolismus glukózy Vzhledem k zásadnímu významu, který glukóza hraje v energetickém metabolismu většiny savčích buněk, byl zkoumán i její vliv na vývoj oocytů a embryí (BRINSTER, 1965). Díky této vlastnosti se glukóza dostala i do centra výzkumu experimentů, které vedl Brinster (1965). Brinster (1965) ke svým pokusům využíval hlavně myších oocytů a embryí, jako modelových organismů. Velké množství experimentů bylo provedeno za účelem stanovení účinku glukózy na vývoj 2-buněčných myších embryí. Byl ovšem zjištěn fakt, že glukóza sama o sobě nemůže podporovat rozvoj 2-buněčných embryí. Tím pádem se embrya nemohou vyvíjet v médiích obsahující pouze glukózu, jako jediný zdroj energie, ale i přes tyto důkazy větší počet výzkumníků v tomto oboru uvádí, že glukóza samotná umožní růst až 8-buněčných myších embryí. Příznivých účinků glukózy na vývoj embrya bylo dosaženo po přidání nepatrného množství pyruvátu do embryonální kultury. Můžeme tedy předpokládat jistou interakci mezi oběma substráty. Schopnost metabolizovat glukózu se výrazně zvyšuje během vývoje embrya (BOTROS et. al, 2008). K zvýšení spotřeby glukózy dochází zejména při vývoji moruly do stadia blastocysty. Z tohoto trendu můžeme vyvodit schopnost glukózy reflektovat momentální stav embrya a poté můžeme zvážit i její schopnost fungovat jako jeden z mnoha identifikační markerů, pro vývojový potenciál a životaschopnost. V mnoha studiích bylo tedy prokázáno, že základní modely metabolismu se liší pro různá vývojová stádia embryí (BIGGERS, 1967). Pro embrya, která se nacházejí ve 2 buněčném

stádiu,

může

sloužit

jako

energetický

substrát

laktát,

pyruvát,

fospfoenolpyruvát (PEP) a oxalacetát. Avšak ne všechny zmíněné sloučeniny mohou podporovat dělení embrya. Pouze pyruvát a oxalacetát můžou podpořit první dělení embrya, laktát a PEP jsou v tomto směru naprosto neúčinné. V průběhu vývoje se ale zdroj energie mění a jako substrát mohou sloužit i další sloučeniny. Embryo nacházející se v 8-buněčném stadiu může využívat již zmíněnou glukózu. Mimo jiné může využívat také sloučeniny, jako jsou malát a α-ketoglutarát.

57

6.2.3 Metabolismus aminokyselin Jako již zmíněné sacharidy, tak i aminokyseliny prokazují jistou schopnost biomarkeru. Při zkoumání metabolismu aminokyselin se ve většině případů využívá vysoce účinné kapalinové chromatografie (HPLC) spolu s hmotnostní spektrometrií (SELI et al., 2010). Na rozdíl od sacharidů, můžeme u aminokyselin hodnotit jak jejich spotřebu, tak i sekreci a to během celého preimplantačního vývoje embrya. Pomocí vysoce výkonné kapalinové chromatografie (HPLC) výzkumníci zjistili, že změny v sekreci a spotřebě aminokyselin v kultivačním médiu, významně korelují s úspěšností vývoje embrya in vitro. Typickou vlastností embryí starých dva a tři dny je jejich snížená schopnost přijímat glutamin, arginin a metionin. Takto stará embrya vykazují i nižší sekreci alaninu a asparaginu a při zachování těchto podmínek může embryo dozrát až do stádia blastocysty. U embryí ve stádiu moruly zase můžeme sledovat nižší schopnost v příjmu serinu a sekreci alaninu a glycinu. Ovšem při celkovém zhodnocení všech fází preimlantačního vývoje dospějeme k výsledku, který udává celkově nižší obrat aminokyselin. Tento obrat aminokyselin se počítá na základě úbytku všech aminokyselin obsažených v kultivačním médiu. A pokud embryo během svého vývoje kontinuálně vykazuje nižší obrat aminokyselin, jeví se jako velice životaschopné. Vykazuje se lepším vývojovým potenciálem, což také odpovídá hypotéze o tzv. tichém embryu. Pro zjišťování obsahu aminokyselin v kultivačním médiu můžeme použít i protonové nukleární magnetické rezonance (HNMR), kterou využili i Seli et al. (2008) a s pomocí této metody našli spojitost mezi vysokými hladinami glutamátu v kultivačním médiu a následným početím. Avšak rozdíly panují jak v použitých technikách, které měří metabolismus aminokyselin, tak v množství a typu použitých kultivačních medií. Všechny tyto faktory můžou být příčinou a vysvětlením pro rozdílnou schopnost aminokyselin sloužit jako biomarker. Dokonce i délka samotné kultivace může tuto schopnost ovlivnit.

6.2.4 Metabolismus kyslíku V současné době se nejlepším ukazatelem pro měření celkové metabolické aktivity jeví spotřeba kyslíku (LOPES et al., 2007). Spotřeba kyslíku je také cenným ukazatelem

58

pro hodnocení kvality embryí. Spotřeba kyslíku je přímo úměrná kapacitě embrya k výrobě ATP, která je důležitou součástí embryonálního vývoje. K výrobě ATP embryu slouží proces oxidativní fosforylace, jenž probíhá za spotřeby kyslíku v mitochondriích. Většina ATP generované blastocystou pochází až z 85 % právě z procesu oxidativní fosforylace. Proto se měření míry respirace u jednotlivých embryonálních stádií jeví jako slibná alternativa pro hodnocení kvality embryí. Zvýšená spotřeba kyslíku souvisí se zvýšenou spotřebou ATP, kterou můžeme pozorovat v pokročilejším stádiu vývoje embrya, kdy je přísun ATP nutný pro samotný proces kompaktace a tvorbu blastocysty. Zvýšená spotřeba po kyslíku v období mezi třetím a šestým dnem vývoje reflektuje zmíněnou potřebu embrya. Dalším faktorem zvyšujícím spotřebu ATP může být změna v mitochondriální stavbě, mimo jiné také přítomnost aktivního embryonálního genomu. Měření spotřeby kyslíku není na vědeckém poli žádnou novinkou, a již dříve bylo využíváno mnoho různých metod. Příkladem jedné ze starších metod může být měření pomocí rozpustnosti. Tato metoda využívá schopnosti netoxických kvartérních benzoidních sloučenin pyrenu rozpouštět se v oleji (BUTCHER, 1998). Tyto sloučeniny se následně v přítomnosti kyslíku rozkládají a emitují fluorescenci. Nejprve se ovšem musí fluorescenční schopnost pyrenu aktivovat. K aktivaci většinou slouží světlo o vlnové délce 340 nm. Následně může být emitovaná fluorescence měřena. Flourescence stoupá se zvýšenou spotřebou kyslíku embryem. Mimo jiné se dříve využívalo i elektrochemických metod, mikrospektrometrů, ultramikroflorescence, nebo také automatických skenovacích metod (LOPES et al., 2007). Dnes se však nejčastěji přistupuje k použití skenovací elektrochemické mikroskopie (SCEM). Nicméně, většina z těchto metod jsou invazivní a časově náročné technicky. Také většina z nich vyžaduje použití UV osvětlení, radioaktivních sond nebo fluorescenčních barviv, což je nevhodné pro posouzení životaschopnosti embryí před jejich transferem. Při měření respirační rychlosti jednotlivých embryí si můžeme vybrat ze dvou podobných měřících technik, které využívají mikrosenzory, jako nanospirometr nebo embryorespirometr. Rozdíly mezi oběma technikami jsou jen v délce pozorování objektů. Oba systémy jsou na rozdíl od již zmíněných metod neinvazivní a nemají vliv na následnou životaschopnost embrya.

59

Nanorespirometer byl vyvinut pro měření míry dýchání jednotlivých embryí v určitém čase nebo fázi vývoje. Měření probíhají jen po pevně stanovenou dobu. Další výhodu nanospirometru je, že měří přímo respirační rychlosti jednotlivých embryí, na rozdíl od jiných technik, kde se provádí měření nepřímo nebo ve skupinách embryí. Kromě tohoto nepotřebuje další externí činidla pro kvantifikaci spotřeby kyslíku. Embryorespirometr kombinuje time-lapse monitoring a upravenou verzi technologie nanorespirometru. Embryorespirometr umožňuje kontinuální sledování a průběžné měření respirace a získává digitální snímky každého embrya a to až po dobu sedmidenní kultivace.

6.2.5 Rozpustný antigen-G lidských leukocytů Rozpustný antigen-G lidských leukocytů (HLA-G) je dalším z mnoha kandidátů, který aspiruje na pozici biomarkeru a který by mohl předpovídat i schopnost otěhotnět (NEL-THEMAAT & NAGY, 2011). K zjištění, že HLA-G může vystupovat jako biomarker, vedla jeho role, kterou zastává v imunologické toleranci těhotenství. Následně byla zjištěna i jeho role v expresi mRNA u oocytů a embryí. Přítomnost tohoto rozpustného proteinu v kultivačním médiu může být detekována metodou ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). Při dalším zkoumání vlastností HLA-G byl objeven jeho pozitivní vliv na dělení a implantační potenciál embrya. Nicméně přesnost a dokonce i existence HLA-G jako možného prediktoru, byla několika studiemi zpochybněna. Ačkoli je použití této metody možné i v klinické praxi, rutinního měření HLA-G se nevyužívá. Zároveň je ze současných poznatků patrné, že tento postup nebude asi nikdy realizován pro rutinní použití.

6.2.6 Leptin Leptin je poměrně malý peptid, který je zodpovědný za konzumaci potravy a energetickou rovnováhu v organismu. Jeho přítomnost byla zjištěna v použitém kultivačním médiu pomocí metody ELISA (NEL-THEMAAT & NAGY, 2011). Byla prokázaná pozitivní korelace mezi sekrecí leptinu a možným vývojem do stádia blastocysty. Nízké hladiny proteinu vykazují zejména ta embrya, která se zastavila ve svém vývoji. Zajímavých výsledků bylo dosaženo při kultivaci embryí spolu s buňkami endometriálního epitelu, kdy sekrece leptinu měla přesně opačné hodnoty, což dokazuje

60

regulační funkci endometriálních buněk. Nicméně i zde docházíme k podobnému závěru jako u HLA-G, protože postup při metodě ELISA je technicky náročný a nevhodný pro klinickou praxi.

6.3 Metody metabolomické analýzy Neinvazivní

stanovení

embryonálního

metabolismu

může

být

provedeno

pomocí analýzy folikulární tekutiny nebo kultivačního média (SING & SINCLAIR, 2007). Tyto analýzy mohou být také využity pro predikci těhotenství. Většina prováděných studií pracuje s malým počtem konkrétních metabolitů, které jsou většinou spojené s glykolytickými meziprodukty nebo aminokyselinami. Je mnoho metod používaných v metabolomické analýze, které mohou měřit široké spektrum metabolitů vyskytujících se v daném organismu. Mezi tyto metabolomické techniky, které jsou schopné detekovat až stovky jednotlivých chemických struktur, patří plynová chromatografie a její kombinace s hmotnostní spektrometrie (GC-MS), kapalinová chromatografie a její kombinace s MS (LC-MS), kapilární elektroforéza a její kombinace s MS (CE-MS) a nukleární magnetické rezonance (NMRS). Významnou technickou nevýhodou mnoha existujících metodik je omezené množství metabolitů, které mohou být stanoveny pouze jednou analytickou platformou. Toto úskalí může být překonáno použitím vibrační spektroskopie, stejně jako spektroskopie v blízké infračervené oblasti (NIR) nebo infračervené spektroskopie s Fourierovskou transformací. Všechny tří typy tvoří jedinečné spektrální podpisy funkčních skupin a vazeb, avšak jejich aplikace při hodnocení kvality embryí ještě není plně ověřena.

Nyní představíme běžné analytické techniky používané v metabolomické analýze: •

Hmotnostní spektrometrie – MS (MUSILOVÁ& GLATZ, 2011)

•

Kapilární elektroforéza -CE

•

Plynová chromatografie- GC

•

Kapalinová chromatografie – LC

•

Kapalinová chromatografie za použití elektrochemického pole - LC-ES (HOLLYWOOD et al., 2006)

•

Vysoce výkonná kapalinová chromatografie - HPLC

•

Ultra výkonná kapalinová chromatografie - UPLC

61

•

Chromatografie s hydrofobními interakcemi - HILIC

•

Ramanova spektroskopie

•

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti - NIR

•

Infračervená spektroskopie s Fourierovy transformací - FT-IR

•

Nukleární magnetická rezonance - NMR

•

Laserová ionizační desorpce MS LDI-MS

•

Ion cyklotronová rezonance s Fourierovy transformací FT-ICR-MS

6.3.1 Vybrané analytické metody používané pro metabolomickou analýzu

6.3.1.1 Ramanova spektroskopie Ramanova spektrometrie je metodou vibrační molekulové spektroskopie, která byla pojmenována po indickém fyzikovi Čandrašékharu Venkatau Ramanovi (URL 14). Profesor Raman společně s K. S. Krišnanem popsali v roce 1928 jev neelastického optického rozptylu, který je základem této metody. Jedná se o metodu vhodnou pro identifikaci složení, struktury i samotných látek. Používá se při analýze pevných látek, kapalin, plynů, povrchů či při analýze biologických systémů od biomolekul až po organismy. Podstatou Ramanova rozptylu je zářivý dvoufotonový přechod mezi dvěma stacionárními vibračními stavy molekuly. Zhao et al. (2013) zjistili, že relativní koncentrace (C') pyruvátu sodného a fenylalaninu vykazují určitý stupeň pravidelnosti a může být tedy použit pro hodnocení embryí. Pomocí Ramanovy spektrometrie přišli na to, že relativní koncentrace pyruvátu sodného byla 0,012. To v důsledku znamenalo, že embrya v kultivačním médiu s menší hodnotou než 0,012, měla vysoký reprodukční potenciál, zatímco ta s hodnotou větší než 0,012 měla nedostatečný potenciál. Obdobně byla získána i hodnota pro fenylalanin, jehož prahová hodnota byla -0,00085. U embryí rostoucích v médiích s hladinou fenylalaninu nad hodnotu -0,00085 by se tedy dala očekávat zvýšená schopnost proliferace a embrya by mohla být označena jako reprodukčně zdatná. Na druhou stranu embrya s relativní koncentrací pod udávanou hodnotu bychom mohli nazvat jako embrya s nízkým reprodukčním potenciálem. Použitím Ramanovy spektroskopie spolu s morfologickým hodnocením vývoje raného embrya pomohlo

62

zvýšit schopnost předpovědi implantační potenciálu embrya až na 85,7 %.

Obr. 12 Ramanovo spektrum pro použité médium typu G1 doplněné o 5% lidský sérový albumin (HSA) (BOTROS et al., 2008).

6.3.1.2 Spektroskopie v blízké infračervené oblasti NIR spektrometrie Spektrometrie v blízké infračervené oblasti („near-infra red spectrometry“ – NIR spectrometry) je metodou molekulové spektroskopie, která využívá spektrální oblast blízkého infračerveného záření, tj. oblast vlnových délek 800 – 2500 nm (URL 15). Oblast pro NIR je vmezeřena mezi dvě důležité oblasti záření a to mezi viditelnou a střední infračervenou. Hranice mezi těmito oblasti není zcela ostrá a mění se podle různých zdrojů informací. Absorpce záření v NIR oblasti je obvykle způsobena energetickými přechody mezi vibračními hladinami molekul, které se označují jako přechody kombinační. NIR může analyzovat změny v několika hlavních organických funkčních skupinách, jako jsou ROH, -SH, C=C, -CH, -OH a -NH (VERGOUW, 2008). S těmito skupinami jsou spojené i změny individuálních metabolitů, k nimž patří albumin, laktát, pyruvát, glutamát a glukóza. Díky těmto změnám se mohou tyto organické funkční skupiny používat jako biomarkery. Zmíněné organické funkční skupiny jsou velice citlivé na přítomnost reaktivních kyslíkových sloučenin a právě tyto rozdíly dané působením reaktivní kyslíkových sloučenin můžou rozhodovat o životaschopnosti daného embrya.

63

Ve studii, kterou provedli Ahlström et al. (2011) využili NIR spektroskopie ke generování speciálního algoritmu, který by sloužil pro výpočet skóre životaschopnosti. Takto vytvořený algoritmus měl vysokou úspěšnost i na jiných pracovištích. Z dalších výsledků této studie plyne, že profilování metabolitů pomocí NIR spektroskopické analýzy může předpovídat implantační potenciál dané blastocysty. Zatímco jiná studie ze stejného roku, kterou provedli Hardarson et al. (2011), poukazuje na to, že provedení NIR spektroskopie nevnáší do této problematiky žádné zlepšení. Zároveň doporučuje další zkoumání, než bude tato metoda použita jako ukazatel životaschopnosti embrya. NIR je přesto výhodnou metodou pro metabolickou profilaci (VERGOUW, 2008). Je schopná využívat pouze malých objemů vzorků (7-10 µl). Další prokázané výhody této metody jsou její neinvazivnost, netoxičnost pro embrya a možnost jednoduchého a rychlého použití. Doba analýzy jednoho vzorku se dá uskutečnit do jedné minuty. NIR je na rozdíl od morfologického hodnocení objektivní metoda, která není zabarvena subjektivními názory embryologů a techniků. Všechny tyto vlastnosti jsou tedy dobrým předpokladem pro zařazení této metody do klinické praxe.

6.3.1.3 Metoda nukleární magnetické rezonance NMR Analytická metoda nukleární magnetické rezonance je založen na způsobu chování jader některých prvků vůči magnetickému poli. Nutnou podmínkou pro tuto analýzu je lichý počet protonů nebo neutronů daného atomu. Příkladem prvků využitelných v NMR jsou vodík, dusík nebo fosfor. Jádra těchto prvků mohou v silném magnetickém poli nabývat různých poloh a orientací. Výsledkem této metody je NMR spektrum sledující absorpci záření v oblasti rádiových vln daného jádra (KLOUDA, 2002). Pudakalakatti et al. (2012) využili ke zkoumání implantačního potenciálu embryí právě NMR spektroskopie. Studie používala hodnoty pyruvátu, laktátu a alaninu získaných z kultivačního media jako biomarkerů. Hladiny všech tří metabolitů byly sledovány po transferu ve druhém nebo třetím dni. Druhý den nebyly stanoveny žádné rozdíly v hodnotách metabolitů mezi embryi, která byla schopna implantace, a ty která tuto schopnost neměla. Pozoruhodných výsledků ale bylo dosaženo při analýze kultivačního média embryí transferovaných třetí den. Tehdy byla zjištěna významně zvýšená hladina pyruvátu v médiu, kde se vyvíjelo úspěšně implantované embryo v porovnání s embryi, která nebyla pro transfer zvolena. Nicméně nebyl pozorován

64

staticky významný rozdíl v hladinách laktátu a došlo jen k malé změně v hladinách alaninu u úspěšně implantovaných embryí. U embryí, která se úspěšně implantovala, byla prokázána vysoká hladina pyruvátu a nízká hladina alaninu ve srovnání s embryi, která se neimplantovala, nebo u nich k transferu vůbec nedošlo. Až s 95% úspěšností může pak poměr pyruvát/alanin předpovídat schopnost implantace, a to z něj dělá velice úspěšný biomarker.

Obr. 13 1D1 H HSQC NMR spektra použitého kultivačního média ISM1, zobrazující jednotlivé píky (PUDAKALAKATTI et al., 2012).

Praktický užitek rychlého a neinvazivního metabolomického profilování pomocí zmíněných analytických metod při procedurách IVF je zlepšení postupů pří výběru embryí a gamet, což umožňuje snížení počtu embryí přenesených do dělohy, které následně zvyšují možnost těhotenství (NAGY et al., 2008). Dlouhodobou výhodou těchto technologií jak pro pacienty, tak lékaře a poskytovatele pojištění je možnost snížení výskytů vícečetných porodů, čímž se snižují s tím spojená zdravotní rizika a náklady vynaložené na následnou léčbu.

65

7.

Preimplantační genetická diagnostika neboli PGD

Stejně jako předešlé kapitoly i tato se bude zabývat výběrem embryí a to za pomoci PGD (URL 16). Preimplantační genetická diagnostika je spojením mezi kontrolou embryologickou a genetickou. Tato metoda využívá faktu, že každá buňka embrya by měla obsahovat stejnou genetickou výbavu, a také toho, že v raných fázích vývoje jednotlivé buňky embrya ještě nejsou specializovány k určitým funkcím.

7.1 Historie a současnost PGD Na začátku 90. let 20. století byla představena PGD jako alternativa k prenatální diagnostice, která mohla zabránit přerušení těhotenství u párů, které vykazovaly vysoké riziko početí potomků s pohlavně vázanými genetickými poruchami (SERMON et al., 2004). Tato metoda umožňovala testování pohlaví embryí in vitro, kdy byla transferovaná embrya pouze ženského pohlaví. Ovšem základy, které umožnily rozvoj PGD, byly položeny v roce 1990 v Hammersmith Hospital v Londýně, kde profesor Handyside se svými kolegy provedl první analýzu jedné embryonální

buňky

(URL

17).

Tato

procedura

byla

provedena

metodu PCR (polymerase chain reaction neboli polymerázová řetězová reakce) kvůli výběru a transferu ženského embrya u páru, kterému bylo diagnostikováno dědičné onemocnění vázané na mužské pohlaví. Postupem času se metoda PCR začala používat k vyšetřování genových mutací a k vyšetřování monogenních chorob. K vyšetřování

počtu

a

struktury

metody multicolor FISH (vícebarevné

chromosomů fluorescenční

se in

situ

začalo

používat

hybridizace).

V

současnosti se PGD nejhojněji provádí pomocí supermoderní mikročipové technologie (microarrays, array-CGH, a-CGH).

7.2 PGD a preimplantační genetický screening PGS PGD je tedy obecně používána pro testování preimplantačních fází vývoje embryí a oocytů na genetické defekty (GERAEDTS & DE WERTS, 2009). Genetické defekty, které mohou být pomocí PGD diagnostikovány, jsou např. abnormality ve struktuře chromozomů, mitochondriální poruchy, monogenně dědičné choroby atd. V současné době se v souvislosti s PGD objevuje i metoda nesoucí název preimplantační genetický

66

screening (PGS), jehož hlavním cílem je taktéž poskytnou šanci k výběru nejperspektivnějšího embrya nezatíženého genetickými vadami (URL 17). Tyto genetické vady by v důsledku mohly vést k závažným vývojovým vadám. Zvyšovaly by riziko potratu plodu a snižovaly by šanci na úspěšné těhotenství. Při PGS dochází ovšem k hledání jakýchkoliv změn v genetické výbavě a dochází tedy ke kontrole celé DNA (URL 18). Naproti tomu při PGD jde o hledání konkrétní genetické změny – mutace. PGS/PGD je vhodný zejména pro páry, u kterých se vyskytují následující indikace: •

věk partnerky je vyšší než 35 let a je tak zvýšena pravděpodobnost porodu dítěte s abnormálním počtem chromozomů (např. Downův syndrom) (URL 16)

•

již se vyskytl potrat nebo porod plodu s chromozomální abnormalitou

•

dochází k opakovaným neúspěchům u IVF léčby

•

dochází k opakovaným abortům v rané fázi gravidity

•

byla cytogeneticky zjištěna u jednoho z partnerů přestavba chromozomů, přestože tento jedinec není geneticky postižen, a tato přestavba může mít za následek tvorbu pohlavních buněk s abnormální genetickou výbavou

•

v rodině se vyskytuje tzv. choroba vázaná na pohlaví (např. hemofilie)

•

jeden z partnerů prodělal nebo prodělává některé druhy chemoterapie nebo radioterapie

•

k oplození vajíček bylo v cyklu IVF použito spermií partnera s neobstrukční formou azoospermie získaných metodou MESA nebo TESE

•

špatné parametry spermiogramu partnera (přítomnost patologických forem spermií) (URL 17)

7.3. Provedení PGD Obecný postup při provedení PGD je sestaven ze tří fází. První fází je proces IVF, protože PGD je neodmyslitelně spjata s cyklem mimotělního oplodnění a nelze jej od něj oddělit (HAMEED & ALI, 2008). Druhým krokem je odběr materiálu pro analýzu a posledním krokem je diagnostika odebrané buňky.

67

7.3.1 Biopsie K odběru buňky z embrya je možné přistoupit ve třech stádiích. A to ve stádiu, kdy oocyt obsahuje první nebo druhá polární tělíska (GERAEDTS & DE WERTS, 2009). Dále může být biopsie provedena ve fázi rýhování nebo ve stádiu blastocysty. Při každé biopsii dochází k narušení obalu zona pellucida (ZP) a k tomu se nejčastěji využívá mikromanipulačních technik. Mikromanipulací se rozumí operace prováděné na vajíčku či embryu pomocí speciálních nástrojů (ŘEZÁBEK, 2008a). Celý mikromanipulační proces se odehrává pod mikroskopem. Nejpoužívanější postup pro narušení ZP patří do skupiny mechanických procedur (DE VOS & VAN STEIRTEGHEM, 2001). Při procedurách mechanického otvírání ZP dochází k punkci a částečné disekci ZP pomocí zkosené nebo bioptické mikropipety. Mikropipeta může být použita k nasávání obsahu nebo se může zvolit i opačný postup a tím je vyfukovaní, pro které je ale nutno vytvořit druhý otvor v ZP. K narušení obalu ZP můžeme použít i kyselý Tyrodův roztoku, jehož pH je 2,3. Tyrodův roztok vytváří mnohem větší a kulatější otvor v ZP a jeho kontrola není vždy snadná. Tento postup vyžaduje použití celkem velkého množství tohoto roztoku a následně může docházet i k okyselení kultivačního média. V některých případech může dojít i k lýze buněk nebo ovlivnění dalšího vývoje nebo dokonce implantace. Embrya jsou sice hned po zákroku několikrát omyta, aby se této komplikaci zamezilo, přesto je však riziko vysoké, a proto se od tohoto přístupu upouští. Alternativou k mechanickému nebo chemickému otevírání ZP je použití laserové techniky. Laserové paprsky konkrétní konfigurace jsou schopny vyvolat jen minimální povrchové poškození ZP oocytů a embryí.

7.3.2 Biopsie polárních tělísek Získaná polární tělíska jsou ve většině případů podrobena nepřímé genetické analýze, která slouží jako ukazatel obsahu oocytů (GERAEDTS & DE WERTS, 2009). Výhodou této metody je možnost vyřazení nevhodných oocytů. Kromě tohoto je testování polárních tělísek eticky přijatelné v zemích, které nedovolují testovaní embryí. Je možné testovat první i druhá polární tělíska, ale u člověka je sekundární tělísko k dispozici až po oplození. Samozřejmě ale existuje i nevýhoda testování polárních tělísek. Ta spočívá v tom, že neumožňuje analýzu otcovského genetického materiálu.

68

A

B

C Obr. 14 Odběr polárních tělísek A) odběr prvního polárního tělíska, B) odběr druhého polárního tělíska, C) Odběr prvního a druhého polárního tělíska (URL 19).

7.3.3 Biopsie blastomer K vyjmutí blastomer dochází až po narušení zona pellucida. K narušení ZP můžeme použít mechanické, chemické nebo laserové postupy (GERAEDTS & DE WERTS, 2009). Samotné vyjmutí blastomer se provádí buď odsátím anebo vytlačováním. Metodika a počet blastomer užívaných pro biopsii jsou stále studovány, nicméně je obecným zvykem odebírat jednu až dvě buňky, pokud je embryo tvořeno 5 - 10 buňkami a vyskytuje se ve fázi ryhování. Další možností je odebrání páru buněk z trofoblastu, když je embryo staré pět dnů a nachází se ve stádiu blastocysty. Odebrané blastomery se následně studují pomocí FISH, PCR nebo mikročipů.

69

Obr. 15 Biopsie blastomery Na obrázku A vidíme prořezaný otvor v nebuněčném obalu ZP. Tímto otvorem vsune embryolog pipetu (obr. B), kterou vysaje z embrya jednu blastomeru (obr. C). Na obrázku D můžeme spatřit volnou blastomeru po jejím vypuzení z pipety (URL 20).

7.3.4 Analýza získaného materiálu

7.3.4.1 Polymerázová řetězová reakce (polymerase chain reaction - PCR) Metoda PCR je poměrně rychlá a snadná metoda, při které dochází k amplifikaci (namnožení) vzorku DNA. Biologický materiál, který byl získán z oocytu nebo embrya je ve většině případů použit pro diagnostiku monogenních onemocnění (SERMONT et al., 2004). Celý proces začíná lýzou odebraných blastomer nebo polárních tělísek. Lýza buněk je vyvolána speciálním roztokem. Následně dojde k uvolnění DNA z buněk. K získanému vzorku DNA se přidá reakční směs PCR a začíná samotný proces PCR. PCR je vysoce citlivá metoda, která dokáže detekovat byť i jedinou molekulu DNA ve vzorku. PCR může být velice citlivá i vůči cizím vzorkům DNA. Kvůli této vysoké citlivosti došlo k přijetí mnoha přísných laboratorních opatření a norem. Jedním z opatření bylo i použití ICSI. Kromě vysoké citlivosti k cizím vzorkům DNA, patří k

70

dalším úskalím této metody možnost amplifikace pouze jednoho místo obou přítomných genů. To může vést k chybné diagnóze onemocnění, přenosu nebo dokonce k implantaci postiženého embrya. K překonání potenciálního problému s amplifikací pouze jedné kopie genu bylo vyvinuto mnoho různých technik, které se specializují na analýzu fragmentů vzniklých během PCR. Příkladem může být fluorescenční PCR, analýza fragmentůn a automatizovaných sekvestorech, a později byla také zavedena multiplex PCR. Od doby zavedení automatizovaného sekvencování, minisekvencovaní a real-time PCR se vědcům podařilo zdokonalit diagnostickou schopnost metody.

7.3.4.2 Fluorescenční in situ hybridizace - FISH Metoda FISH patří do skupiny standardních cytogenetických metod (URL 21). Při této metodě se chromozomy označují fluorescenčními sondami. Sondy jsou krátké úseky DNA, na kterých je navázáno fluorescenční barvivo, které je komplementární k vyšetřovanému úseku DNA. Sondy mohou být označeny přímo fluorochromy nebo nepřímo označeny reportérovými molekulami, jejichž detekce je možná pomocí fluorescenčních protilátek (OGILVIE et al., 2005). Při teplotě 72 - 75 °C dochází k denaturaci. Při procesu denaturace se vlákna sondy i vyšetřované DNA rozvolní a po následném ochlazení se sonda hybridizuje na vyšetřovaný úsek chromosomu (URL 21). Tím dojde k jeho označení, což se ve fluorescenčním mikroskopu projeví barevným hybridizačním signálem. Při použití FISH se můžeme setkat i s problémy (OGILVIE et al., 2005). Největším problémem je získávání požadovaných sond nezbytným fluorochromem nebo reportérovou molekulou, nutnou k označení sledovaného jevu. Může také docházet k překryvu nebo naopak rozdělení sledovaného signálu.

.

71

Obr. 16 Výsledek pěti barevné FISH provedené na jádru jedné blastomery, odlišné chromozomy jsou na obrázku označeny čísly. A) mužské jádro (je přítomen X a Y chromozom B) ženské jádro (jsou přítomny dva X chromozómy) (SERMON et al., 2004).

7.3.4.3 Srovnávací genomová hybridizace (comparative genomic hybridization CGH) a microarray (mikročipy) Srovnávací genomová hybridizace (CGH) dokáže zjistit nerovnováhu v celém genomu. Ke stanovení nerovnováhy používá amplifikaci celého genomu, což je zdlouhavé (WELLS et al., 2002). Tato technologie je časově náročná a celá procedura trvá asi 72 hodin (SERMON et al., 2004). Při biopsii třídenního embrya musí být toto embryo kryokonzervováno až do doby výsledků ze CGH. Chromozomální screening pomocí microarray (mikročipů) stejně jako CGH v sobě zahrnují proces hybridizace referenčních vzorků DNA (WELLS et al., 2002). A stejně jako FISH používá sondy. Každá sonda je specifická pro jinou chromozomální oblast a zabírá diskrétní místo na výsledném snímku. Chromozomální ztráta nebo zisk se projevuje podle barvy přijaté každým místem po hybridizaci. Microarrays mají výhodu oproti konvenční CGH v tom, že hodnocení fluorescenčních poměrů je jednoduché, snadno zautomatizovatelné a čas potřebný pro hybridizace je obecně kratší. Celý proces se dá zvládnou do 48 hodin, což umožňuje diagnostiku embrya bez potřeby kryokonzervace.

72

Obr. 17 Ukázka výsledku vyšetření embrya pomocí a-CGH - normální mužský karyotyp 46, XY (URL 17).

Obr. 18 Ukázka výsledku vyšetření embrya pomocí a-CGH - normální ženský karyotyp 46, XX (URL 17).

Obr. 19 Ukázka výsledku vyšetření embrya pomocí a-CGH - patologický nález: +2, -14,-19, +22 (navíc jsou chromosomy 2 a 22, chybějí chromosomy 14 a 19) (URL 17).

73

Závěr

Cílem této práce bylo posouzení trendů v oblasti hodnocení embryí. Dosavadní hodnocení embryí, které má základ v konvekčním morfologickém hodnocení, je nedostatečné. Jednotlivé postupy v sobě zahrnují i subjektivní přístupy jednotlivých embryologů. Ale přesto morfologické hodnocení stále zůstává na prvním místě v hodnocení kvality a životaschopnosti embryí. Je to díky nenáročnosti na vybavení, které se nepohybuje nad rámec běžného zařízení embryologické laboratoře. Embryologové mají k dispozici značnou škálu hodnotících systémů (Tesárikův, Scottův, Gardnerů), a právě jejich značná variabilita přispívá k vývoji nových metod. Další důležitý faktor, který také ovlivňuje kvalitu embryí, je samotný proces kultivace. Celý proces kultivace embrya může trvat až šest dnů. Neméně důležité je i samotné složení kultivačního média, které se skládá z mnoha komponent. Složení kultivačního média není konečné, stále je usilováno o jejich zlepšení a v této oblasti probíhá intenzivní experimentální vývoj. Do popředí zájmů se dostaly inovativní metody jako monitoring kultivace, metabolomika nebo genetická analýza. Metabolomika je věda, která se zabývá látkovou přeměnou (metabolismem) a ke svým potřebám využívá rozlehlou základnu analytických metod. V současné době se nejlepším ukazatelem pro měření celkové metabolické aktivity jeví spotřeba kyslíku. Spotřebu kyslíku lze měřit neinvazivně pomocí nanospirometru nebo embryoskopu. Genetická analýza využívá pro své účely hlavně metody jako PCR, FISH nebo používá mikročipy. V současnosti se PGD provádí pomocí supermoderní mikročipové technologie. Mikročipy dokáží rychle a efektivně zhodnotit nerovnováhu v celém genomu a zhodnotit celý karyotyp. Na rozdíl od starší metody FISH, která může zkoumat jen omezený počet chromozomů. Přesnost a výtěžnost této metody je velmi vysoká a proto je v současnosti nejvíce preferovanou metodou. Pravděpodobnost narození zdravého potomka bez genetické zátěže tedy nejlépe predikuje mikročipová metoda. Nesmíme ale opomenout i příspěvek metabolomiky, která spolu s morfologickým hodnocením vykazuje vysoká procenta úspěšnosti.

74

Všechny zmíněné metody a procesy se snaží zefektivnit výběrové metody embryí a zároveň se dá předpokládat, že současný rozvoj v oblasti genetiky a počítačových technologií jistě zajistí další možnosti pro vylepšení.

75

Seznam použité literatury •

AGUILAR J. & M. REYLEY. 2005: The uterine tubal fluid: secretion, composition and biological effects. Animal Reproduction 2: 91-105.

•

AHLSTRÖM A., WIKLAND M., ROGBERG L., BARNETT J. S., TUCKER M. & HARDARSON, T. 2011: Cross-validation and predictive value of nearinfrared spectroscopy algorithms for day-5 blastocyst transfer. Reproductive Biomedicine Online 22: 477-484.

•

BĄCZKOWSKI T., KURZAWA R. & GŁĄBOWSKI W. 2004: Methods of embryo scoring in in vitro fertilization. Reproductive Biology 4: 5-22.

•

BLAKE D., SVALANDER P., JIN M., SILVERSAND C. & HAMBERGER L. 2002: Protein supplementation of human IVF culture media. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 19:137-143.

•

BIGGERS J. D. 2002: Thoughts on embryo culture conditions. Reproductive Biomedicine Online 4: 30-38.

•

BIGGERS J. D., WHITTINGHAM D. G. & DONAHUE R. P. 1967: The pattern of energy metabolism in the mouse oöcyte and zygote. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 58: 560.

•

BOTROS L., SAKKAS D. & SELI E. 2008: Metabolomics and its application for non-invasive embryo assessment in IVF. Human Reproduction14: 679 – 690.

•

BRINSDEN P. R. 2005. Textbook of in Vitro Fertilization and Assist ed Reproduction: The Bourn Hall Guide to Clinical and Laboratory Practice. 3.vyd. London: Taylor & Francis Group. 688str. 978-1842142936

•

BRINSTER R. L. 1965: Studies on the development of the mouse embryos in vitro. II. The effect of energy source. Journal of Experimental Zoology. 158: 59– 68.

•

BUTCHER L., COATES A., MARTIN K. L., RUTHERFORD A. J. & LEESE H. J. 1998: Metabolism of pyruvate by the early human embryo. Biology of Reproduction 58: 1054-1056.

•

CATT J. W. & HENMAN M. 2000: Toxic effects of oxygen on human embryo development. Human Reproduction 15: 199-206.

76

•

CRUZ M., GADEA B., GARRIDO N., PEDERSEN K.S., MARTI´NEZ M., PE´REZ-CANO I., MUN˜OZ M. & MESEGUER M. 2011: Embryo quality,blastocyst and ongoing pregnancy rates in oocyte donation patients whose embryos were monitored by time-lapse imaging. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 28: 569–573.

•

ČECH S., HORKÝ D. & SEDLÁČKOVÁ, M. 2011. Přehled embryologie člověka. 1.vyd. Brno: CENTA. 187 s. ISBN 978-80-210-5414-1.

•

DE VOS A. & VAN STEIRTEGHEM A. 2001: Aspects of biopsy procedures prior to preimplantation genetic diagnosis. Prenatal Diagnosis 21: 767-780.

•

DEVREKER F., HARDY K., VAN DEN BERGH M., VANNIN A. S., EMILIANI S., & ENGLERT Y. 2001: Amino acids promote human blastocyst development in vitro. Human Reproduction 16: 749-756.

•

DOHERTY C. M. & CLARK M. M. 2006. Léčba neplodnosti – podrobný rádce neplodným párům. 1.vyd. Brno: Computer Press. 121 s. ISBN 80-251-0771-X.

•

DUMOULIN J. C., MEIJERS C. J., BRAS M., COONEN E., GERAEDTS J. P. & EVERS J. L. 1999: Effect of oxygen concentration on human in-vitro fertilization and embryo culture. Human Reproduction 14: 465-469.

•

FLEMING T. P., KWONG W. Y., PORTER R., URSELL E., FESENKO I., WILKINS A., MILLER D. J., WATKINS A.D. & ECKERT J. J. 2004: The embryo and its future. Biology of Reproduction 71: 1046-1054.

•

FLOOD L. P. & SHIRLEY B. 1991: Reduction of embryotoxicity by protein in embryo culture media. Molecular Reproduction and Development 30: 226-231.

•

GARDNER D. K. & LANE M. 1997: Culture and selection of viable blastocysts: a feasible proposition for human IVF?. Human Reproduction Update 3: 367-382.

•

GARDNER D. K. & LANE M. 1998: Culture of viable human blastocysts in defined sequential serum-free media. Human Reproduction 13: 148-159.

•

GARDNER D. K. & LANE M. 2007: Embryo Culture Systems. In: GARDNER D. K. 2007: In vitro fertilization : a practial approach. 1.vyd. New York: Informa Healthcare USA, Inc. 529str.ISBN: 978‑0‑8493‑3335‑4. pp. 221-282.

•

GARDNER D. K., LANE M., CALDERON I. & LEETON J. 1996: Environment of the preimplantation human embryo in vivo: metabolite analysis of oviduct and

77

uterine fluids and metabolism of cumulus cells. Fertility and Sterility 65: 349353. •

GERAEDTS J. P. M., & DE WERT G. M. W. R. 2009: Preimplantation genetic diagnosis. Clinical Genetics 76: 315-325.

•

GRIM M. & DRUGA R. 2005. Základy anatomie. 1. vyd. Praha: Galén. 163 s. ISBN 8072623028.

•

GUERIF F., LE GOUGE A., GIRAUDEAU B., POINDRON J., BIDAULT R., GASNIER O. & ROYERE D. 2007: Limited value of morphological assessment at days 1 and 2 to predict blastocyst development potential: a prospective study based on 4042 embryos. Human Reproduction 22: 1973-1981.

•

HAMEED N. & ALI M. A. 2008: Preimplantation genetic screening. J Ayub Med Coll Abbottabad 20.

•

HARDARSON T., AHLSTRÖM A., ROGBERG L., BOTROS L., HILLENSJÖ T., WESTLANDER G., SAKKAS D & WIKLAND M. 2012: Non-invasive metabolomic profiling of Day 2 and 5 embryo culture medium: a prospective randomized trial. Human Reproduction 27: 89-96.

•

HOUGHTON F. D., HAWKHEAD J. A., HUMPHERSON P. G., HOGG J. E., BALEN A. H., RUTHERFORD A. J. & LEESE, H. J. 2002: Non-invasive amino acid turnover predicts human embryo developmental capacity. Human Reproduction 17: 999-1005.

•

HOLLYWOOD K., BRISON D. R. & GOODACRE R. 2006: Metabolomics: current technologies and future trends. Proteomics 6: 4716-4723.

•

JONES G. M., FIGUEIREDO F., OSIANLIS T., POPE A. K., ROMBAUTS L., STEEVES T. E., THOUAS G., TROUNSON A. O. 2002: Embryo culture, assessment, selection and transfer. In: VAYENA E., ROWE P. J. & GRIFFIN P. D. 2002: Current practices and controversies in assisted reproduction. 1.vyd. Geneva: World Health Organization, 2002. 404 str. ISBN: 92 4 159030 0. pp. 189-209.

•

KIRKEGAARD K., HINDKJAER J. J., GRØNDAHL M. L., KESMODEL U. S. & INGERSLEV H. J. 2012: A randomized clinical trial comparing embryo culture in a conventional incubator with a time-lapse incubator. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 29. 565-572.

78

•

KLIKA E. 1985. Embryologie člověka. Díl 1, Obecná embryologie a teratologie. 3.vyd. Praha: Státní pedagogické nakladatelství. 125 s.

•

KLOUDA P. 2002. Fyzikální chemie. 2.vyd. Ostrava: Pavel Klouda. 139 s. ISBN 80-86369-06-4.

•

LANE M. & GARDNER D. K. 2001: Inhibiting 3‐phosphoglycerate kinase by EDTA stimulates the development of the cleavage stage mouse embryo. Molecular Reproduction and Development 60: 233-240.

•

LEESE H. J., TAY J. I., REISCHL J. & DOWNING S. J. 2001: Formation of Fallopian tubal fluid: role of a neglected epithelium. Reproduction 121: 339-346.

•

LOPES A. S., GREVE T. & CALLESEN H. 2007: Quantification of embryo quality by respirometry. Theriogenology 67: 21-31.

•

MACHTINGER R. & RACOWSKY C. 2013: Morphological systems of human embryo assessment and clinical evidence. Reproductive Biomedicine Online: 210-221.

•

MAGLI M. C., GIANAROLI L., FIORENTINO A., FERRARETTI A. P., FORTINI D. & PANZELLA S. 1996: Fertilization and early embryology: Improved cleavage rate of human embryos cultured in antibiotic-free medium. Human Reproduction 11: 1520-1524.

•

MALINSKÝ J. & LICHNOVSKÝ V. 2003. Přehled Embryologie člověka v obrazech. 2.vyd. Olomouc: Univerzita Palackého v Olomouci. 176 s. ISBN 80244-0243-2

•

MARDEŠIC T. 1998. Mimotělní oplodnění. Praha: Galén. 1.vyd. 87 s. ISBN 8085824-83-3

•

MARKET-VELKER B. A., FERNANDES A. D. & MANN M. R. W. 2010: Side-by-side comparison of five commercial media systems in a mouse model: suboptimal in vitro culture interferes with imprint maintenance. Biology of Reproduction 83: 938-950.

•

MEHTA, R. H. 2001: Growth of human preimplantation embryos in vitro. Reproductive BioMedicine Online 2: 113-119.

•

MESEGUER M., HERRERO J., TEJERA A., HILLIGSØE K. M., RAMSING N. B. & REMOHÍ, J. 2011: The use of morphokinetics as a predictor of embryo implantation. Human Reproduction 26: 2658-2671.

79

•

MOAYERI S. E., ALLEN R. B., BREWSTER W. R., KIM M. H., PORTO M. & WERLIN, L. B. 2008: Day-3 embryo morphology predicts euploidy among older subjects. Fertility and Sterility 89: 118-123.

•

MOORE K. L. & PERSAUD T.V.N. 2008. The Developing Human: Clinically Oriented Embryology. 8.vyd. Philadelphia: Saunders Elsevier. 522 s ISBN 978-14160-3706-4.

•

MOORE K. L., PERSAUD T.V.N. & TORCHIA M.G. 2013. Before we are born: essentials of embryology and birth defects. 8.vyd. Philadelphia, PA: Elsevier Saunders. 348 s. ISBN 9781437720013.

•

MUSILOVÁ J. & GLATZ Z. 2011: Metabolomika-základní pojmy, strategie a metodologie. Chemické Listy 105: 745-751.

•

MRÁZEK M. 2003. Umělé oplodnění. 1.vyd, Praha: Triton, 62 s. ISBN 807254-413-6.

•

NAGY Z. P., SAKKAS D. & BEHR B. 2008: Non-invasive assessment of embryo viability by metabolomic profiling of culture media (‘metabolomics’). Reproductive Biomedicine Online, 17: 502-507.

•

NAKAHARA T., IWASE A., GOTO M., HARATA T., SUZUKI M., IENAGA M., KOBAYASHI H., TAKIKAWA S., MANABE S., KIKKAWA F. & ANDO H. 2010: Evaluation of the safety of time-lapse observations for human embryos. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 27: 93–96.

•

NEL-THEMAAT, L. & NAGY Z. P. 2011: A review of the promises and pitfalls of oocyte and embryo metabolomics. Placenta 32: S257-S263.

•

OBRUČNÍK M. 1971. Nárys embryologie člověka. 3. vyd. Brno: Univerzita J. E. Purkyně, 1971, 144 s.

•

OGILVIE C. M., BRAUDE P. R. & SCRIVEN P. N. 2005: Preimplantation genetic diagnosis - an overview. Journal of Histochemistry & Cytochemistry 53: 255-260.

•

OH S. J., GONG S. P., LEE S. T., LEE E. J., LIM J. M. 2007: Light intensity and wavelength during embryo manipulation are important factors for maintaining viability of preimplantation embryos in vitro. Fertility and Sterility 88: 1150– 1157.

80

•

OTTOSEN L. D., HINDKJAER J., INGERSLEV J. 2007: Light exposure of the ovum and preimplantation embryo during ART procedures. Journal of Assisted Reproduction and Genetics 24: 99–103.

•

POOL T. B. 2002: Recent advances in the production of viable human embryos in vitro. Reproductive Biomedicine Online 4: 294-302.

•

PRADOS F. J., DEBROCK S., LEMMEN J. G. & AGERHOLM I. 2012: The cleavage stage embryo. Human Reproduction 27: i50-i71.

•

PRAKASH V. & GANGAL S. 2012: Embryo and Blastocyst Culture. In: TALWAR P. 2012: Manual of Assisted Reproductive Technologies and Clinical Embryology. 1.vyd. New Delhi: Jaypee Brothers Medical Pub. 900 str. ISBN: 978-93-5025-506-3. pp 364 – 373.

•

PUDAKALAKATTI S. M., UPPANGALA S., D'SOUZA F., KALTHUR G., KUMAR P., ADIGA S. K. & ATREYA H. S. 2013: NMR studies of preimplantation embryo metabolism in human assisted reproductive techniques: a new biomarker for assessment of embryo implantation potential. NMR in Biomedicine 26: 20-27.

•

ROBERTS, R. M. 2005: Embryo culture conditions: what embryos like best. Endocrinology 146: 2140-2141.

•

ROSYPAL S. 2003. Nový přehled biologie. 1. vyd. Praha: Scientia. 797 s. ISBN 80-7183-268-5.

•

ŘEŽÁBEK K. 2008a: Asistovaná reprodukce: průvodce ošetřujícího lékaře. 1. vyd. MAXDORF, s.r.o.. 112 s. ISBN 978-80-7345-154-7.

•

ŘEŽÁBEK K. 2008b: Asistovaná reprodukce. In: ROB L., MARTAN A. & CITTERBART K. 2008. Gynekologie. 2., dopl. a přeprac. vyd. Praha: Galén. 319 s. ISBN 978-80-7262-501-7. pp 163 – 178.

•

ŘEŽÁBEK K. 2011: Asistovaná reprodukce. In: ROZTOČIL A. & BARTOŠ P. 2011. Moderní gynekologie. 1. vyd. Praha: Grada. 508 s. ISBN 978-80-2472832-2. pp 223 – 246.

•

SANTOS FILHO E., NOBLE J. A., POLI M., GRIFFITHS T., EMERSON G. & WELLS D. 2012: A method for semi-automatic grading of human blastocyst microscope images. Human Reproduction 27: 2641-2648.

81

•

SCOTT L., ALVERO R., LEONDIRES M. & MILLER B. 2000: The morphology of human pronuclear embryos is positively related to blastocyst development and implantation. Human Reproduction 15: 2394-2403.

•

SELI, E., ROBERT, C. & SIRARD, M. A. 2010: OMICS in assisted reproduction: possibilities and pitfalls. Molecular Human Reproduction 16: 513530.

•

SERMON K., VAN STEIRTEGHEM A. & LIEBAERS I. 2004: Preimplantation genetic diagnosis. The Lancet 363: 1633-1641.

•

SINGH R. & SINCLAIR K. D. 2007: Metabolomics: approaches to assessing oocyte and embryo quality. Theriogenology 68: S56-S62.

•

SMITH A. L. 2002: Blastocyst culture in human IVF: the final destination or a stop along the way?. Theriogenology 57: 97-107.

•

SMITH G. D., TAKAYAMA S. & SWAIN J. E. 2012: Rethinking in vitro embryo culture: new developments in culture platforms and potential to improve assisted reproductive technologies. Biology of Reproduction 86: 62.

•

SUMMERS M. C. & BIGGERS J. D. 2003: Chemically defined media and the culture of mammalian preimplantation embryos: historical perspective and current issues. Human Reproduction Update 9: 557-582.

•

SWAIN J. E. 2012: Is there an optimal pH for culture media used in clinical IVF?. Human Reproduction Update 18: 333-339.

•

SWAIN J. E. & SMITH G. D. 2011: Advances in embryo culture platforms: novel approaches to improve preimplantation embryo development through modifications of the microenvironment. Human Reproduction Update 17: 541557.

•

TESARIK J. & GRECO E. 1999: The probability of abnormal preimplantation development can be predicted by a single static observation on pronuclear stage morphology. Human Reproduction 14: 1318-1323.

•

TRÁVNÍK P. 1990: Oplození in vitro a kultivace embryí. In: DVOŘÁK M. 1990: Oplození in vitro a přenos embrya při léčbě lidské neplodnosti. 1. vyd. Brno: Masarykova univerzita.157s. ISBN:80-210-0166-6. pp 85 – 103 s.

•

TRÁVNÍK P. & ČECH S. 2011. Základy obecné a speciální embryologie pro klinické embryology. 1.vyd. Brno: YBUX., 143 s.

82

•

VACEK Z. 2006. Embryologie. 1.vyd. Praha: Grada Publishing. 256 s. ISBN 80247-1267-9.

•

VÁCHA M., FELLNEROVÁ I., BIČÍK V., PETRÁSEK R. & ŠIMEK V. 2008. Srovnávací fyziologie živočichů. 2.vyd. Brno: Studio ARX. 167s. ISBN 978-80210-3379-5.

•

VAN DER AUWERA I., DEBROCK S., SPIESSENS C., AFSCHRIFT H., BAKELANTS E., MEULEMAN C., MEEUWIS L. & D'HOOGHE T. M. 2002: A prospective randomized study: day 2 versus day 5 embryo transfer. Human Reproduction 17: 1507-1512.

•

VERGOUW C. G., BOTROS L. L., ROOS P., LENS J. W., SCHATS R., HOMPES P. G. A., BURNS H. & LAMBALK C. B. 2008: Metabolomic profiling by near-infrared spectroscopy as a tool to assess embryo viability: a novel, non-invasive method for embryo selection. Human Reproduction 23: 14991504.

•

WELLS D., ALFARAWATI S. & FRAGOULI E. 2008: Use of comprehensive chromosomal screening for embryo assessment: microarrays and CGH. Molecular Human Reproduction 14: 703-710.

•

WEISS P. 2010. Sexuologie. Vyd. 1. Praha: Grada. 724 s. ISBN 978-80-2472492-8.

•

WOJTOWICZ P. & JANEČKOVÁ H. 2013: Techniky metabolomiky v biomedicíně. Chemické Listy 107: 3-11.

•

WONG C. C., LOEWKE K. E., BOSSERT N. L., BEHR, B., DE JONGE C.J.,BAER T. M. & REIJO PERA R. A. 2010: Non-invasive imaging of human embryos before embryonic genome activation predictsdevelopment to the blastocyst stage. Nature Biotechnology 28: 1115–1121.

•

ZHANG J. Q., LI X. L., PENG Y., GUO X., HENG B. C. & TONG G. Q. 2010: Reduction in exposure of human embryos outside the incubator enhances embryo quality and blastulation rate. Reproductive Biomedicine Online 20: 510–515.

•

ZHAO Q., YIN T., PENG J., ZOU Y., YANG J., SHEN A. & HU J. 2013: Noninvasive Metabolomic Profiling of Human Embryo Culture Media Using a Simple Spectroscopy Adjunct to Morphology for Embryo Assessment in in Vitro Fertilization (IVF). International Journal of Molecular Sciences 14: 6556-6570.

83

Internetové zdroje •

URL 1: MAŘÍK T. 2012: Počet dětí narozených ve světě po umělém oplodnění přesáhne v roce 2012 hranici 5 milionů. [cit 6.5.2013]. Dostupný z WWW: .

•

URL 2: WILDOVÁ O. 2007: Tři miliony dětí po umělém oplodnění. [cit 6.5.2013]. Dostupný z WWW: .

•

URL 3: ANONYM. Obrázek hlavních fáze meiotického dělení . [cit 20.4.2013] Dostupný z WWW: .

•

URL 4: ANONYM. Obrázek vyzrálé spermie. [cit 10.3.2013] Dostupný z WWW: .

•

URL 5: ANONYM. Obrázek Gráfova folikulu. [cit 10.3.2013] Dostupný z WWW: .

•

URL 6: ANONYM. Obrázek blastocysty. [cit 3.4.2013]. Dostupný z WWW: .

•

URL 7: FERRING. Schéma provedení IUI. [cit 3.5.2013]. Dostupný z WWW: .

•

URL 8: ANONYM. Obrázek ICSI. [cit 3.5.2013] Dostupný z WWW: < http://www.infertile.com/brochures/treating_infertility07.htm>.

•

URL 9: KLEISL L.: Metody asistované reprodukce. [cit 6.3.2013] Dostupný z WWW: .

•

URL 10: ANONYM. How to grade an embryo?. [cit 6.4.2011] Dostupný z WWW: .

•

URL 11: SIANO L. J. 2012: How do we choose embryos for transfer?. [cit 6.4.2011] Dostupný z WWW: < http://fertilitycenter-uconn.org/how-do-wechoose-embryos-for-transfer/>.

84

•

URL 12: ANONYM. Obrázek Embryscope a externí počítač Embryo Viewer. [cit 9.4.2013] Dostupný z WWW: .

•

URL 13: JERRYNO. 2011: Metabolomika. [cit 31.4.2013] Dostupný z WWW: .

•

URL 14: DENDISOVÁ M., ŽVÁTORA P., MATĚJKA P. 2011: Ramanova spektrometrie. [cit 26.2.2011]. Dostupný z WWW:

•

URL 15: MATĚJKA P. 2008: Spektrometrie v blízké infračervené oblasti. [cit 26.2.2011]. Dostupný z WWW: .

•

URL 16: PŘÍBÁŇ L. 2008: PGD - preimplantační genetická diagnostika. [cit 2.5.2013]. Dostupný z WWW: < http://www.gest.cz/cz/crm_ivf.php?pg=3 >.

•

URL 17: REPROMEDA. Preimplantační genetická diagnostika a screening. [cit 26.2.2011]. Dostupný z WWW: < http://www.repromeda.cz/preimplantacni-geneticka-diagnostika--pgd-.html>.

•

URL 18: SANATORIUM HELIOS. Preimplantační genetická diagnostika a screening. [cit 2.5.2013]. Dostupný z WWW: < http://www.sanatoriumhelios.cz/pgd>.

•

URL 19: VERLINSKY Y. & KULIEV A.: Obrázek odběru polárních tělísek. [cit 3.5.2013]. Dostupný z WWW: .

•

URL 20: ANONYM. Obrázek biopsie blastomery pro PGD z 8-buněčného embrya ve třetí den vývoje. [cit 3.5.2013]. Dostupný z WWW: .

•

URL 21: GENNET. 2010: Fluorescenční in situ hybridizace – FISH. [cit 4.5.2013] Dostupný z WWW: < http://www.gennet.cz/metoda-fish.html>.

85

Seznam použitých zkratek

AH

Asissted Hatching

AID

Artificial Insemination from Donor

AIH

Artificial Insemination from Husband

ATP

Adenosintrifosfát

CE

Kapilární elektroforéza

CGH

comparative genomic hybridization

CO2

Oxid uhličitý

DIFI

Direct Intra Falopian Insemination

DIPI

Direct Intra Peritoneal Insemination

DNA

Deoxyribonukleová kyselina

EDTA

Kyselina ethylendiamintetraoctová

ELISA

Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay

ED

Egg Donation

FISH

Fluorescenční in situ hybridizace

FSH

Folikulostimulační hormonu

FT-ICR-MS

Ion cyklotronová rezonance s Fourierovy transformací s MS

FT-IR

Infračervené spektroskopie s Fourierovy transformací

GC

Plynová chromatografie

GIGT

Gamet Intra Falopian Transfer

HEPES

Kyselina 2-[4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethansulfonová

HILIC

Chromatografie s hydrofobními interakcemi

HLA-G

Rozpustný antigen-G lidských leukocytů

HIV

Human immunodeficiency virus

HNMR

protonová nukleární magnetická rezonance

HPLC

Vysoce výkonná kapalinová chromatografie

HSA

Lidský sérový albumin

ICM

Inter cell mass

ICSI

IntraCytoplazmic Sperm Injection

IMSI

Intracytoplazmic Morfological Selested Sperm Injection

IUI

Intra Uterine Insemination 86

IVF ET

In Vitro Fertilizace and Embryo Transfer

IVM

In Vitro Maturation

KET

KryoEmbryo Ttransfer

LC

Kapalinová chromatografie

LC ES

Kapalinovou chromatografií za použití elektrochemické pole

LDI MS

Laserová ionizační desorpce s MS

LH

Luteinizační hormon

MESA

Microsurgical Epididymal Sperm Aspiration

MS

Hmotnostní spektrometrie

NIR

Spektroskopie v blízké infračervené oblasti

NMR

Nukleární magnetická rezonance

NPB

Nucleolar precursor bodies

O2

Kyslík

OHSS

Hyperstimulační ovariální syndrom

PEP

Fospfoenolpyruvát

PCR

Polymerase chain reaction

PGD

Preimplantační genetická diagnostika

PGS

Preimplantační genetický screening

POST

Peritoneal Oocyt and Sperm Transfer

rAH

Rekombinační albumin

SCEM

Skenovací elektrochemické mikroskopie

SET

Singl embryo transfer

SSS

Synthetic serum substitutent

TESA

TEsticular Sperm Aspiration

TESE

TEsticular Sperm Extraction

TET

Tubal Embryo Transfer

UPLC

Ultra výkonná kapalinová chromatografie

ZIFT

Zygot Intra Falopian Transfer (přenos zygot do vejcovodu)

ZP

zona pellucida

87