Kode/Nama Rumpun Ilmu: 112/Kimia Tema : Kesehatan
LAPORAN AKHIR PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI
Produksi Natriuretik Peptida tipe B (BNP) dan Anti BNP scFv Rekombinan serta Aplikasinya untuk Diagnosis Gagal Jantung Secara Biosensor Elektrokimia Tahun ke-1 dari rencana 2 tahun
Ketua Peneliti Dr. Shabarni Gaffar, M.Si. (NIDN: 0025047105) Anggota Peneliti Dr. Yeni Wahyuni Hartati (NIDN: 0024097101) Dra. Dian Siti Kamara (NIDN: 0006126603)
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM UNIVERSITAS PADJADJARAN OKTOBER, 2015
ii
HALAMAN PENGESAHAN PENELITIAN UNGGULAN PERGURUAN TINGGI
iii
RINGKASAN
Basic natriuretic peptide (BNP), dikenal juga dengan B-type natriuretic peptide (BNP) atau GC-B, merupakan polipeptida yang terdiri dari 32 asam amino yang disekresikan oleh bilik jantung untuk merespon peregangan yang berlebihan pada sel otot jantung. Pengeluaran BNP dimodulasi oleh ion kalsium. Hasil penelitian menunjukkan bahwa BNP berpotensi untuk digunakan sebagai marker untuk meramalkan pasien yang mengalami gagal jantung. Anti BNP single chain variable fragment (anti BNP scFv) merupakan gabungan polipeptida antara daerah yang bervariasi pada rantai heavy (VH) dan rantai light (VL) dari immunoglobulin. Anti BNP scFv ini akan berikatan dengan BNP melalui pengenalan antigen-antibodi. Konsentrasi BNP dalam darah pasien dapat dideteksi melalui pengikatan antigen-antibodi (BNPAnti BNP scFv), menggunakan metoda biosensor elektrokimia. Tujuan jangka panjang penelitian ini adalah menghasilkan suatu metoda deteksi penyakit gagal jantung berbasis biosensor elektrokimia berdasarkan interaksi antigenantibodi. Biosensor elektrokimia menggunakan antibodi sebagai mulekul pengenal merupakan metoda yang sederhana dan mudah dibuat tanpa memerlukan peralatan yang mahal. State of the art penelitian ini adalah suatu metoda biosensor elektrokimia dengan menggunakan elektroda grafit pensil/emas berdasarkan interaksi antigenantibodi. Antibodi yang terikat pada suatu elektroda akan mengenali secara spesifik antigen yang komplemen dengannya. Dalam rangka pengembangan metoda deteksi BNP dengan biosensor elektrokimia, diperlukan dua protein standar, yaitu BNP dan anti BNP scFv. Target khusus yang ingin dicapai pada penelitian ini adalah memproduksi BNP rekombinan dan anti BNP scFv rekombinan menggunakan sistem ekspresi E. coli. Selanjutnya akan dilakukan uji interaksi BNP-anti BNP scFv pada biosensor elektrokimia dengan menggunakan elektroda grafit pensil/emas. Hasil yang akan dicapai pada penelitian ini adalah diperolehnya polipeptida BNP dan anti BNP scFv rekombinan dan diketahui batas deteksi BNP menggunakan biosensor elektrokimia dengan elektroda grafit pensil/emas. Penelitian ini akan dilakukan selama dua tahun. Pada tahun pertama dilakukan produksi BNP dan anti BNP scFv rekombinan, dan tahun kedua akan dilakukan pengujian biosensor elektrokimia BNP-anti BNP scFv. Hasil yang dilaporkan pada laporan kemajuan ini adalah: fragmen DNA pengode BNP sintetik telah berhasil disintesis dan di kloning menggunakan vektor ekspresi pET30a untuk E. coli. Fragmen DNA pengode BNP yang berukuran 96 pasang basa disintesis dengan penambahan sisi pengenal enzim restriksi Nde1 dan Xho1. Kodon dioptimasi sesuai dengan kodon preference E. coli, kemudian ditambahkan sisi pengenal enzim restriksi. Fragmen DNA pengode BNP diinsersikan ke vektor ekspresi pET30a, dan disubkloning dalam E. coli TOP10F’. Plasmid rekombinan hasil kloning telah di karakterisasi melalui pemotongan dengan enzim restriksi dan penentuan urutan DNA. Selanjutnya pET30a-BNP juga telah di transformasi ke inang ekspresi E. coli BL21 dan Arctic Express. Hasil ekspresi BNP rekombinan dalam ke dua inang ini belum menunjukkan adanya pita protein yang sesuai dengan ukuran BNP, yaitu sekitar
iv
4 kDa, sehingga masih perlu dilakukan proses ekspresi dengan melakukan beberapa modifikasi. Fragmen polipeptida Single chain variable fragment (ScFv) Vh dan VL yang mengenali BNP belum pernah dipublikasi. Sehingga pada penelitian ini, pertama dilakukan pencarian struktur 3D ScFv VH dan VL yang berikatan dengan ligan lain dari database Protein Data Bank. Kemudian dilakukan docking sejumlah struktur 3D scFv yang diperoleh dengan BNP, sehingga diperoleh satu ScFv yang memiliki binding afinitas tertinggi dengan BNP. Penelitian docking ini dilakukan oleh satu orang mahasiswa S2, dan akan diseminarkan pada seminar tingkat Nasional. Urutan polipeptida ScFv yang terpilih kemudian di reversed translate menjadi urutan nukleotida dengan menggunakan kodon preference E. coli. Fragmen DNA pengode anti BNP ScFv ini di sintesis oleh Genscript (Hongkong). Fragmen DNA pengode anti BNP-ScFv sintetik telah berhasil disintesis dan di kloning menggunakan vektor ekspresi pET30a untuk E. coli. Fragmen DNA pengode anti BNP ScFv yang berukuran 711 pasang basa disintesis dengan penambahan sisi pengenal enzim restriksi Nde1 dan Xho1. Kodon dioptimasi sesuai dengan kodon preference E. coli, kemudian ditambahkan sisi pengenal enzim restriksi. Fragmen DNA pengode anti BNP ScFv diinsersikan ke vektor ekspresi pET30a, dan disubkloning dalam E. coli TOP10F’. Plasmid rekombinan hasil kloning telah di karakterisasi melalui pemotongan dengan enzim restriksi dan penentuan urutan DNA. Selanjutnya pET30a-BNP juga telah di transformasi ke inang ekspresi E. coli BL21 Arctic Express. Hasil ekspresi anti BNP ScFv rekombinan menunjukkan adanya pita protein dengan berat molekul sekitar 25 kDa sesuai dengan berat molekul anti BNP ScFv.
v
PRAKATA Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah Subhanahu wa Ta’ala, karena hanya dengan izin-Nya penulis bisa menyelesaikan laporan kemajuan penelitian ini. Shalawat serta salam semoga tercurah kepada Rasulullah SAW beserta keluarga, sahabat dan seluruh pengikut setia Beliau sampai akhir zaman. Alhamdulillah, penulis akhirnya dapat menyelesaikan laporan kemajuan penelitian unggulan perguruan tinggi dengan judul “Produksi Natriuretik Peptida tipe B (BNP) dan Anti BNP scFv Rekombinan serta Aplikasinya untuk Diagnosis Gagal Jantung Secara Biosensor Elektrokimia”
Penyusun ingin mengucapkan terima kasih kepada: 1. Dr. Ayi Bahtiar, M.Si., selaku Direktur Riset dan Pengabdian Kepada Masyarakat, Unpad. 2. Prof. Dr. Budi Nurani R, MS, selaku Dekan FMIPA Unpad. 3. Dr. Iwan Hastiawan, selaku Kepala Departemen Kimia, FMIPA Unpad. 4. Dr Toto Subroto, selaku kepala Laboratorium Kesehatan dan Pangan Departemen Kimia FMIPA Unpad dan seluruh staf dosen Biokimia atas bantuan dan dorongannya. Semoga Allah memberikan balasan yang berlipat ganda atas segala bantuan dan dorongan selama ini. Penyusun menyadari bahwa dalam penyusunan laporan ini masih terdapat kekurangan. Oleh karena itu, penyusun menerima kritik dan saran yang bersifat membangun dari berbagai pihak sebagai perbaikan supaya penyusunan laporan ini dapat berkembang dan tentunya bermanfaat bagi peneliti pada khususnya dan masyarakat pada umumnya. Akhir kata, semoga penyusunan laporan ini dapat bermanfaat bagi semua pihak dan bisa memberikan ilmu bagi yang membacanya.
Jatinangor, Oktober 2015
Penyusun
vi
DAFTAR ISI
LEMBAR PENGESAHAN ...................................................................................... ii RINGKASAN .......................................................................................................... iii PRAKATA ................................................................................................................ v DAFTAR ISI............................................................................................................ vi BAB I. PENDAHULUAN ........................................................................................ 1 1.1. Latar belakang ............................................................................................... 1 1.2. Rumusan masalah .......................................................................................... 3 BAB II KAJIAN PUSTAKA .................................................................................... 4 2.1. B-type natriuretic peptide ............................................................................... 4 2.2. Single chain variable Fragment (ScvF) ........................................................... 5 2.3. Sistem ekspresi E. coli ................................................................................... 6 2.4. Biosensor elektrokimia .................................................................................. 7 2.5. Immobilisasi komponen biologi ke transduser ................................................ 9 BAB III TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN .............................................11 3.1. Tujuan penelitian ..........................................................................................11 3.2. Manfaat penelitian ........................................................................................11 3.3. Luaran ..........................................................................................................12 3.4. Road Map penelitian .....................................................................................13 BAB IV METODE PENELITIAN ..........................................................................14 4.1. Disain penelitian ...........................................................................................14 4.2. Metoda penelitian tahun I ..............................................................................14 4.2.1. Sintesis fragmen DNA pengode BNP dan subkloning dalam E. coli ...14 4.2.2. Kloning fragmen pengode BNP dengan vektor pET30a dalam E. coli TOP10F’ .................................................................................15 4.2.3. Penentuan urutan nukleotida BNP dalam plasmid pET30a-BNP ..........15 4.2.4. Transformasi inang E. Coli BL21 Arctic express menggunakan pET30a-BNP dan ekspresi BNP oleh E. coli, serta karakterisasi .........14 4.2.5. Docking BNP dengan ScFv rekombinan ..............................................16 4.2.6. Perancangan dan sintesis fragmen DNA pengode anti BNP ScFv ........17
vii
4.2.7. Kloning fragmen anti BNP-ScFv menggunakan vektor pET30a dalam E. coli TOP10F’ .......................................................................17 4.2.8. Penentuan urutan nukleotida ScFv dalam plasmid anti BNP-ScFv....................................................................................18 4.2.9. Transformasi inang E. Coli BL21 Arctic express menggunakan pET30a-anti BNP-ScFv dan ekspresi BNP oleh E. coli, serta karakterisasi ...............................................................................18 4.2.10 Bagan Alur Penelitian Ekspresi BNP dan anti BNP ScFv Rekombinan .......................................................................................19 BAB V HASIL DAN PEMBAHASAN....................................................................20 5.1. Perancangan dan Sintesis fragmen DNA pengode BNP .................................20 5.2. Transformasi E. coli TOP10 menggunakan pET30a-BNP .............................23 5.3. Isolasi plasmid pET30a-BNP ........................................................................24 5.4. Penentuan urutan nukleotida BNP .................................................................25 5.5. Ekspresi BNP dalam inang E. coli Arctic Express dan BL21(DE) .................26 5.6. Docking BNP dengan ScFv dari PDB ...........................................................26 5.7. Perancangan dan sintesis fragmen DNA pengode anti BNP ScFv (4UOU) ....29 5.8. Transformasi E. coli TOP10 menggunakan pET30a-anti BNP ScFv dan isolasi plasmid rekombinan ..........................................................................30 5.9. Penentuan urutan nukleotida anti BNP-ScFv .................................................31 5.10. Ekspresi anti BNP ScFv dalam inang E. coli BL21(DE) Arctic Express ......32 BAB VI. RENCANA TAHAP PENELITIAN SELANJUTNYA ...........................33 BAB VII. KESIMPULAN DAN SARAN................................................................34 7.1. Kesimpulan ...................................................................................................34 7.2. Saran.............................................................................................................34 DAFTAR PUSTAKA ..............................................................................................35 LAMPIRAN 1
Instrumen penelitian ....................................................................38
LAMPIRAN 2
Personalia tenaga peneliti beserta kualifikasinya ..........................39
LAMPIRAN 3
Formulir evaluasi atas capaian luaran kegiatan .............................49
LAMPIRAN 5
LOA Seminar Nasional ................................................................51
BAB I. PENDAHULUAN 1.1 Latar Belakang Penentuan konsentrasi B-type natriuretic peptide (BNP) bermanfaat pada diagnosis gagal jantung (Longenecker et al., 2009; Cardarelli dan Lumicao, 2003). BNP merupakan neuro-hormon yang disekresikan terutama pada bilik jantung untuk merespon peningkatan volume dan tekanan pada jantung. Konsentrasi BNP meningkat pada pasien yang mengalami disfungsi bilik jantung kiri dan berhubungan dengan tingkat keseriusan penyakit jantung (Morrison et al.,.2002; Mueller et al., 2004; Grantham et al., 1997; Tanfous et al., 2006). Oleh karena itu, antibodi terhadap BNP bermanfaat pada uji klinis atau untuk imaging kerusakan jantung. Sudah tersedia beberapa uji immunometri untuk menentukan konsentrasi BNP, seperti Triage
BNP test kit (Biosite; San Diego, CA) menggunakan teknologi
immunofluorescence dengan batas deteksi (20 pg/ml) dan digunakan untuk aplikasi klinis (McDonnell et al., 2009). Teknologi sandwich immune fluorescent BNP assay menggunakan antibodi monoklonal, menunjukkan peningkatan batas deteksi sampai 0,4 pg/mL (Seferian et al., 2007). Grup Niwa melaporkan immunosensor BNP menggunakan peralatan mikrofluida yang dilengkapi dengan spektroskopi surface plasmon resonance (SPR). Metoda sensor optis ini dapat mendeteksi BNP dengan rentang konsentrasi 5 pg/ml sampai 100 ng/ml, sesuai dengan rentang level klinis dan patologis BNP dalam darah (Kurita et al., 2006). Sensor elektrokimia menggunakan antibodi sebagai mulekul pengenal merupakan metoda yang sederhana dan mudah dibuat tanpa memerlukan peralatan yang mahal. Sebuah sensor portable dengan batas deteksi yang luar biasa dapat dengan mudah dibuat secara ekonomis jika sebuah mulekul pengenal seperti scFv digunakan. Suatu immunosensor akan menghasilkan ikatan yang spesifik antara antibodi dengan mulekul tertentu atau antigen. Sifat alami dari interaksi antigenantibodi mirip dengan kunci dan gemboknya, dimana antigen hanya akan berikatan dengan antibodi bila memiliki konformasi yang cocok (Maeng et al., 2012). Adanya teknologi antibodi rekombinan bermanfaat untuk memproduksi antibodi sebagai mulekul yang digunakan untuk diagnosis dan terapi (Hayden et al., 1997). Sejumlah format antibodi rekombinan telah direkayasa untuk digunakan
1
sebagai alat diagnosis. Salah satunya yang paling terkenal adalah single chain variable fragment (scFv) yang mengandung daerah yang bervariasi dari antibodi, dihubungkan oleh asam amino penyambung yang bervariasi (Bach et al., 2001). E. coli sudah digunakan secara ekstensif sebagai inang untuk ekspresi protein rekombinan. Penggunaan E. coli sebagai sistem ekspresi dipilih karena sistem ini mempunyai tingkat ekspresi yang tinggi, media pertumbuhannya murah, serta mudah dilakukan peningkatan skala produksi untuk industri. Namun penggunaan E. coli untuk ekspresi protein eukariot sering menghasilkan protein yang tidak larut (badan inklusi) karena mikroorganisme yang sederhana ini tidak memiliki mesin intraselular untuk melakukan modifikasi pasca-translasi. Sehingga ekspresi protein rekombinan dalam
E. coli sangat tergantung pada struktur primer, sekunder, tersier dan fungsi
karakteristik dari protein tersebut (Daly & Hearn, 2004). Maeng et al. (2011) mengekspresikan anti BNP scFv dalam sistem ekspresi E. coli. Hasilnya, 73,4% dari antibodi rekombinan yang dihasilkan diperoleh dalam bentuk badan inklusi. Untuk meningkatkan solubilitasnya, selanjutnya dilakukan koekspresi mulekul chaperone yang berperan pada pelipatan protein untuk meningkatkan hasil protein yang aktif. Ko-ekspresi chaperone groES/groEL menghasilkan 64,9% dari total scFv dalam bentuk terlarut dan aktif (Maeng et al., 2011). Namun tingkat ekspresi anti BNP yang diperoleh pada sistem ekspresi ini masih terlalu rendah untuk diaplikasikan pada biosensor. Selain itu juga terdapat beberapa kesulitan yang dihadapi untuk memurnikan scFv intraselular karena terdapatnya protein lain yang ukurannya hampir sama dengan scFv. Maeng et al (2012) melaporkan ekspresi anti BNP scFv aktif dalam sistem ekspresi Pichia pastoris dan aplikasinya pada biosensor elektrokimia menggunakan elektroda emas menghasilkan batas deteksi sampai 1 fg/mL. Berdasarkan latar belakang tersebut, penelitian ini bermaksud untuk memproduksi BNP dan anti BNP scFv rekombinan dalam sistem ekspresi E. coli. Vektor ekspresi yang dipilih adalah pET30a untuk E. coli. Menggunakan vektor ekspresi ini, BNP dan anti BNP scFv akan diekspresikan dalam bentuk fusi dengan 6x residu Histidin, dan selanjutnya dapat dimurnikan menggunakan kolom nikel. Inang yang akan digunakan adalah E. coli arctic express competent cell yang memiliki chaperonin Cpn10 dan Cpn60, yang memiliki aktivitas refolding yang tinggi pada
2
suhu 4-12
C, sehingga menjamin dihasilkannya protein yang terlarut (Agilent
Technologies). Pengujian afinitas anti BNP scFv rekombinan untuk mendeteksi BNP akan di uji menggunakan biosensor elektrokimia dengan elektroda grafit/emas.
1.2. Rumusan masalah Berdasarkan latar belakang yang telah diungkapkan, maka rumusan masalah yang akan dikaji dalam penelitian ini adalah: 1. Apakah polipeptida BNP dan anti BNP scFv rekombinan dapat diproduksi dalam sistem ekspresi menggunakan inang E. coli yang memiliki faktor pelipatan protein sehingga dihasilkan polipeptida dalam bentuk terlarut. 2. Apakah biosensor elektrokimia dengan elektroda grafit pensil/emas dapat digunakan untuk mendeteksi afinitas pengikatan BNP-anti BNP scFv. 3. Bagaimana afinitas pendeteksian BNP oleh anti BNP scFv rekombinan menggunakan biosensor elektrokimia.
3
BAB II. KAJIAN PUSTAKA
2.1. B-type Natriuretic Peptide Basic natriuretic peptide (BNP), dikenal juga dengan B-type natriuretic peptide (juga BNP) atau GC-B, merupakan polipeptida yang terdiri dari 32 asam amino (Gambar 2.1) yang disekresikan oleh bilik jantung untuk merespon tekanan yang berlebihan terhadap sel otot jantung (Grantham et al., 1997; Seferian et al., 2007). Pengeluaran BNP dimodulasi oleh ion kalsium (Ziskoven et al., 1989). Pertama kali BNP diidentifikasi pada ekstrak otak babi, pada manusia neuro hormon ini terutama diproduksi di bilik jantung. BNP disekresikan bersama dengan 76 asam amino NT-proBNP (N-terminal prohormon BNP) yang tidak aktif. Jumlah BNP dan NT-proBNP dalam darah biasa digunakan untuk mendeteksi gagal jantung. BNP berikatan dengan reseptor faktor natriuretic NPRA dan NPRB, dengan cara yang sama dengan ANP (atrial natriuretic peptide) namun dengan afinitas yang 10x lebih rendah. Waktu hidup BNP 2x lebih lama dibanding ANP dan NT-proBNP, sehingga BNP merupakan peptida target diagnosis darah yang lebih baik dibanding ANP dan NT-proBNP (Atisha et al., 2004). Mekanisme aksi BNP sama dengan ANP, dimana terjadi resistensi vascular sistemik dan tekanan vena pusat sehingga meningkatkan atriuresis. Pengaruh dari BNP dan ANP secara keseluruhan adalah menurunkan volume darah sehingga menurunkan tekanan darah sistemik.
Gambar 2.1. Struktur sekunder BNP yang terdiri dari 32 asam amino.
4
2.2. Single Chain variable Fragment (scFv) ScFv merupakan gabungan polipeptida antara daerah yang bervariasi pada rantai heavy (VH) dan rantai light (VL) dari immunoglobulin dan dihubungkan oleh peptida pendek (10-25 asam amino) untuk menstabilkan mulekul. ScFv mewakili bagian fungsional terkecil dari domain VH-VL antibodi yang diperlukan untuk berikatan dengan antigen. Peptida penyambung biasanya mengandung banyak asam amino glisin, serin atau treonin (Shen et al., 2005). Protein ini memiliki spesifisitas seperti immunoglobulin asalnya, hanya terjadi penghilangan daerah yang konstan dan penambahan linker. Karena ukurannya yang kecil dan kehomogenannya, maka scFv lebih disukai dibanding antibodi monoklonal atau poliklonal untuk deteksi antigen. Antibodi poliklonal bersifat lebih heterogen, sehingga karakteristik pengikatannya terhadap antigen berbeda-beda, sedang antibodi monoklonal
menghasilkan
karakteristik
pengikatan
yang
homogen,
namun
mulekulnya sangat besar, sehingga kemungkinan untuk terjadinya pengikatan non spesifik dan kontaminan yang terperangkap lebih besar (Peterson et al., 2006). Sebaliknya, scFv hanya memiliki berat mulekul
27.000 Da, merupakan mulekul
yang sangat kecil, sehingga dapat berikatan dengan sangat spesifik, dengan densitas yang tinggi pada permukaan, untuk mengurangi terperangkapnya kontaminan (Shen et al., 2005)
1. A.
2 B.
Gambar 2.2. A. Struktur scFv. B. Dua kemungkinan orientasi scFv, (1) V H-linker-VL; (2) VL-linker-VH. (Paterson et al., 2006) Mulekul ini dibuat untuk memfasilitasi teknologi phage display. ScFv juga bisa dibuat dengan melalui subkloning rantai heavy dan light yang diperoleh dari
5
hibridoma. ScFv memiliki banyak kegunaan, diantaranya untuk analisis dengan flow cytometry, immunohistochemistry dan sebagai domain pengikatan antigen pada reseptor sel T tiruan. Tidak seperti antibodi monoklonal yang biasanya diproduksi menggunakan kultur sel mamalia, scFv biasanya diproduksi menggunakan kultur sel bakteri, seperti E. coli (Paterson et al., 2006). 2.3. Sistem ekspresi Escherichia coli Escherichia coli telah digunakan secara ekstensif sebagai inang untuk ekspresi protein rekombinan. Penggunaan E. coli sebagai sistem ekspresi dipilih karena sistem ini mempunyai tingkat ekspresi yang tinggi, media pertumbuhannya murah, serta mudah dilakukan peningkatan skala produksi untuk industri. Bagaimanapun, penggunaan sistem ini untuk produksi protein yang berasal dari genom eukariot yang membutuhkan
modifikasi
pasca-translasi
menimbulkan
masalah
karena
mikroorganisme yang sederhana ini tidak memiliki mesin intraselular untuk melakukan modifikasi pasca-translasi. Sehingga ekspresi protein rekombinan dalam E. coli sangat tergantung pada struktur primer, sekunder, tersier dan fungsi karakteristik dari protein tersebut (Daly & Hearn, 2004). E. coli merupakan prokariot yang tidak memiliki kemampuan untuk melakukan pelipatan protein asing dan modifikasi pasca-translasi lain, sehingga tipe protein yang dapat diekspresikan E. coli juga terbatas. Ketidakmampuan prokariot untuk memproduksi versi autentik dari protein eukariot, pada umumnya disebabkan oleh pelipatan protein (folding) yang tidak tepat dan tidak adanya mekanisme modifikasi pasca-translasi. Protein yang diekspresikan E. coli pada umumnya diperoleh sebagai protein intraselular yang sering menghasilkan badan inklusi yang tidak larut (dalam kasus ekspresi tinggi) dan tidak mengalami pelipatan dengan benar, sehingga harus dilarutkan dan dilakukan pelipatan ulang (Makrides, 1996). Pelipatan yang tidak tepat mungkin disebabkan oleh tidak cukupnya konsentrasi chaperone intraselular atau kurangnya lingkungan tereduksi dalam sitoplasma (Bardwell, 1994; White et al., 1994). Sehingga E. coli tidak cocok digunakan untuk mengekspresikan protein yang mengandung banyak ikatan disulfida atau protein yang membutuhkan modifikasi pasca-translasi lain, seperti glikosilasi, isomerisasi cis/trans
6
prolin, isomerisasi disulfida, lipidasi, sulfasi atau fosforilasi (Lueking, et al., 2000). Selanjutnya protein yang diekspresikan E. coli juga cenderung mempertahankan residu metionin pada sisi N-terminal protein yang diekspresikan. Ekstra metionin ini dilaporkan mempengaruhi kestabilan konformasi protein, dan menyebabkan immunogenisitas (Chaudlhuri et al., 1999; Takano et al., 1999).
Gambar 2.3. Peta vektor pET30a
2.4. Biosensor elektrokimia Sensor kimia adalah suatu piranti yang dapat mentransformasi informasi kimia menjadi suatu sinyal analitik yang dapat diukur. Sensor kimia terdiri dari dua komponen yang dihubungkan secara berurutan: suatu system pengenal kimia dan transducer fisika. Biosensor adalah sensor kimia dimana sistem pengenalannya memanfaatkan mekanisme reaksi biokimia. Biosensor
elektrokimia
merupakan
peralatan analisis yang mengubah respon biologi menjadi sinyal listrik. Teknologi
7
biosensor elektrokimia sekarang ini
berkembang dengan pesat. Keunggulan dari
biosensor tersebut adalah aplikatif, selektif, praktis, cepat dan akurat. Metode untuk analisis, biosensor elektrokimia banyak dipakai terutama dalam bidang kesehatan, obat-obatan dan lingkungan. Sebagai contoh adalah biosensor untuk penentuan kadar gula dalam darah (Arun et al., 2012).. Antibodi merupakan mulekul biologi yang paling serbaguna. Antibodi (Ab) terhadap suatu substansi tertentu (Antigen/Ag) merupakan mulekul yang sangat selektif. Organisme menghasilkan antibodi yang merupakan protein yang dapat berikatan dengan antigen
penginfeksi,
sehingga
dapat
membuangnya
dan
menghindarkan dari kerusakan sel, dengan cara seperti persamaan berikut: Ab + Ag = Ab-Ag. Konstanta afinitas, K = [Ag-Ab]/[Ag][Ab], biasanya sekitar 106, sehingga pada konsentrasi antibodi tertentu, rasio antigen bebas dan terikat, [Ag]/[Ag-Ab], pada kesetimbangan secara kuantitatif akan berhubungan dengan jumlah ligan total, [Ag] + [Ag-Ab]. Jika antigen terdapat pada larutan uji, konsentrasi Ag awal akan dapat diketahui. Hampir semua transducer dapat digunakan untuk antibodi. Kelebihan dari biosensor antibodi adalah: sangat selektif, ultra sensitif dan terikat sangat kuat. Kelemahannya adalah antibodi tidak memiliki efek katalitik. Antibodi telah lama digunakan dalam immunoassay, pengikatan antibodi-antigen kadang lebih kuat dan selektif dibanding pengikatan enzim-substrat (Egins, 2002). Immunoassay dengan deteksi elektrokimia sangat luas aplikasinya dibanding metoda spektrofotometri, karena batas deteksinya rendah dan waktu pengerjaannya cepat. Antibodi anti BNP yang dilabel dengan alkalin fosfatase (AP) pada immunosensor akan mengkatalisis oksidasi 4-APP menghasilkan 4-AP, yang dideteksi dengan mengukur arus yang dihasilkan dari oksidasi pada potensial 0,2 V dengan menggunakan elektroda referensi Ag/AgCl (Wang et al. 2003). Maeng et al (2012) melaporkan penggunaan elektorda emas untuk mendeteksi sinyal anti BNP scFv-BNP. Anti BNP scFv diorientasikan pada permukaan elektorda emas (Gambar 2.4).
8
Gambar 2.4. Skema protokol penentuan BNP dengan immunoassay dengan elektroda emas (Maeng et al., 2012)
2.5. Immobilisasi Komponen Biologi ke Transducer Untuk menghasilkan biosensor, komponen biologi harus diikatkan ke transducer. Proses ini yang disebut immobilisasi, Terdapat lima metoda untuk immobilisasi komponen biologi ke transducer: 1. Adsorpsi. Merupakan metoda yang paling sederhana, persiapannya mudah. Namun pengikatannya lemah dan metoda ini hanya cocok untuk penelitian yang memerlukan waktu yang pendek. 2. Mikroencapsulasi. Metoda ini telah lama digunakan pada biosensor. Biomaterial diikatkan dibelakang membrane, sehingga dapat mengadakan kontak dengan transducer. Metoda ini dapat dimodifikasi, tidak dipengaruhi oleh realibilitas enzim, dan tidak mudah terkontaminasi dan degradasi. Metoda ini juga stabil terhadap perubahan temperatur, pH, kekuatan ion dan komposisi kimia. Namun system ini permeable terhadap beberapa material, seperti mulekul kecil termasuk gas dan elektron. 3. Penjebakan. Pada metoda ini biomaterial dicampur dengan larutan monomer yang kemudian mengalami polimerisasi membentuk gel, sehingga biomaterial terperangkap. Namun cara ini dapat menghalangi difusi substrat sehingga memperlambat reaksi. Cara ini juga dapat menghilangkan aktivitas biologi.
9
Gel yang paling sering digunakan adalah poliakrilamid, pati, nilon dan gel silastic. 4. Ikatan silang. Pada metoda ini biomaterial terikat secara kimia dengan material padat, atau gel. Reagen bifungsi seperti glutaraldehid dapat digunakan pada teknik ini, namun metoda ini dapat menghambat difusi dan dapat merusak biomaterial. 5. Ikatan kovalen. Pendekatan ini melibatkan disain pembentukan ikatan antara gugus fungsi pada biomaterial dan matriks pendukung. Gugus nukleofilik asam amino yang tidak berperan pada katalitik cocok untuk metoda ini (Egins, 2002).
10
BAB III. TUJUAN DAN MANFAAT PENELITIAN
3.1. Tujuan Penelitian Tujuan dari penelitian ini adalah mendapatkan polipeptida BNP dan anti BNP scFv
rekombinan
melalui
produksi
dalam
sistem
ekspresi
E.
coli
dan
mengaplikasikannya pada pengujian biosensor elektrokimia menggunakan elektroda grafit/emas. Penelitian ini bermanfaat untuk pengembangan metoda produksi antibodi rekombinan menggunakan sistem ekspresi E. coli. Antibodi rekombinan memiliki aplikasi yang luas untuk deteksi penyakit dengan berbasis immunometri, salah satunya adalah biosensor elektrokimia. Manfaat lain dari penelitian ini adalah pengembangan metoda biosensor elektrokimia untuk deteksi penyakit gagal jantung. 3.2. Manfaat Penelitian Penelitian ini merupakan rangkaian penelitian yang dikembangkan oleh kelompok biosensor elektrokimia dan kelompok ekspresi protein rekombinan, jurusan Kimia Unpad. Dalam rangka pengembangan biosensor elektrokimia untuk uji-uji berbasis interaksi antigen antibodi maka dibutuhkan domain variabel dari antibodi yang berikatan dengan antigen. Biosensor untuk mendeteksi antigen membutuhkan sejumlah konsentrasi antibodi yang akan diikatkan ke elektroda. Oleh karena itu unrgensi penelitian ini adalah untuk memproduksi antibodi rekombinan yaitu anti BNP scFv yang dapat diaplikasikan untuk pengembangan metoda biosensor elektrokimia dengan menggunakan elektroda grafit/emas, untuk deteksi penyakit gagal jantung. Deteksi dini penyakit gagal jantung sangat krusial untuk penanganan pasien. Untuk deteksi ini diperlukan suatu metoda yang sensitif dan akurat. Pengembangan metoda biosensor berbasis interaksi antigen-antibodi meliputi pemilihan elektroda yang cocok, pemilihan metoda untuk immobilisasi antibodi ke elektroda dan metoda pendeteksiannya. Metoda-metoda ini perlu di kaji dan di uji supaya bisa diaplikasikan ke sampel nyata. Hasil penelitian ini akan dipublikasikan pada jurnal internasional/nasional terakreditasi. Penelitian ini sesuai dengan Rencana Induk Penelitian Unpad (2012-2016), bidang kesehatan dengan topik: upaya pencegahan, diagnosis dan pengelolaan
11
penyakit yang komprehensif. Sesuai dengan topik riset yang diperlukan, yaitu: efektifitas dan manfaat deteksi dini serta pengelolaan penyakit yang terintegrasi (cohort of patients).
Gambar 3.1: Fishbone diagram penelitian unggulan kesehatan RIP Unpad.
3.3. Luaran Penelitian Luaran yang akan diperoleh dari penelitian ini setiap tahunnya adalah: 1. Pada tahun pertama akan diperoleh BNP dan anti BNP scFv rekombinan yang diekspresikan oleh E. coli rekombinan. Akan diperoleh juga metoda pemurniaan BNP dan anti BNP scFv rekombinan. 2. Pada tahun kedua akan diperoleh metoda uji afinitas pengenalan BNP oleh anti BNP scFv menggunakan metoda biosensor elektrokimia dengan elektroda grafit pensil atau emas. Gambaran produk yang akan dihasilkan dari penelitian ini adalah BNP dan anti BNP scFv rekombinan dan metoda uji deteksi BNP secara biosensor elektrokimia. Metoda ini dapat diaplikasikan untuk deteksi BNP pada serum darah pasien gagal jantung. 12
3.4. Roadmap penelitian. Fragmen urutan nukleotida pengode BNP dan anti BNP scFv sintetik
TAHUN 1
TAHUN 2
•Konstruksi vektor ekspresi yang mengandung pengode BNP dan anti BNP scFv •Kloning dalam E. coli, karakterisasi •Ekspresi BNP dan anti BNP scFv rekombinan •Purifikasi dan karakterisasi BNP dan anti BNP scFv rekombinan
•Uji afinitas pengikatan dengan ELISA •Pretreatment elektroda •Immobilisasi anti BNP scFv ke elektroda •Pengujian sinyal deteksi BNP-anti BNP scFv •Penentuan batas deteksi •Pengujian menggunakan sampel serum darah
Immunosensor untuk deteksi penyakit gagal jantung
13
BAB IV. METODE PENELITIAN
4.1 Desain Penelitian Penelitian yang akan dilakukan merupakan ekspreimen laboratorium secara kuantitatif selama dua tahun efektif, dengan rincian sebagai berikut: Tahun I: 1. Sintesis fragmen DNA pengode BNP dan anti BNP scFv dan subkloning dalam E. coli 2. Ligasi fragmen BNP dan anti BNP scFv ke vektor ekspresi dan kloning dalam E. coli arctic express. 3. Penentuan urutan nukleotida pengode BNP dan anti BNP scFv 4. Ekspresi BNP dan anti BNP scFv oleh E. coli, pemurnian dan karakterisasi Tahun II: 1. Pengujian afinitas pengikatan BNP- anti BNP scFv dengan ELISA 2. Pre treatment elektroda grafit pensil 3. Pengukuran afinitas pendeteksian sensor grafit-anti BNP scFv menggunakan berbagai macam antigen, yaitu BNP, ANP dan HSA dan penentuan batas deteksi
4.2. Metodologi Penelitian Tahun I
4.2.1. Sintesis fragmen DNA pengode BNP dan subkloning dalam E. coli Fragmen DNA pengode BNP dirancang dengan menyesuaikan dengan kodon preferensi E. coli, dengan penambahan sisi restriksi untuk ligasi ke vector ekspresi. Fragmen DNA hasil rancangan disintesis oleh Genscript (Hongkong), dan dipesan sudah berada dalam plasmid kloning. Fragmen DNA ini selanjutnya akan di subkloning dalam E. coli Top10F’. Transformansi E. coli dilakukan dengan metoda elektroporasi. Transforman E.coli TOP 10F’ yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media LB cair untuk selanjutnya digunakan untuk isolasi plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan hasil isolasi selanjutnya di potong dengan enzim restriksi yang sudah
14
ditentukan, untuk menghasilkan fragmen DNA yang mengandung sisi restriksi yang sudah ditentukan.
4.2.2. Kloning fragmen BNP menggunakan vektor pET30a dalam E. coli TOP10F’. a. Ligasi Reaksi ligasi dilakukan dengan perbandingan molar antara vektor pET30a dan fragmen BNP 1:5. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 2 μL buffer 10x reaksi; purified BNP; 1 μL vektor pPET30a; air bebas nuklease; dan 1 μL T4 DNA ligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL. Campuran kemudian divortex dan disentrifugasi selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi pada suhu 22 C selama 1 jam. b. Transformasi E. coli Menggunakan Plasmid pET30a-BNP. Proses transformasi dimulai dengan pembuatan sel kompeten metoda elektroporasi (Sambrook et al., 1986). Sejumlah 5 μL DNA hasil ligasi digunakan untuk mentransformasi E. coli TOP10F’ dengan metoda elektroporasi. Transforman E. coli ditumbuhkan pada media LB padat yang telah mengandung Tetrasiklin 15 μg/mL dan Kanamycin 100 μg/mL, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 16-18 jam. c. Analisis Restriksi Plasmid rekombinan Plasmid rekombinan diisolasi dari transforman E. coli. Sebanyak 10 uL plasmid rekombinan hasil isolasi dianalisis dengan enzim restriksi . Ke dalam larutan plasmid rekombinan ditambahkan 2 uL buffer restriksi 10x, 2 uL masing-masing enzim Nde1 dan Xho1 (10 U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume total reaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 jam. Setelah itu dikarakterisasi dengan elektroforesis gel. 4.2.3. Penentuan Urutan Nukleotida BNP dalam plasmid pET30a-BNP Urutan nukleotida BNP hasil kloning dalam E. coli ditentukan dengan metode dideoksi Sanger (Dye Terminator) dengan menggunakan primer universal T7. Penentuan urutan nukleotida fragmen DNA hasil kloning harus dilakukan untuk memastikan tidak ada urutan nukleotida yang berubah, sebelum dilakukan ekspresi protein rekombinan
15
4.2.4. Transformasi ke inang ekspresi dan ekspresi BNP oleh E. coli, serta karakterisasi Transformasi
inang
ekspresi
oleh
plasmid
pET30a-BNP
dilakukan
menggunakan metoda elektroporasi seperti di atas. Inang ekspresi yang digunakan adalah E. coli Arctic express dan E. coli BL21. Transforman E. coli yang diperoleh digunakan untuk menguji ekspresi BNP rekombinan. GalurE. coli yang digunakan untuk ekspresi adalah BL21(DE3) Arctic express dan, BL21(DE3). Transforman E. coli ditumbuhkan dalam 5 mL media LB cair yang mengandung antibiotik gentamicin (100 µg/mL), tetraciklin (100 µg/mL), kanamycin (100 µg/mL), diinkubasi pada suhu 37°C selama 16-18
jam, dan kecepatan
pengocokan 150 rpm. Kultur diambil sebanyak 0,5% dari volume media ekspresi yang telah disiapkan mengandung antibiotik. Inkubasi sampai OD 0,4-0,8 pada suhu 37°C selama 16-18 jam, dan kecepatan pengocokan 150 rpm. Kultur diangkat dan sampel diambil sebanyak 1 mL ( sampel to), sisa kultur didiamkan pada suhu 12º C selama 15 menit, kemudian ditambahakan IPTG (0,1 mM) diinkubasi selama 16 jam pada suhu 12 ºC dengan pengocokan 150 rpm. Sampel diambil sebanyak 1 mL (sampel t1). Sisa kultur disentrifugasi pada 10000 g selama 10 menit untuk memisahkan pellet. Ke dalam pellet ditambahkan 500 µL baffer lisis (Tris Cl 10 mM, NaCl 500 mM, EDTA 1 mM, pH 8,5), dihomogenkan, kemudian dilakukan sonikasi dengan siklus 2 detik on dan 2 detik off selama 10 menit selama 3x ulangan. Sentrifugasi pada kecepatan 10000 g selama 30 menit. Supernatan dipisahkan (sampel S), pellet ditambahkan urea 8M sebayak 70 µL. Panaskan selama 15 menit dalam air mendidih. Sentrifugasi 10 menit pada 10000 g, supernatan diambil (sampel IF).
sampel S dan IF diambil
sebanyak 40 µL kemudian ditambahkan 7 µL 5x SDS sampel buffer. Sampel to dan t1 ditambahkan 50 μL buffer glisin 20 mM pH 8,6, kemudian ditambahkan 7 µL 5x SDS sampel buffer. Semua sampel dididihkan selama 15 menit. Sebanyak 10 µL sampel dimasukkan ke sumur gel SDS-PAGE.
4.2.5. Docking BNP dengan ScFv dari PDB Berdasarkan studi literatur, belum tersedia urutan antiBNP-ScFv di database GenBank, sehingga pada penelitian ini dilakukan pencarian struktur 3D ScFv yang berikatan dengan ligan lain di Protein Data Bank, selanjutnya dilakukan docking BNP 16
terhadap sejumlah ScFv yang diambil dari PDB untuk menetukan urutan ScFv yang akan disintesis. Struktur BNP dibuat dengan software Marvin Sketch dan disimpan dalam format pdb. Struktur ScFv diambil dari Protein Data Bank kemudian diedit menggunakan Autodock Tools. Docking dilakukan dengan menggunakan Autodock 4.2.3. Visualisasi dilakukan dengan menggunakan program Molegro Virtual Viewer.
4.2.6. Perancangan dan sintesis fragmen DNA pengode anti BNP ScFv Fragmen DNA pengode anti BNP-ScFv yang terpilih dirancang dengan menyesuaikan dengan kodon preferensi E. coli, dengan penambahan sisi restriksi untuk ligasi ke vektor ekspresi. Fragmen DNA hasil rancangan disintesis oleh Genscript (Hongkong), dan dipesan sudah berada dalam plasmid kloning. Fragmen DNA ini selanjutnya akan di subkloning dalam E. coli Top10F’. Transformansi E. coli dilakukan dengan metoda elektroporasi. Transforman E.coli TOP 10F’ yang mengandung plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam media LB cair untuk selanjutnya digunakan untuk isolasi plasmid rekombinan. Plasmid rekombinan hasil isolasi selanjutnya di potong dengan enzim restriksi yang sudah ditentukan, untuk menghasilkan fragmen DNA yang mengandung sisi restriksi yang sudah ditentukan.
4.2.7. Kloning fragmen anti BNP-ScFv menggunakan vektor pET30a dalam E. coli TOP10F’. a. Ligasi Reaksi ligasi dilakukan dengan perbandingan molar antara vektor pET30a dan fragmen anti BNP-ScFv 1:5. Campuran reaksi ligasi terdiri dari 2 μL buffer 10x reaksi; purified anti BNP-ScFv; 1 μL vektor pPET30a; air bebas nuklease; dan 1 μL T4 DNA ligase. Volume total reaksi ligasi adalah 20 μL. Campuran kemudian divortex dan disentrifugasi selama 3-5 detik. Campuran diinkubasi pada suhu 22 C selama 1 jam.
17
b. Transformasi E. coli Menggunakan Plasmid pET30a-anti BNP-ScFv. Proses transformasi dimulai dengan pembuatan sel kompeten metoda elektroporasi (Sambrook et al., 1986). Sejumlah 5 μL DNA hasil ligasi digunakan untuk mentransformasi E. coli TOP10F’ dengan metoda elektroporasi. Transforman E. coli ditumbuhkan pada media LB padat yang telah mengandung Tetrasiklin 15 μg/mL dan Kanamycin 100 μg/mL, kemudian diinkubasi pada suhu 37 C selama 16-18 jam. c. Analisis Restriksi Plasmid rekombinan Plasmid rekombinan diisolasi dari transforman E. coli. Sebanyak 10 uL plasmid rekombinan hasil isolasi dianalisis dengan enzim restriksi. Ke dalam larutan plasmid rekombinan ditambahkan 2 uL buffer restriksi 10x, 2 uL masing-masing enzim Nde1 dan Xho1 (10 U/mL), dan air bebas nuklease hingga volume total reaksi 20 uL. Kemudian diinkubasi pada suhu 37 oC selama 2 jam. Setelah itu dikarakterisasi dengan elektroforesis gel.
4.2.8. Penentuan Urutan Nukleotida ScFv dalam plasmid pET30a-anti BNP-ScFv Urutan nukleotida anti BNP-ScFv hasil kloning dalam E. coli ditentukan dengan metode dideoksi Sanger (Dye Terminator) dengan menggunakan primer universal T7. Penentuan urutan nukleotida fragmen DNA hasil kloning harus dilakukan untuk memastikan tidak ada urutan nukleotida yang berubah, sebelum dilakukan ekspresi protein rekombinan
4.2.9. Transformasi ke inang ekspresi dan ekspresi anti BNP-ScFv oleh E. coli, serta karakterisasi Transformasi inang ekspresi oleh plasmid pET30a-anti BNP-ScFv dilakukan menggunakan metoda elektroporasi seperti di atas. Inang ekspresi yang digunakan adalah E. coli Arctic express dan E. coli BL21. Transforman E. coli yang diperoleh digunakan untuk menguji ekspresi anti BNP-ScFv rekombinan. Ekspresi anti BNP-ScFv oleh E coli dilakukan dengan cara menumbuhkan E. coli dalam media LB, ekspresi protein rekombinan diinduksi menggunakan IPTG. Sel dilisis dengan sonikasi dalam es. Hasil ekspresi di analisis dengan SDS-PAGE.
18
4.2.10. Bagan Alur Penelitian Ekspresi BNP dan anti BNP ScFv Rekombinan Fragmen pengode sintetik (dalam kloning)
BNP vektor
Transformasi E. coli TOP10 Isolasi plasmid rekombinan dan potong dengan enzim restriksi untuk mengeluarkan BNP Ligasi BNP ke vektor pET30a, membentuk plasmid pET30a-BNP Transformasi E. coli TOP10 Seleksi transforman E. coli Isolasi plasmid rekombinan, analisis restriksi, penentuan urutan nukleotida Transformasi E. coli arctic competent cell Ekspresi BNP dan anti BNP-ScFv Karakterisasi dengan SDS PAGE Penentuan Kadar protein BNP rekombinan
Struktur ScFv di Protein Data Bank Docking dengan BNP Perancangan urutan nukleotida Transformasi E. coli TOP10 Isolasi plasmid rekombinan dan potong dengan enzim restriksi untuk mengeluarkan BNP Ligasi BNP ke vektor pET30a, membentuk plasmid pET30a-BNP Transformasi E. coli TOP10 Seleksi transforman E. coli Isolasi plasmid rekombinan, analisis restriksi, penentuan urutan nukleotida Transformasi E. coli arctic competent cell Ekspresi BNP dan anti BNP-ScFv Karakterisasi dengan SDS PAGE Penentuan Kadar protein
BNP rekombinan
19
BAB V. HASIL DAN PEMBAHASAN
5.1. Perancangan dan Sintesis fragmen DNA pengode BNP. Urutan BNP diperoleh dari Homo sapiens natriuretic peptide B (NPPB), mRNA, NCBI Reference Sequence: NM_002521.2 dengan urutan asam amino seperti pada gambar 5.1.
Urutan asam amino BNP (dari ujung N ke C) 1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
ser
pro
lys
met
val
gln
gly
ser
gly
cys
phe
gly
Arg
lys
met
asp
S
P
K
M
V
Q
G
S
G
C
F
G
R
K
M
D
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
32
arg
ile
ser
ser
ser
ser
gly
leu
gly
cys
lys
val
Leu
arg
arg
his
R
I
S
S
S
S
G
L
G
C
K
V
L
R
R
H
Gambar 5.1. Urutan asam amino BNP.
Urutan asam amino ini kemudian ditranslasi balik (reverse translate) menjadi urutan nukleotida dengan menggunakan kodon preferensi E. coli K12 menggunakan program www.gcua.org. Pemilihan kodon ini perlu dilakukan untuk mengoptimalkan ekspresi BNP dalam E. coli.
Perbandingan penggunaan kodon pada E. coli dan
manusia, menunjukkan beberapa kodon yang berbeda persentasi penggunaannya, sehingga perlu dilakukan optimasi penggunaan kodon (Gambar 5.2).
20
Gambar 5.2. Diagram kodon preferensi E. coli dan manusia Berdasarkan diagram diatas, maka urutan BNP di translasi balik menggunakan kodon preferensi E. coli, sehingga diperoleh urutan BNP hasil optimasi adalah seperti gambar 5.3.
Gambar 5.3. Kodon BNP hasil optimasi 21
Gambar 5.4. Urutan nukleotida BNP ditambah stop kodon
Urutan nukleotida BNP hasil optimasi di analisis dengan program Lasergene untuk menentukan sisi enzim restriksi yang memotong BNP dan memilih sisi enzim restriksi yang akan ditambahkan (Gambar 5.5).
Gambar 5.5. Enzim-enzim restriksi yang memotong BNP
Setelah dilakukan analisis diperoleh sisi enzim restriksi Nde1 dan Xho1 pada vektor ekspresi pET30a. Vektor ekspresi pET30a dipilih karena sisi restriksi yang tersedia pada Multi cloning site cocok dengan BNP. Selain itu dengan ekpresi menggunakan vector pET30a, maka BNP akan dihasilkan dalam bentuk fusi dengan 6x residu Histidin, yang bermanfaat untuk pemurnian menggunakan kolom nikel. Penambahan 6x His ini diperkirakan tidak akan mempengaruhi fungsi dan pengikatan BNP dengan anti BNP ScFv karena berada pada ujung C terminal. Berikut adalah MCS vektor pET30a yang digunakan (Gambar 5.6).
22
Gambar 5.6. Multi cloning site vector pET30a
Berikut urutan nukleotida BNP ditambah dengan sisi restriksi:
Gambar 5.7. Urutan nukleotida BNP ditambah sisi restriksi
Urutan nukelotida pengode BNP ini disintesis oleh GenScript dan diperoleh dalam bentuk plasmid rekombinan.
5.2. Transformasi E. coli TOP10 menggunakan pET30a-BNP. Sebanyak 1 ng dari plasmid pET30a-BNP digunakan untuk mentransformasi E. coli TOP10F’ dengan metoda elektroporasi. Transforman diinkubasi semalam pada suhu 37 ºC. Foto transforman E. coli diperlihatkan pada gambar 5.8.
23
Gambar 5.8. Transforman E. coli TOP10[pET30a-BNP]
5.3. Isolasi plasmid pET30a-BNP Plasmid diisolasi dari E. coli menggunakan kit Tiangen mengikuti prosedur. Hasil isolasi plasmid dipotong dengan enzim restriksi Nde1 dan Xho1 dan kemudian dikarakterisasi dengan elektroforesis gel agarose 1%. Elektroforegram diperlihatkan pada gambar 5.9.
Gambar 5.9. Elektroforesis hasil isolasi plasmid dan analisis restriksi.
24
5.4. Penentuan urutan nukleotida BNP Urutan nukleotida BNP dalam plasmid pET30a-BNP dilakukan dengan metoda dideoksi Sanger. Urutan BNP hasil kloning dihomologikan dengan urutan BNP hasil sintesis, dan memperlihatkan 100% homologi, seperti diperlihatkan pada gambar 5.10.
Peta plasmid pET30a-BNP
Gambar 5.10. Hasil penentuan urutan nukleotida BNP
Berdasarkan hasil analisis diatas, menunjukkan bahwa BNP telah berhasil di kloning menggunakan vektor pET30a. Peta plasmid pET30a-BNP diperlihatkan pada gambar 5.11.
Gambar 5.11. Peta plasmid pET30a-BNP
25
5.5 Ekspresi BNP dalam inang E. coli Arctic Express dan BL21(DE) Hasil ekspresi BNP dalam inang E. coli Arctic express menunjukkan bahwa BNP belum berhasil diekspresikan (Gambar 5.12), tidak terdapat pita dengan ukuran sekitar 4 kDa. Diperkirakan proses lisis belum sempurna, sehingga semua protein belum terbebas sari sel. Kondisi ekspresi BNP dalam E. coli perlu dioptimasi.
Gambar 5.12 Hasil SDS-PAGE ekspresi BNP dalam inang E. coli Arctic ekspress.
5.6. Docking BNP dengan ScFv dari PDB Struktur 3 Dimensi scFv dan BNP. Struktur 3 dimensi scFv dapat diperoleh dari PDB melalui alamat situs http://www.rscb.org/pdb/. Struktur kristal scFv yang diambil dari PDB berjumlah empat puluh. Keempat puluh struktur kristal tersebut merupakan hasil penelitian dengan menggunakan X-ray crystallography. Struktur PDB dari scFv yang diambil dari PDB memiliki kode 4OUO, 1NMC, 1MOE, 1MVU, 3NN8, 1NAM, 2UUD, 1A14, 1X9X, 4NKM, 1KTR, 4NKD, 2ZNX, 4NKO, 4P48, 4BUH, 104B, 3JUY, 1DZB, 3UMT, 3H3B, 2A9N, 3U6R, 2GJJ, 1XIW, 2OTU, 2YCI, 2YBR, 1P41, 4HOI, 4HOH, 4HOG, 4LAR, 4UT7, 4KV5, 4LAS, 4NIK, 3ABO, 4P49, 2A9M. Ketika proses docking keempat puluh struktur scFv dari PDB ini akan berperan sebagai makromolekul sedangkan BNP berperan sebagai ligan.
26
Struktur BNP untuk penelitian ini dibuat dengan menggunakan program Marvin sketch karena struktur BNP tidak tersedia di PDB, dan disimpan dengan format.pdb. Tabel 5.1 menunjukkan besaran binding energy dan Ki hasil docking.
Tabel 5.1. Nilai binding energy dan Ki hasil docking ScFv dan BNP.
Nilai Ki dari hasil docking memiliki perbedaan yang tidak terlalu jauh. Hal ini disebabkan karena struktur ScFv yang diperoleh dari PDB memiliki homologi yang tidak terlalu jauh berbeda, dibuktikan dengan data alignment antara urutan asam amino
ScFv
menggunakan
program
T-coffee
(http://tcoffee.crg.cat/apps
/tcoffee/do:expresso/) (data tidak diperlihatkan). Berdasarkan hasil docking diperoleh ScFv 4OUO merupakan ScFv yang memiliki binding energy paling rendah terhadap BNP. Model ikatan hidrogen antara BNP dengan 4OUO dapat dilihat pada gambar 5.12.
27
A
B
C Gambar 5.12. (A) Ikatan hidrogen antara 4OUO- BNP, (B) Interaksi elektrostatik antara 4OUO-BNP, (C) Interaksi sterik antara 4OUO-BNP. Semakin banyak ikatan non kovalen yang dapat terbentuk antara ligan dan protein maka komplek yang terbentuk akan semakin kuat dan akan meningkatkan konstanta inhibisinya. Untuk menunjukkan bahwa komplek antara 4OUO dengan BNP merupakan komplek yang memiliki kualitas yang baik maka kompleks 4OUO dengan BNP digambarkan ke dalam suatu plot Ramachandran (Gambar 5.13) yang dibuat
menggunakan
server
RAMPAGE
http://mordred.bioc.cam.ac.uk
/~rapper/rampage.php/.
28
Gambar 5.13 Plot Ramchandran 4OUO-BNP Berdasarkan plot Ramachandran 4OUO dengan BNP diperoleh jumlah residu pada daerah yang disukai adalah 97,6 % dan jumlah residu pada daerah luar adalah 0,4 %.
5.7. Perancangan dan sintesis fragmen DNA pengode anti BNP ScFv (4UOU) Urutan anti BNP-ScFv yang diperoleh dari hasil docking yaitu 4OUO, di copy urutan asam aminonya dengan urutan pada gambar 5.14.
Gambar 5.14. Urutan asam amino anti BNP-ScFv (4UOU)
Urutan asam amino ini kemudian ditranslasi balik (reverse translate) menjadi urutan nukleotida dengan menggunakan kodon preferensi E. coli K12 menggunakan
29
program EMBOSS backtranseq dari EMBL-EBI. Pemilihan kodon ini perlu dilakukan untuk mengoptimalkan ekspresi anti BNP-ScFv dalam E. coli. Urutan anti BNP ScFv hasil translasi balik diperlihatkan pada gambar 5.15. Urutan nukleotida ini kemudian dianalisis sisi restriksinya untuk menentukan sisi restriksi yang akan ditambahkan pada ujung 5’ dan 3’. Hasil analisis restriksi menunjukkan bahwa ScFv 4OUO dapat di ekspresikan menggunakan vector pET30a dengan sisi restriksi Nde1 dan Xho1 (Gambar 5.15).
Gambar 5.15. Urutan nukleotida hasil optimasi (atas), sisi restriksi anti BNP-ScFv (4UOU) (bawah).
Urutan nukelotida pengode ScFv 4OUO ini disintesis oleh GenScript dan diperoleh dalam bentuk plasmid rekombinan.
5.8.
Transformasi E. coli TOP10 menggunakan pET30a-anti BNP ScFv dan isolasi plasmid rekombinan Sebanyak 1 ng dari plasmid pET30a-anti BNP ScFv digunakan untuk
mentransformasi E. coli TOP10F’ dengan metoda elektroporasi. Transforman diinkubasi semalam pada suhu 37 ºC, sehingga diperoleh sejumlah koloni E. coli yang
30
diperkirakan membawa plasmid rekombinan. Untuk memastikannya maka dilakukan isolasi plasmid dari transforman E. coli. Plasmid diisolasi dari E. coli menggunakan kit Qiagen mengikuti prosedur. Hasil isolasi plasmid dipotong dengan enzim restriksi Nde1 dan Xho1 dan kemudian dikarakterisasi dengan elektroforesis gel agarose 1%. Elektroforegram diperlihatkan pada gambar 5.16.
Gambar 5.16. Elektroforesis hasil isolasi plasmid pETdan analisis restriksi. (M) marker, (1) plasmid uncut, (2) plasmid dipotong dengan Mlu1 dan Xho1.
5.9. Penentuan urutan nukleotida anti BNP-ScFv Urutan nukleotida anti BNP-ScFv dalam plasmid rekombinan ditentukan dengan metoda dideoksi Sanger. Urutan anti BNP ScFv hasil kloning dihomologikan dengan urutan hasil sintesis, dan memperlihatkan homologi 100%. Berdasarkan hasil analisis diatas, menunjukkan bahwa anti BNP-ScFv telah berhasil dikloning menggunakan vektor pET30a.
31
5.10 Ekspresi anti BNP ScFv dalam inang E. coli BL21(DE) Arctic Express Hasil ekspresi anti BNP-ScFv dalam inang E. coli Arctic express menunjukkan bahwa anti BNP ScFv telah berhasil diekspresikan dalam inang E. coli Arctic express (Gambar 5.12) dengan ukuran sekitar 25 kDa (Gambar 5.17). Namun hasil yang diperoleh ini masih perlu dioptimasi dengan memvariasikan konsentrasi penginduksi dan buffer lisis.
Gambar 5.17. Hasil SDS-PAGE ekspresi BNP dalam inang E. coli Arctic ekspress
32
BAB VI RENCANA TAHAPAN BERIKUTNYA
1. Ekspresi BNP dan anti BNP ScFv dan optimasi kondisi ekspresi 2. Pengujian afinitas pengikatan BNP-anti BNP scFv dengan metoda ELISA 3. Ammobilisasi anti BNP scFv ke elektroda grafit, emas dan platina 4. Pengujian deteksi BNP rekombinan oleh biosensor anti BNP scFv dengan elektroda grafit, emas dan platina 5. Pengujian batas deteksi 6. Pengujian menggunakan serum darah 7. Membandingkan efektifitas elektroda grafit, emas dan deteksi segi teknoekonomi
33
BAB VII KESIMPULAN DAN SARAN
7.1. Kesimpulan 1. Gen pengode Natriuretik peptide tipe B (BNP) telah berhasil dikloning dalam E. coli 2. Kondisi ekspresi BNP perlu di optimasi untuk mendapatkan hasil 3. Gen pengode anti BNP ScFv telah berhasil diekspresikan dalam E. coli dengan diperolehnya pita protein dengan BM 25 kDa.
7.2. Saran 1. Kondisi ekspresi BNP dan anti BNP ScFv perlu dioptimasi untuk mendapatkan hasil yang optimum 2. Penelitian ini perlu dilanjutkan untuk mengetahui afinitas pengenalan BNP oleh anti BNP ScFv secara biosensor elektrokimia.
34
DAFTAR PUSTAKA Arun M., Christopher A.J., Sam K., and Arjang H. 2012. Interface Design for CMOSIntegrated Electrochemical Impedance Spectroscopy (EIS) Biosensors. Sensors, 12, 14467-14488; doi:10.3390/s121114467. Atisha D., Bhalla M.A., Morrison L.K., Felicio L., Clopton P., Gardetto N., Kazanegra R., Chiu A., Maisel A.S. 2004. A prospective study in search of an optimal B-natriuretic peptide level to screen patients for cardiac dysfunction. Am. Heart J. 148 (3): 518–23. Agilent Technologies, 2013. Arctic Express competent cell manual. Bach H., Mazor Y., Shaky S., Shoham-Lev A., Berdichevsky Y., Gutnick D.L., Benhar I. 2001. Escherichia coli maltose-binding protein as a molecular chaperone for recombinant intracellular cytoplasmic single chain antibodies. J. Mol. Biol. 312:79–93. Bardwell J. C.A., 1994. Building bridges: disulphide bond formation in the cell. Mol. Microbiol. 14: 199–205. Cardarelli R., Lumicao T.G.Jr. 2003. B-type natriuretic peptide: a review of its diagnostic, prognostic, and therapeutic monitoring value in heart failure for primary care physicians. J. Am. Board. Fam. Pract. 16:327–333 Chaudhuri T.K., Horii K., Yoda T., Arai M., Nagata S., Terada T.P., Uchiyama H., Ikura T., Tsumoto K., Kataoka H., Matsushima M., Kuwajima K., Kumagai I. 1999. Effect of the extra N-terminal methionine residue on the stability and folding of recombinant alpha-lactalbumin expressed in Escherichia coli. J. Mol. Biol. 285: 1179–1194. Chong S., Montello G.E., Zhang A., Cantor E.J., Liao W., Xu M.Q., Benner J. 1998. Utilizing the C-terminal cleavage activity of a protein splicing element to purify recombinant proteins in a single chromatographic step. Nucl. Acids Res. 26: 5109-5115. Dubendorff J.W., Studier J.W. 1991. Controlling basal expression in an inducible T7 expression system by blocking the target T7 promoter with lac repressor. J. Mol. Biol. 219: 45-49. Egins, B.R. 2004. Chemical sensors and biosensors. John Wiley & Sons. Grantham J.A., Borgeson D.D., Burnett J.C. 1997. BNP: pathophysiological and potential therapeutic roles in acute congestive heart failure. Am. J. Physiol. 92:1077–1083. Hartati Y.W., Topkaya S.N., Maksum I.P., Ozsoz M. 2013. Sensitive Detection of Mitochondrial DNA A3243G tRNALeu Mutation via an Electrochemical Biosensor Using Meldola’s Blue as a Hybridization Indicator. Advanced Anal. Chem. 3(3A): 20-27. DOI: 10.5923/s.aac.201307.04. Hayden M.S., Gilliland L.K., Ledbetter J.A. 1997. Antibody engineering. Curr. Opin. Immunol. 9:201–212 Katragadda M. and Lambris J.D. 2006. Expression of compstatin in Escherichia coli: incorporation of unnatural amino acids enhances its activity. Protein Expr. Purif. 47, 289–295.
35
Kurita R., Yokota Y., Sato Y., Mizutani F., Niwa O. 2006. On-chip enzyme immunoassay of a cardiac marker using a microfluidic device combined with a portable surface plasmon resonance system. Anal. Chem. 78:5525–5531. Lueking A., Holz C., Gotthold C., Lehrach H., Cahill D. 2000. A system for dual protein expression in Pichia pastoris and Escherichia coli. Protein Express. Purif. 20: 372–378. Longenecker K.L., Ruan Q., Fry E.H., Saldana S.C., Brophy S.E., Richardson P.L., Tetin S.Y. 2009. Crystal structure and thermodynamic analysis of diagnostic mAb 106.3 complexed with BNP 5–13 (C10A). Proteins 76:536–547. Maeng B.H., Choi J., Young S.S., Shin J.H., Kim Y.H. 2012. Functional expression of recombinant anti-BNP scFv in methylotrophic yeast Pichia pastoris and application as a recognition molecule in electrochemical sensors. World J. Microbiol. Biotechnol. 28:1027–1034. DOI 10.1007/s11274-011-0901-5. Maeng B.H., Nam D.H., Kim Y.H. 2011. Coexpression of molecular chaperones to enhance functional expression of anti-BNP scFv in the cytoplasm of Escherichia coli for the detection of B-type natriuretic peptide. World. J. Microbiol. Biotechnol. 27:1391–1398. Morrison L.K., Harrison A., Krishnaswamy P., Kazanegra R., Clopton P., Maisel A. 2002. Utility of a rapid B-natriuretic peptide assay in differentiating congestive heart failure from lung disease in patients presenting with dyspnea. J Am Coll Cardio 39(2):202–209 Mueller C., Scholer A., Laule-Kilian K., Martina B., Schindler C., Buser P., Pfisterer M., Perruchoud A.P. 2004. Use of B-type natriuretic peptide in the evaluation and management of acute dyspnea. N. Engl. J. Med. 350:647–654. McDonnell B., Hearty S., Leonard P., O’Kennedy R. 2009. Cardiac biomarkers and the case for point-of-care testing. Clinical Biochem. 42:549–561. Makrides, S.C. 1996. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 60: 512ff. Peterson E., Owens S.M., Henry R.L. 2006. "Monoclonal antibody form and function: manufacturing the right antibodies for treating drug abuse". AAPS Journal 8 (2): E383–E390. doi:10.1208/aapsj080243. Seferian K.R., Tamm N.N., Semenov A.G., Mukharyamova K.S., Tolstaya A.A., Koshkina E.V. Kara A.N., Krasnoselsky M.I., Apple F.S., Esakova T.V., Filatov V.L., Katrukha A.G. 2007. The brain natriuretic peptide (BNP) precursor is the major immunoreactive form of BNP in patients with heart failure. Clinical Chem. 53:866–873. Shen Z., Stryker G.A., Mernaugh R.L., Yu L., Yan H., Zeng X. 2005. Single-Chain Fragment Variable Antibody Piezoimmunosensors. Anal Chem. 1:77 (3): 797805. doi: 10.1021/ac048655w Shen Z., Mernaugh R.L., Yan H., Yu L., Zhang Y., Zeng X. 2005. Engineered recombinant single chain fragment variable antibody for immonosensors. Anal. Chem. 77 (21). 6834-42. Subroto T, Shabarni-Gaffar, Hidayat A.S. 2012. Pengembangan vaksin influenza universal berbasis epitop. Laporan insentif Sinas. Takano K., Tsuchimori K., Yamagata Y., Yutani K. 1999. Effect of foreign Nterminal residues on the conformational stability of human lysozyme. Eur. J. Biochem. 266: 675–682.
36
Tanfous N.G.B., Kallel H., Jarboui M.A., Fathallah D.M. 2006. Expression in Pichia pastoris of a recombinant scFv form of MAb 107, an anti human CD11b integrin antibody. Enzyme Microb. Technol. 38:636–642. Wang J., Ibanez A., Chatrathi M.P. 2003. On-chip integration of enzyme and immunoassays: simultaneous measurements of insulin and glucose. J. Am. Chem. Soc. 125:8444–8445. White C.E., Kempi N.M., Komives E.A. 1994. Expression of highly disulfide-bonded proteins in Pichia pastoris. Structure 2: 1003–1005. Ziskoven D., Forssmann W.G., Holthausen U., Menz G., Addicks K., Rippegater G. 1989. Calcium Calmodulin antagonists Influences the release of Cardiodilatin/ANP from Atrial Cardiocytes. Handbook Endocrinology of the Heart.
37
LAMPIRAN 1 INSTRUMEN PENELITIAN
Sarana dan prasarana utama yang dibutuhkan dalam penelitian ini tersedia di Jurusan Kimia FMIPA Unpad. Laboratorium Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Kimia Analitik FMIPA Unpad. Peralatan Utama Peralatan utama yang terdapat di Laboratorium Biokimia FMIPA Unpad antara lain sebagai berikut :
No. Nama Alat 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13.
Thermocycler Automatic DNA sequencer Sentrifugasi Spektrofotometer Elektroforesis DNA SDS-PAGE Fermentor Autoklaf shaker inkubator Freeze dryer Vacuum concentrator Potensiostat Electrophorator
Kegunaan PCR (Polymerase Chain Reaction) Sekuensing DNA Pemisahan Pengukuran konsentrasi DNA Karakterisasi DNA Karakterisasi protein Fermentasi Sterilisasi Pertumbuhan kultur Pengeringan sampel Pemekatan Penentuan sinyal elektrokimia Transformasi sel
38
LAMPIRAN 2 PERSONALIA TENAGA PENELITI BESERTA KUALIFIKASINYA KETUA PENELITI: A. Identitas Diri 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.
Nama Lengkap (dengan gelar) Jabatan Fungsional Jabatan Struktural NIP/NIK/ Identitaslain NIDN Tempat dan tanggal lahir Alamat Rumah
8. 9.
Nomor Telepon/ Faks/ Hp Alamat Kantor
10. 11. 12.
Nomor Telepon/ Faks Alamat e-mail Lulusan yang telah dihasilkan
Dr. Shabarni Gaffar, M.Si (Perempuan) Lektor 19710425 200501 2 001 00225047105 Batang Buo, 25 April 1971 Komp. MyHome@Ujung Berung B-2, Jl Pamekar Raya, Mekar Mulya, Panyileukan, Bandung. 081573019025 Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor, 45363 022-7794391/ 022-7794391
[email protected] S1 = 31 orang S2 = 4 S3 = 0
B. Riwayat Pendidikan Nama Perguruan Tinggi Bidang Ilmu Tahun Masuk-Lulus JudulSkripsi/Thesis/ Disertasi
Nama Pembimbing/ Promotor
S-1 Unand
S-2 ITB
S-3 Unpad
Kimia 1990-1995 Analisis parameter pembentuk kerak serta kualitas air untuk injeksi uap di stasiun pengumpul pusat I, III dan V, PT. Caltex Pacific Indonesia,Duri. Dr. Admin Alief
Biokimia 1996-1998 Varian normal fragmen 0,4 kB daerah D-loop DNA mitokondria manusia Indonesia
Biokimia 2006-2011 Pengaruh kombinasi manipulasi genetik terhadap tingkat sekresi -amilase S. fibuligera R64 dalam Pichia pastoris
Dr. Achmad Saifuddin Noer
Prof. O. Suprijana Prof. Soetijoso Soemitro Dr. Dessy Natalia
39
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir No Tahun
1.
20092011
2.
2012
3.
2012
4.
20122013
5.
2013
6.
20132014
7.
2014
Judul Penelitian
Koekspresi Protein Disulfida Isomerase (PDI1) untuk meningkatkan sekresi αamilase dalam Pichia pastoris Identifikasi populasi bakteri dalam spons pencuci piring dengan metoda PCR-RFLP Pengembangan biosensor DNA secara elektrokimia tanpa indicator eksternal untuk deteksi bakteri patogen dalam sampel darah Pengembangan vaksin influenza universal berbasis epitop Pengaruh Ko-ekspresi Sec4p Pichia pastoris Terhadap Tingkat Sekresi -Amilase Saccharomycopsis fibuligera oleh Pichia pastoris rekombinan Pengembangan produksi thrombin rekombinan sebagai komponen lem fibrin pengganti jahitan pada bedah mata Pengembangan biosensor untuk deteksi Mycobacterium tuberculosis
Pendanaan Sumber Jumlah (Juta Rp) PHB Dikti 102,0,(Ketua) BOPTN (ketua) PHB Dikti (Anggota)
30,0,-
Insentif Riset SINas (Anggota) PUPT (Ketua)
550,0,-
45,0,-
53,6,-
Unggulan Stranas (Anggota) PUPT (Anggota)
1400,0,-
83,0,-
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir No.
Tahun
Pendanaan
Judul Pengabdian Kepada Masyarakat
Sumber 1.
2008
Pembinaan kreativitas melalui peningkatan budaya minat baca dalam sarana dan prasarana taman bacaan kampung Rancakemit, kecamatan Solokan Jeruk, Kabupaten Bandung
LPPM Unpad
2.
2013
Dosen pendamping pada kegiatan pengabdian kepada masyarakat bagi siswa Madrasah Aliyah Darul Hufadz dan SMK Al Hawari Rancaekek di jurusan Kimia FMIPA Unpad
Mandiri
3.
2014
Dosen pendamping pada kegiatan pengabdian kepada masyarakat bagi siswa Madrasah Aliyah Darul Hufadz dan SMK Al Hawari Rancaekek di jurusan Kimia FMIPA Unpad
Mandiri
Jml (Juta Rp) 5,-
40
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir Tahun 2015
2013
2011
2009
2009
Judul Penerbit/Jurnal Identifikasi populasi bakteri dalam spons pencuci Jurnal Chemica piring dengan metoda pcr-rflp Natura Acta Shabarni-Gaffar, Iman Permana Maksum, Euis Juleha Chemical Modification of Saccharomycopsis fibuligera R64α-Amylase to Improve its Stability Against Thermal, Chelator, and Proteolytic Inactivation Applied Biochemistry Ismaya, W.T., Hasan, K., Kardi, I., Zainuri, A., and Biotechnology Rahmawaty, R.I., Permanahadi, S., Viera, B.V.E., Harinanto, G., Gaffar, S., Natalia, D., Subroto, T., Soemitro, S. Pengaruh konsentrasi penginduksi metanol serta sumber karbon sorbitol dan manitol terhadap produksi -amilase Saccharomycopsis fibuligera Jurnal Kimia Terapan Indonesia, Vol. 13, R64 dalam Pichia pastoris. No. 2, Desember Shabarni-Gaffar, Dani Permana, Diana P. 2011, Hal 58-64. Rahmawati, Triana N. Meirina, , Abu Bakar M.I. ISSN 0853-2788 Syihab, Safri Ismayana, Toto Subroto, O. Suprijana, dan Soetijoso Soemitro Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi Jurnal Bionatura, Vol Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara 11 No 3, November Voltammetri 2009, Hal: 276-290. Hartati, Y.W., Wyantuti, S., Shabarni-Gaffar, ISSN 1411-0903 Rochani S., Bahti, H.H., Agma, M. Phylogenetics analysis of marine and coastal Jurnal Bionatura, Vol species using 18S rRNA sequence 11 No 2, Oktober Shabarni-Gaffar, Linawati Hardjito, dan Endang 2009, Hal: 117-128. ISSN 1411-0903 Srieatimah
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir No 1.
Nama Pertemuan Judul Artikel Ilmiah Waktu dan Ilmiah / Seminar Tempat Secretory Expression of International seminar Bandung, Saccharomycopsis fibuligera R64 on chemistry November 2014 -Amylase
with
native
signal
41
2. 3.
peptide in Pichia pastoris Seminar nasional Sub-Kloning Gen -amilase Bandung, Saccharomyces fibuligera (Sfamy) Oktober 2014 FMIPA, Unpad dalam inang Escherichia coli
Seminar Universitas Pakuan-Unpad
Konstruksi vektor ekspresi rekombinan yang mengandung protein Sec4 Pichia pastoris dan kloning dalam Escherichia coli.
Bogor, 2013
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir No 1
2
Judul Buku Produksi protein rekombinan dalam sistem ekspresi P. pastoris (ISBN 978602-8743-23-5) Bioteknologi molekul, konsep dan aplikasi. ISBN: 978-602-8323-46-8.
2010
Jumlah Halaman 176
2010
93
Tahun
Penerbit Unpad Press
Widya Padjadjaran
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 -– 10 Tahun Terakhir No.
Judul/Tema HKI
Tahun
Jenis
Nomor
1
Buku: Produksi protein rekombinan dalam sistem
2010
Hak Cipta
062859 P/ID
ekspresi P. pastoris (ISBN 978-602-8743-23-5)
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, 2015.
Bandung, 30 Oktober 2015 Pengusul,
SHABARNI GAFFAR
42
Anggota Peneliti 1: A. Identitas Diri 1. 2. 3.
Nama Lengkap (dengan gelar) Jabatan Fungsional Jabatan Struktural
4. 5. 6. 7.
NIP/NIK/ Identitaslain NIDN Tempat dan tanggal lahir Alamat Rumah
8. 9.
Nomor Telepon/ Faks/ Hp Alamat Kantor
10 11. 12.
Nomor Telepon/ Faks Alamat e-mail Lulusan yang telah dihasilkan
Dr. Yeni Wahyuni Hartati
(Perempuan)
Lektor Koordinator dan Kepala Laboratorium Kimia Dasar 19710924 199802 2 001 0024097101 Garut, 24 September 1971 Jl. Merkuri Utara No. 8, Margahayu Raya Bandung 022-7561080/ - / 08122132349 Jl. Raya Bandung-Sumedang Km 21 Jatinangor, 45363 022-7794391/ 022-7794391
[email protected] S1 = 20 orang S2 = 4 orang S3 = 1
B. Riwayat Pendidikan
Nama Perguruan Tinggi Bidang Ilmu Tahun Masuk-Lulus JudulSkripsi/Thesis/ Disertasi
Nama Pembimbing/ Promotor
S-1 Universitas Padjadjaran Kimia 1990-1995 Penentuan Rotenon dalam Biji Tephrosia vogelii secara Kromatografi Lapis Tipis -Densitometri Prof. Dr. Ir. Roekmiati Tjokronegoro
S-2 ITB Biokimia 1996-1999 Studi Struktur Fungsi Gen Sup-45 Saccharomyces cerevisiae Sensitif Paromomisin Prof. Dr. Akhmaloka, Dr. Muliawati Sindumartha
S-3 Universitas Padjadjaran Kimia Analisis 2005-2009 Biosensor Voltammetri Untuk Penentuan Urutan Spesifik dan Mutasi Basa Tunggal pada fragmen DNA Prof. Dr. Muljadji Agma, Prof. Dr. Siti Rochani, Prof. Dr. Husein H. Bahti
43
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir Pendanaan Jumlah (Juta Sumber Rp) PUPT 83,0,-
No 1.
Tahun 2014
Judul Penelitian Pengembangan biosensor DNAuntuk deteksi Mycobacterium tuberculosis
2.
20112013
Pengembangan biosensor DNA secara elektrokimia tanpa indicator eksternal untuk deteksi bakteri patogen dalam sampel darah
PHB Dikti (Ketua)
138,5,-
3.
20092010
Pengembangan Biosensor DNA Tanpa Indikator Eksternal untuk Deteksi Mutasi Titik (Point Mutation) DNA Mitokondria pada Pasien Diabetes Mellitus Tipe 2
PHB Dikti (Ketua)
50 +45
4.
2009
Studi Deteksi Urutan Spesifik DNA dan Mutasi Basa Tunggal pada Urutan DNA secara Biosensor DNA Voltammetri mengggunakan Elektrode Grafit
Hibah Penelitian Doktor (Ketua)
32,5
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir Pendanaan No.
Tahun
Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Sumber
1
2008
Sosialisasi Pembuatan Sabun Mandi Cair Dengan Lendir Lidah Buaya (Aloe vera Linn)
BLU Unpad
Jml (Juta Rp) 3,-
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir
No. 1
Judul Artikel Ilmiah Deteksi Urutan Pendek DNA Salmonella Typhi Berdasarkan Sinyal Guanin Target Secara Voltammetri
2. Sensitive Detection of Mitochondrial DNA A3243G tRNALeu Mutation via an Electrochemical Biosensor Using Meldola’s Blue as a Hybridization Indicator
Volume/ Nomor/Thn Vol 11 No 3, November 2009 3(3A): 2027, 2013
Nama Jurnal Bionatura, Unpad
Advanced Analitical Chemistry
44
F. Pengalaman Penyampaian Makalah Secara Oral Pada Pertemuan / Seminar Ilmiah Dalam 5 Tahun Terakhir Nama Pertemuan Ilmiah / Seminar
No
Waktu dan Tempat
Judul Artikel Ilmiah
1.
International Conference of Indonesian Chemist Indonesia
Study of nested PCR voltametric DNA biosensor related to flagellin gene fragment of pathogenic Salmonella typhii
Malang, 2012
2.
Seminar Nasional XIII Jaringan Kerjasama Kimia Indonesia, Yogyakarta, 15 Juli 2010 The second International Conference on Mathematics and Natural Sciences 1st Regional 2008, ITB Conference on Biosensor and Biodiagnostics 2008, Kuala Lumpur, Seminar Nasional Malaysia Himpunan Kimia Indonesia SNHKI 2008
Penentuan Kandungan Basa Guanin dan Adenin dalam Urutan DNA secara Voltammetri Menggunakan Elektrode Grafit Pensil
2010, Yogyakarta
Electrochemical DNA Biosensor for the Detection of Short DNA Sequences Related to the Salmonella typhi
2008, ITB
Single Base Mismatch Detection on the mtDNA A3243G Mutattion Using DNA Biosensor Based on Meldola’s Blue as the Hybridization Indicator
2008, Kuala Lumpur
Deteksi Hibridisasi DNA Secara Elektrokimia Pada Elektrode Pensil Grafit Dengan Interkelator Redoks-aktif Meldola’s Blue
2008, Denpasar
3.
4.
5.
G. Pengalaman Penulisan Buku dalam 5 Tahun Terakhir No
Judul Buku
1
Biosensor Elektrokimia Untuk Deteksi Urutan Spesifik DNA ISBN 978-979-3985-84-8
Tahun 2010
Jumlah Halaman 158
Penerbit Unpad Press
H. Pengalaman Perolehan HKI Dalam 5 -– 10 Tahun Terakhir No. 1
Judul/Tema HKI
Tahun
Jenis
Nomor P/ID
45
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya. Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, 2015.
Bandung, 30 Oktober 2015 Pengusul,
YENI WAHYUNI HARTATI
46
Anggota Peneliti 2: A. Identitas Diri 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12.
Nama Lengkap (dengan gelar) Jabatan Fungsional Jabatan Struktural NIP / NIK / Identitas lain NIDN Tempat dan Tanggal Lahir Alamat Rumah Nomor Telepon/ Faks/ Hp Alamat Kantor Nomor Telepon/ Faks Alamat e-mail Lulusan yang telah dihasilkan
Dra. Dian Siti Kamara, M.Si (Perempuan) Lektor 196612061991012001 0006126603 Bandung, 6 Desember 1966 Jl. Setiabudi No. 78A, Bandung 40141 081319992227 Jl. Raya Bandung - Sumedang Km 21, Jatinangor 45363 022-7794391/ 022-7794391
[email protected] S1 = 22 orang S2 = S3 = -
B. Riwayat Pendidikan Nama Perguruan Tinggi Bidang Ilmu Tahun Masuk - Lulus Judul Skripsi / Tesis
Nama Pembimbing
S-1 Universitas Padjadjaran
S-2 Universitas Padjadjaran
Kimia 1985 - 1990 Penggunaan k-Karageenan untuk amobilisasi sel atau enzim dalam produksi 6APA 1. Dr. Soetijoso Soemitro 2. Drs. R. Ukun M.S. Soedjanaatmadja
Ilmu Kimia 2000 - 2002 Pemurnian enzim protease dari bakteri BAC-4 dengan metode afinitas 1. Dr. Husein H. Bahti 2. Dr. Soetijoso Soemitro 3. Dr. O. Suprijana, MSc.
C. Pengalaman Penelitian Dalam 5 Tahun Terakhir
No 1.
Tahun 2009
Judul Penelitian Mutagenesis terarah K3911, K3651 dan K3811 untuk meningkatkan kestabilan α-amilase dari Saccaromycopsis fibuligera
Pendanaan Jumlah (Juta Sumber Rp) Reaserch 25,0 Grant IMHERE (Anggota)
47
2.
2009
Produksi anti jamur oleh Streptomyces ISP 192 secara fermentasi menggunakan media glukosa dan pati
Reaserch Grant IMHERE (Anggota)
25,0
3.
2012
Hidrolisis parsial tepung ubi ungu dengan amilase dari Saccaromycopsis fibuligera dan aplikasinya sebagai bahan pembuatan roti
PHB Dikti (Anggota)
37.5
D. Pengalaman Pengabdian Kepada Masyarakat Dalam 5 Tahun Terakhir Pendanaan No. Tahun
Judul Pengabdian Kepada Masyarakat Sumber Jml (Juta Rp)
1
2010
Peduli Anak Asuh Sekolah, Tingkat Fakultas sebagai Motivator dan Orang Tua asuh
E. Pengalaman Penulisan Artikel Ilmiah Dalam Jurnal Dalam 5 Tahun Terakhir Tua Asuh No. 1
Judul Artikel Ilmiah Partial hydrolysis of purple sweet potato flour by amylase from saccharomycopsis fibuligera and its application for composite breadmaking (Agus safari, Dian S. Kamara, Franciska silalahi, Muhammad Fadhlillah, Idar Kardi, Safri Ishmayana)
Volume/ Nomor/Thn 2 (5) 23402343, 2013
Nama Jurnal Journal of microbiology biotechnology and food sciences
Semua data yang saya isikan dan tercantum dalam biodata ini adalah benar dan dapat dipertanggungjawabkan secara hukum. Apabila di kemudian hari ternyata dijumpai ketidaksesuaian dengna kenyataan, saya sanggup menerima risikonya.Demikian biodata ini saya buat dengan sebenarnya untuk memenuhi salah satu persyaratan dalam pengajuan Penelitian Unggulan Perguruan Tinggi, 2015. Bandung, 30 Oktober 2015 Pengusul,
DIAN SITI KAMARA 48
LAMPIRAN 3 FORMULIR EVALUASI ATAS CAPAIAN LUARAN KEGIATAN
Ketua
: Shabarni Gaffar
Perguruan Tinggi
: Universitas Padjadjaran
Judul
: Produksi Natriuretik Peptida tipe B (BNP) dan Anti BNP scFv Rekombinan serta Aplikasinya untuk Diagnosis Gagal Jantung Secara Biosensor Elektrokimia
Waktu Kegiatan
: tahun ke 1 dari rencana 2 tahun
Luaran yang direncanakan dan capaian tertulis dalam proposal awal: No. 1. 2.
Luaran yang direncanakan Ekspresi BNP rekombinan dan pemurnian Ekspresi anti BNP-ScFv rekombinan dan pemurnian
Capaian 85% 90%
1. PUBLIKASI ILMIAH Keterangan Artikel Jurnal Ke-1* Nama jurnal yang dituju Klasifikasijurnal
Makara UI Jurnal Nasional Terkareditasi/JurnalInternasional
Impact factorjurnal Judul artikel
-Draf artikel
In silico study of Single Chain Variable Fragment (ScFv) sellective to B-type Natriuretic Peptide (BNP) and its expression in Escherichia coli.
√
-Sudah dikirim ke jurnal -Sedang ditelaah -Sedang direvisi -Revisi sudah dikirim ulang -Sudah diterima -Sudah terbit
49
2. BUKU AJAR Bukuke-1 Judul: Penulis: Penerbit: 3. PEMBICARAPADAPERTEMUAN ILMIAH (SEMINAR/SIMPOSIUM) Nasional
Internasional
JudulMakalah
In silico study of Single Chain Variable Fragment (ScFv) sellective to B-type Natriuretic Peptide (BNP)
Nama Pertemuan Ilmiah Tempat Pelaksanaan
The Gruber Soedigdo Lecture 2015 ITB
Waktu Pelaksanaan
10 November 2015
-Draf makalah
√
-Sudah dikirim
√
-Sedang direview -Sudah dilaksanakan
Jatinangor, 30 Oktober 2015 Ketua
(Shabarni Gaffar)
50
LAMPIRAN 4 LOA Seminar
51
