KANDUNGAN TANIN DAN POTENSI ANTI Streptococcus mutans DAUN TEH VAR. ASSAMICA PADA BERBAGAI TAHAP PENGOLAHAN
RITA YULIA
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2006
ABSTRAK RITA YULIA. Kandungan Tanin dan Potensi Anti Streptococcus mutans Daun Teh Var. Assamica pada Berbagai Tahap Pengolahan. Dibimbing oleh MANSJUR HAWAB dan EDY DJAUHARI. Penelitian ini dilakukan untuk menguji setiap tahap dari pengolahan te h melalui pengujian fenol total dan aktivitas antibakteri. Daun teh yang telah diolah di pabrik kemudian dimaserasi dan diuji kandungan tanin dengan metode fenol total yang terlebih dahulu dibuat kurva standar dengan 0;5;10;25;50;100;250 ppm. Uji KLT menggunakan selulosa dengan asam galat sebagai standar. Pada pengujian aktivitas antibakteri ke -8 sampel, digunakan 3 macam konsentrasi yaitu 2500; 5000 dan 10000 ppm. Bakteri uji yang digunakan adalah S. Mutans. Hasil penelitian kandungan tanin kedelapan sampe l yaitu: 0.13, 0.07, 0.11, 0.15, 0.12, 0.11, 0.10 and 0.12%. Nilai Rf pada analisis KLT untuk semua tahap pengolahan memberikan hasil yang positif, artinya spot noda yang terbentuk relatif mendekati standar, namun pada kedelapan sampel juga menunjukkan ada nya senyawa lain. Hal ini dipertegas dengan uji scanning pada kedelapan sampel dan ternyata sampel juga memberikan serapan pada panjang gelombang lain yaitu pada panjang gelombang 400-500 nm, sedangkan standar asam galat berada pada panjang gelombang 200-250 nm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa daun segar yang belum mengalami pengolahan lebih berpotensi sebagai senyawa antibakteri, karena seiring dengan pengolahan menjadi teh hitam, aktivitas senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri pada daun teh menjadi berkurang.
ABSTRACT RITA YULIA. The tannin content and its potency as anti Streptococcus mutans of tea leaves Var.Assamica at different manufacturing stages. Under the direction of MANSJUR HAWAB and EDY DJAUHARI. This research was carried out to test every step of tea manufacturing through total phenol test and antibacteria l activity. The tea leaves which processed in factory was macerated and the tannin test was examined by total phenol method, which firstly was made the standard curve of 0;5;10;25;50;100;250 ppm. TLC test used cellulose and gallat acid as standard. The antibacteria activity test at the eight samples, it was used three concentration, i.e. 2500, 5000 and 10000 ppm. The bacteria for testing was S. Mutans. The research result of tannin content of eight samples were 0.13, 0.07, 0.11, 0.15, 0.12, 0.11, 0.10 and 0.12%. Rf value at TLC analysis in every step of processing gave positive results. It meant that the spot was relatively closed to the standard. However, at the eight samples showed there was another compound. It was determined by scanning test at the samples. They gave another absorbent at wavelength of 400-500 nm while the gallat acid standard was at wavelength of 200-250 nm. The results showed that fresh leaves, which have not been processed, was more potential as antibacterial compound. Due to the process into black tea form, potential compounds as antibacterial at tea leaves was reduced.
KANDUNGAN TANIN DAN POTENSI ANTI Streptococcus mutans DAUN TEH VAR. ASSAMICA PADA BERBAGAI TAHAP PENGOLAHAN
RITA YULIA
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia
PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR
2006
PRAKATA Alhamdulillah, puji dan syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala rahmat, hidayah dan karunianya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah ini berjudul Kandungan Tanin dan Potens i Anti Streptococcus mutans Daun Teh Var. Assamica pada Berbagai Tahap Pengolahan. Penelitian dilakukan di Laboratorium Pusat Studi Biofarmaka, IPB. Pengambilan sampel dilakukan di PT Perkebunan Nusantara VIII, Goalpara Sukabumi. Penelitian dilakukan mulai bulan Maret sampai Mei 2006. Terima kasih penulis ucapkan kepada Prof. Dr. drh. H. Mans jur Hawab, M.S. dan Drs. H. Edy Djauhari, P.K., M.Si. selaku pembimbing yang selalu memberikan dorongan, arahan dan semangat selama penelitian dan dalam penyusunan karya ilmiah ini. Tak lupa penulis ucapkan terima kasih kepada pegawai PTPN VIII Goalpara atas kerja samanya, staf laboratorium PSB di antaranya Bu Nunuk, Waras , Mas Atep, Teh Ina, Teh Ninik, Zaim, Teh Titis dan Endi. Ungkapan rasa cinta dan syukur penulis sampaikan kepada Mamah, Teh Enti dan Om Wawan atas segala perhatian, do’a, semangat dan kasih sayangnya. Ku persembahkan skripsi ini untuk almarhum Babah, Ananda bangga dengan segala pengorbanan besar dari seorang pejuang tangguh yang tidak mengenal lelah dalam memperjuangkan cita -cita Ananda. Akhirnya penulis berharap semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2006 Rita Yulia
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Sukabumi pada tanggal 4 Juli 1984 sebagai anak kedua dari dua bersaudara. Putri dari pasanga n Engkos Kosasih dan Wahidah. Penulis lulus dari SMUN 3 Sukabumi pada tahun 2002 dan pada tahun yang sama penulis masuk IPB melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB dengan Program Studi Biokimia, Jurusan Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Selama mengikuti perkuliahan, penulis pernah mengikuti praktik lapangan di LIPI Bioteknologi, Cibinong Kabupaten Bogor dari bulan Juni sampai Agustus 2005.
DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................................................................................... x DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... x DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xi PENDAHULUAN ............................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Teh ............................................................................................ Jenis Teh ................................................................................................... Komposisi Kimia Teh .............................................................................. Tanin ........................................................................................................ Khasiat Teh .............................................................................................. Streptococcus mutan ................................................................................. Metode Pengukuran Antibakteri .............................................................. Ekstraksi ...................................................................................................
1 2 2 2 3 3 3 4
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ......................................................................................... 4 Metode Penelitian .................................................................................... 4 HASIL DAN PEMBAHASAN Analisis Kadar Air .................................................................................... 6 Ekstraksi ................................................................................................... 7 Analisis Kandungan Tanin ....................................................................... 8 Analisis KLT ............................................................................................ 9 Uji Aktivitas Antibakteri ........................................................................ 10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................... 12 Saran ....................................................................................................... 12 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................ 12 LAMPIRAN ....................................................................................................... 14
DAFTAR TABEL Halaman 1 Hasil analisis kadar air pada setiap pengolahan teh ....................................
7
2 Hasil rendemen eks trak setiap pengolahan teh ...........................................
8
3 Hasil uji tanin teh hitam ..............................................................................
9
4 Hasil uji KLT ..............................................................................................
9
5 Hasil uji daya hambat ekstrak teh terhadap S.mutans ................................
11
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Daun teh Camellia sinensis .........................................................................
2
2 Reaksi oksidasi katekin oleh enzim polifenol oksidase .............................
2
3 Streptococcus mutans ..................................................................................
3
4 Halogen moisture analyzer .........................................................................
5
5 Hasil KLT dari berbagai tahap pengolahan ………………………..……... 10 6 Zona hambat antibakteri (mm) dari daun segar, pelayuan dan penggilingan daun teh konsentrasi 5000 dan 10000 ppm ……………………………….. 11
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Diagram alir penelitian ................................................................................... 15 2 Pengolahan teh hitam ..................................................................................... 16 3 Rendemen hasil ekstraksi tahap pengolahan .................................................. 17 4 Bagan alir pengujian tanin dari tahapan pengolahan teh hitam ..................... 18 5 Data pengujian tanin standar asam galat (mg/l) .............................................. 19 6 Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat (mg/l) dengan absorbans .......................................................................................... 19 7 Data pengujian kandungan tanin sampel teh .................................................. 19 8 Data hasil KLT …………………………………………………..……….… 24 9 Data hasil scanning panjang gelombang dari 200-765 nm ............................ 25 10 Komposisi media LB (Luria Bertani) ........................................................... 21 11 Pembuatan media ......................................................................................... 22 11 Pengujian aktivitas antibakteri ..................................................................... 21 12 Foto zona hambat Foto zona hambat standar ...... 22 13 Foto zona hambat ekstrak sampel (konsentrasi 2.5 mg/ml) .......................... 22 14 Foto zona hambat ekstrak sampel (konsentrasi 5 mg/ml) ............................ 23 15 Foto zona hambat ekstrak sampel (konsentrasi 10 mg/ml) .......................... 23 16 Analisis uji anova dan uji duncan hasil pengujian tanin dari proses pengolahan teh hitam …………………………………………. 23 17 uji anova dan uji Duncan hasil pengujian tanin terhadap bakteri S.mutans konsentrasi 10000 ppm ………………………………………….………… 24 18 Uji anova dan uji Duncan hasil pengujian tanin terhadap bakteri S.mutans konsentrasi 5000 ppm …………………………………………….……….. 24 19 Data hasil KLT ………………………………………………………….… 24 20 Data hasil scanning panjang gelombang dari 200-765 nm ........................... 25
PENDAHULUAN Teh merupakan bahan minuman yang dimanfaatkan sebagai penyegar dan obat. Umumnya teh masih dianggap sebagai bahan minuman tradisional, sehingga di pasaran masih kalah bersaing dibandingkan jenis minuman lainnya. Teh memiliki kandungan unsur kimia, vitamin dan mineral yang lengkap. Kandungan tersebut merupakan komponen senyawa yang banyak dibutuhkan oleh tubuh manusia, baik untuk kesehatan maupun nutrisi. Komposisi senyawa kimia dari daun teh yang banyak diajukan oleh beberapa peneliti, di antaranya adalah sebagai komponen kesehatan atau obat. Komponen utama yang berkhasiat dalam teh disebabkan oleh kandungan kimia utamanya, yaitu polifenol yang tersusun atas 10-25% dari seluruh berat kering daun. Tanin merupakan senyawa polifenol utama pada teh yaitu sebesar 90% dari total kandungan polifenol. Kandungan senyawa polifenol yang terdapat pada teh tergantung pada varietas dan lingkungan tumbuhnya. Perkebunan teh di Jawa barat banyak menanam jenis teh varietas Assamica yang terbukti lebih baik daripada teh varietas Sinensis. Secara genetis, varietas Assamica memiliki kandungan tanin yang lebih banyak daripada var. Sinensis sehingga lebih potensial menyehatkan dan dapat meningkatkan daya saingnya di pasaran. PT Perkebunan Nusantara VIII Goalpara, Sukabumi menanam teh (Camellia sinensis ) varietas Assamica yang cocok untuk dijadikan sebagai teh hitam dan tanin yang terkandung di dalam teh varietas Assamica klon Gambung belum diketahui dengan pasti pot ensinya sebagai senyawa antibakteri maka melalui perbandingan cara pengolahan, diharapkan teh var. Assamica jenis klon Gambung mampu menghambat pertumbuhan streptococcus penyebab plak gigi. Plak gigi disebabkan oleh adanya bakteri yang terakumulasi pada gigi. Bakteri yang menyebabkan kerusakan pada gigi adalah Streptococcus mutans yang bersifat tahan asam, menghasilkan senyawa bersifat asam dan membentuk polisakarida yang lengket dari sukrosa. Sifat asam dapat menurunkan pH plak gigi dan selanjutnya mengakibatkan demineralisasi email gigi dan pembentukan lubang gigi. Penelitian ini bertujuan untuk menguji pengaruh pengolahan teh terhadap kandungan tanin dan potensinya sebagai anti S.mutans. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi ilmiah mengenai
pengaruh pengolahan teh terhadap kandungan tanin dan potensinya sebagai anti S.mutans. Hipotesis penelitian ini yaitu pengolahan teh akan mempengaruhi kandungan tanin dalam teh varietas Assamica klon Gambung dan dapat mempengaruhi sifat antibakterinya.
TINJAUAN PUSTAKA Tanaman Teh Tanaman teh berasal dari daerah Asia Selatan dan Timur, masuk ke Indonesia pada tahun 1690 dan mulai ditanam sejak tahun 1826. Teh dapat tumbuh baik pada suhu udara 16-30 ºC dan kelembaban (RH) kira-kira 60% atau curah hujan minimum 1200 mm/tahun yang hampir merata sepanjang tahun (Sukasman 1997). Di Indonesia, teh tumbuh baik di daerah pegunungan dengan ketinggian antara 900-1500 M, artinya tanaman teh dapat tumbuh di daerah rendah, sedang dan tinggi (Darmawijaya 1982). Iklim dan tanah sangat mempengaruhi produksi tanaman teh. Teh tumbuh paling baik di tanah yang agak asam dan berdrainasi baik. Selain iklim, tanah, suhu tanah, kelembaban tanah, curah hujan, penyinaran matahari, suhu udara, kelembaban udara dan angin semuanya sangat berpengaruh terhadap proses-proses pertumbuhan dan perkembangan tanaman teh. Tanaman teh diklasifikasikan ke dalam divisi Spermatophyta, sub divisi Angiospermae, kelas Dicotyledonae, sub kelas Dialypetalae, ordo Clusiales , familia Theaceae, genus Camellia, spesies C. Sinensis , varietas Sinensis dan Assamica. Berdasarkan informasi yang diperoleh dari http://www.kompas.com/. tahun 2006, tanaman teh terdiri dari daun, bunga dan buah. Secara umum teh mempunyai ciri-ciri yang berbeda dengan tanaman lain, yaitu pohonnya kecil dengan tinggi sampai 12 meter, daun berwarna hijau dan berbentuk jorong atau bundar telur yang panjangnya sekitar 3-30 cm, permukaan bawahnya berbulu jarang (trichoma), tepi daunnya bergerigi, ujungnya meruncing dan pucuk daunnya berwarna hijau kekuningan. Bunga yang muncul di ketiak daun, terdiri dari bunga tunggal atau dalam rangkaian kecil, warnanya putih dan berbau harum. Buah berupa kotak yang berwarna hijau kecoklatan, bergerombol dan berisi 3-6 biji bulat atau gepeng (Gambar 1). Fungsi dari buah dan bunga pada tanaman teh adalah untuk penyerbukan.
Katekin
Gambar 1 Daun teh Camellia sinensis . Jenis Teh Teh dapat dibedakan menjadi dua varietas utama yaitu teh berdaun kecil asal Cina, yaitu teh Camellia sinensis varietas Sinensis dan teh berdaun lebar asal Assam, India, C. sinensis assamica varietas Assamica. Kedua spesies tersebut memiliki perbedaan, baik habitat, pembungaan maupun bentuk dan ukuran daun (Kustamiyati 1976). Tanaman teh dari var. Sinensis atau disebut varietas cina, merupakan tanaman perdu dengan daun yang kecil, tumbuh pada iklim dingin dan cocok dibuat teh hijau dan teh oolong, sedangkan tanaman teh dari var. Assamica merupakan tipe tanaman tinggi dengan daun-daun yang lebar, kurang tahan dingin dan cocok dibuat teh hitam. Berdasarkan pengolahannya, teh dapat dibedakan dalam tiga kategori utama yaitu teh hijau ( tidak mengalami fermentasi), teh oolong ( semi fermentasi) dan teh hitam (fermentas i penuh). Teh hitam adalah teh yang banyak dikonsumsi oleh masyarakat sebagai seduhan air minum, jenis teh ini banyak diproduksi oleh pabrik-pabrik teh di Indonesia dan sebagian hasilnya di ekspor ke luar negeri. Teh hitam diperoleh melalui beberapa tahap pengolahan, yaitu tahap pemetikan daun, pelayuan, penggilingan, fermentasi, pengeringan dan sortasi. Tahapan utama pada pembuatan teh hitam terdapat pada tahap ketiga yaitu proses fermentasi. Pada tahap ini katekin dapat teroksidasi menjadi theaflavin (1-2%) dan thearubigin (10-20%) melalui bantuan enzim polifenol oksidase dan membentuk warna dan cita rasa yang khas . Selama proses fermentasi, enzim yang ada di dalam daun teh bersentuhan dengan udara dan mulai teroksidasi, hal inilah yang menghasilkan aroma, warna, dan mutu yang khas dari teh hitam. Proses fermentasi dihentikan pada saat aroma dan rasanya sudah maksimal (Gambar 2).
Gambar 2 Reaksi oksidasi katekin oleh enzim polifenol oksidase. Komposisi Kimia Teh Kualitas teh yang baik sebagian besar terletak pada komposisi kimiawinya (Sanderson 1964). Komposisi tersebut akan berbeda-beda menurut tipe, klon, musim, kondisi lingkungan pertumbuhannya dan perubahan warna daun teh setelah proses pembuatannya (Bokuchava 1969). Senyawa kimia dalam daun teh secara umum dapat digolongkan menjadi empat kelompok, yaitu: (1) substansi fenol, yang terdiri atas flavanol dan flavonol, (2) Substansi bukan fenol, di antaranya karbohidrat, pektin, alkaloid, protein, lemak, asam amino, klorofil, asam organik, vitamin, mineral, (3) Substansi aromatik dan (4) Enzim. Di antara keempat kelompok senyawa tersebut, substansi fenol dianggap paling berperan dalam menentukan kualitas teh hitam (Bokuchava 1969). Polifenol teh atau yang disebut sebagai tanin merupakan zat yang unik, karena berbeda dengan tanin yang terdapat dalam tanaman lain. Tanin dalam teh tidak bersifat menyamak dan tidak berpengaruh buruk terhadap pencernaan makanan.
Tanin Tanin adalah senyawa polifenol yang larut dalam air dan umumnya berasal dari senyawa-senyawa fenol alam yang memiliki kemampuan mengendapkan protein-protein seperti gelatin. Tanin dinamakan juga asam tanat dan asam galotanat, ada yang tidak berwarna tetapi ada juga yang berwarna kuning atau coklat. Istilah tanin yang dipakai ahli pangan ada dua yakni tanin terkondensasi
(condensed tannin) dan tanin terhidrolisis (hydrolized tannin). Tanin dalam teh termasuk tanin terkondensasi yang secara biosintesis terbentuk dari kondensasi katekin tunggal yang membentuk senyawa dimer kemudian oligomer yang lebih tinggi. Pada daun teh segar terdapat sekitar 30% senyawa tanin, yang sebagian besar dari golongan katekin dan daun teh juga dilengkapi dengan enzim polifenol oksidase yang siap bekerja mengubah tanin menjadi sederetan senyawa turunan melalui suatu reaksi kondensasi dan hampir semua tanin yang mengalami reaksi kondensasi diubah menjadi senyawa turunan tanin yaitu theaflavin dan thearubigin. Pada proses ini daun teh berubah warna dari hijau, menjadi coklat muda, lalu coklat tua. Semakin lama teroksidasi, teh menjadi semakin gelap dan sarinya menjadi kurang pahit. Di dalam teh terdapat beberapa jenis katekin, yaitu epigalokatekin galat (EGCG), epigalokatekin (EGC), epikatekin (EC), epikatekin galat (ECG), galokatekin (GC) dan katekin. Khasiat Teh Semua senyawa kimia yang terdapat dalam teh dapat digunakan s ebagai obat. Menurut hasil penelitian diketahui bahwa kandungan unsur kimia pada teh merupakan komponen senyawa yang banyak dibutuhkan oleh tubuh manusia, baik untuk kesehatan maupun nutrisi dan salah satunya sebagai senyawa antibakteri. Senyawa antibakteri adalah zat yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba dan dapat digunakan untuk kepentingan pengobatan infeksi pada manusia, hewan dan tumbuhan. Berdasarkan sifat toksisitas selektif, antibakteri dibedakan menjadi 2 yaitu antibakteri yang bersifat bakteriostatik dan bakterisida. Antibakteri bakteriostatik bekerja dengan cara menghambat perbanyakan populasi bakteri dan tidak mematikan, sedangkan bakterisida bersifat mematikan bakteri. Bakteriostatik dapat bertindak sebagai bakterisida dalam konsentrasi tinggi (Schunack et al dalam Martini H, 2004). Berdasarkan informasi yang diperoleh dari http://www.kompas.com/. tahun 2006 , teh hitam mengandung bahan yang dapat mengurangi terbentuknya plak gigi dan mencegah gigi berlubang. Menurut Otake dalam Kustamiyati (1976) menyatakan bahwa tanin merupakan bahan yang paling mampu menghambat pembentukan glukan oleh enzim glukosiltransferase yang dihasilkan oleh
S.mutans. Mutans sendiri merupakan bakteri dominan penyebab karies gigi . Epigalokatekingalat (EGCG) dan epikatekingalat (ECG) yang terkandung dalam daun teh merupakan bahan yang paling mampu menghambat pembentukan glukan oleh enzim glukosiltransferase. Berdasarkan penelitian yang dilakukan di Universitas Iowa bekerjasama dengan Universitas Swedia yang dibiayai oleh Tea Trade Health Research Association, dibuktikan bahwa meminum teh setiap hari dapat mengurangi terbentuknya plak di gigi dan menghambat pertumbuhan bakteri yang ada di mulut. Streptococcus mutans Bakteri adalah protista yang bersifat prokariot yang khas, bersel tunggal (uniseluler) dan tidak mengandung struktur yang terbatasi membran di dalam sitoplasmanya. Sel-selnya secara khas berbentuk bola (kokus), batang (basilus) atau spiral (spirillum) dan diameternya sekitar 0.51.0 µm serta panjangnya 1.5-2.5 µm. Bakteri Streptococcus mutans merupakan Streptococci yang ditemukan pada plak gigi dan mampu memfermentasi mannitol dan sorbitol. Pada tahun 1924, Clarke mengisolasi organisme dari lubang gigi pada manusia dan organisme tersebut disebut S.Mutans ( Loesche dalam Waras N 2006) . Bakteri yang tergolong bakteri gram positif ini mempunyai ciri bentuk bulat (coccus), membentuk rantai, bersifat heterotrof, hidup secara anaerob fakultatif dan patogen terhadap manusia dan hewan (Gambar 3). S. Mutans merupakan bakteri dominan penyebab karies pada gigi. karies gigi (kavitasi) adalah daerah yang membusuk di dalam gigi, terjadi akibat suatu proses bertahap yang dapat melarutkan email (permukaan gigi sebelah luar yang keras) dan terus berkembang ke bagian dalam gigi sehingga pada akhirnya menyebabkan gigi tanggal.
Gambar 3 Streptococcus mutans.
Metode Pengukuran Antibakteri Antibakteri adalah antimikroba yang dapat menghambat pertumbuhan bakteri dan dapat digunakan untuk kepentingan pengobatan infeksi pada manusia, hewan dan tumbuhan. Pengujian antibakteri dapat dilakukan secara kualitatif menggunakan media agar dan organisme uji. Senyawa antibakteri yang dimasukkan ke dalam media akan berdifusi dan mencegah pertumbuhan organisme uji (Goldberg HS 1569). Menurut Minner & Henegan dalam Wahyudi ZM (1997), teknik pengujian antibakteri dibedakan menjadi 3, yaitu senyawa antibakteri dilarutkan dengan media cair steril kemudian bakteri uji diinokulasikan pada media tersebut, antibakteri dicampurkan dengan media agar kemudian bakteri uji diinokulasikan pada media tersebut dan bakteri uji diinokulasikan pada media agar, kemudian antibakteri ditempatkan pada media kultur tersebut. Pengukuran aktivitas antibakteri dapat dilakukan dengan beberapa metode, di antaranya metode difusi dan metode pengenceran. Metode difusi merupakan metode yang paling umum digunakan (Pelczar & Chan 1986). Metode ini dapat dilakukan dengan tiga cara, yaitu: 1. Metode silinder Silinder steril dengan diameter 8 mm ditetesi larutan uji dan ditempatkan pada permukaan agar yang telah ditanami bakteri uji. Daerah hambat yang terbentuk terlihat sebagai daerah bening di sekeliling silinder. 2. Metode perforasi Media agar ditanami bakteri uji dan selanjutnya pada media tersebut dibuat lubang atau sumur dengan diameter 6 mm dan larutan uji sebanyak 10 µL dimasukkan ke dalamnya. Daerah bening yang terbentuk merupakan daerah hambatannya. 3. Metode Difusi Cakram Metode ini merupakan metode yang paling banyak digunakan dan dikenal sebagai metode Kirby-Bauer. Sejumlah bakteri diinokulasikan pada media agar dan cakram yang mengandung larutan uji atau antibakteri tertentu diletakkan pada permukaan media agar yang telah memadat. Daerah bening sebagai daerah hambatan terbentuk setelah masa inkubasi dan terlihat tidak ditumbuhi bakteri di sekeliling cakramnya. Ekstraksi Suatu senyawa tidak terdapat dalam bentuk murni di alam, maka untuk
memperoleh itu, diperlukan suatu metode yang tepat. Salah satu metode untuk memisahkan senyawa dari suatu bahan alam adalah dengan metode ekstraksi. Ekstraksi adalah proses penyarian bahan dengan menggunakan cairan penyari yang sesuai dan metode yang tepat sehingga hasil yang diinginkan dapat tersari sempurna. Hal-hal yang perlu dipertimbangkan dalam pemilihan pelarut untuk ekstraksi adalah berdasarkan sifat selektivitas, kapasitas, toksisitas dan kemudahan untuk diuapkan, stabil secara fisik dan kimia, bereaksi netral, tidak mudah terbakar, mudah diperoleh dan murah. Metode ekstraksi tergantung dari polaritas senyawa yang akan diekstrak. Suatu senyawa menunjukkan kelarutan yang berbeda-beda dalam pelarut yang berbeda karena keberhasilan proses ekstraksi tergantung pada pemilihan pelarut yang digunakan. BAHAN DAN METODE Tempat dan Waktu Penelitian Penelitian dilakukan di Laborat orium Pusat Studi Biofarmaka, IPB. P engambilan sampel dilakukan di PT Perkebunan Nusantara VIII, Goalpara Sukabumi. Penelitian dilakukan mulai bulan Maret sampai Mei 2006. Bahan dan Alat Bahan-bahan yang digunakan adalah teh var. Assamica klon Gambung dari PTPN VIII Goalpara, Sukabumi, biakan bakteri S.mu tans, yeast extract, tripton, NaCl, bacto agar, tetrasiklin, akuades, metanol absolut, standar asam galat, pereaksi Folin-ciocalteu, Na2CO3 15%, asam asetat dan butanol. Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah oven, inkubator, pipet volumetrik, erlenmeyer, autoklaf, ose, gelas piala, neraca analitik, jangka sorong, gelas ukur, hot plate, magnetic stirrer, labu takar 100 ml, cawan petri, kertas saring, kertas cakram, batang pengaduk, sudip, Halogen Moisture Analyzer (HMA), laminar air-flow, corong gelas, alumunium foil, tip, vorteks, micro pipet, alat penguap putar (Rotavapor), pelat KLT selulosa, jarum ose, lampu uv 254 nm, kapas, lemari es, pipet kapiler, spektrofotometer U-2800 dan bejana KLT.
Metode Penelitian Perlakuan Tahapan Pengolahan Pelayuan. Daun teh dimasukkan ke dalam kotak pelayuan (Whithering throught). Pada bagian bawahnya diberi kipas dengan tujuan untuk menghembuskan angin ke dalam kotak tersebut. Pelayuan dilakukan selama 18 jam pada suhu 32 ºC. Pembalikan pucuk dilakukan sebanyak 2-3 kali dengan maksud untuk meratakan proses pelayuan. Penggilingan. Daun teh digiling dengan menggunakan mesin penggiling Open Top Roller (OTR) yang dilakukan selama 40 menit kemudian dilakukan pengayakan dengan mesin DBN selama 10 menit dilanjutkan dengan penggilingan di mesin Pressure Cup Roller (PCR) selama 40 menit, diayak kembali selama 10 menit dan terakhir dimasukkan ke dalam mesin rotorvane selama 15 menit. Fermentasi. Teh yang telah digiling kemudian ditempatkan di atas nampan (trays ), sehingga enzim-enzim yang ada di dalam daun teh bersentuhan dengan udara, hal ini dilakukan untuk mengoksidasi senyawa katekin menjadi theaflavin dan thearubigin sehingga mempunyai warna dan cita rasa teh yang khas. Pada proses ini daun teh berubah warna dari hijau, menjadi coklat muda, lalu coklat tua, dan perubahan warna daun ini terjadi pada temperatur 28 ºC dan lama waktu fermentasi selama 30 menit. Pengeringan. Teh yang telah mengalami fermentasi kemudian dikeringkan pada mesin dryer yang memiliki pemanas di bawahnya. Pada tahap ini digunakan suhu 102 ºC selama 23 menit. S ortasi. Teh yang yang telah dikeringkan kemudian disimpan di dalam bulker penampung bubuk selama 4 jam dan dihasilkan berbagai mutu teh. Mutu yang dihasilkan berupa mutu 1, 2 dan 3. Analisis Kadar Air Teh dari setiap pengolahan dihitung kadar airnya dengan menggunakan alat Halogen Moisture Analyzer (Gambar 4). Untuk analisis kadar air dari daun teh segar sampai tahap fermentasi, masing-masing daun teh sebanyak 10 gram dimasukkan ke dalam alat Halogen Moisture Analyzer (HMA) selama 20 menit dan suhu yang digunakan adalah 160 ºC , sedangkan untuk tahapan pengeringan dibutuhkan teh sebanyak 5 gram dengan waktu 5 menit dan suhu 105 ºC.
Gambar 4 Halogen moisture analyzer . Ekstraksi 20 gram teh dari berbagai tahapan pengolahan masing-masing dimasukkan ke dalam erlenmeyer kemudian dimaserasi dengan campuran metanol:air (1:1) sebanyak 200 ml dan proses ini diulang sebanyak 3 kali selama 3x24 jam. Larutan kemudian disaring dengan kertas saring dan dipekatkan dengan Rotavapor suhu 40 ºC dan di oven pada suhu 50 ºC sampai menjadi ekstrak kering. Residu yang diperoleh kemudian dihitung rendemennya dan digunakan untuk uji antibakteri. Analisis Kandungan Tanin Membuat Standar Asam Galat. Larutan standar asam galat 0, 5, 10, 25, 50, 100 dan 250 ppm diambil sebanyak 2 ml dan ditambahkan 0.2 ml pereaksi folin-ciocalteu dan 1 ml larutan Na2CO3 15% lalu dikocok hingga rata. Larutan didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 765 nm. Analisis S ampel. 100 µl ekstrak teh (10mg/ml) diambil dan ditambahkan 0.2 ml pereaksi folin-ciocalteu , 2 ml akuades, 1 ml Na2CO3 15% lalu dikocok hingga rata. Larutan didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar kemudian absorbansinya diukur dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 765 nm. Tahapan ini dapat dilihat pada Lampiran 4. Analisis KLT Sebanyak 8 tetes ekstrak pekat dari setiap tahapan pengolahan ditotolkan pada pelat selulosa lalu dibiarkan hingga kering, kemudian dim asukkan ke dalam bejana KLT yang telah berisi eluen butanol:asam asetat:air (2:0.5:1.1) dan dibiarkan sampai eluen merambat naik hingga garis akhir, setelah itu pelat diangkat dan dibiarkan mengering. Analisis spot noda dilakukan dengan
menggunakan sinar uv pada panjang gelombang 254 nm. Setiap bercak yang terdeteksi dilingkari (untuk menentukan diameter/pusatnya) dan kemudian dihitung nilai Rf-nya dengan rumus: Rf = jarak titik pusat spot noda ke titik awal Jarak garis akhir ke titik awal Pengukuran Akti vitas Antibakteri Biakan bakteri Streptococcus mutans ditanam sebanyak satu ose secara steril pada 10 ml media cair, kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC . Biakan tersebut diambil 100 µL dan dicampur ke dalam 10 ml media agar Luria Bertani (LB) suhu 45 ºC, lalu didiamkan pada suhu kamar sampai media agar memadat. Secara steril, kertas cakram diletakkan di atas agar yang telah membeku kemudian ekstrak teh sebanyak 10 µL diteteskan ke permukaan kertas cakram . Cawan petri tersebut diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Zona bening yang terbentuk di sekeliling kertas cakram diukur menggunakan jangka sorong (mm). Kontrol yang digunakan dalam penelitian ini adalah antibiotik tetrasiklin sebagai kontrol positif dan akuades sebagai kontrol negatif. Regenerasi Bakteri Bakteri terlebih dahulu diregenerasi sebelum dipakai untuk uji antibakteri. Hal pertama yang harus dilakukan adalah membuat biakan agar dalam cawan petri yaitu dengan cara menggoreskan biakan stok bakteri ke agar yang mas ih baru kemudian diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Biakan tersebut merupakan awal dari stok bakteri yang telah disimpan pada suhu 4-5 ºC dan dari biakan tersebut diambil satu mata ose kemudian diinokulasikan ke dalam tabung reaksi yang berisi 10 ml media LB cair steril. Tabung tersebut kemudian diinkubasikan di dalam shaker selama 24 jam pada suhu 37 ºC. Analisis S tatistik Analisis statistik dalam penelitian ini menggunakan ANOVA yaitu RAL (rancangan acak lengkap) satu faktor dengan dua kali ulangan kemudian dilanjutkan dengan uji Duncan. Adapun model dari rancangan faktorial dalam RAL ini adalah: Yij = µ + t i + e ij ;
Keterangan: i = Teh yang diproses melalui tahap pemetikan, pelayuan, penggilingan, fermentasi, pengeringan dan sortasi j = ulangan; 1, 2, Dengan: Yij = respon atau nilai pengamatan pada faktor I taraf ke-i dan ulangan ke-j µ = rataan umum t i = pengaruh faktor I taraf ke-i eij = galat atau komponen acak
HASIL DAN PEMBAHASAN Analis is pendahuluan dimulai dengan pengambilan sampel dari pabrik PTPN VIII Goalpara, Sukabumi. Proses diawali dengan pengolahan daun segar melalui tahap pelayuan daun. P elayuan dimaksudkan untuk mengurangi kadar air hingga 70% (persentase ini bervariasi dari satu wilayah dengan yang lain) dan untuk melemaskan daun agar mudah digiling, setelah daun layu kemudian daun digiling. Penggilingan bertujuan untuk mempertemukan senyawa aktif yaitu katekin dengan enzim polifenol oksidase dengan jalan merusak membran dan dinding sel sehingga cairan sel keluar ke permukaan pucuk dan bertemu dengan oksigen dari udara sehingga proses fermentasi dapat berlangsung secara merata dan peristiwa ini merupakan awal oksidasi senyawa polifenol secara enzimatis yang akan membentuk mutu teh (Kustamiyati 1975). Tahap berikutnya adalah pengeringan yang akan menghentikan proses fermentasi dan mendapatkan hasil akhir yang kering, mudah untuk ditangani, dapat disimpan lama dan mudah untuk disajikan. Tahap terakhir adalah sortasi yang dapat membedakan teh berdasarkan jenis dan mutunya, karena teh hasil pengeringan masih berupa campuran dari berbagai jenis maka untuk dapat diterima oleh pasar, teh kering tersebut harus dipisahkan. Pada tahap sortasi ini, daun-daun dipisahpisahkan menurut ukuran karena selama proses produksi banyak daun teh yang robek atau remuk sehingga teh akhir terdiri atas daun utuh, daun robek, dan partikel-partikel yang lebih kecil. Mutu teh yang diteliti ada tiga jenis, yaitu Broken Orange Pekoe Fanning (BOPF), Broken Orange Pekoe (BOP) dan dust (Partikel kecil) dan ket iganya dapat dibedakan dari bentuk daun teh yang dihasilkan. BOP berbentuk serpihan daun kasar, BOPF berbentuk serpihan daun namun lebih halus
dan dust berbentuk partikel-partikel kecil yang halus dan sering digunakan untuk pembuatan teh celup. Ketiga jenis teh tersebut sebagian besar terdiri dari pucuk dan daun muda. Analisis Kadar Air Kadar air setiap pengolahan teh diukur dengan Halogen Moisture Analyzer (HMA) yang dilakukan di Pabrik teh Goalpara, Sukabumi. Penentuan kadar air berguna untuk mengetahui ketahanan suatu bahan dalam penyimpanannya dan merupakan cara penanganan terbaik bagi suatu bahan untuk menghindari pengaruh aktivitas mikroba. Dilihat dari hasil pengeringan, teh hitam mengandung kadar air sebesar 2.08% jumlah tersebut sesuai dengan persyaratan kadar air yang baik yaitu kurang dari 10 %, hal ini dikarenakan bahan akan lebih tahan disimpan dalam jangka waktu yang relatif lama sehingga kemungkinan rusak terkena jamur pada saat penyimpanan sangat kecil. Kadar air terbesar diperoleh dari sam pel daun segar yang belum mengalami pengolahan yaitu sebesar 78.00%, salah satu faktor tingginya kadar air tersebut dikarenakan faktor lingkungan yaitu musim. Secara umum tanaman mengandung air 8595% dan menurut Keegel dalam Sukasman (1997) pucuk teh berbeda kadar airnya pada setiap musim, yaitu pada musim kemarau kadar airnya 70% dan musim penghujan 83%. Perbedaan ini dikarenakan produksi pucuk bersifat musiman, artinya pada musim penghujan produksinya naik dan pada musim kemarau turun. Pemetikan dilakukan pada bulan Maret dan pada saat itu dikategorikan sebagai musim penghujan sehingga nilai kadar air daun teh relatif tinggi. Kadar air yang diperoleh pada setiap proses pengolahan ditunjukkan pada Tabel 1. Tabel 1 Hasil analisis kadar air pada setiap proses pengolahan teh Tahapan pengolahan Kadar air % (b/b) Daun segar 78.00 Pelayuan 62.07 Penggilingan 63.60 Fermentasi 55.87 Pengeringan 2.08 BOPF 3.26 BOP 2.96 Dust 4.10 Ekstraksi Menurut Harborne (1987) untuk mengekstraksi tanin total dalam suatu jaringan
tumbuhan diperlukan suatu pelarut yang mampu melarutkan senyawa-senyawa polar khususnya tanin. Penyarian daun teh pada setiap pengolahan dilakukan dengan metode maserasi menggunakan dua macam pelarut polar yaitu metanol dan air. Air merupakan pelarut yang baik untuk sebagian besar tanin, namun pelarut yang terbaik adalah campuran pelarut organik dan air. Umumnya campuran pelarut yang digunakan adalah aseton air atau metanol:air (Scalbert dalam Mulyadi 1996). Pemilihan pelarut metanol dan air didasarkan karena keduanya mudah bercampur pada segala perbandingan, memberikan perlindungan yang terpadu terhadap kontaminasi mikroba dan dapat melarutkan tanin, hal ini dikarenakan senyawa tanin bersifat polar dan hanya akan larut jika digunakan pelarut yang bersifat polar sebagai bahan penyarinya. Selain itu, hampir semua senyawa pada jaringan tumbuhan dapat terekstraksi oleh metanol (Harborne dalam Gunawan E, 2003). Menurut Kurnama (1984) penarikan zat ekstraktif dari suatu jenis tumbuhan dari berbagai pelarut yang tingkat kepolarannya berbeda seperti eter, kloroform, aseton, etanol, metanol dan etil asetat semuanya bertujuan untuk memperoleh hasil yang optimal, baik dalam jumlah senyawa yang terkandung dalam ekstrak dan ditinjau dari segi polaritas, air dan metanol merupakan pelarut yang mempunyai tingkat kepolaran yang tinggi (Moelyono 1994). Bahan yang akan dimaserasi sebanyak 20 gram direndam dalam campuran metanol:air (1:1) selama 24 jam dan perlakuan diulang sampai 3 kali (Harborne 1987). Maserasi digunakan karena proses ini mempunyai efektivitas penyerapan yang cukup tinggi terhadap zat-zat aktif yang terdapat di dalam daun teh, termasuk tanin. Cairan hasil maserasi kemudian diuapkan dengan penguap putar (Rotavapor ) sehingga diperoleh ekstrak kasar teh yang pekat dan berwarna coklat dan untuk mengeringkannya, kedelapan sampel di oven pada suhu 50 ºC. Perendaman pada sampel 1 (daun segar) menghasilkan warna coklat kehijauan, sedangkan sampel 2, 3, 4, 5, 6, 7 dan 8 menghasilkan larutan berwarna coklat pekat. Dilihat dari warna larutan, karena sampel 1 masih berupa daun segar sehingga warna ekstrak menunjukkan zat warna daun atau klorofil dan warna coklat yang terbentuk disebabkan keluarnya tanin dari dalam vakuola saat penggerusan sehingga warna
akhir yang terbentuk pada ekstrak adalah coklat kehijauan. Kualitas teh hitam ditentukan oleh warna yang terbentuk, sehingga adanya klorofil atau warna hijau pada teh hitam dianggap dapat menurunkan kualitasnya. Menurut Kustamiyati (1976), apabila tingginya intensitas warna hijau pada teh hitam diakibatkan oleh tingginya intensitas warna hijau daun segar, maka kandungan klorofil yang tinggi pada daun segar dapat menurunkan potensi kualitasnya. Sampel 2-8 menunjukkan warna coklat dengan intensitas warna yang semakin pekat setelah proses akhir yaitu sortasi berupa coklat kehitaman. Warna tersebut merupakan gabungan warna tanin yang teroksidasi yaitu theaflavin yang berwarna merah keemasan yang juga memberikan rasa khas pada teh hitam serta thearubigin yang berwarna kecoklatan (brownish). Menurut teori warna, struktur tanin dengan ikatan rangkap dua yang terkonjugasi pada polifenol sebagai pengemban warna (kromofor) dan adanya gugus OH sebagai pengikat warna (auksokrom) dapat menyebabkan warna coklat. Pemekatan bertujuan untuk mengetahui % rendemen sekaligus mempermudah dalam hal penyimpanannya bila dibandingkan dalam keadaan ekstrak yang masih kental (masih terdapat pelarut). Perbedaan rendemen pada kedelapan sampel salah satunya dikarenakan kandungan senyawa bioaktif yang terekstrak oleh pelarut metanol:air, sehingga hasil rendemen yang diperoleh pun bervariasi. Rendemen yang diperoleh dapat dilihat pada Tabel 2. Persentase rendemen dihitung dari bobot ekstrak kering hasil ekstraksi dengan melihat bobot basah sampel awal dan kandungan air dari setiap pengolahan yang dibandingkan dengan kandungan air daun segar. Tabel 2 Hasil rendemen ekstrak setiap pengolahan teh. Tahapan Rendemen Koreksi pengolahan (% b/b) terhadap daun Segar (%) Daun segar 11.27 11.27 Pelayuan 11.04 6.40 Penggilingan 12.74 7.70 Fermentasi 18.14 9.05 Pengeringan 28.80 6.47 BOPF 28.22 6.42 BOP 25.62 5.81 Dust 30.67 7.04
Analisis Kandungan T anin Kandungan tanin dalam setiap pengolahan diuji dengan menggunakan metode fenol total dengan menggunakan pereaksi folin-ciocalteu dan standar asam galat. Penentuan fenol total digunakan untuk menentukan kandungan dari senyawa tanin yang terdapat pada setiap sampel teh . Metode ini mempunyai kelebihan di antaranya penampakan warna yang lebih baik, dapat memperkecil perbedaan pada saat pengujian dan lebih spesifik, begitupun dengan standar asam galat yang digunakan secara ekonomis lebih murah dibandingkan dengan standar yang lain. Dilihat dari Tabel 3, daun segar memiliki kandungan tanin sebesar 0.13%. Kandungan tersebut berasal dari senyawa yang terukur pada saat pengujian, khususnya senyawa tanin seperti katekin, EC, ECG, EGC, ECGG dan GC yang masih aktif berada pada sel daun. Pada daun yang telah layu, nilai tanin yang diperoleh sebesar 0.07% dan dalam hal ini penurunan kandungan tanin dikarenakan pengaruh dari preparasi sampel daunnya. Pada tahap ini, daun dilayukan selama 18 jam sehingga kadar air berkurang sebesar 15.93% dan daun yang telah layu lebih sulit untuk dihaluskan sehingga senyawa yang terdapat dalam vakuola daun belum keluar seluruhnya. Pada tahap penggilingan, daun digiling dengan beberapa mesin giling menyebabkan daun lebih kecil bentuknya dan banyak sel yang pecah, sehingga banyak tanin yang keluar dari dalam vakuola sel daun dan ketika terukur menghasilkan nilai tanin yang lebih besar dari sampel 2. Tahap fermentasi menghasilkan kandungan tanin sebesar 0.15% dan pada tahap pengeringan, daun dikeringkan dengan mesin yang menyebabkan kadar airnya berkurang sampai 2.08%, hal ini memungkinkan pemekatan senyawa yang terdapat di dalamnya, selain itu karena daunnya telah berbentuk serbuk, sehingga pada saat penyarian senyawa tanin mudah terekstrak dan ketika terukur, maka kandungan taninnya adalah sebesar 0.12%. Pada tahap sortasi, dust memiliki kandungan tanin yang lebih besar dibandingkan jenis BOPF dan BOP. Dust menghasilkan serbuk daun yang lebih halus dibandingkan dengan BOPF dan BOP yang daunnya masih berupa serpihan kasar. Halusnya daun akan memperbesar luas permukaan selnya sehingga reaksi akan lebih sempurna dan menghasilkan kandungan tanin yang besar.
Nilai koreksi merupakan jumlah dari senyawa tanin yang terdapat dalam setiap sampel ekstrak teh yang dibandingkan terhadap daun segar. Kandungan tanin dapat diprediksi oleh besarnya rendemen. Sampel yang diekstrak oleh metanol dan air akan menentukan nilai rendemen sehingga mempengaruhi terhadap jumlah dari senyawa tanin yang diperoleh. Hasil analisis statistik melalui uji lanjut Duncan menyatakan bahwa daun segar ketika dibandingkan dengan tahap pelayuan sampai tahap sortasi yaitu BOPF dan BOP, nilai yang diperoleh berbeda nyata namun bila dibandingkan dengan dust maka nilainya tidak berbeda nyata. Tabel 3 Hasil uji tanin teh hitam Tahapan Kandungan Koreksi pengolahan tanin (%) terhadap daun segar (%) Daun segar 0.128 0.13 Pelayuan 0.115 0.07 Penggilingan 0.173 0.11 Fermentasi 0.300 0.15 Pengeringan 0.514 0.12 BOPF 0.492 0.11 BOP 0.438 0.10 Dust 0.541 0.12 Analisis KLT Kromatografi adalah suatu metode pemis ahan yang dapat digunakan untuk memisahkan suatu komponen dimana komponen yang akan dipisahkan didistribusikan di antara dua fase yaitu fase diam dan fase gerak (Sastrohamidjoyo dalam Srirahayu 2003). Pemisahan senyawa tanin dilakukan dengan menggunakan salah satu teknik kromatografi yaitu kromatografi kertas, kromatografi lapis tipis dan kromatografi cair kinerja tinggi. Cara terbaik untuk memisahkan dan mengidentifikasi senyawa tanin adalah dengan kromatografi lapis tipis (Harborne 1987). Metode ini memiliki beberapa kelebihan di antaranya metodenya sangat sederhana, praktis, proses kerja singkat, sampel dan pelarut fase gerak (eluen) yang digunakan ekonomis dan analisis dapat dilakukan dengan alat sederhana sehingga penggunaannya mudah. Pada KLT diperlukan pemilihan fase diam dan fase gerak. Fase diam berupa lapisan yang dibuat dari penjerap khusus untuk KLT dan penjerap yang umum digunakan adalah silika gel, alumunium oksida dan selulosa.
Sedangkan fase gerak merupakan medium angkut yang terdiri atas satu atau beberapa pelarut. Pemilihan fase gerak (eluen) harus disesuaikan dengan senyawa yang dicari dan senyawa tanin biasanya dipisahkan menggunakan campuran butanol:asam asetat:air. Noda sampel dan standar yang terbentuk dilihat di bawah lampu uv pada panjang gelombang 254 nm dan jarak diukur dalam Rf. Nilai Rf adalah perbandingan jarak yang ditempuh senyawa dengan jarak yang ditempuh pelarut. Sampel teh ditotolkan pada pelat dan dielusi dalam bejana oleh eluen butanol:asam asetat:air. Setelah elusi selesai, pelat dikeringkan dan dilihat di bawah lampu uv pada panjang gelombang 254 nm. Identifikasi terhadap kedelapan ekstrak menunjukkan hasil yang berbeda-beda, hal ini ditunjukkan pada Tabel 4. Spot noda yang terbentuk pada panjang gelombang 254 nm berupa bercak lembayung. Sinar uv digunakan untuk mendeteksi hasil KLT pada selulosa, karena pada lapisan penjerap tersebut mengandung indikator fluorosensi yang akan membuatnya bersinar jika dikenai sinar yang memiliki panjang gelombang yang tepat pada daerah UV sehingga tidak perlu perlakuan kimia lebih lanjut yang diperlukan dan hal ini diperlukan untuk penampakan bercak yang tidak terlihat oleh mata. Pengamatan di bawah lampu uv 254 nm dan dilihat dari Gambar 5, menunjukkan pada kedelapan sampel terbentuk spot noda dengan nilai Rf yang hampir mirip dengan standar dengan nilai berturut -turut sebesar 0.6548, 0.6667, 0.6548, 0.6786, 0.6428, 0.6428, 0.6310, 0.6190. Begitupun dengan warna noda yang terbentuk menunjukkan warna yang sama dengan standar yaitu bercak lembayung walaupun dengan intensitas warna yang berbeda-beda dan warna tersebut merupakan warna dari senyawa tanin ketika terdeteksi dengan sinar uv pendek (Haslam dalam Harborne 1987). Tabel 4 Hasil uji KLT Tahapan Spot noda pengolahan yang dihasilkan Daun segar ++ Pelayuan ++ Penggilingan ++ Fermentasi ++ Pengeringan ++ BOPF ++++ BOP ++++ Dust +++
Dilihat pada sampel 1 (daun segar), 2 (pelayuan), 3 (penggilingan) terbentuk pula spot noda dengan nilai Rf yang berbeda dengan standar yaitu 0.9524, 0.9167 dan 0.9404. Adanya perbedaan tersebut menunjukkan adanya senyawa lain yang ikut terelusi dan senyawa-senyawa tersebut memiliki kepolaran yang lebih tinggi dari standar sehingga menghasilkan nilai Rf yang besar. Pada sampel 4 (tahap fermentasi) dan 5 (pengeringan), nilai Rf yang dihasilkan sebesar 0.3690 dan 0.5357. Kedua senyawa tersebut memiliki nilai Rf yang lebih kecil dari senyawa yang terbentuk pada sampel 1, 2, 3 dan kemungkinan senyawa baru tersebut memiliki sifat kepolaran yang leb ih rendah dari standar. Sampel 6 (BOPF) menghasilkan nilai Rf yang berbeda dengan standar yaitu sebesar 0.2738, 0,3928, 0.8452 dan senyawa-senyawa baru tersebut terbentuk pada saat tahap sortasi. Begitupun dengan nilai yang dihasilkan oleh sampel 7 (BOP) dan 8 (dust), spot noda yang dihailkan lebih banyak dari sampel 1, 2, 3, 4 dan 5. Perbedaan tersebut dikarenakan pada tahap sortasi, daun teh kering mengalami pengayakan lebih lanjut yang bertujuan untuk menyeleksi daun sehingga dapat dibedakan menurut mutunya. Pada tahap sortasi, dihasilkan teh dengan jenis BOPF, BOP dan dust yang merupakan jenis mutu pertama dan teh yang dihasilkan hanya berisi pucuk dan daun muda saja, sedangkan daun tua dan tangkai yang ikut terolah akan dipisahkan sebagai mutu 2 dan 3. Selain itu, ketiga jenis teh tersebut memiliki ukuran daun yang lebih kecil dibandingkan pada saat pengeringan sehingga senyawa yang terbentuk pada pelat kromatogram lebih banyak dibandingkan sampel lainnya. Nilai Rf pada semua tahap pengolahan memberikan hasil yang positif, artinya spot noda yang terbentuk relatif mendekati standar, namun kedelapan sampel juga menunjukkan nilai Rf yang berbeda dengan standar. Perbedaan nilai Rf sampel dengan standar dikarenakan dengan semakin meningkatnya kepolaran eluen, maka senyawa yang akan terbawa lebih cepat adalah senyawa yang lebih bersifat polar . Senyawa polar yang berinteraksi kuat dengan fase gerak akan terelusi lebih cepat dan menghasilkan nilai Rf yang besar. Interaksi yang kuat ini disebabkan adanya kemir ipan kepolaran dengan fase gerak. Sedangkan senyawa yang kepolarannya lebih rendah dari standar akan terelusi lebih lama dan menghasilkan nilai Rf yang kecil.
Pembuktian lain dengan cara scanning panjang gelombang dari range 200-765 nm. Scanning ini merupakan pengujian secara kualitatif pola spektrum senyawa tanin menggunakan spektroskopi uv-vis yang menunjukkan daerah puncak panjang gelombang standar asam galat yang dibandingkan dengan panjang gelombang kedelapan sampel. Tujuan dari pengujian ini adalah menguji adanya senyawa tanin dalam ekstrak yang dibandingkan terhadap standar asam galat dilihat dari panjang gelombang yang dihasilkan. Hasil scanning membuktikan bahwa kedelapan sampel berada pada panjang gelombang yang sama dengan standar, yaitu pada panjang gelombang 200-250 nm, tidak adanya puncak serapan panjang gelombang kemungkinan tanin memiliki range panjang gelombang yang luas. Kedelapan sampel juga memberikan serapan pada panjang gelombang 400-500 nm, kemungkinan adanya kenaikan kurva pada panjang gelombang tersebut menunjukkan bahwa memang ada senyawasenyawa lain yang terdapat di dalam ekstrak
Gambar 5
Hasil KLT dari berbagai tahap pengolahan.
Uji Aktivitas Antibakteri Uji ini dilakukan untuk mengetahui potensi antibakteri ekstrak kasar teh terhadap S.mutans. Dilihat dari Tabel 5 mulai dari tahapan pengolahan pertama yaitu daun segar, pelayuan, penggilingan, fermentasi, pengeringan sampai tahap sort asi mengalami penurunan bahkan tidak lagi berfungsi sebagai senyawa antibakteri. Menurut Sumaryono W (2003), Polifenol aktif menghambat serangan S.mutans penyebab kerusakan gigi, namun polifenol teh bukanlah senyawa yang stabil terhadap pengaruh oksidasi, cahaya dan perubahan kimia, apabila teroksidasi maka strukturnya akan berubah sehingga fungsinya sebagai komponen biomedis akan menurun bahkan hilang.
Daun segar memiliki aktivitas sebagai senyawa antibakteri yang lebih besar dari tahapan pengolahan lainnya yaitu sebesar 3.85 mm pada konsentrasi 5000 ppm dan 4.65 mm pada 10000 ppm, hal ini dikarenakan pada sampel belum adanya pengolahan baik tanpa atau dengan mesin olah. Senyawa tanin yang terdapat dalam daun segar masih aktif dan menunjukkan fungsinya sebagai senyawa antibakteri. Tahap pelayuan daun menghasilkan nilai zona hambat sebesar 2.80 mm dan 3.80 mm, kedua sampel dari konsentrasi berbeda tersebut nilainya lebih kecil dibandingkan dengan sampel daun segar. Pelay uan daun segar selama 18 jam akan mempengaruhi aktivitas tanin sehingga fungsinya sebagai senyawa antibakteri menurun. Pada tahap fermentasi, akibat proses oksidasi enzimatis, menyebabkan rusaknya kandungan senyawa aktif tanin (termasuk epigalokatekin galat) yang berfungsi sebagai senyawa antibakteri. Hal tersebut dibuktikan dengan pengujian terhadap bakteri S.mutans dengan konsentrasi 5000 dan 10000 ppm dimana tidak adanya zona hambat yang terbentuk. Menurut Suriawiria dalam Rahmawati R (2006), pengukuran kekuatan antibiotikantibakteri didasarkan pada metode Davis Stout, yang menyatakan bila diameter zona bening lebih kecil atau sama dengan 5 mm menunjukkan aktivitas antibakteri lemah, diameter zona bening 5-10 mm menunjukkan aktivitas antibakteri sedang, diameter zona bening 10-20 mm menunjukkan aktivitas antibakteri kuat dan diameter zona bening lebih besar atau sama dengan 20 mm
menunjukkan aktivitas antibakteri sangat kuat. Dilihat dari gambar 6, ternyata sampel teh dengan konsentrasi 5000 dan 10000 ppm hanya dapat menunjukkan aktivitas antibakteri yang lemah. Hasil uji Duncan menyatakan pada konsentrasi 5000 ppm dan 10000 ppm, antara daun segar dengan daun yang dilayukan memiliki nilai zona hambat yang tidak berbeda nyata, namun bila kedua sampel tersebut dibandingkan dengan daun yang digiling maka nilai zona hambatnya akan berbeda nyata. Ketiga sampel daun teh ketika dibandingkan dengan standar tetrasiklin akan memiliki nilai zona hambat yang berbeda nyata. Perbedaan nilai zona hambat pada setiap pengolahan mencerminkan kandungan senyawa aktif yang terkandung dari masingmasing sampel. Tetrasiklin merupakan antibiotik berspektrum luas yang berpotensi menghambat bakteri baik gram positif maupun gram negatif, bersifat bakteriostatik dan mekanisme kerjanya yang menghambat biosintesis protein sel. Pada penelitian ini antibiotik tersebut menunjukkan aktivitas antibakteri yang sedang dengan zona penghambatan sebesar 12.85 mm untuk konsentrasi 2500 ppm, 13.15 mm untuk 5000 ppm dan 15.85 mm untuk 10000 ppm. Melalui uji statistik diperoleh hasil bahwa pengolahan daun teh menjadi teh hitam akan mempengaruhi daya hambatnya sebagai senyawa antibakteri. Daun segar yang belum mengalami pengolahan lebih berpotensi sebagai senyawa antibakteri, namun seiring dengan pengolahan menjadi teh hitam, maka aktivitas senyawa-senyawa yang berpotensi sebagai antibakteri pada daun teh menjadi berkurang.
20 Zona Hambat (mm)
Tabel 5 Hasil uji daya hambat ekstrak teh terhadap S.mutans Sampel 2500 5000 10000 ppm ppm ppm Zona Zona Zona hambat hambat hambat (mm) (mm) (mm) 1 3.85 4,65 2 2.80 3.80 3 1.15 2.30 4 5 6 7 8 Tetrasik 12.85 13.15 15.85 lin (+) Air (-)
5000
15
10000
10 5 10000 Konsentrasi 5000 (ppm)
0 1
2 Sampel
3
4
Gambar 6 Zona hambat antibakteri (mm) dari daun segar, pelayuan dan penggilingan daun teh konsentrasi 5000 dan 10000 ppm.
SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Setiap pengolahan teh diuji kandungan fenol total termasuk di dalamnya adalah senyawa tanin, dengan nilai berturut-turut 0.13, 0.07, 0.11, 0.15, 0.12, 0.11, 0.10 dan 0.12%. Nilai rendemen ikut mempengaruhi terhadap kandungan tanin yang diperoleh. Dalam hal ini keduanya berkorelasi positif, artinya metode ekstraksi secara maserasi dapat digunakan untuk mengisolasi tanin sehingga nilai rendemennya dapat dijadikan parameter untuk menentukan kandungan tanin yang diperoleh. Pengujian terhadap bakteri S. Mutans menunjukkan bahwa daun segar, daun yang dilayukan dan daun yang digiling memiliki zona hambat sebesar 3.85, 2.80, 1.15 mm untuk konsentrasi 5000 ppm dan 4.65, 3.80 dan 2.30 mm untuk konsentrasi 10000 ppm. Peristiwa oksidasi enzimatis pada saat fermentasi akan mempengaruhi terhadap aktivitasnya sebagai senyawa antibakteri sehingga akan mempengaruhi terhadap hasil akhir yang diperoleh. Saran Berdasarkan hasil penelitian, perlu dilakukan isolasi dan pemurnian untuk ke-8 sampel sehingga diperoleh senyawa turunan tanin yang benar-benar murni. Penelitian terhadap klon teh hitam yang lain perlu dilakukan karena klon-klon yang berbeda mengandung tanin yang berbeda pula. Diperlukan penelitian lebih lanjut untuk mengetahui potensi tanin sebagai senyawa antibakteri terutama pada bakteri gram negatif sehingga bisa diaplikasikan untuk proses industri sebagai senyawa antibakteri yang potensial. DAFTAR PUSTAKA Bokuchava MA. 1969. Advances In Food Research. London: Academic Pr.
Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Goldberg HS. 1959. Antibiotics: Their Chemistry and Non-Medical Uses. New York: Van Nostrand Company. Gritter RJ. 1985. Pengantar Kromatografi. Padmawinata K, Penerjemah; Bandung: ITB Pr. Terjemahan dari: Introduction To Chromatography. Harborne. 1987. Metode Fitokimia. Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan. Padmawinata K, Soediro E, Penerjemah; Bandung: ITB Pr. Terjemahan dari: Phytochemical methods. Hart H. 1983. K imia Organik . Achmadi S, Penerjemah; Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari: Organic Chemistry. Hudayanti M. 2004. Aktivitas antibakteri rimpang temulawak (Curcuma xanthorrhiza Roxb.) [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Kurnama. 1984. Penelitian daya antibakteri dan antijamur dari daun Plumbago zeylanica linn dengan cara perforasi dan usaha untuk mendapatkan komponen aktifnya [tesis]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjajaran. Kustamiyati. 1975. Pengolahan t eh wangi. Jurnl Pusat Penelitian Teh dan Kina. 4:241-248. Kustamiyati. 1976. Pendugaan potensi kualitas dalam teh hitam melalui daun segarnya. Jurnal Pusat Penelitian Teh dan Kina . 2:115 -122. Moelyono. 1994. Studi fit okimia fraksi antidiare daun jambu (Psidium guajava L) [skripsi]. Bandung: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Padjajaran.
Darmawijaya. 1982. Klasifikasi keserasian tanah bagi tanaman teh di indonesia. Jurnal Pusat Penelitian Teh dan Kina. 2:26-33.
Pelczar MJJr, Chan ECS. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Volume ke-1,2. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, Penerjemah; Jakarta: UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology.
Gunawan E. 2003. Uji ekstrak metanol dan kloroform daun jati belanda terhadap konsistensi aktivitas lipase dan karakterisasi ekstrak. [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu
Rahmawati F. 2006. Aktivitas antibakteri daun geranium (Geranium homeanum. Turez) [s kripsi]. Bogor: Fakultas
Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Sanderson GW. 1964. The Chemical Composition of Fresh Tea Flush Affected by Clone and Climate. London: Oxford University Pr. Sukasman. 1997. Peran suhu, kelembaban udara pada budidaya teh dan faktor-faktor yang berpengaruh. Jurnal Pusat Penelitian Teh dan Kina 8:55-72. Sumaryono W. 2003. Produksi metabolit sekunder tanaman s ecara bioteknologi. Di dalam: Peranan Tanaman Obat dalam Industri. Prosiding Seminar Nasional Tumbuhan Obat Indonesia XXIII; Jakarta, 25-26 Mar 2003. Jakarta: Perhimpunan Peneliti Obat Alami. hlm 32-34. Srirahayu. 2003. Isolasi, pemurnian, dan uji aktivitas antibakteri senyawa sinensetin dari ekstrak daun kumis kucing (Orthosiphonis aristatus) [s kripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Waras N. 2006. Kandungan xanthorrizol temulawak (Curcuma xanthorriza Roxb ) pada berbagai cara masa t anam [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Wahyudi ZM. 1997. Ekstraksi dan uji aktivitas antibakteri s enyawa aktif p ada batang tumbuhan karumbi (Homalanthus populnea O.K.) [s kripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor.
LAMPIRAN
Lampiran 1 Tahapan penelitian
Daun teh segar
Pelayuan
Penggilingan
Fermentasi
Pengeringan
Sortasi
Ekstraksi teh
Peremajaan bakteri Pengukuran fenol total secara spektrofotometri
Uji KLT
Scanning panjang gelombang senyawa tanin
Uji aktivitas antibakteri
Lampiran 2 Pengolahan teh hitam
Daun teh segar
Pelayuan Suhu 32 ºC selama 18 jam
Penggilingan ( OTR 40 menit) OTR 1
OTR 2
OTR 3
OTR 4
OTR 5
OTR 6
Pengayakan (DBN) 10 menit
PCR (40 menit)
Pengayakan (DBN) 10 menit
Rotorvane ( 15 menit)
F ermentasi Suhu 28 ºC, 140 menit
Pengeringan Suhu 112 ºC selama 23 menit Sortasi
Lampiran 3 Nilai rendemen ekstrak Tahap
Bobot
Bobot
pengolahan
sampel
kosong
(g)
vial (g)
Bobot vial +
Bobot
Rendemen
ekstrak (g)
(rerata)
ekstrak (g)
(%)
Koreksi terhadap daun Segar (%)
Daun segar
20.00
36.5499
38.8564
2.3065
Ulangan
20.00
37.3195
39.5223
2.2028
Pelayuan
20.00
36.4530
38.7650
2.3120
Ulangan
20.00
37.5397
39.6428
2.1031
Penggilingan
20.00
37.2027
39.7960
2.5933
Ulangan
20.00
36.9981
39.5020
2.5039
Fermentasi
20.00
37.6032
41.1724
3.5692
Ulangan
20.00
37.8560
41.5447
3.6887
Pengeringan
20.00
36.8133
42.5990
5.7857
Ulangan
20.00
37.3743
43.1080
5.7337
Sortasi: BOPF
20.00
37.6529
43.3140
5.6611
Ulangan
20.00
37.4917
43.1173
5.6256
BOP
20.00
37.6251
42.7445
5.1194
Ulangan
20.00
37.8355
42.9631
5.1276
DUST
20.00
37.4215
43.3225
5.9010
ulangan
20.00
36.6296
42.9980
6.3684
Contoh perhitungan: Rendemen daun segar
= Bobot ekstrak daun segar (rerata) x 100% Bobot sampel = 2.2547 g x 100% 20 g = 11.27%
Koreksi nilai rendemen tahap pelayuan terhadap daun segar : Kandungan tanin (x) = bobot sampel (g) (100 – kadar air daun layu %) x 100% ( 100 – kadar air daun segar %) = 20 g ( 100% - 62.07%) = 34.48 gram (100-78%) Persentase rendemen = bobot ekstrak (rerata) x 100% Kandungan tanin (g) = 2.2076 g x 100% = 6.40% 34.48 g
11.27
11.27
11.04
6.40
12.74
7.70
18.14
9.05
28.80
6.47
28.22
6.42
25.62
5.81
30.67
7.04
Lampiran 4 Tahapan pengujian tanin dari pengolahan teh hitam
Kurva standar asam galat 0.5 g Asam galat ditambahkan 10 ml etanol
dikocok
Ditera dengan akuades dalam labu takar 100 ml
Dibuat pengenceran larutan
5ppm 10ppm
25ppm 50ppm 100ppm
250ppm
@ 0.2ml folin-cioclteu, 1 ml Na2CO 3 15%
Didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar
Diukur absorbansinya pada ?=765 nm
Pembuatan sampel 100 µl ekstrak teh (10mg/ml) dari berbagai tahapan pengolahan @ ditambahkan 0.2 ml folin-ciocalteu @ ditambahkan 2 ml akuades @ ditambahkan 1 ml Na2CO3 15% Didiamkan selama 2 jam pada suhu kamar Diukur absorbansinya pada ?=765 nm
Kandungan tanin (mg/l)
Lampiran 5 Kurva standar asam galat Standar (ppm)
Absorbans
Konsentrasi (mg/l)
0
0.000
0
5
0.069
5
10
0.084
10
25
0.135
25
50
0.367
50
100
0.416
100
250
1.028
250
Kurva hubungan antara konsentrasi asam galat (mg/l) dengan absorbans 1,2
Absorbans
1 0,8 0,6
y=
39x 0,00
2R 067 + 0,
2
2 978 = 0,
0,4 0,2 0 0
50
100
150
200
250
300
Konsentrasi (mg/l
Lampiran 6 Data pengujian kandungan tanin sampel teh Tahap
Absorbans
pengolahan
Konsentrasi
Kandungan
Koreksi
(mg/l)
Tanin (%)
terhadap daun segar (%)
Daun segar
0.5020
113.5
0.128
0.13
Pelayuan
0.4645
104
0.115
0.07
Penggilingan
0.5335
135.5
0.173
0.11
Fermentasi
0.7125
165.5
0.300
0.15
Pengeringan
0.7650
178.5
0.514
0.12
Sortasi: BOPF
0.7485
174.5
0.492
0.11
BOP
0.7230
171
0.438
0.10
Dust
0.7575
176.5
0.541
0.12
Lampiran 6 (Lanjutan) Contoh perhitungan kandungan tanin pada tahap pelayuan: Kandungan tanin daun layu = 0.104 g x 100% = 1.04% 10 g = 1.04 % x 2. 2076 g = 0.0230 g 100% = 0.0230 g x 100% =0.115% 20 g
Koreksi terhadap daun segar = kandungan tanin daun layu x bobot sampel daun segar 100% = 0.115% x 20 g = 0.0230 g 100% = 0.0230 g x 100% = 0.07% 34.48 g
Lampiran 8 Data hasil scanning panjang gelombang dari 200-765 nm
Lampiran 7 Data hasil KLT Tahap
Rf1
Rf2
Rf3
Rf4
Standar
0.6548
-
-
-
Sampel 1
0.6548
0.9524
-
-
Sampel 2
0.6667
0.9167
-
-
Sampel 3
0.6548
0.9404
-
-
Sampel 4
0.3690
0.6786
-
-
Standar
0.6786
-
-
-
Sampel 5
0.5357
0.6428
-
-
Sampel 6
0.2738
0.3928
0.6428
0.8452
Sampel 7
0.3690
0.4286
0.6310
0.8452
Sampel 8
0.3571
0.4167
0.6190
-
pengolahan
Lampiran 9 Komposisi media LB (Luria Bertani) Media
komposisi
(g/L)
LB cair
Yeast extract
5g
Tripton
10 g
NaCl
5g
Akuades
1L
Yeast extract
5g
Tripton
10 g
NaCl
5g
Bacto agar
20 g
Akuades
1L
LB padat
Lampiran 10 Pembuatan media Media cair LB (Luria bertani) 0.1 gram yeast extract, 0.2 gram tripton dan 0.1 gram NaCl dilarutkan dalam 20 ml akuades, kemudian dipanaskan sambil dikocok dengan magnetic stirrer sampai homogen. Ketiga campuran bahan tersebut dimasukkan ke dalam labu erlenmeyer dan mulut erlenmeyer ditutup dengan menggunakan kapas dan alumunium foil kemudian disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 2 atm, suhu 121 ºC selama 20 menit. Media padat LB (Luria bertani) 1 gram yeast extract , 2 gram tripton, 1 gram NaCl dan 4 gram bacto agar dilarutkan dalam 200 ml akuades dimasukkan ke dalam erlenmeyer, kemudian dipanaskan sambil dikocok dengan magnetic stirrer sampai homogen. Mulut erlenmeyer ditutup dengan menggunakan kapas dan alumunium foil kemudian media disterilkan dengan otoklaf pada tekanan 2 atm, suhu 121 ºC selama 20 menit.
Lampiran 11 Pengujian aktivitas antibakteri
1 ose
Bakteri stok S.mutans
10 ml media cair LB Diinkubasi 24 jam pada suhu 37 ºC
100 µL diambil dicampur dengan 10 ml media agar LB suhu 45 ºC
dibiarkan memadat pada suhu kamar
Kertas cakram
ekstrak teh
kontrol
Diinkubasi pada suhu 37 ºC selama 24 jam
Zona bening di sekeliling kertas cakram diukur dengan jangka sorong (mm)
Lampiran 12 Foto zona hambat standar
1
2
3
Keterangan: 1. Konsentrasi tetrasiklin 2.5 mg/ml 2. Konsentrasi tetrasiklin 5 mg/ml 3. Konsentrasi tetrasiklin 10 mg/ml
Lampiran 1 3 Foto zona hambat ekstrak sampel (konsentrasi 2.5 mg/ml) 2
3
5 6
2 4 1
7
8
Keterangan: 1. Daun segar, 2. Pelayuan, 3. Penggilingan, 4. Fermentasi, 5. Pengeringan, 6. Sortasi: BOPF, 7. Sortasi: BOP, 8 Sortasi: Dust
Lampiran 14 Foto zona hambat ekstrak sampel (konsentrasi 5 mg/ml)
Keterangan: 1. Daun segar, 2. Pelayuan, 3. Penggilingan, 4. Fermentasi, 5. Pengeringan, 6. Sortasi: BOPF, 7. Sortasi: BOP, 8 Sortasi: Dust
Lampiran 15 Foto zona hambat ekstrak sampel (konsentrasi 10 mg/ml) 2
4
3
5
3
3 b
6 7
8
1
Keterangan: 1. Daun segar, 2. Pelayuan, 3. Penggilingan, 4. Fermentasi, 5. Pengeringan, 6. Sortasi: BOPF, 7. Sortasi: BOP, 8. Sortasi: Dust Lampiran 16 Uji Anova dan Duncan hasil pengujian tanin dari proses pengolahan teh hitam Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups ,008 7 ,001 98,474 ,000 Within Groups ,000 8 ,000 Total ,008 15
Sampel teh 2,00 7,00 3,00 6,00 5,00 8,00 1,00 4,00 Sig.
N 2 2 2 2 2 2 2 2
1 ,0667
Subset for alpha = .05 2 3 4
5
,1000 ,1058 ,1137 ,1158 ,1241 ,1280 1,000
,104
,535
,253
,1496 1,000
Lampiran 17 Uji anova dan Duncan hasil pengujian tanin terhadap bakteri S.mutans konsentrasi 10000 ppm Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 231,370 3 77,123 582,063 ,000 Within Groups ,530 4 ,133 Total 231,900 7
Sampel teh 4,00 3,00 2,00 1,00 Sig.
N 2 2 2 2
Subset for alpha = .05 1 2 3 2,3000 3,8000 4,6500 15,8500 1,000 ,080 1,000
Lampiran 18 Uji anova dan Duncan hasil pengujian tanin terhadap bakteri S.mutans konsentrasi 5000 ppm Sum of Squares df Mean Square F Sig. Between Groups 174,364 3 58,121 325,154 ,000 Within Groups ,715 4 ,179 Total 175,079 7
Sampel teh 4,00 3,00 2,00 1,00 Sig.
N 2 2 2 2
Subset for alpha = .05 1 2 3 1,1500 2,8000 3,8500 13,1500 1,000 ,068 1,000
