Isolatie en karakterisering van kameel antilichaam fragmenten tegen het prostaatspecifiek

VRIJE UNIVERSITEIT BRUSSEL Faculteit Wetenschappen Vakgroep Toegepaste Biologische Wetenschappen Onderzoeksgroep Ultrastructuur Academiejaar 2000 – 2001

Isolatie en karakterisering van kameel antilichaam fragmenten tegen het prostaatspecifiek antigen

Promotor:

Prof. Dr. S. Muyldermans

Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van Bio-ingenieur in de Cel- en Genbiotechnologie

Saerens Dirk

De auteur en de promotor geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen er van de kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting uitdrukkelijk de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie. Auteur

Promotor

Dirk Saerens

Serge Muyldermans

Professor Doctor

2

Woord vooraf Vooreerst wil ik Prof. Dr. Serge Muyldermans danken voor de zeer interessante scriptie. Ook zijn opvolgen van resultaten en bijstaan met raad stelde ik erg op prijs. Daarnaast mag ik zeker niet vergeten iedereen van de onderzoeksgroep ULTR te bedanken voor hun bereidwilligheid om me met raad en daad bij te staan bij het oplossen van de wetenschappelijke en soms minder wetenschappelijke problemen. Vooral het Camel deel van de ULTR onderzoeksgroep wil ik ten zeerste bedanken voor de steun en de bemoedigende sfeer in het labo tijdens het werken aan de thesis. Tenslotte staken mijn ouders en familie me steeds een hart onder de riem, wanneer het werk minder vorderde, en zonder Katja zou het resultaat van de thesis zeker niet zo mooi geweest zijn.

3

Inhoudsopgave 1

Inleiding ................................................................................................................................................ 6

2

Literatuurstudie – Overzicht van de bestaande literatuur ................................................................... 10 2.1 2.1.1

Algemeenheden over immuniteit....................................................................................... 10

2.1.2

Humoraal antwoord ........................................................................................................... 11

2.1.3

Isotypen in humorale antwoord ......................................................................................... 11

2.1.4

Antigen bindende site ........................................................................................................ 12

2.1.5

Generatie van diversiteit voor antigen herkenning............................................................ 12

2.1.6

Humoraal antwoord in Camelidae..................................................................................... 13

2.1.7

Verschillen tussen conventionele en zware keten antilichamen........................................ 14

2.1.8

Ontogenie van de zware keten antilichamen ..................................................................... 16

2.1.9

Antigenisch repertorium .................................................................................................... 16

2.1.10

Structuren van VHH’s ....................................................................................................... 17

2.1.11

VHH-antigen binding ........................................................................................................ 18

2.1.12

Biotechnologische Applicatie............................................................................................ 20

2.1.13

Filamenteuze bacteriofaag display van antilichamen ........................................................ 22

2.2

Prostaat-specifiek antigen .......................................................................................................... 24

2.2.1

Prostaatkanker ................................................................................................................... 24

2.2.2

Kallikrein serine protease familie...................................................................................... 25

2.2.3

Prostaat-specifiek antigen.................................................................................................. 26

2.2.4

Enzymatische reacties van PSA ........................................................................................ 28

2.2.5

Interactie van PSA met protease inhibitoren ..................................................................... 29

2.2.6

Epitoop mapping van PSA ................................................................................................ 31

2.2.7

Mogelijke diagnostische testen.......................................................................................... 32

2.2.8

Verbeterde diagnostische testen ........................................................................................ 33

2.2.9

Laatste ontwikkelingen...................................................................................................... 36

2.3 3

Kameel antilichamen.................................................................................................................. 10

Doelstelling ................................................................................................................................ 36

Materiaal en methoden........................................................................................................................ 38 3.1

Micro-organismen (Escherichia coli)......................................................................................... 38

3.2

Media en Buffers........................................................................................................................ 38

3.3

Plasmiden en vectoren................................................................................................................ 41

3.3.1

pHEN4............................................................................................................................... 41

3.3.2

pHEN6............................................................................................................................... 42

3.3.3

pHEN7............................................................................................................................... 43

3.4

Primers ....................................................................................................................................... 44

4

4

3.5

PCR reactie................................................................................................................................. 44

3.6

Kolonie PCR en fingerprinting................................................................................................... 45

3.7

DNA agarose gels....................................................................................................................... 45

3.8

DNA digestie.............................................................................................................................. 46

3.9

Zuivering van DNA fragment uit agarose gel ............................................................................ 47

3.10

Ligatie van DNA fragment met vector of plasmide en zuivering/ontzouting ............................ 47

3.11

Plasmide transformatie in E.coli cellen...................................................................................... 48

3.12

Expressie test, maken van periplasmatisch extract .................................................................... 48

3.13

DNA Miniprep protocol ............................................................................................................. 49

3.14

SDS-PAGE................................................................................................................................. 50

3.15

Western Blot............................................................................................................................... 51

3.16

Immunisering van kameel .......................................................................................................... 52

3.17

Fractionatie van IgG subklassen ................................................................................................ 52

3.18

VHH bibliotheek constructie...................................................................................................... 53

3.19

Panning en selectie van antigen bindende kameel antilichaam fragmenten............................... 53

3.20

Expressie en zuivering van VHH fragmenten............................................................................ 54

3.21

ELISA......................................................................................................................................... 55

3.21.1

Faag ELISA ....................................................................................................................... 55

3.21.2

Solid fase ELISA ............................................................................................................... 56

3.21.3

Dose-respons ELISA......................................................................................................... 56

3.21.4

Competitieve ELISA ......................................................................................................... 56

3.21.5

Spiking ELISA................................................................................................................... 57

Resultaten en bespreking .................................................................................................................... 58 4.1

Aangewende proteïne hulpmiddelen .......................................................................................... 58

4.2

Immuunantwoord ....................................................................................................................... 59

4.3

Aanmaken van een VHH bibliotheek......................................................................................... 62

4.4

In vitro selectie of panning......................................................................................................... 64

4.5

Antigen bindende kameel antilichaam fragmenten afzonderen ................................................. 67

4.6

Productie van cAbPSA3, 11, 15 en 20 ....................................................................................... 69

4.7

Karakterisering van cAbPSA3, 11, 15 en 20.............................................................................. 70

5

Besluit ................................................................................................................................................. 77

6

Samenvatting....................................................................................................................................... 79

7

Literatuurlijst....................................................................................................................................... 81

5

1 Inleiding Na longkanker is prostaatkanker de meest voorkomende doodsoorzaak bij mannen, in de wereld. De beste manier om prostaatkanker aan te pakken is het vroege opsporen via diagnostische testen. Het prostaat-specifiek antigen (PSA) wordt algemeen aanvaard als een prostaat tumormerker. Via deze tumormerker kan men metingen uitvoeren die een snelle diagnose van prostaat kanker mogelijk maken. Door PSA kan een vroege opsporing van prostaatkanker gedaan worden, als het nog in een geneesbaar stadium zit. Het PSA is lid van de kallikrein gen familie, die codeert voor serine proteasen. De fysiologische hoofdfunctie van PSA is het vervloeien van semen coagulum. Onder invloed van PSA vindt de digestie van semenogelines en fibronectines plaats. Normaal wordt al het geproduceerde PSA getransporteerd naar het semen plasma, maar een kleine fractie kan geabsorbeerd worden in de bloedstroom. Een belangrijke proportie van het PSA in semen plasma en bloed serum is intern geknipt en als dus danig biologisch inactief. In de bloedstroom wordt de enzymatische activiteit van PSA gereguleerd door verschillende serum protease inhibitoren zoals alpha-1-antichymotrypsine, alpha-2-macroglobuline en alpha-1-protease inhibitor. Het PSA in complex met alpha-1-antichymotrypsine is de meest voorkomende vorm van PSA in het bloed serum. Bij prostaatkanker lekt meer PSA in de bloedcirculatie, met een hogere PSA concentratie in het bloed als gevolg. Om een effectieve en specifieke prostaatkanker diagnose te kunnen stellen, moet de verhouding van de hoeveelheid vrij, ongecomplexeerd PSA tot de totale hoeveelheid PSA in het serum gemeten worden. Want deze verhouding ligt lager bij patiënten met de kwaadaardige vorm van prostaatkanker, dan bij patiënten met de goedaardige vorm. Deze PSA metingen worden in commerciële testen gedaan met monoklonale antilichamen tegen verschillende vormen van PSA, meerbepaald de vrije, ongecomplexeerde vorm van PSA, de gecomplexeerde vorm van PSA met alpha-1-antichymotrypsine en een monoklonaal antilichaam tegen de totale hoeveelheid PSA (som van vrij, ongecomplexeerd PSA en gecomplexeerd PSA). Voor een biotechnologische toepassing, zijn er telkens kleinere moleculen nodig die specifiek hun antigen herkennen. Productie en toepassing van kleine entiteiten die enkel het variabele domein van de zware keten van conventionele antilichamen bevat, werd gedaan. Maar hieraan zijn verschillende nadelen verbonden, zoals kleverigheid van de entiteit, lagere antigen bindende capaciteit,… De productie en toepassing van kameel enkel domein antilichaam fragmenten afgeleid van de kameel zware keten antilichamen, vermijdt al deze nadelen. Verschillende eigenschappen zoals hoge oplosbaarheid, hoge stabiliteit, goede affiniteit maken de kameel 6

antilichaam fragmenten uitstekende hulpmiddelen in biotechnologische toepassing. Een heel voordelige eigenschap van kameel antilichamen is het feit dat ze de mogelijkheid vertonen om epitopen op het antigen te herkennen, die conventionele antilichamen moeilijk kunnen bereiken, meerbepaald de actieve site van een enzym. De actieve site van een enzym bevindt zich meestal in een moeilijk te bereiken caviteit van het enzym en die caviteit is dus moeilijker bereikbaar dan een oppervlakte epitoop. Kameel antilichamen hebben nu de eigenschap boven conventionele antilichamen om die caviteiten toch als immunogeen te beschouwen en zodanig de enzymen te kunnen inhiberen. Het gebruik van kameel antilichaam fragmenten wordt in deze scriptie aangewend om PSA specifiek bindende fragmenten af te zonderen en te karakteriseren, met mogelijkheid om ze in een prostaatkanker diagnostische test te gebruiken. De aangewende methode start vanaf de immunisering van een kameel met PSA, waarna uit het bloed de lymfocyten afgezonderd worden. Uit cDNA, geprepareerd vanaf mRNA uit deze lymfocyten, worden de antigen-bindende genfragmenten van de zware keten antilichamen gekloneerd en een bibliotheek wordt gemaakt in een fagmide vector. Een in vitro selectie, meerbepaald verschillende ronden van panning, vindt plaats om aanrijking in PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten te verkrijgen. Na screening van een aantal kolonies kan men PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten isoleren. De nodige karakterisering volgt door middel van ELISA, SDS-PAGE en Western Blots. Om een diagnostische test te produceren moeten er minimaal twee van de volgende drie verschillende kameel antilichaam fragmenten geïsoleerd worden: één die de totale hoeveelheid PSA kan herkennen, één voor enkel het gecomplexeerde PSA en één voor het vrije PSA.

7

Afkortingen In deze scriptie werden de volgende afkortingen gebruikt. − (RT-) PCR: (reverse transcriptase-) polymerase chain reaction − A2M (of AMG): alpha-2-macroglobuline − ABTS: 2,2’-azino-di(3-ethylbenzythiazoline-6-sulfonzuur) − ACT: alpha-1-antichymotrypsine − Amp: ampicilline − API: alpha-1-protease inhibitor − APS: ammonium persulfaat − BCIP: 5-bromo-4-chloro-3-indolylfosfaat − BPH: benign prostatic hyperplasia − BSA: bovine serum albumine − cDNA: copy DNA − CDR: complement determining region − DNA: desoxyribonucleic acid − dNTP: deoxyribonucleic acid triphosphate − dsDNA: dubbelstrengig DNA − DTT: dithiotreitol − EDTA: ethyleendiaminetetra-acetaat dinatrium − ELISA: enzym linked immunosorbent assay − FR: framework region − Fv: variabel fragment van een antilichaam − HCAb: heavy chain antibody − hK2: human glandular kallikrein 2 − IMAC: immobilised metal affinity chromatography − IPTG: isopropyl β-D-thiogalactopyranoside − Kan: kanamycine − mRNA: messenger ribonucleic acid − MW: molecular weight − NBT: nitro blauw tetralozium − OD: optische densiteit

8

− PBS: phosphate buffered saline − PCa: prostaat carcinoma − PEG: polyethyleenglycol − pNPP: p-nitrophenyl fosfaat − PSA: prostaat-specifiek antigen − PSAD: PSA densiteit − scFv: single chain Fv − SDS: natrium dodecylfosfaat − SDS-PAGE: SDS poly-acrylamide gel electroforese − ssDNA: enkelstrengig DNA − Temed: N, N, N’, N’-tetramethylethyleendiamine − Tris: hydroxymethyl-aminomethaan − VHH: variabel domein van de zware keten van zware keten antilichamen

9

2 Literatuurstudie – Overzicht van de bestaande literatuur

2.1 Kameel antilichamen

2.1.1 Algemeenheden over immuniteit Bij het continue gevecht tegen vreemde componenten hebben gewervelde dieren een immuun systeem ontwikkeld. Een antigen is een molecule waartegen het mogelijk is om de productie van antilichamen te induceren. Antigenen bestaan onder verschillende vormen: kleine haptenen gebonden op een drager, carbohydraten, lipopolysacchariden, proteïnen en DNA. Het immuun systeem werkt via een leer proces, waarbij het eerste contact met een antigen leidt tot een ziekte of intoxicatie, maar het tweede contact resulteert in een verdediging tegen het antigen, omdat het immuun systeem leert van het antigen te herkennen en te verwijderen uit het biologisch systeem. Het immuun systeem werkt op twee verschillende manieren, via de humorale en cellulaire immuniteit. De humorale immuniteit wordt veroorzaakt door antilichamen, die hoofdzakelijk aanwezig zijn in de bloedbaan (Roitt, 1988). Een antilichaam is een Y-vormig molecule, waarin de domeinen die de tips vormen van de armen (Fab) binden met het antigen en de domeinen die de stengel (Fc) vormen verantwoordelijk zijn voor de effectorfuncties, die het antigen elimineren (Padlan, 1994). Deze immunoglobulines vertegenwoordigen 20% van de totale proteïne hoeveelheid in het bloed. Bij de toediening van bijna elke mogelijke vreemde stof, aan een gewerveld dier, zal een humoraal antwoord opgewekt worden. Het opgewekte humorale antwoord wordt gegenereerd door de lymfocyten, die ongeveer 20% van de witte bloed cellen in het lichaam voorstellen. Als een gewervelde geconfronteerd wordt met een vreemde stof voor de eerste keer in zijn bestaan, dan zullen er enkele dagen overgaan vooraleer er antilichamen in het bloed detecteerbaar zijn tegen deze vreemde stof. Men krijgt een primair immuunantwoord. Echter bij herhaalde confrontaties met die welbepaalde vreemde stof, zullen specifieke antilichamen tegen deze vreemde stof sneller gegenereerd worden en aanwezig blijven in het bloed. Men zegt dat een geheugen is opgebouwd tegen de specifieke vreemde stof. Hier spreekt men over een secundaire immuunantwoord.

10

2.1.2 Humoraal antwoord De unieke functie van een antilichaam is de mogelijkheid om te binden met een hoge affiniteit op een kleine regio van het antigen. Deze interactie tussen antilichaam en antigen behelst hydrofobe krachten, Van der Waals interacties, ionische krachten, maar geen enkele covalente binding is aanwezig tussen antilichaam en antigen. Het deel van het antigen dat herkend wordt door het antilichaam wordt het epitoop genoemd. Elke antigen bezit over het algemeen verschillende overlappende of niet-overlappende epitopen. Meestal wordt een polyklonaal antwoord opgewekt tegen elk antigen. Als het antilichaam bindt op het antigen, dan zal er een brede waaier van biologische functies nodig zijn om te zorgen voor de afbraak en verwijdering van het antigen. De inductie van deze biologische functies gebeurt door het Fc stuk van het antilichaam (Roitt, 1988). Structureel is het antilichaam opgebouwd uit twee identieke zware en twee identieke lichte ketens, die bij elkaar gehouden worden door verschillende disulfide bruggen. Het moleculaire gewicht van een antilichaam bedraagt 150 kDa, waarbij elke zware keten een moleculair gewicht van 50 kDa en elke lichte keten een moleculair gewicht van 25 kDa heeft. Elke zware en lichte keten bestaat respectievelijk uit vier en twee opgevouwen domeinen. De zware keten is opgebouwd uit de domeinen VH, CH1, CH2 en CH3. Bij de lichte keten vinden we enkel VL en CL. De algemene structuur van zo een domein is globulair met een klassiek β-pleated sheet tertiaire structuur. In elke keten, worden eenheden van 110 aminozuren opgevouwen tot compacte domeinen, waarbij elk domein één enkele interne disulfide brug bezit en die de twee βsheets verbindt. Het variabele domein bestaat uit negen β-strands, opgevouwen in twee sheets gepakt tegen elkaar en gestabiliseerd door een disulfide brug. Het constante domein bevat zeven

β-strands. De eerste twee van de vier domeinen van de zware keten interageren met de lichte keten om het Fab stuk te vormen. Het Fab stuk zorgt voor de herkenning van het antigen. Een hinge regio volgt deze twee domeinen en laat toe aan het antilichaam om een onafhankelijke beweging te verrichten tussen het Fab en Fc stuk. Deze hinge regio wordt gevolgd door de twee constante domeinen van de zware keten. Het Fab en Fc stuk worden dus verbonden door de hinge regio (Padlan, 1994; Roitt, 1988).

2.1.3 Isotypen in humorale antwoord Verschillende klassen van antilichamen worden gedefinieerd op basis van hun distributie in verschillende organen en weefsels en ook op basis van hun verschillende effectorfunctie. Onderling verschillen de antilichaam klassen in half-leven, distributie doorheen het hele lichaam, 11

mogelijkheid om complement te activeren en hun binding op cel gebonden Fc receptoren. Deze verschillen zijn te wijten aan het Fc deel en er kunnen 5 verschillende klassen aangeduid worden: IgA, IgG, IgM, IgD en IgE. De 5 klassen bezitten elke hun eigen biologisch karakter. De IgGs zijn de meest overvloedige in de interne lichaamvloeistof en zijn hoofdzakelijk extra vasculair. IgA wordt enkel gevonden in muceuze secreties en slijmvliezen. IgM komen voor onder de vorm van pentameren en zijn op die manier efficiënt in het aggregeren van de antigenen, ze zijn op die manier ook verantwoordelijk voor het primaire immuunantwoord. IgD wordt enkel gevonden op de celmembraan van de lymfocyten en worden geassocieerd met geheugen B-cellen. De IgE zijn verantwoordelijk voor het parasitaire immuunantwoord en verdediging van de externe lichaamsoppervlakken. Het Fc stuk van het antilichaam verzorgt de verschillende biologische effectorfuncties (Roitt, 1988).

2.1.4 Antigen bindende site Bij het vergelijken van de sequenties van antilichamen valt op dat het N-terminale deel van de zware en lichte keten heel wat variatie vertoont, waar de rest van de delen van de zware en lichte keten relatief geconserveerd zijn. In deze variabele regio’s vindt men drie hypervariabele sequenties terug. Deze segmenten noemt men de CDR’s (Complement Determining Regions), omdat men de hypothese naar voren bracht dat deze zouden samenkomen aan één zijde van het variabele domein en een oppervlakte vormen die complementair is met het antigen. De enorme diversiteit in de sequenties van de CDR’s zorgt voor een onmetelijke diversiteit in antigen specificiteit door de variatie in vorm en natuur van de antigen bindende oppervlakte. Volgens Kabat et al. (1991) worden de residu’s in de variabele regio’s geclassificeerd als hypervariabel (CDR) of framework (FR) residu. De FR’s bezitten een grote graad van conservatie doorheen de IgG moleculen, vooral sommige posities zijn belangrijk voor stabiliteit en opvouwing van het domein (Chothia & Lesk, 1987). Bepaalde residu’s in FR’s en CDR’s hebben vaste oriëntatie in antilichamen en dit kan gebruikt worden voor model binding van de gecombineerde sites naar een beperking van de conformaties en posities van de lussen.

2.1.5 Generatie van diversiteit voor antigen herkenning Elk antigen kan herkend worden door een antilichaam. Om zo een grote diversiteit aan antilichamen te kunnen opbouwen met maar een beperkt aantal genen, zijn er verschillende mechanismen voorhanden. Om een lichte keten te produceren, moeten verschillende

12

gensegmenten associëren. Een Vλ/κ gen associeert met een J-gen en met een Cλ/κ gen. Om een zware keten te verkrijgen, wordt een willekeurig V-, D- en J-gen door DNA recombinatie bij elkaar gevoegd en geassocieerd met het constante gedeelte van een bepaald isotype. De V-genen coderen voor de CDR1 en CDR2 en het DJ gedeelte zorgt voor de CDR3 sequentie. De recombinatie tussen een VDJ combinatie gebeurt ad random en zorgt voor een extra diversiteit. Verder kunnen additionele nucleotiden geïnsereerd worden aan de 5’ terminale regio van het Den J-segment. Dit proces wordt verricht door het enzym terminaal deoxynucleotidyl transferase. De paring van een zware keten met een lichte keten zorgt ook voor extra diversiteit. De laatste hulp voor de broodnodige diversiteit is afkomstig vanwege de verhoogde somatische hypermutatie. Deze mutaties zijn een resultaat van enkele nucleotidensubstituties en ze komen enkel voor in de variabele regio’s, dus zowel in de FR’s als in de CDR’s. Ze vinden plaats bij de generatie van het immunologisch geheugen en zorgen voor een hoger wordende affiniteit van de geproduceerde antilichamen voor het antigen (Tonegawa, 1981).

2.1.6 Humoraal antwoord in Camelidae De familie van de Camelidae is de enige overlevende van de suborde van de Tylopoda, afkomstig vanuit het Eoceen. De leden van de Camelidae familie zijn de kameel, de dromedaris en de lama. Bij het onderzoeken van hun humorale immuniteitssysteem zijn interessante eigenschappen naar voor gekomen. Hun bloed bevat niet alleen de verwachte conventionele antilichamen bestaande uit twee zware en twee lichte ketens, maar er zijn ook antilichamen aanwezig die alleen bestaan uit twee zware ketens. Bij Camelidae bestaat een belangrijk aandeel van het natuurlijke antilichaam repertorium uit antilichamen die geen lichte keten bevatten. De antilichamen die enkel opgebouwd zijn uit zware ketens worden zware keten antilichamen genoemd (HCAb : Heavy Chain Antibody, gedefinieerd als een immunoglobuline zonder lichte keten). Ze zijn functioneel in antigenbinding (Hamers-Casterman et al., 1993). Deze zware keten antilichamen hebben de kleinste natuurlijk voorkomende antigen bindende sites, bestaande uit één enkel domein met enkel drie antigen bindende lussen, equivalent met de CDR1, 2 en 3 van VH’s. De zware keten antilichamen komen voor als een IgG isotype. Hun moleculaire gewicht bedraagt ongeveer 95 kDa, dit in tegenstelling tot de 150 kDa voor conventionele antilichamen. Voor de zware keten antilichamen kunnen verschillende subklassen gedefinieerd worden. In het geval van de dromedaris, behoren de subklassen IgG2 en IgG3 tot de zware keten antilichamen, waarbij de IgG2 waarschijnlijk een 35 aminozuur lange hinge en IgG3 een 12 aminozuren lange hinge bevatten (Vu et al., 1997).

13

2.1.7 Verschillen tussen conventionele en zware keten antilichamen De zware keten antilichamen in Camelidae verschillen van de conventionele antilichamen in verscheidene aspecten. De polypeptide keten van de zware keten antilichamen is significant korter dan die van de zware keten van de conventionele antilichamen. Dit komt doordat het CH1 domein, dat normaal interageert met de lichte keten, verdwenen is bij de zware keten antilichamen (figuur 1).

Fig. 1. Schematische voorstelling van conventioneel antilichaam (links) en zware keten antilichaam (rechts) naar Muyldermans & Lauwereys (1999). Voor de conventionele antilichamen zijn de domeinen VL en CL voor de lichte keten en VH, CH1, CH2 en CH3 voor de zware keten weergegeven. Voor de zware keten antilichamen zijn de domeinen VHH, CH2 en CH3 weergegeven. Het CH1 domein is afwezig bij zware keten antilichamen.

Het variabele domein van de zware keten van de zware keten antilichamen, afgekort als VHH, vertoont enkele opmerkzame aminozuur substituties in hun framework. Dit is om functioneel te kunnen zijn met de afwezigheid van het VL domein en deze aminozuur substituties worden niet gevonden in de zware ketens van conventionele antilichamen. Normaal wordt het translatie product van het immunoglobuline zware keten mRNA getransporteerd naar het endoplasmatisch reticulum. De zware keten polypeptide wordt dan gebonden met chaperone proteïnen (BiP), welke normaal moeten verplaatst worden door de lichte keten om de secretie van het antilichaam te bewerkstelligen. De chaperone proteïnen binden normaal op het CH1 en VH domein van de zware keten, maar omdat bij de zware keten antilichamen van Camelidae het CH1 domein

14

afwezig is, kunnen de chaperone proteïnen er niet op binden en zal de zware keten niet in het endoplasmatisch reticulum blijven en onmiddellijk gesecreteerd worden (Vu et al., 1997). Deze zware keten aanpassingen bij de Camelidae worden geconcentreerd gevonden in het gebied dat overeenkomt met de VH zijde, die interageert met de VL zijde in conventionele antilichamen. Bij verwijdering van het VL domein, komt er een groot hydrofoob gebied vrij voor solvent bij de VH, dit leidt tot kleverigheids- en aggregatieproblemen. De grootte van het geëxposeerd hydrofoob oppervlak bedraagt tussen de 500 en 800 Ǻ. Er zijn echter mutaties ontstaan die ervoor zorgen dat het voor solvent extra toegankelijk gebied meer hydrofiel wordt gemaakt (figuur 2). De eerste duidelijke mutatie is de substitutie van leucine 11 naar een serine, wat een iets hydrofieler karakter heeft. In de conventionele antilichamen zorgt leucine 11 voor een ball-and-socket joint via interactie met fenylalanine 149 en proline 150 van het CH1 domein (Lesk & Chothia, 1988). Deze joint zorgt voor een juiste oriëntatie om het domein op de correcte manier te laten interageren met de lichte keten. Deze ball-and-socket joint vergemakkelijkt ook de beweging om de verscheidene interacties van het antilichaam voor antigen interactie en effectorfunctie te bewerkstelligen. Al de andere aminozuren substituties komen voor in framework 2 (figuur 2), dat normaal interageert met het VL domein, het zijn de substituties Val37Phe/Tyr, Gly44Glu/Gln, Leu45Arg/Cys en Trp47Gly/Ser/Leu/Phe (Riechmann & Muyldermans, 1999).

Fig. 2. Schematische illustratie van de verschillen tussen VH en VHH gebaseerd op sequentie vergelijking (naar Muyldermans & Lauwereys (1999). De relatieve positie van de antigen binding lussen (CDR1, 2 en 3) zijn gegeven,

15

de blauwe segmenten stellen de vier framework regio’s (FR) voor. De mogelijke extra disulfide brug tussen CDR1 en CDR3 is in groen weergegeven, samen met de framework aminozuur substituties in VHH.

Deze substituties in VHH’s laten de structuur van de hoofdketen onveranderd in het opgevouwen domein ten opzichte van de VH’s, maar zorgen voor een hydrofieler oppervlak, zodanig dat het geïsoleerde domein meer oplosbaar wordt in het solvent.

2.1.8 Ontogenie van de zware keten antilichamen Het genoom van de Camelidae bevat zowel VH als VHH kiembaan genen, waarbij de VHH genen telkens in het FR2 de hierboven vermelde substituties en een extra cysteïne in de CDR1 of op positie 45 bezitten (Nguyen et al., 1998). De genen, coderende voor de VHH’s, kunnen onderverdeeld worden in zeven subklassen, afhankelijk van de positie van het cysteïne in de CDR1 en de lengte van de CDR2. Vijf van de zeven subklassen komen zeker voor met gerecombineerde DJ segmenten (Nguyen et al., 2000). Bij de zware keten antilichamen ziet men een afwezigheid van het CH1 domein, alhoewel het aanwezig is in de kiembaan, maar tijdens de mRNA processing eruit wordt gespliced (Nguyen et al., 2000). Een ander typische eigenschap van de zware keten antilichamen is dat de CDR3 lus gemiddeld langer is dan bij conventionele antilichamen (Muyldermans et al., 1994). Doordat er in CDR1 en CDR3 meestal een cysteïne zit, leidt dit tot de vorming van een interlus disulfidebrug. De cysteïne in de CDR1 is gecodeerd in de kiembaan, maar de cysteïne in de CDR3 is niet aanwezig in de kiembaan, maar wordt geïntroduceerd bij het recombinatieproces van de VHH-D-J gen segmenten.

2.1.9 Antigenisch repertorium Omdat de zware keten antilichamen enkel drie CDR’s bevatten voor antigen binding, in tegenstelling tot de zes CDR’s bij conventionele antilichamen, kan verondersteld worden dat het antigen bindend vermogen kleiner zou zijn. Alhoewel werd gevonden dat zware keten antilichamen bij een geïmmuniseerde of zieke kameel een heel breed antigen bindend vermogen bezitten (Hamers-Casterman et al., 1993). Alles wijst erop dat Camelidae een efficiënt humoraal immuunsysteem bezit, dat grotendeels gebaseerd is op zware keten antilichamen en dat daardoor de zware keten antilichamen andere strategieën ontwikkelden om hun antigen bindend landschap te kunnen verbreden (Muyldermans et al., 2001; Nguyen et al., 2000). Reeds een honderdtal VH/VHH genfragmenten zijn geïdentificeerd. De VHH fragmenten zijn aparte entiteiten uit de evolutie en niet afkomstig uit mutaties van de VH genen. Zowel de VH als de VHH 16

genfragmenten zijn hoogstwaarschijnlijk aanwezig op hetzelfde functionele chromosoom, omdat hetzelfde D-segment werd gevonden in conventionele als zware keten antilichamen (Nguyen et al., 2000). Het is wel nog onverklaard of de kiembaan VH’s en VHH’s interspersed of clustered liggen op diezelfde locus van het chromosoom. Bij het vergelijken van de kiembaan en cDNA sequenties, blijkt het belang van somatische hypermutatie in het genereren van het VHH repertorium (Vu et al., 1997).

2.1.10

Structuren van VHH’s

Vergelijkingen van de sequenties van mens en muis antilichamen, lieten zien dat aanwezigheid van specifieke aminozuren op specifieke plaatsen in de CDR’s, kan leiden tot een gelimiteerd aantal structuren, canonieke structuren genoemd (Al-Lazikani et al., 1997; Chothia & Lesk, 1987). Vele van de sequentie variaties in de hypervariabele regio’s leidt enkel tot een modificatie van de antigen bindende oppervlakte. Hoewel, sequentie variaties op sommige specifieke posities in zowel framework als hypervariabele regio’s zorgen voor een andere canonieke structuur. De relatie tussen VHH lus structuur en canonieke structuur blijkt minder strikt te zijn dan bij conventionele antilichamen. De H1, H2 en H3 lussen worden gedefinieerd als het solvent bereikbaar deel van de overeenkomstige CDR in de natieve 3D structuur. Er werd voor zware keten antilichamen gevonden dat de H1 en H2 lussen alternatieve conformaties dan de reeds gedefinieerde conformaties konden aannemen (Decanniere et al., 2000). De kristal structuren van VHH moleculen onthult dat de structuren van de eerste en tweede hypervariabele lussen, verschillen van die in de VH moleculen, alhoewel de sequentie context van deze lussen heel gelijkend zijn in VHH en VH moleculen. Voor de VH zijn er zes verschillende H1-H2 lus combinaties mogelijk (Chothia et al., 1992). Vijf van de zes kunnen voorspeld worden via algoritmen die gebaseerd zijn op lengte van de lus en de aanwezigheid van welbepaalde aminozuren op sleutelposities. Voor de VHH’s daarentegen blijkt het dat er meer dan tien verschillende lus conformaties mogelijk zijn (Decanniere et al., 2000; Nguyen et al., 2000). Dit leidt uiteindelijk tot een grotere structurele diversiteit om te kunnen interageren met het antigen. De H1 regio is verbreed zodat de meer stroomopwaarts gelegen aminozuren ook gebruikt worden. Deze vergroting van de CDR1 leidt uiteindelijk tot een grotere variabiliteit. Men weet dat hot spots voor hypermutatie TAC/T (enkel voor de aminozuurposities 27 en 29) of AGC/T

17

zijn en sommige nucleotidensequenties zijn veranderd in deze hot spots in het geval van VHH’s. Het kan gebeuren dat grotere CDR1 lussen voorkomen door nucleotiden inserties, die dan op hun beurt leiden tot een groter antigen bindend oppervlak. Ook kortere en langere H2 lussen zijn gevonden in VHH gen fragmenten. De CDR3 lengte van een VHH is gemiddeld langer dan die van een VH, daarenboven is de CDR3 ook meer toegankelijk voor het solvent, wat ook leidt tot een groter beschikbaar oppervlak voor antigen herkenning (Muyldermans et al., 2001). Uit verschillende VHH-antigen structuren is afgeleid dat de CDR3 lus bijdraagt tot 50 tot 75% van de totaal antigen interagerend oppervlak. Een extra disulfide brug is meestal aanwezig in de VHH, door de aanwezigheid van extra cysteïne residu’s in de CDR1 lus of op posities 45 of 50 en in de CDR3 lus. Deze disulfide brug stabiliseert de langere lus en zou mogelijk nieuwe lus structuren kunnen induceren (Decanniere et al., 2000).De extra disulfide brug leidt tot een nieuwe variëteit van antigen bindende lussen. De lengte en variabiliteit van de CDR3 reflecteert ook het VDJ diversificatie proces. Een lange CDR3 wordt gevonden in verschillende organismen met een lage VH diversiteit. Deze lange uitpuilende (protruding) lussen van tien aminozuren of meer blijken uniek te zijn voor de antigen binding sites van het zware keten antilichamen. De langere CDR3 in Camelidae in tegenstelling tot muis of mens zou kunnen compenseren voor het verlies van de contacten van de VL met het antigen (Muyldermans et al., 1994). De aanwezigheid van langere CDR1, 2 en 3 lussen laten toe dat andere canonieke structuren kunnen voorkomen, wat aanleiding geeft tot een vergroting van het structureel repertorium van de antigen bindende site en uiteindelijk tot het compenseren van het verlies van het VL domein.

2.1.11

VHH-antigen binding

Verschillende VHH-complex kristalstructuren gaven extra informatie over de manier van binden van het antigen op de VHH. Voor het cAbLys3-HEL complex (HEL = kip lysozyme), waar de VHH het lysozyme competitief inhibeert, werd gevonden dat tien aminozuren van de CDR3 zich bevinden in de actieve site van het lysozyme. De uitpuilende lus van de CDR3 bootst het natuurlijke substraat van het lysozyme na (Desmyter et al. 1996). Dat zo een uitpuilende lus nog niet gevonden is in conventionele antilichamen, kan erop wijzen dat de Camelidae met de zware keten antilichamen andere epitopen kan binden dan conventionele antilichamen.

18

In het geval van de cAbRN05-RNase A complex, werd vastgesteld dat enkel residu’s van de CDR1 en CDR3 contact maken met het antigen, wat leidt tot een kleiner VHH-antigen interagerende oppervlakte van 570 Ǻ² (Decanniere et al., 1999). Normaal ligt de antigen interagerende oppervlakte tussen 600 en 800 Ǻ². Toch is het mogelijk om met zo een kleinere antigen interagerende oppervlakte, een affiniteitsconstante in de nanomolaire range te verkrijgen. Het is best mogelijk dat deze hoge affiniteit te verklaren is doordat het antigen herkennende proces bewerkstelligd wordt door Van der Waals interacties en waterstofbruggen, gemedieerd door een overgrote meerderheid van hoofdketen atomen. Bij conventionele antilichamen worden de antigen bindende krachten vooral verzorgd door zijketen atomen. Het lijkt erop dat zware keten antilichamen een verschillende strategie hanteren om te kunnen interageren met het antigen. De structuur van het cAbCA05-carbonic anhydrase complex laat zien dat de interactie van de VHH met het antigen alleen gebeurt via de residu’s van de CDR3 lus. De CDR3 is verdeeld in een N-terminaal en C-terminaal deel, doordat een cysteïne aanwezig is als middelpunt en dat een disulfide brug maakt (Desmyter et al., 2001). Het N-terminaal gedeelte van de CDR3 lus plooit terug over de CDR1 en CDR2 lussen. Het C-terminaal gedeelte echter plooit over de voormalige VL zijde en verbergt de overblijvende hydrofobe residu’s van het solvent. Beide delen van de CDR3 lus participeren in carbonic anhydrase binding via een plat oppervlakte. Deze verschillende VHH-antigen complex structuren openbaren een divers structureel repertorium van antigen bindende sites van de VHH’s en ook nieuwe canonieke structuren werden geïdentificeerd (Muyldermans et al, 2001). Conventionele antilichamen binden het antigen door te interageren via een vlak oppervlak. Alhoewel hapteen binding kan voorkomen door de vorming van een caviteit in de zes CDR regio’s van het antilichaam (Spinelli et al., 2000). Zware keten antilichamen kunnen het antigen binden op verschillende manier. Eerst en vooral kunnen de zware keten antilichamen interageren zoals de conventionele antilichamen via een vlak structuur oppervlak met het antigen (Decanniere et al., 1999). Daarnaast kan de interactie met grote caviteiten gebeuren via een uitpuilende lus, die ook in de enzym actieve sites kan binden (Desmyter et al., 1996). Haptenen kunnen gebonden worden door een caviteit te generen met de drie CDR lussen (Spinelli et al., 2000). Het is overduidelijk dat VHH’s het antigen kunnen binden met een nanomolaire affiniteit voor het antigen met een enkele CDR (Desmyter et al.,

19

2001), waar conventionele antilichamen op zijn minst drie CDR lussen nodig hebben om te kunnen interageren met het antigen. Dit wil zeggen dat de herkenning van meerdere, variabele epitopen, qua structuur en sequentie, kan gebeuren door zware keten antilichamen, wat de deur opent naar een verschillende toepassingen.

2.1.12

Biotechnologische Applicatie

Om tot een biologische applicatie te komen, wordt er steeds gezocht naar kleinere moleculen die antigenen specifiek herkennen met een hoge affiniteit. Van kleinere moleculen wordt verwacht dat ze een lagere immunogeniciteit, snellere bloed verwijdering, hogere weefsel penetratiegraad en lagere aspecifieke binding vertonen. Productie van kleine entiteiten, die enkel het variabele domein bevatten van de zware keten van de conventionele antilichamen werd geprobeerd. Maar men stootte op verschillende nadelen zoals kleverigheid vanwege de solvent toegankelijkheid van de hydrofobe residu’s, normaal interagerend met de lichte keten en een gereduceerde antigen bindende capaciteit ten opzichte van een intacte VH-VL antigen bindende site. De productie van enkel domein antilichamen, afgeleid van kameel zware keten antilichamen, vermijdt echter al deze negatieve eigenschappen. Deze VHH’s binden specifiek aan een welbepaald antigen met een nanomolaire affiniteit (dit is in hetzelfde affiniteitsgebied als scFv). VHH’s tegen alle soorten antigenen kan men verkrijgen door immunisering van kamelen met het antigen. Na een immunisering protocol, worden de periferale bloed lymfocyten gezuiverd uit het bloed en het mRNA wordt geïsoleerd vanuit de cellen. De genen die coderen voor de VHH domeinen worden geamplifieerd vanaf cDNA, verkregen vanaf mRNA, door PCR met één set primers. De geamplifieerde genen worden gekloneerd in een fagmide vector en kleine bibliotheken van 106 tot 107 transformanten zijn voldoende om een representatief antigen bindend repertorium te bestrijken, als men start vanaf 5x106 lymfocyten.

20

Fig. 3. Isolatie van recombinante VHH’s met gekende antigen specificiteit. De weg van kameel immunisering tot oplosbaar antigen specifiek eiwit wordt getoond (naar Muyldermans & Lauwereys, 1999).

Het VHH gen wordt geïnsereerd stroomopwaarts van het minor coat gen 3 proteïne van de M13 filamenteuze faag. Door deze manier van werken, wordt na de bibliotheek te infecteren met helperfagen, de productie van faag partikels mogelijk die een VHH-g3p fusieproteïne op hun tip bezitten. Het corresponderende VHH gen wordt in het faag partikel verpakt. De recombinante fagen worden blootgesteld aan verschillende opeenvolgende ronden van in vitro selectie, genaamd panning. Het verkrijgen van antigen specifieke VHH’s door panning wordt verkozen boven de screening van individuele kolonies, omdat de panning condities ook selecteren voor binders met de hoogste affiniteit voor het antigen en diegene die goed uitgedrukt worden in bacteriën. Een aanrijking in specifieke fagen wordt bereikt na twee tot drie selectieronden. De analyse van individuele klonen, na de panning procedure, leidt tot de identificatie van verschillende VHH’s specifiek voor het welbepaalde antigen (figuur 3). Met behulp van deze methode kunnen specifieke VHH’s tegen het antigen met een goede affiniteit verkregen worden in een korte tijdsperiode (Ghahroudi et al., 1997). De hoge oplosbaarheid tot 10 mg/ml, hoge stabiliteit, goede affiniteit en geen VH-VL dissociatie door verdunning wegens het enkel domein karakter, maken VHH’s een krachtige hulpmiddel in de biotechnologie. De goede expressie in E.coli en makkelijke zuivering maken VHH’s goede applicatie model systemen (Nguyen et al., 2001). Een heel opmerkelijke eigenschap, enkel bij de VHH’s, is het feit dat in circa 50% van de gevallen VHH’s die opgewekt zijn tegen een enzym,

21

de mogelijkheid bezitten om dat enzym te inhiberen (Lauwereys et al., 1998; Conrath et al., 2001). Het is algemeen geweten dat de actieve site van een enzym zich meestal bevindt in een caviteit en dat deze caviteiten over het algemeen minder immunogeen zijn dan andere delen van het proteïne. Deze eigenschap van VHH’s, dat ze de mogelijkheid hebben om epitopen te herkennen, die niet herkend worden door conventionele antilichamen, geven de VHH’s een bijkomend voordeel in biotechnologische toepassingen (Conrath et al., ingediend bij JBC). In verschillende toepassingen is het juist behulpzaam om een inhibitorische VHH te kunnen gebruiken als hulpmiddel. De inhibitorische VVH’s kunnen helpen in het begrijpen van het enzymatisch mechanisme of kan aangewend worden bij de inactivatie van een enzym in een bepaald proces. Deze inhibitorische VHH’s kunnen op basis van hun CDR sequenties ook aanleiding geven tot het ontwerpen van inhibitorische peptiden. Antitumor antilichamen kunnen zorgen voor een selectiviteit in hun doelwit en kunnen ook gebruikt worden om therapeutische agentia te transporteren naar de plaats van de tumor. Muis monoklonale antilichamen, die gegenereerd werden door de hybridoma technologie, vertonen sommige nadelen als ze gebruikt worden in klinische testen, mede door hun grootte en hoge immunogeniciteit. Hun grotere omvang geeft een lagere tumorweefsel penetratie. Daarom hebben kleinere fragmenten een hogere tumor penetratie en snellere bloed verwijdering. Enkel domein antilichamen kunnen aangewend worden onder bispecifieke of bivalente vorm, gekoppeld aan een drug of toxine (Conrath et al., 2001). Het wordt verwacht dat de VHH ook toepassingen zal vinden in diagnostiek en therapeutische hulpmiddelen, zeker wanneer men een economisch productie, kleine grootte en een robuuste entiteit nastreeft.

2.1.13

Filamenteuze bacteriofaag display van antilichamen

De filamenteuze fagen bezitten een aantal eigenschappen, die hun gebruik voordelig maakt in het klonen en screenen van het Ig repertorium. De fagen lyseren hun gastheer cellen niet en laten toe van een groter dan normaal DNA molecule op te nemen in hun faag partikel. Men kan ook zorgen dat het product van het gekloneerde gen vertoond wordt op de faag oppervlakte. De gastheercellen verkrijgen ook immuniteit tegen een verdere faag infectie, zodat het mogelijk is om monospecificiteit te hebben voor het vertoonde vreemde proteïne. De filamenteuze fagen bezitten ook een immense selectie kracht, waardoor de mogelijkheid bestaat om specifieke genen op te sporen, die oorspronkelijk slechts 1/1010 aanwezig waren.

22

De filamenteuze bacteriofagen zijn een groep van heel gerelateerde virussen, dewelke alleen gram-negatieve bacteriën kunnen infecteren via hun vertoonde oppervlakte proteïne, het gen 3 proteïne, waarmee ze zich vasthechten op de F pilus van de bacteriële membraan. De fagen zijn 900 nm lang en 6 tot 10 nm dik en zijn de smalste gekende virussen. Deze mannelijk-specifieke bacteriofagen beschikken over een kleine, enkelstrengige, circulair DNA genoom. De genoomgrootte bedraagt ongeveer 6400 basenparen en codeert voor 10 proteïnen, die nodig zijn voor infectie, biosynthese en generatie van nieuwe faag partikels (Smith & Petrenko, 1997). De virus mantel bestaat uit een groot mantel proteïne van 2700 tot 3000 kopijen, welk het product is van het gen VIII (gp8), en vier kleinere proteïnen, de producten van genen III, VI, VII en IX. Deze zijn allemaal aanwezig in een vijftal kopijen. Het gen 3 product (g3p) of het adsorptie proteïne wordt verankerd aan een uiteinde van het faag partikel mantel via het C-terminaal domein. Het N-terminaal domein is geëxposeerd en medieert de aanhechting op de F pilus van de bacterie. Bij herkenning en aanhechting van de faag partikels, wordt het groot mantel proteïne verwijderd, terwijl het virale DNA samen met het g3p wordt getransporteerd tot binnen in de bacterie. Het infecterende ssDNA wordt onmiddellijk omgezet naar een dsDNA. Terwijl de virale proteïnen worden getranscripteerd, wordt ook het virale genoom geamplifieerd. De assemblage van nieuwe faag partikels wordt verricht in het bacteriële membraan en het periplasma. De infectie van de bacterie door de faag lyseert de bacterie niet, maar vertraagd wel de bacteriële groei, die leidt tot een permanente infectie van de bacterie. Er werden speciale filamenteuze kloneringsvectoren ontwikkeld. Een grote regio met gen III en f1 origin of replication (ORI) van het wilde type M13 werd geïntegreerd in een plasmide (term fagmide). Dit chimaere plasmide kan propageren zoals een elke andere plasmide in een bacterie of kan verpakt worden in een faag partikel. Dit laatste wordt geholpen door een helper faag (M13KO7), die een mutatie draagt in de ORI en draagt ook een antibiotica resistentie merker. Door die mutatie in de ORI zal er weinig helper faag genoom worden geamplifieerd en dus een meerderheid van recombinante fagmide ingekapseld worden in nieuwe faag partikels. Sommige fagmide vectoren dragen een amber stop codon tussen het gen III en het vreemde gen. Dit laat een gemakkelijke switching toe tussen oppervlakte gebonden uitdrukking en gesecreteerde en oplosbare expressie van het vreemde gen alleen, door gebruik te maken van suppressor of nonsuppressor bacterie stammen.

23

Het faag display systeem kan men gebruiken om antilichamen of antilichaam fragmenten uit te drukken om de tip van het faag partikel. Hierdoor kan men de hybridoma technologie omzeilen. De enige limitering in de faag antilichaam technologie is de grootte van de bibliotheek, die gelimiteerd is door de transformatie efficiëntie in bacteriën. Die gaat maximaal tot een grootte van 109 klonen. Het gebruik van deze faag display procedure op de selectie van kameel antilichaam fragmenten vertoont de volgende voordelen. Vooreerst wordt het immuunsysteem van de Camelidae geëxploiteerd om te zorgen voor generatie en maturatie van in vivo bindende fragmenten tegen het antigen. Hierdoor is er later geen nood om de binders te optimaliseren qua affiniteit of specificiteit. Slecht één enkel VHH gen fragment moet gekloneerd worden, dit is in tegenstelling tot het kloneren van de VL en VH voor het repertorium na te bootsen van muis of mens in vitro via scFv’s. Er komt slechts één enkele familie van VHH’s voor in de Camelidae, zodat in essentie slecht één enkele set primers nodig is om het hele repertorium te kloneren. Als laatste voordeel is een VHH fragment van de kameel zware keten antilichamen een enkel domein antilichaam. De vouwing in een functioneel proteïne wordt hierdoor vergemakkelijkt. Bovendien moet de stabiliteit van een enkel domein antilichaam hoger zijn dan de antigen bindende fragmenten van conventionele antilichamen, omdat er geen dissociatie kan gebeuren van de VHVL paren bij verdunning (Muyldermans & Lauwereys, 1999). De intrinsieke stabiliteit van het kameel antilichaam fragment is hoger dan een Fab, Fv of scFv, want het is zuurbestendig, het heeft een reversiebele denaturatie/renaturatie. Het herkent verschillende epitopen, zowel inhibitorische epitopen als epitopen die ook herkend worden door conventionele antilichamen. Door genetische engineering kunnen er reactieve groepen gekoppeld worden aan het kameel antilichaam fragment om de immobilisatie op bio-chips te vergemakkelijken.

2.2 Prostaat-specifiek antigen

2.2.1 Prostaatkanker Prostaatkanker is de meest voorkomende kanker bij mannen in de Verenigde Staten en de tweede meest voorkomende doodsoorzaak bij mannen na longkanker wereldwijd. Er werd vooropgesteld dat bijna 39 miljoen mannen in Noord-Amerika, Europa en Japan prostaatkanker hebben (Andriole et al., 1994). De incidentie van prostaatkanker varieert evenwel bij vergelijking van verschillende landen. De oorzaak van deze wijde variatie in verschillende landen is nog een raadsel, alhoewel raciale en etnische factoren, verschillen in levensstijl en dieet wel degelijk een

24

invloed op de incidentie van prostaatkanker kunnen hebben. De beste manier om prostaatkanker aan te pakken, is het vroeg opsporen via diagnostische testen en/of biopsieën.

Er werd

vastgesteld dat, bij prostaatkanker, tumorcellen verschillende antigenen uitdrukken, wat aanleiding kan geven tot een herkenning van deze vreemde antigenen door het immuunsysteem. Voor prostaatkankerdetectie zijn reeds verschillende antigenen de revue gepasseerd, enkel het prostaat-specifiek antigen (PSA) wordt algemeen aanvaard als een prostaat tumormerker, zodanig dat het PSA 15 jaar geleden werd geïntroduceerd in de urologie als prostaat tumormerker (Woolf et al., 1999). Het PSA is de eerste tumormerker die aanvaard werd door de Food and Drug Administration in de Verenigde Staten als een hulpmiddel in de diagnose van prostaatkanker in populatie screening programma’s (Diamandis, 2000). PSA wordt nu zelfs wereldwijd gebruikt als een prostaatkanker biomerker in populatie screening, diagnose en opvolgen van patiënten met prostaatkanker. Eén van de grote voordelen van het gebruik van PSA als tumormerker is zijn weefselspecificiteit, omdat enkel de prostaat het PSA aanmaakt (Belldegrum et al., 1998). Door de introductie van PSA metingen in de klinische praktijk kan een snellere diagnose van prostaatkanker gemaakt worden. Alhoewel voor vele patiënten de diagnose niet vlug genoeg kan gebeuren, want 30 tot 40% van de mannen met klinisch gelokaliseerde tumoren hebben reeds metastasen. Als prostaatkanker reeds in een vroeg stadium wordt opgespoord, is het potentieel geneesbaar door radicale prostaatectomie voor patiënten met een tumor, die beperkt is tot de prostaat (Chan et al., 1987). Door de ontdekking van PSA mag men hopen op een vroege opsporing van prostaatkanker in een geneesbaar stadium. Er is dus een grote nood aan verbeterde detectiemethoden van prostaatkanker, zolang de tumor beperkt blijft tot de prostaatklier zelf. Men aanvaardt dat een combinatie van serum PSA concentratie en rectaal onderzoek met een ultrasonografie in patiënten een betere methode is om prostaatkanker te detecteren dan rectaal onderzoek alleen.

2.2.2 Kallikrein serine protease familie De kallikrein familie is een subfamilie van de proteolytische enzymen superfamilie. Het prostaatspecifiek antigen is lid van de kallikrein gen familie. Deze familie bestaat uit minstens 14 genen, die alle coderen voor serine proteasen en die veel structurele gelijkenissen en significante homologieën dragen. Origineel werden kallikrein proteasen geïdentificeerd door hun mogelijkheid om kininen vrij te maken uit hoog moleculair gewicht substraten (Lundwall & Lilja, 1987). Juist omdat PSA een lid is van de kallikrein familie is het mogelijk dat zijn

25

biologische functies gerelateerd kunnen worden aan de activiteit van de andere kallikrein proteasen. De primaire structuur van PSA vertoont extensieve homologie met de humane kallikrein familie (Lundwall & Lilja, 1987). Het PSA wordt, zoals de andere leden van de kallikrein familie, aangemaakt als een pre-provorm, meer bepaald als een enkele polypeptide keten van 261 aminozuren. De eerste 17 aminozuren worden verondersteld van het signaal peptide te zijn, wat zorgt voor het transport naar het endoplasmatisch reticulum. Na verwijdering van de eerste 17 residu’s van de Nterminale zijde van de pre-pro-vorm van PSA, bereikt de pro-vorm van PSA (zymogen vorm) de celmembraan en wordt vervolgens gesecreteerd in het kanaalsysteem van de prostaat (Noldus et al., 1997). Een kleine hoeveelheid van het geproduceerde PSA komt eveneens in de bloedcirculatie terecht (figuur 4).

Fig. 4. Productie van PSA in de prostaat epitheel cellen (prostatic epithelial cells) en secretie naar het kanaalsysteem van de prostaat (prostate gland lumen) en naar de bloedcirculatie (blood vessel) (naar Belldegrum et al., 1998).

De secretie van PSA uit de prostaat epitheel cellen gebeurt onder de vorm van een pro-enzym (pro-PSA), die geactiveerd moet worden door de verwijdering van de eerste zeven aminozuren. Dit activeringsproces wordt gemedieerd door human glandular kallikrein 2 (hK2) (Diamandis, 2000; Nurmikko et al., 2000). De actieve vorm van PSA kan dan zijn fysiologische substraten hydrolyseren (figuur 5).

2.2.3 Prostaat-specifiek antigen Het prostaat-specifiek antigen is één van de drie meest overvloedige prostaat gesecreteerde proteïnen in het humane semen (Lilja et al., 1991). De prostaat maakt naast PSA ook 26

voornamelijk hK2 en prostase aan. Het PSA is een enkele polypeptide keten glycoproteïne van 237 aminozuren met vier carbohydraat zijketens. Het moleculair gewicht van de nietgeglycosyleerde vorm van het proteïne bedraagt 27 kDa. De geglycosyleerde vorm van PSA heeft een moleculair gewicht van 33 kDa. De site voor N-glycosylatie werd geïdentificeerd op het aminozuur residu asparagine 45. De rest van de glycosylaties vindt men op de O-geglycosyleerde residu’s serine 69, threonine 70 en serine 71 (Watt et al., 1986). Het protease bezit vijf disulfide bruggen, om zijn natieve 3D structuur in stand te houden (Zhang et al., 1995; Michel et al., 1999). Functioneel is het een orgaanspecifiek, kallikrein gelijkend serine protease geproduceerd door de prostaat epitheel cellen langsheen de kanalen van de prostaatklier (figuur 4). Het PSA is orgaanspecifiek, maar niet ziektespecifiek omdat het PSA uitgedrukt wordt bij zowel goed- als kwaadaardige processen in de prostaat epitheel cellen. Onder normale fysiologische condities wordt PSA gesecreteerd in het lumen van de prostaatkanalen. PSA wordt in hoge concentraties gevonden in het semen plasma en is een belangrijk deel van de prostaatsecreties. De hoofdfunctie van PSA is het vloeibaar maken van het semen coagulum (figuur 5). Normaal wordt slechts een kleine proportie van het geproduceerde PSA geabsorbeerd in de bloedcirculatie. De typische concentratie in het semen plasma bedraagt tussen 0,5 en 5 mg/ml. De concentratie van PSA in de bloedcirculatie bedraagt slechts enkele ng/ml (Noldus et al., 1997).

Fig. 5. Productie als pro-PSA, activering hoogstwaarschijnlijk door hK2, regulatie door inhibitoren en effect op semen vervloeiing (uit Diamandis, 2000).

27

Het PSA gezuiverd uit semen plasma is heel heterogeen. Het blijkt dat ongeveer 65% van het PSA in semen plasma intact en enzymatisch actief is. 35% is echter inactief, blijkbaar door een interne knipping van de polypeptide keten (Leinonen et al., 1996). De meest voorkomende knipping in PSA, die PSA enzymatisch inactief maakt, is deze tussen de aminozuren lysine 145 en lysine 146 (Lilja et al., 1992). De peptide knipping tussen deze twee residu’s zorgt voor twee vrije uiteinden, die hoogstwaarschijnlijk de proteïne conformatie beïnvloedt (Nurmikko et al., 2000). Deze knipping van PSA gaat gepaard met een reductie van pI en wordt geassocieerd met de verdere degradatie van PSA (Zhang et al., 1995). Ook kunnen knippingen van aminozuren aan het carboxyl uiteinde van PSA, veranderingen teweeg brengen in de conformatie van het proteïne en PSA enzymatisch inactief maken. De rest van het PSA geïsoleerd uit semen plasma, geeft een beperkte chymotrypsine activiteit bij een pH optimum van 7,8 (Lilja et al., 1992). Deze chymotrypsine gelijkende activiteit van PSA is consistent met de primaire structuur van PSA en met de PSA gemedieerde knippingen die gebeuren aan de carboxyl termini van bepaalde tyrosine en leucine residu’s in het substraat semenogeline. Uiteindelijk kan men uit semen plasma vijf isovormen van PSA zuiveren, twee intacte isoenzymen en drie geknipte vormen van PSA (Zhang et al., 1995; Wang et al., 2000).

2.2.4 Enzymatische reacties van PSA De algemeen aanvaarde enzymatische omzetting die onder invloed van PSA plaatsvindt, is de digestie van de semenogelines (semenogeline I en II) en fibronectinen (Robert et al., 1997). Deze biologische substraten zijn in heel hoge concentratie aanwezig in het semen plasma en PSA zorgt voor de vervloeiing van de semen coagulum na de ejaculatie. Het semen coagulum bestaat voor het grootste deel uit hoog moleculair gewichtsproteïnen of semenogelines. Het semen plasma wordt aangemaakt door de semen vesikels in de prostaat. Dit PSA gemedieerd enzymatisch proces heeft als biologische functie ervoor te zorgen dat de mobiliteit van de sperma cellen drastische verhoogd wordt. De karakteristieke proteolytische reactie wordt gekenmerkt door de katalytische triade, opgebouwd uit de aminozuren histidine, aspartaat en serine in de actieve site. De katalytische site regio bestaat uit de katalytische triade, residu’s die de oxyanion hole vormen en hoofdketen substraat bindende residu’s. De substrate specificity pocket van PSA gelijkt op die van chymotrypsine. Het residu aan de bodem van de substrate specificity pocket is hetzelfde in PSA en chymotrypsine (Vihinen, 1994). Al de gekende serine protease structuren bestaan uit

28

structureel geconserveerde regio’s en variabele regio’s die de geconserveerde verbinden. De structurele geconserveerde regio’s bevatten onder meer de katalytische triade. Het grote verschil tussen serine proteasen onderling zijn de variabele regio’s, waarbij de oppervlaktelussen verschillen in lengte. De katalytische residu’s zijn geconserveerd en de substraat specificiteit wordt verkregen door verschillen in de substraat herkenning regio’s (Vihinen, 1994). De katalytische site van zowel PSA als hK2 zijn zeer geconserveerd. De residu’s die de katalytische triade vormen en diegene voor de oxyanion hole zijn heel geconserveerd. De knipplaatsen in proteïnen, die substraat zijn van PSA, vertonen veel leucine en tyrosine residu’s. De sites voor knipping werden geïdentificeerd als α-carboxyl uiteinden van enkel hydrofobe residu’s zoals tyrosine, leucine, valine en fenylalanine en enkele basische residu’s zoals histidine, lysine en arginine (Watt et al., 1986; Wu et al., 2000).

2.2.5 Interactie van PSA met protease inhibitoren Een belangrijk aandeel van het gezuiverde PSA vanuit semen plasma en bloed serum is intern geknipt en dus biologisch inactief. De aanwezigheid van verschillende protease inhibitoren in semen plasma kan in verband staan met deze geknipte vorm. In de bloedcirculatie wordt de proteolytische activiteit van PSA geïnhibeerd door vorming van irreversibele complexen met serum protease inhibitoren specifiek voor serine proteasen, meer bepaald serpines (figuur 6). De meest voorkomende serum protease inhibitoren waarmee PSA interageert zijn alpha-1antichymotrypsine (ACT) en alpha-2-macroglobuline (A2M) en alpha-1-protease inhibitor (API) (Zhou et al., 1993; Christensson et al., 1990).

Fig. 6. Productie, secretie en interactie van PSA met inhibitoren A2M (of AMG) en ACT in de bloedcirculatie (naar Belldegrum et al., 1998).

29

In het semen plasma zijn de grote immunoreactieve vormen van PSA, het PSA-ACT complex, complex tussen PSA en proteïne C inhibitor en vrij PSA. 70% van het PSA in semen plasma komt voor als een enkele polypeptide keten enzymatisch actief molecule, waar ongeveer 30% geknipt is en geen enzymatische activiteit vertoont (Zhang et al., 1995). Omdat geen vrij protease kan gedetecteerd worden in semen plasma bij een grote overmaat aan inhibitoren, zal de 30 kDa vorm van PSA ofwel een pro-enzym zijn ofwel een geïnactiveerde vorm. Afhankelijk van het knipping patroon in de polypeptide hoofdketen, kan het PSA een partiële enzymatische activiteit behouden. De binding van proteasen met A2M wordt veroorzaakt door een capture mechanisme, waarbij de actieve proteasen een peptide binding in de doelwit regio van de protease inhibitor knippen. Hierdoor verandert de conformatie van de inhibitor en omgeeft zo het protease (Lilja et al., 1991). Op basis van het gegeven dat A2M verschillende vormen van PSA snel en efficiënt kan binden, is het mogelijk dat A2M een belangrijke rol in het metabolisme van PSA speelt. Het complexeren van PSA met A2M resulteert in een compleet verlies van de antigenische epitopen van PSA (Leinonen et al., 1997). In geval van complex vorming van PSA met ACT blijven een beperkt aantal epitopen vrij op het PSA. De 80 tot 90 kDa grote entiteit van PSA in complex met ACT is de predominante moleculaire vorm in serum. De kleinere moleculaire vorm van serum PSA is de ongeveer 30 kDa fractie die niet bindt met een protease inhibitor (Lilja et al., 1992). Een heel klein deel van PSA in serum is ook gecomplexeerd met API. Omdat de structuren van API en ACT zo verschillend zijn, is het mogelijk dat de bindende epitopen van PSA in het PSA-API complex, verschillen van die van het PSA-ACT complex (Zhang et al., 1999). Het ACT is één van de grote lever-gesecreteerde protease inhibitoren in het bloed (Christensson et al., 1993). Het PSA gebonden met ACT start pas met dissociëren na een lange incubatie tijd (10 dagen) bij 37°C (Leinonen et al., 1996). Gevormd aan een molaire verhouding van 1:1, zijn de inhibitor complexen tussen PSA en ACT in vitro heel stabiel. De stabiliteit kan verhoogd worden door de incubatie buffer een pH te geven tussen 6,8 en 7,4 en door een 100 tot 1000 molaire overmaat aan ACT toe te voegen. De PSA-inhibitor complexen zijn extreem stabiel onder de meeste condities. Het vrije PSA is stabiel gedurende vier weken bij incubatie bij 35°C (Pettersson et al., 1995).

30

Er werd geen correlatie gevonden tussen de mate van uitdrukking van ACT en de proportie van PSA gecomplexeerd met ACT. De proportie van het ACT complex neemt toe bij verhoogde PSA concentraties. Het complex tussen PSA en ACT is van covalente oorsprong. De covalente binding gebeurt tussen het serine 189 residu van de actieve site van PSA en het leucine 360 residu van ACT. Bij alkalische pH waarden kan een hydrolytische breking van deze covalente binding optreden. Nadat deze binding gebroken is, ondergaat ACT een grote conformationele verandering, doordat bij breking van de leucine 360 – serine 361 peptide binding, het niet meer kan binden aan enzymatisch actief PSA. Het vrijgemaakte PSA is evenwel enzymatisch actief in een enkele polypeptide keten vorm en kan een nieuwe covalente binding aangaan met een andere ACT molecule, indien deze molecule zich in functionele conformatie bevindt (Peter et al., 2000; Pettersson et al., 1995).

2.2.6 Epitoop mapping van PSA Antigenische determinanten als binding doelwitten van antilichamen kunnen opgedeeld worden in twee categorieën: lineaire (sequentiële, continue) en niet-lineaire (conformationele, discontinue). Lineaire epitopen bestaan uit aminozuur residu’s die elkaar opvolgen in de primaire sequentie. Niet-lineaire epitopen worden opgebouwd uit aminozuur residu’s die van elkaar verwijderd liggen in de primaire sequentie, maar bij elkaar gebracht worden als het proteïne zijn natieve 3D vorm aanneemt (Corey et al., 1997). Weinig is geweten over de antigenische determinanten van PSA die verantwoordelijk zijn voor antilichaam herkenning. Toch zijn er zes grote antigenische regio’s ontdekt op PSA. De inhibitie van PSA enzymatische activiteit en hindering van PSA-ACT associatie door monoklonale antilichamen kan niet gebruikt worden om te voorspellen of deze monoklonale antilichamen binden op vrij PSA, PSA-ACT complex of beide, want er bestaan meerdere vormen van vrij PSA in bloedserum: nicked (inactief) PSA en actief PSA (Stenman et al., 1991).

Sommige

monoklonale antilichamen kunnen de PSA-ACT associatie blokkeren, door periferale occlusie van de binding site of door inductie van conformationele veranderingen in PSA (Corey et al., 1997). Een onafhankelijke methode om de karakterisering van de binding doelwitten van de antiPSA monoklonale antilichamen te bestuderen is het effect na te gaan op de enzymatische activiteit van PSA. Deze activiteit is essentieel voor de vorming van PSA-ACT complex, wat impliceert dat antilichamen, die de activiteit van PSA beïnvloeden, geassocieerd kunnen worden

31

met de epitopen nabij de ACT binding site. Deze welbepaalde epitopen kunnen leiden tot de mogelijkheid om vrij PSA te detecteren ten opzichte van het complex. Van de zes antigenische regio’s van PSA, worden er vier herkend door monoklonale antilichamen in vrij PSA en PSA-ACT. Eén antigenische regio is niet bereikbaar in PSA-ACT en één regio associeert met antilichamen die een sterke voorkeur hebben voor vrij PSA (Corey et al., 1997). Deze regio voor het vrije PSA bestaat uit de kallikrein lus: residu’s 84 tot 91 (Michel et al., 1999). De antilichamen die alleen aan het vrij PSA binden, worden verwacht van de ACT-PSA associatie te inhiberen. Omdat PSA enzymatische activiteit nodig is voor de ACT binding, zou dit fenomeen eerst te wijten zijn aan de sterische hindering van de ACT binding pocket of aan conformationele wijzigingen van het PSA door de interactie met het antilichaam. De associatie van verscheidene monoklonale antilichamen verhinderen de ACT binding op PSA, en toch kunnen deze antilichamen het PSA-ACT complex binden. Dit wijst erop dat de eisen voor ACT associatie, een juist opgevouwen actieve site, strikter zijn dan voor de binding van de monoklonale antilichamen (Corey et al., 1997).

2.2.7 Mogelijke diagnostische testen Bij prostaatkanker dringt PSA in de bloedcirculatie, wat leidt tot een hogere PSA concentratie in het bloed. Hierdoor kan een meting van de hoeveelheid serum PSA een belangrijke merker zijn voor de diagnose en behandeling van prostaatkanker. De PSA concentratie in het serum verhoogt bij kwaadaardige vorm van prostaat kanker (PCa), alsook in patiënten met bacteriële prostatitis of de goedaardige vorm van prostaat kanker: benign prostatic hyperplasia (BPH). Ook de zymogen vorm van PSA wordt gevonden in het serum van prostaatkankerpatiënten. Omdat het zymogen niet actief is, kan het geen complexen aangaan met serpines en blijft dus in vrije vorm in de bloedcirculatie (Nurmikko et al., 2000). Verschillende onderzoekers gebruiken een serum PSA waarde groter dan 4,0 ng/ml door de Hydritech Tandem test en/of een abnormale digitaal rectaal onderzoek als een criterium voor mogelijke aanwezigheid van prostaatkanker (Catalona et al., 1991). Maar er zijn echter ook significante problemen bij het gebruik van serum PSA metingen als een screening hulpmiddel. Het blijkt dat ongeveer 20% van de klinisch significante kankers worden geassocieerd met PSA waarden in de normale fysiologische range. Daarenboven wijzen verscheidene studies op het feit dat patiënten met BPH ook verhogingen van serum PSA vertonen. Deze nadelen beperken evenwel de efficiëntie van PSA alleen als screening hulpmiddel in de strijd tegen prostaatkanker. De sensitiviteit van serum PSA metingen wordt gedefinieerd als

32

het percentage van de patiënten met prostaat kanker (PCa) die PSA waarden hebben, die boven de beslissingswaarde liggen. De specificiteit van serum PSA metingen wordt echter gedefinieerd als het percentage van de patiënten welke PSA waarden hebben die lager liggen dan of gelijk zijn aan de beslissingswaarde (Chan et al., 1987). De sensitiviteit van PSA is relatief hoog, maar de specificiteit is laag, zodat een verhoogde PSA waarde niet al de patiënten met prostaatkanker identificeert met een voldoende graad van selectiviteit. De kans bestaat eveneens dat een patiënt met BPH, gezien wordt als PCa patiënt.

2.2.8 Verbeterde diagnostische testen Om een verbeterd gebruik van PSA als indicator van prostaat kanker aan te wenden, zijn verschillende strategieën naar voren gebracht.Vele studies suggereren dat de ratio van serum PSA tot prostaat klier volume (PSA index of densiteit) een waarde heeft als indicator van mogelijke kwaadaardige prostaatkanker. Andere data ondersteunen de seriële metingen van serum PSA als een diagnostische test. Ook de snelheid van aangroei van de serum PSA waarde (PSA velocity) kan gezien worden als een sensitieve indicator van kwaadaardigheid van de prostaatkanker over een periode van verschillende jaren. Een recente ontwikkeling in prostaatkanker diagnostische tests op basis van serum PSA, is gevonden bij het vergelijken van de vrije versus totale hoeveelheid PSA in het serum. Omdat PSA eveneens is gevonden bij gezonde mannen zonder prostaatkanker, bestaat de moeilijkheid in het gebruik van deze tumormerker bij het definiëren van de normale waarden van serum PSA. Een verhoogde lekkage van PSA naar de bloedcirculatie, blijkt de oorzaak te zijn van de meeste PSA verhogingen bij prostaataandoeningen. Andere factoren, naast kwaadaardige prostaatkanker, die zorgen voor een verhoging van serum PSA zijn BPH, trauma en ontsteking van de prostaat. Met de bedoeling van een verhoogde PSA meting te definiëren, werd een normale PSA distributie voor mannen zonder prostaat aandoeningen gedetermineerd door gebruik te maken van de Tandem-R test (Hybritech, San Fransisco, CA, USA). De specificiteit van een test is van heel groot belang omdat een hogere waarde betekent dat er drastisch minder biopsieën moeten verricht worden onder mannen met een verhoogde serum PSA drempel, maar toch geen kwaadaardige prostaat kanker (PCa) vertonen. Vier methode zijn bekend om de specificiteit van PSA tests naar prostaatkanker te verbeteren (Belldegrum et al., 1998).

33

1. PSA densiteit (PSAD) wordt gedefinieerd als de ratio van serum PSA tot het volume van de prostaatklier. Omdat prostaatkankercellen meer PSA in de circulatie sturen dan hyperplastische cellen, kan het begrijpelijk zijn dat, als een patiënt PSA waarden heeft boven deze die verwacht worden bij een hyperplastische klier van dezelfde grootte, het verschil kan gemaakt worden tussen PCa en BPH. 2. Een andere manier om de specificiteit te verbeteren is het meten van de PSA velocity. Men gelooft dat de prostaatgroeisnelheid kan opgevolgd worden door jaarlijkse PSA waarden en dat bij incidentie van prostaatkanker een substantiële verhoging kan waargenomen worden. Echter wegens de op dagelijkse basis fluctuerende PSA waarden, door biologische en analytische variaties, mislukt het gebruik van metingen van de PSA velocity om te specificiteit van PSA testen te verbeteren. 3. De volgende wijze om prostaatkankerdetectie te vergemakkelijken is het aanwenden van leeftijd specifieke PSA referentie waarden. Ze zijn gebaseerd op het feit dat de PSA waarden verhogen met de leeftijd en dat de PSA drempelwaarde specifieker is voor elke leeftijdscategorie. Maar eens te meer tonen niet alle uitgevoerde studies het voordeel aan van leeftijd specifieke drempelwaarden doorheen alle leeftijdsgroepen. 4. De meest verheugende vooruitgang in het onderzoek naar prostaatkanker is de ontdekking van verschillende vormen van PSA. Er werden sterke aanwijzingen gevonden dat er een correlatie bestaat tussen de gecomplexeerde vorm van PSA en prostaatkanker. Door een gebrek aan ACT productie in BPH, kan dit leiden tot de verhoogde vorming van PSAACT complex bij de prostaatkankerpatiënten. Het verklaart natuurlijk ook de verschillen in hoeveelheid vrij PSA tussen BHP en PCa. Voor de studie van PSA in serum zijn er drie testen ontwikkeld (Christensson, 1993). Een eerste (T) test detecteert de epitopen van PSA, die beschikbaar zijn zowel op vrij PSA als op PSA dat complexen vormt met protease inhibitoren, zoals ACT.

Fig. 7. De T test detecteert de totale hoeveelheid PSA in een staal.

Een tweede (C) test is er één die enkel PSA detecteert onder de vorm van complex met ACT. 34

Fig. 8. De C test detecteert enkel het PSA dat gecomplexeerd is met ACT.

De laatste (F) test zal enkel het PSA detecteren dat geen complex kan vormen.

Fig. 9. De F test detecteert enkel het vrije PSA in het staal.

Door deze drie testen te gebruiken in de meting van de verschillende vormen van PSA in het serum, werd nu duidelijk dat de proportie van PSA-ACT complex hoger is in patiënten met PCa dan in BHP (Christensson et al., 1993; Lilja et al., 1992; Stenman et al., 1991). De concentratie van vrij PSA, dat geen complex vormt, is lager in patiënten met PCa dan die patiënten met BHP. Een betere discriminatie kan verkregen worden door de ratio vrij PSA tot totaal PSA te gebruiken in plaats van de ratio gecomplexeerd PSA tot totaal PSA (Pettersson et al., 1995). De standaard voor PCa patiënten is 90% PSA-ACT en 10% vrij PSA. De ratio van deze verschillende vormen van PSA, die zijn gevonden in serum, is representatief voor patiënten met prostaatkanker (Rafferty et al., 2000). De verlaagde ratio van vrij PSA tot totaal PSA in het serum van prostaatkankerpatiënten kan veroorzaakt worden door verschillende processen op het cellulaire niveau (Jung et al., 2000): (a) een veranderde synthese van ACT in neoplastische cellen, vergeleken met goedaardige cellen. Deze leidt tot een verhoogde vorming van PSA-ACT complex reeds vroeg in kwaadaardige cellen, juist voor de vrijlating in de bloedcirculatie (b) het vrijmaken van verschillende proporties van enzymatische inactieve PSA vormen, die op een verschillende wijze reageren met ACT in de bloedcirculatie

35

(c) de veranderde glycosylatiegraad van PSA in neoplastische cellen, leidend tot karakteristieke verschillen in de verwijdering van PSA isovormen uit het bloed.

2.2.9 Laatste ontwikkelingen De laatste jaren zijn er studies gemaakt naar het examineren van het ejaculaat om een meer specifieke en minder ingrijpende methode voor opsporing en karakterisering van prostaatkanker te vinden. De basis van de studie is de veronderstelling dat van alle mogelijk onderzochte weefsels en vloeistoffen, de inhoud van het ejaculaat het best de cellulaire disfunctie van de prostaatklier kan reflecteren (Clements et al., 2000). Op gelijkaardige manier dat de ratio van vrij PSA tot totaal PSA in serum een gemakkelijke manier is om te differentiëren tussen goedaardige (BPH) en kwaadaardige (PCa) vorm van prostaatkanker, moet er ook een gelijkaardige correlatie bestaan in het ejaculaat supernatans. Het ejaculaat of semen plasma werd over het algemeen niet beschouwd als een mogelijke bron van selectieve merkers voor prostaataandoeningen. Alhoewel de veranderingen in serum PSA bij prostaatziekten gecorreleerd kunnen worden met een verandering in lekkage in de bloed circulatie door afbraak van de prostaat cel architectuur. Er wordt verwacht dat de waarden van PSA in semen plasma lager zijn bij mannen met een kwaadaardige prostaatziekte. Telkens komt men het probleem tegen dat de ratio van vrij PSA tot totaal PSA in semen plasma of bloed serum afhankelijk is van de leeftijd van de persoon in kwestie. Een ander probleem is dat de vrije, geknipte vormen van PSA in serum misschien op een verschillende manier wordt herkend in de PSA tests. Het blijkt echter dat er ook verschillen zijn in de waarden van geknipte vormen van PSA, aanwezig in het serum van mannen met BHP of PCa. Het ejaculaat kan dus ook als een potentiële indicator gebruikt worden van urogenitale ziekten. Metingen van serum PSA bieden verschillende voordelen: economisch haalbaar, makkelijk uitvoerbaar, gemakkelijk aanvaard door de patiënt en objectieve resultaten.

2.3 Doelstelling We hebben tot doel kameel antilichaam fragmenten af te zonderen tegen het prostaat-specifiek antigen. Door middel van kameel immunisering met een halfgezuiverde PSA mengsel, kan men, na verschillende PCR reacties, de VHH genen kloneren in een fagmide vector. Na verschillende ronden van in vitro selectie (panning), kunnen verschillende PSA specifieke kameel antilichamen fragmenten geïdentificeerd worden. Om een mogelijke prostaatkanker test te produceren, moeten er zeker twee verschillende kameel antilichaam fragmenten gevonden worden: één VHH die een epitoop herkent op totaal PSA (som van oplosbaar vrij PSA en PSA-ACT complex) en één VHH 36

die enkel een epitoop op vrij PSA detecteert of één VHH die enkel het PSA-ACT complex herkent. Het epitoop voor herkenning van totaal PSA is een epitoop dat niet te dicht gelegen is bij de actieve site van PSA, want complex vorming van PSA met ACT zal zorgen voor een blokkering van de actieve site van PSA. Voor de detectie van alleen het oplosbare vrije PSA zal best een VHH afgezonderd worden, die een epitoop van PSA herkent, dat ligt in de buurt van de actieve site van PSA en niet kan herkent worden als ACT gebonden is op PSA. Een epitoop om enkel gecomplexeerd PSA te detecteren, zal overeenkomen met het zoeken naar een VHH die bindt op PSA-ACT. Een andere vereiste voor een prostaatkanker test, is de mogelijkheid van de kameel antilichaam fragmenten om met een voldoende hoge affiniteit en specificiteit het vrije PSA en/of het gecomplexeerde PSA uit een bloed- of semenstaal te vangen.

37

3 Materiaal en methoden 3.1 Micro-organismen (Escherichia coli) De volgende 2 E.coli stammen werden gebruikt: E.coli TG1 (Sambrook & Russell, 1989) K12, ∆(lac-pro), supE, this, hsdD5/F’traD36, proA+B+, laclq, lacZ∆M15 E.coli WK6 ∆(lac-proAB), galE, StrA/F’, laclq, lacZ∆M15, proA+B+

3.2 Media en Buffers LB medium (Luria-Bertani medium, pH 7,0) Bacto-tryptone 10 g Bacto-yeast extract 5 g NaCl 10 g H2O tot 1 liter eindvolume 2x TY medium (pH 7,0) Bacto-tryptone 16 g Bacto-yeast extract 10 g NaCl 5 g H2O tot 1 liter eindvolume TB (Terrific Broth) Bacto-tryptone 12 g Bacto-yeast extract 24 g Glycerol 4 ml KH2PO4 2,31 g K2HPO4 12,54 g H2O tot 1 liter eindvolume SOB Bacto-tryptone 20 g Bacto-yeast extract 5 g NaCl 0,5 g KCl 1,86 g 38

H2O tot 1 liter eindvolume PBS 136 mM NaCl 2,6 mM KCl 10 mM Na2HPO4 1,5 mM NaH2PO4 (pH 7,4) PBS-caseïne PBS + 1% (w/v) caseïne PBST PBS + 0,05% (v/v) ‘Tween 20’ TE 10mM Tris-HCl (pH 8,0) 1 mM EDTA (pH 8,0) Tris-Glycine 50mM Tris 0,38% Glycine 0,1% SDS TES 0,2 M Tris-HCl (pH 8,0) 0,5 mM EDTA 0,5 M sucrose 10x TBE 108 g Tris 55 g boorzuur 9,3 g EDTA H2O tot 1 liter eindvolume DNA loading buffer 0,25% bromofenol blauw 0,25% xyleen cyanol FF 15% Ficoll (Type 400, Pharmacia) in H2O 10x Laemmli buffer (pH 8,3) 30,3 g Tris 144 g glycine

39

10 g SDS H2O tot 1 liter eindvolume Protein loading buffer 7 ml 0,5 M Tris (pH 6,8) 3 ml 100% glycerol 1 g SDS 1,2 mg bromofenol blauw Staining solution (kleuren SDS-PAGE) 0,125 g Coomassie R250 50% methanol 10% azijnzuur H2O tot 100 ml eindvolume Destaining solution (ontkleuren SDS-PAGE) 100 ml 100% azijnzuur 400 ml methanol 500 ml H2O Transfer buffer 14,4 g glycine 3 g Tris 200 ml methanol H2O tot 1 liter eindvolume Blot/ELISA buffer (pH 9,8) 1 M diethanolamine 1mM MgSO4 PEG oplossing 20% PEG 2,5 M NaCl 1x ABTS 450 ml 50 mM citroenzuur (pH 4,0) 100 mg ABTS Amp 1000x stockoplossing = 100 mg/ml opgelost in 70% ethanol Kan 1000x stockoplossing = 70 mg/ml opgelost in H2O IPTG 1 M in H2O opgelost

40

3.3 Plasmiden en vectoren Alle gebruikte vectoren beschikken over het gen voor ampicilline resistentie. Elke incubatie van E.coli cellen gebeurt met gebruik van ampicilline in het medium.

3.3.1 pHEN4

--TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGC 79

SfiI

NcoI

CCAGGTGCAGCTGCAGGAGCTCGAGGATCCGGTCACCGTCTCCAGCGGCCGC Pst

XhoI

NotI/EagI

TACCCGTACGACGTTCCGGACTACGGTTCCGGCCGAGCATAG ACTGTTG----------------------------Dec-tag--------------------------

EagI

amber

Fig. 10. pHEN4 vector. Relevante genen, regio’s en restrictie enzym sites zijn weergegeven. Daaronder een voorstelling van de multiple cloning site van de vector (positie 79 tot 204), met de polylinker en een decapeptide tag (haemaglutinine tag). Belangrijke restrictie enzym sites zijn onderlijnd.

41

De pHEN4 vector heeft een PelB signaal sequentie om te zorgen dat het VHH fragment naar het periplasma getransporteerd wordt. Achter het VHH fragment is een haemaglutinine tag die detectie in ELISA en Western Blot mogelijk maakt. Deze tag wordt gevolgd door het gen3, dat zorgt voor de aanmaak van het fusie eiwit VHH-gen3p. Deze fagmide vector is geschikt voor de pannings. Tussen de tag en het gen3 zit een amber stopcodon (TAG) dat in een suppressor E.coli stam (zoals TG1) partieel gesuppresseerd wordt.

3.3.2 pHEN6

---GACGTGCAGCTGCAGGCG ----------//---------- CAGGTCACCGTCTCCTCA 95

BstEII

484

------------------------------------------cAbPSA11---------------------------------------------CGCGGCCGCCACCACCATCACCATCAC TAA TAGAATTC----------------His6-tag--------------ochre amber Fig. 11. pHEN6-cAbPSA11. Relevante genen, regio’s en restrictie enzym sites zijn weergegeven. Daaronder een deel van de sequentie met de BstEII site en de His6-tag.

42

Deze vector is grotendeels gelijkend aan de vector pHEN4, maar de haemaglutinine tag en de gen3 sequentie zijn vervangen door een His6-tag. Deze vector wordt gebruikt voor eenvoudige productie en snelle zuivering van VHH’s als oplosbaar eiwit door IMAC.

3.3.3 pHEN7

--TTACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGCTCGAGGA 79

SfiI

NcoI

PstI

XhoI

TCCGGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCACACCACCATCACCATCACTCGGCCGC NotI

--------------His6-tag-------------

AGAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAATGGGGCCGCATAGACTGTT--------------------------------c-myc-tag------------------------------------------amber

236

Fig. 12. pHEN7 vector. Relevante genen, regio’s en restrictie enzym sites zijn weergegeven. Daaronder, een deel van de sequentie van de vector (positie 79 tot 236), met de polylinker en de twee tags (hexahistidine en c-myc). Restrictie enzym sites zijn onderlijnd.

43

De pHEN7 vector heeft de eigenschappen van de vorige vectoren. Het bezit een His6- en c-myctag alsook het gen3 voor gebruik in panning.

3.4 Primers Tabel 1. Alle gebruikte PCR primers voor de amplificatie van de VHH genen. De restrictie enzym sites zijn onderlijnd.

Primer naam

Nucleotidensequentie 5’-3’

Call001

GTCCTGGCTGCTCTTCTACAAGG

Call002

GGTACGTGCTGTTGAACTGTTCC

SM017

CCAGCCGGCCATGGCTGATGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG NcoI

SM018

CCAGCCGGCCATGGCTCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG NcoI

A4Short

CATGCCATGACTCGCGGCCCAGCCGGCCATGGC SfiI

FR4FOR = 38

NcoI

GGACTAGTGCGGCCGCTGGAGACGGTGACCTGGGT NotI

BstEII

3.5 PCR reactie Met behulp van een PCR reactie kan men via specifieke primers een gewenst stuk van een DNA sequentie amplifiëren om dan in verdere manipulaties te gebruiken. Praktische uitvoering De PCR reacties werden uitgevoerd volgens de instructies van de enzym leverancier. PCR reactie mengsel met DNA primer 1 en 2: − 1 tot 10 ng template DNA (dit is meestal 1 tot 2 µl) − 5 µl 10x PCR buffer − 1 tot 2 µl primer 1 (20 µM) − 1 tot 2 µl primer 2 (20 µM) − 0,2 tot 1 µl Taq DNA polymerase (als laatste toevoegen) − 1 µl dNTP (20 mM) − aanlengen met H2O tot 50 µl

44

Bij elke uitvoering van een PCR werd een negatieve controle toegevoegd, om mogelijke contaminaties na te gaan bij het bereiden van het PCR reactie mengsel. Het volgende standaard programma kan algemeen gebruikt worden: 5’ op 94°C 25 tot 30 cycli van: − 20’’ tot 1’ op 94°C − 20’’ tot 1’ op 50 tot 58°C − 20’’ tot 1’ op 72°C 7’ tot 10’ op 72°C

3.6 Kolonie PCR en fingerprinting Een snelle manier om de kolonies met de juiste VHH fragment insert te detecteren is via de zeer gevoelige PCR techniek. Via de specifiek aangepaste primers kan men uit de cellen selectief screenen voor het gewenste fragment. Voor de kolonie PCR om VHH fragmenten te screenen werden de primers A4Short en 38 gebruikt. Om identieke of verschillende amplificatie producten te onderscheiden werd een fingerprinting uitgevoerd door restrictie enzym digestie. Praktische uitvoering Aan de PCR tube werd een op een tip geprikte kolonie toegevoegd. Goed mengen en roeren van de tip in de PCR tube. Het standaard PCR programma is zoals bovenstaand weergegeven, met de tijdsduur van de cycli stappen op 25’’ en de annealing temperatuur op 58°C. Na het uitvoeren van de PCR, werd aan elke 50 µl PCR tube de benodigde restrictie enzymen toegevoegd: − 1 µl HinfI (10 U/µl) − 6 µl 10x restrictie enzym buffer De restrictie reactie werd geïncubeerd bij 37°C voor minstens één uur. Dit restrictie mengsel werd op een 2% agarose-1000 gel geladen om het restrictiepatroon te fingerprinten.

3.7 DNA agarose gels Onder invloed van een elektrisch veld worden de DNA moleculen op basis van hun lengte gezeefd doorheen de agarose gel. Deze methode is zeer hulpzaam en snel tijdens kloneringtechnieken en laat toe om op een efficiënte en snelle manier te bepalen of het gewenste plasmide al dan niet is opgenomen door de bacterie of om te zien of een PCR reactie al dan niet het correcte fragment heeft geamplifieerd.

45

Praktische uitvoering Voor scheiding van fragmenten groter dan 200 bp en maximum 1,5 kbp, werd een scheiding op 1% agarose gel in 1x TBE buffer verricht. Voor de detectie van DNA werd ethidiumbromide gebruikt, aan ongeveer een concentratie van 0,2 µg/ml in de agarose gel. Bij de scheiding werd een voltage van 100 tot 150 V aangewend. Om fragmenten met een lengte kleiner dan 200 bp te scheiden (fingerprinting) werd een 2% agarose-1000 gel gebruikt. Als basenpaar merker werd gebruik gemaakt van de Smartladder (Eurogentec) die tevens de mogelijkheid verschaft om de concentratie of hoeveelheid van het DNA op gel te bepalen. Bij elke agarose gel wordt de volgende basepaar merker (Smartladder van Eurogentec) toegevoegd. Het aantal baseparen wordt samen met de hoeveelheid weergegeven.

3.8 DNA digestie Om een DNA fragment in een plasmide te kloneren dienen beide allereerst gedigereerd te worden met de gepaste restrictie enzymen. Om een fragment uit een vector te halen, wordt er geknipt met restrictie enzymen die het fragment flankeren. Praktische uitvoering Alle restrictie enzym reacties werden uitgevoerd volgens de instructies van de enzym leverancier. Aan 100 ng tot 1 µg DNA template DNA werd het volgende toegevoegd: − 1 µl restrictie enzym (dit is 10 U) − 1/10 volume van totale reactiemengsel 10x restrictie enzym buffer De rest van het mengsel werd aangelengd met H2O. De restrictie werd gedaan voor minstens 1 uur bij de optimale werkingstemperatuur van het welbepaalde restrictie enzym. Afhankelijk van de hoeveelheid te knippen DNA werd het reactie mengsel langer geïncubeerd. Als een vector

46

werd gedigereerd dan diende deze gezuiverd te worden na digestie. De band met de gepaste lengte werd uit de gel gesneden en het vector DNA werd door middel van de JetSorb kit (Genomed) uit de agarose gel gezuiverd. Voor de pHEN4/pHEN7 - pHEN6 herklonering stap werden de enzymen NcoI en BstEII gebruikt om zowel de VHH PCR fragmenten als pHEN6 vector te digereren. De restrictie werd uitgevoerd overnacht. Een zuiveringstap werd gedaan aan de hand van de Qiagen PCR Purification kit en protocol. Het digestie mengsel kan desgewenst gestockeerd worden op –20°C voordat de zuivering van het fragment of vector kan beginnen.

3.9 Zuivering van DNA fragment uit agarose gel Praktische uitvoering Jetsorb Kit (Genomed) zuivering werd gedaan volgens bijgeleverd protocol van de leverancier.

3.10

Ligatie van DNA fragment met vector of plasmide en zuivering/ontzouting

Om twee of meerdere fragmenten DNA met elkaar te verbinden wordt het T4 DNA ligase enzym toegevoegd om de compatibele uiteinden met elkaar te verbinden. Men dient wel rekening te houden met de aard van de uiteinden van de fragmenten, want sticky-sticky ligatie zal verschillend verlopen dan een blunt-blunt ligatie. Ook kunnen de verhoudingen van fragment tot vector verschillen om een efficiënte ligatie te verkrijgen. Praktische uitvoering Voor een herklonering ligatie werd de ligatie reactie uitgevoerd in een volume van 50 µl met daarin 5 µl T4 DNA ligase en 5 µl 10x ligase buffer, voor een bibliotheek ligatie werd gewerkt met volumes tot 500 µl. De rest van het ligatie mengsel bevat de vector en de fragmenten en H2O om tot het juiste eindvolume te komen. De ligatie reactie voor een herklonering werd gedaan bij kamertemperatuur voor minstens één uur, echter bij een ligatie voor het maken van een bibliotheek werd de reactie gedaan overnacht bij 16°C. Om het ligase enzym te inactiveren, werd het reactie mengsel eerst voor een tiental minuten opgewarmd bij 65°C, zodanig dat het ligase enzym niet kan tussenkomen in de volgende stappen van de ligatie. Aan het geïnactiveerde ligatie mengsel werd voor zuivering éénzelfde volume fenol/chloroform (1/1) toegevoegd en dit werd voor 30’’ gevortext. Na een korte centrifugatie van 1’ bij 13000 rpm stelde het fasenevenwicht zich in: het geligeerde DNA bevond zich in de bovenste fase. Om de daaropvolgende transformatie te laten verlopen met een maximale transformatie efficiëntie werd het ligatie 47

mengsel eerst gezuiverd om alle contaminerende zouten te verwijderen. Dit werd verricht via gebruik van de QiaQuick PCR Purification Kit van Qiagen.

3.11 Plasmide transformatie in E.coli cellen Het gezuiverde DNA, plasmide of vector, kan via electroporatie in competente E.coli cellen getransformeerd worden om het gewenste proteïne aan te maken. Het gezuiverde DNA kan afkomstig zijn van een plasmide preparatie of van een bibliotheek ligatie. Praktische uitvoering Juist voor gebruik bij transformatie werd SOC milieu aangemaakt: 25 ml SOB milieu met: − 0,4% glucose oplossing − 10 mM MgSO4 − 10 mM MgCl2 Het te transformeren DNA wordt in H2O opgelost, aan een maximaal volume, dat 1/10 is van het celsuspensievolume. Het reactiemengsel werd overgebracht naar een 1 mm electroporatiecuvet en de electroporatie werd verricht in een electroporatie toestel (Bio-Rad). Het voltage voor de electroporatie was 1,8 kV. Meteen na de electroporatie werd 1 ml SOC milieu toegevoegd en geïncubeerd bij 37°C voor minstens één uur. Bij het gebruik van puur plasmide vanuit een plasmide preparatie werden er verdunningen uitgeplaat, bij niet zuiver plasmide of ligatie mengsel, werd geen verdunning uitgeplaat. Van het reactiemengsel werd 100 tot 150 µl uit op geschikte antibiotica platen en overnacht geïncubeerd bij 37°C.

3.12 Expressie test, maken van periplasmatisch extract Om te screenen of er duidelijke expressie is van VHH fragmenten specifiek voor het antigen, kan een kleine expressie test verricht worden, met als voordeel een heel snelle screening van een groot aantal kolonies. Alle expressievectoren bevatten de PelB signaal sequentie zodanig dat het recombinant proteïne na expressie getransporteerd wordt naar het periplasma. Om de proteïnen uit dit periplasma te krijgen, moet men een osmotische shock geven, zodat de buiten membraan permeabel wordt en de periplasmatische proteïnen in het supernatans lekken. Deze osmotische shock is mild om niet de hele bacteriële celwand te breken en alle mogelijke bacteriële cytosolische proteïnen in het supernatans te verkrijgen. Het extract kan gebruikt worden voor detectie van het proteïne in Western Blot en detectie in ELISA.

48

Praktische uitvoering Het maken van het periplasmatisch extract werd gedaan volgens Skerra & Plückthun (1988). − 10 ml TB medium, met juiste antibiotica, incuberen met afzonderlijke kolonie of bacteriën uit een glycerol stock. − Bij 37°C al schuddend incuberen tot een OD600nm tussen de 0,3 en 0,5 bereikt wordt en dan de cultuur induceren door toevoegen van 1 M IPTG tot een eindconcentratie van 1 mM. − Productie van VHH fragmenten werd gedaan overnacht bij 37°C. − Cellen afcentrifugeren aan 3000 tot 4000 rpm voor 5’ tot 10’. − Bacterieel pellet resuspenderen in 200 tot 300 µl (= 1 volume) TES en voor 20’ op ijs incuberen. − 300 tot 450 µl (= 1,5 volume) TES/4 toevoegen en incuberen op ijs voor 30’. − Centrifugatie aan 13000 rpm voor 20’. Het supernatans bevat de periplasmatische proteïnen, waarin de periplasmatische eiwitten zitten, en is klaar voor verdere experimenten.

3.13 DNA Miniprep protocol De uitvoering van de plasmide bereidingen werd gedaan volgens de instructies in de handleidingen van de kits (Qiagen Qiaquick). Praktische uitvoering − 10 ml LB milieu, met het juiste antibiotica, incuberen met juiste kolonie. − Overnacht schuddend incuberen bij 37°C. − Culturen afcentrifugeren bij 3000 tot 4000 rpm voor 10’. − Nu werd het Qiaprep Miniprep Kit protocol gevolgd. − DNA precipitatie: 1/10 volume 3 M NaAcetaat toevoegen, samen met 2 volumes 100% ethanol. − Mengsel minstens 20’ incuberen op –80°C of ten minste één uur bij –20°C. − Centrifugatie bij 13000 rpm voor 20’. − Pellet wassen met 300 µl 70% ethanol en drogen op 37°C. Gedroogd pellet resuspenderen in 20 µl H2O of TE.

49

3.14 SDS-PAGE Detectie van een proteïne uit een mengsel of bepaling van de zuiverheid van een bepaald proteïne in een mengsel kan gedaan worden via SDS-PAGE. De scheiding is gebaseerd op basis van het moleculair gewicht van het proteïne en op basis van de lading. Het principe is dat de proteïnen gedenatureerd worden door middel van de SDS dat zich rond de proteïnen gaat binden en een nagenoeg uniforme negatieve lading geeft per eenheid van polypeptide lengte. Het mengsel wordt onder invloed van een elektrisch veld gebracht waardoor de proteïnen door de acrylamide gel migreren en waarbij de grootste proteïnen het traagste migreren. De proteïnen worden als het ware door de gel getrokken die als een zeef fungeert. De mobiliteit van de meeste proteïnen onder deze condities is lineair met het logaritme van hun moleculaire massa. Dit is een eenvoudige en snelle methode die algemeen toegepast wordt. De proteïnen kunnen na elektroforese eenvoudig gevisualiseerd worden door kleuring met Coomassie blauw. De methode hier gebruikt volgt diegene beschreven door Laemmli (1970). Praktische uitvoering De volgende oplossingen zijn voor twee 12% SDS geltabs: Running gel: − 3,3 ml H2O − 4 ml 30% Acryl/bis acrylamide (verhouding 29/1) − 2,5 ml 1,5 M Tris pH 8,8 − 100 µl 10% SDS − 100 µl 10% APS − 5 µl Temed (crosslinker) Stacking gel: − 3,4 ml H2O − 830 µl 30% Acryl/bis acrylamide (verhouding 29/1) − 630 µl 1M Tris pH 6,8 − 50 µl 10% SDS − 50 µl 10% APS − 5 µl Temed Eerst werd de running gel gegoten, ongeveer 4 ml per geltab. Als de running gel gepolymeriseerd was, werd de stacking gel erop gegoten. Voor de proteïne benchmark (GibcoBRL) werd maar 5 µl geladen. Het voorbereiden van de proteïne stalen gebeurt door de stalen te koken met DTT of mercaptoethanol en protein loading buffer voor de gereduceerde stalen of alleen met loading

50

buffer voor niet-gereduceerde stalen. De gel werd gelopen aan een voltage van 135 V in de stacking gel en 180 V in de running gel. De gel kan dan gebruikt worden in een Coomassie kleuring of een Western Blot. Voor de Coomassie kleuring laten we de gel een 30’ incuberen in een Coomassie kleurstof, daarna spoelen we met water en doen we destaining solution erbij, totdat de meestal blauwe kleuring uit de gel is gediffuseerd en de gel doorzichtig wordt. De gel werd dan tussen 2 cellofaan lagen gelegd en overnacht gedroogd. Zowel voor SDS-PAGE als Western Blot wordt dezelfde MW merker gebruikt. De verschillende MW’s worden weergegeven.

3.15 Western Blot Bij de techniek van Western Blotting gaat men na of een band op de gewenste hoogte op de SGSPAGE gel wel degelijk het gewenste proteïne is. Men kan na transfer van de proteïnen naar een nitrocellulose membraan onder invloed van een elektrische veld, het gewenste proteïne detecteren door middel van antilichamen, gericht tegen één welbepaald epitoop van het proteïne, of van polyklonale antilichamen, gericht tegen verschillende epitopen; het is evident dat polyklonale antilichamen een hogere achtergrond zullen opleveren dan monoklonale antilichamen door mogelijke kruisreacties. Men gaat dus het liefst gebruik maken van monoklonale antilichamen indien ze beschikbaar zijn. Praktische uitvoering De Western Blots werden uitgevoerd in een semi-dry blotting machine, met de volgende opstelling volgens het principe van de semi-dry blot. Alle filters en membraan werden eerst natgemaakt in transfer buffer. Eerst werd een laag van 3 Whatman filter papiertjes gelegd als

51

onderlaag. Hierop werd het nitrocellulose membraan geplaatst, met de SDS-PAGE gel erop. Dit werd afgedekt met een nieuwe reeks van 3 Whatman filter papiertjes. De blotting gebeurde voor 35’ aan 225 mA, het voltage mag maximum tot aan 60 V gaan, omdat anders de kans bestaat dat de gel oververhit en de blotting mislukt. Het blotmembraan werd geïncubeerd in PBS+caseïne overnacht, om alle open ruimte te volzetten met niet-significante proteïnes. Dit noemt de overcoating. De wasbeurt, die toegepast werd tussen elke stap, bestaat uit vijfmaal spoelen met PBS of PBST. De geblotte proteïnes werden dan gevisualiseerd door verschillende antilichamen (aan een verdunning van 1/1000, zie resultaten) aan een incubatieperiode van telkens voor elk antilichaam van één uur. De ontwikkeling in een blot buffer met 0,05 mg/ml BCIP (Sigma) en 0,2 mg/ml NBT (Sigma). De kleurreactie werd beëindigd door het reactiemengsel met H2O weg te spoelen.

3.16 Immunisering van kameel Door een kameel te immuniseren zal een humorale of antilichaam respons opgebouwd worden tegen het subcutane ingespoten antigen. De periferale bloed lymfocyten moeten afgezonderd worden om de VHH genfragmenten te kunnen kloneren. Praktische uitvoering Een kameel kreeg zesmaal een antigen dosis van 1 mg. Voor de eerste immunisering werd het antigen gemengd in Compleet Freund’s Adjuvans, al de volgende boosts verder uitgevoerd in Incompleet Freund’s Adjuvans. Na dit immunisering protocol, werd niet-gecoaguleerd bloed verkregen van de kameel en hieruit werd lymfocyten bereid. De werkwijze ging volgens Uni-Sep (WAK-Chemie, Duitsland). De cellen werden geteld en aliquots van 5x106 werden gepelleteerd en bewaard op –80°C tot verder gebruik.

3.17 Fractionatie van IgG subklassen Door de scheiding van de IgG subklassen kan men voor het maken van de bibliotheek een goed beeld hebben van de respons van de antilichamen op het ingespoten antigen. Praktische uitvoering De scheiding van de IgG subklassen werd verricht door differentiële adsorptie op Hitrap-proteïne A en Hitrap-proteïne G kolommen (Pharmacia). IgG3 en IgG1 subklassen werden geëlueerd van een proteïne G kolom bij respectievelijk pH 3,5 met een acetaat buffer en pH 2,7 met een glycine-HCl buffer (Hamers-Casterman et al., 1993). De flow-through werd geladen op een

52

proteïne A kolom, om de elutie van geabsorbeerde IgG2 subklasse te verrichten bij pH 3,5 met een acetaat buffer. Voor de concentratie bepaling werd een spectrofotometrische meting gedaan bij 280nm, waarbij ε1% gelijk is aan 13,5 voor alle IgG subklassen.

3.18 VHH bibliotheek constructie De periferale bloed lymfocyten bevatten de genen voor de VHH fragmenten. mRNA wordt afgezonderd en de VHH genfragmenten worden selectief geamplifieerd, na aanmaak van cDNA. Nadien worden de VHH genfragmenten gekloneerd in een speciale vector (pHEN4 of pHEN7), geschikt voor in vitro selectie door panning. Praktische uitvoering Het mRNA werd geïsoleerd vanuit de lymfocyten (Ready-to-go kit, Pharmacia) en cDNA werd geprepareerd (Ready-to-go Beads, Pharmacia). Met de specifieke DNA primers Call001 en Call002, die respectievelijk binden aan de leader nucleotidensequentie en op het CH2 exon sequentie van de zware keten van de antilichamen, kon het genfragment geamplifieerd worden dat codeert voor de variabele regio, eventueel het CH1 domein, hinge en deel van het CH2 domein van de zware keten van de antilichamen. Het juiste gen fragment, dat de VHH fragmenten bevat, werd gescheiden van de andere gen fragmenten door scheiding in en zuivering uit agarose gel. Een reamplificatie van de VHH gen fragmenten via een geneste PCR met primers die annealen respectievelijk op FR1 en FR4, werd verricht met de primers SM017/018 (in equimolaire hoeveelheid) en 38 voor de eerste van de twee geneste PCR reacties. Deze PCR gaf fragmenten van ongeveer 420 bp weer. De tweede van de geneste PCR werd gedaan met de primers A4Short en 38, die de restrictie sites NcoI en NotI bevatten. Bij deze PCR werden fragmenten van ongeveer 400 bp verkregen. Met behulp van deze restrictie sites werden de finale PCR producten gekloneerd in de pHEN4 vector volgens Ghahroudi (1997).

3.19 Panning en selectie van antigen bindende kameel antilichaam fragmenten Door gebruik te maken van faag display, werden de VHH fragmenten uitgedrukt op de tip van de fagen. Drie ronden in vitro selectie voor het antigen bij coating van 10 µg/well, werden verricht om specifieke VHH fragmenten aan te rijken. Deze in vitro selectie techniek werd panning genoemd (Smith & Petrenko, 1997). Praktische uitvoering

53

Een aliquot van de bibliotheek met een grootte van 6x106 werd opgegroeid tot exponentiële fase in 300 ml 2x TY medium, dat ampicilline en 1% glucose bevat. Aan de cellen werden M13K07 (KanR) helperfagen toegevoegd aan een concentratie van 1011 pfu/ml en dit mengsel werd aan kamer temperatuur gehouden zonder te schudden voor een periode van 30 minuten. Vervolgens werd kanamycine toegevoegd en de cultuur werd met hevig schudden geïncubeerd bij 37°C overnacht. De volgende morgen werden de cellen gepelleteerd door centrifugatie voor 30’ aan 8000 rpm en aan het supernatans, dat de fagen bevat, werd 20% (v/v) PEG oplossing toegevoegd. Dit mengsel werd een half uur op ijs geïncubeerd, waarna de geprecipiteerde fagen werden afgecentrifugeerd bij 4000 rpm voor een half uur. Het pellet werd geresuspendeerd in PBS en de OD260nm werd gemeten met de spectrofotometer om een indicatie van de hoeveelheid fagen te hebben (OD260nm = 1 => 3x1010 pfu/ml). De overnacht met antigen gecoate well werd gewassen met PBS en ongeveer 1011 fagen werden toegevoegd. De incubatie werd gedaan voor een uur lang bij kamer temperatuur. Alle ongebonden fagen werden weggewassen door 20 maal te wassen met PBS of PBST. De gebonden faag partikels werden geëlueerd van de microtiter platen met 100 µl 100 mM triëthylamine pH 10,0. Na 10 minuten werd het eluaat naar een Eppendorf tube overgebracht en geneutraliseerd door toevoegen van 100µl 1 M Tris-HCl pH 7,4 en dit werd gebruikt om exponentieel groeiende E.coli TG1 cellen te infecteren. Dit om een nieuwe ronde van panning te kunnen starten. Telkens werden verschillende verdunning gemaakt van de geëlueerde fagen in 10 mM MgCl2 om de titer te bepalen en een idee te hebben van de aanrijking. De aanrijkingsfactor werd berekend door de verhouding te nemen van het aantal geëlueerde fagen in de antigen gecoate wells tot de niet gecoate wells. Na de laatste ronde panning werden individuele kolonies opgepikt en hun VHH fragmenten werden geïnduceerd door 1mM IPTG in een kleine 10 ml TB cultuur. Het periplasmatisch extract werd aangemaakt vanaf deze culturen en getest in ELISA op mogelijke specifieke antigen herkenning.

3.20 Expressie en zuivering van VHH fragmenten De vectoren voor panning en productie zijn anders geconstrueerd en om betere opbrengsten te hebben moet men de inserties herkloneren van display vectoren pHEN4 of pHEN7naar de productie vector pHEN6. Praktische uitvoering De klonen die na aanrijking positief scoorden in ELISA, werden geherkloneerd in de vector pHEN6 door gebruik te maken van de restrictie enzymen NcoI en BstEII en getransformeerd in E.coli WK6 cellen. Grote schaal productie van VHH fragmenten werd bekomen door de

54

bacteriën te groeien bij 37°C in TB medium, gesupplementeerd met 0,1% glucose en ampicilline, tot een OD600nm van 0,6 tot 0,9 en dan geïnduceerd met 1mM IPTG. De VHH productie gebeurde voor 16 uur bij 28°C. Na het pelleteren van de cellen door centrifugatie voor 7’ bij 8000 rpm, werd een osmotische schok gegeven, volgens het protocol van de expressie test maar nu met een groter volume TES en TES/4, om de periplasmatische proteïnen te verzamelen in het supernatans. Het periplasmatisch extract werd gescheiden van de celresten door centrifugatie voor 30’ bij 15000 rpm. Het supernatans bevat de periplasmatische eiwitten, waaraan 3 ml Ni-NTA superflow (Qiagen) oplossing werd toegevoegd. Dit werd dan geïncubeerd al schuddende voor minstens één uur. Dit werd geladen op een lege kolom en na wassen van de niet-gebonden proteïnen met fosfaat buffer bij pH 6,0, werden de gebonden proteïnen geëlueerd met een acetaat buffer bij een pH van 4,7. De adsorptie werd gemeten op een spectrofotometer bij 280 nm en vanuit de aminozuur sequentie, werd de extinctie coëfficiënt berekend om zo de concentratie van geproduceerd VHH fragment te verkrijgen. Een gelfiltratie van het gezuiverd VHH fragment kan gebeuren om extra zuiverheid te hebben en om nog contaminerende zouten te verwijderen. Eerst werd de geëlueerd fractie geconcentreerd op Vivaspin concentrators met een MW drempel waarde van 5 kDa (Vivascience). Dit concentraat werd geladen op een Superdex-75 16/60 gelfiltratie kolom (Pharmacia).

3.21 ELISA De ELISA techniek is enorm krachtig om kleine hoeveelheden materiaal te detecteren in een mogelijk gecontamineerde pool. Bijna alle mogelijk proteïne materiaal kan gedetecteerd worden door gebruik te maken van monoklonale antilichamen. Als er geen monoklonale antilichamen beschikbaar zijn, kan men nog altijd beroep doen op polyklonale antilichamen. Praktische uitvoering Er zijn vele verschillende manieren om deze techniek te gebruiken. De wasstap bestaat telkens uit vijfmaal PBST toe te voegen aan de wells en weg te spoelen. De incubatie periode van antilichamen, VHH fragmenten of antigenen bedroeg telkens één uur bij kamer temperatuur. De OD bij 405 nm werd gemeten met behulp van een Ultra Microplate Reader (Bio-Tek Instruments), een tiental minuten tot een half uur na toevoegen van substraat pNPP.

3.21.1

Faag ELISA

− ELISA plaat (Nunc) coaten aan 1 µg/ml antigen in PBS en overnacht incuberen op 4°C. 55

− Wasstap en ELISA plaat overcoaten met PBS+caseïne incuberen voor minstens één uur bij kamer temperatuur. − Wasstap en fagen uit verschillende ronden panning toevoegen aan éénzelfde aantal per well en één uur incubatie bij kamer temperatuur. − Wasstap, maar nu werden de ongebonden fagen weggewassen door 20 keer PBST toevoeging en weg te spoelen. − Anti-M13 monoklonaal antilichaam toevoegen aan een verdunning van 1/1000 voor faag detectie. − Wasstap en het konijn anti-muis monoklonaal antilichaam (Sigma), geconjugeerd met een alkaline fosfatase, toevoegen aan een 1/1000 verdunning. De anti-muis antilichamen zijn gekoppeld aan een alkaline fosfatase dat zorgt voor een omzetting van een substraat pNPP naar een gele kleur. De OD werd gemeten op 405 nm.

Solid fase ELISA

3.21.2

− ELISA plaat coaten overnacht bij 4°C met het antigen aan een concentratie van 1 µg/ml in PBS. − Wasstap en overcoating door PBS+caseïne. − Wasstap en het VHH fragment in gezuiverde of periplasmatische vorm tegen het antigen erop brengen in geconcentreerde of verdunde vorm. − Wasstap en het anti-HIS6-tag (pHEN6 en pHEN7) (Serotec) of anti-c-myc-tag (pHEN7) monoklonaal antilichaam toevoegen aan een verdunning van 1/1000. − Wasstap en incubatie met konijn anti-muis monoklonaal antilichaam. − Wasstap, fosfatase ELISA substraat toevoegen en de OD405nm meten.

Dose-respons ELISA

3.21.3

− ELISA plaat coaten met 1 µg/ml antigen en overnacht incuberen bij 4°C. − Wasstap en overcoating door PBS+caseïne. − Wasstap en seriële verdunningsreeks van het gezuiverde VHH fragment aanbrengen. − De verdere ontwikkeling is analoog aan de solid fase ELISA.

3.21.4

Competitieve ELISA

− ELISA plaat coaten met 1 µg/ml antigen en overnacht incubatie bij 4°C. − Wasstap en overcoating met PBS+caseïne.

56

− Wasstap en toevoegen van laagste hoeveelheid VHH fragment, waarbij nog maximaal signaal kon worden verkregen vanuit de dose-respons ELISA. − Wasstap en een seriële verdunningsreeks van vrij antigen opgelost in PBS toevoegen om in competitie te treden met de reeds gebonden VHH fragmenten. − Wasstap en verdere ontwikkeling is analoog aan de ontwikkeling bij de solid fase ELISA.

3.21.5

Spiking ELISA − ELISA plaat coating met gezuiverd VHH fragment aan een concentratie van 1 tot 10 µg/ml en overnacht incubatie bij 4°C. − Wasstap en overcoating met PBS+caseïne. − Wasstap en een seriële verdunning van vrij antigen, in een pool van andere proteïnen, toevoegen. − Wasstap en detectie van het gebonden antigen gedaan met een monoklonaal antilichaam tegen het antigen of een mengsel van IgG subklassen van de geïmmuniseerde kameel. De verdere ontwikkeling ging via respectievelijk een antimuis monoklonaal antilichaam of een anti-kameel polyklonaal konijn serum. − Wasstap en verdere ontwikkeling is analoog aan de ontwikkeling bij de solid fase ELISA.

57

4 Resultaten en bespreking 4.1 Aangewende proteïne hulpmiddelen We hebben verschillende fysiologische vormen van het PSA antigen voorhanden (figuur 13). Een veelgebruikte vorm is het halfgezuiverde PSA mengsel vanuit semen plasma. Hierin zijn zowel het PSA-ACT complex als het vrije PSA in oplossing aanwezig. De halfgezuiverde vorm van PSA (EuroGenetics) werd gebruikt om de kameel te immuniseren. Andere hulpmiddelen zijn gezuiverd PSA uit semen plasma (EuroGenetics, Sigma) , gezuiverd en gebiotinyleerd PSA uit semen plasma (EuroGenetics), gezuiverd ACT (Sigma) en een PSA specifiek monoklonaal antilichaam, geproduceerd in muis (EuroGenetics).

Fig. 13. 12,5% SDS-PAGE van proteïne hulpmiddelen. Slot 1: MW merker; slot 2: halfgezuiverde PSA mengsel uit semen plasma; slot 3: gezuiverd PSA uit semen plasma; slot 4 gezuiverd, gebiotinyleerd PSA; slot 5: gezuiverd ACT; slot 6: PSA specifiek monoklonaal antilichaam; slot 7: gereduceerd PSA specifiek monoklonaal antilichaam.

Het halfgezuiverde PSA mengsel, dat gebruikt werd voor de immunisering, geeft twee belangrijke banden van respectievelijk ongeveer 30 en 85 kDa. Er zijn ook nog verschillende contaminaties aanwezig in het halfgezuiverde PSA mengsel. De moleculaire gewichten van de twee belangrijkste banden komen overeen met de aanwezigheid van vrij PSA (30 kDa) en PSA gecomplexeerd met ACT (85 kDa) in het halfgezuiverde PSA mengsel en deze vormen worden gevonden in patiënten met prostaat kanker (Zhou et al., 1993). Door het gebruik van dit halfgezuiverde mengsel bestaat de kans dat, bij de immunisering van de kameel, ook een humoraal antwoord wordt opgewekt tegen het ACT dat gecomplexeerd is met PSA. Het gezuiverde PSA uit semen plasma en gebiotinyleerd PSA migreren tot op een overeenkomstige plaats met het vrije PSA uit het halfgezuiverde PSA mengsel. Deze vorm van PSA in semen

58

plasma is mogelijk een mengsel van zowel enzymatisch actief als geknipt, en daardoor inactief vrij PSA. Het gezuiverde alpha-1-antichymotrypsine (ACT) heeft op SDS-PAGE een moleculair gewicht tussen 55 en 60 kDa. Het PSA specifieke monoklonale antilichaam migreert ongeveer tot op 160 kDa en de gereduceerde vorm ervan vertoont 3 banden, respectievelijk 50, 35 en 30 kDa. De 50 kDa band stemt overeen met de zware keten en de 25 kDa band met de lichte keten. De extra 35 kDa grote band bij de reductie van het PSA specifieke monoklonaal antilichaam is mogelijk een geglycosyleerde lichte keten of een afbraakproduct van de zware keten, doordat meerdere malen de stock met PSA specifiek monoklonaal antilichaam ingevroren en ontdooid moest worden voor gebruik in allerlei experimenten.

4.2 Immuunantwoord Een mannelijke dromedaris werd zesmaal geïmmuniseerd met een dosis PSA van 1 mg. Het bloed werd afgenomen drie dagen na de laatste immunisering en onderzocht op een specifieke antilichaam respons tegen het PSA. Vanuit het serum werden de IgG subklassen gefractioneerd in de conventionele immunoglobulines (IgG1) en de zware keten immunoglobulines (IgG2 en IgG3), door middel van differentiële adsorptie op proteïne G en proteïne A, zoals HamersCasterman et al. (1993). De subklassen IgG1 en IgG3 binden op proteïne A en proteïne G en IgG2 bindt enkel op proteïne A. Met een verschillende pH kunnen de IgG1 en IgG3 van de proteïne G kolom geëlueerd worden. De flow-through van de proteïne G kolom wordt geladen op proteïne A kolom, zodat IgG2 kan gezuiverd worden. De opbrengsten voor IgG1, IgG2 en IgG3 bedragen respectievelijk 1,5; 0,5 en 1,5 mg per ml dromedaris serum. De zuiverheid van de IgG subklassen kon bepaald worden door SDS-PAGE (figuur 14).

Fig. 14. 12,5% SDS-PAGE van gezuiverde IgG subklassen. Slot 1: MW merker; slot 2: IgG1; slot 3: IgG1 gereduceerd; slot 4: IgG2; slot 5: IgG2 gereduceerd; slot 6: IgG3; slot 7: IgG3 gereduceerd.

Het moleculaire gewicht van IgG1, IgG2 en IgG3 bedraagt respectievelijk ongeveer 150, 90 en 90 kDa onder niet-gereduceerde condities. Bij reduceerde condities bedraagt het moleculair

59

gewicht van subklassen IgG1, IgG2 en IgG3 respectievelijk 55/25, 45 en 45 kDa en zijn in overeenstemming met de resultaten beschreven in Muyldermans & Lauwereys (1999). We zien evenwel dat de zuivering van de IgG2 subklasse niet optimaal is en er nog contaminaties overblijven na differentiële adsorptie op proteïne A en proteïne G, maar deze geven geen hindering bij het ontwikkelen van ELISA’s of Western Blots. Het humorale antwoord in elke subklasse werd nagegaan (figuur 15). Seriële verdunningen van de IgG subklassen werden gebruikt in een solid fase ELISA met PSA en ACT als gecoat antigen en de detectie werd bekomen door konijn anti-dromedaris serum tegen de IgG subklassen en antikonijn IgG alkalisch fosfatase conjugaat tegen het konijn serum.

1,4

1,2

OD405nm

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2 0

1

2

3

4

5

concentratie IgG (µg/ml) Fig. 15. Solid fase ELISA met PSA specifieke IgG’s. PSA werd geïmmobiliseerd aan 1 µg/ml op een microtiter plaat. Gebonden subklassen IgG1 (■); IgG2 (●) en IgG3 (▲) werden gedetecteerd met konijn anti-dromedaris serum tegen de IgG subklassen en anti-konijn IgG alkalisch fosfatase conjugaat tegen het konijn serum.

Het immuunantwoord voor elke IgG subklasse is ongeveer even groot. Evenwel ligt het antwoord van de IgG3 lichtjes hoger dan de conventionele IgG1 en IgG2. Men mag dus stellen dat zowel voor conventionele als zware keten antilichamen een PSA specifiek immuunantwoord opgewekt werd. Het zou dus mogelijk moeten zijn om PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten te identificeren door panning. Eenzelfde solid fase ELISA werd gedaan met als gecoat antigen ACT 60

aan 1 µg/ml, maar hierbij werd een veel lagere respons teruggevonden (resultaten niet weergegeven). Omdat we een verschillende positieve respons kregen in ELISA met de IgG subklassen tegen PSA of ACT, gaat men na welke vormen van PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel herkend worden door middel van een Western Blot experiment (figuur 16).

Fig. 16. 12,5% SDS-PAGE van halfgezuiverde PSA mengsel (Coomassie gekleurd) en Western Blot van gezuiverde IgG subklassen op halfgezuiverde PSA mengsel (bruin gekleurd). Slot 1, 4 & 5: MW merker; slot 2 & 3: halfgezuiverde PSA mengsel; slot 6: detectie van het halfgezuiverde PSA mengsel door IgG1; slot 7: detectie van het halfgezuiverde PSA mengsel met IgG2; slot 8: detectie van het halfgezuiverde PSA mengsel met IgG3.

De SDS-PAGE laat een patroon zien van drie banden voor het halfgezuiverde PSA mengsel. Zoals hierboven beschreven is de bovenste band het PSA-ACT complex van ongeveer 85 kDa en de middelste is het vrije PSA met een moleculair gewicht van ongeveer 30 kDa. De minder goed zichtbare band, van ongeveer 11 kDa, is mogelijk een afbraakproduct van het ACT (Christensson, 1990). Dit wordt vrijgesteld bij het vormen van het PSA-ACT complex. PSA knipt namelijk een stuk van ACT bij het vormen van het covalente complex tussen PSA en ACT. We zien een duidelijke respons in Western Blot voor elke IgG fractie op zowel het PSA-ACT complex als het vrije PSA. De respons voor de IgG1 subklasse is evenwel hoger dan voor de IgG2 en 3 subklasse, dit is te verklaren op verschillende manieren. Men kan een hogere titer hebben voor de IgG1 subklasse, het kan zijn dat de HCAb’s meer conformationele epitopen herkennen, of het kan ook een combinatie van de voorgaande redenen zijn. Voor de IgG1 subklasse wordt ook een goede respons gegeven voor het afbraakproduct van ACT. Zelfs enkele contaminaties in de antigen pool worden herkend. Men kan hieruit besluiten dat de immunisering van de dromedaris met het halfgezuiverde PSA mengsel een specifiek immuunantwoord heeft opgewekt tegen zowel het PSA in vrije als gecomplexeerde vorm. Het moet dus mogelijk zijn om 61

de VHH genen te kloneren en kameel antilichaam fragmenten te selecteren die kunnen binden op PSA in vrije of gecomplexeerde vorm. Het kan zelfs mogelijk zijn om kameel antilichaam fragmenten te selecteren die ACT herkennen. Men moet echter weten dat in Western Blot de proteïnen in een gedenatureerde vorm voorkomen en de IgG’s voornamelijk kunnen binden op lineaire epitopen en veel minder op de conformationele epitopen. Voor het PSA specifieke monoklonaal werd eveneens vastgesteld in Western Blot dat het een conformationeel epitoop herkent op PSA (resultaten niet weergegeven).

4.3 Aanmaken van een VHH bibliotheek Na zes immuniseringen van een dromedaris, werd 50 ml bloed afgenomen, waarbij EDTA toegevoegd werd tegen coagulatie. Een extra 10 ml bloed werd afgenomen om serum te bereiden. Uit het antigecoaguleerde bloed van de geïmmuniseerde dromedaris, werden de witte bloedcellen geïsoleerd door middel van evenwichtscentrifugatie in ficoll, waarbij de rode en niet de witte bloedcellen in de ficoll-fase kunnen pelleteren. Uit 5x106 lymfocyten werd het mRNA geïsoleerd en in een volgende stap werd cDNA gemaakt via RT-PCR met gebruik van een oligo dT primer. Dit cDNA werd gebruikt als template om de genen te amplifiëren die coderen voor het variabele domein van de zware keten antilichamen. Een eerste amplificatie werd gedaan om alle mogelijke VH genfragmenten te verkrijgen (Ghahroudi et al., 1997) met PCR primers Call001 en Call002. Deze primers annealen in het geval van Call001, de leader signaal sequentie van de VH genen, en in het geval van Call002, een sequentie in het midden van het CH2 domein van de zware keten. Via deze amplificatie krijgt men een patroon van drie banden wanneer de PCR producten op 1% agarose gel geladen worden (figuur 17). De bovenste band, corresponderend met het hoogste moleculaire gewicht, stemt overeen met de fragmenten die de VH, CH1, hinge en stuk van CH2 exon van de conventionele antilichamen bevatten (moeilijk te zien op figuur 17), de andere twee banden stemmen overeen met de fragmenten die de VHH, hinge en stuk van CH2 exon van zware keten antilichamen bevatten. Het bovenste fragment bevat het CH1 exon, waardoor de lengte van het geamplifieerde materiaal 400 bp groter is dan de lengte van de twee andere banden, die dit CH1 exon niet bevatten. Ten minste twee populaties van genen worden geamplifieerd voor de zware keten antilichamen, namelijk een populatie met korte hinge (IgG3) en een populatie met lange hinge (IgG2), wat op een 1% agarose gel resulteert in twee banden met een klein verschil in grootte. De twee banden corresponderend met de VHH fragmenten werden tezamen uit gel gesneden en gezuiverd.

62

Fig. 17. PCR 1: 1% agarose gel in 1x TBE van de amplificatie van het cDNA met Call001 en Call002. 10 µl van elk staal werd geladen. Slot 1: MW merker (123 bp ladder, beginnende vanaf onderaan met 123 bp, volgende banden zijn telkens veelvouden van 123 bp); slot 2: PCR met 1 µl template cDNA; slot 3: PCR met 3 µl template cDNA; slot 4: PCR met 6 µl template cDNA; slot 5: negatieve controle.

Op de gezuiverde pool van DNA werd een geneste PCR uitgevoerd om voldoende fragment aan te maken in een formaat dat klonering in een fagmide vector toelaat. De eerste PCR van de geneste PCR wordt uitgevoerd met SM017/018 en 38 en men krijgt een band van ongeveer 400 bp op 1% agarose gel. De tweede wordt verricht met de primers A4Short en 38 en ook hier wordt een band van 400 bp gedetecteerd op 1% agarose gel. Deze beide PCR’s leveren het volledig gen, coderend voor het variabele domein van de zware keten antilichamen, met de bijhorende restrictie enzym sites nodig voor de klonering in de fagmide vector pHEN4 (figuur 18). Op deze manier werd 10 µg gezuiverd VHH pool DNA aangemaakt die in de volgende stap gebruikt wordt voor de aanmaak van een bibliotheek.

Fig. 18. Schematische voorstelling van de drie PCR reacties. Eerste PCR werd gedaan met Call001 en Call002. De geneste PCR’s werden gedaan met eerst SM017/018 en 38, daarna met A4Short en 38. De verkregen PCR fragmenten werd geknipt met NcoI en NotI.

63

De gezuiverde VHH-PCR fragmenten werden geknipt met de restrictie enzymen NcoI en NotI, gezuiverd en vervolgens geligeerd in de pHEN4 vector, eveneens geknipt met NcoI en NotI en zorgvuldig gezuiverd zoals vermeld in de materialen en methoden (figuur 19). De ligatie werd overnacht bij 16°C uitgevoerd met verscheidene fragment/vector verhoudingen (molaire verhoudingen) van 1/1, 3/1, 10/1. Voor de bibliotheek constructie werd de fragment/vector verhouding 3/1 gebruikt, omdat die de beste resultaten gaf om een voldoende grote bibliotheek te construeren. Na ligatie werd het geligeerde materiaal op verschillende manieren gezuiverd om uit te maken welke zuiveringsmethode resulteert in de beste transformatie efficiëntie. De efficiëntie werd bekomen met een fenol/chloroform extractie gevolgd door DNA precipitatie met ethanol.

Fig. 19. pHEN4 en PCR 3: 1% agarose gel in 1x TBE. Slot 1: 5 µl Smartladder; slot 2: 5 µl pHEN4 (NcoI/NotI); slot 3: 5 µl van de geamplifieerde VHH genen na digestie met NcoI/NotI en na zuivering.

Het extensief gezuiverd, geligeerd materiaal werd getransformeerd in verse TG1 E.coli cellen, om maximale electrocompetentie te verkrijgen.

Door overnacht ligatie van 3 µg pHEN4

(NcoI/NotI) met 3 µg VHH pool (NcoI/NotI) op 16°C werd een bibliotheek met een grootte van 6x106 individuele transformanten verkregen. Via kolonie PCR werd aangetoond dat meer dan 75% van de transformanten van de bibliotheek de vector met een VHH gen insert van de correcte lengte bevatten.

4.4 In vitro selectie of panning De bibliotheek, die de genen voor de VHH’s omvat, dient gescreend te worden voor mogelijke specifieke VHH’s tegen PSA. Doordat de genen in een fagmide vector gekloneerd werden, kan men door additie van helperfagen aan de bacteriële cultuur van de VHH bibliotheek, de productie van recombinante fagen verkrijgen. Deze recombinante fagen drukken op hun tip het fusie eiwit van gen3 met de VHH uit. Op deze manier werd het VHH repertorium uitgedrukt op filamenteuze fagen na infectie van de bibliotheek met helper fagen. De selectie van de virions, 64

die een fusie-eiwit VHH-gen3 uitdrukken specifiek voor PSA, werd uitgevoerd via in vitro selectie: panning (Hoogenboom & Chames, 2000). De in vitro selectie werd uitgevoerd door een hoge concentratie aan PSA (100 µg/ml) te coaten in een microtiter well. 1011 virions, afkomstig na de rescue van de bibliotheek, werden op het gecoate antigen geladen. Aspecifieke virions werden verwijderd door middel van een extensieve wassing, de specifieke virions werden vervolgens van het antigen geëlueerd door een pH schok te geven. De geëlueerde virions werden gebruikt om exponentieel groeiende TG1 E.coli cellen te infecteren. Op deze manier werden de geëlueerde virions in grotere hoeveelheid aangemaakt en gebruikt voor een volgende selectieronde. Na drie opeenvolgende selectie ronden op solid fase PSA coating, PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam coating en ACT coating, werd een duidelijke aanrijking in antigen specifieke virions gevonden. Door een verdunningsreeks van de geëlueerde virions, na infectie van TG1 E.coli cellen, uit te platen op ampicilline kan de aanrijking gedetecteerd worden in het stijgend aantal kolonies bij de geëlueerde virions gebonden op PSA ten opzichte van geëlueerde virions gebonden op een niet-gecoate plaat (aspecifiek bindende virions). Na elke ronde van panning werden gezuiverde virions bijgehouden om via een faag ELISA de toename aan PSA specifieke virions te detecteren (figuur 20). De faag ELISA wordt verricht zoals een solid fase ELISA met een coating van 1µg/ml PSA. Telkens wordt hetzelfde aantal fagen (108 of 109 per well) toegevoegd en na een uur incubatie worden de ongebonden, nietantigen-specifieke fagen weggewassen. De antigen specifieke, gebonden fagen worden gedetecteerd met een anti-M13 horseradisch peroxidase conjugaat.

65

1,25

1,00

OD405nm

0,75

0,50

0,25

0,00 1

2

3

Selectie ronden Fig. 20. Faag ELISA bij coating van 1µg/ml PSA. Horizontaal gelijnd: PSA solid fase coating; kruislings gelijnd: PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam solid fase coating.

Men ziet dat na 3 ronden van panning er een duidelijke aanrijking gebeurd is van PSA specifieke virions. De aanrijking is duidelijk groter voor virions die specifiek het PSA, gebonden op een PSA specifiek monoklonaal antilichaam, herkennen. De aanrijking kan men ook formuleren in een aanrijkingsfactor na elke ronde van panning (tabel 2). Deze aanrijkingsfactor wordt gedefinieerd als de verhouding van het aantal antigen specifieke kolonies tot het aantal kolonies uit niet-PSA gecoate wells (Ghahroudi et al., 1997). Tabel 2. Aanrijkingsfactoren van de verschillende selectiemethoden na elke ronde panning.

PSA PSA-mAb ACT

1e ronde

2e ronde

3e ronde

2

12

40

3,5

2

3

-

350

750

Een duidelijke aanrijking is gevonden voor PSA en ACT coating, minder voor de PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. Het verschil tussen de aanrijking gezien in faag ELISA of bij de aanrijkingsfactoren is te wijten een het feit dat bij de aanrijkingsfactoren er een groot aantal kolonies te zien waren bij platen van enkel gecoat met PSA specifiek monoklonaal

66

antilichaam. Het is dus best mogelijk dat het grotere signaal in faag ELISA te wijten is aan virions die specifiek binden op het PSA gebonden op het PSA specifieke monoklonaal antilichaam. Want bij de aanrijkingsfactoren werd vastgesteld dat de bacterie cellen, die geïnfecteerd zijn geweest door aspecifiek bindende fagen, sneller groeien dan de bacterie cellen die geïnfecteerd zijn geweest door PSA bindende fagen.

4.5 Antigen bindende kameel antilichaam fragmenten afzonderen Van 20 willekeurig gekozen kolonies, na de derde ronde panning, werd het periplasmatisch extract gemaakt en getest op expressie van PSA specifieke VHH. Detectie gebeurde door middel van PSA en ACT rechtstreekse coating op microtiter platen en PSA gebonden op een PSA specifiek monoklonaal antilichaam, rechtstreeks gecoat op microtiter plaat. Er werden voor ACT, PSA rechtstreekse coating of PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam respectievelijk 16, 5 en 7 positieve signalen op 20 kolonies gevonden. De genfragmenten van de klonen, die positief waren in solid fase ELISA, werden door PCR geamplifieerd en gedigereerd met het frequent knippend restrictie enzym HinfI. Op die manier werd van de positieven, 4 verschillende restrictie patronen geïdentificeerd die PSA bonden en slechts 1 patroon voor ACT binding. Dit werd bevestigd door DNA sequentie (figuur 21). Het cAbPSA11 is afgezonderd na panning met PSA gebonden op monoklonaal antilichaam, de overige cAbPSA’s zijn afgezonderd na panning met PSA rechtstreekse coating. Het cAbACT16 is eveneens afgezonderd uit een rechtstreekse coating van ACT op microtiter plaat.

67

Fig. 21. Aminozuursequenties van cAb-PSA3, 11, 15, 20 en cAb-ACT16, geallinieerd tegenover de humane VH consensussequentie. Rood omkaderd is de CDR gedefinieerd volgens Kabat et al. (1991), de geel gekleurde residu’s zijn de solvent geëxposeerde lus residu’s volgens Chothia & Lesk (1987), de groene gekleurde residu’s zijn kameelspecifieke aminozuren in VH, de blauwe residu’s zijn de lysines die bruikbaar zijn voor chemische immobilisatie en de paars gekleurde residu’s zijn VHH specifieke residu’s. Een – geeft aan dat hetzelfde residu gevonden werd in de cAb sequentie als in de humane VH consensus, een spatie geeft een deletie weer tegenover de humane consensus sequentie.

De aminozuur residu’s in het paars stellen de framework substituties voor die zorgen voor het hydrofieler karakter van de VHH ten opzichte van de VH. De substituties die hier voorkomen zijn de leucine 11 naar een serine, de valine 37 naar fenylalanine (cAbPSA3, 11 en 20) of tyrosine (cAbPSA15 en cAbACT16), glycine 44 naar glutamaat (cAbPSA3, 11, 20 en cAbACT16) of glutamine (cAbPSA15), leucine 45 naar arginine voor alle cAbs, tryptofaan 47 naar alanine (cAbPSA20) of valine (cAbPSA11) of glycine (cAbPSA3) of leucine (cAbACT16). De rode kaders geven de CDR’s weer volgens Kabat et al. (1991). De cAbPSA11, 15, 20 en cAbACT16 hebben allen een eerste hypervariabele lus regio van 10 aminozuur residu’s, de cAbPSA3 heeft slechts een lengte van 7 aminozuur residu’s. In de CDR1 van cAbPSA15, 20 en cAbACT16 is er een extra cysteïne aangetroffen, deze zal met de extra cysteïnes in de CDR3 zorgen voor een interlus disulfide brug. De lengte van de CDR2 bedraagt voor alle cAbs 16 of 17 aminozuur residu’s. Voor de CDR3 is er ofwel een lengte van 12 en 13 aminozuur residu’s voor respectievelijk cAbPSA15 en cAbACT16, ofwel een lengte van 16 aminozuurresidu’s voor

68

cAbPSA3, 11 en 20. In cAbPSA15 vindt men ook een deletie terug van de 2 aminozuur residu’s glutamine en glycine in de FR4. De deleties op deze plaatsen zijn waarschijnlijk te wijten aan het gebruik van truncated primers tijdens de PCR amplificatie.

4.6 Productie van cAbPSA3, 11, 15 en 20 Om een betere productie en zuivering van de kameel antilichaam fragmenten te bekomen, werden alle verschillende positieven geherkloneerd in de vector pHEN6 zoals vermeld in de materiaal en methoden (figuur 22). Deze vector geeft betere opbrengsten dan de pHEN4/pHEN7 vectoren en draagt enkel de His6-tag. Om de hoeveelheid geproduceerd cAbPSA te bepalen werd een OD meting gedaan bij 280 nm. Met behulp van de theoretisch bepaalde extinctiecoëfficiënten (PCGene) kon vervolgens gemakkelijk de concentratie berekend worden (tabel 3). Tabel 3. Productie en zuivering van cAbPSA3, 11, 15 en 20. De theoretische extinctiecoëfficiënten (M-1 cm-1) zijn verkregen door het ingeven van de aminozuursequenties in het programma PCGene.

cAbPSA

Theoretische

Totaal gezuiverd (mg)

extinctiecoëfficiënt

Opbrengst (mg/liter cultuur)

(M-1 cm-1) 3

28260

20,8

5,8

11

21860

30,6

8,5

15

23950

6

1,7

20

30350

14,1

3,9

Het verschil tussen de pHEN4 en pHEN6 vector is de afwezigheid van het gen3 in pHEN6, zoals zichtbaar op een 1% agarose gel (figuur 22).

Fig. 22. pHEN6 en pHEN4 vectoren na zuivering. 1% agarose gel in 1x TBE van telkens 5 µl per slot. Slot 1: MW merker; slot 2: pHEN 6; slot 3: pHEN4. Beide vectoren, pHEN6 en pHEN4, zijn geknipt met respectievelijk NcoI/BstEII en NcoI/NotI.

69

4.7 Karakterisering van cAbPSA3, 11, 15 en 20 Vanuit de DNA sequentie werd de aminozuur sequentie bepaald. De voorspelde moleculaire gewichten zijn respectievelijk 14535, 14652, 13960 en 14850 voor cAbPSA3, 11, 15 en 20. Om na te gaan of de kameel antilichaam fragmenten wel degelijk gezuiverd zijn na IMAC werden van elke cAbPSA binder een paar µg op SDS-PAGE gezet, in zowel natieve als gereduceerde vorm (figuur 23).

Fig. 23. 12,5% SDS-PAGE van cAb-PSA3, 11, 15, 20, telkens onder zowel gereduceerde als niet-gereduceerde vorm. Slot 1: MW merker; slot 2: cAbPSA3; slot 3: cAbPSA3 gereduceerd; slot 4: cAbPSA11; slot 5: cAbPSA11 gereduceerd; slot 6 cAbPSA15; slot 7: cAbPSA15 gereduceerd; slot 8: cAbPSA20; slot 9: cAbPSA20 gereduceerd.

De theoretische moleculaire gewichten komen overeen met de experimenteel bepaalde moleculaire gewichten. Enkel bij het cAbPSA11 wordt bij het niet-gereduceerde slot een extra band gevonden met een experimenteel bepaald moleculair gewicht van 30 kDa. Dit is mogelijk een dimere vorm van het cAbPSA11. Ondanks het feit dat er geen extra cysteïne zit in de CDR1 of CDR3, kan er toch een reductie optreden van het dimeer naar een monomeer vorm van cAbPSA11. Een mogelijke verklaring is het aannemen van een intermoleculaire domain swapping tussen verschillende cAbPSA11’s, waarbij zelfs naast dimeren, ook trimeren en tetrameren kunnen gevormd worden (figuur 24) (Zegers et al., 1999).

70

Fig. 24. 12,5% SDS-PAGE van cAb-PSA11. Slot 1: MW merker; slot 2: 10 µg in PBS; slot 3: 5 µg in PBS.

De multimere vormen kunnen gevormd zijn bij het maken en zuiveren van het periplasmatisch extract. We hebben evenwel een hoge opbrengst voor de cAbPSA11. Daardoor is het mogelijk dat bij de translatie in E.coli, de kameel antilichaam fragmenten samenkomen en reeds dimeren vormen bij het opvouwen van de kameel antilichaam voordat er transport gebeurd naar het periplasma. Men zou dit kunnen tegengaan door het maken en zuiveren van het periplasmatisch extract onder denaturerende condities. Daarna kan men het cAbPSA11 opnieuw renatureren naar een monomere vorm. We hebben vier PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten gezuiverd. Nu moet men nagaan of ze wel degelijk binden in gezuiverde vorm. We ondernemen hiervoor een solid fase ELISA op twee verschillende manieren. Aan de ene kant coat men het halfgezuiverde PSA aan een concentratie van 1 µg/ml. Aan de andere kant coat men eerst overnacht een PSA specifiek monoklonaal antilichaam en daarna laat men het halfgezuiverde PSA mengsel op dit PSA specifiek monoklonaal antilichaam binden (figuur 25). Men onderzoekt de respons van de gezuiverde kameel antilichaam fragmenten op deze twee verschillende manieren van coating. Men gebruikt verdunningreeksen van kameel antilichaam fragmenten tussen 50 µg/ml tot 5x10-4 µg/ml.

71

1,2

1,0

OD405nm

0,8

0,6

0,4

0,2

0,0 1E-4

1E-3

0,01

0,1

1

10

Concentratie cAb (µg/ml)

Fig. 25. Dose-respons ELISA van cAbPSA11 (●) op PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam; cAbPSA15 (■) op rechtstreekse PSA coatings; cAbPSA20 (▲) op rechtstreekse PSA coatings.

We hebben geconstateerd dat het cAbPSA11 duidelijk bindt op het PSA dat gebonden is op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. Er was evenwel een lichte respons op rechtstreekse PSA coating (niet weergegeven). De cAbPSA15 en 20 gaven enkel een duidelijke respons op rechtstreekse PSA coating op microtiter plaat. Dit kan men verklaren door het feit dat ofwel het PSA specifieke monoklonale antilichaam hetzelfde epitoop bindt als de cAbPSA15 en 20. Een andere mogelijke verklaring is dat de structuur van PSA bij rechtstreekse coating en binding op PSA specifiek monoklonaal antilichaam wel degelijk verschillend is (Wu et al., 2000). Een Western Blot met cAbPSA detectie van PSA gescheiden door SDS-PAGE, geeft geen respons. Ze herkennen dus een conformationeel en geen lineair epitoop op PSA. De 3D vorm van PSA kan mogelijk een andere conformatie aannemen naargelang PSA rechtstreeks gecoat is op microtiter plaat of gebonden is op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. Naar alle waarschijnlijkheid bindt cAbPSA11 de natieve 3D conformatie van PSA en binden de cAbPSA15 en 20 een semi-gedenatureerde conformatie van PSA. Voor cAbPSA3 werd geen respons meer gevonden, alhoewel het testen van het periplasmatisch extract tweemaal een positief resultaat gaf. Mogelijk heeft dit te maken met contaminaties in het periplasmatisch extract.

72

Om een idee te krijgen van de grootte orde van de affiniteit van de cAbs ligt, kan men een competitieve ELISA doen (Friguet et al., 1985). Eerst wordt een microtiter plaat gecoat met het PSA rechtstreeks voor cAbPSA15 en 20 of het PSA, dat gebonden is op PSA specifiek monoklonaal antilichaam voor cAbPSA11. Het PSA wordt dan gedetecteerd met de laagste concentratie aan kameel antilichaam fragment, waarbij nog een maximaal signaal verkregen werd uit curve van de dose-respons ELISA. Voor elke cAbPSA werd deze waarde genomen op ongeveer 1 µg/ml. Dan wordt een verdunningsreeks van half of volledig gezuiverd PSA toegevoegd aan de microtiter plaat. Zo ontstaat er een competitie tussen het rechtstreeks gecoate PSA of het PSA, dat gebonden is op PSA specifiek monoklonaal antilichaam, en het PSA in oplossing. Het kameel antilichaam fragment zal een evenwicht vinden in het binden van het vrije, in oplossing zijnde, PSA en het gecoate of gebonden PSA op de microtiter plaat. De laatste stap is het detecteren van de hoeveelheid van overgebleven cAb op de microtiter plaat. Met de verkregen curve kan men een idee krijgen van de KD van het kameel antilichaam fragment (figuur 26).

0,6

0,5

OD405nm

0,4

0,3

0,2

0,1

0,0 0,1

1

10

100

1000

Concentratie toegevoegd vrij PSA (nM)

Fig. 26. Competitieve ELISA van cAbPSA11 (■ = PSA pool ; ▲= PSA puur); cAbPSA15 (● = PSA pool ; ▼= PSA puur ).

73

We krijgen een soort sigmoïdale curve waarbij het buigpunt van de curve een redelijke overeenkomst geeft met de reële KD van het kameel antilichaam fragment voor het antigen. We hebben verschillende vormen van PSA antigen gebruikt en we zien dat het cAbPSA11 een hogere affiniteit heeft voor het gezuiverde PSA dan het halfgezuiverde PSA. Maar hierin kunnen ook meetfouten zitten door het foutieve en moeilijke inschatten van de concentratie van PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel. De KD van cAbPSA11 voor gezuiverd PSA zou in de buurt van 50 nM liggen. Bij het cAbPSA15 zien we enkel een competitie voor het halfgezuiverde PSA mengsel en niet voor het gezuiverde PSA. Dit kan men verklaren door het feit dat het epitoop dat herkend wordt door cAbPSA15 in het halfgezuiverde PSA afwezig is in het gezuiverde PSA. Als we aannemen dat het gezuiverde PSA in een natieve 3D conformatie zit, dan kan het dus mogelijk zijn dat het PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel in een half of volledig gedenatureerde conformatie zit. Dit is ook een tweede aanwijzing voor de mogelijkheid dat cAbPSA15 en 20 binden op een nicked PSA conformatie. We kunnen evenwel een indicatie geven van de KD van cAbPSA15 voor het halfgezuiverde PSA mengsel. Die ligt in de buurt van 60 nM. Voor het cAbPSA20 werd geen enkele respons verkregen, zowel voor half gezuiverd als volledig gezuiverd PSA. Een belangrijke vereiste voor elk kameel antilichaam fragment tegen PSA, is de mogelijkheid om heel lage concentraties/hoeveelheden van PSA te kunnen detecteren in bloed- of semenstalen. Om dit te testen doet men een spiking ELISA (figuur 27). Op een microtiter plaat gecoat met cAbPSA’s worden oplossingen met verschillende PSA concentraties vanaf 1 µg/ml tot 0,001 µg/ml gebracht, onder condities van PSA als enige opgelost eiwit of PSA samen met andere eiwitten (BSA en/of caseïne) in oplossing. De detectie van het gebonden PSA op het cAb gebeurd door een PSA specifiek monoklonaal antilichaam voor cAbPSA11 of een duo van PSA specifiek gezuiverde kameel IgG met konijn anti-kameel anti-serum voor cAbPSA15. Om de gevoeligheid na te gaan, worden op microtiter plaat verschillende concentraties van 10 µg/ml tot 0,25 µg/ml aan cAbPSA gecoat.

74

2,0

OD405nm

1,5

1,0

0,5

0,0 0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Concentratie zuiver PSA (µg/ml)

Fig. 27. Spiking ELISA van cAbPSA11. Verschillende hoeveelheiden cAbPSA11 werden gecoat op microtiter plaat. ■ = 5 µg/ml in PBS; ● = 5 µg/ml in PBS met 0,5 mg/ml BSA en caseïne; ▲ = 1 µg/ml in PBS; ▼ = 1 µg/ml in PBS met 0,5 mg/ml BSA en caseïne; ↵ = 0,25 µg/ml in PBS; + = 0,25 µg/ml in PBS met 0,5 mg/ml BSA en caseïne.

Voor de spiking ELISA met cAbPSA15 werd het moeilijk om een specifieke curve te verkrijgen, want het konijn anti-kameel serum gaf een positieve respons op het cAb. Zodanig kunnen we deze capturing van PSA door cAbPSA15 moeilijk detecteren, mede omdat het gebruik van PSA specifiek monoklonaal antilichaam niet mogelijk was. Het is dus heel waarschijnlijk dat cAbPSA15 een conformatie van PSA bindt, die niet door het PSA specifiek monoklonaal antilichaam wordt herkend. Voor aspecifieke eiwitten werden zowel caseïne als BSA apart of tezamen in oplossing getest en ze gaven analoge resultaten. Enkel de resultaten voor het mengsel van BSA en caseïne zijn weergegeven op figuur 27. Hier zijn enkel de relevante waarde aangegeven, want vanaf een concentratie van 5 µg/ml cAbPSA11 coating werd het maximum van de curve bereikt. Bij een concentratie lager dan 0,1 µg/ml gezuiverd PSA in oplossing werd geen signaal meer verkregen.

75

Een kleine samenvatting van de cAbs wordt hier geven. Tabel 4. Binding van verschillende kameel antilichaam fragmenten geïsoleerd uit PSA geïmmuniseerde kameel.

Coating

Caseïne

PSA

mAb

mAb+PSA

ACT

cAbPSA11

-

-

-

+

-

cAbPSA15

-

+

-

-

-

cAbPSA20

-

+

-

-

-

cAbACT16

-

-

-

-

+

Binder

Van de 4 verschillende PSA bindende kameel antilichaam fragmenten blijven er maar 3 effectief bindende kameel antilichamen over. Het cAbPSA3 gaf in gezuiverde vorm geen respons meer. Enkel het cAbPSA11 en 15 gaven een respons bij de competitieve ELISA, zodat een grote orde van affiniteit voor PSA kan bepaald worden voor deze cAbPSA’s. Ze liggen in de range van 50 tot 60 nM. Voor een mogelijk gebruik in PSA diagnostische testen moet ook een goede capturing kunnen gebeuren van PSA in oplossing. Enkel het cAbPSA11 kan PSA uit oplossing binden, maar dit is echter met een te lage gevoeligheid, zodat het onder deze vorm niet bruikbaar is in de vooropgestelde diagnostica.

76

5 Besluit Een kameel werd verschillende malen geïmmuniseerd met het halfgezuiverde PSA mengsel. Uit het serum van de geïmmuniseerde kameel werden via differentiële adsorptie op proteïne A en proteïne G kolom de verschillende IgG subklassen gezuiverd. Een PSA specifiek immuunantwoord werd vastgesteld voor zowel de conventionele (IgG1) als zware keten antilichamen (IgG2 en IgG3) in solid fase ELISA en ook voor zowel vrij als gecomplexeerd PSA in Western Blot. De immunisering van de kameel met het halfgezuiverde PSA mengsel is geslaagd, zodat het mogelijk moet zijn om PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten af te zonderen. Bloed werd afgetapt en de periferale bloedlymfocyten werden via een evenwichtscentrifugatie geïsoleerd. Uit de lymfocyten werd mRNA afgezonderd. Het cDNA werd bereid vanaf dit mRNA. Via een eerste PCR reactie met de primers Call001 en Call002 kon men al de mogelijke VH genfragmenten amplifiëren. Door middel van een geneste PCR met primers die specifiek de VHH genfragmenten herkennen, werden unieke restrictie enzym sites toegevoegd aan de VHH genfragmenten. Door restrictie en extensieve zuivering van zowel fragment als fagmide vector werd, na ligatie en transformatie in TG1 E. coli, een bibliotheek van 6x106 individuele transformanten verkregen. De kwaliteit werd getest en men kwam op een percentage juiste insert van 75. Met een in vitro selectie techniek, meerbepaald panning, werden verschillende klonen geïsoleerd, wiens periplasmatisch extract in een ELISA experiment het PSA herkent. Uit fingerprinting analyse met het restrictie enzym HinfI werden 4 verschillende kameel VHH fragmenten geïdentificeerd. Door DNA sequentie onderzoek werd dit bevestigd. Al de geïdentificeerde kameel antilichaam fragmenten bezitten de specifieke VHH aminozuur substituties in hun FR2. Om tot karakterisering over te gaan van de kameel antilichaam fragmenten, werden ze eerst in een productie vector geherkloneerd om ze dan in bulk te produceren. Voor elk werd hierdoor een goede opbrengst verkregen en de zuivering werd bekomen via IMAC. Op SDS-PAGE werd de zuiverheid van de geproduceerde kameel antilichaam fragmenten getest en men zag eveneens dat de experimenteel bepaalde moleculaire gewichten overeenkwamen met de theoretisch bepaalde moleculaire gewichten. Elk kameel antilichaam fragment is degelijk gezuiverd geweest, enkel werd vastgesteld dat het cAbPSA11 in een dimere vorm kon voorkomen. Al de rest van de geproduceerde kameel antilichaam fragmenten gaven het juiste MW op SDS-PAGE. 77

Vervolgens werd een solid fase ELISA experiment verricht om de respons van de geïdentificeerde kameel antilichaam fragmenten tegen het PSA rechtstreeks gecoat of gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam na te gaan. Het cAbPSA11 herkent enkel het PSA gebonden op PSA specifiek monoklonaal antilichaam. De cAbPSA15 en 20 herkennen enkel de PSA rechtstreeks gecoat op microtiter plaat. Het verschil tussen deze PSA specifieke kameel antilichaam fragmenten is doordat bij het coaten van PSA rechtstreeks op microtiter plaat, de conformatie van PSA drastisch veranderd en dus een invloed heeft op de epitoop herkenning van zowel monoklonaal antilichaam als kameel antilichaam fragment. Om een idee van de range te krijgen van de cAb affiniteit voor PSA, werd een competitieve ELISA uitgevoerd volgens Friguet et al. (1985). Hierbij werd een waarde van 50 en 60 nM gevonden voor respectievelijk cAbPSA11 en cAbPSA15. Het cAbPSA11 herkent evenwel het volledig gezuiverde PSA beter dan het halfgezuiverde PSA mengsel. Dit is waarschijnlijk te wijten aan de aanwezigheid van verschillende contaminaties in het halfgezuiverde PSA mengsel. Het cAbPSA15 kon niet weggecompetiteerd worden door zuiver PSA, maar wel door het halfgezuiverde PSA mengsel. Deze discrepantie tussen het volledig gezuiverde PSA en het halfgezuiverde PSA mengsel bij competitie met cAbPSA15, kan te wijten zijn aan de hogere proportie van nicked (inactief) PSA in het halfgezuiverde PSA mengsel. Het cAbPSA15 herkent mogelijk een gedenatureerd epitoop van PSA. Voor een PSA diagnostische test moet het mogelijk zijn om met een kameel antilichaam fragment PSA te kunnen binden uit oplossing. Hiervoor werd een spiking ELISA experiment gedaan waarbij nagegaan werd in welke mate een bepaalde hoeveelheid van PSA, alleen of met irrelevante proteïnen in oplossing, kon gebonden worden op een kameel antilichaam fragment. Enkel voor cAbPSA11 werd een positief resultaat gevonden. Echter is de gevoeligheid van het cAbPSA11 te laag om extreem lage hoeveelheden van een paar ng/ml PSA in bloed te kunnen detecteren met de nodige graad van voldoening.

78

6 Samenvatting Omdat prostaatkanker de tweede meest voorkomende doodsoorzaak is bij mannen, zoekt men naar middelen om prostaat kanker te behandelen en te voorkomen. Sinds de ontdekking van het prostaat-specifiek antigen (PSA) is de diagnose bij prostaatkanker patiënten in een stroomversnelling gekomen. Door middel van een eenvoudige meting van verschillende vormen van PSA in het serum van de mogelijke prostaatkanker patiënt kan snel een diagnose gesteld worden. De scriptie bestaat erin binders te zoeken tegen het prostaat-specifiek antigen. PSA, lid van de serine protease familie, is een antigen dat specifiek door de prostaat klier cellen wordt uitgescheiden en in de bloedbaan wordt geïnhibeerd door het serpine, alpha-1-antichymotrypsine (ACT). In de bloedbaan komt het PSA grotendeels voor onder een vrije vorm of als een complex met alpha-1-antichymotrypsine. Er werden meerdere studies verricht waarbij de concentraties van verschillende vormen van PSA in de bloedbaan werden gecorreleerd met de incidentie van prostaat kanker, maar deze bleken inaccuraat te zijn. Het grootste probleem bleek dat men geen onderscheid kon maken tussen de goedaardige of kwaadaardige vorm van prostaat kanker. Recentere studies wijzen op het feit dat metingen van de verhouding van de vrije vorm van PSA, in complex met alpha-1-antichymotrypsine, tot de totale hoeveelheid PSA in de bloedbaan, een beter resultaat geeft. Hierdoor kan een duidelijk onderscheid gemaakt worden in de diagnose tussen de goedaardige of kwaadaardige vorm van prostaat kanker. Meerbepaald de verhouding van de hoeveelheid vrije vorm van PSA tot de totale hoeveelheid PSA in het bloedplasma is lager bij patiënten met de kwaadaardige vorm van prostaat kanker dan met de goedaardige vorm van prostaat kanker. De huidige diagnostische tests bepalen deze ratio met behulp van een simpele bloedtest en dit geeft een indicatie welke vorm van prostaat kanker men heeft. Deze manier van een primair bloedonderzoek is veel handiger dan alle mogelijke prostaat kanker patiënten een digitaal rectaal onderzoek laten ondergaan. Nu worden deze snelle diagnoses uitgevoerd door commerciële kits die gebruik maken van monoklonale antilichamen gericht tegen het PSA en alpha-1-antichymotrypsine. Antilichamen worden algemeen gebruikt als onderzoekshulpmiddel en hebben veel toepassingen in diagnostische en therapeutische doelen. In de ULTR onderzoeksgroep heeft men de expertise om kameel antilichaam fragmenten af te zonderen uit het bloed van geïmmuniseerde kamelen. De kameel antilichaam fragmenten zijn enkel domein antilichamen. Ze hebben vele voordelen over de conventionele monoklonale antilichamen: resistentie tegen zuur, temperatuur en chemicaliën en gemakkelijke oppervlakte immobilisatie zonder de antigen bindende capaciteit te verliezen. 79

Voor diagnostiek zou men voordeel halen in het gebruik van kameel antilichaam fragmenten boven de monoklonale antilichamen. We zoeken naar binders tegen het PSA door een kameel te immuniseren, door een normaal immunisering protocol te hanteren. Na verschillende inspuitingen met mg hoeveelheden PSA, heeft men bloed genomen van de met PSA geïmmuniseerde kameel. Uit dit bloed werden de B-lymfocyten geïsoleerd en daaruit mRNA afgezonderd. cDNA werd bereid vanaf het mRNA en op het totale cDNA werd een geneste PCR uitgevoerd. De delen van antilichamen die specifiek zorgen voor binding met hun antigen werden zo geamplifieerd. Deze worden in een fagmide vector geligeerd om een kameel antilichaam fragment bibliotheek te verkrijgen. Door gebruik te maken van de panning techniek met behulp van M13 filamenteuze fagen, kan men overgaan tot het zoeken naar de specifieke PSA binders. Na verschillende ronden van in vitro selectie, panning, komt men tot een aanrijking van PSA bindende kameel antilichaam fragmenten. Deze specifieke PSA binders kunnen dan opgepikt en tot expressie gebracht worden in E.coli. Zo werden 3 verschillende binders tegen PSA (cAbPSA11, cAbPSA15 en cAbPSA20) en 1 tegen ACT (cAbACT16) geïdentificeerd. De affiniteiten van cAbPSA11 en 15 bedragen respectievelijke 50 nM voor volledig gezuiverd PSA en 60 nM voor het halfgezuiverde PSA. Het cAbPSA11 en cAbPSA15 herkennen verschillende epitopen op PSA: cAbPSA11 een conformationeel epitoop en cAbPSA15 een gedenatureerd epitoop. Met cAbPSA11 kon een capturing gedaan worden van PSA uit oplossing, maar de gevoeligheid is te laag om te kunnen aanwenden in een diagnostische test.

80

7 Literatuurlijst 1. Al-Lazikani, B., Lesk, A.M., Chothia, C. (1997). Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins. Journal of Molecular Biology, 273, 927-948. 2. Andriole, G.L. & Catalona W.J. (1994). Prostate carcinoma. Annual Review of Medicine, 45, 351-359. 3. Belldegrum, A., Kirby, R.S., Oliver, R.T.D. (1998). New perspectives in prostate cancer. Isis Medical Media, Oxford, 429 pp. 4. Catalona, W.J., Smith, D.S., Ratliff, T.L. et al. (1991). Measurement of prostate-specific antigen in serum as a screening test for prostate cancer, The New England Journal of Medicine, 324 (17), 1156-1161. 5. Chan, D.W., Bruzek, D.J., Oesterling, J.E., Rock, R.C., Walsh, P.C. (1987). Prostatespecific antigen as a marker for prostatic cancer: a monoclonal and a polyclonal immunoassay compared, Clinical Chemistry, 33 (10), 1916-1920. 6. Chothia, C. & Lesk, A.M. (1987). Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins. Journal of Molecular Biology, 196, 901-917. 7. Christensson, A., Laurell, C.B., Lilja, H. (1990). Enzymatic activity of prostate-specific antigen and its reactions with extracellular serine protease inhibitors.European Journal of Biochemistry, 194 (3), 755-763 8. Christensson, A.,Björk, T., Nilsson, O. et al. (1993).Serum prostate specific antigen complexed to alpha-1-antichymotrypsin as an indicator of prostate cancer. Journal of Urology, 150, 100-105. 9. Clements, J.A., Merritt, T., Devoss, K. et al. (2000). Inactive free: total prostate specific antigen ratios in ejaculate form men with suspected and known prostate cancer, compared with yound control men, British Journal of Urology International, 86, 453-458. 10. Conrath, K.E. (2001) Exploring camel single-domain antibody fragments for biotechnological applications. Scriptie, Vrije Universiteit Brussel, 150 pp. 11. Conrath, K.E., Lauwereys, M., Galleni, M. et al. (2001). Beta-lactamase inhibitors derived from single-domain antibodies elicited in Camelidae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45 (10). 12. Conrath, K.E., Lauwereys, M., Wyns, L., Muyldermans, S. (2000). Camel single-domain antibodies as modular building units in bispecific and bivalent antibody constructs. Journal of Biological Chemistry, 276 (10), 7346-7350.

81

13. Conrath, K.E., Stijlemans, B., Wyns, L. et al. (2001). Differential epitope recognition by single-domain antibody fragments generated in Camelids against the Trypanosome Variant Surface Glycoprotein. Journal of Biological Chemistry, Submitted. 14. Corey, E., Wegner S.K., Corey, M.J., Vessella, R.L. (1997). Prostate-specific antigen: characterization of epitopes by synthetic peptide mapping and inhibition studies. Clinical Chemistry, 43 (4), 575-584. 15. Decanniere, K., Desmyter, A., Lauwereys, M., Ghahroudi, M.A., Muyldermans, S., Wyns, L. (1999). A single-domain antibody fragment in complex with RNase A: noncanonical loop structures and nanomolar affinity using two CDR loops. Structure, 7 (4), 361-370. 16. Decanniere, K., Muyldermans, S., Wyns, L. (2000). Canonical antigen-binding loop structures in immunoglobulins: more structures, more canonical classes? Journal of Molecular Biology, 300, 83-91. 17. Desmyter, A., Decanniere, K., Muyldermans, S., Wyns, L. (2001). Antigen specificity and high affinity binding provided by one single loop of a camel single-domain antibody. Journal of Biological Chemistry, 276, 26285-26290. 18. Desmyter, A., Transrue, T.R., Ghahroudi, M.A. et al. (1996). Crystal structure of a camel single-domain VH antibody fragment in complex with lysozyme. Nature Structural Biology, 3 (9), 803-811. 19. Diamandis, E.P. (2000). Prostate-specific antigen: a cancer fighter and a valuable messenger? Clinical Chemistry, 46 (7), 896-900. 20. Friguet, B., Chafotte, A.F., Djavadi-Ohaniance, L., Goldberg, M.E., 1985. Measurement of the true affinity constant in solution of antigen-antibody complexes by enzyme-linked immunosorbent assay. Journal of Immunological Methods, 77 (2), 305-319. 21. Ghahroudi, M.A. (1997). Generation and characterization of phage-displayed camel single-domain antibodies. Scriptie, Vrije Universiteit Brussel, 161 pp. 22. Ghahroudi, M.A., Desmyter, A., Wyns, L., Hamers, R., Muyldermans, S. (1997). Selection and identification of single domain antibody fragments from camel heavy-chain antibodies. FEBS Letters, 414, 521-526. 23. Hamers-Casterman, C., Atarhouch, T., Muyldermans, S. et al. (1993). Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Letters to Nature, 363, 446-448. 24. Hoogenboom, H.R. & Chames, P. (2000). Natural and designer binding sites made by phage display technology. Immunology Today, 21 (8), 371-377.

82

25. Jung, K., Brux, B., Lein, M. et al. (2000). Molecular forms of prostate-specific antigen in malignant and benign prostatic tissue: biochemical and diagnostic implications. Clinical Chemistry, 46 (1), 47-54. 26. Kabat, E., Wu, T.T., Perry, H.M., Gottesman, K.S., Foeller, C. (1991). Sequence of proteins of immunological intrest. US Public Health Services, NIH Bethesda, M.D., Publication No. 91-3242 27. Lauwereys, M., Ghahroudi, M.A., Desmyter, A. et al. (1998). Potent enzyme inhibitors derived from dromedary heavy-chain anitbodies. The EMBO Journal, 17 (13), 3512-3520. 28. Leinonen, J., Zhang, W.M., Stenman, U.H. (1996). Complex formation between PSA isoenzymes and protease inhibitors. Journal of Urology, 155, 1099-1103. 29. Lesk, A.M. & Chothia, C. (1988). Elbow motion in the immunoglobulins involves a molecular ball-and-socket joint. Nature, 355, 188-190. 30. Lilja, H., Christensson, A., Dahlén, U. et al. (1991). Prostate-specific antigen in serum occurs predominantly in complex with α1-antichymotrypsin. Clinical Chemistry, 37 (9), 1618-1625. 31. Lilja, H., Cockett, A.T.K., Abrahamsson, P.A. (1992). Prostate-specific antigen predominantly forms a complex with α1-antichymotrypsin in blood. Cancer Supplement, 70 (1), 230-234. 32. Lundwall, A. & Lilja, H.(1987). Molecular cloning of human prostate specific antigen cDNA. FEBS letters, 214 (2), 317-322. 33. Michel, S., Deléage, G., Charrier, J.P. et al. (1999). Anti-free postate specific antigen monoclonal antibody epitopes defined by mimotopes and molecular modeling. Clinical Chemistry, 45 (5), 638-650. 34. Muyldermans, S. & Lauwereys, M. (1999). Unique single-domain antigen binding fragments derived from naturally occurring camel heavy-chain antibodies. Journal of Molcular Recognition, 12,131-140. 35. Muyldermans, S., Atarhouch, T., Saldanha, J., Barbosa, J.A.R.G., Hamers, R. (1994). Sequence and structure of VH domains from naturally occuring camel heavy chain immunoglobulins lacking light chians. Protein Engineering, 7 (9), 1129-1135. 36. Muyldermans, S., Cambillau, C., Wyns, L. (2001). Recognition of antigens by singledomain antibody fragments: the superfluous luxury of paired domains. Trends in Biochemical Sciences, 26 (4), 230-235. 37. Nguyen, V.K., Desmyter, A., Muyldermans, S. (2001). Functional heavy-chain antibodies in Camelidae. Advances in Immunology, Submitted. 83

38. Nguyen, V.K., Hamers, R., Wyns, L., Muyldermans, S. (2000). Camel heavy-chain antibodies: diverse germline VHH and specific mechanisms enlarge the antigen-binding repertoire. The EMBO Journal, 19 (5), 921-930. 39. Nguyen, V.K., Muyldermans, S., Hamers, R. (1998). The specific variable domain of camel heavy-chain antibodies is encoded in the germline. Journal of Molecular Biology, 275, 413-418. 40. Noldus, J., Chen, Z., Stamey, T.A. (1997). Isolation and characterization of free form prostate specific antigen (f-PSA) in sera of men with prostate cancer. Journal of Urology, 158, 1606-1609. 41. Nurmikko, P., Väisänen, V., Piironen, T., Lindgren, S., Lilja, H., Pettersson, K. (2000). Production and characterization of novel anti-prostate-specific antigen (PSA) monoclonal antibodies that do not detect internally cleaved Lys145-Lys146 inactive PSA. Clinical Chemistry, 46 (10), 1610-1618. 42. Padlan, E.A. (1994). Anatomy of the antibody molecule. Molecular Immunology, 31 (3), 169-217. 43. Peter, J., Unverzagt, C., Hoesel, W. (2000). Analysis of free prostate-specific antigen (PSA) after chemical release from the complex with α1-antichymotrypsin (PSA-ACT), Clinical Chemistry, 46 (6), 474-482. 44. Pettersson, K., Piironen, T., Seppälä, M. et al. (1995). Free and complexed prostatespecific antigen (PSA): in vitro stability, epitope map, and development of immunofluorometric assays for specific and sensitive detection of free PSA and PSA-α1antichymotrypsin complex, Clinical Chemistry, 41 (10), 1480-1488. 45. Rafferty, B., Rigsby, P., Rose, M., Stamney, T., Das, R.G. (2000). Reference reagents for prostate-specific antigen (PSA): establishment of the first international standards for free PSA and PSA (90:10). Clinical Cheminstry, 46 (9), 1310-1317. 46. Riechman, L., Muyldermans, S. (1999). Single domain antibodies: comparison of camel VH and camelised human VH domains. Journal of Immunological Methods, 231, 25-38. 47. Robert, M., Gibbs, B.F., Jacobson, E., Gagnon, C. (1997). Characterisation of prostatespecific antigen proteolytic activity on its major physiological substrate, the sperm motility inhibitor precursor/semenogelin I. Biochemistry, 36, 3811-3819. 48. Roitt, I. (1988). Essential Immunology. Blackwell Scientific Publications, London, 286 pp. 49. Sambrook., J. & Russell, D.W. (1989). Molecular Cloning – A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York. 84

50. Skerra, A. & Plückthun, A. (1988). Assembly of functional immunoglobulin Fv fragments in Escherichia coli. Science, 240, 1038-1041. 51. Smith, G.P. & Petrenko, V.A. (1997). Phage Display. Chemical Review, 97, 391-410. 52. Spinelli, S., Frenken, L., Hermans, P., Verrips, T., Brown, K., Tegioni, M., Cambillau, C. (2000). Camelid heavy-chain variable domains provide efficient combining sites to haptens. Biochemistry, 39, 1217-1222. 53. Stenman, U.H., Leinonen, J., Alfthan, H., Rannikko, S., Tuhkanen, K., Alfthan, O. (1991). A complex between prostate-specific antigen and α1-antichymotrypsin is the major form of prostate-specific antigen in serum of patients with prostatic cancer: assay of the complex improves clinical sensitivity for cancer, Cancer Research, 51, 222-226. 54. Tonegawa, S., Sakano, H., Kurosowa, K., Weigert, M. (1981). Identification of D segments of immunoglobulin heavy chain genes and their rearrangement in T-lymfocytes. Nature, 290, 562-565. 55. Vihinen, M. (1994). Modeling of prostate specific antigen and human glandular kallikrein structures. Biochemical and Biophysical Research Communication, 204 (3), 1251-1256. 56. Vu, K.B, Ghahroudi, M.A., Wyns, L., Muyldermans, S. (1997). Comparison of llama VH sequences from conventional and heavy chain antibodies. Molecular Immunology, 34 (1617), 1121-1131. 57. Wang, T.J., Slawin, K.M., Rittenhouse, H.G., Millar, L.S., Mikolajczyk, S.D. (2000). Benign prostatic hyperplasia-associated prostate-specific antigen (BPSA) shows unique immunoreactivity with anti-PSA monoclonal antibodies. European Journal of Biochemistry, 267, 4040-4045. 58. Watt, K.W.K., Lee, P.J., M’Timkulu, T., Chan, W.P., Loor, R. (1986). Human porstatespecific antigen: structural and functional similarity with serine proteases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 83, 3166-3170. 59. Woolf, S.H. & Rothemich, S.F. (1999). Screening for prostate cancer: the roles of science, policy, and opinion in determining what is best for patients. Annual Review of Medecine, 50, 207-221. 60. Wu, P., Leinonen, J., Koivunen, E., Lankinen, H., Stenman, U.H. (2000). Identification of novel prostate-specific antigen-binding peptides modulating its enzyme activity. European Journal of Biochemistry, 267, 6212-6220. 61. Zegers, I., Deswarte, J., Wyns, L. (1999). Trimeric domain swapped barnase. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 96 (3), 818-822.

85

62. Zhang, W.M., Finne, P., Leinonen, J., Vesalainen, S., Nordling, S., Stenman, U.H. (1999). Measurement of the complex between prostate-specific antigen and α1-protease inhibitor in serum. Clinical Chemistry, 45 (6), 814-821. 63. Zhang, W.M., Leihonen, J., Kalkkinen, N., Dowell, B., Stenman, U.H. (1995). Purification and characterization of different molecular forms of prostate-specific antigen in human seminal fluid. Clinical Chemistry, 41 (11), 1567-1573. 64. Zhou, A.M., Tewari, P.C., Bluestein, B.I., Caldwell, G.W., Larsen, F.L. (1993). Multiple forms of prostate-specific antigen in serum: differences in immunorecognition by monoclonal and polyclonal assays. Clinical Chemistry, 39 (12), 2483-2491.

86