ISBN

1

ISBN 978-80-254-9634-3

2

BEST Servis, Ústí nad Labem Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v. v. i., Praha Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta, Katedra analytické chemie, UNESCO Laboratoř elektrochemie ţivotního prostředí

Sborník přednášek mezinárodní odborné konference

XXXI.

Moderní Elektrochemické Metody Jetřichovice, Česká republika 23. – 27. května 2011

Uspořádali: Navrátil Tomáš, Barek Jiří

ISBN 978-80-254-9634-3

3

4

BEST Servis, Ústí nad Labem J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Prague Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Prague

Collection of Conference Proceedings International Conference

Modern Electrochemical Methods XXXI

Jetřichovice, Czech Republic May 23rd - May 27th, 2011

Editors: Navrátil Tomáš, Barek Jiří

ISBN 978-80-254-9634-3

5

Tato publikace je určena pro účastníky konference a členy pořádajících organizací.

Za obsah veškerých textů nesou plnou zodpovědnost autoři. Publikace neprošla odbornou ani jazykovou úpravou. Zveřejněné informace mohou být dále pouţity za předpokladu úplného citování původního zdroje. Přetiskování, kopírování či převádění této publikace do jakékoliv tištěné či elektronické formy a její prodej je moţný pouze na základě písemného souhlasu vydavatele. (Bona fide vědečtí pracovníci si mohou pořídit jednotlivé kopie pro vlastní potřebu).

6

New Procedures for Voltammetric Determination of Copper(II) and Mercury(II) Using Antimony Film-Coated Carbon Paste Electrode Amir M. Ashrafi, and Karel Vytřas Department of Analytical Chemistry, University of Pardubice, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Determination of Cu(II) and Hg(II) have been tried using antimony film carbon paste electrode. Optimization of voltammetric variables have been carried out and the real sample was also analyzed using the new methods .The obtained results confirmed the method as a successful and precise method. Introduction Since invention of polarography, mercury electrodes has been playing predominant role in stripping voltammetry. Nevertheless, due to the toxicity of mercury its use seems to be constrained. In the year 2000, bismuth, a new electrode material was introduced as a promising alternative of mercury used for decades in stripping analysis 1 however, due to strict regulation and provisions concerning the use of the mercury, there are still considerable efforts focused on new mercury free electrode materials which can satisfactorily be applied in modern stripping electroanalysis. The in situ prepared antimony film electrode was suggested as another alternative 2,3 that approaches the electroanalytical performance of mercury- and bismuth-based electrodes, featuring some interesting characteristics such as favorably negative overpotential of hydrogen evolution, wide operational potential window, conventional operation in relatively strong acidic medium (pH≤2) and interestingly low stripping signal for antimony itself. In this contribution, the possibility was tried of using mentioned benefits of Sb-based electrodes for determination of some metals whose stripping signals are very close to antimony one: first, Cu2+ which has been measured by square wave anodic stripping, and secondly, Hg2+ which has been also determined at in situ SbF-CPE in the presence of cadmium which exhibited a catalytic effect on the Hg stripping peak. Experimental part Chemicals All chemicals used in this work were of analytical grade. Atomic absorption standard stock solutions were used for antimony(III), copper(II), mercury(II) and other metal ions (1000 mg L-1, Fluka). Equipments A modular electrochemical analyzer AUTOLAB equipped with PGSTAT12 controlled by GPES software (EcoChemie, Utrecht, The Netherlands) was used for all voltammetric measurements. The conventional three-electrode configuration with antimony film-plated carbon paste electrode (SbF-CPE) was employed throughout the work. The Ag/AgCl/3M KCl and a Pt plate served as the reference and auxiliary electrodes. All electrochemical experiments were carried out in one-compartment voltammetric cells (10-20mL) at conditioned room temperature (23±1 °C). In voltammetric stripping measurements, a magnetic stirrer was employed during the electrochemical deposition step. The pH values were measured with a CPH 52 pH-meter (Elteca, Turnov, Czech Republic) with combined glass electrode (OP-0808P; Radelkis, Budapest, Hungary) and calibrated using commercially available standard buffers.

7

Preparation of a carbon paste substrate electrode The carbon paste was prepared by intimately hand-mixing of graphite powder (0.5 g; CR-5, Maziva Týn nad Vltavou, Czech Rep.) with highly viscous silicone oil (0.3 mL; LUKOIL MV 8000, Lučební závody Kolín, Czech Rep.). Both components were homogenized to obtain a mixture that was subsequently packed into a piston-driven carbon paste holder 4, thus providing a carbon paste electrode support for in situ platting with antimony film. When needed, the carbon paste surface was mechanically renewed extruding ca. 0.5 mm of the paste out of the electrode holder and smoothed with a wet filter paper. Usually, this simple operation was made before starting a new set of experiments. Procedure Anodic stripping voltammetry (ASV). A solution containing antimony(III) salt (600 ppm Sb) and desired concentration of an analyte (Cu(II) or Hg(II)) in HCl solution (20 mL), whose concentration was optimized for each analyte separately, in the case of Hg(II) also Cd(II) salt (50 ppb) was added because of its apparent catalytic effect on the Hg(II) peak, was prepared inside of the voltammetric cell and electrolyzed under corresponding voltage. Following the electrochemical deposition step and a short equilibration period (tep 15 s), a square-wave (SW) voltammogram was recorded by applying a square-wave potential scan toward more positive potentials. Before each measurement, the “cleaning” step was performed by keeping the working electrode at +0.3 V for 30 s. Results and discussion Effect of the antimony film on the Cu(II) and Hg(II) was investigated, it had clearly positive effect on oxidation peaks of both metals (not shown). Optimization of voltammetric parameters such as; pH, accumulation potential and accumulation time and in the case of Hg(II) the optimum concentration of added Cd(II) were carried out. The results are shown in Table I. Table I. Optimum amount of voltammetric parameters for determination Cu (II) and Hg (II) at SbFCPE Concentration Accum. Accum. Concentration Amount of Parameter of HCl potential time of Sb added cadmium mol L-1 V s ppb ppb Analyte Cu(II) 2 -1.2 120 600 Hg(II) 1 -1.1 150 500 150 In the case of copper, the positions of re-oxidation potentials for both Sb and Cu are almost the same, however, signal for the Sb peak is very small. Thus, the determination of copper can successfully be realized. Effect of the Sb(III) concentration on the Cu and Hg peaks altitude was also investigated. Under abovementioned conditions, additions of 200 – 1000 ppb Sb(III) were applied to a solution containing 50 ppb Cu(II) or Hg (II). It was observed that at least 510 times higher concentration of the film forming Sb(III) salt must be used to obtain sufficiently higher current response for analyte. Further increase of the salt had a slight effect on the Cu or Hg peak only (not shown); therefore, an addition of 600 ppb Sb(III) was used for calibration. Possible interferences on ASV determination of copper(II) and mercury(II) caused by the presence of other metal ions were investigated in the solution containing 50 ppb Cu(II) or Hg(II) respectively. The results are shown in Table II.

8

Table II. Study of interference effects of different metals ions on Cu(II)and Hg(II) determination. Interference Hg(II) or Cu(II) Pb(II) Ag(I) Au(III) Cd(II) Bi(III) c effect c effect c effect c effect c effect c effect Analyte ppb ppb ppb ppb ppb ppb Cu(II) (50ppb) Hg(II) (30ppb)

150

-

150

-

50

100

-

100

-

100 27% 100 strong

11% 100

23%

50 -42% -

-

50

-

100

-

The resulting stripping voltammograms under optimum conditions are presented in Fig. 1 and Fig. 2 together with corresponding calibration plots as insets. 45

30

40

25 20

35

15 I[µA]

30

10 5

25

0

I [µA]

0

20

50 c (Cu) [ppb] 100

150

15 10 5 0 -1.4

-1.2

-1

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

0

0.2

0.4

E [V]

Fig. 1. Construction of the calibration plot for determination of copper in the concentration range of 0 to 120 ppb at optimum conditions. 30

25 20 15

25

10 5

20

0 0

c

50 Hg

(ppb)

100

15 I (µA) 10

5

0 -1.5

-1.0

-0.5 E (V)

0.0

0.5

Fig. 2.Construction of the calibration plot for determination of mercury in the concentration range of 0 to 100 ppb at optimum conditions.

9

Real sample analysis To verify the procedures elaborated, a sample of river water representing quite complicated matrix (taken from Labe river in Pardubice, Czech Rep.) was tested. the sample was filtered three times and acidified to desired PH with concentrated HCl and then spiked with analyte (Cu(II) or Hg(II)) before three consecutive standard additions of 10 ppb analyte and SW stripping voltammograms were gradually recorded after each addition. In the case of copper, the result was compared with ICP-MS using the same sample and it was found out that there is good compromise between these two methods; statistical calculations also showed that this method is free of systematic errors. For mercury, the recovery was calculated to be 93.8%. Conclusion Using antimony film carbon paste electrode, Cu(II) and Hg(II) whose oxidation peak are so close to Sb(III) one have been determined and the interference effect of several other metal ions have been investigated, the variety of method has been tried using a real sample. Acknowledgements A financial support of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (MSM0021627502) is gratefully acknowledged. Literature 1. Wang J., Lu J., Hočevar S.B., Farias P.A.M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 2. Hočevar S.B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Anal. Chem. 79, 8639 (2007). 3. Tesařová E., Baldrianová L., Hočevar S.B., Švancara I., Vytřas K., Ogorevc B.: Electrochim. Acta. 54, 1506 (2009). 4. Švancara I., Vytřas K., Metelka R.: Czech Patent CZ 301714 B6 (applied 2 Dec 2002, administered 22 Apr 2010).

10

Comparison of Various Types of Diamond Electrodes for Determination of Biologically Active Organic Compounds b,c Simona Balasoiu , Jan Fischer a, Jiri Barek a, Raluca-Ioana van Staden b, Jacobus Frederick van Staden b, and Gabriel Lucian Radu c a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Laboratory of Electrochemistry and PATLAB Bucharest, National Institute of Research for Electrochemistry and Condensed Matter, 202 Splaiul Independentei Str., 060021, Bucharest, Romania, E-mail: [email protected] c Politehnica University of Bucharest, Faculty of Applied Chemistry and Materials Science, Department of Analytical Chemistry and Instrumental Analysis , 1-7 Gh. Polizu Str., Bucharest, Romania Abstract The properties of two types of diamond based electrodes were investigated, namely diamond screen-printed electrode and boron-doped diamond film electrode, in order to compare their performances and to test the possibility of their application for determination of biologically active organic compounds. The optimal conditions for voltammetric determination of the pesticide acifluorfen by differential pulse voltammetry on a boron-doped diamond thin film electrode were found, the pesticide being successfully determined in real water samples in a concentration range of 1.0∙10-7 -1.0∙10-6 mol L-1 with a limit of detection of 2.35∙10 -7. Key words: Diamond based screen printed electrodes, Boron-doped diamond electrode, Acifluorfen, Differential pulse voltammetry. Introduction Nowadays there is an increasing demand for sensors able to give a stable response, in a short time, but in the same time sensitive, selective, with high precision, to use and inexpensive. This necessity led to the development of a new type of electrochemical electrodes, namely screen-printed electrodes, which have been successfully used in various applications, from biomedical analysis, industrial process analysis to the environmental analysis, by a simple modification of the surface. The fabrication technique of these electrodes is simple, and is based on depositing thin layers on an inert support material, such as PVC or ceramic. On this substrates are imprinted the working electrode as well as the reference and the auxiliary electrode. The material used to obtain the reference and the auxiliary electrode can be kept the same once the method is established, only the working electrode can be modified by the use of various conductive inks, depending on further applications of the assembly 1,2. Due to the multiple advantages of this type of electrodes an increase in the number of original articles referring this subject has been reported as well as an increase in their application area, many screen-printed electrodes being commercial available, starting from the most popular, the glucose sensor, to electrodes used in more complex applications as the environmental detection of some herbicides, pesticides, heavy metals. The main limitation in the use of screen-printed electrodes is due to the physical-chemical proprieties of the electrode surface, problems as the surface passivation, the contamination, the physical adsorbtion or chemosorbtion during the measurements, are the ones influencing the performances of the electrodes. To avoid this inconveniences new disposable screenprinted electrodes have been developed, and new electrode materials, nontraditional, able to increase the performances of the electrodes have been studied 3. A new trend in this area is the use of the diamond in the construction of the working electrode. The advantages of using

11

diamond as electrode material are the chemical inertness, the wide potential window and negligible adsorption of organic compounds 4-6. Another variation of printed layers based on diamond is the diamond-like carbon (DLC) which presents the advantage of a higher mechanical durability than that of the screen printed carbon films 7. Electrochemical behavior of diamond thin films started to gain more importance from the 1980, manly highly boron-doped diamond electrodes which presents several advantages over conventional electrodes, such as: an inert surface with low adsorption proprieties, a low background current, stability to corrosion even in aggressive media and a wide potential window in electrolytes solutions 8,9. The aim of this paper is to present a comparison between screen-printed diamond based electrodes and a highly boron-doped diamond electrode and their use in some analytical applications. Experimental All chemicals used were of analytical grade. The stock solution of 1 mmolL-1 acifluorfen (AF) was prepared by dissolving the substance (Supelco, Bellefonte, USA) in NaOH 0.02 molL-1. Sodium ferrocyanide decahydrate (Na4Fe(CN)6∙10H2O) and potassium chloride (KCl) were purchased from Sigma-Aldrich. Other chemicals were obtained from Lachema Brno (Czech Republic). Deionized water was produced by a Milli-Q Plus System (Millipore, USA). Voltammetric measurements were performed using an Eco-Tribo Polarograph linked to a computer via Polar Pro software version 5.1 (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The screen-printed electrodes were provided by BVT Technologies (Brno, Czech Republic). The configuration of the electrodes is a three electrode arrangement. The sensor is formed on a corundum ceramic base, on witch were applied the working, the reference and the auxiliary electrodes. The end of the sensor contains a silver conductive part covered by a dielectric protection layer. The reference electrode is silver/silver chloride while the auxiliary electrode is made from platinum. The working electrode material was: pure platinum (Pt0D), platinum covered by a 5nm layer of diamond-like carbon ink (Pt5D), platinum covered by a 20 nm layer of diamond-like carbon ink (Pt20D), pure gold (Au0D), gold covered by a 5nm layer of diamond-like carbon ink (Au5D), gold covered by a 20 nm layer of diamond-like carbon ink (Au20D), pure nickel (Ni0D), nickel covered by a 5nm layer of diamond-like carbon ink (Ni5D), nickel covered by a 20 nm layer of diamond-like carbon ink (Ni20D), pure copper (Cu0D), copper covered by a 5nm layer of diamond-like carbon ink (Cu5D), copper covered by a 20 nm layer of diamondlike carbon ink (Cu20D). A polycrystalline boron-doped diamond film (BDDF) deposited on a silicon substrate (Adamant Technologies, Switzerland) was used as working electrode, an Ag/AgCl (3M KCl) as reference electrode and a platinum wire as auxiliary electrode. All measurements were performed at room temperature. In the case of screen-printed electrodes for the evaluation of the potential window direct current voltammetry (DCV) was used for each electrode in KCl 1.0 M solution, at a scan rate of 20 mV s-1. The scan rate, 20 mV s-1 the pulse amplitude, ±50 mV, and pulse width, 100 ms, were used in all differential pulse voltammetric (DPV) measurements. The cleaning of the screen printed electrodes was

12

carried out in 0.1M HNO3 solution by repeated cyclic voltammetry in the area of -1500 – 900 mV, with a scan rate of 100 mV s-1 while for the BDDF electrode the cleaning procedure consisted in applying a fixed potential of -3.0 V (vs. Ag/AgCl) for 10s followed by a potential of +3.0 V (vs. Ag/AgCl) for 10s in 1molL-1 HNO3 10. The general procedure to obtain the voltammograms for the evaluation of the screen-printed electrodes was: 6mL of 1M KCl were placed into an electrochemical cell, followed by spiking. Oxygen was removed from the measured solutions by purging with nitrogen. For the analysis of AF a similar procedure was applied: measurements in Britton-Robinson buffer were carried out followed by the addition of AF in the appropriate concentration. The calibration curves were measured at least five times and the dates were evaluated by linear regression. The limit of detection was calculated as three times the standard deviation for ten measurements at the lowest evaluable concentration divided by the slope of the linear regression. Results and discussion Screen-printed electrodes The potential window obtained by DCV for each type of tested screen-printed electrode is presented in Table I. The best results were obtained with Pt and Au based electrodes. Table I. Screen printed electrodes potential window (mV) in KCl 1M. DLC film thickness, nm 0 5 20

Electrode substrate Pt Au Ni Cu -700 – (+900) -1100 – (+850) -800 – (+450) -900 – (0) -800 – (+850) -950 – (+850) -700 – (+500) -950 – (-100) -600 – (+850) -1000 – (+850) -700 – (+500) -500 – (+150)

Additional measurements were carried out for the forward characterization of the Pt and Au screen printed electrodes. The cyclic voltammograms showed a higher stability of the Pt electrodes and better response characteristics. Even if the potential window for the Au based electrodes is wider, the electrode is not giving a reversible response, and the surface is passivated very fast. The highest signal for the concentration of 1.0 mM Na4Fe(CN)6 in KCl 1M is obtained by the use of Pt0D, but the use of Pt20D is giving a reproducible and more stable response as well as a more stable background current. Repeated measurements revealed that the electrode is not suitable for sensitive analytical determinations. Boron-doped diamond thin film electrode (BDDFE) A BDDFE was also tested during this experiment. Measurements in Na4Fe(CN)6 showed no change in the electrode response characteristics, no passivation of the electrode surface being registered like in the previous case. At first the pH influence was studied on differential pulse voltammograms of AF (c = 1 x 10-5 mol L-1) as shown in Fig.1. The peak current is decreasing from pH 2 to pH 6, at pH higher than 6 similar responses being observed, while the peak potential is shifting toward more negative potentials with the increase of pH (from 460 mV in the case of pH 2 to -825 mV in the case of pH 8) (Fig. 1). The optimal pH for the determination of AF was established to be pH 2. The calibration dependence was investigated in the concentration range of 1.0∙10-5-1.0∙10-4, 1.0∙10-6-1.0∙10-5 and 1.0∙10-7 - 1.0∙10-6 (Fig. 2). For concentrations higher than 4.0∙10-5 the electrode is not giving a linear response. Based on the obtained results the electrode was successfully tested for the detection of AF in drinking

13

water and river water samples. The main results are summarized in Table II. -600

-150

I, nA

pH 2 pH 12 pH 9

-300 pH 3

pH 7

pH 4 pH 5

I, nA pH 11 pH 10 pH 6

-100

pH 8

pH 6

-50 0 -200

-500

-500 -800 E, mV

-800 -1100 E, mV

Fig. 1. Differential pulse voltammograms of AF ( c = 1.0∙10-5 mol L-1) at BDDF electrode in a Britton-Robinson buffer of pH from 2 to 12. -40

I, nA

-20

-80

0

5 10 -7 c x 10 , mol/L

I, nA

7 6 5

0

4 -50

3 2 1 -20 -200

-500

-800 E, mV

Fig. 2. Differential pulse voltammograms of AF BDDF electrode in Britton-Robinson buffer pH 2. Concentration of AF: 0 (1), 1.0∙10-7 (2), 2.0∙10-7 (3), 4.0∙10-7 (4), 6.0∙10-7 (5), 8.0∙10-7 (6), 1.0∙10-6 (7) mol/L. Table II. Calibration characteristics for voltammetric determination on AF at BDDF electrode in B-R buffer pH 2 Sample C, mol/L Slope, nA∙L/mol Intercept, nA LOD, mol/L R -6 -5 7 -6 Deionized water 1.0∙10 -1.0∙10 -4.80∙10 -9.9 1.05∙10 -0.9939 Deionized water Drinking water River water

1.0∙10-7 -1.0∙10-6 -7

-6

-7

-6

1.0∙10 -1.0∙10 1.0∙10 -1.0∙10

-4.62∙10 7 -2.81∙10

7

-3.75∙10

7

14

-1.8

2.35∙10 -7

-0.9889

-8.6

3.91∙10

-7

-0.9926

2.14∙10

-7

-0.9923

-0.9

Conclusions The behavior of two types of diamond electrodes was investigated in order to determine which one is more suitable to use for the determination of biologically active organic compounds. The screen-printed electrodes tested were found unsuitable, the thin diamond layer being unstable, the electrodes proving not to be suitable for sensitive analytical determinations. On the other hand the boron-doped diamond electrode proved to be a suitable electrode for the determination of submicromolar concentration of an organic active compound, namely acifluorfen, even in the complex matrices of model samples. Acknowledgements Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC 06035, RP 14/63 and MSM 0021620857), Grant Agency of Charles University (project SVV 2011-263204) and the Grant Agency of the Czech Republic (project P206/10/P087) is gratefully acknowledged. S. Balasoiu is grateful to the project funded by the Sectoral Operational Program Human Resources Development 2007-2013 of the Romanian Ministry of Labour, Family and Social Protection through the Financial Agreement POSDRU/6/1.5/S/19 – ID 7713. References 1. Pemberton R.M., Pittson R., Biddle N., Hart J.P.: Biosens. Bioelectron. 24, 1246 (2009). 2. Carrara S., Shumyantseva V. V., Archakov A. I., Samor B.: Biosens. Bioelectron. 24, 148 (2008). 3. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 4. Rao T. N., Ivandini T. A., Terashima C., Sarada B. V., Fujishima A.: New Diamond Front. Carbon Technol. 13 , 79 (2003). 5. Rao T.N., Loo B. H., Sarada B. V., Terashima C., Fujishima A.: Anal. Chem. 74, 1578 (2002). 6. Peckova K., Musilova J., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 148 (2009). 7. Zeng A., Liu E., Tan S. N., Zhang S., Gao J.: Electroanalysis 14, 1294 (2002). 8. Panizza M., Cerisola G.: Electrochim. Acta 51, 191 (2005). 9. Cizek K., Barek J., Fischer J., Peckova K., Zima J.: Electroanalysis 19, 1295 (2007). 10. Dejmkova H., Scampicchio M., Zima J., Barek J., Mannino S.: Electroanalysis 21, 1014 (2009).

15

Voltammetric Study of Cytosine Oligonucleotides in Buffered and Non–Buffered Solutions (Voltametrická studie cytosinových oligonukleotidů v pufrovaném a nepufrovaném prostředí) Zdenka Balcarova, Sylvie Holubova, and Libuse Trnkova Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic, E–mail: [email protected] Abstract The work deals with the electrochemical study of three short homo–deoxyoligonucleotides (homo–ODNs) containing cytosine (C). Using linear sweep voltammetry (LSV) and elimination voltammetry with linear scan (EVLS) the effect of pH and the number of C in the ODN chain on reduction signals of dC3, dC6, and dC9 in buffered and non-buffered solutions was investigated. Reduction C peaks, recorded at mercury electrode in the potential range from –1.1 V to –1.7 V vs. Ag/AgCl/3M KCl, are strongly dependent not only on pH but also on the composition of solutions. With the addition of buffer (acetate-phosphate buffer) to 0.1 M NaCl the reduction peaks increase and move to more positive potentials. In nonbuffered solutions changes of voltammetric responses of all ODNs in time were observed. The biggest changes were recorded in the case of dC6. The adsorption or surface kinetics of ODNs was confirmed by EVLS and electrochemical behaviour of ODNs studied was discussed in the context of the i-motif formation. Keywords: Cytosine, Oligonucleotides, Linear sweep voltammetry, Elimination Voltammetry with linear scan. Introduction Oligo(dC) are important building blocks of nucleic acids taking part in the process of genetic information transfer. By C.CH+ pairs they can form the so-called structural i-motifs (intercalated motifs) which are extremely stable. Hydrogen bonding interactions between C are of prime importance for the formation of particular structure motifs 1-2. R N

H

H

O

N

+

N N H

N

H H

N

O

R

Fig. 1. Hydrogen bonding interactions between two cytosines and corresponding i-motif of (dC3)4. The i-motifs affect a wide scale of physico-chemical properties of ODNs including redox properties. Cytosine (2-oxy-4-aminopyrimidine) is reducible nucleobase on mercury electrode in the pH range from 2 to 7. The reduction mechanism was studied in buffered solutions by many electrochemists 3-4. The aim of our work was the electrochemical study of three short homo-deoxyoligonucleotides (ODNs) containing cytosine (C). We studied their electrochemical behavior by means of cyclic voltammetry (CV) and elimination voltammetry with linear scan (EVLS) in combination with adsorptive stripping technique. Research of these ODNs is important because it was found that the occurrence of trinucleotides repeated

16

in a sequence of DNA is related to the occurrence of hereditary diseases, such as some type of cancer and neurological diseases 5. Experiment Short synthetic ODNs: 5´–CCC–3 (dC3), 5´–(CCC)2–3´ (dC6), 5–(CCC)3–3´ (dC9) were purchased from Thermo Fisher Scientific, Ulm, Germany; dC6 and dC9 also from Integrated DNA Technologies, Inc., USA. The chemicals used for the preparation of solutions (sodium chloride and buffer components) were from Sigma Aldrich (ACS purity). Stock solutions of ODNs were prepared by dissolving their lyophilized forms in three times distilled water. Concentrations of dC3, dC6, and dC9 were determined by UV spectroscopy using the molar extinction coefficient calculated by the rule of the nearest neighbour. The extinction coefficient ε of the ODN of different number of nucleotides (n) was obtained by the relationship 6, 7 : n n nearest neighbour 260

n 1

individual n 2

n

Aqueous solutions of ODN samples were added to phosphoric acetic buffer (0.08 M) and their concentrations were 10µM. The pH values were verified by gel electrode in conjunction with a pH meter CyberScan PC 5500 (Eutech Instruments). Linear sweep and elimination voltammetry The cytosine ODNs were measured on a mercury electrode by LSV in buffered solutions (phosphoric + acetic buffer = FA) and non-buffered solutions (NaCl, the ionic strength I = 0.18 M) at pH 5.2. Voltammetric measurements were carried out at room temperature. The voltammetric parameters were as follows: time of conditioning of the electrode was 2 s, and scan potential was changed from –1.1 V to –1.7 V. The voltammetric curves were measured at different scan rates (from 100 to 800 mV/s) using an electrochemical analyser AUTOLAB PGSTAT 20 (EcoChemie, Netherlands) connected with VA Stand 663 (Metrohm, Switzerland) and controlled by GPES software. Electrochemical measurements were carried out in three electrode system. Hanging mercury drop electrode (HMDE) with an area of 0.4 mm2 was used as working electrode. Ag/AgCl/3M KCl electrode served as reference electrode and platinum wire as auxiliary electrode. The data obtained were evaluated by elimination voltammetry with linear scan (EVLS). We used the function with simultaneous elimination of kinetic and charging currents and with the diffusion current conservation (EVLS E4). The elimination function for scan rates based on multiples of two: f(I) = 17.485I – 11.657I1/2 – 5.8584I2, was applied 8-14. This elimination function increases current sensitivity and offers the possibility of fast studying if the depolariser is adsorbed at the electrode surface or not. Results and discussion Linear sweep voltammograms of dC3, dC6, and dC9 in buffered (FA buffer), non-buffered (NaCl) solutions are presented in Fig. 2, 3, and 4. The addition of buffer to 0.1M NaCl was also studied. It was found that the addition of buffer to NaCl leads to a substantial increase of reduction signals for all three ODNs and to a change of reduction peak shape. The most potential shift to more positive potentials was observed in the case of dC9 (Fig.4). At more negative potentials the process of hydrogen evolution and its catalysis by ODNs was observed The EVLS function E4 showed that in buffered and non-buffered solutions the electron transfer proceeds in an adsorbed state (peak-counterpeak signals in Fig. 5).

17

To determine the causes of time changes of the reduction signals of ODNs were studied peak heights (Ip) in the dependence on the scan rate immediately after sample preparation and after two hours. The slopes of bilogaritmic dependences {log Ip = f (log v)}, where scan rates 100, 150, 200, 250, 300 and 400 mV/s were used, indicated the checking the reduction of cytosine for all ODNs by adsorption. The comparison of reduction peak heights, having regard to the cytosine number in the ODN chain, indicated the creation of conformers including i-motifs.

Fig. 2. LSV curves of dC3 (10 µM) in non-buffered (0.1M NaCl), buffered (0.1M FA), and in mixture solutions (0.1M NaCl+FA), pH 5.2.

Fig. 3. LSV curves of dC6 (10 M) in non-buffered (0.1M NaCl), buffered (0.1M FA), and in mixture solutions (0.1M NaCl+FA), pH 5.2.

Fig. 4. LSV curves of dC9 (10 M) in non-buffered (0.1M NaCl), buffered (0.1M FA), and in mixture solutions (0.1M NaCl+FA), pH 5.2.

18

Fig. 5. EVLS curves of dC3, dC6 and dC9 in buffered solutions, pH 5.2. Scan rates used for E4 EVLS (200, 400, 800 mV/s). Reference scan was 400 mV/s. Conclusions The differences in electrochemical behavior of three cytosine ODNs (dC3, dC6 and dC9) were studied on a mercury electrode in buffered and non-buffered solutions by linear sweep voltammetry. LSV data were processed by the elimination procedure (EVLS E4) and it was found that the ODN adsorption and differences in structure (i-motif) are the main cause of different processes of ODNs on the charged interface such as mercury and the electrolyte. Acknowledgement This research was supported by projects INCHEMBIOL MSM0021622412 and BIO-ANALMED LC06035 and MUNI/A/0992/2009 the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic. References 1. Gehring K., Leroy J.L., Gueron M.: Nature 363, 561 (1993). 2. Kypr J., Kejnovska I., Renciuk D., Vorlickova M.: Nucleic Acids Res. 37, 1713 (2009). 3. Dryhurst G.: Electrochemistry of Biological Molecules, Academic Press, New York, 1977. 4. Brabec V., Walz D., Milazzo G.: Experimental Techniques in Bioelectrochemistry, Birkhäuser, Basel, Boston, Berlin 1996. 5. Vojtylova T., Dospivova D., Triskova O., Pilarova I., Lubal P., Farkova M., Trnkova L., Taborsky P.: Chemical Papers 63, 731 (2009). 6. Warshaw M.M, Tinoco I.: J.Mol. Biol. 20, 29 (1966). 7. Cantor, C.R., Warshaw, M.M. Biopolymers. 9, 1059 (1970). 8. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 9. Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 10. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis, 12, 905 (2000). 11. Trnkova.L.: Application of elimination voltammetry with linear scan in bioelectrochemistry. In: Bioelectrochemical and Mathematical Methods in Biological Research, Ed.: Adam, V. and Kizek, R: Signpost, Kerala, Chaper 4, p. 51, 2007. 12. Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001). 13. Trnkova L., Jelen F., Postbieglova I.: Electroanalysis 15, 1529 (2003). 14. Trnkova L., Jelen F., Postbieglova I.: Electroanalysis 18, 662 (2006) 15. Serrano N., Klosova K., Trnkova L.: Electroanalysis, 22, 2071 (2010). 16. Trnkova L., Novotny L., Serrano N., Klosova K., Polaskova P.: Electroanalysis 22, 1873 (2010).

19

Voltammetric Behavior of Leucovorin on Mercury Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode (Voltametrické chování leukovorinu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě) Lenka Bandţuchová, and Renáta Šelešovská Institute of environmental and chemical engineering, University of Pardubice, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected], [email protected] Abstract The voltammetric behavior of leucovorin (folinic acid, LV), as an important metabolite of folic acid, has been investigated in this paper. Mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE) as a working electrode in connection with differential pulse voltammetry (DPV) was applied for monitoring of electrochemical reduction of leucovorin. The limit of detection was found as 1.84×10-8 M (tacc = 60s). Proposed method was successfully applied for LV determination in a drug which is used as an antidote during methotrexate treatment. Key words: leucovorin, mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode, hanging mercury drop electrode, differential pulse voltammetry. Úvod Leukovorin (folinová kyselina, citrovorum faktor, Obr. 1 A) je jedním z redukovaných derivátů kyseliny listové (FA, Obr. 1 B) 1. FA je v organismu enzymaticky redukována enzymem dihydrofolát reduktásou na svoji aktivní formu tetrahydrogenfolát (H4folát). Jedním z metabolitů kyseliny listové je i LV neboli 5-formyl-tetrahydrogenfolát (5-formylH4folát). Foláty obecně se zúčastňují přenosu aktivovaných jednouhlíkových skupin nutných k výstavbě purinových bazí, které jsou nezbytné k tvorbě nukleových kyselin a tedy k obnově a dělení buněk 1. Naopak metotrexát (MTX), dikarboxylová kyselina lišící se od FA chybějící metylovou skupinou na pozici N10 a nahrazením hydroxylové skupiny na pteridinovém kruhu aminoskupinou, inhibuje enzym dihydrofolát reduktasu. Tím blokuje syntézu purinů ve všech buňkách, zamezuje jejich dalšímu dělení a zároveň dochází k jejich poškození. Vzhledem k rychlejšímu dělení nádorových buněk je právě jejich poškození největší 1-3. Proto je MTX vyuţíván například k léčbě různých forem rakoviny, psoriázy nebo revmatoidní artritidy 2,3. LV působí jako antidotum MTX a je vyuţíván při léčbě vysokými dávkami MTX. Dávky a doba podání LV po uţití MTX je vţdy individuální a závisí na konkrétní terapii 4. Negativní účinky MTX na lidský organismus se projevují především poškozením epitelu trávicího traktu, jater, kůţe či ledvin 2-4. LV se také pouţívá jako látka zvyšující cytostatický účinek 5fluorouracilu (5-FU) a případně pro léčbu megaloblastické anémie s prokázaným deficitem kyseliny listové 1-3. A

B

Obr. 1. Struktura leukovorinu (A) a kyseliny listové (B).

20

Vzhledem ke své biologické aktivitě a hojnému vyuţití v lékařství je problematika stanovení LV důleţitá a v literatuře jiţ byla publikována řada prací na toto téma. Např. vysoce účinná kapalinová chromatografie (HPLC) ve spojení s UV detekcí byla vyuţita pro stanovení LV a 5-FU v lidské plazmě 5. Espinosa-Mansilla a kol. úspěšně spektrofotometricky stanovili LV spolu s MTX v lidském séru 6. Stanovení LV, FA a MTX pomocí kapilární elektroforézy v moči provedl Flores a kol. 7. Vzhledem k tomu, ţe kyselina listová podléhá velmi snadno elektrochemické redukci a byla jiţ úspěšně voltametricky stanovena na rtuťových 8-12, modifikovaných uhlíkových 13-15 ale i amalgámových elektrodách 16,17 a rovněţ pro MTX byly navrţeny vhodné voltametrické metody stanovení 18,19, lze předpokládat, ţe leukovorin bude také poskytovat určitou elektrochemickou odezvu. Voltametrické chování LV na statické rtuťové kapkové elektrodě (SMDE) bylo popsáno M. Heyrovským 8. V acetátovém pufru o pH 4,7 podléhá tetrahydropteridinové jádro leukovorinu 2-stupňové oxidaci (píky okolo potenciálu -150 mV a 0 mV). Tato oxidace je svázána s redukčním píkem okolo potenciálu -400 mV. Další anodický pík, který je moţné pozorovat pouze při aplikaci počátečního potenciálu negativnějšího neţ -900 mV, je pozorován okolo potenciálu -800 mV. Tato oxidační reakce souvisí s redukčním píkem pozorovaným při potenciálu -950 mV 8. Tato práce je zaměřena na studium voltametrického chování leukovorinu na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě (m-AgSAE), která je jednou z modifikací stříbrných pevných amalgámových elektrod představených Novotným a Yosypchukem v r. 2000 20,21. Dále jsou výsledky získané na m-AgSAE porovnány s výsledky získanými s pouţitím HMDE. Experimentální část Všechny chemikálie pouţité pro přípravu zásobních roztoků, základního elektrolytu a ostatních roztoků byly čistoty p.a. Britton-Robinsonův (B-R) pufr o pH 3 aţ 12 byl připravován z kyselé sloţky obsahující 0,04 M H3PO4, 0,04 M H3BO3 a 0,04 M CH3COOH (všechny Lachema, Brno) a z alkalické sloţky, kterou představoval 0,2 M NaOH (Lachema, Brno). 0,05M acetátový pufr o pH 5 byl připravován ze směsi kyseliny octové a octanu sodného (oba Lachema, Brno). Roztok 0,2M KCl potřebného na aktivaci m-AgSAE byl připraven rozpuštěním vhodného mnoţství KCl (Lachema, Brno) v destilované vodě. Zásobní roztok leukovorinu o koncentraci 0,001 M byl připravován rozpuštěním vhodného mnoţství leukovorinu (Sigma-Aldrich) v destilované vodě kaţdých 14 dní a byl skladován v chladničce. Pro přípravu reálného vzorku léčiva byl pouţit prášek na přípravu injekčního roztoku LEUCOVORIN Ca LACHEMA 10 (Pliva-Lachema a.s., Brno), jehoţ deklarované mnoţství po rozpuštění v 1 ml destilované vody bylo 10 mg LV/1 ml. Všechna měření byla provedena pomocí počítačem řízeného Eco-Tribo Polarographu PC-ETP (Polaro-Sensors, Praha) se softwarem POLAR.PRO verze 5.1 v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda slouţila m-AgSAE příp. HMDE (obě Polaro-Sensors, Praha), jako referentní elektroda byla pouţívána nasycená argentchloridová elektroda a jako pomocná elektroda platinový drátek (obě Monokrystaly, Turnov). Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Kyslík z analyzovaného roztoku byl před kaţdou analýzou odstraněn probubláním roztoku dusíkem (čistota 4,0; Linde, Praha) po dobu 5-ti minut. Hodnoty pH byly měřeny pH-metrem Hanna 221 (Hanna Instruments, Inc., USA).

21

Při kaţdodenním pouţívání m-AgSAE byl jednou týdně obnoven rtuťový meniskus ponořením elektrody do kapalné rtuti zhruba na 15 sekund. Na začátku kaţdého pracovního dne nebo po přestávce v měření delší neţ 1 hodina byla elektroda aktivována v roztoku 0,2M KCl při potenciálu -2200 mV po dobu 5-ti minut. Regenerace povrchu byla prováděna před kaţdou analýzou nastavením vhodných podmínek v pouţitém software (-1000 mV po dobu 30-ti sekund). Pro měření byla vyuţita cyklická voltametrie (CV) při testování vlivu pH na elektrochemické chování LV, DC voltametrie (DCV) pro studium závislosti výšky píku na rychlosti polarizace a diferenčně pulzní voltametrie (DPV) pro všechna ostatní měření. Pro DPV byly jako optimální parametry navrţeny tyto hodnoty: výška pulzu -50 mV, šířka pulzu 80 ms, počáteční potenciál Epoč = 100 mV, konečný potenciál Ekon = -1000 mV, rychlost polarizace v = 20 mV∙s-1, potenciál regenerace Ereg = -1000 mV, doba regenerace treg = 30 s, potenciál akumulace Eak = 200 mV (-200 mV pro HMDE) a doba akumulace tak závisela na koncentraci leukovorinu v roztoku. Výsledky a diskuse Pomocí CV bylo zjištěno, ţe LV poskytuje 2 redukční píky na m-AgSAE v kyselém prostředí. V roztocích o pH 8 a vyšším ţádné píky pozorovány nebyly. Oxidační píky odpovídající oxidaci pteridinového jádra a zmíněné v literatuře pro HMDE 8 nebyly na m-AgSAE vůbec zaznamenány. Oba zmíněné redukční píky (Ep1 = -430 mV a Ep2 = -820 mV) poskytovaly největší proudovou odezvu v Britton-Robinsonově pufru o pH 4, který byl nadále pouţíván jako základní elektrolyt. Při pouţití HMDE jako pracovní elektrody byly v kyselém prostředí sledovány 2 píky oxidační (3. pík popsaný v literatuře 8 okolo potenciálu -800 mV pozorován nebyl) a 2 redukční, coţ odpovídá literatuře 8. I v případě této elektrody byly píky pozorovány pouze v kyselém prostředí. Poloha všech píků na obou pouţitých pracovních elektrodách se posouvala k negativním potenciálům lineárně s rostoucí hodnotou pH. Pomocí DCV bylo zjištěno, ţe oba redukční píky zaznamenané na m-AgSAE rostou lineárně s rychlostí polarizace, coţ odpovídá redukci v adsorbovaném stavu. Rovněţ na HMDE rostly všechny píky lineárně s rychlostí polarizace. S vyuţitím DPV s výše uvedenými optimalizovanými parametry bylo zjištěno, ţe druhý redukční pík LV je moţné sledovat na obou elektrodách jen při vyšších koncentracích a ţe nerostl s dobou akumulace. Proto byl pro další měření vyuţíván pouze první redukční pík. Pík 1 rostl lineárně s dobou akumulace, např. pro c(LV) = 5×10-7 M na m-AgSAE rostla výška píku lineárně v rozmezí tak = 10 aţ 70 s podle rovnice I p nA 0,0271t ak s 0,1264 s korelačním koeficientem R = 0,9995. Dále byly pro tento pík stanoveny některé statistické parametry. Z 11-ti opakovaných měření byla vypočítána hodnota relativní směrodatné odchylky opakovaného měření RSDM(11) = 1,52 % (pro m-AgSAE) a RSDM(11) = 13,06 % (pro HMDE). Pro různé koncentrace LV byly pomocí programu ADSTAT 22 určeny relativní směrodatné odchylky opakovaného stanovení RSDS(5) (Tabulka I.). Limit detekce byl stanoven pro m-AgSAE 1,84×10-8 M (tak = 60 s) a pro HMDE 1,51×10-6 M (tak = 40 s), coţ svědčí o výrazně vyšší citlivosti m-AgSAE pro voltametrické stanovení LV. Lineární dynamický rozsah pro LV byl nalezen v rozmezí 5×10-8 aţ 5×10-6 M (m-AgSAE) a 1×10-6 aţ 1×10-5 M (HMDE). Příklad koncentrační závislosti (c(LV) = 5×10-8 aţ 4×10-7 M) získané na m-AgSAE je znázorněn na Obr. 2. Vzhledem k vyšší citlivosti a lepší reprodukovatelnosti jednotlivých měření byla pro stanovení leukovorinu v léčivu pouţita pouze m-AgSAE jako pracovní elektroda. Obsah LV byl 5× opakovaně stanoven metodou standardního přídavku v injekčním roztoku LEUCOVORIN Ca LACHEMA 10 (RSDS(5) = 1,29 %) a získaná průměrná hodnota 10,08 mg/ml se od hodnoty uvedené výrobcem lišila o 0,8 %.

22

Tabulka I. Porovnání opakovaných stanovení různých koncentrací a RSDS(5) na m-AgSAE a HMDE. m-AgSAE HMDE stanoveno [M]

5×10-7 2×10-7 1×10-7 5×10-8

5,00×10-7 2,05×10-7 1,06×10-7 5,04×10-8

přidáno [M] stanoveno [M]

RSDS(5) [%]

2×10-6 -

1,31 1,06 2,79 0,99

I p [nA]

přidáno [M]

I [nA]

-5

-1

RSDS(5) [%]

2,07×10-6 -

2,89 -

Ip [nA] = -0,002 c [nM] - 0,000 R = 0,9985

-0,8 -0,6 -0,4

-4,5

-0,2 0

-4

0

100

200

300

400

500 c [nM]

-3,5

-3 -200

-250

-300

-350

-400

-450

-500

-550 E [mV]

Obr. 2. Koncentrační závislost leukovorinu na m-AgSAE; metoda: DPV, základní elektrolyt: B-R pufr o pH 4, parametry: Epoč = 100 mV, v = 20 mV∙s-1, Ereg = -1000 mV, treg = 30 s, Eak = 200 mV, tak = 60s; c(LV) = 5×10-8 aţ 4×10-7 M. Závěr V této práci bylo zkoumáno voltametrické chování leukovorinu, významného metabolitu kyseliny listové, na rtuťovým meniskem modifikované stříbrné pevné amalgámové elektrodě ve srovnání s visící kapkovou rtuťovou elektrodou. Pro obě elektrody byly nalezeny optimální podmínky pro stanovení LV, ale m-AgSAE vykazovala mnohem vyšší citlivost a lepší reprodukovatelnost jednotlivých měření neţ HMDE. Proto byla pro stanovení LV v léčivu, pouţívaného především pro prevenci a léčbu intoxikace metotrexátem, pouţita pouze mAgSAE. Průměrný výsledek získaný z 5-ti opakovaných stanovení se lišil o 0,8 % od hodnoty stanovené výrobcem, coţ svědčí o správnosti stanovení a úspěšné aplikaci m-AgSAE ve voltametrické analýze LV. Poděkování Tato práce vznikla za podpory výzkumného záměru MSM 0021627502 a výzkumného centra LC 06035.

23

Literatura 1. Jolivet J.: Eur. J. Cancer 31A, 1311 (1995). 2. Bleyer W. A.: Cancer 41, 36 (1978). 3. http://farmaceutika.info/leucovorin-ca-lachema-20, Downloaded 20th February 2011. 4. Cercós-Fortea T., Casabó V. G., Nácher A., Cejudo-Ferragud E., POlache A., Merino M.: Int. J. Pharm. 155, 109 (1997). 5. Vandenbosch C, Van Belle S., De Smet M., Taton G., Bruynseels V., Vandenhoven G., Massart D. L.: J. Chromatogr. 612, 77 (1993). 6. Espinosa-Mansilla A., Merás I. D., Gómez M. J. R., de la Pena A. M., Salinas F.: Talanta 58, 255 (2002). 7. Flores J. R., Penalvo G. C., Mansilla A. E., Goméz M. J. R.: J. Chromatogr. B 819, 141 (2005). 8. Stejskal D., Heyrovský M.: Výzkumná zpráva č. 1544-2. Všeobecná Fakultní nemocnice, Praha 1993-1994. 9. Jacobsen E., Wiesebjornsen M.: Anal. Chim. Acta 96, 345 (1996). 10. Alvarez J. M. F., Garci A. C., Ordieres A. J. M., Blanco R. T.: J. Electroanal. Chem. 225, 241 (1987). 11. Gurira R. C., Montgomery C., Winston R.: J. Electroanal. Chem. 333, 217(1992). 12. Plavsic M.: Environ. Int. 30, 761 (2004). 13. Guo H. X., Li Y. Q., Fan L. F., Wu X. Q., Guo M. D.: Electrochim. Acta 51, 6230 (2006). 14. Vaze V. D., Srivastava A. K.: Electrochim. Acta 53, 1713 (2007). 15. Xiao F., Ruan C., L. Liu L., Yan R., Zhao F., Zeng B.: Sens Actuors B: Chem. 134, 895 (2008). 16. Bandţuchová L., Šelešovská R., Navrátil T., Chýlková J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). 17. Bandţuchová L., Šelešovská R.: 11 th European Meeting on Environmental Chemistry, Portorož 8 – 11 Dec. 2010, Books of Abstracts (Trebše P., ed.), p. 23 (resp. poster no. 5). 18. Šelešovská R., Bandţuchová L., Navrátil T.: Electroanalysis 23, 177 (2011). 19. Gurrira R.C., Bowers L.D.: J. Electroanal. Chem. 146, 109 (1983). 20. Novotný L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 1118 (2000). 21. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 22. Trilobyte statistical software, TriloByte s.r.o., Pardubice (1995).

24

Photometric Determination of Phosphates after the Electrochemical Reduction of Phosphomolybdate (Fotometrické stanovení fosforečnanů po elektrochemické redukci fosfomolybdenanu) Martin Bartoš, Tereza Valentová, Ivana Prchalová, and Jiří Dobeš University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The photometric determination of phosphates in form of phosphomolybdate blue is described. The phosphomolybdate was electrochemically reduced at porous carbon electrode in the flow cell which construction was changed in order to avoid influence of electrochemical reactions at auxiliary electrode on analysis. Optimal composition of reduced solution was 0.5 mol/l HNO3 (H2SO4, HCl resp.) and 0.04 mol/l Na2MoO4. It was possible to determine phosphates within the concentration range from 2 to 20 mg/l PO43-. The influence of various parameters on analysis and advantage of electrochemical reduction in comparison to chemical reduction is herein discussed. Key words: Phosphate, Molybdenum blue, Photometry, Electroreduction. Úvod Fosforečnany patří k velmi často stanovovaným analytům a pro stanovení jejich koncentrace v nejrůznějších matricích byla vypracována celá řada postupů. Pravděpodobně nejčastěji pouţívaným a přitom jedním z nejstarších je spektrofotometrické stanovení vyuţívající reakci fosforečnanu s molybdenanem, při které vzniká ţlutá forma fosfomolybdenanového aniontu, kterou lze redukovat na formu modrou 1. Tento postup má řadu modifikací, lišících se mimo jiné pouţitým redukčním činidlem (nejčastěji kyselina askorbová a chlorid cínatý). Uvedené stanovení je často vyuţíváno i v různých variantách průtokové analýzy 2. Fosforečnany lze stanovit i separačními metodami, ať uţ iontovou chromatografií, elektroforézou nebo izotachoforézou, jejichţ výhodou je moţnost současného stanovení polyfosforečnanů. Málo pouţívané jsou metody elektrochemické, především potenciometrie, i kdyţ byla navrţena celá řada elektrod se zvýšenou citlivostí k různým disociačním formám fosforečnanového iontu 3-5. Voltametrická stanovení obvykle vyuţívají snadné redukovatelnosti fosfomolybdenanu. Při detekci v průtokových analyzátorech nalezla uplatnění amperometrie 2,6. Zatím jen ojediněle bylo popsáno fotometrické stanovení fosforečnanů vyuţívající elektrochemickou redukci fosfomolybdenanu. Mas-Torres et. all. 7 pouţili jako pracovní elektrodu ocelovou HPLC kapiláru o délce 135 cm a vnitřním průměru 0,8 mm, na kterou, oddělena krátkou elektricky nevodivou hadičkou, navazovala tubulární uhlíková pomocná elektroda o délce 3,3 cm a průměru 1 mm. Referentní elektroda (Ag/AgCl) byla umístěna aţ v nádobce, do které vytékal roztok po průchodu fotometrickým detektorem. Redukce probíhala za zastaveného průtoku po dobu 120 sekund při napětí -0,53 V. Zápornější napětí sice urychlilo redukci, ale také způsobilo tvorbu bublin plynů, které rušily fotometrické stanovení. Předloţená práce pouţívá takovou konstrukci elektrochemické cely a pracovní elektrody, která umoţňuje provádět redukci za průtoku a zabraňuje rušení analýzy plyny vznikajícími na pomocné elektrodě.

25

Experimentální část Schema aparatury pouţité k redukci ţluté formy fosfomolybdenanu na ţlutou formu je na obrázku 1. Dvoukanálovým peristaltickým čerpadlem (Gilson Minipuls 3, průtok 1 ml/sec kaţdou větví) byl čerpán roztok vzorku resp. fosforečnanu (jedna větev) a okyseleného molybdenanu (druhá větev) do směšovacího bloku, ze kterého byl reakční kapilárou, ve které vznikala z molybdenanu a fosforečnanu fosfomolybdenová ţluť, veden přes mikrofiltr (1 μm, Whatman GFM 150) do průtokové elektrochemické cely (ECA Cell 353-b, Istran Bratislava) s porézní uhlíkovou elektrodou (E53C, Istran Bratislava), platinovou pomocnou a argentchloridovou referentní elektrodou. Zde byla ţlutá forma fosfomolybdenanu redukována na modrou formu. Část roztoku po redukci byla pomocí nástavce z elektrochemické cely ECA Jett (Istran Bratislava) z těsné blízkosti porézní elektrody odčerpávána peristaltickým čerpadlem (Ismatec MS-CA 2/860 C, Zürich, průtok 1 ml/sec) do křemenné spektrofotometrické kyvety o tloušťce 1 cm, zbytek procházel kolem pomocné platinové elektrody do odpadu. Tímto způsobem bylo odstraněno rušení analýzy plyny (kyslíkem, resp. chlorem) vznikajícími na pomocné elektrodě. Elektrody byly připojeny k Polarografickému analyzátoru PA3 (Laboratorní přístroje Praha). Ke spektrofotometrickým měřením byl pouţit přístroj Specol 11 (Carl Zeiss Jena), absorbance byla měřena při vlnové délce 750 nm. K čištění aparatury od zbytků fosfomolybdenanu byl pouţit roztok NaOH o koncentraci 1 mol/l.

Obr. 1. Schéma pouţité aparatury (podrobnější popis je v textu). P1,P2: peristaltická čerpadla; RK: reakční kapilára; EC: elektrochemická cela; W, R, A: pracovní, referentní a pomocná elektroda. Všechny pouţité chemikálie byly čistoty p.a. a pocházely od firmy Lachema Brno. Veškeré roztoky byly připravovány z destilované demineralizované vody. Výsledky a diskuse Molybdenan tvoří v kyselém prostředí dlouhou řadu iso- a heteropolyaniontů, které mohou obsahovat aţ desítky atomů molybdenu v jednom iontu. Základem ţluté formy fosfomolybdenanu je aniont (PMo12O40)3-, který pomalu přechází na iont (P2Mo18O62)6-. Oba tyto ionty je moţné redukovat na modrou formu, redukce obvykle probíhá postupně ve dvouelektronových krocích. Obdobně se chovají i další heteropolymolybdenany, především arsenu, křemíku a germania, čehoţ se vyuţívá při jejich kvantitativním stanovení 8. Elektrochemicky lze redukovat nejen fosfomolybdenan, ale i samotný molybdenan. Rychlost resp. účinnost redukce, měřená jako velikost absorbance roztoku po redukci, vzrůstá s klesajícím napětím vkládaným na pracovní elektrodu. Závislost je v rozmezí potenciálů +500 aţ -300 mV téměř lineární a je přibliţně dvojnásobně strmější pro fosfomolybdenan, neţ pro molybdenan (obr. 2).

26

Obr. 2. Závislost absorbance na potenciálu pracovní elektrody. Roztok obsahoval 0,5 M H2SO4 a 0,025 M MoO42- s přídavkem 0 mg/l PO43- (A) a 6 mg/l PO43- (B).

Obr. 3. Závislost absorbance na koncentraci kyseliny sírové. Roztok obsahoval kromě H2SO4 ještě 0,025 M MoO42- s přídavkem 0 mg/l PO43- (A) a 6 mg/l PO43- (B). Uveden je i rozdíl absorbancí obou roztoků (C).

Obr. 4. Závislost absorbance na koncentraci molybdenanu. Roztok obsahoval kromě molybdenanu ještě 0,5 M H2SO4 s přídavkem 0 mg/l PO43- (A) a 6 mg/l PO43- (B). Uveden je i rozdíl absorbancí obou roztoků (C). S rostoucí koncentrací kyseliny sice klesá účinnost redukce, ale roste rozdíl absorbancí fosfomolybdenanu a molybdenanu. Tento rozdíl nabývá maxima při koncentraci přibliţně 0,5 27

mol/l kyseliny sírové, dusičné nebo chlorovodíkové, s dalším zvyšováním koncentrace kyseliny pomalu klesá (obr. 3). Roztok neokyseleného molybdenanu podléhá na světle samovolné redukci, a proto je nutné zásobní roztok činidla ihned okyselit. S rostoucí koncentrací molybdenanu roste absorbance roztoků molybdenanu i fosfomolybdenanu, rozdíl absorbancí nabývá maxima při koncentraci přibliţně 0,04 mol/l Mo a dále zůstává téměř konstantní (obr. 4). Doporučené sloţení roztoku činidla je 0,5 M kyselina sírová a minimálně 0,04 M Na2MoO4. Nejvhodnější potenciál redukce je v rozmezí -100 aţ +100 mV (vs. Ag/AgCl/sat. KCl). Za těchto podmínek lze stanovit fosforečnany v koncentračním rozmezí přibliţně 1 aţ 20 mg/l PO43-. Reprodukovatelnost stanovení je velmi proměnná a závisí na okamţitém stavu porézní elektrody. K okyselení roztoku činidla lze pouţít i kyselinu dusičnou a chlorovodíkovou. Na pomocné elektrodě vznikající kyslík (resp. elementární chlor v případě pouţití HCl, který reoxiduje fosfomolybdenovou modř) neruší, protoţe roztok procházející kolem pomocné elektrody odchází přímo do odpadu. Negativnější potenciál sice zvyšuje účinnost redukce, ale současně zvětšuje i pravděpodobnost ucpání porézní elektrody sraţeninou fosfomolybdenanu. Pokud k tomu dojde, lze elektrodu vyčistit roztokem NaOH. Pozornost je nutné věnovat i době reakce molybdenanu s fosforečnanem, tzn. délce reakční kapiláry. Účinnost elektrochemické redukce dosahuje za doporučených podmínek maximálně 50 % účinnosti chemické redukce. Závěr V práci je popsáno fotometrické stanovení fosforečnanů ve formě fosfomolybdenanu, který je ze ţluté na modrou formu redukován v průtokové elektrochemické cele s porézní uhlíkovou elektrodou. Vhodnou úpravou cely je zabráněno ovlivnění průběhu analýzy elektrochemickými reakcemi probíhajícími na pomocné elektrodě. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů Ministerstva školství, mládeţe a tělovýchovy ČR č. MSM0021627502 a LC06035. Literatura 1. Malát M.: Absorbční anorganická fotometrie. Academia. Praha 1973, p. 466-478. 2. Estela J. M., Cerdà V.: Talanta 66, 307 (2005). 3. De Marco R., Phan C.: Talanta 60, 1215 (2003). 4. Elmasbaut A., Benayada A., Bessiere J., Pillet I.: Analusis 24, 182 (1996). 5. Jurinskaja V. E., Bart T., Materova E. A., Golikova O. E.: Vestn. Leningr. Univ., ser. 4: Fiz. Khim. 2, 40 (1988). 6. Udnan Y., McKelvie I. D., Grace M. R., Jakmunee J., Grudpan K.: Talanta 66, 461 (2005). 7. Mas-Torres F., Estela J. M., Miró M., Cladera A., Cerdà V.: Anal. Chim. Acta 510, 61 (2004). 8. Greenwood N. N., Earnshaw A.: Chemie prvků. Informatorium. Praha 1993, p. 12471256.

28

Determination of Phytohormones in Genetically Modified Nicotiana Plants by Differential Pulse Voltammetry (Stanovení fytohormonů v geneticky modifikovaných rostlinách Nicotiana pomocí diferenční pulsní voltametrie) a Jana Bulíčková , Romana Sokolová a, and Stefania Giannarelli b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b University of Pisa, Department of Chemistry and Industrial Chemistry, 35-56126 Pisa, Italy Abstract The differential pulse voltammetry was used for the determination of the phytohormone indole-3-acetic acid (IAA) in plant samples using a glassy-carbon electrode. The limit of detection of the proposed method is 0,45 µg ml-1. The electroanalytical determination of IAA is selective and the concentration of IAA in sample of genetically modified plant Nicotiana langsdorfii was determined in the presence of other phytohormones as abscisic acid and some cytokinins. Key words: Phytohormones, Voltammetry, DPV, Glassy-carbon electrode, HMDE Úvod Vývoj rostlin je zavislý na přítomnosti čtyř různých skupin fytohormonů: auxinů, giberelinů, cytokininů a inhibitorů. Ty i v malých koncentracích regulují a kontrolují fyziologické procesy rostlin. IAA je fytohormon patřící do skupiny auxinů. Auxiny a cytokininy součinně působí na kontrolu dělení a diferenciaci buňky, na intenzitu buněčné proliferace, na prodluţování stonku, na tvorbu výhonků a vrcholovou dominanci 1. Auxiny spolupůsobí s kyselinou giberelovou a podporují prodluţování stonku a vytváření plodů bez oplození 2. Také jejich interakce s kyselinou abscisovou (enantiomer S-ABA) a ethylenem ovlivňuje shazování listů, květů a ovoce, dále pak regulaci otvírání průduchů, pohlavní znaky, dozrávání a stárnutí rostliny 3, 4. Vzájemná interakce rostlinných hormonů a jejich poměr koncentrací v rostlině hraje důleţitou roli při reakci rostlin na stresy prostředí a je významná pro odolnost proti nemocem 5, 6. Poměr koncentrací IAA a cytokininu zeatin ribozidu je významný při určení, zda je rostlina geneticky modifikovaná či nikoli 7.

Obr. 1. Kyselina indol 3-octová (IAA). Ke stanovení fytohormonů lze vyuţít biotesty zaloţené na zjištění růstové nebo metabolické odezvy na daný hormon. Jsou pouţívány imunochemické techniky (ELISA8, kapilární enzymové imunoanalýzy s elektrochemickou detekcí 9), elektroforéza s ampérometrickou detekcí 10 nebo chromatografické separační metody 11. Dále se vyuţívá hmotnostní spektrometrie (MS) doplněná separační technikou jako je kapalinová chromatografieelektrosprej 12, 13, HPLC 7 nebo plynová chromatografie (GCMS) 14, 15. Byly publikovány i některé elektroanalytické metody pro kvantitativní stanovení IAA v rostlinných extraktech pomocí uhlíkové mikroelektrody (7µm) 16, uhlíkové pastové elektrody modifikované

29

silikonem OV-17 17, kompozitní elektrody grafit-polyurethan 18 či pomocí elektrody ze skelného uhlíku pokryté filmem uhlíkových nanotub 19. Přínosem této práce je selektivní stanovení IAA v reálném vzorku geneticky modifikovaných rostlin za přítomnosti kyseliny abscisové (ABA) a některých cytokininů (isopentenyladenin IP, isopentenyladenosin - IPR, zeatin - Z, zeatin ribosid - ZR). Experimentální část Chemikálie: kyselina indol-3-octová: INDOLE-3-ACETIC ACID (IAA) [3-indolylacetic acid]; kyselina abscisová: (±)-cis,trans-ABSCISIC ACID (ABA) [5-(1-hydroxy-2,6,6-trimethyl4-oxocyclohex-2-en-1-yl)-3-methyl-(2Z,4E)-pentadienoic acid]; [2H6] N6-ISOPENTENYLADENIN (D-iP) [6-[2H6](3,3-dimethylallylamino)purine] [2H6] N6-ISOPENTENYLADENOSIN (D-iPR) [6-[2H6] (3,3-dimethylallylamino)-9-b-Dribofuranosylpurin] [2H5] trans-ZEATIN RIBOSID (D-ZR) [6-[2H5] ((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2enylamino)-9-b-D-ribofuranosylpurine] [2H5] trans-ZEATIN (D-Z) [6-[2H5] ((E)-4-hydroxy-3-methylbut-2-enylamino)purin], o čistotě ≥ 98% (HPLC), byly získány od firmy OlChemIm (Olomouc). Pro elektrochemická měření byly pouţívány univerzální Brittonovy-Robinsonovy tlumivé roztoky o pH 2,9 – 10,4 za přítomnosti 20% ethanolu p.a. (Lach-Ner, Neratovice) (v/v). Příprava extraktu z rostlin: Listy geneticky modifikované rostliny Nicotiana Langsdorffii byly nařezány, zmrazeny a lyofilizovány. 100 mg lyofilizovaného vzorku odpovídající 1 g rostliny bylo homogenizováno a pouţito k extrakci roztokem methanol/voda/kyselina mravenčí (75/20/5 v/v/v). Kolona SepPak C18 byla pouţita k odstranění lipidů a části pigmentů rostlin. Eluent byl odpařen a rozpuštěn v 5 ml 1M kyseliny mravenčí. Tento roztok obsahuje cytokininy, ABA a IAA přítomné v reálném vzorku. Cytokininy lze oddělit kolonkou Oasis MCX 20. Po odpaření byl extrakt rozpuštěn v 5 ml methanolu a 1 ml roztoku pouţit pro elektrochemické stanovení. Tento roztok byl doplněn na celkový objem 2 ml roztokem pufr/ethanol (80/20 v/v) o pH 5,3. Stanovení obsahu IAA bylo prováděno metodou standardního přídavku. Použité metody: K elektrochemickému měření byla vyuţita metoda diferenční pulzní voltametrie (DPV). Přístrojové vybavení se skládalo z potenciostatu Autolab PGSTAT30 (Ecochemie, Nizozemí). Tříelektrodová elektrochemická cela byla tvořena referentní argentchloridovou elektrodou Ag|AgCl|0.1 M LiCl oddělenou od roztoku solným můstkem, pomocnou elektrodou byla cylindrická platinová síťka a pracovní elektrodu tvořila buď elektroda ze skelného uhlíku (GC) o ploše 0,0027 cm2 nebo ventilem ovládaná stacionární/visící rtuťová kapková elektroda (SMDE/HMDE, Laboratorní přístroje, Praha). Velikost kapky byla dána otevřením ventilu na dobu 40 ms a počítač kontroloval dobu kapky. Plocha rtuťové kapkové elektrody byla 0,00767 cm2. Roztok byl zbaven kyslíku probubláváním proudem argonu. Výsledky a diskuse Elektrochemické chování kyseliny indol 3-octové (IAA) bylo studováno v Britonových – Robinsonových pufrech v rozmezí pH 2,9 – 10,4 na elektrodě ze skelného uhlíku. Potenciál první oxidační ireverzibilní vlny IAA se posouvá s klesající hodnotou pH k vyšším hodnotám. Při pH = 5 se za první oxidační vlnou při 0,75 V objevuje druhá oxidační vlna při 0,9 V.

30

Dalším sniţováním hodnoty pH dochází ke zvyšování výšky druhé oxidační vlny. Optimální hodnota pH byla zvolena pH = 5,3, kdy je první oxidační vlna dostatečně vysoká a dostatečně oddělená od druhé oxidační vlny. Byla optimalizována metoda diferenční pulzní voltametrie na elektrodě ze skelného uhlíku. Optimalizované parametry byly: rychlost polarizace 25 mV/s, amplituda pulzu 100 mV a šířka pulzu 50 ms. Kalibrační křivka je lineární v rozmezí od 0,16 – 116,1 µg ml-1, limit detekce (koncentrace odpovídající 3s) je 0,45 µg ml-1 a limit stanovitelnosti 3,14 µg ml-1.

-1.8 -1.6 -1.4

-i/ A

-1.2 -1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0

0.4

0.6

0.8

1.0

1.2

E/V Obr. 2. Voltamogram přídavků IAA v Britonově-Robinsonově pufru s 20% ethanolu o výsledném pH = 5,3. Na GC elektrodě, s dobou polarizace 25 mV/s a amplitudou 100 mV. Vliv přítomnosti dalších fytohormonů a chemikálií pouţívaných při extrakci rostlinného materiálu na výšku oxidační vlny IAA byl sledován za výše uvedených podmínek. Bylo zjištěno, ţe fytohormony ABA, IP, IPR, Z, ZR nejsou elektrochemicky aktivní v rozmezí potenciálů, kde dochází k oxidaci IAA. Bylo sledováno moţné blokování povrchu elektrody vlivem adsorpce přítomných cytokininů a ABA. Obsah IAA v extraktu geneticky modifikované rostliny Nicotiana Langsdorffii byl stanoven pomocí navrţené analytické metody. Nalezené mnoţství IAA 52,5 µg ve 100 mg lyofilizátu odpovídá váze 1 g rostliny. Závěr Byla navrţena metoda stanovení kyseliny indol-3-octové ve vzorcích geneticky modifikovaných rostlin pomocí diferenčně pulzní voltametrie na elektrodě ze skelného uhlíku. Tuto metodu je moţné aplikovat bez předchozí separace cytokininů přítomných v reálných vzorcích. Poděkování Tato práce vznikla za podpory Grantovou agenturou Akademie věd České republiky (203/09/1607, 203/08/1157) a Ministerstva školství (LC510).

31

Literatura 1. Davies P. J. (Ed.): Plant hormones: Biosynthesis, signal transduction, action. Kluwer Academic. Dordrecht - The Netherlands 2004, pp.1-15. 2. Vivian-Smith A., Koltunow A. M.: Plant Physiol. 121, 437 (1999). 3. Eckert M., Kaldenhoff R.: J. Exp. Bot. 51, 1435 (2000). 4. Swarup R., Parry G., Graham N., Allen T., Bennett M.: Plant Mol. Biol. 49, 411 (2002). 5. Xiong L., Schumaker K. S., Zhu J. K.: Plant Cell. 14, 165 (2002). 6. Singh K., Foley R. C., Oñate-Sánchez L.: Curr. Opin. Plant Biol. 5, 430 (2002). 7. Giannarelli S., Muscatello B., Bogani P., Spiriti M. M., Buiatti M., Fuoco R.: Anal. Biochem. 398, 60 (2010). 8. Pence V. C., Caruso J. L.: Phytochem. 26, 1251 (1987). 9. Gao H., Jiang T., Heineman W. R., Halsall H. B., Caruso J. L.: Fresenius J. Anal. Chem. 364, 170 (1999). 10. Olsson J., Claeson K., Karlberg B., Nordstrom A. C.: J. Chromatogr. A 755, 289 (1996). 11. Budini R., Girotti S., Pierpaoli A. M., Tonelli D.: Microchem. J. 27, 365 (1982). 12. Houa S., Zhu J., Ding M., Lv G.: Talanta 76, 798 (2008). 13. Pan X., Welti R., Wang X.: Phytochemistry 69, 1773 (2008). 14. Tarkowski P., Ge L., Yong J. W. H., Tan S. N.: Trends Anal. Chem. 28, 323 (2009). 15. Edlund A., Eklöf S., Sundberg B., Moritz T., Sandberg G.: Plant Physiol. 108, 1043 (1995). 16. Hernandez L., Hernandez P., Paton F.: Anal. Chim. Acta 327, 117 (1996). 17. Hernandez P., Galan F., Nieto O., Hernandez L.: Electroanalysis 6, 577 (1994). 18. .de Toledo R.A., Vaz C. M. P.: Microchemical Journal 86, 161 (2007). 19. Wu K., Sun Y., Hu S.: Sensors and Actuators B 96, 658 (2003). 20. Dobrev P.I., Kamínek M.: J. Chromatogr. A 950, 21 (2002).

32

Determination of 2,4-Dinitrophenol Metabolites in Urine Using HPLC with Amperometric Detection Hana Dejmková, Jiří Barek, and Jiří Zima Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Methods for determination of 2,4-dinitrophenol metabolites, namely 2-amino-4-nitrophenol and 4-amino-2-nitrophenol, were developed using HPLC with amperometric and spectrophotometric detection. Optimum conditions for the separation and determination were found, involving the mobile phase composition and detection potential. The applicability of these methods for the determination of the analytes in model samples of urine was tested; solid-phase extraction was used for the preliminary separation from the matrix. This procedure allowed the determination of the analytes down to micromolar concentrations. Amperometric detection proved to be more sensitive and selective than the spectrophotometric one. Key words: carbon paste electrode; HPLC with amperometric detection; 2,4-dinitrophenol metabolites; aminonitrophenols. Introduction 2,4-Dinitrophenol (2,4-DNP) is used in chemical industry in the synthesis of dyes, explosives, pesticides and other products 1. It is considered as one of the important pollutants, listed also among the priority pollutants by US Environmental Protection Agency 2. Besides the environmental and industrial sphere, however, it is also a subject of interest in toxicology. In exposed organism, it uncouples oxidative phosphorylation by increasing the basal proton conductance through mitochondria membrane, which results in the increased metabolic rate, oxygen consumption and body temperature, finally leading to the loss of body fat 3. This effect caused the utilization of 2,4-DNP in medicine as weight-reduction drug during 1930s 4. Adverse effects, particularly skin lesions and eye cataract 5, forced abandoning the official application. Another danger connected with the consumption of 2,4-DNP is tendency of the consumers to overdosing in attempt to amplify the weight-reducing effect. The increase of the desired high metabolic rate is accompanied by the increase of body temperature, which might lead to life-threatening hyperthermia. In spite of the risks, 2,4-DNP is still unofficially sold as a diet pill and dietary supplement for body builders. Among the consumers, causes of poisoning appear, some of them fatal 6-8. 2,4-DNP is partially excreted in the original form and partially metabolized. Its main metabolites are 2-amino-4-nitrophenol (2A4NP) and 4-amino-2-nitrophenol (4A2NP), less significant is the presence of glucuronide and sulphate conjugates and of 2,4-diaminophenol 9. The determination of these compounds as markers of dinitrophenol intoxication was previously described using techniques of gas chromatography-mass spectrometry 10 and liquid chromatography-mass spectrometry 9. Due to the presence of electrochemically active groups, electrochemical techniques offer an interesting possibility for the determination of aminonitrophenols. For this work, anodic oxidation was employed using carbon paste electrode (CPE) based on microbeads of glassy carbon. This electrode material possesses the general advantages of carbon paste electrodes, such as easily renewable surface, wide potential window, and low background current 11, and also exhibits stability in media containing organic solvents 12.

33

The aim of this work is the development of analytical method for the determination of 2A4NP and 4A2NP, main 2,4-DNP metabolites, using HPLC with amperometric detection on the carbon paste electrode, and the evaluation of the applicability of this method for their determination in urine samples. Experimental Chemicals 2-Amino-4-nitrophenol (2A4NP, CAS Number 99-57-0) and 4-amino-2-nitrophenol (4A2NP, CAS Number 119-34-6) were supplied by Aldrich. The stock solutions (c = 1 mmol L–1) were prepared by dissolving the exact amount of the respective substance in methanol and kept at a laboratory temperature. It was proved by UV spectrophotometry that the solutions were stable for at least six months. Britton-Robinson (B-R) buffers diluted 10 times with water were used as aqueous part of mobile phase for chromatographic measurements. For pH 2, diluted B-R buffer was replaced by 0.01 M phosphate buffer (0.01 mol L–1 sodium dihydrogen phosphate adjusted to the desired pH value by concentrated phosphoric acid). All chemicals used for buffer preparation were of analytical grade purity and obtained from Lachema Brno, Czech Republic. Other used chemicals were hydrochloric acid (p.a., Lachema Brno, Czech Republic), acetonitrile (for HPLC, Merck), methanol (for HPLC, Chromservis, Czech Republic) and deionized water (Millipore, USA). Apparatus HPLC measurements were performed using high pressure pump Beta 10, injector valve with 20 L loop, UV/VIS detector Sapphire 800 (all Ecom, Czech Republic) and amperometric detector ADLC 2 (Laboratorní přístroje, Czech Republic) connected in series. LiChroCART 125-4 Purospher STAR RP-18E (5 m) column (Merck) was used for the separation. The HPLC system was controlled via Clarity 2.3 software (DataApex, Czech Republic). The working carbon paste electrode was adjusted against the outlet capillary in “wall-jet” arrangement 12 and immersed in the overflow vessel together with a platinum wire auxiliary electrode and an Ag/AgCl (3 M KCl) reference electrode RAE 113 (Monokrystaly Turnov, Czech Republic), to which all the potential values are referred. Procedures The glassy carbon paste electrode (CPE) was prepared from 100 L of mineral oil (Fluka) and 250 mg of spherical microparticles of glassy carbon with a diameter from 0.4 to 12 m (Alfa Aesar, Germany). Carbon paste was packed in the Teflon electrode body with 3 mm inner diameter (geometric area 7.1 mm2). Renewing of the surface of the electrode by wiping with wet filtration paper was performed once a day unless stated otherwise. Detection wavelength 300 nm was selected from UV spectra of the analytes, preferring higher wavelengths in order to ensure higher selectivity of the determination. Measurements were performed with flow rate of 1 mL min–1. All measurements were made in triplicate. Concentration 100 mol L–1 was used during optimization measurements, unless stated otherwise. Calibration dependences were evaluated by least squares linear regression method. The quantification limits were calculated as the concentration of the analyte which gave a signal ten times the standard deviation of the lowest evaluable concentration. Urine samples treatment Prior the extraction, sample pH was adjusted to pH 4.0 with concentrated hydrochloric acid. Solid phase extraction was performed using poly(styren-divinylbenzene) based solid-phase

34

extraction columns LiChrolut® EN 200 mg/3 mL (Merck). The solid phase was conditioned with 3 mL of acetonitrile, 6 mL of methanol and 2 mL of deionized water, which were allowed to pass through the cartridge without the use of vacuum. After that, 100 mL of spiked urine sample was loaded on the column at the flow rate of approximately 1 mL min–1, then the cartridges were washed with 2 mL of deionized water and dried under the vacuum for 1 min. Elution of adsorbed analytes was carried out without the use of vacuum using 4 mL volume of the particular solvent. In case of elution by diethyl ether, eluted fraction was dried and dissolved in 1 mL of methanol. Prior injection to chromatographic system, samples were diluted to contain 33 % of water to prevent deformations of chromatographic peaks. Results and discussion HPLC determination As a first step, optimization of mobile phase composition was performed, concerning the mobile phase composition. Both compounds have relatively low retention in reversed-phase chromatography, which might cause their interference with some substances present in the envisaged real samples. Therefore, the optimization focused on the search for the conditions ensuring higher retention and still sufficient resolution of both analytes. Influence of the pH of the aqueous part of the mobile phase in the pH range from 2 to 7 and of the methanol content in the concentration range from 30 to 50 % (v/v) was studied. Protonization and dissociation of the analyte molecules caused lower retention on the both ends of the studied pH range. The requirement for a suitable resolution resulted in the selection of pH 3 and methanol content 30 % (v/v). As a second step, hydrodynamic voltammograms were measured (see Fig. 2), suggesting detection potential +0.8 V as optimum value. The repeatability of the determination was tested by fifteen consecutive injections of the mixture of both analytes in two-minute intervals. RSD of the measurements was found to be 1.1 % and 2.2 % for 2A4NP and 4A2NP, respectively, using spectrophotometric detection, and 1.3 % and 0.7 % for 2A4NP and 4A2NP, respectively, using electrochemical detection, which confirms stability and repeatability of the measurements. Under the optimum conditions, the concentration dependences were measured (see Table I). The dependences are linear within the investigated concentration range, with correlation coefficients close to one and statistically insignificant intercept. Lower limits of quantification were reached using amperometric detection, with values 0.18 mol L–1 and 0.14 mol L–1 for 2A4NP and 4A2NP, respectively. Using spectrophotometric detection, quantification limits of 0.47 mol L–1 and 0.30 mol L–1 2A4NP and 4A2NP, respectively, were found. Chromatograms of the lowest concentration range obtained by amperometric detection are shown in Fig. 1. Sample treatment optimization For the preliminary separation of the analytes from urine matrix, solid-phase extraction (SPE) was employed, using poly(styren-divinylbenzene) based solid-phase extraction columns LiChrolut® EN 200 mg/3 mL (Merck). Methanol, methanol acidified by the addition of 1 % glacial acetic acid, acetonitrile and diethyl ether were tested as eluting solvents; the extraction procedure was performed as described above. Recovery of the analytes was examined for 1 mol L–1 analyte concentration in deionized water; resulting values are summarized in Table II. Due to the high retention of the analytes, particularly 2A4NP, in the solid phase, none of the solvents was able to elute both analytes in recovery over 50 %. Sufficient recovery was achieved by the combination of two eluting solvents, 2 mL of acetonitrile and 2 mL of methanol containing 1 % of glacial acetic acid. Both fractions were mixed and further

35

handled as a single sample. Under such conditions, recovery of the analytes was 83 % and 70 % for 2A4NP and 4A2NP, respectively. Table I. Parameters of concentration dependences of 2A4NP and 4A2NP, obtained using amperometric and spectrophotometric detection in deionized water and spiked urine samples. Slope Intercept b LDRa (AU L mmol–1) (mAU) or Correlation LoQ Analyte ( mol L–1) or (mA L mol–1) (nA) coefficient ( mol L–1) Spectrophotometric detection, DET = 300 nm 2A4NP c 0.2 - 100 0.23 -0.15 0.9996 0.47 c 4A2NP 0.2 - 100 0.18 -0.13 0.9992 0.30 2A4NP d 1 - 20 0.33 -2.82 0.9625 1.66 d 4A2NP 5 - 20 1.5 -6.57 0.9673 6.31 Amperometric detection, EDET = 0.8 V 2A4NP c 0.1 - 100 4.59 -1.64 0.9996 0.18 4A2NP c 0.1 - 100 6.09 -1.93 0.9999 0.14 d 2A4NP 0.5 - 20 41.9 -18.52 0.9942 0.69 4A2NP d 5 - 20 45.1 -120.47 0.9890 3.68 a b c d Linear dynamic range, Limit of quantification, direct determination, in model urine samples after SPE

6 I (nA)

4A2NP

2A4NP

4

2

0

-2

0

1

2

3

4

5 t (min)

Fig. 1. HPLC chromatograms of 2A4NP and 4A2NP (concentrations 0.1; 0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0 mol L–1), amperometric detection on CPE. Column LiChroCART 125-4 Purospher STAR RP-18E (5 m), mobile phase B-R buffer pH 3 : MeOH (70:30, v/v), EDET = 0.8 V. Determination in real samples Preliminary separation does not provide baseline separation of analytes peaks from other compounds present in the sample, but it enables the determination of the analytes. Concentration dependences were measured in the range from 0.5 mol L–1 to 20 mol L–1, i.e.,in the concentration range expected in the real samples; parameters of the dependences are summarized in Table 1. Although the concentration dependences of 4A2NP are linear, their intercepts are markedly negative, probably due to the decrease of analyte recovery with decreasing concentration. Applicable concentration range is therefore limited to the values above approximately 5 mol L–1. Concentration dependences of 2A4NP are both linear and

36

with statistically insignificant intercept; higher selectivity and sensitivity of the amperometric detection provided the quantification limit of 0.7 mol L–1, while spectrophotometric detection reached the quantification limit of 1.7 mol L–1. Table II. Recovery of 2A4NP and 4A2NP after SPE using various solvents for the elution. Analyte Methanol Acetonitrile Diethyl ether Methanol (1% Acetonitrile + acetic acid) methanol (1% acetic acid) 2A4NP 55 % 27 % 12 % 93 % 83 % 4A2NP 34 % 65 % 30 % 33 % 70 % Conclusion Method for the determination of 2A4NP and 4A2NP, metabolites of 2,4-dinitrophenol, using HPLC with amperometric detection on CPE was developed. HPLC employed LiChroCART 125-4 Purospher STAR RP-18E (5 m) column as the stationary phase and B-R buffer pH 3 containing 30 % (v/v) of methanol as the mobile phase. Amperometric detection on CPE worked with a potential of +0.8 V. Applicability of these methods was tested by the determination of studied compounds in model urine samples after preliminary separation by solid-phase extraction. This method was able to determine the studied compounds in model samples in the concentrations, which can be expected in real samples, and the results were comparable to those obtained earlier by LC-MS method 9. Electrochemical detection was found to be better than the spectrophotometric one in both selectivity and sensitivity. The best results were obtained in the determination of 2A4NP reaching the quantification limit of 0.7 mol L–1. Acknowledgement Financial support of the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects MSM 0021620857, RP14/63 and LC06035), KONTAKT (AMVIS) project ME10004 and of the grant SVV-2011-263204 is gratefully acknowledged. References 1. http://www.atsdr.cdc.gov/ToxProfiles/tp64.pdf, Downloaded 9.1.2011. 2. http://water.epa.gov/scitech/swguidance/methods/pollutants.cfm, Downloaded 9.1.2011. 3. Harper, J. A., K. Dickinson and M. D. Brand: Obes. Rev. 2, 255 (2001). 4. Tainter, M. L., W. C. Cutting and A. B. Stockton: Am. J. Publ. Health 24, 1045 (1934). 5. Horner, W. D.: Trans. Am. Ophthalmol. Soc. 39, (1941). 6. Miranda, E. J., I. M. McIntyre, D. R. Parker, R. D. Gary and B. K. Logan: J. Anal. Toxicol. 30, 219 (2006). 7. Bartlett, J., M. Brunner and K. Gough: Emerg. Med. J. 27, 159 (2010). 8. McFee, R. B., T. R. Caraccio, M. A. McGuigan, S. A. Reynolds and P. Bellanger: Vet. Hum. Toxicol. 46, 251 (2004). 9. Politi, L., C. Vignali and A. Polettini: J. Anal. Toxicol. 31, 55 (2007). 10. Robert, T. A. and A. N. Hagardorn: J. Chromatogr. 344, 177 (1985). 11. Zima, J., I. Svancara, J. Barek and K. Vytras: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 204 (2009). 12. Zima, J., H. Dejmkova and J. Barek: Electroanalysis 19, 185 (2007).

37

The Oxidation of Voltammetric Determination of Trace Amount of 2-Methoxy-5Nitrophenol on Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode Jan Fischer, Michaela Charvátová, and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, 128 43 Praha 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Voltammetric determination of growth stimulator 2-methoxy-5-nitrophenol was studied using DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at a meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). Optimal conditions were found for its determination by DCV and DPV on m-AgSAE in Britton-Robinson (BR) buffer pH 2 and 6 within the concentration range 1∙10-4 – 1∙10-6 mol.l-1. Method was successfully used for determination of the substance in model samples of drinking and river water. Key words: 2-Methoxy-5-nitrophenol, DC voltammetry, Differential pulse voltammetry, Meniscus modified silver solid amalgam electrode. Introduction Development of sensitive and selective methods for determination of agrochemicals play important role in modern analytical chemistry. For monitoring of agrochemicals, like 5methoxy-2-nitrophenol, it is possible to use inexpensive new electrode materials 1. Nitro group in the structure of 5-methoxy-2-nitrophenol can be easy electrochemical reduced on mercury electrodes 2. The silver solid amalgam presents nontoxic electrode material with potential window comparable with hanging mercury drop electrode (HMDE), good mechanical stability and simple handling, good reproducibility ensured by software-operated electrochemical pretreatment and sufficient sensitivity for the determination of electrochemically reducible compounds. This type of material was used for determination of this substance in flow system 3 but so far was not used for batch analysis. Experimental All reagents were of analytical grade. A stock solutions of 1∙10-3 mol.l-1 2-methoxy-5nitrophenol was prepared by dissolving 0.0085 g of the substance (C. A. S. Registry Number: [636-93-1]; 98%, Sigma-Aldrich, Germany) in 50 ml of deionized water. Britton–Robinson buffer was used as a supporting electrolyte. Deionized water was produced by a Milli-Q plus system. Other chemicals were obtained from Lachema Brno (Czech Republic) in p.a. purity. All the chemicals were used without any further purification. Voltammetric experiments were performed using computer controlled Eco-Tribo Polarograph. The working electrode was meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). The polished silver solid amalgam electrode was immersed into a small volume of liquid mercury and agitated for 15 seconds to form m-AgSAE. This process, denoted as amalgamation, was repeated every week. Before starting the experiment for each new surface of m-AgSAE the electrochemical activation was carried out in 0.2 mol.l-1 KCl at –2200 mV under stirring of the solution for 300 s followed by rinsing with distilled water. Work with mAgSAE was carried out at a scan rate of 20 mV.s-1, pulse amplitude of –50 mV, pulse duration of 100 ms, sampling time of 20 ms beginning 80 ms after the onset of the pulse and interval between pulses of 100 ms. In the case of electrode passivation, a short electrochemical regeneration of m-AgSAE lasting about 30 s preceded each measurement. The regeneration was carried out by periodical switching every 0.1 s between potentials

38

100 mV more negative than the potential of amalgam dissolution and 100 mV more positive than the potential of hydrogen evolution and in the given base electrolyte. Results and discussion In the first part of research, pH of Britton - Robinson buffer for voltammetric determination of 2-methoxy-5-nitrophenol was optimized. Effect of pH on DC and DP voltammetric signal was explored in the range of pH 2 to 12 (for DPV see in Fig. 1). For further measurements pH 2 and pH 6 was used where the substance gave well developed wave/peak for the both voltammetric techniques. Afterwards, repeatability of measurements at m-AgSAE was checked. For DCV at pH 6 and for DPV at pH 2 the repeatability was on acceptable level, but for DCV at pH 2 was necessary to use regeneration of electrode surface using potentials 230mV (Ereg1) and –730 mV (Ereg2) and for DPV at pH 6 using potentials 0 mV (Ereg1) and – 1230 mV (Ereg2), see in Fig. 2. Found optimal conditions were used for measuring calibration dependences in the concentration range from 1∙10-4 to 2∙10-6 mol.l-1 with both techniques and for both pH 2 and pH 6. According to obtained results, DPV seems to be slightly more sensitive and gives more linear calibration curves then DCV. Newly developed methods were applied for the determinations of 2-metoxy-5-nitrophenol in the concentration range from 1∙10-5 to 2∙10-6 mol.l-1 in model samples of drinking and river water. The results show similar sensitivity in this matrix as for previous measurements in deionized water thus confirming the applicability of the newly developed methods. Figures of merit of the developed methods are summarized in Table I.

-200

6

2

Ip, nA

3 4

7

8 9 10

5

11

-100 12

0

-200

-400

-600

-800 E, mV

Fig. 1. DP voltammograms of 2-methoxy-5-nitrophenol (1∙10-4 mol.l-1) measured by DPV on m-AgSAE in Britton – Robinson buffer (pH correspond to number above given curve).

39

6 5 -15 4

Ip, nA

3 -10

2 1

-400

-600

-800 E, mV

Fig. 2. DP voltammograms of 2-methoxy-5-nitrophenol (0 (1); 2∙10-6 (2); 4∙10-6 (3); 6∙10-6 (4); 8∙10-6 (5); 1∙10-5 (6) mol.l-1) measured by DPV on m-AgSAE in Britton – Robinson buffer pH 6.. Regeneration potencials: Ereg1 = 0 mV; Ereg2 = –1230 mV. Table I. Comparison of developed methods for determination of 2-methoxy-5-nitrophenol in deferent mediums on m-AgSAE. Method pH of BR buffer Matrix LOD, mol.l-1 DCV

DCV

DPV

DPV

2.0

Deionized water

1.7∙10-6

2.0

River water

6.7∙10-7

2.0

Drinking water

5.3∙10-7

6.0

Deionized water

5.4∙10-6

6.0

River water

2.9∙10-6

6.0

Drinking water

6.5∙10-6

2.0

Deionized water

3.4∙10-6

2.0

River water

1.9∙10-6

2.0

Drinking water

1.3∙10-6

6.0

Deionized water

1.3∙10-6

6.0

River water

6.5∙10-7

6.0

Drinking water

2.7∙10-6

40

Conclusions The m-AgSAE showed good electrochemical response towards 2-methoxy-5-nitrophenol with good reproducible results without any surface passivation. This indicated that m-AgSAE is a suitable sensor for the determination of micromolar concentrations of this substance. The limit of determination was on micromolar level for both used voltammetric techniques, but for DPV it was generally slightly lower then for DCV. Sensitivity of these methods could be further increased by a preconstruction step 4. The easy regeneration of electrode surface makes the method easier than the use of other solid electrodes and thus it represents an effective and simple alternative to the use of HMDE. Acknowledgements Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC 06035, RP 14/63 and MSM 0021620857), Grant Agency of Charles University (project SVV 2011-263204), the Grant Agency of the Czech Republic (project P206/10/P087) and the Technology Agency of the Czech Republic (project TA01020565) is gratefully acknowledged. References 1. Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). 2. Barek J., Ebertova H., Mejstrik V., Zima J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 59, 1761 (1994). 3. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 4. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Environ. Chem. Lett. 9, 83 (2011).

41

Magnetic Beads-Based Electrochemical Techniques for DNA-Protein Interaction Monitoring (Elektrochemické techniky využívající magnetické mikročástice pro monitorování interakcí DNA s proteiny) a Miroslav Fojta , Hana Pivoňková a, Kateřina Němcová a, Petra Horáková a, Luděk Havran a, Petr Orság a, Pavlína Vidláková a, Hana Macíčková-Cahová b, Jana Balintová b, and Michal Hocek b a Institute of Biophysics ASCR,v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry v. v. i., Flemingovo nam. 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic Abstract Electrochemical techniques, in connection with separation of nucleoprotein complexes at magnetic beads, are suitable for the monitoring of DNA-protein interactions. For the detection of complexes captured at the beads it is possible to utilize intrinsic electrochemical activity of the protein, intrinsic structure-selective signals of the DNA, or indicator DNA substrates taillabeled with electroactive moieties. Key words: DNA-protein interaction, Electrochemistry, Magnetic beads, Label-free, Electroactive labels. Úvod Pro studium interakcí DNA s proteiny se vyuţívají různé detekční metody s cílem rozpoznat tvorbu příslušného nukleoproteinového komplexu a případně charakterizovat tento komplex z hlediska kinetiky a termodynamiky dané interakce. Mezi klasické metody patří gelová elektroforéza, pomocí které se sleduje změna mobility DNA po navázání specifického proteinu (tzv. gelová retardační analýza, anglicky obvykle electrophoretic mobility shift assay, EMSA) 1-3. Pro ověření identity navázaného proteinu se často vyuţívají protilátky generované proti tomuto proteinu, a to buď tak, ţe se sleduje zvýšení retardace komplexu DNA s proteinem v gelu po navázání protilátky (supershift assay), anebo po přenosu nukleoproteinových komplexů z gelu po elektroforetické separaci na membránu (blotting), kde je pak protein detekován pomocí protilátky obvykle značené enzymem a signál proteinu je kolokalizován se signálem DNA v gelu 1. Specifické protilátky mají v oblasti studia interakcí DNA s proteiny široké vyuţití, byly pro tento účel aplikovány jak v klasickém formátu ELISA, tak v různých imunoprecipitačních technikách, při kterých se vyuţívá zachycení komplexu daného proteinu s DNA prostřednictvím protilátky na pevném nosiči. Tyto metody mohou slouţit jak k jednoduchému testování různých způsobů vazby proteinů ke známým sekvencím nebo strukturám DNA a ovlivnění těchto interakcí vnějšími podmínkami 3, 4, tak k identifikaci dosud nepopsaných míst vazby proteinů na genomovou DNA in vivo v kontextu struktury chromatinu (chromatin immunoprecipitation, ChIP) 5. Magnetické mikročástice v analýze interakcí DNA s proteiny Pro selektivní zachycení biopolymerů (nukleových kyselin, proteinů) a jejich komplexů je výhodné vyuţít magnetických nosičů představovaných mikročásticemi ze 6 superparamagnetických materiálů (magnetic beads, MB) . Pro účely molekulární biologie jsou komerčně dostupné různé typy MB lišící se povrchovou modifikací specifickými „biorekogničními prvky“, např. oligonukleotidy dT25 (primárně určeny pro izolaci mRNA), streptavidinem (pro zakotvení biomolekul modifikovaných biotinem), proteinem A nebo proteinem G (které slouţí k imobilizaci protilátek ve správné orientaci tak, aby zůstala dostupná vazebná místa pro antigen) aj. MB jsou široce vyuţívány v oblasti elektrochemické

42

analýzy nukleotidových sekvencí, např. pro detekci hybridizace DNA 7 nebo identifikaci jednonukleotidových polymorfismů na základě sekvenčně-specifické inkorporace modifikovaných nukleotidů 8, 9. V poslední době byly navrţeny analogické elektrochemické techniky pro detekci interakcí DNA s proteiny. Pro tento účel lze v zásadě vyuţít dvou experimentálních uspořádání: nukleoproteinový komplex můţe být na MB zakotven prostřednictvím molekuly DNA modifikované vhodným adaptorem (např. biotinylované oligonukleotidy) 10, 11, nebo prostřednictvím proteinu vázaného pomocí protilátky 4, 12. Po separaci specifických komplexů od matrice, ve které dochází k interakci a tvorbě komplexu, a po disociaci zakotvených komplexů lze pro vlastní elektrochemickou detekci vyuţít buď vlastní elektrochemickou aktivitu proteinu 10, 11, 13, vlastní elektrochemickou aktivitu DNA 4, nebo elektrochemicky aktivních značek inkorporovaných do DNA 12. Využití vlastní elektrochemické aktivity proteinu Nositeli přirozené elektrochemické aktivity bílkovin jsou některé zbytky aminokyselin v těchto bílkovinách obsaţených 14. Pro účely elektrochemické analýzy byly dosud v největší míře vyuţity voltametrické nebo chronopotenciometrické signály související s elektrooxidací postranních skupin tyrozinu nebo tryptofanu na uhlíkových elektrodách a katalytické vylučování vodíku v přítomnosti bílkovin na rtuťových nebo amalgamových elektrodách elektrodách (Brdičkova reakce, která se objevuje v přítomnosti thiolových skupin – tedy proteinů obsahujících cystein – a iontů kobaltu, a tzv. „pík H“, který lze za vhodných podmínek pozorovat v přítomnosti jakýchkoli bílkovin bez ohledu na přítomnost cysteinu) 14. Pomocí píku H byla sledována interakce proteinu MutS, coţ je jeden z klíčových faktorů podílejících se na opravě chybných párů bazí in vivo, s heteroduplexy DNA obsahujícími tyto chyby v párování. Biotinylovaná dvouřetězcová DNA, zakotvená na MB, obsahující nekanonický pár G•T, vázala protein MutS s výrazně vyšší afinitou neţ přesně komplementární DNA, coţ se projevilo nárůstem píku H v důsledku zvýšeného mnoţství komplexu DNA-MutS zachyceného na MB 11. Podobným způsobem, ale s vyuţitím elektrooxidace tyrozinových zbytků na uhlíkové elektrodě, byly sledovány interakce MutS s DNA obsahující různé chybné páry bazí 10, nebo interakce lysozymu se specifickým aptamerem vázajícím tento protein 13. Využití vlastní elektrochemické aktivity DNA Na základě rozdílů ve voltametrickém chování DNA obsahující a neobsahující volné konce na rtuťové elektrodě 15 byla navrţena jednoduchá metoda pro testování DNA-vazebné aktivity nádorového supresoru proteinu p53 s různými DNA substráty, lišícími se globální strukturou a přítomností specifické vazebného místa pro p53 (p53CON) 4. Tento protein se váţe na p53CON v promotorech genů, jejichţ transkripce je prostřednictvím proteinu p53 regulována. Pro tento typ interakce je klíčová centrální DNA-vazebná doména (CD) p53 a je známo, ţe řada mutací v CD vede ke ztrátě schopnosti p53 rozpoznávat p53CON. Kromě toho byla u p53 popsána schopnost vázat se s vysokou selektivitou na různé struktury DNA, včetně struktur typických pro nadšroubovicovou (supercoiled, sc) DNA 1. Pro vazbu na scDNA je klíčové C-koncové DNA vazebné místo (C-terminal DNA binding site, CTDBS) p53. ScDNA, která nemá ţádné volné konce, neposkytuje na rtuťových a amalgamových elektrodách tzv. pík 3, který je naopak poskytován lineární formou téţe DNA. Díky tomu je moţno pomocí jednoduchý kompetičních experimentů snadno sledovat změny ve vazebné preferenci p53 pro různé molekuly plasmidové DNA v důsledku např. blokování CTDBS protilátkami (dochází ke ztrátě schopnosti preferenční vazby na scDNA a v důsledku toho ke zvýšení vazby na lineární DNA a tím ke vzrůstu píku 3, zejména v případě interakce s lineární DNA obsahující p53CON) nebo v důsledku mutace v centrální doméně proteinu (protein se váţe selektivně na scDNA, ale není schopen sekvenčně specifické vazby) 4.

43

Využití elektrochemicky aktivních značek Zavedení elektrochemicky aktivních skupin do DNA se vyuţívá ke zvýšení citlivosti, a především selektivity jejího elektrochemického stanovení ve smyslu jednoznačného rozpoznání molekul DNA lišících se nukleotidovou sekvencí. V případě sledování interakcí DNA s proteiny lze vyuţít specificky značené ON jako indikátorové substráty poskytující charakteristický signál, jímţ se liší od všech ostatních molekul DNA ve vzorku. Na základě změn signálu tohoto indikátoru je pak moţno nepřímo sledovat interakce proteinu s neznačenými kompetitory a změny těchto interakcí v důsledku změny struktury kompetitorové DNA, výběru protilátky pro imunoprecipitaci na MB, mutace apod. Pro monitorování interakce proteinu p53 s DNA byly vyuţity dvouřetězcové ON, obsahující p53CON a zakončené jednořetězcovým přesahem několika desítek značených nukleotidů. Tímto způsobem bylo ke kaţdé molekule ON připojeno větší mnoţství značek, zajišťující amplifikaci měřeného signálu, zatímco vazebné místo pro p53 bylo uvnitř dvouřetězcového úseku zachováno intaktní. Značené nukleotidy byly na konce DNA zavedeny dvěma různými způsoby 12. S vyuţitím enzymu terminální deoxynukleotidyltransferázy a značených nukleosid trifosfátů byly k DNA připojeny nukleobáze modifikované nitrofenylem nebo propargylkarbamoylantrachinonem. Druhý způsob spočíval v modifikaci jednořetězcového dT20 přesahu oxidem osmičelým v přítomnosti 2,2„-bipyridinu (Os,bipy) 7. Ve všech případech tak byly získány značené indikátorové substráty poskytující specifické elektrochemické signály (čtyřelektronová ireverzibilní redukce nitroskupiny, reverzibilní redukce/oxidace chinonu/hydrochinonu nebo katalytické vylučování vodíku doprovázející redukci osmia v aduktech s thyminem), které byly vyuţity v kompetičních experimentech zaměřených na sledování interakce proteinu p53 s DNA (příklad výsledku získaného pro DNA značenou Os,bipy je ukázán na obr. 1).

1-blank 2-no p53, p21(Os) 3-p21(Os)+noCON competitor 4-p21(Os)+PGM1 competitor

3 4

2

1

Obr. 1. Příklad elektrochemických signálů odpovídajících interakcím proteinu p53 s DNA. Dvouřetězcový ON o délce 50 párů bazí, obsahující p53CON z promotoru genu p21, zakončený jednořetězcovým přesahem dT20 modifikovaným Os,bipy, byl pouţit jako indikátorový substrát, plasmidové DNA obsahující (PGM1) nebo neobsahující (noCON) specifické vazebné místo jako kompetitory. Komplexy p53-DNA byly zachyceny na MB pomocí anti-p53 protilátky a následně byla DNA uvolněna zvýšením iontové síly a zahřátím. Katalytický signál odpovídající redukci osmia v indikátorovém substrátu je pozorován pouze tehdy, je-li ve vzorku přítomna p53 a nespecifický kompetitor (křivka 3). V nepřítomnosti protilátky (křivka 2) nedojde k zachycení komplexu na MB, v přítomnosti specifického kompetitoru je p53 vyvázána tímto (neznačeným) kompetitorem a netvoří komplex se značeným substrátem p21(Os).

44

Závěr Elektrochemické techniky v kombinaci se separací nukleoproteinových komplexů na magnetických částicích jsou vhodné pro sledování interakcí DNA s proteiny. Pro detekci zachycených komplexů je moţno vyuţít vlastní elektrochemické aktivity proteinu, vlastních strukturně selektivních elektrochemických signálů DNA, nebo indikátorových DNA substrátů koncově značených elektrochemicky aktivními skupinami. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA AVČR (IAA400040901), GAČR (P206/11/1638, P301/11/2076), MŠMT ČR (LC06035) a výzkumných záměrů AV0Z50040507 a AV0Z50040702. Literatura 1. Fojta M., Pivonkova H., Brazdova M., Nemcova K., Palecek J., Vojtesek B.: Eur J Biochem 271, 3865 (2004). 2. Jagelska E. B., Pivonkova H., Fojta M., Brazda V.: Biochem Biophys Res Commun 391, 1409 (2010). 3. Pivonkova H., Sebest P., Pecinka P., Ticha O., Nemcova K., Brazdova M., Jagelska E. B., Brazda V., Fojta M.: Biochem Biophys Res Commun 393, 894 (2010). 4. Nemcova K., Havran L., Sebest P., Brazdova M., Pivonkova H., Fojta M.: Anal Chim Acta 668, 166 (2010). 5. Brazdova M., Quante T., Togel L., Walter K., Loscher C., Tichy V., Cincarova L., Deppert W., Tolstonog G. V.: Nucleic Acids Res 37, 1486 (2009). 6. Palecek E., Fojta M.: Talanta 74, 276 (2007). 7. Fojta M., Kostecka P., Trefulka M., Havran L., Palecek E.: Anal. Chem. 79, 1022 (2007). 8. Horakova P., Simkova E., Vychodilova Z., Brazdova M., Fojta M.: Electroanal. 21, 1723 (2009). 9. Vrabel M., Horakova P., Pivonkova H., Kalachova L., Cernocka H., Cahova H., Pohl R., Sebest P., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Chem-Eur J 15, 1144 (2009). 10. Masarik M., Cahova K., Kizek R., Palecek E., Fojta M.: Anal. Bioanal. Chem. 388, 259 (2007). 11. Palecek E., Masarik M., R. K., Kuhlmeier D., Hassmann J., Schülein J.: Anal. Chem. 76, 5930 (2004). 12. Horakova P., Macickova-Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org Biomol Chem 9, 1366 (2011). 13. Kawde A. N., Rodriguez M. C., Lee T. M. H., Wang J.: Electrochem. Commun. 7, 537 (2005). 14. Palecek E., Ostatna V.: Electroanal. 19, 2383 (2007). 15. Fojta M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 69, 715 (2004).

45

Properties of Some Radiosensitizers Studied by Means of the Electrochemical Methods (Štúdium vlastností vybraných rádiosenzitizátorov pomocou elektrochemických metód) Miroslav Gál a, Viliam Kolivoška a, Marta Ambrová b, Ján Híveš b, Romana Sokolová a, and Magdaléna Hromadová a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Inorganic Chemistry, Technology and Materials, Department of Inorganic Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, STU Bratislava, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic Abstract To determine the correlation between reduction potential and some physicochemical properties of selected radiosensitizers cyclic voltammetry and theoretical calculations based on the DFT method with B3LYP functional at the level of 6-311++G** basis set in vacuum were utilized. Very good correlation was found between electron affinities of radiosensitizers and their reduction potential and so called E 17 potential. Key words: Radiosensitizers, Cyclic voltammetry, Radiochemistry, Radical ions, Hypoxic cell, Electron affinity. Introduction The cytotoxic properties of radiosensitizers are due to the fact that in the cell these compounds undergo one-electron reduction to generate radical anions 1-4, which exhibit cytotoxicity towards cellular systems 5. The reactivity of anion radicals from most of the nitrogen-containing compounds has been studied mainly by the pulse radiolysis technique 6,7. Recently electrochemical techniques have been used to study the behavior of the nitro radical anions 3,8-18. Good correlation between electrochemical properties of some nitro-compounds with their ability act as hypoxic cell radiosensitizers is found 19. Electron affinity (EA) is one of the fundamental properties of atoms and molecules. Drugs with higher electron affinity are generally the most toxic and mutagenic. Furthermore, there are a lot of other studies 20,21 dealing with the relationship between reduction potentials and pharmacological activity showing that this parameter is of interest from electrochemical and pharmacological points of view. In this study we correlate the first reduction potential (anion radical production potential) of several radiosensitizers with electron affinity, HOMOs of the radiosensitizers‟ anions, LUMOs of neutral radiosensitizers and so called E 17 potential that account for the energy necessary to transfer the first electron to an electroactive group at pH 7 in aqueous medium to form a radical anion. Therefore, in the case of nitro compounds, the E 17 values represent the ability to form the nitro radical anion. All these correlations could be useful if effects of different radiosensitizers in the human body are being compared.

Experimental Electrochemical measurements were performed using AUTOLAB instrument PG STAT 30 equipped with FRA2 module (ECO Chemie, The Netherlands). A three-electrode

46

electrochemical cell was used. The reference electrode (RE), Ag|AgCl|1M LiCl, was separated from the test solution by a salt bridge. The working electrode (WE) was a valveoperated static mercury electrode (SMDE2, Laboratorní Přístroje, Prague) with an area of 5.15 × 10-3 cm2. The counter electrode (CE) was cylindrical platinum wire with area ca 100 times higher than area of WE. Radiosensitizers (Etanidazole, Tirapazamine (Sigma Aldrich), Metronidazole (Acros Organics, France), Megazol (Bios Chemicals, France), Nimorazole (Carbon Scientific CO, LTD. UK), Tinidazole, Ornidazole (LKT Laboratories, Inc., USA)) are used without further purification. Density functional theory (DFT) calculations of EAs, HOMOs and LUMOs of the selected radiosensitizers were calculated using Spartan‟08 program (Wavefunction, Inc., Irvine, CA, USA)22 with B3LYP functional at the level of 6311++G** basis set in vacuum. This approach was successfully utilized in calculating of EAs of several chemical compounds 23-25. Results and Discussion Radiosensitizers have been studied in various, mostly, aprotic or mixed solvents. This study is aimed on the redox properties of the selected drugs in dimethylformamide (aprotic solvent) and 0.1 M tetrabutylamonium hexaflurophosphate (supporting electrolyte). Radiosensitizers utilized in this study are shown in Fig. 1.

Fig. 1. Chemical structure of the radiosensitizers utilized in this study. The main in vivo effect of radiosensitizers is the anion radical production. As can be seen from Fig. 2 the formation of radical anion of Metronidazole in aprotic medium is a reversible one electron process.

47

Fig. 2. Dependence of the peak current of selected radiosensitizer Metronidazole on the scan rate. According Fig. 2 reduction peak current ipc can be expressed as i pc = A* | v - v c | p , (1) where v is a scan rate, A, p are the optional parameters and vc is a difference between experimental and theoretical cross section of the curve with x axis. In the case of 0 , A 0.424 0.015 and p 0.546 0.006 . Therefore the Metronidazole (Fig. 2) x c control of the overall one electron reduction process of Metronidazole in aprotic medium by diffusion of the reactive species is proved. Behavior of other anion radicals of radiosensitizers in aprotic media is very similar to that of Metronidazole. Despite the structural differences among some of radiosensitizers utilized are not very big, significant differences in the reduction potentials of anion radical of respective radiosensitizers are observed 1-3,9,11,26. It is well known that slight structural modifications may confer the big chemical and/or biological activities in vitro and/or in vivo. The E 17 values were firstly obtained experimentally by electron pulse radiolysis. According to the study published by Breccia et al. 27 it is possible to obtain an excellent correlation between the cathodic peak potentials Epc of the first reduction peak of the several nitro-compounds measured in aprotic media with the E 17 values obtained with pulse radiolysis in water. Using this observation the value of E 17 potential for all radiosensitizers utilized in this study can be determined. Thus obtained values of E 17 together with measured Epc values of radiosensitizers can be correlated with theoretically calculated values of EAs, HOMOs (anion) and LUMOs of the neutral form of the same compounds. The EA is defined as the energy of neutral molecule minus that of the anion radical: EA E 0Drug E Drug (2) To determine EA of the selected radiosensitizers the DFT calculations with B3LYP functional at the level of 6-311++G** basis set in vacuum was used.

48

Fig. 3. Correlation between Epc of the selected radiosensitizers determined form the cyclic voltammetry measurements and LEFT) the LUMO energies of the respective neutral species; RIGHT) theoretical electron affinities (EAs). Epc for Benznidazole taken from Ref. 29. In Fig. 3 the correlation between theoretically calculated electron affinities of selected radiosensitizers and their respective peak potentials Epc determined from cyclic voltammetry measurements and correlation between the LUMO energies of the neutral species 28 and Epc is plotted. Very good correlation between theoretically calculated EAs by DFT/B3LYP/6311++G** method and Epc measured by cyclic voltammetry can be observed. Similarly, good correlation between theoretical EAs of selected radiosensitizers and so called E 17 potential can be found. Another approach how to estimate the ability of the radiosensitizers to accept single electron and form anion radical may be calculation of the energy of the highest occupied molecular orbital (HOMO) of the anion of the respective compound or calculate the energy of the lowest unoccupied molecular orbital (LUMO) of the neutral species 28. In the left part of Fig. 3 the correlation between LUMO of radiosensitizers and Epc of the radiosensitizers is shown. The linear dependency of LUMO energies of radiosensitizers on cathodic peak potentials of respective drugs has the same tendency than that for EAs. However, the spread of points in the case of LUMO is not as good as for EAs. Very similar observation can be made in the case of HOMO energies of radiosensitizer anions (graph not shown). We can summarize that calculation of EAs represents more precise method than the calculation of HOMO energies of anion radical species of radiosensitizers or LUMO energies of neutral species. Similar conclusion was made also by Ramalho et al. 30. Correlation of HOMO-LUMO energy gap of radiosensitizers with reduction peak potential or E 17 potential was even worse than previous two correlations (HOMO (anion) – Epc/ E 17 , LUMO – Epc/ E 17 ). Acknowledgement This research was supported by the Grant Agency of the Czech Republic (203/09/P502 and 203/09/0705), and the Ministry of Education (LC510). Literature 1. Gal M., Hives J., Sokolova R. et. al: Coll. Czech. Chem. Comm. 74, 1571, (2009). 2. Gal M., Hives J., Sokolova R. et. al: Modern Electrochemical Methods XXX 55, (2010). 3. Gal M., Hromadova M., Pospisil L., Hives J. et. al: Bioelectrochemistry 78, 118, (2010). 4. Viode C., Bettache N., Cenas N. et. al: Biochem. Pharmacol. 57, 549, (1999). 5. Stewart F. A., Denekamp J., Randhawa V. S.: Brit. J. Cancer 45, 869, (1982). 6. Wardman P.: Rep. Prog. Phys. 41, 259, (1978). 7. Wardman P.: Environ. Health Persp. 64, 309, (1985). 8. Navratil T., Barek J., Fasinova-Sebkova S.: Electroanalysis 21, 309, (2009).

49

9. Squella J. A., Jimenez G., Bollo S., Nunezvergara L. J.: Electrochim Acta 42, 2305, (1997). 10. Squella J. A., Letelier M. E., Lindermeyer L. et al.: Chem.-Biol. Interact. 99, 227, (1996). 11. Squella J. A., Solabarrieta C., Nunezvergara L. J.: Chem.-Biol. Interact. 89, 197, (1993). 12. Tocher J. H.,.Edwards D. I.: Biochem. Pharmacol. 50, 1367, (1995). 13. Barek J., Cabalkova D., Fischer J., Navratil T. et. al: Environ. Chem. Lett. 9, 83, (2011). 14. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J. et. al: Electroanalysis 23, 129, (2011). 15. Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034, (2010). 16. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B. et. al: Anal. Lett. 42, 2339, (2009). 17. Cabalkova D., Barek J., Fischer J., Navratil T. et. al: Chem. Listy 103, 236, (2009). 18. Peckova K., Vrzalova L., Bencko V. et al.: Coll. Czech. Chem. Commun. 74, 1697, (2009). 19. Adams G. E., Clarke E. D., Jacobs R. S. et. al: Biochem. Bioph. Res. Co. 72, 824, (1976). 20. Ames J. R., Foye W. O., Kovacic P.: Bioelectroch. Bioener. 36, 171, (1995). 21. Vachalkova A., Novotny L., Blesova M.: Neoplasma 43, 113, (1996). 22. Shao Y., Molnar L. F., Jung Y. et. al: Phys. Chem. Chem. Phys. 8, 3172, (2006). 23. Takahata Y.,.Chong D. P.: J. Brazil. Chem. Soc. 10, 354, (1999). 24. Lu J. F., Zhu S. L., Zhou Z. Y., Wu Q. Y. et. al: Int. J. Quantum Chem. 106, 2073, (2006). 25. Lee J. E., Choi W. Y., Mhin B. J.: Bull. Kor. Chem. Soc. 24, 792, (2003). 26. Nunezvergara L. J., Garcia F., Dominguez M. et. al: J. Electroanal. Chem. 381, 215, (1995). 27. Breccia A., Berrilli G., Roffia S.: Int. J. Radiat. Biol. 36, 85, (1979). 28. Smeyers Y. G., Debueren A., Alcala R., Alvarez M. V.: Int. J. Radiat. Biol. 39, 649, (1981). 29. Barety D., Resibois B., Vergoten G., Moschetto Y.: J. Electroanal. Chem. 162, 335, (1984). 30. Ramalho T. C., de Alencastro R. B., La-Scalea M. A., Figueroa-Villar J. D.: Biophys. Chem. 110, 267, (2004).

50

Electrochemical Properties of Nucleosides, Nucleotides and DNA Labeled by Protected –SH Group (Elektrochemické vlastnosti nukleosidů, nukleotidů a DNA značených chráněnou –SH skupinou) a Luděk Havran , Hana Macíčková-Cahová b, Radek Pohl b, Petra Horáková a, Jan Špaček a, Miroslav Fojta a, and Michal Hocek b a Institute of Biophysics ASCR v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry ASCR v.v.i., Flemingovo nám. 2, 16610 Prague 6, Czech Republic Abstract By aqueous Suzuki–Miyaura cross-coupling reaction was prepared nucleosides, nucleotides and nucleoside triphosphates (dNTP) substituted by methyl-, benzyl- and tritylsulfanylphenyl groups. The modified dNTPs were incorporated into DNA by primer extension (PEX) using enzymes - DNA polymerases. Electrochemical behavior of building blocks, nucleosides, nucleotide monophosphates and PEX products were studied at hanging mercury drop electrode. The electrochemical behavior of the alkylsulfanylphenyl nucleosides indicated formation of compact layers at the electrode. Electrochemical deprotection of modified nucleotides and PEX products with incorporated benzyl- or tritylsulfanylphenyl moieties was detected by measuring of Brdička catalytic responses in repeated constant current chronopotentiometric scans. Key words: labeling of DNA, electrochemical methods, organosulfur compounds. Úvod Imobilizace syntetických oligonukleotidů (ON) koncově značených –SH skupinou (ON-SH) na povrch zlata, při které dochází ke vzniku samoorganizující se monovrstvy (SAM), je jednou ze základních metod pouţívaných pro funkcionalizaci povrchů při konstrukci senzorů pro DNA hybridizaci 1. Nedávno byla také publikována práce popisující tvorbu SAM ON-SH na povrchu visící rtuťové kapkové elektrody (HMDE) 2. Komerčně dostupné ON-SH mají thiolovou skupinu připojenou k oligonukleotidovému řetězci dlouhým alkylovým linkerem. Tento linker silně ovlivňuje konformační chování takto modifikovaných ON. Inkorporace různě chemicky modifikovaných nukleosidtrifosfátů (dNTP) (včetně těch nesoucích elektroaktivní značku) pomocí DNA polymeráz je v současnosti jednou z často pouţívaných metod pro přípravu funkcionalizované DNA 3. Alkylsulfanylfenylénová skupina ve značené DNA můţe být pouţita jako redox značka. Po chemickém, případně elektrochemickém odchránění můţe také slouţit jako prekurzor volné –SH skupiny pro imobilizaci DNA na kovový povrch. V tomto příspěvku bude prezentováno studium elektrochemického a mezifázového chování nukleosidů, nukleotidů a DNA nesoucích různé alkylsulfanylfenylénové skupiny na HMDE. Toto studium zahrnuje jak moţnosti tvorby SAM v případě nukleosidů, tak i důkaz elektrochemického odchránění některých nukleotidů a PEX produktů 4. Experimentální část Nukleosidy, nukleosidmonofosfáty (dNMP) a dNTP (Obr. 1.) modifikované methyl- , benzyla tritylsufanylfenylem byly připraveny Suzuki–Miyaura cross-coupling reakcí halogenovaných nukleosidů a nukleotidů s příslušnými alkylsufanylfenylboronovými kyselinami ve vodném prostředí.

51

CH3 S S NH2

NH2 N

A HO

N O

N

N

O

B

HO P O

N

O

O

OH

OH

OH

C

S NH2 N

O

O

O

HO P O P O P O OH

OH

N

O

O

OH OH

Obr. 1. Struktury výsledných nukleosidů (A), nukleotid monofosfátů (B) a nukleosid trifosfátů (C) modifikovaných methylsufanylfenylem (A), tritylsufanylfenylem (B) a benzylsufanylfenylem (C). Modifikované dNTP byly inkorporovány do DNA pomocí Vent(exo-) polymerázy (New England Biolabs, UK), za pouţití primeru: 3‟-GGGTACGGCGGGTAC-5‟ a templátu: 5‟CTAGCATGAGCTCAGTCCCATGCCGCCCATG-3‟ (oboje Sigma–Aldrich). Výsledky PEX reakce byly kontrolovány pomocí elektroforézy v polyakrylamidovém gelu. Elektrochemické chování modifikovaných nukleosidů a dNMP bylo studováno konvenční (in situ) cyklickou (CV) a AC (ACV) voltametrií a také pomocí chronopotenciometrie s konstantním proudem (CPS). PEX produkty byly analyzovány pomocí adsorptivní přenosové rozpouštěcí (ex situ AdTS) CV, ACV a CPS. Všechna voltametrická měření byla prováděna za pouţití potenciostatu/galvanostatu Autolab (Metrohm-Autolab, Holandsko) a elektrodového systému 663 VA-stand (Metrohm, Švýcarsko) v tříelektrodovém zapojení. Jako pracovní elektroda byla pouţita HMDE, jako referenční elektroda byla pouţita Ag/AgCl/3M KCl a jako pomocná elektroda platinový drát. Všechna měření byla prováděna při laboratorní teplotě v anaerobním prostředí. Pouze měření CPS záznamů bylo prováděno za přístupu vzduchu. Výsledky a diskuse Suzuki–Miyaura cross-coupling reakcí ve vodném prostředí byly připraveny nukleosidy, dNMP a dNTP modifikované methyl- , benzyl- a tritylsufanylfenylem (dNMe, dNBn, dNTri). Značené dNTP byly úspěšně inkorporovány do oligonukleotidového řetězce DNA pomocí PEX reakce. Pomocí měření na HMDE bylo zjištěno, ţe modifikované nukleosidy poskytují v CV, kromě signálů odpovídajících redukci příslušné báze i dvojici velmi ostrých (spikes) katodických píků (Obr. 2.). Výskyt těchto signálů v CV a také výsledky získané pomocí ACV naznačují, ţe dochází ke vzniku kompaktní uspořádané vrstvy daného nukleosidu na povrchu HMDE. Charakter této vrstvy je ovlivněn typem chránící skupiny.

52

0.03

I[ A]

0.00

-0.03

-0.06

-0.09 -1.2

-0.8

-0.4

0.0

E [V] Bn

Obr. 2. CV záznamy dC (plná čára) a dC (čárkovaná čára). v = 500mV/s; Ei = 0.0 V; Esw = -1.9 V; elektrolyt (tenká čára): 50mM borax (pH9,3); c = 40 M.

1. scan 2. scan ze

dt/dE(s/V)

0.6

0.4

0.2

0.0 -1.6

-1.4

-1.2

-1.0

E [V] Obr. 3. Chronopotenciogramy PEX produktu s inkorporovaným dCTriTP. Ei = 0.0 V; Istr = -10 A; elektrolyt: 0,1M amoniakální pufr (pH 9,5) + 1mM [Co (NH3)6]3+, ta = 60s.

Pomocí opakovaných scanů v CPS při měření Brdičkovy reakce studovaných dNMP a PEX produktů dochází v případě dNBnMP a dNTriMP a produktů inkorporace příslušných dNTP k redukci vazby síra uhlík a tedy k elektrochemickému odchránění –SH skupiny (Obr. 3.).

53

Závěr Nukleosidy, dNMP a dNTP modifikované alkylsulfanylfenylénovou skupinou byly připraveny cross-coupling reakcí ve vodném prostředí. Značené dNTP byly úspěšně inkorporovány do DNA. Modifikované nukleosidy tvoří na povrchu HMDE kondenzované vrstvy. V případě dNMP a PEX produktů nesoucích benzyl- a tritylsufanylfenylénovou skupinu dochází při měření opakovaných scanů v CPS k odchránění –SH skupiny. Získané výsledky naznačují, ţe alkylem chráněná –SH skupina můţe slouţit pro imobilizaci DNA na kovový povrch. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu GA AVČR (IAA 400040903 a IAA400040901), podporou MŠMT centru základního výzkumu LC06035 a institucionálními výzkumnými plány AV0Z50040507 a AV0Z50040702. Literatura 1. Herne T. M., Tarlov M. J.: J. Am. Chem. Soc. 119, 8916 (1997). 2. Ostatná V., Paleček E.: Langmuir 22, 6481 (2006). 3. Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 6, 2233 (2008). 4. Macíčková-Cahová H., Pohl R., Horáková P., Havran L., Špaček J., Fojta M., Hocek M.: Chem. Eur. J. (2011) in press.

54

Unusual Reaction of Gold on Hanging Mercury Drop Electrode Michael Heyrovský a, Bogdan Yosypchuk a, and Andrey Korshunov b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Tomsk Polytechnic University, Department of General and Inorganic Chemistry, Lenin Avenue 30, 634050 Tomsk, Russian Federation, E-mail: [email protected] Abstract In linear voltammetry of dilute aqueous chloroauric acid with hanging mercury drop electrode, when scanning proceeds from negative to positive potentials, a prominent maximum of cathodic current appears on the curves near 0 V. This effect is explained by catalysis of hydrogen evolution by short-lived gold nanoparticles at the electrode surface. Key words: Aqueous chloroauric acid, Hanging mercury drop electrode, Linear voltammetry, Catalytic hydrogen evolution, Au nanoparticles. Introduction In our study of electrochemical behaviour of gold we found with 10–4 M aqueous solution of chloroauric acid that when in linear voltammetry on hanging mercury drop electrode (HMDE) the potential is scanned from negative to positive values, a prominent maximum of cathodic current appears at the end of the curve when the potential of working electrode approaches that of the reference electrode. This unexpected effect required systematic research. Experimental Voltammetric curves were studied and recorded by means of the Eco-Tribo Polarograph from Polaro-Sensors, Prague, with MultiElchem v.2.1 software (J. Heyrovský Institute). In the 3-electrode system were used HMDE, saturated calomel electrode based on silver solid amalgam 1 (with potential equal to that of classical SCE) and Pt wire as auxiliary electrode. Solutions were prepared from deioinized water (Millipore, Milli-Qplus system) and from chemicals of p.a. purity. Experiments were done with solutions deaerated by pure nitrogen, at room temperature. Results and discussion First figure shows cyclic voltammetric curve of dilute chloroauric acid recorded from positive to negative potentials and back with the steep cathodic current maximum towards the positive end. As there is only inconspicuous decreasing cathodic current at the beginning of the curve, the cause of the unusual steep maximum has to be searched in the processes occurring at the electrode in the part of inversion of the curve in the negative potential region. The height of the positive cathodic maximum depends on the value of the negative inversion potential. That is demonstrated by the curves in Fig. 2, recorded with linear voltammetry starting at various negative limiting potentials and proceeding in the positive direction. At negative potentials –1500 mV and –1550 mV flows already considerable cathodic current due to evolution of hydrogen from chloroauric acid. However, the positive cathodic current maximum appears only when the initial negative potential equals or exceeds –1600 mV, when at the cathode proceeds reduction of the chloroauric anion, i.e., reduction of Au(III). Even when the initial potential is sufficiently negative, the positive current maximum appears only when the rate of potential scan is sufficiently high, as is shown by the curves in Fig. 3. From Fig. 3 it can be concluded, that the products of electrode reactions at the negative initial 55

potential are short-lived – they must be brought sufficiently fast to the positive potential region, where they cause the appearance of the cathodic current maximum. If the transfer of the active products is slower than corresponds to duration of potential scan 20 mV s–1, they deactivate and the positive current maximum does not appear.

Fig. 1. Cyclic voltammogram of aqueous 1×10-4 M HAuCl4 solution (pH 1.9), recorded after 60 s delay at reverse potential Erev = –1900 mV to Ein = Efin = 0 mV at the rate of potential scan v = 200 mV s–1. Fig. 2. Linear voltammograms of aqueous 2×10-4 M HAuCl4 solution (pH 1.9), recorded from different negative potentials (Ein = –1500, –1550, –1600, –1650, –1700, –1750, –1800, –1850, –1900, –1950 mV) to Efin = +150 mV with accumulation time at initial potential tac = 30 s and with rate of potential scan v = 1000 mV s–1. Also the amount of the active products of electrode reactions at negative potentials, causing the positive cathodic current maximum, has to exceed a certain limit, otherwise the active products are too few, they disappear, and hence also the maximum disappears. That follows from the curves in Fig. 4. When the time of delay of the scan at the initial negative potential, during which the reaction products at the electrode surface accumulate, increases, the maximum of the positive cathodic current increases and shifts to negative potentials, and at the same time the slope of the charging current part of the curves decreases. Such dependence is typical for electrochemical processes accompanied by adsorption of reaction products at the electrode surface. The occurrence of the maximum is hence connected with adsorption of the active products of processes formed at negative potentials. Addition of different adsorptive species to the solution blocks the effect: in 2×10–4 M HAuCl4 + 0.1 M KCl the chloride anions adsorb on mercury at the positive side of the point of zero charge and eliminate the maximum completely. The maximum appears on the curves in a relatively narrow range of pH, as is shown in Fig. 5. From dilute aqueous solutions of chloroauric acid at negative potentials at the mercury

56

electrode first develops hydrogen, at more negative potentials occurs electroreduction of the chloroauric anion. The development of hydrogen causes alkalization of the electrode/solution interface which leads to formation of complexes of gold – from AuCl4– to [AuCl3OH]–, [AuCl2(OH)2]–, [AuCl(OH)3]– and finally to the insoluble Au(OH)3, which aggregates into polymeric particles of 20–200 nm size 2, which adsorb at the electrode surface. The electroreduction of gold from the hydrolyzed complexes produces gold atoms at the outer side of the mercury surface prior to their amalgamation; the gold amalgam contains more than three different gold-mercury intermetallics 3. When the electrode potential is scanned in positive direction the production of gold and the development of hydrogen stops, the thereby caused alkalization of the interface stops and the adsorbed hydroxidic layer in the acid solution dissolves. The gold atoms accumulated at the electrode surface temporarily aggregate into adsorbed nanoparticles. Nanosized gold particles are known for their varied catalytic properties in heterogeneous systems, also in electrochemistry 4,5. In the moment when the layer of gold hydroxidic complexes disappears from the electrode surface, the adsorbed gold particles catalyze evolution of hydrogen, which occurs at potentials more positive than hydrogen evolution at normal gold amalgam electrode 6. After some time all the gold particles dissolve in mercury forming gold amalgam. At electrodes prepared from gold amalgams no catalytic evolution of hydrogen was observed 7. The sequence of events at the electrode surface depends on the rate of potential scan – at the rate of 20 mV s–1 the fast time-dependent processes are quickly over and the cathodic current maximum does not appear (Fig. 3).

Fig. 3. Linear voltammograms of aqueous 2×10–4 M HAuCl4 solution (pH 1.9), recorded from Ein = –1700 mV to Efin = +150 mV with accumulation time at initial potential tac = 10 s with rates of potential scan v = 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200, 250, 500, 1000 mV s–1. Fig. 4. Linear voltammograms of aqueous 2×10–4 M HAuCl4 solution (pH 1.9), recorded from Ein = –1700 mV to Efin = +150 mV at rate of potential scan v = 200 mV s–1 and with accumulation times at initial potential tac = 1, 2, 3, 5, 10, 15, 20, 30, 60, 90 s.

57

Fig. 5. Dependence of height of the positive cathodic current maximum on pH. Linear voltammograms of aqueous 2×10–4 M HAuCl4 + 10–2 M KCl solutions, recorded from Ein = –1700 mV to Efin = +150 mV with accumulation time at initial potential tac= 30 s and with potential scan rate v = 200 mV s–1; pH values 1.81, 1.83, 1.87, 1.92, 1.96, 2.04, 2.08, 2.15, 2.19, 2.31, 2.36, 2.45, 2.77 gradually increased by regular additions of 0.1 ml 0.1 M NaOH to 10 ml of the initial solution. Conclusion In voltammetry with hanging mercury drop electrode of dilute aqueous solutions of chloroauric acid two electrode processes occur simultaneously at negative potentials: evolution of hydrogen and production of atomic gold. These two reactions under selected time and potential conditions lead to generation of a prominent cathodic current maximum at positive potentials due to catalysis of hydrogen evolution by short-lived nanoparticles of gold. Acknowledgements This work was financially supported by the Grant Agency of the Czech Republic (grant P206/11/1638), by GA AS CR (grant IAA400400806) and by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (project LC06063). References 1. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 16, 238 (2004). 2. Busev A.I., Ivanov V.M.: Analytical Chemistry of Gold (in Russian), p. 264. Nauka, Moscow 1973. 3. Guminski C.: Polish J. Chem. 78, 1733 (2004). 4. Das J., Patra S., Yang H.: Chem.Commun. 4451 (2008). 5. Burke L.D., O´Mullane A.P.: J. Solid State Electrochem. 4, 285 (2000). 6. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 7. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003).

58

Evaluating the Accuracy of Continuous Glucose Monitoring by the Patient through Continuous Glucose Error Grid Analysis (Hodnocení přesnosti kontinuálního měření glykémie pacientem prostřednictvím Clarkovy analýzy chybové mřížky) Šárka Honsová a, and Tomáš Navrátil b a Charles University in Prague, Faculty of Physical Education and Sport, José Martího 31, 162 52 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected] b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The aim of the study is to compare the difference between the accuracy declared by the producer of continuous glucose determination using the MiniMed Paradigm REAL-Time system with the results achieved by patients in real life. The glucose sensor evaluates the catalytic transformation of glucose (enzyme glucose dehydrogenase) to hydrogen peroxide, the concentration of which is electrochemically evaluated. The accuracy of measurement was determined by Clarke Error Grid Analysis. It can be concluded that in normal glycaemia (4.4 to 10.0 mmol/l) the measurements realized by the patients are more accurate than it is supposed by the producer, opposite to the cases of hypoglycaemia or hyperglycaemia. Key words: Continuous glucose monitoring, Continuous glucose error grid analysis, Practical accuracy. Úvod Minimed Medtronic je jednou ze tří firem, která na českém trhu poskytuje senzory pro kontinuální měření glykémie (CGM). Vzhledem k tomu, ţe její CGM systém MiniMed Paradigm REAL-Time je jako jediný součástí inzulínové pumpy, tudíţ pacient nemusí nosit na těle další zařízení, dostává se tento systém velmi často do samostatného vyuţívání pacientem. Všechny současné CGM systémy jsou postaveny na minimálně-invazivní metodě stanovení glykémie z intersticiální tekutiny. Díky vlastnostem intersticiální tekutiny sebou však nese tento systém stanovení glykémie problémy, které mohou přesnost měření velkou měrou ovlivňovat. Jedná se zejména o to, ţe změny glykémie stanovené z koncentrace glukózy v intersticiální tekutině se projevují se zpoţděním, různí autoři uvádějí rozmezí 7–20 min 1-4 a dále krátkodobé extrémní výkyvy glykémie se nemusí na koncentraci glukózy v intersticiální tekutině vůbec neprojevit. V praxi to znamená, ţe jestliţe pacient kalibruje senzor v době rychlé změny glykémie, případně při vysokých hladinách glykémie, senzor pak vykazuje neodpovídající hodnoty glykémie. Sám pacient pak můţe přesnost měření dále ovlivňovat zejména frekvencí kalibrace, místem získání vzorku krve pro kalibraci a časovou prodlevou mezi stanovením hodnoty glykémie a jejím zadáním do pumpy. U CGM firmy Minimed Medtronic je před zahájením kontinuálního měření zavedena subkutánní elektroda a následně senzor vyţaduje dvě hodiny na ustálení, ale čas můţe být i delší. Následně je nutná kalibrace senzoru podle aktuálních hodnot glykémie stanovených glukometrem. Kalibrace je vyţadována kaţdých 12 hodin. Ţivotnost senzoru jsou 3 dny, ovšem jeden senzor je moţné pouţít bez vyjmutí dvakrát za sebou. Přenos ze senzoru je realizován pomocí transmiteru Minilink radiovým signálem do inzulínové pumpy. U Minilinku výrobce 5 udává ţivotnost 9 měsíců nepřetrţitého pouţívání. Měření senzoru je zaloţeno na elektrochemickém principu, kdy se jako specifický glukózový receptor uplatňuje enzym glukózy dehydrogenázy. Tento enzym katalyzuje oxidaci glukózy

59

za vzniku peroxidu vodíku, přičemţ elektrochemicky se stanovuje vzestup koncentrace peroxidu nebo pokles koncentrace kyslíku 6. Experimentální část Pro analýzu byla pouţita data z kontinuálního měření glykémie získaná v průběhu dvou let a tří měsíců, kdy bylo pouţito celkem 36 kontinuálních glukózových senzorů a provedeno celkem 502 kalibrací senzoru. 42 kalibrací (8,4 %) bylo z analýzy vyřazeno, protoţe doba mezi posledním stanovením glykémie senzorem a kalibračním měřením glukometrem byla delší neţ 10 min. Celkem tedy bylo analyzováno 460 párů hodnot glykémie (senzor – glukometr). Všechny senzory byly aplikovány u jednoho pacienta a pro všechna měření byl pouţit jeden Minilink (transmiter). Přibliţně v polovině sledovaného období byla provedena záruční výměna inzulínové pumpy, ovšem na základě technických informací výrobce 5 předpokládáme, ţe samotná inzulínová pumpa přesnost kontinuálního měření glykémie neovlivňuje. Pacient prováděl měření při nestandardních situacích, zejména při zvýšené fyzické námaze, nebo kdyţ se pacientovi nedařilo dosáhnout cílových hodnot glykémie. Pacientova hladina glykovaného hemoglobinu (HbA1c) se v průběhu celého sledovaného období pohybovala v rozmezí 4,8–5,4 %. Referenční hodnoty byly pořízeny glukometrem Freestyle mini od firmy Abbott, který pracuje jako biosenzor na principu elektrochemického coulometru. Měří výsledný náboj anody, který je úměrný mnoţství glukózy v původním vzorku. Za klinicky přesné se povaţují výsledky, jejichţ odchylka je do 20 % od referenční hodnoty, ovšem u tohoto glukometru 95 % hodnot vykazuje odchylku niţší neţ 10 %. Vzhledem k tomu, ţe kalibrace jednoho senzoru byla většinou realizována na testovacích prouţcích jedné šarţe, můţeme případnou systematickou chybu měření glukometru zanedbat. Referenční hodnoty byly při všech kalibracích stanovovány z kapilární krve z konečků prstů. Přesnost měření senzorů byla hodnocena prostřednictvím metody Clarkova analýza chybové mříţky, neboť tato metoda byla jednak pouţita při stanovení přesnosti CGM výrobcem 5 a jednak je nejčastěji vyuţívána v řadě dalších současných výzkumů 7-9. Clarkova analýza chybové mříţky u kontinuálního měření glykémie tzv. CG-EGA continuous glucose-error grid analysis) ve své upravené podobě analyzuje hodnoty glykémie ze senzoru a referenční metody (v našem případě glukometru) v určitém čase a z hlediska trendů poklesu či vzestupu glykémie. Výsledky měření CGM a glukometru jsou rozděleny v mříţkovém grafu do pěti zón A–E na základě klinického dopadu rozhodnutí pacienta. V zóně A se nacházejí hodnoty reprezentující správná rozhodnutí pacienta, hodnoty senzoru se neliší o více neţ 20 % od referenční glykémie, v zóně B se hodnoty liší o více neţ 20 % od referenční metody, ale klinická rozhodnutí na základě měření nevedou k výraznějším chybám, hodnoty v zóně C by mohly vést pacienta k nadměrné korekci normální glykémie, hodnoty v zóně D reprezentující nesprávnou detekci klinicky významné glykémie nebo změny glykémie a nesprávnou korekci a v zóně E se nacházejí zcela chybné a nebezpečné hodnoty, které by pacienta vedly ke zcela chybným a nebezpečným rozhodnutím. Pokud je změna glykémie rychlejší nebo pomalejší o více neţ 1,1 mmol/l/min, je nutno posunout hranice některých zón 3. Shoda mezi spárovanými hodnotami byla stanovena jako rozdíl mezi hodnotou naměřenou senzorem a hodnotou naměřenou glukometrem. Rozdíl byl vypočítán jako procento hodnoty

60

glukometru (střední absolutní odchylka v procentech). Dále byla stanovena celková odchylka, která je definována jako celkový rozdíl mezi hodnotami glykémie zjištěnými senzorem a glukometrem. Výsledky a diskuse Celková odchylka ukazuje, ţe senzory ve většině případů podměřují (Tabulka I). Velikost střední absolutní odchylky ovlivňují krajní hodnoty, kdy maximální rozdíl dosáhl 250 %, coţ však spadá do případů, kdy při měření senzorem došlo k některé z chyb (chyba kalibrace apod.). Ve srovnání s údaji výrobce 5 je námi zjištěná střední absolutní odchylka větší o 2,5 % a směrodatná odchylka (SD) je větší o 4,8 %. Tabulka I. Základní popis dat. počet spárovaných měření glykémie střední absolutní odchylka v procentech (α=0.05) celková odchylka

460 22,2±2,3 % 144,5 mmol/l

Z celkového počtu 460 párů měření se 3 hodnoty glykémie měřené glukometrem dostaly pod hranici 2,2 mmol/l, tudíţ celkový počet párů v jednotlivých výrobcem stanovených hladinách glykémie je o 3 páry niţší. Vzhledem k tomu, ţe výrobce provedl analýzu dat podle původní Clarkovy metodody 9 bez zohlednění rychlosti změny glykémie, do naší analýzy jsme také zahrnuli všechny páry měření bez ohledu na rychlost, abychom mohli data porovnat. Rychlost změny glykémie jsme však také sledovali. V našem vzorku dat bylo při rychlejší změně glykémie neţ 1,1 mmol/l/min provedeno 16 % kalibrací, coţ je dáno tím, ţe v reálném ţivotě, zejména při fyzické aktivitě, není vţdy moţné čekat, aţ se glykémie ustálí. Přesnost měření systému MiniMed Paradigm REAL-Time byla také hodnocena relativním počtem párů měření s odchylkou do 20 % a 30 % v jednotlivých pásmech glykémie (Tabulka II). U celkového počtu spárovaných měření se relativní počty s odchylkou do 20 % a 30 % téměř shodují, resp. se liší o 3 %. V pásmech normální glykémie jsou měření u sledovaného pacienta přesnější, naopak v pásmech hypoglykémie a hyperglykémie je přesnost měření u sledovaného pacienta výrazně horší, v pásmu glykémie nad 13,3 mmol/l mělo odchylku menší neţ 20 % jen 13 % párů měření oproti 61 % udávaných výrobcem 5. Tabulka II. Srovnání relativního počtu párů měření s odchylkou do 20 % a 30 % s výrobcem senzorů. počet počet spárovaných do 20% do 30% rozsah spárovaných do 20% do 30% měření údaje výrobce údaje výrobce glykémie měření [%] [%] údaje výrobce [%] [%] celkem 460 59 76 2941 62 79 2,2-4,4 113 41 58 356 68 68 4,5-6,7 133 66 86 769 60 77 6,8-13,3 196 69 85 2362 62 81 >13,3 15 13 33 454 61 82 Výsledky posouzení klinické relevance odchylek měření mezi senzorem a glukometrem pomocí Clarkovy analýzy chybové mříţky zobrazuje korelogram (Obr. 1) a Tabulka III. V poţadovaných zónách A a B, které vedou pacienta ke správným, příp. neškodným rozhodnutím, se nachází nejvíce hodnot v pásmu normálních glykémií, coţ se shoduje

61

i s údaji výrobce 5 a s výsledky několika dalších studií 8, 10, 11. V našem případě se v zónách A a B v pásmu 4,5–6,7 nachází 100 % párů měření (u výrobce 99,9 %), tedy pokud se pacient nacházel v tomto ideálním pásmu glykémie, senzor mu vţdy poskytl pro jeho rozhodování správnou informaci.

Obr. 1. Clarkova analýza chybové mříţky. Přesnost informace ze senzoru je však pro pacienta nejdůleţitější v pásmu hypoglykémie, u kterého se v zónách A a B nachází pouze 70,8 %, přičemţ výrobce udává 76,1 %, coţ je u něj navíc v této zóně nejniţší hodnota. Vzhledem k tomu, ţe hypoglykémie bezprostředně ohroţuje ţivot pacienta, v tomto ohledu je přesnost glukózových senzorů stále nedostačující. Nejmenší relativní četnost v zónách A a B (33,3 %) mají páry měření, které proběhly při glykémii vyšší neţ 13,3 mmol/l. U těchto hodnot se výrobcem značně lišíme, neboť výrobce udává relativní četnost 86,8 %. Tabulka III. Četnost spárovaných měření v jednotlivých zónách A-E* podle rozsahů koncentrací glukózy. relativní absolutní četnost rozsah četnost spárov. glykémie spárov. měření A+B A B C D [mmol/l] měření [%] A+B [%] A [%] B [%] C [%] D [%] 2,2-4,4 113 24,7 80 70,8 55 48,7 25 22,1 0 0,0 33 29,2 4,5-6,7 133 29,1 133 100,0 90 67,7 43 32,3 0 0,0 0 0,0 6,8-13,3 196 42,9 193 98,5 135 68,9 58 29,6 3 1,5 0 0,0 >13,3 15 3,3 5 33,3 2 13,3 3 20,0 0 0,0 10 66,7 celkem 457 100,0 411 89,9 282 61,7 129 28,2 3 0,7 43 9,4 * V zóně E se nenacházejí ţádné hodnoty, proto není v tabulce uvedena.

62

Celkově se však s výrobcem 5 i dalšími studiemi 8, 10, 11 shodujeme v trendu, který ukazuje, ţe čím glykémie dosahuje extrémnějších hodnot, tím je přesnost senzoru menší. V tomto ohledu s námi nesouhlasí pouze Mráz a kol. 12, který uvádí, ţe přesnost měření roste se zvyšující se glykémií. Závěr V souladu s naším očekáváním jsme došli k závěru, ţe v pásmech normální glykémie jsou měření senzoru realizována pacientem v běţném ţivotě ještě přesnější, neţ udává výrobce. V pásmech hypoglykémie a hyperglykémie však dochází k větším chybám měření, neţ udává výrobce, coţ je ovlivněno zejména tím, ţe v běţném ţivotě mají hodnoty glykémie větší rozptyl a pacient se dostává do extrémnějších situací neţ při klinických studiích, zvláště pak, pokud se pacient věnuje fyzické aktivitě nebo dochází k rychlým změnám glykémie. Metoda kontinuálního monitoringu glykémie je i přes své současné nedostatky významným posunem v léčbě diabetu a můţeme konstatovat, ţe poučení pacienti jsou schopni tuto metodu plnohodnotně vyuţívat. Poděkování Tato práce vznikla s podporou veřejného zdravotního pojištění, konkrétně Všeobecné zdravotní pojišťovny České republiky, která svým klientům plně hradí 4 kontinuální glukózové senzory ročně a s podporou grantu GA AV ČR (č. IAA400400806) a GA ČR (č. P206/11/1638). Literatura 1. Boyne M. S., Silver D. M., Kaplan J., Saudek C. D.: Diabetes 52, 2790 (2003). 2. http://cukrovka-ocima-biochemie.blog.cz/, Downloaded: 4th March 2011. 3. Kovatchev B., Anderson S., Heinemann L., Clarke W.: Diabetes Care 31, 1160 (2008). 4. Wentholt I. M., Hoekstra J. B., DeVries J. H.: Diabetes Care 29, 1805 (2006). 5. http://www.minimed.com/pdf/guardian_real_time_user_guide.pdf, Downloaded: 4th March 2011. 6. Harper A., Anderson M. R.: Sensors-Basel 10, 8248 (2010). 7. Clarke W., Kovatchev B.: Diabetes Technol. The. 11, S45 (2009). 8. Clarke W. L., Anderson S., Farhy L., Breton M., Gonder-Frederick L., Cox D., Kovatchev B.: Diabetes Care 28, 2412 (2005). 9. Clarke W. L., Cox D., Gonderfrederick L. A., Carter W., Pohl S. L.: Diabetes Care 10, 622 (1987). 10. Hasanbegovic S.: HealthMED 4, 615 (2010). 11. Clarke W. L., Anderson S., Kovatchev B.: Cur. Diabetes Rev. 4, 193 (2008). 12. Mraz M., Svacina S., Haluzik M.: Diabetol. Metabol. Endokr. Výţiva 12, 71 (2009).

63

An Electrochemical Approach to Study Bis-coordinated Copper/Tebuconazole Complexes Elektrochemické přiblížení studia komplexů mědi s dvěma ligandy tebukonazolu Michal Jakl a, Jana Jaklová Dytrtová b, and Eva Čadková a a Czech University of Life Sciences, Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources, Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Kamýcká 129, 165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The stability and stoichiometry of leading complex in the model system of copper nitrate and tebuconazole (Teb) were evaluated. The successive formation constant for bis-coordinated Cu-Teb species (involved in peak with potential approx. -250 mV) was measured; β0 = 7.61±0.10. The pseudopolarographic measurement indicated the consecutive loss of NO3group and Cu reduction in more negative accumulation potentials. The structure of an original bis-coordinated species [Cu(II)NO3(Teb)2]+ was calculated. Key words: Pesticides, stability constant, stoichiometry, DPASV, pseudopolarography. Introduction Tebuconazole ((RS)-1-p-chlorophenyl-4,4-dimethyl-3-(1H-1,2,4-triazol-1-ylmethyl)-pentan3-ol; Fig. 1) is a systemic triazole fungicide, which inhibits ergosterol biosynthesis. It is used for controlling soil-borne and foliar fungal pathogens.

Fig. 1. Structure of tebuconazole (Teb). Copper-based fungicides are widely used inorganic pesticides. They can interact with other pesticides present in soils and thus influence their behaviour in the environment, i.e., accumulation in soils, degradation, mobility, stability, etc. 1, 2. Even though both fungicides are usually applied on plants, they can be transported to soil through washing-off or falling of plant material 3, which can subsequently cause risks for soil ecosystems, groundwater and surface water. It is evident, that triazol fungicides can create complexes with various metals, including Cu. E.g. 4, 5 reported an easy formation of Cu-Teb complexes, where copper is present in its divalent state. 1 showed penconazole ability to form penconazole-Cu complexes and pointed out their different behaviour in soil environment. Penconazole adsorption increased in the presence of Cu due to the formation of penconazoleCu complexes. The aim of the presented study is to investigate tebuconazole-copper interactions in solution using electrochemical methods. Utilization of these methods in environmental analysis belong to relatively frequent 6-9. Obtained results, in addition to other analytical methods, e.g. 10, can contribute to a better understanding of the behaviour of these pesticides in the environment and prevent the risks associated with their application.

64

Experimental The model solutions were prepared from 1g L-1 Cu(NO3)2 in 2% HNO3 solution (Suprapur®), tebuconazole (PESTANAL®; Fig. 1), HPLC-grade methanol (all Sigma-Aldrich, CR), and deionised water (>18MΩ). All tebuconazole solutions and mixtures were prepared immediately prior to analyses to prevent possible tebuconazole sorption and decomposition. The electrochemical measurements were carried out by means of computer controlled polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP (Polaro-Sensors, Prague, CR), equipped with MultiElchem v. 2.1 software (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Czech Republic) 11 and with POLAR.PRO software v. 5.1 (Polaro-Sensors, Prague, CR). The voltammograms were recorded using an assembly of three electrodes; a pen-type hanging mercury drop electrode (HMDE) (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic) as a working electrode, an Ag/AgCl/KClsat. (type 10-20+; ED, Turnov, CR) reference electrode, and a Pt-wire auxiliary electrode. The potential shifts between copper peak and tebuconazole/copper complex peak were obtained by the “titration” of the methanol/water (1:1 v/v) solution of 10-7 mol L-1 Cu(NO3)2 and indifferent base electrolyte 12 NaClO4 (0.1 mol L-1). The tebuconazole standard in methanol was added to the measured solution in small amounts, the concentration of copper and tebuconazole were corrected to increasing volume. From the potential shift were calculated number of ligands and stability constant 13, 14. Pseudopolarography was realized by substeps of the differential pulse anodic stripping voltammetry (DPASV) records, a mixture of Cu(NO3)2 (9.1∙10-8 mol L-1) and tebuconazole (9.1∙10-7 mol L-1) was used. The set of polarograms in different accumulation potential was used to the sample “fingerprint” and from the variation of peak current of the copper/tebuconazole complex a pseudopolarogram of the complex was provided. Results and discussion For the determination of stability constants of mostly present copper/tebuconazole complexes DPASV measurements with the addition of tebuconazole into copper solution were realized (Fig. 2). The study was focused on the complex with the most negative potential; the determination of other complexes was postponed owing to its bad reproducibility. In the first step, the number of ligands involved was graphically calculated from the potential shift of the copper peak to consecutive peak belonging to copper/tebuconazole complex (approx. -250 mV) according to Lingane equation 15. The number of ligands involved is given by the slope of linear dependence (Fig. 3a) of ΔEp∙nF/RT on ln[L], where potential shift ΔEp = ECuTeb – ECu, n is the number of electrons involved in reaction and [L] is the tebuconazole concentration in solution. The intercept of the curve represents the formation constant of the complexes. In the second step consecutive peak potentials (Ep)CuTeb and peak currents (Ip)CuTeb of the complex formed were used for the computation of particular values of F0. This polynomial function is calculated from the equation 16: nF E p

ln

I Cu

I CuT eb F0 e RT and represents the sum of successive formation constants (βx) for all complexes formed 13.

65

The successive formation constants βx of each complex formed can be determined by the plotting of the polynomial function F0 vs. [L] (Fig. 3b) and its regression analysis. The β0 was obtained from the curve intercept. 400

blank -1 0 mol L -8 -1 9.9 * 10 mol L -7 -1 2.0 * 10 mol L -7 -1 3.8 * 10 mol L -7 -1 5.7 * 10 mol L -7 -1 7.4 * 10 mol L -7 -1 9.1 * 10 mol L -6 -1 1.3 * 10 mol L -6 -1 1.7 * 10 mol L

i/nA

300

200

100

shift of the potential

0 -450

-300

-150

0

150

E/mV

24

11

22

10

F0

deltaE*nF/RT

Fig. 2. ASV voltammograms; Eacc = -800 mV, tacc = 10 s, polarization rate 10 mV s-1 of the solution consisted of Cu(NO3)2 10-7 mol L-1 as starting concentration and additions of tebuconazole in methanol/water mixture as a solvent; NaClO4 (0.1M) as a base electrolyte.

20

9

2

R = 0.9646 intercept = 7.61 ± 0.1

2

R = 0.9955 slope = 1.99 ± 0.03 8

18 7

-16

-15

-14

-13

ln[L]

0

-7

5x10

-6

-6

1x10

2x10

-6

2x10

[L]

Fig. 3. Graphical computation of (a) ligands number from the slope of the linear dependence of ΔE∙nF/RT on natural logarithm of tebuconazole concentration [L]. (b) β0 from the intercept of the dependence of F0 function on tebuconazole concentration [L]. Pseudopolarography may bring additional information about complexes formation. From the fingerprint of the Cu-Teb system (Fig. 4b) is disclosed that the most negative peak decays with the decreasing accumulation potential into two separated peak with the potential difference 70 mV. Additionally the proportionality of both peaks changes; in accumulation potential from -800 to -720 mV the more negative peak is higher, in potential -720 mV they are approximately with the same height and behind this accumulation potential the less negative peak increases comparing to the more negative one. This finding can be discussed with knowledge from collision induced experiments provided upon ESI 10. There was observed a cleavage of original Cu-Teb species [Cu(II)Cl(Teb)2] to [Cu(I)(Teb)2]+ and Claccompanied by Cu(II) reduction to Cu(I). There is an evidence of parallel; the complex observed in our system includes also 2 ligands of tebuconazole and the presumption of copper reduction is not negligible. The idea of copper reduction is likely supported by the reduction effect of triazole compounds 17 and it works via N in triazole ring. It is not clear if the copper 66

reduction in our system is likely given by the tebuconazole presence (one order of magnitude higher amount in the sample) or by the cleavage of NO3- group. But from the parallel with ESI experiments it is possible to estimate, that the most negative peak in stripping voltammogram (Fig. 2) represents two bis-coordinated species of Cu-Teb: [Cu(II)NO3(Teb)2]+ and [Cu(I)(Teb)2]+. Also, the accumulation potential more negative than 800 mV supports the reduction of copper, because the vast majority of bis-coordinated copper species can be observed by the signal of more negative peak (practically, in voltammogram is not visible any second peak). As is visible from Fig. 3a this peak includes more than one subspecies of [Cu(I)(Teb)2]+, this evidence is also supported by the pseudopolarogram of more negative peak (Fig. 4a). There two flex points can be clearly distinguished, IF1 = -737 mV and IF2 = -650 mV. They signify to following changes in complexes stoichiometry and oxidation state of copper (Fig. 5): the bis-coordinated Cu-Teb species is present in the solution as [Cu(II)NO3(Teb)2]+ while the inserted accumulation potential is less negative than -650 mV. Behind this potential the loss of NO3- group is preferred and behind the accumulation potential -737 mV the reduced form of copper in [Cu(I)(Teb)2]+ is observed. 40

40

(a)

(b)

10

IF1 = -737 mV

30 IF2 = -650 mV IF3 = -590 mV

-400 -400

-300

-200

-100

0

IF4 = -551 mV

25

ac

E

c

/m

V

0 -800

35 i/nA

20

i/nA

30

-900

E/mV

-800

-700 -600 Eacc/mV

-500

-400

Fig. 4. (a) “Fingerprint” of Cu-Teb system and (b) pseudopolarogram of the most negative peak.

Fig. 5. Designed scheme of changes in Cu-Teb speciation caused by inserted accumulation potential. Conclusion While the accumulation potential in the system Cu(NO3)2 and tebuconazole (Teb) is more negative than -800 mV, the species with the peak at approx. -250 mV, contains two ligands of tebuconazole and Cu(I): [Cu(I)(Teb)2]+. This complex has stability constant βx = 7.61 ± 0.10. However, it is not the original species of bis-coordinated Cu-Teb. By changing the accumulation potential in pseudopolarography it was elucidated that the original biscoordinated species of Cu-Teb is [Cu(II)NO3(Teb)2]+, which is converted to [Cu(I)(Teb)2]+ via loss of NO3- group and copper reduction to Cu(I) in accumulation potentials more negative than -737 mV.

67

Acknowledgement Financial support for these investigations was provided by the Czech University of Life Sciences Prague, project No. CIGA 1313/3102, and by the Ministry of Education, Youth and Sports, project No. MSM 6046070901. References 1. Arias M., Paradelo M., López E., Simal-Gándara J.: J. Agric. Food. Chem. 54, 8155 (2006). 2. Komárek M., Čadková E., Chrastný V., Bordas F., Bollinger J.-C.: Environ. Int. 36, 138 (2010). 3. Dinter A., Coulson M., Heimbach F., Keppler J., Krieg W., Kölzer U.: J. Soils Sed. 8, 333 (2008). 4. Zhang P.-Z., Wu J.: Acta Crystallographica Section E 61, m560 (2005). 5. Evans P. D., Schmalzl K. J., Forsyth C. M., Fallon G. D., Schmid S., Bendixen B., Heimdal S.: J. Wood Chem. Technol. 27, 243 (2007). 6. Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 7. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 8. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 9. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 10. Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Čadková E., Komárek M.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 25, 1037 (2011). 11. Navratil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009). 12. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Szakova J., Miholova D., Tlustos P.: Cent. Eur. J. Chem. 6, 71 (2008). 13. Luther G. W., Theberge S. M., Rickard D.: Talanta 51, 11 (2000). 14. Rahimi-Nasrabadi M., Ganjali M. R., Gholivand M. B., Ahmadi F., Norouzi P., SalavatiNiasari M.: J. Mol. Struct. 885, 76 (2008). 15. Lingane J. J.: Chem. Rev. 29, 1 (1941). 16. Heath G. A., Hefter G.: J. Electroanal. Chem. 84, 295 (1977). 17. Ciesielski M., Pufky D., Döring M.: Tetrahedron 61, 5942 (2005).

68

Ferrocene; a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray Ionization Mass Spectrometry Oxidace ferocenu; spojení voltametrie s hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprejem Jana Jaklová Dytrtová a, Michal Jakl b, and Detlef Schröder a a Institute of Organic Chemistry and Biochemistry of the AS CR, v.v.i., Flemingovo náměstí 2, 166 10 Prague 6, Czech Republic, [email protected] b Department of Agro-Environmental Chemistry and Plant Nutrition, Czech University of Life Sciences, Kamýcká 129, 165 21 Prague – Suchdol, Czech Republic Abstract The coupling of ESI-MS with two-electrodes flowing cell was provided and tested on ferrocene system. The oxidation potential of ferrocene was 430 mV in Pt/Ag electrode system. The bis-coordinated ferrocene complex with base electrolyte (NaClO4) was found using DPASV provided in different accumulation potentials and its analogy was also observed as protonated cation in mass spectra. The impact of inserted accumulation potential on mass spectra was also studied; the inserted potential changes the natural pattern of ferrocene. Key words: ESI-MS, DPASV, CV, Ferrocene, Base electrolyte. Introduction Utilization of electrochemical (EC) methods as well as ESI-MS in environmental analysis belong to relatively frequent 1-4. EC methods and electrospray process have similar basis. The ionization during the electrospray is provided via inserted high voltage. The coupling of electrochemistry prior mass spectrometer can provide 5 additional data for spectrometry and vice versa. Mostly it provides the investigation of kinetic properties of electrochemical reactions. The coupling of ESI-MS with EC has several restrictions 6-8. The goal of the study is to couple electrochemical cell prior mass spectrometer and to describe the impact 9 of the base electrolyte presence to ferrocene/ferricene system. Experimental The design of the cell (Fig. 1) was (inspired by 10) provided regarding to sample flow rate suitable for ESI-MS (0.5 mL h-1). The cell body was built from a peak cross (P-729 PEEK Cross 0.020” thru-hole with F-300 Fittings completed, Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science), with the sweep volume 0.72 µL. The sample inlet and outlet were via capillary PEEK Tubing 0.25 mm (Upchurch Scientific Rheodyne, IDEX Health & Science). The voltammetric cell works in two electrodes connection of computer controlled polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP, Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic), with 2.1 software (JH IPC, v.v.i., Czech Republic) 11 and POLAR.PRO software v. 5.1 (PolaroSensors, Prague, Czech Republic). Platinum wire (diameter 1 mm, Goodfellow) was used as working electrode (WE) and silver wire (diameter 1mm, Goodfellow) was used as reference electrode. The sample solution was prepared from ferrocene (10-4 mol L-1) and base electrolyte (NaClO4 and HClO4 12, in pure 99.98 % ethanol (all from Sigma-Aldrich). The concentration of base electrolyte was reduced (NaClO4 10-3 mol L-1 and HClO4 10-4 mol L-1) owing to compatibility with ESI-MS 10. Prior to measurement the sample was degassed using N2 and afterwards was

69

dosen continually (0.5 mL h-1) from a Hamilton syringe (Thermo Fisher) via syringe pump (KD Scientific, USA).

Fig. 1. (a) The design of voltammetric flow-cell and (b) detail of the peak cross used (http://www.idex-hs.com/); diameters in inches. For electrochemical oxidation/reduction of ferrocene/ferricene were used cyclic voltammetry records from -400 mV to +800 mV, the polarization rate was 10 mV s-1. Anodic stripping voltammetry was used to show the impact of inserted accumulation potential (-400, -300, 200, -100 and 0 mV) to ferrocene speciation visible in MS spectra, accumulation time was 120 s, polarization rate 10 mV s-1. The changes of ferrocene speciation during oxidation/reduction were recorded in MS spectra. The ESI-MS experiments were performed with a Finnigan LCQ Advantage ion-trap mass spectrometer (ThermoFinnigan, San Jose, CA, USA) fitted with an electrospray ionization source operated in positive and negative-ion mode 13. The sample solutions of ferrocene were introduced into the ESI source via a fused-silica capillary at a flow rate of 0.5 mL∙h-1. Nitrogen was used as the nebulizer gas. The operating conditions were set as follows: spray voltage 6.0 kV, capillary voltage 10 V and tube lens offset 20 V, heated capillary temperature 250°C, sheath gas flow rate, and auxiliary gas flow rate 10–50 arbitrary units. The ionization conditions in ESI are critically influenced by the settings of the capillary voltage and the tube lens offset. Results and discussion Fig. 2a shows cyclic voltammograms measured in flowing system and demonstrates good reproducibility of measurements. The oxidation potential of ferrocene was in the system PtAg in approx. 430 mV, the electrode surfaces were renewed by a reverse scan (not shown). The reduction peak is slightly visible and shifted owing to 0.5 mL h-1 sample flow rate 14. DPASV was conducted in different accumulation potentials (Fig. 2b). From stripping voltammogram can be seen that ferrocene creates complexes probably with base electrolyte (NaClO4), which can be seen also in MS spectra (Fig. 3). The number of sodium perchlorate ligands is 2 and the complex is protonated.

70

1000

500

400

(a)

(b)

1) oxidation 2) reduction

+430 mV

i/nA

i/nA

300 0

-400 -300 -200 -100 0 Eacc/mV

-500 Sample flow rate = 0.5 mL h -1 Scan rate = 10 mV s

-1000 -400

-200

0

200

400

600

-1

-200 800

0

200 400 E/mV

600

800

E/mV

Fig 2. (a) Cyclic voltammogram of ferrocene in flowing system to show the reproducibility of the measurements, (b) DPASV in different accumulation potentials. 6

3x10

6

inzenzity

2x10

185

Fe(C5H5)2

190

430

440 +

Fe(C5H5)2(NaClO4)2+H

6

1x10

0 150

400 m/z

450

Fig. 3. Positive mode ESI mass spectrum in the range from m/z 150 to 400 of an ethanol solution of ferrocene (10-4 mol L-1) and NaClO4 (10-3 mol L-1) and HClO4 (10-4 mol L-1). As an example, the insets on top shows the isotope pattern of ferrocene as well as the protonated ferrocene complex [Fe(C5H5)2 (NaClO4)2] + H+ on an expanded mass scale. The impact of accumulation potential held during 120 s in EC was expressed in the spectra as a change in natural pattern of ferrocene (Fig. 4). In on-line regime of cell the concentration of protonated ferrocene increased.

71

relative intensity

1

0 1

(a)

182

(c)

off-line

184

186

188

(b)

182

190 -400 mV

-200 mV

184

186

188

(d)

190 0 mV

0 182

184

186

188

190

182

184

186

188

190

m/z

Fig. 4. The impact of inserted accumulation potential (120 s) on positive mode ESI mass spectra in the range from m/z 181 to 191 of an ethanol solution of ferrocene (10-4 mol L-1) and NaClO4 (10-3 mol L-1) and HClO4 (10-4 mol L-1). (a) ferrocene pattern in off-line regime, without connection with the EC cell, (b) the cell was connected and accumulation potential was -400 mV, (c) the cell was connected and accumulation potential was -200 mV, (d) the cell was connected and accumulation potential was 0 mV. Conclusion The coupling between ESI-MS and EC has several restrictions resulting from the required presence of a base electrolyte (BE) used in most electrochemical methods and the minimal flow rate of the sample suitable for ESI-MS sampling. The decrease of BE electrolyte concentration within 2 orders of magnitude caused a decrease of electrochemical signal. The presence of base electrolyte also formed the bis-coordinated ferrocene complex with BE [Fe(C5H5)2(NaClO4)2] visible in ASV voltammogram as well as in MS spectra as protonated cation. The inserted potential into EC also influences MS, which can be demonstrated in changed pattern of ferrocene due to a protonated ferrocene income. Acknowledgements Financial support for these investigations was provided by the European Research Council (AdG HORIZOMS), by the Grant Agency of the Czech Republic (203/08/1487), and by the Czech Academy of Sciences (Z40550506). References 1. Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 2. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 3. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 4. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 72

5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14.

Jaklová Dytrtová J., Jakl M., Schröder D., Navrátil T.: Curr. Org. Chem. in press (2011). Ma L., Iezzi M., Kaucher M. S., Lam Y. F., Davis J. T.: J. Am. Chem. Soc. 128, 15269 (2006). Blades A. T., Ikonomou M. G., Kebarle P.: Anal. Chem. 63, 2109 (1991). Arakawa R., Abura T., Fukuo T., Horiguchi H., Matsubayashi G.-e.: Bull. Chem. Soc. Jpn. 72, 1519 (1999). Bond A. M., Colton R., D'Agostino A., Downard A. J., Traeger J. C.: Anal. Chem. 67, 1691 (1995). Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Schroder D.: Modern Electrochemical Methods XXX, (Eds: Navratil T., Jiri B.), p. 89, ://000283050900020 2010. Navrátil T., Yosypchuk B., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 54, 3 (2009). Bond A. M., McLennan E. A., Stojanovic R. S., Thomas F. G.: Anal. Chem. 59, 2853 (1987). 112, 12097 (2008). Masawat P., Liawruangrath S., Vaneesorn Y., Liawruangrath B.: Talanta 58, 1221 (2002).

73

Determination of Neutral Saccharides by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection (Stanovení sacharidů kapilární elektroforézou s bezkontaktní vodivostní detekcí) Klára Málková, Eva Samcová, and Petr Tůma Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic E-mail: [email protected] Abstract Capillary electrophoresis with contactless conductivity detection (C4D) was used for the determination of mono- and disaccharides. CE separation was successfully performed in NaOH solution of the concentration range 25 – 100 mmol/L, pH 12.5 – 12.9. The developed method is characterized by a separation time shorter than 2.5 min. and limit of detection 0.1 mg/L. The method was applied to the determination of saccharides in foods, drinks, and food additives. Key words: Capillary electrophoresis, Contactless conductivity detection, Saccharides. Úvod Sacharidy jsou polyhydroxysloučeniny obsahující v molekule karbonylovou skupinu (aldosy, ketosy) a jejich deriváty 1. Jde o všeobecně rozšířené látky. Jsou přítomny prakticky v kaţdé buňce. Jsou jedním z hlavních zdrojů energie organotrofních organismů a zdrojem uhlíku pro syntézu buněčných sloţek. Tvoří hlavní rezervní formu chemické energie. Některé polysacharidy jsou strukturními sloţkami buněk, tkání a pletiv. Jsou také součástí biologicky aktivních sloţek buňky, jako jsou nukleové kyseliny a kofaktory enzymů 2. Sacharidy, především glukóza, fruktóza a sacharóza, jsou přítomny v mnoha potravinách a nápojích. Velmi často se vyuţívají jako potravinářské přísady 3,4. Kvalitativní a kvantitativní analýza sacharidů má zásadní význam v potravinářské chemii a biochemii 5,6. Nejrozšířenější metodou stanovení monosacharidů a disacharidů je vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) ve spojení s refraktometrickou detekcí 4, 7. Nevýhodou této techniky je nízká citlivost, nekompatibilita s gradientovou elucí a kolísání základní linie detektoru v závislosti na teplotě. Vhodnou alternativou je pouţití detektoru rozptylu světla. Zvýšení citlivosti a separační selektivity lze také dosáhnout iontově výměnnou HPLC s pulzní ampérometrickou detekcí nebo fluorescenční detekcí7, která vyţaduje provádění časově náročné derivatizace vzorku. Další metodou uplatňující se při analýze sacharidů je plynová chromatografie (GC) často kombinovaná s hmotnostní detekcí (GC-MS) 3,8. V poslední době je pro analýzu neutrálních sacharidů stále více vyuţívána kapilární elektroforéza (CE). Výhody této techniky je především vysoká separační účinnost a minimální nároky na spotřebu vzorku 6. Sacharidy obsahují hydroxylové skupiny, které disociují aţ v silně alkalickém prostředí 8. Dalším principem elektroforetické analýzy je tvorba komplexů s kyselinou boritou a ionty kovů, které umoţňují provádět CE separace při niţších hodnotách pH. Problémem CE analýzy sacharidů je absence vhodných chromoforů, která omezuje vyuţití fotometrické detekce. Řešením je nepřímá UV detekce nebo provádění derivatizace sacharidů. Komplikací derivatizačních reakcí je rozdílná reaktivita jednotlivých sacharidů a tvorba různých stereoisomerů. Provádění derivatizace je navíc časově i finančně náročné 7. Dalšími vyuţívanými detekčními technikami jsou bezkontaktní vodivostní detekce (C4D) nebo hmotnostní detekce s ionizací vzorku elektrosprejem (MS-ESI) 3.

74

Experimentální čast Všechny pouţité chemikálie vykazovaly stupeň čistoty p. a.: glukóza (Sigma-Aldrich), fruktóza (Sigma-Aldrich), laktóza (Sigma-Aldrich), galaktóza (Sigma-Aldrich), manóza (Sigma-Aldrich), ribóza (Sigma-Adrich), sacharóza (Sigma-Aldrich), NaOH (Fluka), acetonitril (Fluka). Pro přípravu separačních elektrolytů a zásobních roztoků standardů byla pouţita deionizovaná voda (Millipore, Bedford, USA). pH bylo měřeno laboratorním pH metrem (pMX 3000, WTW, Německo). Všechna elektroforetická měření byla provedena na přístroji HP3D CE (Agilent Technologies, Waldbronn, Německo) vybaveném bezkontaktním vodivostním detektorem (C4D). C4D byl vyvinut a zkonstruován na Katedře fyzikální a makromolekulární chemie Přírodovědecké fakulty Univerzity Karlovi v Praze a pracuje při frekvenci 1,8 MHz. Detekční cela je umístěna v kazetě termostatované na 25°C. Přístroj pro CE i sběr dat je řízen softwarem ChemStation. Elektroforetické separace byly provedeny v křemenné kapiláře s vnější ochrannou vrstvou polyimidu o vnitřním průměru 5 m, vnějším průměru 360 m a celkové délce 33 cm, délka k detektoru byla 18 cm (Composite Metal Services, UK). Před prvním pouţitím byla kapilára promývána 0,1 M NaOH (10 min), poté deionizovanou vodou (10 min) a nakonec byla naplněna separačním elektrolytem. Separace byly prováděny při konstantním napětí +15 kV. Vzorky nápojů byly pro CE stanovení upraveny pouze zředěním vodou a acetonitrilem. Celkové zředění pro Coca-colu je 200násobné. 1 g jogurtu Jogobella byl rozpuštěn v 25 ml vody, zfiltrován a následně 10krát zředěn. 1 g pastovaného medu byl rozpuštěn v 50 ml vody, zfiltrován a následně 50krát zředěn. Vzorek mléka byl po 100násobném zředění zfiltrován. Obsah acetonitrilu ve vzorcích je 50 % v/v. Výsledky a diskuse K disociaci sacharidů dochází aţ v silně alkalickém prostředí. Pro CE stanovení byly testovány roztoky NaOH v koncentračním rozmezí 25–100 mmol/l. Se zvyšující se koncentrací NaOH rozlišení sacharidů postupně roste; např. rozlišení glukózy od zóny elektroneutrálních látek monotónně stoupá od hodnoty 3,8 (25 mM NaOH, pH 12,5) aţ k 13,4 (100 mM NaOH, pH 12,9). Zároveň byl sledován vliv koncentrace NaOH na účinnost elektroforetické separace. Účinnost separačního procesu charakterizována počtem teoretických pater (N) se téměř nemění. Pro glukózu dosahuje hodnot kolem 60 000. Elektroferogramy separace sacharidů v roztocích NaOH jsou znázorněny na obrázku 1. Disociované sacharidy poskytují v C4D záporné píky, coţ souvisí s niţší elektroforetickou pohyblivostí aniontů sacharidů v porovnání s koiontem separačního elektrolytu hydroxidovým aniontem. Při vyšších koncentracích NaOH je patrné zvlnění základní linie elektroferogramu, ke kterému dochází v důsledku zvýšeného uvolňování tepla. Odezva C4D na sacharidy vyjádřená jako výška píku je závislá na koncentraci separačního elektrolytu. Výška píku glukózy zpočátku se zvyšující se koncentrací NaOH roste. Při vyšších koncentracích se však růst zastavuje. Detektor totiţ zaznamenává změny mezi vodivostí zóny analytu a vodivostí okolního separačního elektrolytu. Při velmi vysokých hodnotách vodivosti separačního elektrolytu dochází k poklesu odezvy C4D aţ k nule, protoţe je zaznamenávána malá změna vodivosti odpovídající průchodu zóny analytu proti vysoké hladině základní linie detektoru. Jako optimální byla pro následné experimenty zvolena koncentrace 75 mM NaOH (pH 12,8).

75

Obr. 1. Elektroferogramy separace sacharidů: A - 25 mM NaOH (pH 12,5), B - 50 mM NaOH (pH 12,7), C - 60 mM NaOH (pH 12,75), D - 75 mM NaOH (pH 12,8), E - 90 mM NaOH (pH 12,85), F - 100 mM NaOH (pH 12,9). Identifikace píků A: 1 - zóna elektroneutrálních látek, 2 - laktóza + galaktóza, 3 - glukóza, 4 - fruktóza, 5 - ribóza. Identifikace píků B, C, D, E, F: 1 - zóna elektroneutrálních látek, 2 - sacharóza, 3 - laktóza, 4 - galaktóza, 5 - glukóza, 6 - fruktóza, 7 - ribóza. Experimentální podmínky: koncentrace glukózy 100 mg/l v 50% (v/v) acetonitrilu, hydrodynamické dávkování tlakem 50 mbar po dobu 80 s, separační napětí +15 kV. Po optimalizaci CE-C4D metody byla provedena její kalibrace. Získané kalibrační závislosti (Tabulka I) jsou lineární v celém testovaném rozsahu koncentrací. Hodnoty korelačních koeficientů (R) jsou velmi blízké 1. LOD vypočtené z výšky píku jako trojnásobek šumu detektoru se pohybují na submikromolární úrovni. Tabulka I Parametry lineárních regresních závislostí plochy píku na koncentraci sacharidu. byly získány ze čtyř různých koncentrací v rozmezí 25 aţ 250 mg.l-1. Látka Citlivost Úsek R LOD [mV.s.mg-1.l] [mV.s] [mg.l-1] [ Sacharóza 0,016 -0,197 0,9998 0,12 Laktóza 0,013 -0,066 1,0000 0,14 Glukóza 0,018 -0,051 0,9996 0,11 Galaktóza 0,018 -0,167 1,0000 0,11 Fruktóza 0,016 -0,197 0,9999 0,13 Mannóza 0,019 -0,002 0,9993 0,12

Parametry LOD mol.l-1] 0,4 0,4 0,6 0,6 0,7 0,6

Opakovatelnost metody byla testována pro 10 po sobě opakovaných analýz vzorku Coca-coly obsahující glukózu a fruktózu. Před kaţdým CE-C4D stanovením byl vzorek opakovaně zpracován. Získaná hodnota koeficientu variace je pro plochu píku glukózy 1,53% a fruktózy 1,57%. Výtěţnost metody byla testována pomocí metody standardního přídavku. Stanovená hodnota pro glukózu je 93,2% a fruktózu 96,7%. Vyvinutá metoda byla pouţita pro stanovení sacharidů v reálných vzorcích potravin a nápojů (obr. 2).

76

Obr. 2. Elektroferogramy vzorků potravin a nápojů: (A) med, 50krát ředěno, glukóza 41,5%, fruktóza 42,5%; (B) mléko, 100krát ředěno, laktóza 42 g.l-1; (C) Jogobella, 10krát ředěno, sacharóza 1,1 g.l-1, laktóza 1,1 g.l-1, galaktóza 0,3 g.l-1, glukóza 1,4 g.l-1, fruktóza 1,2 g.l-1; (D) Coca-cola, 200krát ředěno, sacharóza 38,1 g.l-1,glukóza 27,0 g.l-1, fruktóza 32,3 g.l-1. Identifikace píků a experimentální podmínky viz. obr. 1. Závěr Vyvinutá CE/C4D metoda umoţňuje provádět stanovení mono- a disacharidů v jejich nativní formě bez nutnosti derivatizace vzorku. Stanovení je velmi rychlé s dobou separace 2,5 min. a vyznačuje se minimálními poţadavky na úpravu vzorku. CE/C4D metoda je pouţitelná pro analýzu potravin, potravinových doplňků a nápojů. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (projekt P206/10/1231) a Ministerstva školství, mládeţe a tělovýchovy (výzkumný záměr MSM0021620814). Literatura 1. Kodíček M. Sacharidy. z Biochemické pojmy : výkladový slovník [online]. Praha: VŠCHT Praha, 2007.. Downloaded: 20.3.2011. 2. Vodráţka Z.: Biochemie. 2. oprav. vyd. Praha, Academia 2002. 3. Rovio S., Yli-Kauhaluoma J., Sirén H.: Electrophoresis 28, 3129 (2007). 4. Soga T., Serwe M.: Food Chem. 69, 339 (2000). 5. You J., Sheng X., Ding Ch., Sun Z., Suo Y., Wang H., Li Y.: Anal. Chim. Acta 609, 66 (2008). 6. Carvalho A.Z., da Silva J. A. F., do Lago C. L.: Electrophoresis 24, 2138 (2003). 7. Alekseeva A. V., Kartsova L. A., Kazachishcheva N. V.: J. Anal. Chem. 65, 202 (2010). 8. Rovio S., Simolin H., Koljonen K., Sirén H.: J. Chromatogr. A 1185, 139 (2008).

77

Electroanalysis with Phthalocyanine Modified HOPG Electrodes Věra Mansfeldová a, b, and Pavel Janda a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry ASCR, v. v. i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, e-mail: [email protected] b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Hlavova 8, 128 43 Prague 2, Czech Republic Abstract In this paper, we present modification of highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) by two different phthalocyanine (Pc) derivatives and two diferent deposition techniques. We have investigated electrode modified by fullerene-derived phthalocyanine and cobalt tetraneopentoxyphthalocyanine (CoTNPc) to consider how diferent modification procedure-electrodeposition and drop evaporation and composition of phthalocyanine influences detection of model compound, L-cysteine. Keywords: phthalocyanines, cyclic voltammetry, fullerene, carbon electrode, surface modification. Introduction Basal plane of highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) has smooth and very well-defined surface which is cleaned only by adhesive tape. Two procedures frequently employed for modification of glassy carbon we have used for preparation phthalocyanine HOPG electrodes. 1) Placing drop of solution containing studied compound on the carbon surface and subsequently drying 2.

1

2) Electrodeposition from solution containing studied compound and the electrolyte. The deposition is carried out by applying repetitive potential sweeps at certain rate in specific potential range 3. Nowadays the compound named phthalocyanine does not mean only dye, but also it represents large group of compounds with various properties and utilizations. Phthalocyanines as redox systems undergo redox reaction either on central metal atom or ligand. Electrodes modified by phthalocyanines have been studied in numerous electroanalytic and electrocatalytic applications such as in O2 reduction 4, cysteine 5 oxidation etc. Kobayashi 6 synthesized new phthalocyanine utilizing covalently bonded fullerene C60 molecule as an excellent electron acceptor attached to Pc ring. Experimental section Reagents Nickel hexabutyloxy phthalocyanine–C60 (NiHBPc–C60) and cobalt tetraneopentoxy phthalocyanine (CoTNPc) (Fig. 1) were synthesized in the laboratory of Tohoku University, Japan, by Kobayashi‟s group. Tetrabutylammonium perchlorate (TBAP, electrochemical grade, 98%, Fluka) and nonaqueous solvent 1,2-dichlorobenzene (o-DCB, 99%, Aldrich) were used as received. The stock solution (c = 1×10-2 mol.L-1) of L-cysteine hydrochloride (p.a., Lachema) was prepared by dissolving the exact amount of the substance in borate buffer pH = 10. Purified water (Milli-Q system Gradient, Millipore, resistivity 18.2 MΩcm) was used for preparation of aqueous electrolytes.

78

OBu

BuO

BuO

OCH 2C(CH3)3 OBu

N

(H3C)3CH2CO

N

N Ni

N

N

Co

N

N

N

N

N

N

N

N N

N

OBu

N

OCH 2C(CH3)3

OBu

(H3C)3CH2CO

Fig. 1. Nickel phthalocyanine [B].

A hexabutyloxyphthalocyanine-C60

[A]

and

B cobalt

tetraneopentoxy-

Electrode preparation and electrochemical measurements Basal plane of highly oriented pyrolytic graphite (HOPG) 12 mm×12 mm×2 mm (SPI Supplies, USA) was pealed off with an adhesive tape before each experiment. The fresh surface of HOPG was treated by two ways: 1) One drop of 1 mM phthalocyanine in o-DCB was placed on HOPG and dried at room temperature. 2) Cyclic voltammetry of 1 mM phthalocyanine in o-DCB with 0.1 M TBAP was performed on the electrode at scan rate 100 mV.s-1 and dried at room temperature. The voltammetric measurements were carried out with the potentiostat/galvanostat Wenking POS 2 (Bank Elektronik, Germany) controlled by the CPC-DA software (Bank Elektronik, Germany). A three-electrode system with saturated calomel reference electrode (SCE) and platinum wire auxiliary electrode were used for all measurements. For electrodeposition in nonaqueous media silver wire (Ag) as a quasi-reference electrode was used. All experiments were performed at room temperature in solution deoxygenated by bubbling with argon for five minutes. Stock solutions were kept in glass vessels in dark at laboratory temperature. Stock solutions of L-cysteine were prepared fresh before every measurement. The voltammetric measurements were carried out at scan rate 10 mV.s-1. The pH values were measured using pH meter (Jenway 3510, UK). Results and discussion The following sections describe influence of modification procedure and composition of phthalocyanines used. We have already published results 7 how CoTNPc drop evaporation and electrodeposition respectively affected detection of L-cysteine. Electrodes modified with new type of phthalocyanine NiHBPc–C60 was utilized in identical modification procedures and experimental conditions, respectively. This comparison indicates that the electrode with electrodeposited NiHBPc–C60 exhibits about three times higher current response to L-cysteine than HOPG with electrodeposited CoTNPc (Fig. 2).

79

8

8

6

6

4

4

2

2

0

I [ A]

I [ A]

0

-2

-2

-4

-4

-6

-6

-8 -1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

-8 -1,2

1,2

-0,8

-0,4

E [V]

0,0

0,4

0,8

1,2

E [V]

A B Fig. 2. Cyclic voltammograms of 0.01 M L-cysteine hydrochloride in borate buffer pH = 10. Concentration of cysteine hydrochloride = 0.0 mol.L-1 (–––), 8.3×10-4 mol.L-1 (----). Working electrode: HOPG surface after cyclic voltammetry in 1 mM NiHBPc–C60 and 0.1M TBAClO4 dissolved in o-DCB and dried (A); after cyclic voltammetry in 1 mM CoTNPc and 0.1M TBAClO4 dissolved in o-DCB and dried (B). Reference electrode SCE, scan rate = 10 mV.s-1.

8

8

2

3 6

6

3 4

4

2

I [ A]

I [ A]

2

2

1

1 0

0

-2

-2

-1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

-1,2

1,2

-0,8

-0,4

0,0

0,4

0,8

1,2

E [V]

E [V]

A B Fig. 3. Cyclic voltammograms of 0.01 M L-cysteine hydrochloride in borate buffer pH = 10. Concentration of cysteine hydrochloride = 0.0 mol.L-1 (1), 8.3×10-4 mol.L-1 first scan (2) and second scan (3). Working electrode: HOPG surface after modification by drop of 1 mM NiHBPc–C60 dissolved in o-DCB and dried in air (A); after cyclic voltammetry in 1 mM NiHBPc–C60 and 0.1M TBAClO4 dissolved in o-DCB and dried in air (B). Reference electrode SCE, scan rate = 10 mV.s-1. To find how electrode preparation procedure influences NiHBPc–C60 electrochemical processes, we compared drop evaporation and electrodeposition, respectively. In contrast to CoTNPc, NiHBPc–C60–modified electrode showed differences in detection of model

80

analyte, L-cysteine hydrochloride. The difference between cyclic voltammograms acquired using the NiHBPc–C60–modified electrode prepared by electrodeposition and by drop deposition is illustrated in Fig. 3. Electrodeposited electrode showed longer response time to equal addition of L-cysteine in comparison with drop deposited electrode which reaction was immediate. The decrease of peak current in subsequent scans can be explained by analyte depletion in the electrode vicinity. Although detection time response is different in both cases of modification by NiHBPc–C60, maximum values of current for the same addition of L-cysteine are comparable. Electrode modified by electrodeposited CoTNPc showed about half of the current found in the case of drop evaporation technique 7. The fact, that fullerene-derived phthalocyanine molecule can serve as an electron carrier even in compact electrodeposited layer can explain this behavior. Conclusion Although electrodeposition can create more uniform layer than drop-evaporation, we have found that modification procedure has to be chosen with respect to specific phthalocyanine. CoTNPc-modified electrode yielded lower current response to L-cysteine in case of electrodeposited compared to drop-evaporated mediator. Electrode modified by fullerene-derived phthalocyanine has different current transient but final magnitude of current response is almost similar in both cases of modification. Acknowledgements We are grateful to N. Kobayashi, Tohoku University, Japan for supplying phthalocyanines used in this work. We acknowledge the financial support by the Grant Agency of Charles University in Prague (the project SVV 261204), and by the research project MSM0021620857, the development project RP 14/63 of the Ministry of Education Youth and Sports of the Czech Republic. Literature 1. Obirai J. C., Nyokong T.: J. Electroanal. Chem. 600, 251 (2007). 2. Santos W. J. R., Sousa A. L., Luz R. C. S., Damos F. S., Kubota L. T., Tanaka A. A., Tanaka S. M. C. N.: Talanta 70, 588 (2006). 3. Guan J., Wang Z., Wang Ch., Qu Q., Yang G., Hu X.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 572 (2007). 4. Janda P., Kobayashi N., Auburn P. R., Lam. H., Leznoff C. C., Lever A. B. P.: Can. J. Chem. 67, 1109 (1989). 5. Maree S., Nyokong T.: J. Electroanal. Chem. 492, 120 (2000). 6. Fukuda T., Masuda S., Kobayashi N.: J. Am. Chem. Soc. 129, 5472 (2007). 7. Hudská V., Janda P., Tarábková H.: Electrochemical Sensor: Mediator Deposition by Drop Evaporation, In: Proceedings of 6th ISIC Modern Analytical Chemistry, Nesměrák K. (Ed.), Charles University, Faculty of Science, Prague 2010. p. 104.

81

Amperometric Ethanol Detection Using FIA and Screen-Printed Carbon Electrodes Modified with Metal Oxides (Amperometrická detekce ethanolu ve FIA na uhlíkových tištěných elektrodách modifikovaných oxidy kovů) Radovan Metelka, and Dana Jirkovská University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Ethanol was electrochemically detected at screen-printed carbon electrodes modified with various metal oxides using FIA and thin-layer flow cell. Unlike other already published procedures of direct ethanol oxidation, which require highly acidic or alkaline media, the proposed technique was performed in mild conditions exploiting electrocatalytic properties of metal oxides. Electrodes modified with platinum(IV) oxide (5 % w/w) showed the highest amperometric response to ethanol injection at -0,3 V vs. Ag/AgCl in 0.1 M phosphate buffer (pH 7). Optimal experimental parameters and influence of interfering species were then ascertained for FIA assay of ethanol in model samples. Key words: Ethanol, FIA, Amperometric detection, Screen-printed carbon electrodes, Platinum(IV) oxide. Úvod Určení obsahu ethanolu je důleţitý parametr při analýzách vzorků v potravinářském průmyslu, medicíně a při bezpečnostních kontrolách řidičů. Pro rutinní stanovení většího mnoţství vzorků lze vyuţít např. kapalinovou nebo plynovou chromatografii či infračervenou nebo hmotnostní spektrometrii. Tyto instrumentálně náročné techniky však nejsou vhodné pro jednoduché a cenově nenáročné analýzy mimo laboratoř. V těchto případech představuje elektrochemický způsob stanovení, zvláště pak s vyuţitím enzymových biosenzorů, výhodnou alternativu. V amperometrických biosenzorech pro ethanol se nejčastěji pouţívá enzym alkohol dehydrogenáza (ADH) 1 nebo alkohol oxidáza (AOx) 2. Stanovení je dostatečně selektivní a přesné, avšak samotné biosenzory mají většinou krátkou dobu pouţitelnosti a jejich odezva není stálá v čase. Při pouţití ADH je rovněţ nutná přítomnost vhodného kofaktoru, eventuelně mediátoru elektronového přenosu, čímţ se konstrukce senzoru komplikuje. Další moţností je vyuţít elektrokatalytickou oxidaci ethanolu na různých elektrodových materiálech buď přímo vyvíjených za tímto účelem nebo přejatých z prací zabývajících se elektrosyntézou 3. Byly popsány různé amperometrické senzory pro stanovení ethanolu např. na elektrodách ze směsných oxidů Co a Ni 3, Pt/WO3 4, RuO2 5, Cu 6, či materiálů na bázi Ni 7-9. Kromě analýzy kapalin lze tento typ senzorů pouţít i pro sledování obsahu ethanolu v plynné fázi. Tento příspěvek se zabývá charakterizací uhlíkových tištěných elektrod (SPCE) modifikovaných vybranými oxidy kovů jako levných čidel pro amperometrickou detekci ethanolu ve FIA. Elektrokatalyzátor rozptýlený v tenké vrstvě tištěné elektrody má zásadní vliv na velikost proudové odezvy pozorované v přítomnosti ethanolu. Byly zjišťovány optimální experimentální parametry amperometrické detekce v průtokovém uspořádání a vliv potenciálně rušivých látek. Experimentální část Příprava modifikovaných uhlíkových tištěných elektrod

82

Do uhlíkové tiskové pasty (typ C2050106D7, Gwent Electronics Materials, Velká Británie) byl přimíchán oxid kovu (5 %, Acros Organics, Belgie) a celá směs byla homogenizována 20 min za občasného působení ultrazvuku. Tisk elektrod byl proveden na keramické substráty (typ CLS 641000396R, Coors Ceramics, USA) pomocí poloautomatického tiskového stroje UL 1505 A (Tesla, Česká republika). Vytvořená vrstva byla poté vytvrzena několik hodin při pokojové teplotě. Elektrochemická detekce ethanolu Pro průtokovou injekční analýzu s amperometrickou detekcí byla pouţita peristaltická pumpa Minipuls3 (Gilson, Francie), injekční ventil (typ D, Ecom, Česká republika) a tenkovrstvá průtoková cela z nerezové oceli (MF-1092, BASi, USA), plnící zároveň funkci pomocné elektrody, spolu s Ag/AgCl referentní elektrodou (RE-6, BASi, USA). Jednotlivé komponenty byly propojeny PEEK kapilárou s vnitřním průměrem 0,5 mm. Cyklické voltamogramy byly měřeny na elektrochemickém analyzátoru BAS 100B/W s drátkovou Pt pomocnou a Ag/AgCl referentní elektrodou (vše BASi, USA). Výsledky a diskuse Uhlíkové tištěné elektrody modifikované některými oxidy platinových kovů byly pouţity pro amperometrické sledování oxidace ethanolu v průtokovém uspořádání. Na rozdíl od dosud publikovaných postupů, vyuţívajících buď silně kyselé 5, nebo naopak zásadité prostředí 3 podle pouţitého elektrodového materiálu, bylo moţné pozorovat amperometrickou odezvu po nadávkování ethanolu do FIA systému i v prostředí 0,1 M fosforečnanového pufru (pH 7). Nejvyšší proudové signály byly registrovány při pouţití SPCE modifikované PtO 2 a potenciálu detekce -0,3 V vs. Ag/AgCl (Obr. 1). Na cyklických voltamogramech pufru s přídavkem ethanolu, zaznamenaných při různých rychlostech polarizace elektrody, byl rovněţ patrný nárůst anodických proudů v širokém rozmezí potenciálů oproti měření v čistém pufru.

Obr. 1. Proudové odezvy 0,1 % hm. ethanolu na modifikovaných SPCE (5 % modifikátoru). FIA, 0,1 M fosforečnanový pufr (pH 7), průtok 1 ml min–1, nástřik 100 µl. Byly optimalizovány experimentální parametry detekce ethanolu pomocí FIA. Při průtoku nosného roztoku vyšším neţ 1 ml min–1 nebylo pozorováno ţádné další zvýšení proudových

83

signálů ani zlepšení tvaru píků. Změnou pH fosforečnanového pufru v rozmezí 5,5 – 8,3 docházelo ke sniţování velikosti signálů vzorku směrem ke krajním hodnotám intervalu. Objem nástřiku 100 µl byl zvolen jako kompromis s ohledem na velikost signálu a dobu analýzy. Z opakovaných nástřiků vzorku je vidět, ţe pasivace pracovní elektrody oxidačními produkty se v průtočném uspořádání příliš neprojevuje (Obr. 2). Pro analytické účely je vhodné v případě FIA s amperometrickou detekcí pracovat při potenciálech kolem 0 V vs. Ag/AgCl pro omezení moţného rušivého vlivu dalších elektroaktivních látek, přítomných v matrici vzorku. Modifikované SPCE poskytují i za takových podmínek a v pouţitém uspořádání dostatečnou proudovou odezvu na přítomnost ethanolu (Obr. 2). Při tomto potenciálu byly následně zjišťovány interference nízkomolekulárních alkoholů, cukrů, kyseliny askorbové, mléčné a močové. Stanovení nejvíce ruší kyselina askorbová a mléčná, cukry a další alkoholy poskytují mírnou odezvu. S vyuţitím FIA lze za výše uvedených podmínek kvantifikovat obsah ethanolu minimálně v řádu setin hmotnostních procent, tj. desetin promile, v modelových vzorcích.

Obr. 2. Amperometrická detekce 0,1 % hm. ethanolu na SPCE s 5 % PtO2. FIA, 0,1 M fosforečnanový pufr (pH 7), potenciál detekce 0 V vs. Ag/AgCl, průtok 1 ml min–1, nástřik 100 µl. Závěr Přídavek některých oxidů kovů do materiálu uhlíkové tištěné elektrody několikanásobně zvyšuje elektrokatalytickou účinnost takto připraveného senzoru a umoţňuje sledovat malá mnoţství elektroaktivních látek. Elektrodu modifikovanou PtO2 bylo moţné vyuţít pro amperometrické sledování přítomnosti ethanolu bez nutnosti pouţít silně kyselé nebo zásadité prostředí a při potenciálech detekce kolem 0 V vs. Ag/AgCl. Aplikační moţnosti výše uvedeného senzoru budou testovány v navazujících experimentech. Poděkování Příspěvek vznikl za podpory Ministerstva školství, mládeţe a tělovýchovy České republiky (projekty č. MSM0021627502 a LC06035).

84

Literatura 1. Sprules S. D., Hartley I. C., Wedge R., Hart J. P., Pittson R.: Anal. Chim. Acta 329, 215 (1996). 2. Vijayakumar A. R., Csoregi E., Heller A., Gorton L.: Anal. Chim. Acta 327, 223 (1996). 3. Hayes E. T., Bellingham B. K., Mark H. B., Galal A.: Electrochim. Acta 41, 337 (1996). 4. Chen Y., Chen K. Y., Tseung A. C. C.: J. Electroanal. Chem. 471, 151 (1999). 5. Cataldi T. R. I., Centonze D., Desimoni E., Forastiero V.: Anal. Chim. Acta 310, 257 (1995). 6. Paixão T. R. L. C., Corbo D., Bertotti M.: Anal. Chim. Acta 472, 123 (2002). 7. Pang C.-C., Chen M.-H., Lin T.-Y., Chou T.-C.: Sensor. Actuat. B-Chem. 73, 221 (2001). 8. Weng Y.-C., Rick J. F., Chou T.-C.: Biosens. Bioelectron. 20, 41 (2004). 9. Chen Y.-S., Huang J.-H.: Biosens. Bioelectron. 26, 207 (2010).

85

Amperometric Solid–State NO2 Sensor with Ionic Liquid–Polymer Electrolyte (Amperometrický solid-state NO2 sensor s elektrolytem na bázi polymeru a iontové kapaliny) Martina Nádherná a, František Opekar a, and Jakub Reiter b a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 6, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected], [email protected] b Institute of Inorganic Chemistry of ASCR, v.v.i., 250 68 Husinec–Řeţ, Czech Republic Abstract A new ionic liquid-polymer electrolyte was successfully tested in the planar amperometric solid-state sensor sensitive towards nitrogen dioxide. The electrolyte consists of 1-butyl-3methylimidazolium hexafluorophosphate (BMIPF6) and poly(ethylene glycol) methyl ether methacrylate (PEGMEMA) in the ratio 57:43 mol. %. The analyte, gaseous nitrogen dioxide in air, was determined using the electrochemical reduction at −900 mV vs. Pt/air on gold minigrid indicating electrode with Pt/air as a reference electrode. Dependency of sensor sensitivity on the indicating electrode area and relative humidity was determined. The sensor response is linear in the NO2 concentration range 0.3 – 1.1 ppm and is reproducible and longterm stable. Key words: Sensor, Ionic Liquid, Nitrogen Dioxide, Gold Minigrid. Úvod Koncentrace oxidu dusičitého, agresivního a jedovatého plynu, ve vzduchu je jedním z nejdůleţitějších sledovaných parametrů znečištění ţivotního prostředí. Byla vyvinuta celá řada elektrochemických sensorů pro detekci plynů. Jeden ze známých typů sensorů plynů je Clarkův sensor. Sensory s kapalným elektrolytem mají ale nevýhodu v obtíţné, ne-li nemoţné miniaturizaci, malé robustnosti a v neposlední řadě je zde problém s vypařováním elektrolytu. Řešení tohoto problému je v pouţití solid-state elektrolytů s dobrou iontovou vodivostí. Jako pevný elektrolyt byl v sensorech pouţit např. jodid stříbrný, fosforečnan zirkoničitý a další anorganické materiály 1, 2, 3. V některých případech musí být jejich nízká vodivost zvýšena zahřátím na vyšší pracovní teplotu. Velký pokrok v analytických měřeních byl učiněn vývojem polymerních elektrolytů 4, 5. Nejpouţívanější polymer v amperometrických sensorech plynů je Nafion – kopolymer polytetrafluoroethylenu a sulfonylfluorid vinyl etheru od firmy DuPont (USA) 6, 7, 8, 9. Elektrolyt je značně hydrofilní a proto jeho geometrický rozměr a elektrické vlastnosti jsou výrazně závislé na mnoţství vody obsaţené uvnitř polymeru měnící se s relativní vlhkostí okolního prostředí 9, 10, 11. Jiné polymery s iontovou vodivostí jsou pouţívány v amperometrických sensorech jen zřídka 12, 13, 14. Vyloučení makroskopické kapalné fáze a zachování dobré iontové vodivosti je v dalším typu elektrolytů, kde kapalná fáze je ukotvena v polymerní matrici, ať jiţ se jedná o různé binární (polymer-sůl) nebo ternární systémy (polymer-rozpouštědlo-sůl) 9, 15, 16, 17, 18. V posledních letech vzrůstá zájem o iontové kapaliny v různých odvětvích chemie, díky jejich výborným vlastnostem jako je dobrá iontová vodivost jiţ při laboratorní teplotě, nízká tense par, netěkavost, nízká toxicita a nebezpečnost pro ţivotní prostředí. Tyto vlastnosti jsou výhodné i pro elektrolyt do elektrochemických sensorů 19, 20. V těchto sensorech slouţí

86

iontová kapalina obvykle jako elektrolyt a eliminuje pouţití permeabilní membrány pro plyn. Pro lepší manipulovatelnost se sensorem byla pro kyslíkový sensor imobilizována iontová kapalina EMIBF4 do porézní polyethylenové membrány 21. Naše poslední práce se zaměřuje na vývoj a charakterizaci nového typu elektrolytu pro amperometrický sensor detekující NO2. Jedná se o binární systém polymer-iontová kapalina, v němţ je iontová kapalina ukotvena jiţ při samotné polymerizaci. Tento elektrolyt spojuje výhody iontových kapalin a imobilizovaných kapalných fází v polymerní síti. Princip detekce je zaloţen na měření proudu generovaného při elektrochemické redukci NO2 na pracovní elektrodě. Obecná rovnice redukce 9, 22, 23, 24, 25 NO2 je: NO2 + 2 H+ + 2 e− → NO + H2O (1) Experimentální část Polymerní elektrolyty byly připraveny přímou radikálovou polymerizací výchozí směsi 16, 17, 26 sloţené z makromonomeru – poly(ethylenglykol) methyl ether methakrylát (PEGMEMA; Mn 300; Sigma-Aldrich), iontové kapaliny – tetrafluoroboritan 1-ethyl-3methylimidazolia (EMIBF4) nebo bis(trifluoromethylsulfonyl)imid 1-ethyl-326 methylimidazolia (EMITFSI) (obě připravené dle ), síťovacího činidla – poly(ethylenglykol) dimethakrylát (PEGDMA; Mn 330; 0,3 mol.% monomeru) a iniciátoru polymerizace 2,2‟azo-bis(isobutyronitril) (AIBN; Sigma-Aldrich; rekrystalizovaný z acetonu; 1 mol.% monomeru). Dále jsme připravili elektrolyt obsahující navíc kyselinu methakrylovou (MA; Sigma-Aldrich) pro zvýšení protonové vodivosti (viz Tabulka I). Polymerizace probíhala při 80°C po dobu 150 minut. Vzorky pro základní elektrochemickou charakterizaci byly připraveny v cele sloţené z polypropylenové destičky, ze silikonového distančního rámečku a skleněné destičky. Vlastní sensor byl konstruován dle 13, 27. Ve tříelektrodovém uspořádání byla jako indikační elektroda pouţita zlatá minisíťka (Goodfellow, United Kingdom), jako pomocná a pseudoreferentní (Pt/air) elektroda slouţila platinová plocha. Vzduch byl do zařízení vháněn membránovou pumpou (Cole-Palmer, USA) a rozdělěn do dvou proudů – hlavní a referenční. Hlavní proud vzduchu procházel kolem permeační trubičky s analytem (Vici AG International, USA) – NO2 (produkce 148 ng.min−1 ± 2 %), nebo s případnými interferenty, SO2 (produkce 270 ng.min−1 ± 25 %) nebo H2S (produkce 160 ng.min−1 ± 25 %). Poţadovaná koncentrace analytu byla získána změnou rychlosti proudu vzduchu kolem permeační trubičky. Pro účely sledování vlivu relativní vlhkosti na signál sensoru, oba proudy vzduchu byly zvlhčovány průchodem dvěma lahvemi naplněnými nasyceným roztokem soli, LiCl (RH 12%), MgCl (RH 33%), Mg(NO3)2 (RH 54%) nebo NaCl (RH 75%), poskytující stabilní a reprodukovatelnou relativní vlhkost (RH). Sensor byl umístěn do skleněné komůrky o objemu 8 cm3. Měření bylo prováděno za laboratorní teploty při průtoku vzduchu 1 ml.s−1. Pro konstrukci potenciostatu a měřidla proudu byly pouţity operační zesilovače. Výsledky a diskuse První část našeho výzkumu se zaměřila na přípravu a charakterizaci nových elektrolytů na bázi methakrylátů s iontovými kapalinami. Následně byli nejvhodnější kandidáti otestováni jako součást miniaturizovaného sensoru pro NO2. Impedančním měřením byla zjištěna iontová vodivost polymerních elektrolytů s iontovou kapalinou pro PEGMEMA-BMIPF6 (1,6 . 10−4 S.cm−1 při 20°C) pro PEGMEMA-EMITFSI (2,0 . 10−3 S.cm−1 při 25°C) a pro PEGMEMA-EMITFSI-MA (2,0 . 10−3 S.cm−1 při 25°C). Elektrochemická stabilita elektrolytu je dána hlavně přítomností iontové kapaliny, která

87

vykazuje obecně vyšší stabilitu neţ vodné elektrolyty. Elektrochemická stabilita elektrolytu PEGMEMA-BMIPF6 byla studována pomocí lineární voltametrie (LSV) na zlaté elektrodě a cyklické voltametrie (CV) na elektrodě ze skelného uhlíku. Obě měření ukazují katodickou stabilitu do –1,8V, v uspořádání pouţitém z našeho dřívějšího výzkumu 26. Anodická stabilita tohoto elektrolytu přesahuje 2,2 V vs. Cd/Cd2+, kdy limitujícím faktorem je stabilita aniontu. Další významnou výhodou binárního systému polymer-iontová kapalina je vyšší tepelná stabilita díky absenci těkavého a často hořlavého organického rozpouštědla. Námi připravený elektrolyt PEGMEMA-BMIPF6 vykazuje teplotní stálost aţ do 230°C, u ostatních elektrolytů je tepelná stálost obdobná. Prvním krokem při testování elektrolytu v sensoru bylo zjištění optimálního pracovního potenciálu. Pomocí steady-state polarizační křivky redukce oxidu dusičitého na indikační elektrodě při relativní vlhkosti 54% byl nalezen optimální pracovní potenciál sensoru při –0,9 V vs. Pt/air. Tento potenciál byl vyuţit pro další měření. Tabulka I. Základní charakteristiky testovaných sensorů. Sensor Geometrická Poměr Citlivost při plocha p2/A 54% RH, nA elektrody, ppm−1 mm2 S1

7,54

S2

4 . 105

Úsek nA

Sloţení elektrolytu

72,3 ± 1,6

−5,9 ± 1,1

16,37

8 . 10

5

345,4 ± 24,8

*)

S3

33,21

2 . 106

439,0 ± 21,1

*)

S4

104,95

5 . 106

850,7 ± 32,2

*)

S5

17,85

9 . 105

188,8 ± 6,2

−7,6 ± 4,2

PEGMEMA-EMITFSI

S6

19,95

1 . 106

176,4 ± 2,9

*)

PEGMEMA-EMITFSI-MA

PEGMEMA-BMIPF6

*) Nulová hodnota leţí v intervalu spolehlivosti úseku. Pro sensory uvedené v Tabulce I byla nalezena lineární koncentrační závislost signálu v rozsahu koncentrací NO2 0,3 – 1,1 ppm. Kalibrační křivka, rov. (2), získaná ze 6 bodů (kaţdý je průměrem ze 6 měření) pro sensor S3: I = 439,0 c(NO2), (2) −1 kde I je proud v nA a c(NO2) koncentrace v ppm (1 ppm = 1,848 ng.ml ). Průměrný signál šumu byl 1,3 . 10−3 μA. Z trojnásobku této hodnoty a pouţitím rovnice (2) byl určen limit detekce 0,01 ppm. Pro zjištění vlivu velikosti třífázového rozhraní pracovní elektrody na signál byly sestaveny 4 sensory s různou geometrickou plochou minisíťky a stejným elektrolytem. Zvýšení poměru p2/A (p délka třífázového rozhraní (mm), A geometrická plocha elektrody exponovaná analytu (mm2)) z 4 . 105 na 5 . 106 vedlo ke zvýšení citlivosti sensoru o jeden řád, ne však lineárně jak by se podle teorie souboru páskových mikroelektrod dalo očekávat 28. Ukázalo se, ţe citlivost je ovlivňována relativní vlhkostí testovaného plynu, přičemţ stupeň ovlivnění se mění s plochou elektrody. Závislost citlivosti detekce na geometrické ploše elektrody p2/A měřená při různých relativních vlhkostech je na (Obr. 1). Závislost lze povaţovat za přímo úměrnou celkové ploše elektrody pro všechny testované sensory pouze při detekci v plynu o nejvyšší

88

testované vlhkosti. Při niţších vlhkostech dochází k poklesu citlivosti tím více, čím je plocha elektrody větší a vlhkost menší. Uvedené závislosti lze vysvětlit na základě obecně přijímaného mechanismu redukce NO2 na zlaté elektrodě 22, 23, 24, 25. Celkovou reakci redukce NO2 lze popsat rovnicí (1). Potřebné protony jsou produkovány na pomocné elektrodě oxidací vody, rovnice (3). H2O  2H+ + 2e− + 1/2O2. (3) Proud tekoucí sensorem je řízen redukcí NO2 dle rov. (1) v případě, ţe produkce protonů reakcí (3) a rychlost jejich transportu z místa vzniku na pomocné elektrodě k místu spotřeby na indikační elektrodě je dostatečný. V sensorech o malé geometrické ploše indikační elektrody, na níţ zreaguje za jednotku času relativně malé mnoţství NO2 molekul, lze tuto podmínku splnit i v plynu o nízké vlhkosti. Proud je v tomto případě řízen reakcí (1) a citlivost detekce je lineární funkcí geometrické plochy elektrody. V sensorech o velké geometrické ploše elektrody zreaguje podstatně více molekul NO2, takţe v plynech o malé vlhkosti nestačí produkce protonů krýt jejich spotřebu. Odezva je tak řízena především reakcí (3) a citlivost detekce je niţší neţ by odpovídalo při dané koncentraci NO2 ploše elektrody. Teprve při vysoké vlhkosti plynu je v systému dostatek vody k tomu, aby proud určovala reakce (1), tj. koncentrace NO2. Z uvedených měření vyplývá, ţe při stanovení NO2 v plynech o měnící se relativní vlhkosti je výhodné pouţívat sensory s indikační elektrodou o malé geometrické ploše. Pro ně je závislost na relativní vlhkosti malá v širokém oboru RH a lze ji povaţovat za lineární. Ze směrnice této závislosti pro sensor S1 vyplývá změna citlivosti na změnu RH, 0,8 nA.ppm−1 na 1% RH. 75

citlivost, nA ppm

-1

1600

1200

54 33

800

S3

12

S2

S4 400

S1 0 0

20

40

60

80

geometrické plocha elektrody, mm

100

120

2

Obr. 1. Závislost citlivosti NO2 sensorů S1 aţ S4 na geometrické ploše indikační elektrody při různých relativních vlhkostech testovaného plynu (uvedeny u jednotlivých závislostí v %). Kaţdý bod je střední hodnotou ze 6 měření, RSD v intervalu od 1,5 do 6,8 %. V sensoru byl také testován elektrolyt PEGMEMA-EMITFSI s vysokou iontovou vodivostí 4,0 mS.cm−1 při 20°C. Citlivost sensoru byla ale menší neţ pro sensor s elektrolytem PEGMEMA-BMIPF6. Pro usnadnění transportu H+ iontů byla do elektrolytu PEGMEMAEMITFSI přidána kyselina methakrylová. Citlivost se ale významně nezměnila. Důleţitou součástí výzkumu je také studium vlivu interferentů. Oxid siřičitý SO2 nevykazuje při pracovním potenciálu detekce NO2 –0,9 V měřitelný signál, coţ je v souladu s prací [29],

89

kde oxidace SO2 na zlatě v kyselém i zásaditém prostředí probíhá při odlišném potenciálu neţ redukce nebo případná oxidace NO2. Sirovodík H2S při potenciálu –0,9 V také neposkytuje měřitelný signál, při potenciálu 1V lze ale zaznamenat jeho oxidaci. Závěr Byla připravena řada elektrolytů, provedena jejich elektrochemická charakterizace a byly testovány v amperometrickém sensoru. Byly zjištěny základní analytické parametry sensoru a zjištěna lineární koncentrační závislost pro NO2. Byl studován vliv geometrie indikační elektrody a relativní vlhkosti analyzovaného plynu na citlivost sensoru. Byl sledován vliv interferentů SO2 a H2S. Poděkování Tato práce vznikla s podporou MŠMT (LC523 a MSM0021620857) a Grantové Agentury AVČR (KJB200320901). Literatura 1. Suzuki S., Nagashima K.: Anal. Chim. Acta 144, 261 (1982). 2. Fergus J.W.: Sens. Actuators B 134, 1034 (2008). 3. Alberti G., Cherubini F., Palombari R.: Sens. Actuators B 24–25, 270 (1995). 4. Fenton D.E., Parker J.M., Wright P.V.: Polymer 14, 589 (1973). 5. Armand M.: Adv. Mater. 2, 278 (1990). 6. Opekar F., Štulík K.: Anal.Chim. Acta. 385, 151 (1999). 7. Bontempelli G., Comissio N., Toniolo R., Schiavon G.: Electroanalysis 9, 433 (1997). 8. Hodgson A.W.J., Jacquinot P., Jordan L.R., Hauser P.C.: Electroanalysis 11, 782 (1999). 9. Opekar F.: Electroanalysis 4, 133 (1992). 10. Zawodzinski T.A., Springer T.E., Uribe F., Gottesfeld S.: Solid State Ionics 60, 199 (1993). 11. Yan H., Liu C.: Sens. Actuators B 10, 133 (1993). 12. Langmaier J., Opekar F., Samec Z.: Sens. Actuators B 41, 1 (1997). 13. Hrnčířová P., Opekar F., Štulík K.: Sens. Actuators B 69, 199 (2000). 14. Tieman S.R., Heineman W.R., Johnson J., Segun R.: Sens. Actuators B 8, 199 (1992). 15. Fort A., Lotti C., Mugnaini M., Palombari R., Rocchi S., Vignoli V.: Microelectron. J. 40, 1308 (2009). 16. Reiter J., Krejza O., Sedlaříková M.: Sol. Energy Mater. Sol. Cells 93, 249 (2009). 17. Reiter J., Dominko R., Nádherná M., Jakubec I.: J. Power Sources 189, 133 (2009). 18. Opekar F., Štulík K.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 253 (2002). 19. Buzzeo M.C., Hardacre Ch., Compton R.G.: Anal. Chem. 76, 4583 (2004). 20. Wei D., Ivaska A.: Analytica Chimica Acta 607, 126 (2008). 21. Wang R., Okajima T., Kitamura F., Ohsaka T.: Electroanalysis 16, 66 (2004). 22. Sedlak J.M., Blurton K.F.: J. Electrochem. Soc. 123, 1476 (1976). 23. Sedlak J.M., Blurton K.F.: Talanta 23, 811 (1976). 24. Chang S.C., Stetter J.R.: Electroanalysis 2, 359 (1990). 25. Do J.S., Shieh R.Y.: Sens. Actuators B 37, 19 (1996). 26. Reiter J., Vondrák J., Michálek J., Mička Z.: Electrochim. Acta 52, 1398 (2006). 27. Hoherčáková Z., Opekar F.: Sens. Actuators B 97, 379 (2004). 28. Štulík K., Amatore C., Holub K., Mareček V., Kutner W.: Pure Appl. Chem. 72, 1483 (2000). 29. Bergman I.: J. Electroanal. Chem. 157, 59 (1983).

90

Transport of Divalent Cations across the Gel Supported Phospholipid Membranes Tomáš Navrátil, Ivana Šestáková, and Vladimír Mareček J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract This contribution deals with elucidation of principles of transporting processes of heavy metals (mainly lead, cadmium) across the biological membranes. The real membranes were for purposes of described experiments replaced by model membranes, which were composed of phospholipid bilayers. Two different phospholipids (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3phosphocholine and the mixture of phospholipids obtained from soybeans (under commercial name Asolectin)) were used as the building elements for the formation of these membranes on the surface of the constructed gel electrode. The registered transporting processes have been characterized using voltammetry, and electrochemical impedance spectrometry (EIS). The impact of some parameters on these systems and processes was investigated. Key Words: Membranes, Phospholipids, Heavy metals, Cadmium, Lead, Transport across the membrane, Voltammetry, Electrochemical impedance spectroscopy. Introduction We have focused our attention to the investigation of phospholipid bilayers for last a few years. More precisely, we tried to elucidate the natural processes, which enable the transfer of charged as well as uncharged particles (cations, anions, molecules, etc.). They must be transported across the cell membranes from the extracellular space into the intracellular space to start they active role (positive or negative) in the cell or reversely, from the cell into the extracellular space. Similar barrier must be crossed inside the cell by the transport between the cell compartments. The elucidation of such processes presents the first step of affecting of these processes (e.g., increasing or decreasing of the total amount of some specified ion (metal) in the cell by phytoremediation 1). Before the start of the investigation of the processes occurring on the real membranes, which surround the natural living animal and plant cells, we have utilized the model phospholipid bilayers (PBLs) for these purposes. PLB (or lipid bilayers (LBs)) are thin, flat membranes consisting of two layers of lipid molecules, with their hydrophobic parts, usually fatty acid tails, directed toward the center of the membrane, and with hydrophilic parts located at the inner and outer borders 2. The basic building elements for the formation of the real LB are the phospholipids (as diacylphosphatidylcholine or diacylphosphatidylinositol, etc.), which are composed of two fatty acid tails, phosphate group and choline, inositol, serine, etc. groups 3. The primary role of such membrane is the function of a barrier, which separates the cells and the sub-cellular compartments mutually and which keeps ions and a great variety of molecules at places, where they are needed, and prevents them from diffusing into areas, where they should not be. LBs are ideally suited to this role because, even though they are only a few nanometers thick (about 6-10 nm), they are impermeable to most water-soluble (hydrophilic) molecules 4. The principles, on which the transporting processes are based, have been studied for many years in a lot of laboratories all over the world. They are based on many principles, such as passive diffusion, facilitated diffusion, ion pumps and channels (e.g., in cases of Ca2+, K+, Na+), or endocytosis and exocytosis (e.g., larger objects and particles, such as bacteria, viruses) 5). In spite of a certain progress in this field of research, the transport of some elements or particles (e.g., heavy metals) is still poorly understood and there are many unanswered questions. There are different possibilities, how to form the artificial (model) membranes, which can be used for simulation of transporting processes: e.g. the form of vesicules, SPLBs on the

91

surfaces of solid materials, on the metallic substrates (mercury 6, gold). The surfaces of solid amalgam electrodes (e.g., 7-10) seem to be very suitable for the formation of SPLBs 11, 12. Such layers can be prepared in the form of a self-supporting membrane too (e.g., by filling a small micro-holes in a plate 13, etc.). Our team has dealt with formation and investigation of SPLBs on porous polycarbonate membranes 2, 3, 14-19 in last a few years. Very important condition for formation of such SPLB is the flat surface on the molecular level. Therefore, it is not possible to use the polycrystalline composite electrodes (e.g., 20-23) for these purposes. On the other hand, the application of an electrode, prepared on the base of a polymer or a gel (e.g., agar, agarose), seems to be very promising 24. Such type of the formed SPBLs can be applied for construction of biosensors, micro- and nano-structures, blood-compatible surfaces, medical implant devices, and for production of catalytic interfaces 3, 25. In the suggested agar-gel SPBLs, the agar gel is supposed to serve as a new type of “soft polymer cushion” 3, 25. Various techniques have been applied to the study of the membrane formation and of the transporting processes (some of them are mentioned in 18, 26-29). Our research team has devoted its attention to the application of electrochemical methods (electrochemical impedance spectroscopy (EIS), voltammetry, conductometry etc.) for these purposes. Experimental Preparation of Gel Electrode The PLBs were formed by self-assembling at the surface of the agar or agarose electrode, respectively. Agar or agarose (both purchased from Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) were warmed up on a water bath. The Tygon tube (inner diameter 1.0 mm, outer diameter 2.0 mm) was immersed into the liquid gel. By shaking of the tube, gel material rose up and approximately 5 cm high compact column was formed. Into this column, the silver/silver chloride wire (silver wire, diameter 0.4 mm, electroplated with silver chloride) was introduced to represent the electrical contact. After cooling to the room temperature, the preparation of the gel electrode was finished. Preparation of Supported Phospholipid Bilayers The end of the column (about 2-3 mm) was cut by a very sharp scalpel and such freshly prepared surface was ready to be coated by a phospholipid bilayer. The surface of the gel electrode was immersed into the solution phospholipids in n-heptane (20 mg.mL-l) or into the mixture of phospholipid with the selected ionophore, respectively. The regular phospholipid bilayer was formed in 2 minutes. Such column electrode was inserted into the plastic tube of 1 cm diameter of the same length as the Tygon tube (to preserve the electrode surface from the contact with the other parts of the electrolytic cell). To investigate the transport processes, the ionophore Calcimycin (Calcium Ionophore, Antibiotic A23187) was used (purchased from Sigma-Aldrich, > 98% (TLC). The ionophore was added to the solution of the phospholipids before their application to the support. Apparatus For quantification of the electrochemical impedances, the reference silver/silver chloride electrode (silver wire, diameter 1 mm, electroplated with silver chloride) was used. Platinum wire, diameter 1 mm, served as the auxiliary electrode. The measurements were realized using a CHI 650C Electrochemical Analyzer/Workstation, software CHI v. 8.1 (IJ Cambrija Scientific, Carms, UK). Reagents and Materials The 0.1 M KCl base electrolyte solutions were prepared from KCl Suprapur, purchased from Merck, Prague, Czech Republic. The p.a. solvents were obtained from Penta-Švec, Prague,

92

Czech Republic. All the other chemicals used were of the analytical grade. For all the measurements, deionized water from Milli-Q-Gradient, Millipore, Prague, Czech Republic (conductivity < 0.05 µS.cm-1) was used. The AAS standard solution of Cd2+ and Pb2+ (1000 mg.L-1 in 2% HNO3) were purchased from Analytica, Prague, Czech Republic. Two types of phospholipids were used for the preparation of SPLBs: 1,2-dipalmitoyl-snglycero-3-phosphocholine (lecithin, DPPC, GPCho (16:0/16:0)) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, USA) and Asolectin from soya beans (Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic) (a mixture, which comprises roughly equal proportions of lecithin, cephalin and phosphatidylinositol along with minor amounts of other phospholipids and polar lipids; about 24 % saturated fatty acids, 14 % mono-unsaturated and 62 % poly-unsaturated fatty acids). Results and discussion The first task of our work consisted in drawing up of the reproducible way of preparation of the gel electrode and of SPLBs formation (as it is described above in the “Experimental” part of this article). To prepare the new (clean) surface, it is necessary to cut the surface of the electrode (ca. 5 mm). Nevertheless, the Tygon tube can be contaminated by metal ions. Therefore, it is advisable to prepare new electrode (to use new Tygon tube) for each experiment. Due to the electrical properties of the gel material (resistance and capacitance, values of which are not negligible), the electrodes with constant distances between the end of the electrical contact (silver wire covered by silver chloride), and the gel surface must be fabricated. On the other hand, the column of the gel cannot be too short, because the electrochemical impedance measurements could be affected by the properties of this contact. Therefore, the gel column should amount to about 10 mm minimally. Our attention aimed to investigation of the transport of divalent cadmium cations across the SPLBs, formed from DPPC and Asolectin with an addition of ionophore calcimycin (A23187 ionophore. Using the EIS it was proved that the SPLBs prepared from both phospholipids are almost equivalent (from the point of view of the transporting processes). The presence of the mentioned ionophore enabled the transport of the heavy metal divalent cations Cd2+ or Pb2+. In comparison with SPLB, formed in pores of the polycarbonate membrane, the steady state is reached in shorter time, in about 15-25 minutes. Electric equivalent circuits A few types of electrical equivalent circuits were utilized to characterize the formed SPLBs bilayers and the corresponding transport processes. Two types of them were described in detail in 2, 3. These were used for characterization of SPLBs formed in the pores of polycarbonate membranes too 2, 3. The simpler one was applicable for characterization of the free polycarbonate membranes or gel electrode. The other one was more suitable for characterization of SPLBs formed on the polycarbonate membrane pores. Each member of the circuits can be used for characterization of the system 3, 17, 18. There are a few other possibilities of the used circuits, applications of which are tested in these days: e.g., additional capacitors(s) on the right parts of the parallel circuits. The other tested circuit was similar to the simplest one. However, in addition, the second parallel combination of a capacitor and a resistor was added. The first parallel combination characterizes the properties of the gel electrode and the second one characterizes the properties of the SPLB (formed on the surface of the gel electrode), including ionophores and transport of metal cations. A capacitor can be added in serial to this circuit.

93

The resistances of the measuring cell (solution, wires etc.) and of the gel support are almost constant in time. On the other hand, the resistance of the SPLB is decreasing slightly in first two hours. The absolute values of capacitances of all capacitors in electrical equivalent circuits are increasing continuously in time (the relative increases of all are almost equal). This effect can be explained by increasing compactness of the SPLB. This increase is interrupted by addition of the metal cations to the solution. The transporting process of the heavy metal divalent cations Cd2+ or Pb2+, which can be seen as the electrical current of charged particles, which are passing across the SPLB, decreases the registered capacitances. This effect was observed in the case of SPLBs formed on the porous membrane in previews experiments 2, 16. The surface of the gel electrode (more precisely, of the SPLB membrane) is about 1 order lower in comparison with SPLBs formed on the porous membrane and therefore, the capacitance decrease is much less pronounced. Nevertheless, the transport of lead and cadmium ions could be detected by cyclic voltammetry, performed in different intervals during ESI measurement – Fig.1.

Fig. 1. DC voltammogram of 50 μg.L-1 Pb2+ and 150 μg.L-1 Cd2+ in 0.1 M KCl registered using agar gel electrode covered by lecithin SPLB with addition of calcimycin (v=100 mVs-1). Conclusions The gel electrode based on agar or agarose seems to be suitable as support for formation of model SPLBs, prepared from lecithin or Asolectin. Ionophore calcimycin was successfully incorporated into these SPLBs. The changes of electrical parameters (recorded using EIS) in electrical equivalent circuits characterized transport of metal divalent cations across the membrane. Cyclic voltammetry proofs the transport of lead and cadmium ions through BLM. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge financial support by the GA AV CR (project No. IAA400400806) and GA ČR (project No. P206/11/1638). References 1. Jakl M., Jaklova Dytrtova J., Miholova D., Kolihova D., Szakova J., Tlustos P.: Chem. Speciation Bioavailability 21, 111 (2009). 2. Navratil T., Sestakova I., Stulik K., Marecek V.: Electroanalysis 22, 2043 (2010). 3. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: WSEAS Trans. Environ. Dev. 6, 208 (2010).

94

4. Tien H. T., Salamon Z., Guo D. L., Ottovaleitmannova A., v knize: Active Materials and Adaptive Structures; (Knowles G. J., ed. Iop Publishing Ltd, Bristol, 1992. 5. Murray R. K., Granner K. D., Mayes P. A., Rodwell V. W.: Harper's Biochemistry Appleton and Lange, Stamford 1996. 6. Becucci L., Moncelli M. R., Guidelli R.: Langmuir 19, 3386 (2003). 7. Danhel A., Peckova K., Cizek K., Barek J., Zima J., Yosypchuk B., Navratil T.: Chem. Listy 101, 144 (2007). 8. Vankova L., Maixnerova L., Cizek K., Fischer J., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B.: Chem. Listy 100, 1105 (2006). 9. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 10. Peckova K., Barek J., Navratil T., Yosypchuk B., Zima J.: Anal. Lett. 42, 2339 (2009). 11. Yosypchuk B., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXX, Electrochemical Properties of Thiol Monolayer at Surfaces of Different Electrodes, (Navratil T., Jiri B., Eds.), p. 197. 12. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011). 13. Lhotsky A., Holub K., Neuzil P., Marecek V.: J. Chem. Soc., Faraday Trans. 92, 3851 (1996). 14. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 15. Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS International Conference on Environment, Ecosystems and Development, Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers, Puerto de la Cruz, SPAIN, Dec 14-16, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.), World Scientific and Engineering Acad. and Soc., p. 212. 16. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Modern Electrochemical Methods XXIX, Electrochemical impedance spectroscopy of lecithin bilayers supported on porous membranes, Jetrichovice, 25.-29.5.2009, (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST Servis, p. 74. 17. Navratil T., Sestakova I., Marecek V.: Development, Energy, Environment, Economics (DEEE '10), Supported phospholipid bilayers and transport of heavy metals across them, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), p. 192. 18. Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX, Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes, Jetrichovice, 24.-28.5.2010, (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST Servis, p. 119. 19. Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T.: Development, Energy, Environment, Economics (DEEE '10), The electrochemical assessment of cadmium and lead mobility in the rhizosphere, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), p. 186. 20. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 21. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 38, 1747 (2005). 22. Navratil T., Sebkova S., Kopanica M.: Anal. Bioanal. Chem. 379, 294 (2004). 23. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 36, 2767 (2003). 24. Osakai T., Kakutani T., Senda M.: Bunseki Kagaku 33, E371 (1984). 25. Sackmann E.: Science 271, 43 (1996). 26. Jakl M., Jaklova Dytrtova J., Tlustos P.: Modern Electrochemical Methods XXX, The Study of Cadmium - Oxalic Acid Complexes Using DPASV and ESI-MS, Jetrichovice, (Navratil T., Jiri B., Eds.), p. 85. 27. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Kolihova D., Miholova D., Tlustos P.: Chem. Listy 103, 401 (2009). 28. Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Sestakova. I., Zins E. L., Schroder D., Navratil T.: Anal. Chim. Acta, In press; doi:10.1016/j.aca.2011.03.028 (2011). 29. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Szakova J., Miholova D., Tlustos P.: Cent. Eur. J. Chem. 6, 71 (2008).

95

Elucidation of Metabolic Pathways Affected by Creatine Supplementation Using Electrochemical Methods a Tomáš Navrátil , Eva Kohlíková b, Miroslav Petr a, and Michael Heyrovský a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Charles University in Prague, Faculty of Physical Education and Sport, Department of Physiology and Biochemistry, José Martího, 162 52 Prague 6, Czech Republic Abstract This contribution deals with successful application of electrochemical methods (voltammetric techniques for analysis of urine and impedance techniques for characterization of body parameters) in investigation metabolic pathways of exogenously supplemented creatine (CR). The electrochemical methods were successfully combined with spectroscopic methods (mostly) based on enzymatic reactions. Key Words: Creatine, Supplementation, Thiodiglycolic acid, Voltammetry, Homocysteine, Vitamin B12, Folates. Introduction It is well known that sportsmen generally believe that the species, which are current components of metabolic pathways, as, e.g., CR, lecithin, carnitine, arginine, or taurine, do not endanger their health 1. All these compounds are more or less involved in, or related to energy metabolism. Endogenously supplemented CR has been used for a few decades to increase physical fitness (by sportsmen) 2-5. Similarly, the endogenous CR supplementation is applied for medical purposes. The strategy of the supplementation (doses and their frequencies) depends on a few important factors. Nevertheless, as it has been revealed, CR consumption not always necessarily results in increased physical fitness. There are many metabolic pathways, which can be affected by the administered CR. The most important are the pathways, which utilize glycine, arginine, and S-adenosylmethionine (S-AM), i.e., the basic species, from which CR is formed 1. The CR synthesis is controlled by the interrelationship of the folate and of the vitamin B12 coenzymes. This can be concluded from reciprocal changes of the levels of folates and B12 vitamin in blood after a month of CR administration. For better understanding of the role of CR in general metabolism we evaluated the results obtained in study with volunteers, who were given in course of 1, 2, 4 and 30 days food supplements containing CR. In some cases, this supplementation was enriched by vitamin B12 and folates. Among other findings, it was proved that thiodiglycolic acid (TDGA) belongs to the relatively stable products, the formation of which is affected by CR supplementation, and excreted from the body into urine 2-6. Electrochemistry has proved to be very suitable in determination as well as in characterization of various biologically important and active methods (e.g., 7-15). Our team has paid its attention to the development of voltammetric methods utilizing different electrodes based on liquid mercury (HMDE), on solid amalgams as well as on other metallic and non-metallic composite materials for many decades (e.g., 16-30). TDGA has been in the center of our research in about last ten years. We have developed the voltammetric method, which seems to be very suitable for TDGA determination 31, 32. Its level in urine is affected by the exposition to vinyl chloride monomer 19, 31-33, by consuming some victuals and drugs, by vitamins (B12, folates) etc. 32-34. The voltammetric methods for determination of some of these compounds (e.g., folates) have been developed in last two years 35, 36.

96

When the effect of CR served to sportsmen regularly as nutrition supplement was followed with respect to individual physical performance and metabolism, several parameters were evaluated, which are connected with the development of atherosclerosis. It is, above all, an increase of the levels of cholesterol (CH), triacylglycerols (TAG) and homocysteine (HoCySH). Information on levels of the mentioned compounds, obtained using voltammetric methods and spectral method, were completed by body parameters, gained using other electrochemical methods: multifrequency bioimpedance methods (MBIA impedance methods) (muscle mass, absolute as well as relative contents of body fat, of extracellular and of intracellular fluids and of proteins). Experimental Supplementation procedure The volunteers were given food supplements containing: a) folic acid with vitamin B12 and b) CR. Supplementation with folic acid and vitamin B12 p.o. was realized with the supplement “Kyselina listová, Forte“(Folic acid, Forte), produced by Agrochemie, Ltd., Zlín, containing 0.2 mg of folic acid and 1 μg of vitamin B12 of natural origin in 1 tablet (1 dose = 1 tablet). “Creatine monohydrate – a special nutritional supplement for athletes” (Plutino, Czech Rep.) was administered p. o. in 5 g doses, dissolved in water. Group of volunteers for the long term and one short term experiments was composed of 11 young men, students of Faculty of Physical Education and Sport, of the age from 21 to 28 (on average 24.6 years). More than 35 parameters were evaluated for each person 2, 3, 6, 37, 38: In blood: folates, vitamin B12, homocysteine, triacylglycerols, total cholesterol, LDL cholesterol and HDL cholesterol, uric acid, cortisol, and testosterone; In urine: the changes in levels of CR, creatinine, TDGA, and pH; and the corrected results: a) per specific gravity: TDGA, CR and creatinine; b) per creatinine: TDGA and CR 33. CR was administered p. o. in 5 g doses, diluted in tepid water 2. Blood and urine of each proband were sampled and analyzed in the morning before the first CR application and the day after the last dose application in the long term, test and urine was sampled according to the specially designed schedule in short time tests. TDGA in urine samples was analyzed using the voltammetric method developed by us 32, 34, 39 . -value, used for individual characterization of probands, was calculated for each parameter as difference between the values determined in the samples of urine and blood on the last and on the first day of the long term test. Apparatus The analysis of TDGA was carried out by the computer-controlled Eco-Tribo Polarograph using the software “Polar 5.1” version for Windows (Polaro-Sensors, spol. s r. o., Czech Republic), on pen type hanging mercury drop electrode (HMDE) (Polaro-Sensors, spol. s r. o., Czech Republic), on mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (e.g., 40-43), or on solid composite electrode (e.g., 21-23, 44-47). The results, achieved using all three above mentioned working electrodes, were equivalent. More precisely, the calculated confidence intervals of results overlapped with probability higher than 95 %. The shapes of recorded curves with all three tested electrodes were similar; the peak positions and peak shapes were similar as well. Nevertheless, the determinations realized with electrode containing liquid mercury, i.e., HMDE exhibited the highest sensitivity and the lowest background. HMDE was the most “user friendly”, its surface was the easiest, and the fastest renewable, the repeatability of results achieved by it was the best. Smaller amount of mercury on the electrode surface (mercury meniscus, mercury film, polished amalgam surface, or amalgam composite surface) causes smaller sensitivity to TDGA concentration. Responses of such

97

electrodes are lower and worse reproducible. The highest background and the lowest sensitivity were recorded with composite electrodes. Therefore, in most experiments presented in this manuscript, the HMDE was used 2, 3. Compound levels in blood were determined in a commercial laboratory (KlinLab, Praha) by usual, mostly spectroscopic methods, which were (mostly) based on enzymatic reactions. CR and creatinine were determined using Specord 200. pH was measured by digital laboratory pH-meter Inolab (Benella CZ, Praha). Results and discussion The one month administration of CR to the sportsmen has proved that their organism adjusts itself to the regular application of the substance, which under normal conditions would have to get synthesized endogenously. From the measured values of other observed parameters it follows that the CR administration caused mutually reciprocal changes of folates and vitamin B12 levels. Simultaneously, it increased tissue proteins (muscle mass) and decreased body fat. The nutrition conditions guarantee the recyclation of compounds, in which participate vitamins, thiocompounds and other transporters of protons and electrons, necessary in catalytic amounts for anabolic and catabolic processes. According to the different extents of enzyme activities of the use of HoCySH and 1C and 2C units under control of folates and B12 the rightfulness of dividing the volunteers into 4 groups was confirmed. As it was supposed, the results of electroanalytical approach to the study of metabolic processes lead to the general ascertainment that each human metabolic system tries to cope with intrusion into its homeostasis in an individual way. Our results showed that the values of folates and vitamin B12 levels in blood are not the best indicators for evaluation of human health. They changed in opposite directions and in this way equilibrated the effect of increased supply of basal components, 1C and 2 units present in meal and CR given as food supplement. In future it seems to be useful to devote the attention to genetic aspects of the investigated processes and to transporting processes of the species from extracellular into intracellular spaces and among the subcellular compartments (as e.g. 24, 48-51). Conclusions The voltammetric method of TDGA determination in urine, which was developed by our research team, offers new tool for studying effects of remedies and of food supplements on redox equilibria in human metabolism connected with thiocompounds. According to our results, these equilibria are in some people more dependent on the usage of vitamin B12. The advantage of this method consists in easy availability of analyzed biological material, i.e., of urine. This method can help us to learn more about our health condition. Moreover, for the successful revealing and description of metabolic pathways it is necessary to realize the complex evaluation of all results gained using electrochemical and spectral techniques. The suggested pathways can be described qualitatively as well as quantitatively and incorporated in more or less complex metabolic schemes 2, 3, 5, 38, 52. Acknowledgements The authors gratefully acknowledge financial support by the GA AV CR (project No. IAA400400806), GA ČR (project No. P206/11/1638) and MSM 0021620864.

98

References 1. Pristoupilova K., Navratil T., Petr M., Senholdova Z., Pristoupil T. I., Pelclova D., Zak J., Kohlikova E., Heyrovsky M.: Atherosklerosa 2007, Interaction of creatine metabolism with three possible enzymatic pathways using homocysteine, Prague, (Tvrzicka E., Eds.), 4th Department of Internal Medicine of First Faculty of Medicine, Charles University in Prague and the General Teaching Hospital in Prague, p. 73. 2. Navratil T., Kohlikova E., Petr M., Pelclova D., Heyrovsky M., Pristoupilova K.: Physiol. Res. 59, 431 (2010). 3. Navratil T., Kohlikova E., Petr M., Heyrovsky M., Pelclova D., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Senholdova Z.: Food Chem. 112, 500 (2009). 4. Navratil T., Petr M., Senholdova Z., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Heyrovsky M., Pelclova D., Kohlikova E.: Physiol. Res. 56, 113 (2007). 5. Petr M., Navratil T., Heyrovsky M., Kohlikova E., Pristoupilova K.: Curr. Org. Chem., Accepted (2011). 6. Petr M.: PhD Thesis, Charles University, Prague, 2007. 7. Gal M., Hives J., Sokolova R., Hromadova M., Kolivoska V., Pospisil L.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1571 (2009). 8. Gal M., Hromadova M., Pospisil L., Hives J., Sokolova R., Kolivoska V., Bulickova J.: Bioelectrochemistry 78, 118 (2010). 9. Hromadova M., Kolivoska V., Sokolova R., Gal M., Pospisil L., Valasek M.: Langmuir 26, 17232 (2010). 10. Pospisil L., Hromadova M., Gal M., Valasek M., Fanelli N., Kolivoska V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1559 (2009). 11. Pospisil L., Teply F., Gal M., Adriaenssens L., Horacek M., Severa L.: Phys. Chem. Chem. Phys. 12, 1550 (2010). 12. Sokolova R., Degano I., Hromadova M., Bulickova J., Gal M., Valasek M.: Collect. Czech. Chem. Commun. 75, 1097 (2010). 13. Sokolova R., Hromadova M., Fiedler J., Pospisil L., Giannarelli S., Valasek M.: J. Electroanal. Chem. 622, 211 (2008). 14. Sokolova R., Hromadova M., Ludvik J., Pospisil L., Giannarelli S.: Electrochim. Acta 55, 8336 (2010). 15. Sokolova R., Hromadova M., Pospisil L.: J. Electroanal. Chem. 552, 53 (2003). 16. Danhel A., Peckova K., Cizek K., Barek J., Zima J., Yosypchuk B., Navratil T.: Chem. Listy 101, 144 (2007). 17. Navratil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 18. Navratil T., Sebkova S., Kopanica M.: Anal. Bioanal. Chem. 379, 294 (2004). 19. Navratil T., Senholdova Z., Shanmugam K., Barek J.: Electroanalysis 18, 201 (2006). 20. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 36, 2767 (2003). 21. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 37, 603 (2004). 22. Sebkova S., Navratil T., Kopanica M.: Anal. Lett. 38, 1747 (2005). 23. Yosypchuk B., Navratil T., Lukina A. N., Peckova K., Barek J.: Chem. Anal. (Warsaw) 52, 897 (2007). 24. Jaklova Dytrtova J., Sestakova I., Jakl M., Navratil T.: Electroanalysis 21, 573 (2009). 25. Navratil T., Novotny L.: Fresen. J. Anal. Chem. 366, 249 (2000). 26. Cizkova P., Navratil T., Sestakova I., Yosypchuk B.: Electroanalysis 19, 161 (2007). 27. Fischer J., Vanourkova L., Danhel A., Vyskocil V., Cizek K., Barek J., Peckova K., Yosypchuk B., Navratil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007). 28. Vyskocil V., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Danhel A., Barek J.: Modern Electrochemical Methods XXX, Voltammetric Determination of Selected Biologically

99

29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37.

38.

39. 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49.

50.

51.

52.

Active Nitro Compounds at a Polished Silver Solid Amalgam Composite Electrode, Jetrichovice, 24.-28.5.2010, (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST Servis, p. 192. Vyskocil V., Navratil T., Danhel A., Dedik J., Krejcova Z., Skvorova L., Tvrdikova J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). Vyskocil V., Navratil T., Polaskova P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). Dlaskova Z., Dvorakova L., Navratil T., Basova P.: Chem. Listy 95, 184 (2001). Dlaskova Z., Navratil T., Heyrovsky M., Pelclova D., Novotny L.: Anal. Bioanal. Chem. 375, 164 (2003). Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Navratil T., Heyrovsky M., Senholdova Z., Pelclova D.: Anal. Lett. 38, 613 (2005). Navratil T., Senholdova-Dlaskova Z., Heyrovsky M., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Pelclova D.: Anal. Lett. 37, 1093 (2004). Bandzuchova L., Selesovska R., Navratil T., Chylkova J.: Electrochim. Acta 56, 2411 (2011). Selesovska R., Bandzuchova L., Navratil T., Chylkova J.: Electroctroanalysis 23, 177 (2011). Kohlikova E., Petr M., Pristoupilova K., Senholdova Z., Pristoupil T. I., Pelclova D., Zak J., Heyrovsky M., Navratil T.: Atherosklerosa 2007, The effect of supraphysiological doses of creatine on homocysteine metabolism in sportsmen, Prague, (Tvrzicka E., Eds.), Ceska lekarska spolecnost J. E. Purkyne, p. 45. Navratil T., Kohlikova E., Petr M., Pristoupilova K., v knize: Nutritional Biochemistry: Genomics, Metabolomics and Food Supply; (Haugen S., Meijer S., Eds.), Nova Science Publishers, Hauppauge, NY, 2010. Senholdova-Dlaskova Z.: Ph.D. Thesis, University Pardubice, Pardubice, 2002. Yosypchuk B., Novotny L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002). Yosypchuk B., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1733 (2002). Barek J., Dodova E., Navratil T., Yosypchuk B., Novotny L., Zima J.: Electroanalysis 15, 1778 (2003). Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B.: Sensors-Basel 6, 445 (2006). Navratil T., Kopanica M.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 153 (2002). Navratil T., Kopanica M.: Chem. Listy 96, 111 (2002). Barek J., Fischer J., Navratil T., Peckova K., Yosypchuk B., Zima J.: Electroanalysis 19, 2003 (2007). Navratil T., Kopanica M., Krista J.: Chem. Anal. (Warsaw) 48, 265 (2003). Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Sestakova. I., Zins E. L., Schroder D., Navratil T.: Anal. Chim. Acta, In press; doi:10.1016/j.aca.2011.03.028 (2011). Navratil T., Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Marecek V.: 7th WSEAS International Conference on Environment, Ecosystems and Development, Study of charged particles transport across model and real phospholipid bilayers, Puerto de la Cruz, SPAIN, Dec 14-16, (Otesteanu M., Celikyay S., Mastorakis N., Lache S., Benra F. K., Eds.), World Scientific and Engineering Acad. and Soc., p. 212. Navratil T., Sestakova I., Marecek V., Stulik K.: Modern Electrochemical Methods XXX, Transport of cadmium ions across model supported phospholipid membranes, Jetrichovice, 24.-28.5.2010, (Barek J., Navratil T., Eds.), BEST Servis, p. 119. Sestakova I., Jaklova Dytrtova J., Jakl M., Navratil T.: Development, Energy, Environment, Economics (DEEE '10), The electrochemical assessment of cadmium and lead mobility in the rhizosphere, Puerto de la Cruz, (Mladenov V., Psarris K., Mastorakis N., Caballero A., Vachtsevanos G., Eds.), p. 186. Navratil T., Kohlikova E., Petr M., Pelclova D., Heyrovsky M., Pristoupilova K.: Physiol. Res., In Preparation (2011).

100

Voltammetric Determination of Dissolved Iron Using the Specified Amalgam Electrodes (Voltametrické stanovení rozpuštěného železa s využitím specifikovaných amalgamových elektrod) Ladislav Novotný, Renata Šelešovská, Barbora Vystrčilová, and Libor Dušek University Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Preliminary results on testing of a proper procedure of voltammetric determination of dissolved iron (a possible product of the electrocoagulation process) using the hanging mercury drop electrode and the specified amalgam electrodes were described. The recently designed experimental arrangement for application of electrochemical coagulation was discussed. Key words: Mercury electrodes, Amalgam electrodes, Iron, Electrocoagulation Úvod Řešení způsobů kontroly a čištění kvality vod a vodných roztoků je jedním z dlouhodobě rozvíjených témat. Mezi oblíbené a stále rozvíjené metody řadí se v tomto směru techniky vyuţívající elektrochemických principů. Příkladem toho je zájem jak o technologicky vyuţitelné elektrokoagulační a jiné elektroseparační procesy 1,2 pro čištění vod a vodných roztoků, tak zájem o uplatnění voltametrie a čidel na bázi amalgam či dalších materiálů (příp. miniaturizovaných rtuťových elektrod) slouţících 3-14 zejm. pro analýzu roztoků, pro studium chování bioaktivních látek apod. Cílem tohoto sdělení je poskytnout informaci o zahájení další etapy výzkumu a rozvoje specifikovaných elektrochemických způsobů čištění vodných roztoků při vyuţití voltametrického sledování účinných (a popřípadě i jiných) sloţek roztoku pomocí amalgamových a jiných elektrod. Experimentální část Popsané výsledky byly získány zejména s vyuţitím sestav nebo komponent polarografu PCETP (Polaro-Sensors nebo ECO-TREND PLUS s.r.o. Praha), popř. i PA4 (Laboratorní přístroje LP, Praha), s minaturizovanou rtuťovou tuţkovou elektrodou, se stříbrnou amalgamovou elektrodou pokrytou rtuťovým meniskem popř. i se statickou rtuťovou elektrodou SMDE-1 (LP); podle potřeby byla téţ vyuţita elektrodová uspořádání s plastovými nástavci či zakončeními a s modifikovanými amalgamy. Voltametrická měření byla prováděna v tříelektrodovém uspořádání v reţimu DPV, výška pulzu 50 mV, frekvence 5 Hz, popřípadě i v reţimu DCV; roztoky obsahující rozpuštěné ţelezo byly analyzovány v prostředí 0,1 M chloracetátového pufru pH 3 obsahujícího 0,1 M chelaton III. Čistota pouţitých chemikálií byla p.a.; podle potřeby byly měřené roztoky probublány dusíkem. Výsledky a diskuse Součástí nedávno zahájené další etapy rozvoje problematiky čištění vod a vodných roztoků je vyuţívání novějších uspořádání (systémů) 2 pro uplatnění elektroseparačních procesů s cílem zlepšit vyuţitelnost, účinnost a případně i další ţádoucí parametry těchto technik. Citované experimentální uspořádání vyuţívá přitom zejména různých provedení a topologie tvarovaných a miniaturizovaných elektrod, v kombinaci s řízenými polarizačními reţimy. Základem výzkumu podmínek uplatnění těchto systémů a funkčních reţimů je studium polarizačních křivek, zvolených parametrů charakterizujících probíhající elektrodové procesy,

101

jakoţ i výzkum vlivů experimentálních podmínek na tyto procesy resp. parametry. Tento výzkum probíhá za potenciostatických, galvanostatických nebo i modifikovaných (kombinovaných) podmínek. Jeho součástí je sledování obsahu aktivních iontů či sloţek přítomných v roztoku. V případě elektrod na bázi ţeleza nebo různých druhů ocelí jde především o ionty Fe2+ popř. Fe3+. Ukázalo se proto potřebným a uţitečným ověřit a v reálných prostředích (pokud moţno blízkých technologickým podmínkám) i vyhledat vhodné podmínky pro stanovení těchto iontů, navrhnout vhodné postupy, metody a elektrody. Předběţné výsledky ukazují, ţe by těmto potřebám mohly vyhovovat elektrody na bázi výše zmíněných amalgamů, modifikovaných amalgamů, popř. rovněţ hybridních či kompozitních/hybridních amalgamů, v plastových i jiných materiálech 12-14. Testovací měření potvrdila moţnost sledování rozpuštěného ţeleza jak s vyuţitím miniaturizované stacionární rtuťové tuţkové elektrody HMDE (Obr. 1) tak pevné stříbrné amalgamové elektrody modifikované meniskem rtuti m-AgSAE (Obr. 2). Koncentrační rozsah v rozmezí 1.10-5 aţ 7.10-5 mol/L v případě Obr. 1 odpovídal pravděpodobným provozním potřebám při účinném elektrochemickém rozpouštění ţelezných elektrod v průběhu elektrokoagulačního (elektročistícího) procesu. Koncentrační rozsah 5.10-6 aţ 3.10-5 mol/L v případě Obr. 2 dokumentuje moţnost citlivého laboratorního stanovení obsahu ţeleza i s vyuţitím robustnějších amalgamových elektrod.

Obr. 1. DPV-stanovení obsahu ţeleza v 0,1 M chloracetátovém pufru pH 3 obsahujícím 0,1 M chelaton III. Obsah ţeleza odpovídá jeho rovnoměrným přídavkům v rozsahu 1.10-5 aţ 7.10-5 mol/L.

Obr. 2. Podmínky DPV-stanovení obsahu ţeleza za podmínek viz Obr. 1. Obsah ţeleza odpovídá jeho rovnoměrným přídavkům v rozsahu 5.10-6 aţ 3,5.10-5 mol/L.

102

Závěr Provedená měření potvrdila moţnost vyuţití amalgamových a příbuzných elektrod pro sledování obsahu rozpuštěného ţeleza v koncentračních rozsazích odpovídajících předpokládaným moţnostem vyuţití výše uvedených elektrochemických technik čištění vod a vodných roztoků. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektů č. MSMT CR č. LC06035, VZ 0021627502-UPa a TACR TA/112/0411. Literatura 1. Jiang J.Q., Graham N., Andre C., Geoff H. K., Brandon N.: Water Research 36, 4064 (2002). 2. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2006-18099, UV 17030. 3. Wang J.: Analytical Electrochemistry, VCH, New York 1994. 4. Yosypchuk B., Novotný L.: Crit. Rev. Anal. Chem. 32, 141 (2002). 5. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 6. Navrátil T., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 131 (2009). 7. Havran L., Fojta M., Paleček E.: Bioelectrochemistry 63, 239 (2004). 8. Šelešovská-Fadrná R., Fojta M., Navrátil T., Chýlková J.: Anal. Chim. Acta 582, 344 (2007). 9. Yosypchuk B., Fojta M., Havran L., Heyrovský M., Paleček E.: Electroanalysis 18, 186 (2006). 10. Hasoň S., Fojt L., Šebest P., Fojta M.: Electroanalysis 21, 666 (2008). 11. Novotný L.: Chem. listy 95, 147 (2001). 12. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2001-1, UV 298 623. 13. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2007-19501; UV 19062. 14. Novotný L.: ÚPV Praha, PUV 2009-22130; UV 21734.

103

Direct Voltammetric Determination of Aclonifen in Natural Waters at a Silver Solid Amalgam Electrode Vít Novotný UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Department of Analytical Chemistry, Charles University, Albertov 2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract A method for the determination of Aclonifen in tap water and Vltava river water by differential pulse voltammetry on a meniscus modified silver solid amalgam electrode is described. All measured calibration dependencies are linear. The detection limit for the determination of Aclonifen in deionised water is 2∙10-7 mol∙L-1. The detection limit for the determination of AC in Vltava river water is 2∙10-7 mol∙L-1. The detection limit for the determination of AC in Vltava river water is 3∙10-8 mol∙L-1. AgSAE is therefore a suitable sensor for the determination of Aclonifen in environmental waters. Keywords: Aclonifen determination, Silver solid amalgam electrode, River water. Introduction Aclonifen (AC) is a preemergent diphenyl ether herbicide (DPhEH) used to combat weeds in potatoes, peas, carrot, corn, rice and sunflowers 1. DPhEHs inhibit plant growth via their photodegradation products that inhibit the activity of protoporphyrinogen oxidase. As other DPhEHs AC exhibits some side effects 2, such as high toxicity for aquatic organisms and hepatotoxicity in mammals in high doses 3. It is listed as a suspected human carcinogen and substances with similar structures are endocrine disruptors and have adverse effects on blood formation 4, 5. It has been registered for use in the European Union since 2008 under the trade names Bandur, Bander or Mikado. Silver solid amalgam electrodes (AgSAE) have already proved themselves to be suitable sensors for the determination of trace amounts of pollutants in the environment 6 including the determination of some DPhEHs at a meniscus modified AgSAE (m-AgSAE) 7, 8. Among their advantages are low price, high sensitivity, easy handling and mechanical robustness. Various methods for the determination of AC are described in the literature 9-13, but none uses voltammetry AgSAE. Materials and methods Due to its low solubility in water (1,4 - 2,5 mg∙L-1 at 20 °C), the stock solution (c 1∙10-3 mol∙L-1) of Aclonifen (2-chloro-6-nitro-3-phenoxybenzenamine 99%, Sigma– Aldrich Laborchemikalien, Germany.) has been prepared by dissolving 0,02648 g of AC in 100 mL of methanol. Solutions of lower concentrations were prepared by precise diluting of the stock solution with methanol. The stock solution was kept in the dark in the refridgerator. The stability of the stock solution has been checked by UV-VIS spectrophotometric measurements. The stock solution was stable for at least 6 months in the conditions under which it was kept. Other used chemicals were boric acid, acetic acid (99%), phosphoric acid (85%), sodium hydroxide, potassium chloride, all chemicals p. a., Lachema Brno, Czech Republic. Methanol p.a. Merck, Germany was used. Britton-Robinson buffers of the desired pH were prepared by mixing of 0,2 mol∙L-1 NaOH with a solution containing 0,04 M boric acid, phosphoric acid and acetic acid. Measurements of pH were performed on a Jenway 3510 (Jenway, Essex, Great Britain) pH-meter with a combined glass membrane electrode (type 924 005) The electrode was calibrated by standard buffer solutions in water. Deionized water (Millipore, USA) was used as a solvent. Palmsens Electrochemical Sensor Interface (Palm Instruments BV, Ruitercamp, The Netherlands) and the PalmsensPC software was used for all voltammetric techniques. The software was running under the Windows XP (Microsoft Corp.)

104

operating system. Pulses of width of 80 ms and height of –50 mV were used while performing DPV. A polarization rate of 20 mV/s, and potential resolution of 2 mV were used. All measurements were performed using a three electrode system. A silver chloride electrode (1 mol∙L-1 KCl) type RAE 113, Monokrystaly, Turnov, Czech Republic, a platinum wire auxiliary electrode and a meniscus modified silver solid amalgam electrode that was purchased from Polaro Sensors, Prague, Czech Republic. After extended periods of storage and if the behavior of the electrode starts changing the meniscus is renewed by immersing the electrode in a vial containing a small quantity of mercury, the process is called amalgamation. Each day at the start of using the electrode it was activated in 0.2 M KCl solution by applying of a potential of -2200 mV for 300s, as described in 14. Measured solutions of AC were prepared by adding an appropriate amount of the stock solution to a 10 mL volumetric flask, filling with methanol to a total volume of 5 mL and then filling the flask up to 10 mL with BR buffer of the desired pH. Model samples of AC in the concentration range (2∙10-6 - 1∙10-5) mol∙L-1 in drinking water were prepared by making a 1∙10 -5 mol∙L-1 solution of AC in drinking water. The drinking water was taken after letting it flow for 5 minutes to remove any impurities or gas pockets in the tubing. The appropriate amount of the stock solution was then added to a 10 mL volumetric flask, filled to 5 mL with pure drinking water and then filled up to 10 mL by BR buffer pH 12. The same was true for the (2∙10-7 - 1∙10-6) mol∙L-1concentration range, but a 1∙10-6 mol∙L-1 stock solution has been used instead. Analogous procedure was used for the determination in Vltava river water. The river water was taken from the surface of the river into a clean PET bottle and was stored in a refridgerator in a glass vessel for about 2 days during the experiments. Values of points in calibration curves are arithmetic averages of 3 measurements. Error bars are derived from the same data. Detection limits are calculated according to the formula LOD = 3,3∙σ/S where σ is the standard deviation of 10 measurements of the lowest concentration when the signal can still be evaluated and S is the slope of calibration curve in the vicinity of that concentration. Results and discussion Aclonifen yields only a single peak in the whole pH range studied (pH 2-12), see Fig. 1. The potential of the peak is shifting towards more negative values with increasing pH and the peak height is increasing. The pH chosen for the determination of AC at m-AgSAE is 12, as the AC peak is the highest and best developed under these conditions. This pH was also used for all the model samples of real matrices. The voltammograms of AC in deionized water in the concentration range (2∙10-7 - 1∙10-6) mol∙L-1 can be seen in Fig. 2. The calibration dependence is linear in the range of concentrations from 2∙10-7 mol∙L-1 to 10∙10-5 mol∙L-1. The detection limit reached is 2∙10-7 mol∙L-1. The voltammograms of AC in the concentration range (2∙10-7 1∙10-6) mol∙L-1 in drinking water can be seen in Fig. 3. The calibration dependence is linear in the concentration range from 2∙10-7 mol∙L-1 to 10∙10-5 mol∙L-1 and lower concentrations could not be determined. The detection limit reached is 2∙10-7 mol∙L-1. The voltammograms of AC in the concentration range (2∙10-8 - 1∙10-7) mol∙L-1 in Vltava river water can be seen in Fig. 4. The calibration dependence is linear in the concentration range from 2∙10-7 mol∙L-1 to 10∙10-5 mol∙L-1 and lower concentrations could not be determined. The detection limit reached is 2∙10-7 mol∙L-1. The parameters of the calibration dependencies in real samples can be found in Tab. 1.

105

-0,03

5 2

6

4 3

1 -0,02

I [ A]

-0,01

0,00 -0,4

-0,6

-0,8

E [V]

-1,0

Fig. 1. DP voltammograms of AC (c 1∙10-5 M) at m-AgSAE in various pH.. Measured in a solution of 50% MeOH and BR buffer pH 2 (1), 4 (2), 6 (3), 8 (4), 10 (5), and 12 (6).

-0,010

6

3

Ip [nA]

5

2

4

1

-0,008

0 0,2

0,4

0,6

0,8

c [ mol/L]

I [ A]

1,0

3 2

-0,006

1

-0,004 -0,6

-0,8

E [mV]

-1,0

Fig. 2. DP voltammograms of AC at m-AgSAE. Measured in a solution of BR buffer pH 12 and MeOH (1:1). AC concentration 0 (1), 2∙10-7 (2), 4∙10-7 (3), 6∙10-7 (4), 8∙10-7 mol∙L-1 (5), and 1∙10-6 mol∙L-1 (6).

106

-10

-5

6 5

-4

-9

-3

I [nA]

-2

4 -1

3

-8 0

0.3

0.6 0.9 -1 c [ mol.L ]

2

-7

1 -6

-5 -500

-600

-700

-800

E [mV]

-900

-1000

Fig. 3. DP voltammograms of AC at m-AgSAE. Measured in a solution of BR buffer pH 12 and drinking water (1:1). AC concentration in drinking water 0 (1), 2∙10-7 (2), 4∙10-7 (3), 6∙10-7 (4), 8∙10-7 mol∙L-1 (5), and 1∙10-6 mol∙L-1 (6).

-9.0 -0.6

Ip [nA] -0.4

6 -8.5

-0.2

5 I [nA]

0.0 0.00

0.03

0.06 0.09 c [ mol/L]

4

-8.0

3

-7.5

-7.0 -600

2

1

-675

-750

E [mV]

-825

-900

Fig. 4. DP voltammograms of AC at m-AgSAE. Measured in a solution of BR buffer pH 12 and Vltava river water (1:1). AC concentration in river water 0 (1), 2∙10-8 (2), 4∙10-8 (3), 6∙10-8 (4), 8∙10-8 mol∙L-1 (5), and 1∙10-7 mol∙L-1 (6).

107

Table I. Parameters of the calibration dependences of AC in Vltava river and drinking water. c water k q σ R LD [mol∙L-1] [nA∙μmol-1∙L] [nA] [nA] [μmol∙L-1] (2-10)∙10-6 drinking -3.82 3.9 ---0.9994 --(2-10)∙10-7 drinking -4.32 -0.32 0.048 -0.9970 0.037 (2-10)∙10-6 river -4.82 1.9 ---0.9983 --(2-10)∙10-7 river -3.51 -0.15 ---0.9901 ---8 (2-10)∙10 river -5.14 -0.016 0.036 -0.9754 0.023 Where c denotes the investigated concentration range, k denotes the slope of the calibration curve, q the intercept, σ the standard deviation of 10 measurements of the lowest concentration, R the correlation coefficient and LD the limit of detection. Conclusions A method for the determination of AC by DPV at m-AgSAE has been successfully developed. The calibration dependence is linear in the concentration range from 2∙10-7 to 1∙10-4 mol∙L-1. The detection limit reached is 2∙10-7 mol∙L-1. A method for the direct determination of AC by DPV at m-AgSAE in drinking water has been successfully developed. The calibration dependence is linear in the concentration range from 2∙10-7 to 1∙10-5 mol∙L-1. The detection limit reached is 2∙10-7 mol∙L-1. A method for the direct determination of AC in Vltava river water by DPV at m-AgSAE has been successfully developed. The calibration dependence is linear in the concentration range from 2∙10-8 to 1∙10-5 mol∙L-1. The detection limit reached is 3∙10-8 mol∙L-1. Further work will be focused on decreasing the detection limit of the method in real samples by using solid phase extraction as a preconcentration step. Acknowledgements The financial support of The Czech Ministry of Youth and Sports (project LC06035, MSM 021620857 and RP14/63) and of the Technological Agency of Czech Republic (Project TA01020565), and by the Project SVV 2011-263204, is gratefully acknowledged. References 1. Cobucci, T.,Prates, H. T.,Falcão, C. L. M., Rezende, M. M. V.: Weed Sci. 46, 258 (1998). 2. Kilinc, Ö.,Reynaud, S.,Perez, L.,Tissut, M., Ravanel, P.: Pest. Biochem. Physiol. 93, 65 (2009). 3. Scrano, L.,Bufo, S. A.,D‟Auria, M.,Meallier, P.,Behechti, A., Shramm, K. W.: J. Environ. Qual. 31, 268 (2002). 4. Teshima, R.,Nakamura, R.,Nakajima, O.,Hachisuka, A., Sawada, J.-I.: Toxicol. Lett. 150, 277 (2004). 5. Francis, B. M.,Metcalf, R. L.,Lewis, P. A., Chernoff, N.: Teratology 59, 69 (1999). 6. Yosypchuk, B., Barek, J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 7. Novotný, V., Barek, J.: Chem. Listy 103, 217 (2009). 8. Cabalková, D.,Barek, J.,Fischer, J.,Navrátil, T.,Pecková, K., Yosypchuk, B.: Chem. Listy 103, 236 (2009). 9. Lagana, A.,Fagoa, G.,Fasciani, L.,Marino, A., Mosso, M.: Anal. Chym. Acta 414, 79 (2000). 10. Hong-Li, S.,Yu-Hsiang, S.,Mahaveer, B. M., Shang-Da, H.: J. Sep. Sci. 29, 2647 (2006). 11. Pang, G.-F.,Liu, Y.-M.,Fan, C.-L.,Zhang, J.-J.,Cao, Y.-Z.,Li, X.-M.,Li, Z.-Y.,Wu, Y.-P., Guo, T.-T.: Anal. Bioanal. Chem. 384, 1366 (2006). 12. Perreau, F., Einhorn, J.: Anal. Bioanal. Chem. 386, 1449 (2006). 13. Sagratini, G., et al.: Fresenius' Environ. Bull. 16, 973 (2007). 14. Yosypchuk, B., Novotny, L.: Electroanalysis 14, 1733 (2002).

108

Methodology of Electrophoretic Separations in Short Capillaries (Metodika elektroforetických separací v krátkých kapilárách) František Opekar, and Karel Štulík Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Albertov 2030, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Various methods of rapid electrophoretic separations are presented and discussed. The separations can be performed either in short section of capillaries of common length with utilization of standard electrophoretic systems or in short capillaries in specialized apparatus. Time of separation can be reduced up to units of seconds with preservation of high separation efficiency using specialized instrumentation. Electrophoretic separations in short capillaries are also very suitable for combination with other flow-through analytical methods, namely with liquid chromatography, flow-injection and sequential-injection analysis to form very efficient 2D analytical systems. Key words: Capillary electrophoresis, Short capillary, Fast separations, Combined analytical systems, Hyphenated techniques. Úvod Výkonné a efektivní analytické metody jsou zaloţeny na separaci a detekci látek v toku kapaliny. Jednou z takových metod je kapilární elektroforéza (CE). CE je experimentálně jednoduchou metodou s minimem pohyblivých mechanických komponent a malými poţadavky na objemy činidel i vzorků. Tok kapaliny separačním prostředím, pokud je zapotřebí, zajišťuje elektroosmotický tok (EOF), jehoţ velikost a směr lze snadno řídit separačním napětím, úpravou vnitřního povrchu kapiláry či sloţením nosného elektrolytu. Plochý koncentrační profil zón separovaných látek a dobrý odvod Jouleova tepla z kapiláry přispívají k vysoké separační účinnosti metody. Doba separace ve standardní aparatuře pro provádění CE je zpravidla 5 aţ 30 minut. Má-li být CE pouţita např. ke sledování kinetiky (bio)chemických reakcí nebo jako následná separační metoda ve vícedimenzionálních separačních systémech, je nutné, aby doba separace byla mnohem kratší. Poţadavky na rychlost analýzy však rostou i při běţných analýzách velkých mnoţství vzorků, kdy i malé zvýšení rychlosti separace přispívá ke zkrácení doby analýzy, coţ výrazně ovlivňuje počet analyzovaných vzorků za časovou jednotku a tím i cenu analýzy. Tento příspěvek poskytuje informaci o metodice rychlých separací v systémech s krátkou separační dráhou, kterých lze dosáhnout jednak specifickým přístupem k vyuţití standardních elektroforetických aparatur s kapilárami o nejčastěji pouţívaných délkách 50 aţ 80 cm a jednak pouţitím specializovaných aparatur s krátkými kapilárami o délkách v jednotkách cm. Detailní diskusi problematiky najde zájemce v referátu 1. V práci 2 byly odvozeny rovnice pro separační účinnost vyjádřenou počtem pater, N, a migrační čas, t. Pro separační účinnost platí U ef N , (1) 2D kde je elektroforetická pohyblivost [cm2 V-1 s-1], Uef je separační napětí [V] na úseku kapiláry mezi dávkovacím koncem a místem detekce a D je difúzní koeficient [cm2 s-1]. Separační účinnost v CE vyjádřená počtem teoretických pater, N, roste s růstem aplikovaného efektivního napětí Uef, ale na rozdíl od např. kapalinové chromatografie není funkcí délky separačního prostředí. Pro migrační čas platí

109

t

Lef L

, (2) U kde L a Lef [cm] jsou celková délka separační kapiláry a délka mezi místem dávkování a detekcí. Pokud je na kapiláře stále stejné napětí, roste se zkracováním její délky intenzita elektrického pole a migrační čas klesá, tj. roste účinnost a rychlost separace. Zkracováním kapiláry lze však zkracovat dobu separace bez ztráty účinnosti jen za předpokladu, ţe se nemění faktory, které vedou k rozšiřování zón látek. Nejvýznamnějším z nich je generace Jouleova tepla vyvolaná průchodem elektrického proudu separační kapilárou. Pro zachování dostatečně vysoké separační účinnosti je proto nutné pouţívat kapiláry s malým vnitřním průměrem a separaci provádět v málo vodivých pufrech. Rychlé separace v komerčních elektroforetických sestavách Na komerčních elektroforetických sestavách lze k rychlé separaci látek vyuţít postupu, při němţ je vzorek dávkován do výstupního konce kapiláry (Short-End Injection, SEI), tj. do místa, které je mnohem blíţe detektoru neţ regulerní dávkovací konec kapiláry; k separaci tak dochází na asi 10cm úseku kapiláry. Při tom je nutno pouze zvolit správnou polaritu napětí na elektroforetických elektrodách, ostatní funkce aparatury (dávkování vzorku, promývání kapiláry, atd.) jsou zachovány. Separací je dosahováno v řádu desítek sekund aţ jednotek minut. Velmi přehledně jsou základní vlastnosti této metody zpracovány v pracech3,4, kde jsou ukázány její moţnosti na příkladě separací různých typů látek. Dalšího zrychlení separace lze dosáhnout tím, ţe nadávkovaná zóna vzorku je v kapiláře posunuta zónou nosného elektrolytu při vhodně aplikovaném tlaku směrem k detektoru 5 (Extended Short-End Injection) aţ na separační délku řádu jednotek cm. Jinou moţností, jak vyuţít standardní elektroforetickou aparaturu pro rychlou separaci, je spojení krátké separační kapiláry o malém vnitřním průměru s dostatečně dlouhou pomocnou kapilárou o podstatně větším vnitřním průměru 6. Odpor elektrolytu je v separační kapiláře významně větší ve srovnání s odporem v pomocné kapiláře. Po připojení vysokého napětí je proto intenzita elektrického pole v systému nerovnoměrně rozdělena a to tak, ţe v separační kapiláře je řádově větší neţ v kapiláře pomocné. Spojení krátké separační kapiláry s dlouhou pomocnou kapilárou (dlouhé kapiláry mohou být i z obou stran kapiláry separační) rovněţ umoţňuje umístit vysokonapěťové elektrody do bezpečné vzdálenosti od sebe. Specializované elektroforetické aparatury s krátkou kapilárou Specializované elektroforetické aparatury jsou navrhovány tak, aby v nich mohly být pouţívány krátké separační kapiláry, délky řádově jednotky cm. Problémem při jejich pouţívání je dávkování vzorku, protoţe krátké kapiláry mají omezenou moţnost dočasné změny tvaru a omezenou pohyblivost. Dávkování je proto řešeno tak, aby se separační kapilárou nebylo nutno pohybovat. Laboratorně sestavované aparatury Nejjednodušší laboratorní aparatury jsou v podstatě miniaturizovanými standardními elektroforetickými sestavami, viz např. 7. Oba konce krátké kapiláry jsou fixovány v maloobjemových nádobkách, v nichţ jsou umístěny elektroforetické elektrody. Podle potřeby jsou nádobky naplněny separačním pufrem, roztokem vzorku nebo promývací kapalinou. Vzorek je nejčastěji dávkován elektrokineticky. V drtivé většině CE analýz jsou zóny látek detegovány v jednom bodě v blízkosti detekčního konce kapiláry. Pouţití krátkých separačních kapilár však umoţňuje opticky detegovat látky současně v celé délce kapiláry. Záření ze zdroje dopadá na celou kapiláru kolmo na její podélnou osu a intenzita prošlého záření při absorpčním měření, intenzita fluorescenčního záření či změny v indexu lomu jsou snímány rovněţ v celé délce kapiláry digitální kamerou (Whole-Column Imaging Detection,

110

WCID). Metoda je často vyuţívána v kapilární izoelektrické fokusaci, viz např. referát citace tam uvedené.

8

a

Kombinace CE aparatur s průtokovou injekční či sekvenční analýzou Pro dávkování vzorku do krátkých kapilár lze s výhodou vyuţít instrumentace pouţívané v průtokových analytických metodách, jako je průtoková injekční analýza (Flow Injection, FI) nebo sekvenční injekční analýza (Sequential Injection, SI). Uvedené metody jsou vhodné nejen pro dávkování vzorku i do velice krátkých kapilár bez nutnosti jejich pohybu, ale umoţňují účinnou předběţnou úpravu vzorku před jeho nadávkováním do separační kapiláry. K tomu lze vyuţít mnoha postupů (prekoncentrace, separace, derivatizace), které jsou pro tyto metody vypracovány. Dávkování vzorku do systému a jeho předúprava v toku kapaliny můţe být automatizována, coţ se příznivě projevuje v počtu zpracovaných vzorků za jednotku času. Kombinace těchto metod vykazuje synergické efekty, takţe spojení průtokové (sekvenční) injekční analýzy s elektroforézou prováděnou v kapiláře (FI-CE, SI-CE) nebo na mikročipu je velmi účinným analytickým nástrojem, viz např. referáty z poslední doby 9,10. Pro spojení FI-CE je nutné vhodné spojovací rozhraní (interface), které zajistí, aby do kapiláry byl nadávkován pouhý zlomek objemu kapaliny vystupující z FI systému (splitting sampling) a aby FI systém nebyl přímo spojen s vysokonapěťovu částí CE systému. V interface popsaném v práci11 je v trubičce kolmo na směr toku kapaliny z FI aparatury umístěn dávkovací konec separační kapiláry. Při průchodu zóny vzorku kolem dávkovacího konce kapiláry je jeho určitá malá frakce elektrokineticky nadávkována do kapiláry. Interface bylo upraveno zařazením ventilu do výstupu trubičky přivádějící vzorek z FI systému 12. Při jeho zavření vzroste v systému tlak a vzorek je dávkován hydrodynamicky; mnoţství nadávkovaného vzorku je řízeno dobou zavření ventilu. Při určitých variantách kombinace FI-CE je z bezpečnostních i funkčních důvodů ţádoucí elektrické oddělení obou systémů. V práci 13 bylo k elektrickému oddělení FI a CE systému vyuţito izolace bublinkami vzduchu. Vzduchem segmentovaný roztok z FI systému volně kapal do vhodně upraveného vstupního ramene interface, z nějţ byl roztok odsáván pumpou (Falling-Drop Interface, FDI). Elektroforetická elektroda byla umístěna v blízkosti ústí separační kapiláry tak, aby mezi kapilárou a elektrodou zůstal vţdy film roztoku, i kdyţ kolem ústí kapiláry procházela vzduchová bublinka. Tím bylo zajištěno, ţe i v případě vzduchem segmentovaného toku roztoku nebylo přerušováno separační napětí. Modifikace FDI pro miniaturizovaný CE systém byla popsána v práci 14. Na povrch skleněného sloupku, na němţ je poloţen dávkovací konec separační kapiláry a elektroforetická elektroda, postupně podle programu FI systému volně vykapává roztok separačního pufru nebo vzorku. V době, kdy je na sloupku kapka vzorku, dochází k jeho elektrokinetickému nadávkování, v době, kdy je na sloupku roztok pufru probíhá separace. Pokud je křemenná kapilára v CE systému pokryta materiálem o niţším indexu lomu neţ má roztok uvnitř kapiláry, nemusí být pouze separační částí aparatury, ale můţe mít i funkci světlovodu s kapalným jádrem (Liquid-Core Waveguide, LCW). Takovým materiálem je např. polymer Teflon AF. V miniaturizovaných FI- nebo SI-CE systémech s fluorescenční detekcí (FI-LCW-CE) je analyt v roztoku uvnitř kapiláry excitován zářením přiváděným přes stěnu kapiláry kolmo na separační kanál a generované fluorescenční záření je vedeno kapalinou v kapiláře k jejím koncům. K detekčnímu konci kapiláry je přiloţeno klasické světlovodné vlákno vedoucí záření k fotonásobiči, případně je fotonásobič umístěn přímo proti detekčnímu konci kapiláry. Mezi kapiláru a fotonásobič bývá vloţen jednoduchý optický absorpční filtr. Fluorescence je v těchto systémech buzena světloemitujícími diodami (LED). Podrobnosti o LCW-CE i s kapilárami běţných délek lze nalézt v přehledových referátech 15,16 . 111

Kombinace CE aparatur s kapalinovou chromatografií Pro separace sloţitějších směsí látek jsou výhodné analytické postupy vyuţívající více separačních principů. Z tohoto hlediska je velice výhodným 2D separačním systémem kombinace kapalinové chromatografie (LC, HPLC) s kapilární elektroforézou. Prvou metodou, např. LC s reversními fázemi, jsou látky separovány především na základě rozdílné hydrofobicity, zatímco metodou druhou na základě jejich náboje, případně velikosti. CE je navíc metodou rychlou, především při pouţití krátkých separačních kapilár, proto je vhodná jako druhá v 2D systému, dovoluje tak větší volnost v časové optimalizaci prvního separačního stupně. Účinným analytickým nástrojem se kombinace LC-CE stává tehdy, je-li moţno dávkování vzorku do druhého separačního stupně automatizovat. Jednou z moţností je pouţití elektronicky řízeného 6-ti cestného dávkovacího ventilu 17. Eluent z LC kolony plní jeho dávkovací smyčku a ventil je v pravidelných intervalech přepínán a obsah dávkovací smyčky veden kolem dávkovacího konce CE kapiláry, kde je analyt elektrokineticky nadávkován. V době plnění smyčky protéká kolem dávkovacího konce kapiláry separační pufr pumpovaný pomocnou pumpou. V případě mikrokolonové kapalinové chromatografie, atraktivní pro praxi z hlediska vysoké separační účinnosti a malé spotřeby vzorku a mobilní fáze, je průtok eluentu malý, takţe je interface s dávkovacím ventilem obtíţně pouţitelný. Proto bylo vyvinuto speciální tokem kapaliny řízené (Flow Gating, FG) interface 18. Výstup z LC mikrokolony je orientován v malé vzdálenosti proti dávkovacímu vstupu CE kapiláry v prostoru, jímţ můţe kolmo na tok z kolony protékat řídící roztok (separační pufr pro CE) z pomocné pumpy. Tok řídícího roztoku prostorem interface je ovládán ventilem. Při průtoku řídícího roztoku je eluent z kolony odváděn do odpadu a jeho nadávkování do CE kapiláry je tak zabráněno. Elektrokinetické nadávkování analytu je umoţněno pouze při přerušení toku řídícího roztoku na definovanou dobu. V tradiční CE a ve všech doposud uvedených variantách CE s krátkou kapilárou je do kapiláry dávkován vzorek ve formě zóny, jejíţ délka je řízena dávkovacím zařízením pracujícím na určitém mechanickém principu. To je faktor znemoţňující dávkování velmi krátkých zón a dosaţení velkých dávkovacích rychlostí, coţ je velice ţádoucí pro vícedimenzionální separační metody. Pro vzorky obsahující analyty, které lze označit vhodnou fluorescenční značkou, bylo vyvinuto opticky řízené (Opticaly Gated, OG) interface, umoţňující definované dávkování vzorku po dobu pouhých desítek ms do kapilár o efektivní délce jednotek aţ desítek mm 19. Princip je následující: roztok se stanovovanou sloţkou označenou fluorescenční značkou (např. fluorescein-isothiocyanátem, FITC) prochází v důsledku elektromigrace a EOF kontinuálně separační kapilárou. Dávkování je řízeno zářením z kontinuálního laserového zdroje. Záření je rozděleno na dva výkonově nestejné paprsky, které jsou soustředěny na kapiláru v určité vzdálenosti od sebe. Paprsek nesoucí více neţ 90 % výkonu je soustředěn na místo blíţe vstupnímu konci kapiláry a způsobuje fotolýzu značeného analytu na nefluoreskující látku. Druhý paprsek, soustředěný na místo blíţe detekčnímu konci kapiláry je součástí LIF detektoru a je určen k buzení fluorescence. Pokud není fotolyzující paprsek zastíněn, přichází do LIF detektoru pouze nefluoreskující látky a ţádná fluorescence nemůţe být buzena. Krátkodobým zacloněním fotolyzujícího paprsku (na řádově ms) je generována zóna vzorku obsahující analyt s fluorescenční značkou, který můţe být detegován LIF detektorem. K separaci tedy dochází v délce kapiláry mezi oběma paprsky. Potenciální moţnosti této metody jsou patrné z následujícího příkladu 20: v kapiláře o vnitřním průměru 6 m, délce 5 mm a době dávkování 5 ms bylo dosaţeno úplné separace (na základní linii) směsi Arg, Phe, Gly a Glu za 0,7 s. Brzdou jejího širšího rozšíření do analytické praxe je zřejmě poněkud sloţitá potřebná instrumentace. 112

Závěr Z uvedeného přehledu je vidět, ţe metodika CE separací v krátkých kapilárách umoţňuje rychlé a efektivní řešení mnoha analytických problémů vyţadujících separace látek v jedno i vícedimenzionálních separačních systémech. Za uvedené výhody je však nutno zaplatit. Dobrých separačních účinností je dosahováno v kapilárách o malém vnitřním průměru a při dávkování malých mnoţství vzorku, kdy jsou v kapiláře velmi úzké zóny separovaných látek. To klade velké nároky na citlivost detekčních metod. Z toho důvodu je při separacích v krátkých kapilárách často pouţívána LIF detekce, která je jednak metodou citlivou a jednak umoţňuje detekci ve velice krátkém úseku kapiláry. Při separacích v extrémě krátkých kapilárách, kdy se migrační časy jednotlivých látek liší i o zlomky sekund, je rovněţ nutno pouţívat velmi rychlých metod pro sběr dat z detektoru. Kolem jednoduchého separačního prostředí – krátké separační kapiláry, je tak soustředěna poměrně sloţitá instrumentace zajišťující dávkování vzorku a detekci separovaných látek. To je však obecný problém valné většiny mikroseparačních metod. Poděkování Práce vznikla při řešení projektů podporovaných MŠMT ČR, výzkumný záměr MSM 0021620857 a GA ČR, grant P206/10/1231. Literatura 1. Opekar F., Coufal P., Štulík K.: Chem. Rev. 109, 4487 (2009). 2. Jorgenson J. W., Lukacs K. D.: Anal. Chem. 53, 1298 (1981). 3. Altria K. D., Kelly M. A., Clark B. J.: Chromatographia 43, 153 (1996). 4. Zemann A. J.: J. Chromatogr. A 787, 243 (1997). 5. Bergholdt A. B., Lehmann S. V.: Chirality 10, 699 (1998). 6. Monnig C. A., Jorgenson J. W.: Anal. Chem. 63, 802 (1991). 7. Zhang Y., Lee H. K., Li S. F. Y.: Talanta 45, 613 (1998). 8. Wu X. Z., Huang T. M., Liu Z., Pawliszyn J.: TrAC – Trends Anal. Chem. 24, 369 (2005). 9. Chen X. G., Fan L. Y., Hu Z. D.: Electrophoresis 25, 3962 (2004). 10. Hanrahan G., Dahdouh F., Clarke K., Gomez F. A.: Curr. Anal. Chem. 1, 321 (2005). 11. Kubáň P., Engström A., Olsson J. C., Thorsén G., Tryzell R., Karlberg B.: Anal. Chim. Acta 337, 117 (1997). 12. Kubáň P., Pirmohammadi R., Karlberg B.: Anal. Chim. Acta 378, 55 (1999). 13. Fu C. G., Fang Z. L.: Anal. Chim. Acta 422, 71 (2000). 14. Cao X. D., Fang Q., Fang Z. L.: Anal. Chim. Acta 513, 473 (2004). 15. Wang S. L., Fang Z. L.: Anal. Bioanal. Chem. 382, 1747 (2005). 16. Okada T.: Electrophoresis 28, 3414 (2007). 17. Bushey M. M., Jorgenson J. W.: Anal. Chem. 62, 978 (1990). 18. Lemmo A.V., Jorgenson J. W.: Anal. Chem. 65, 1576 (1993). 19. Monnig C. A., Jorgenson J. W.: Anal. Chem. 63, 802 (1991). 20. Moore A. W., Jorgenson J. W.: Anal. Chem. 65, 3550 (1993).

113

Bioimpedance Methods to Measure Somatometric and Volumetric Changes (Identifikace somatometrických a volemických změn bioimpedančními metodami) Miroslav Petr a, Eva Kohlíková a, and Tomáš Navrátil b a Charles University in Prague, Faculty of Physical Education and Sport, Department of Physiology and Biochemistry, José Martího 31, 162 52 Prague 6, Czech Republic, E-mail: [email protected] b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Assessment of human body composition has stimulated the need for an understanding of available methodologies of estimating fat-free mass and percent body fat. In our study, we found statistical significant changes of body composition evaluated by multi-frequency bioelectrical analysis in a group of athletes following creatine supplementation. These results are consistent with literature i.e. supplemented creatine effects osmolality of cell‟s membranes which leads to increased intracellular water retention. Multi-frequency BIA can be considered to be an accurate and sensitive method for assessment of human body composition. Key words: Bioelectrical Impedance Analyses, multi-frequency BIA, Body Weight, Fat Tissue, Body Composition. Úvod Stanovení tělesné hmotnosti a výšky poskytuje uţitečná avšak neúplná data o tělesném sloţení jedince. Z tohoto důvodu se jiţ v minulosti začal projevovat zájem o detailnější posouzení tělesné kompozice zejména pak v oborech, které mají co do činění s vývojovými aspekty jedince nebo jeho výţivou. V současné době je k hodnocení tělesné kompozice vyuţíváno mnoho metodik, v naprosté většině se jedná o dvou-segmentální modely, které rozdělují tělo na tukovou a beztukovou hmotu. Metody bioelektrické impedance (BIA) jsou moderní neinvazivní, rychlé a relativně levné metody k určování tělesného sloţení jak v laboratoři, tak v terénních podmínkách. Princip metodiky je zaloţen na odlišných elektrických vlastnostech tkání, tuku a hlavně tělesné vody 1 . Jiţ v roce 1971 byly popsány elektrické vlastnosti jednotlivých tkání. Později byly prozkoumány na širším rozsahu frekvencí a na větším mnoţství typů tkání 2, 3. Thomasset ve svých pracích stanovoval elektrickou impedanci jako index celkové tělesné vody s pouţitím dvou jehel vpíchnutých do podkoţí 2, 3. Hoffer et al. 4 byli první, kdo pouţili techniku BIA s vyuţitím čtyř povrchových elektrod. Nevýhodou těchto elektrod je však nutnost pouţití vysoké intenzity proudu (800 mA) a vysokého napětí, aby se sníţila nestabilita probíhajícího proudu s ohledem na podkoţní impedanci (10.000 Ω/cm2) 5. V sedmdesátých letech minulého století byla zaloţena metoda BIA a krátce potom se na trhu objevilo jiţ několik jednofrekvenčních analyzátorů. V devadesátých letech na trh vstoupily multi-frekvenční analyzátory. Vyuţití BIA jako metody vhodné pro pacienty fixované na lůţko se rychle rozšířilo díky své jednoduchosti, mobilnosti, bezpečnosti a reprodukovatelným výsledkům. Teprve nedávno byla vyvinuta metoda segmentální BIA, jejímţ cílem bylo řešení nekonzistence mezi odporem a tělesnou hmotou trupu 6. Princip metodiky je zaloţen na odlišných elektrických vlastnostech tkání, tuku a hlavně tělesné vody 1. Spočívá v tom, ţe tukuprostá hmota, obsahující vysoký podíl vody a elektrolytů, je dobrým vodičem proudu, zatímco tuková tkáň se chová jako izolátor a špatný vodič. Čím je tedy větší podíl vody a tukuprosté hmoty, tím menší odpor je kladen elektrickému proudu a tím jsou niţší hodnoty impedance 7. Odpor (R) homogenního vodivého

114

materiálu s daným průřezem je přímo úměrný jeho délce (L) a nepřímo úměrný jeho průřezu (A). Přestoţe tělo není rovnoměrný válec a jeho vodivost není konstantní, mezi impedančním kvocientem (L2/R) a mnoţstvím vody obsahující elektrolyty existuje empirický vztah. V praxi je jednodušší měřit výšku neţ vodivost délky, které se obvykle týká vzdálenosti od zápěstí po kotník. Z tohoto důvodu existuje empirický vztah mezi beztukovou hmotou, obsahující obvykle 73% vody a výškou2/R. Díky obecné nehomogenitě těla popisuje termín výška2/R odpovídající válec, který musí být skutečné geometrii přizpůsoben příslušným koeficientem. Tento koeficient je závislý na několika faktorech, k nimţ patří i anatomie vyšetřovaných segmentů. Při změnách výšky a délky vodivého materiálu v důsledku variability tvaru těla a tělesných segmentů proto dochází k odchylkám měření 6. Multi-frekvenční BIA vyuţívá podobně jako jedno-frekvenční analyzátory lineární regresní model s tím rozdílem, ţe zohledňuje impedanci při různých frekvencích (0, 1, 5, 50, 100, 200 aţ 500 kHz). Při frekvencích pod 5 kHz a nad 200 kHz byla zaznamenána nízká reprodukovatelnost 8. Podle Patel et al. (1996) 9 je multi-frekvenční BIA bez ohledu stanovení extracelulární tekutiny přesnější a zkresluje méně neţ jedno-frekvenční BIA. Na druhou stranu se jedno-frekvenční BIA ve srovnání multi-frekvenční BIA ukázala být méně přesná pro stanovení celkových tělesných tekutin u nemocných jedinců 9. Hannan et al. 10 uvádí, ţe multi-frekvenční BIA poskytuje lepší výsledky ohledně stanovení celkového mnoţství tělesných tekutin neţ bioelektrická spektroskopie. Olde-Rikkert et al. (1997) poznamenává, ţe multi-frekvenční BIA není schopna detekovat změny distribuce tekutin mezi extracelulárním a intracelulárním prostorem u starších jedinců 11. Zastánci multi-frekvenční BIA metody však tvrdí, ţe nízkofrekvenční proud (< 10 kHz) nedokáţe prostoupit buněčnou membránou, která tak brání jeho průniku dovnitř buňky. Takto můţe být stanoven odhad objemu extracelulární tekutiny. Na druhou stranu, vysokofrekvenční proud (> 50 kHz) snadno proniká skrze membránu, prochází buněčnou tekutinou, čehoţ je následně vyuţito ke stanovení objemu extracelulární tekutiny a objemu celkových tělesných tekutin 12. Cílem naší práce bylo zaznamenat krátkodobé změny tělesné kompozice metodou BIA během 30 denní suplementace kreatinem a to u skupiny sportovců s konstantním stravovacím a pohybovým reţimem. Suplementace kreatinem je dlouhodobě vyuţívána sportovci k podpoře regeneračních procesů po zátěţi, zejména během nástupů krátkodobé intenzivní činnosti. Zlepšení výkonnosti se po příjmu kreatinu se mj. projevuje hypertrofií svalové tkáně, zvýšením svalové síly a zvýšeným podílem aktivní tělesné hmotnosti 13-16. Jedním z nepříznivých účinků podávání kreatinu je nárůst tělesné hmotnosti, který je vysvětlován právě vyšším zadrţováním tělesných tekutin 17-19. Experimentální část Soubor byl tvořen muţi (n = 11) ve věku od 21 – 28 let (24,8). Všichni probandi byli mladí, zdraví a fyzicky aktivní jedinci věnující se sportovní činnosti, která byla v průběhu studie monitorována 20-23. Probandům byl podáván potravní doplněk – kreatin monohydrát (Plutino, ČR) v dávce 5g/den po dobu 30 dnů. Bezprostředně před zahájením suplementace kreatinem byla změřena tělesná hmotnost a provedeno měření BIA s ohledem na stanovení hmotnosti svalové tkáně, tělesného tuku, bílkovin a dále objemu intracelulární a extracelulární tekutiny a celkové tělesné vody. K těmto analýzám bylo vyuţito multifrekvenčního analyzátoru In Body 3.0, který segmentálně vyuţívá frekvencí 5, 50, 250 a 500kHz. Dle základního principu BIA je tělo rozděleno na pět segmentů. Měření jsou prováděna pomocí osmibodových tetrapolárních dotekových elektrod. Na základě regresních rovnic byly následně z hodnot impedance odvozeny jmenované parametry 24. Do rovnice vstupují kromě hodnot impedance parametry

115

věk, tělesná výška, hmotnost a pohlaví 25. V přístroji lze nastavit i rasu měřené osoby (white, black, asian). In Body 3.0 umoţňuje stanovit nejen celkovou tělesnou vodu a rozlišit extracelulární a intracelulární tekutinu, ale měří i segmentální rozloţení tekutin v končetinách a trupu. Pomocí těchto parametrů lze diagnostikovat asymetrické sloţení těla či případné svalové dysbalance. Ke statistickému zhodnocení bylo vyuţito párového t-testu, jehoţ výsledkem je informace o rozdílnosti středních hodnot. K jednotlivým proměnným byl dále vypočítán korelační koeficient. Výsledky a diskuse Výsledky t-testu BIA jsou znázorněny Tabulce I. Signifikantní změny v naší skupině probandů nastaly téměř ve všech posuzovaných parametrech. Průměrně došlo ke zvýšení tělesné hmotnosti, nárůstu svalové hmoty, sníţení tělesného tuku, zvýšení intracelulární nikoliv však extracelulární tekutiny i nárůstu bílkovin. U těchto proměnných zároveň vysoká hodnota korelačního koeficientu napovídá, ţe se jednalo o systematické změny u všech měřených osob a ţe tyto změny nebyly důsledkem odlehlého pozorování. Tabulka I. Výsledky t-testu BIA. Parametr tělesná hmotnost (kg) svalová hmota (kg) svalová hmota (%) tělesný tuk (kg) tělesný tuk (%) tekutina intracelulárně (l) tekutina intracelulárně (%) tekutina extracelulárně (l) tekutina extracelulárně (%) celkový objem tělesné vody (l) celkový objem tělesné vody (%) obsah bílkovin (kg) obsah bílkovin (%)

Průměr pre-test 83,20 67,97 81,94 10,78 12,70 36,56 44,09 16,79 20,20 53,34 64,29 14,64 17,65

Průměr post-test 84,20 69,44 82,67 10,22 11,94 37,49 44,65 16,91 20,13 54,40 64,76 14,99 17,89

Tstat

P (T≤t)

r

-2,32 -3,21 -1,99 1,80 1,95 -3,50 -2,54 -1,07 0,61 -2,98 -1,62 -3,25 -2,64

0,020 0,005 0,037 0,051 0,040 0,003 0,015 0,154 0,276 0,007 0,068 0,004 0,012

0,99 0,99 0,93 0,97 0,93 0,99 0,92 0,99 0,92 0,99 0,93 0,99 0,91

Podobná zjištění uvádí i literatura 18, 26, 27. Předpokládá se, ţe zadrţování tekutiny ve svalových vláknech nastává vlivem zvýšení intracelulární osmolarity 17. Podobně jako v naší studii, Ziengenfuss et al. (1998) 27 naměřili největší nárůst objemu intracelulární tekutiny, coţ bylo dále registrováno jako zvýšení tělesné hmoty. Na výše popsaných změnách tělesné kompozice má jistě významný podíl i kvantita a především druh pohybové aktivity, kterou probandi v průběhu suplementace vykonávali. V souladu s literaturou je moţné BIA pojímat jako dostatečně citlivou metodu k posouzení volemických změn během krátkodobých sledování. Závěr Pomocím měření tělesné kompozice metodou BIA byly zaznamenány statisticky signifikantní změny, nejvíce pak u intracelulární tekutiny. Tato zjištění jsou v přímém souladu s literaturou, tj. ţe kreatin ovlivňuje osmolaritu na buněčných membránách a jeho suplementace způsobuje vyšší zadrţování intracelulární tekutiny. Metodu multi-frekvenční BIA lze povaţovat za 116

dostatečně citlivou k efektivnímu posouzení krátkodobých volemických změn jako např. v důsledku zvýšeného zadrţování tekutin po výţivové intervenci. Podpora Studie byla finančně podpořena grantem MSM 0021620864, grantem GA AV ČR IAA400400806 a GA ČR P206/11/1638). Literatura 1. Lukaski H. C.: Am. J. Clin. Nutr. 46, 537 (1987). 2. Thomasset A.: Lyon Med. 209, 1325 (1963). 3. Thomasset M. A.: Lyon Med. 94, 107 (1962). 4. Hoffer E. C., Meador C. K., Simpson D. C.: J. Appl. Physiol. 27, 531 (1969). 5. Boulier A., Fricker J., Thomasset A. L., Apfelbaum M.: Am. J. Clin. Nutr. 52, 581 (1990). 6. Kyle U. G., Bosaeus I., De Lorenzo A. D., Deurenberg P., Elia M., Manuel Gomez J., Lilienthal Heitmann B., Kent-Smith L., Melchior J. C., Pirlich M., Scharfetter H., A M. W. J. S., Pichard C.: Clin. Nutr. 23, 1430 (2004). 7. Lukaski H. C., Johnson P. E., Bolonchuk W. W., Lykken G. I.: Am. J. Clin. Nutr. 41, 810 (1985). 8. Hannan W. J., Cowen S. J., Fearon K. C., Plester C. E., Falconer J. S., Richardson R. A.: Clin. Sci. 86, 479 (1994). 9. Patel R. V., Peterson E. L., Silverman N., Zarowitz B. J.: Crit. Care Med. 24, 1824 (1996). 10. Hannan W. J., Cowen S. J., Plester C. E., Fearon K. C., deBeau A.: Clin. Sci. 89, 651 (1995). 11. Olde Rikkert M. G., Deurenberg P., Jansen R. W., van't Hof M. A., Hoefnagels W. H.: J. Am. Geriatr. Soc. 45, 1345 (1997). 12. Ziegenfuss T. N., Rogers M., Lowery L., Mullins N., Mendel R., Antonio J., Lemon P.: Nutrition 18, 397 (2002). 13. Balsom P. D., Harridge S. D. R., Soderlund K., Sjodin B., Ekblom B.: Acta Physiol. Scand. 149, 521 (1993). 14. Greenhaff P. L., Bodin K., Soderlund K., Hultman E.: Am. J. Physiol. 266, E725 (1994). 15. Green A. L., Sewell D. A., Simpson L., Hultman E., Macdonald I. A., Greenhaff P. L.: J. Physiol.-London 491P, P63 (1996). 16. Kreider R. B., Ferreira M., Wilson M., Grindstaff P., Plisk S., Reinardy J., Cantler E., Almada A. L.: Med. Sci. Sports Exerc. 30, 73 (1998). 17. Jeukendrup A., Gleeson M.: Sport nutrition: An introduction to energy production and performance 1st edition ed.; Human Kinetics, 2004. 18. Kutz M. R., Gunter M. J.: J. Strength Cond. Res. 17, 817 (2003). 19. Volek J. S., Duncan N. D., Mazzetti S. A., Strom R. S., Putukian M., Gomez A. L., Pearson D. R., Fink W. J., Kraemer W. J.: Med. Sci. Sports Exerc. 31, 1147 (1999). 20. Petr M.: PhD Thesis, Charles University, Prague, 2007. 21. Navratil T., Kohlikova E., Petr M., Heyrovsky M., Pelclova D., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Senholdova Z.: Food Chem. 112, 500 (2009). 22. Navratil T., Kohlikova E., Petr M., Pelclova D., Heyrovsky M., Pristoupilova K.: Physiol. Res. 59, 431 (2010). 23. Navratil T., Petr M., Senholdova Z., Pristoupilova K., Pristoupil T. I., Heyrovsky M., Pelclova D., Kohlikova E.: Physiol. Res. 56, 113 (2007). 24. Thomas B. J., Cornish B. H., Ward L. C.: Journal of clinical engineering 17, 505 (1992). 25. Kushner R. F.: J. Am. Coll. Nutr. 11, 199 (1992). 26. Kilduff L. P., Pitsiladis Y. P., Tasker L., Attwood J., Hyslop P., Dailly A., Dickson I., Grant S.: Int. J. Sport Nutr. Exe. 13, 504 (2003). 27. Ziegenfuss T. N., Lowery L. M., Lemon P. W. R.: J. Exe. Physiol. 1, (1998).

117

The Effect of Ionic Strength on Protonation Equilibria of 6-Benzylaminopurine (Vliv iontové síly na protonační rovnováhu 6-benzylaminopurinu) Iveta Pilarova a, Zdenka Balcarova a, Nuria Serrano b, and Libuse Trnkova a a Department of Chemistry, Faculty of Science, Masaryk University, Kotlarska 2, CZ-611 37 Brno, Czech Republic, e–mail: [email protected], [email protected] b Departament de Química Analítica, Facultat de Química, Universitat de Barcelona, Martí i Franquès 1-11, E–08028 – Barcelona, Spain, e-mail: [email protected] Abstract Derivatives of adenine, known as cytokinins (CKs), are one of the five major groups of phytohormones, which support cell division, bud formation, branching of stems, and metabolism of plants. One of the most important cytokinins, 6–benzylaminopurine (6–BAP), was studied by two electrochemical methods, potentiometry and voltammetry. Attention was paid to the effect of ionic strength on their behaviour in water–methanol solutions. Potentiometric titrations enabled to determine the protonation constants (pKa) and voltammetric study (linear sweep voltammetry – LSV and elimination voltammetry with linear scan – EVLS) allowed to determine not only their reduction potentials but also deeper evaluation of their reduction processes. Due to potential antitumor activity of derivatives of 6–BAP it is very important to gain further insight into the mechanism of reduction depending on two parameters such as pH and ionic strength, which play a significant role in a living organism. Key words: Cytokinins, phytohormones, 6–benzylaminopurine, Antitumor activity, Potentiometric titration, Cyclic voltammetry, Protonation constants, Reduction potential, Electrode process. Introduction All derivatives of adenine, named as cytokinins (CKs), are one of the five major groups of phytohormones. CKs promote cell division, bud formation, branching of stems, and setting of blossoms. Depending on the nature of the side chain, derivatives of adenine belong to two subgroups: the first one, labelled as isoprenoid (trans–zeatin, cis–zeatin, N6– isopentenyladenine) and the second one, the aromatic subgroup (N6-benzylaminopurines, topolins, etc.). One of the most important CKs is 6-benzylaminopurine (6–BAP) 1. BAP and its derivatives are active and easily obtainable plant growth promoting substances 2. From the electrochemical point of view, purine and its derivatives represent a group of substances with typical electroactive properties. The redox properties of purines at mercury and carbon electrodes have been studied previously 3. In the case of some phytohormones, the anodic oxidation on carbon electrode has been used for analytical purposes. The redox behaviour of 6–BAP on mercury electrode in buffered solution using DC polarography, cyclic and differential pulse voltammetry, and constant potential coulometry has been studied recently 4. From the suggested mechanism the protonation constants (pKa) of 6–BAP were determined 4. Nowadays, attention is also given to derivatives of 6–BAP due to the antitumor activity of all chlorine derivatives 5-7.

118

Fig. 1. N6-benzylaminopurine (6–BAP) The goal of our research is the electrochemical study of 6–BAP by potentiometric and voltammetric measurements. From potentiometric measurements the protonation constants depending on ionic strength have been obtained. The determination of redox potential, possibilities of electroanalysis and the mechanism of the electrode process have been performed on the basis of electrochemical measurements. In order to increase the electroanalytical sensitivity of all derivatives, as well as to solve the mechanism of electrode processes, the elimination voltammetry with linear scan (EVLS) has been used. EVLS, as the mathematical procedure applied to LSV results, allows the elimination or conservation of some partial currents by using a certain elimination function. The elimination function chosen is formed by a linear combination of linear scan voltammetric (LSV) or cyclic voltammetric (CV) total currents measured at different scan rates. Different types of elimination functions are able to detect minor processes which are hidden in major processes, and provide new information about the mechanism of electrode processes 8-17. Experiment a) Potentiometric titration Potentiometric titrations were performed with the automatic titrator Titrando 835 by Metrohm AG in conjunction with the Tiamo 1.2 software. Potential changes during the titration were recorded using a combined glass ISE electrode LL Ecotrode plus. All measurements were carried out in tempered 50 ml tubes (25 °C) connected to a thermostat under inert argon atmosphere. The standard titration solution was 0.1 M NaOH (Sigma Aldrich; 97 %; p. a.) prepared in 10 % (v/v) CH3OH (Penta, Chrudim; 99 %; p.a.). Potassium hydrogen phthalate C8H5O4K was purchased from Sigma Aldrich (p.a.) and, at a concentration of 0.1 M, used for the standardization of 0.1 M NaOH. The ionic strength was adjusted with 1 M NaCl (Sigma Aldrich; ACS reagent; ≥ 99 %; p.a.). Before each measurement, calibration of the electrode with 0.1 M HCl (Penta, Chrudim; 35 %; p.a.) was carried out. 1mM 6–BAP (Lachema; N.P. Brno; purum) solution was used for the measurements. The data obtained were evaluated using MS Excel software. b) Linear sweep and elimination voltammetry Using an electrochemical analyser AUTOLAB PGSTAT 20 connected with VA Stand 663, electrochemical behaviour of 6–BAP (1x10-5 M) was studied in phosphoric acetic buffer at pH 3.1 and ionic strength (0.1 – 1M NaCl) with 10 (v/v) percentages of CH3OH. Experiments were carried out at 25 °C. The voltammetric parameters were as follows: time of conditioning of the electrode was 2 s, and scan potential was changed from -1.1 V to -1.7 V. The voltammetric curves were measured at different scan rates from 100 to 800 mV/s and Autolab was controlled by GPES software. LSV data obtained were evaluated by elimination voltammetry with linear scan (EVLS). We used the function with simultaneous elimination of kinetic and charging currents and with the diffusion current conservation. The elimination function for scan rates based on multiples of two: f(I) = 17.485I – 11.657I1/2 – 5.8584I2 (E4-

119

EVLS) was applied 8-17. This elimination function increases current sensitivity and offers the possibility of fast studying if the depolariser is adsorbed at the electrode surface or not. Results and discussion Potentiometry The protonation constants pKa of 6–BAP at different ionic strength I, (from 0.1 to 1 M NaCl) in 10 % (v/v) CH3OH at a temperature of 25 °C were determined and the effect of ionic strength was discussed. The pKa values were computed using the following equations:

pKa1

log H

log

z

pKa2

1 z

log H

log

1 z z

where z is the degree of titration. The values of pKa of 6–BAP are presented in Tables I which pays attention to the dependence of pKa of 6–BAP on ionic strength. Table I. Dependence of both pKa of 6-BAP on ionic strength (25 °C). Ionic strength [M] 6–BAP 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 pKa1 3.750 3.745 3.743 3.736 3.730 pKa2 9.710 9.690 9.670 9.660 9.650

0.7 3.800 9.750

0.8 3.840 9.800

1 3.880 9.810

The pKa1 values with 1% deviation and pKa2 with 0.7% deviation were measured.

Fig. 2. Dependence of pKa of 6-BAP on ionic strength. Fig. 2 shows that pKa decreases in the range of ionic strength from 0.1 to 0.5 M (NaCl); at ionic strength 0.5 M (NaCl) the dependence reaches a minimum, but in the range of ionic strength from 0.7 to 1 M (NaCl) an increase of pKa is observed. The visible break could be explained from the similar behaviour of the dependence on the activity coefficient with ionic strength18. 120

Linear sweep and elimination voltammetry 0.1 -0.1 -0.3

I [μA]

-0.5 -0.7 BAP at I=0.1 M pH 3.14

-0.9 BAP at I = 0.5 M pH 3.14 BAP at I = 1 M pH 3.14

-1.1 -1.3 -1.5 -1500

-1450

-1400

-1350

-1300 E [mV]

-1250

-1200

-1150

-1100

-1150

-1100

Fig. 3. LSV of 6-BAP in 10 % of CH3OH at different ionic strengths. 2 1.5 elimination function

1 0.5 0

-0.5

BAP at I=0.1 M pH 3.14

-1

BAP at I=0.5 M pH 3.14

-1.5 -2

BAP at I=1 M pH 3.14

-2.5 -3 -1500

-1450

-1400

-1350

-1300 -1250 E [mV]

-1200

Fig. 4. E4-EVLS of 6-BAP in 10 % of CH3OH at different ionic strengths. Typical LSV peaks of 6–BAP are presented in Fig. 3. The BAP reduction is an irreversible process. The pH value of the basic electrolyte (phosphoric – acetic buffer), in which the experiment was conducted, was set at 3.14. According to pKa values obtained by potentiometric titration, we can assume that the protonisation of BAP molecules occurs at this pH. In the LSV curves some small indications of a second process are visible (at more negative potentials), which were revealed by EVLS in the form of a second peak (Fig.4). The process at more negative potentials is strongly depending on pH and ionic strength. It takes

121

place in an adsorbed state and using EVLS the peak is higher and more pronounced than LSV corresponding signal. It indicates the advantage of EVLS for this application. We found that the effect of ionic strength is stronger in the case of BAP than of its derivatives (not given). The highest reduction signals are observed at the ionic strength of 0.1 M. Conclusions The protonation constants of 6–BAP depending on ionic strength (0.1 – 1 M NaCl) in 10 % of CH3OH were determined by potentiometric titration. In the range of ionic strength from 0.1 to 0.5 M (NaCl) a decrease of pKa is presented; at an ionic strength of 0.5 M (NaCl) the curve pKa = f (I) reaches its minimum, but in the range of ionic strength from 0.7 to 1 M (NaCl) an increase of pKa is shown. In the LSV curves measured at pH 3.14 (Fig. 3) some indications of a second process are visible which were revealed by EVLS in the form of a second peak (to be discussed elsewhere). This process, taking place in an adsorbed state, is more visible at 6– BAP than in the case of its derivatives and the effect of ionic strength is stronger in the case of 6–BAP than in the case of its derivatives. It is interesting that the highest reduction signals are observed at an ionic strength of 0.1 M. Acknowledgement This research was supported by projects INCHEMBIOL MSM0021622412 and BIO-ANALMED LC06035 and MUNI/A/0992/2009 the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic. Núria Serrano gratefully acknowledges financial support from Ministerio de Ciencia e Innovación, mediante el Programa Nacional de Movilidad de Recursos Humanos del Plan Nacional de I-D+i 2008-2011. References 1. Tarkowski P., Dolezal K., Strnad M.: Chem. Listy 98, 834 (2004). 2. Strnad M.: Physiol. Plant 101, 674 (1997). 3. Dryhurst G.; Electrochemistry of Biological Molecules. London, 1977. 4. Tarkowska D., Kotoucek M., Dolezal K.: Collect. Czech. Chem. Commun. 68, 1076 (2003). 5. Klanicova A., Travnicek Z., Vanco J., Popa I., Sindelar Z.: Polyhedron 29, 2582 (2010). 6. Malon M., Travnicek Z., Marek R., Strnad M.: J. Inorg. Biochem. 99, 2127 (2005). 7. Malon M., Travnicek Z., Marysko M.; Marek J., Dolezal K., Rolcik J., Strnad M.: Transit. Met. Chem. 27, 580 (2002). 8. Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 402, 19 (1996). 9. Trnkova L.: J. Electroanal. Chem. 582, 258 (2005). 10. Trnkova L., Kizek R., Dracka O.: Electroanalysis 12, 905 (2000). 11. Trnkova L.: Application of elimination voltammetry with linear scan in bioelectrochemistry. In: Bioelectrochemical and Mathematical Methods in Biological Research, Ed.: Adam, V. and Kizek, R: Signpost, Kerala, Chaper 4, p. 51, 2007. 12. Trnkova L.: Chem. Listy 95, 518 (2001). 13. Trnkova L., Dracka O.: J. Electroanal. Chem. 348, 265 (1993). 14. Trnkova L., Jelen F., Postbieglova I.: Electroanalysis 15, 1529 (2003). 15. Trnkova L., Jelen F., Postbieglova I.: Electroanalysis 18, 662 (2006). 16. Serrano N., Klosova K., Trnkova L.: Electroanalysis 22, 2071 (2010). 17. Trnkova L., Novotny L., Serrano N., Klosova K., Polaskova P.: Electroanalysis 22, 1873 (2010). 18. Boukhalfa N.; Meniai A.H.; Desalination 206, 38 (2007).

122

Comparison of Voltammetric and UV Spectrometric Determination of Selected Aliphatic Phthalates Munawar Saeed Qureshi a, Jan Fischer b, Jiří Barek b, Sirajuddin a, and Muhammad Iqbal Bhanger a a National Centre of Excellence in Analytical Chemistry, University of Sindh, Jamshoro 76080, Pakistan b Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030, 12843 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Sensitivity of UV spectrometric determination for dibutyl phthalate (DBP), diethyl phthalate (DEP), didecyl phthalate (DDP), and diallyl phthalate (DAP) was compared with voltammetric determination on a hanging mercury drop minielectrode (HMDmE) and a meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). UV spectrometry suggests similar sensitivity like differential pulse voltammetry (DPV) on m-AgSAE, both in methanolic media, on micro molar level. DPV on a hanging mercury drop minielectrode (HMDmE) in 0,1 mol.l-1 tetramethylammonium bromide (TMAB) in methanol was ten times more sensitive. Key words: Dibutyl phthalate, Diethyl phthalate, Didecyl phthalate, Diallyl phthalate, Differential pulse voltammetry, Meniscus modified silver solid amalgam electrode, Hanging mercury drop minielectrode, UV spectrometry. Introduction Phthalates are widely used as plasticizer, additives in polymeric products, deodorants, nail polishes, printer inks, insecticides, toys, PVC shower curtains, lubricants, food wraps, bloodbags, catheters, etc. Potential toxicity of phthalates is actual topic today. Therefore, interest about phthalates is growing and new analytical methods for their determination are developed. They are reducible at highly negative potentials and it opens an area for using electrochemical methods, which can be for specific application useful more than traditional methods like UV spectrometry. Experimental All reagents were of analytical grade. DEP (density 1.118 g.ml-1, 99.5%), DBP (density 1.043 g.ml-1, 99%), DDP (density 0.97 g.ml-1, 95%), were purchased from Fluka, Germany, and DAP (density 1.1 g.ml-1, 99%), from Sigma-Aldrich, Germany. TMAB was purchased from Lachema Brno, Czech Republic. Stock solutions of phthalates (c = 0.01 mol.l-1) were prepared by dissolution of precisely weighed amount of test substances in methanol (Lachner Chemicals, Czech Republic). Computer controlled Eco-Tribo Polarograph with Polar Pro software version 5.1 (both Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic) was used. Either HMDmE of the UM E type with drop surface area 0.785 mm2, or m-AgSAE with disk diameter 0.485 mm, all from EcoTrend Plus, Prague, Czech Republic was used as working electrode. The way of preparation of m-AgSAE was described earlier 1, 2. UV spectra were measured in quarz cuvettes (optical path length 1.0 cm; Hellma, Heiloo, Netherlands) vs. methanol using Agilent 8453 UV-visible Spectrophotometer driven by UV-visible ChemStation 9.01 software (both Agilent Technologies, Santa Clara, USA).

123

Results and discussion Absorption maximum for pthalates was found at 224 nm, 223 nm, 225 nm, and 226nm for DEP, DBP, DDP, and DAP, respectively. These wave lengths are close to absorption edge of methanol solvent, bud the results were better than at second absorption maximum around 275 nm. Methanol was used as solvent because it is commonly used as an elution agent after solid phase extraction 3. Therefore, calibration dependences were measured at these optimal conditions in ranges from 1.10-4 to 2.10-5 mol.l-1 and from 1.10-5 to 2.10-6 mol.l-1. Lower range was under detection limits for all phthalates and in higher range the calibration dependence was not was not linear. Earlier developed methods of DPV on HMDmE and m-AgSAE were used for determination of the same contraction of these phthalates. 4 Different organic salts as supporting electrolyte for DP voltammetric determination of phthalates in non-aqua methanolic media were tested. The optimal results were obtained with 0,1 mol.l-1 TMAB in methanol. Calibration dependences were measured at these optimal conditions in ranges from 1.10-4 to 2.10-5 mol.l-1 and from 1.10-5 to 2.10-6 mol.l-1 for both m-AgSAE and MHDmE. Sensitivity of HMDmE allowed to work in the range from 1.10-6 to 2.10-7 mol.l-1. Sensitivity of all methods is summarized in Table I and in Fig. 1 calibration curves of these methods for DAP are depicted. Table I. Parameters of methods for determination of DBP, DEP, DDP, DAP using voltammetry on HMDmE, on m-AgSAE in 0.1 mol l-1 TMAB in methanol and UV-spectroscopy in methanol. Name of Concentration Slope LOQ Slope LOQ Slope LOQ phthalate range mol.l-1

nA.µmol-1.l

µmol.l-1

HMDmE

nA.µmol-1.l

µmol.l-1

m-AgSAE

AU.µmol-1.l

µmol.l-1

UV-spectrometry

DEP

( 2 – 10 ) 10-5

–8.10

–

–2.93

–

0.0077

–

DEP

-6

–7.81

–

–2.78

3

0.0072

4

DEP

( 2 – 10 ) 10

-7

–6.18

0.3

–

–

–

–

DBP

( 2 – 10 ) 10-5

–7.48

–

–2.28

–

0.0091

–

DBP

( 2 – 10 ) 10

-6

–6.02

–

–2.03

2

0.0114

5

DBP

( 2 – 10 ) 10-7

–7.84

0.3

–

–

–

–

DDP

( 2 – 10 ) 10-5

–8.26

–

–2.10

–

0.0095

–

DDP

-6

–6.26

–

–2.37

4

0.0086

2

-7

–5.03

0.5

–

–

–

–

-5

–6.08

–

–2.11

–

0.0097

–

DAP

( 2 – 10 ) 10

-6

–7.50

–

–1.92

4

0.0093

1

DAP

( 2 – 10 ) 10-7

–8.64

0.3

–

–

–

–

DDP DAP

( 2 – 10 ) 10

( 2 – 10 ) 10 ( 2 – 10 ) 10 ( 2 – 10 ) 10

124

1,0 100 µM

0,05

0,05

0,0 0

0,5

40

50

0,00

100 c, µM

4

0

5 c, µM 10

0

0,00

250

I, nA

0

2

20

-270

B

A

8 6

60

0,0

0,10

10 µM

A

A 0,5

80

A

0,10

A

1,0

100 µM

-220 Ip, nA -110

0 0

-160

250

, nm 300

-150 I, nA

C

80 50 100 c, µM

60

-20 Ip, nA -10 0 0

-100

,nm

300

D

10 µM 8 6 4

5 10 c, µM

40 20

2

0

0

-50

-50 -1500

-1600

I, nA

-400

-1500

-16

E

Ip, nA -300

0 0

-1800 E, mV

100 µM

-600

-600

-1700

I, nA

80 50 100 c, µM

-1700

-8

1.0 µM

Ip, nA -4

-10

60

-1600

0 0,0

F

0.8 0,5 1,0 c, µM

0.6 0.4

40 -200

-1800 E, mV

0.2

20

0

-4

0 -1500

-1600

-1500

-1700 -1800 E, mV

-1600

-1700 -1800 E, mV

Fig. 1. Absorption spectrums (A, B) in methanol solvent, DP voltammograms in 0.1 mol l-1 TMAB in methanol on m-AgSAE (C, D) and on HMDmE (E, F) for DAP, numbers next to curves correspond to given concentration, inset corresponding calibration dependence.

125

Conclusions Both UV spectrometry in of methanol and DPV at m-AgSAE can be used for the determination of tested phthalates in micromolar level. DPV on HMDmE in methanolic solutions is suitable also for determination of submicromolar concentration. Generally, electrochemical methods suggest fully compatible alternative and they are more selective for direct determination of phthalates than UV detection. Acknowledgements Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC 06035, RP 14/63 and MSM 0021620857), of Charles University (project SVV 2011-263204) and of the Grant Agency of the Czech Republic (project P206/10/P087) is gratefully acknowledged. M.S.Q. thanks for the financial support of the Higher Education Commission of Pakistan. References 1. Yosypchuk B., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1138 (2002). 2. Fischer J., Vanourkova L., Danhel A., Vyskocil V., Cizek K., Barek J., Peckova K., Yosypchuk B., Navratil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007). 3. Suzuki T., Yaguchi K., Suzuki S., Suga T.: Environ. Sci. Technol. 35, 3757 (2001). 4. Qureshi S. M., Fischer J., Barek J., Sirajuddin, Bhanger M. I.: Electroanalysis 22, 1957 (2010).

126

Indirect voltammetric analysis of fluoride ions in toothpaste at IDA microelectrodes (Nepriame voltampérometrické stanovenie fluoridov v zubnej paste na IDA mikroelektródach) Miroslav Rievaj a, Ľubomír Švorc a, Peter Tomčík b, Monika Čerňanská, and Dušan Bustin a a Slovak University of Technology, Faculty of Chemical and Food Technology, Institute of Analytical Chemistry, Radlinského 9, 812 37 Bratislava, Slovak Republic, E-mail: [email protected] b Catholic University in Ruţomberok, Faculty of Education, Department of Chemistry, Hrabovská cesta 1, 034 01 Ruţomberok, Slovak Republic Abstract A novel technique based on dynamic electrochemistry for the detection of fluoride ions was developed. It is based on its strong complexation with ferric ion. Formed fluoroferric complex is cathodically inactive at the potential of the reduction of free ferric aquo ion. Interdigitated microelectrode array (IDA) was used as an indicating electrode. In comparison with ISE electrodes this method is faster and also avoiding large error resulting from the antilogarithmization of ISE Nerstian response. The method was applied to the analysis of toothpaste. Key words: Fluoride ions, Interdigitated microelectrode array, Toothpaste, Voltammetry. Introduction Simple anions or their derivatives play an important role in biological, chemical, and technological processes; therefore there is an increasing interest in the development of analytical methods for their detection. Fluoride anion is a relevant species in toothpaste for caries prevention. Its quantification, however, is limited to a few methods. The most popular in this respect is fluoride ion selective electrode (ISE) introduced by Frant and Ross 1. This device has a membrane with single crystal of LaF3 with high electrical conductance, good mechanical properties, wide fluoride concentration range response as well as an enhanced selectivity for fluoride ion 2. The response of ISE is Nernstian what may cause a large error of analytical results due to necessity of antilogarithmization. Other methods recently published are based on ion-pairing chromatography 3, fluorescence 4 and colorimetry 5. Microstructures with interacting diffusion layers 6 and interdigitated microelectrode arrays 7 are very popular in contemporary electrochemistry. They can be used as HPLC 8, biamperometric 9 or FIA 10 detectors in various applications as well as for mechanistic studies in reaction electroanalysis 11. In this paper a method for the detection of fluoride ions based on dynamic electrochemistry is presented. It is based on chemical reaction of fluoride with ferric ion forming fluoroferric complex which is electroinactive at the potential of the reduction of ferric aquo ion. A conventional interdigitated microelectrode array 12 with interconnected segments is used as an amperometric detector of unreacted ferric ion. In this study we would like to extend the amperometric approach of IDA towards electroinactive species with limitations of dynamic electrochemical detection. Experimental All chemical were of analytical grade purity and tripply distilled water was used for the preparation of all solutions. Sodium chloride (NaCl, Lachema CZ) with a concentration of 0.2 mol.L−1 as a supporting electrolyte and ferric(III) chloride (FeCl3, Lachema CZ) with a concentration of 0.5 mol.L−1 were pipetted into an electrolytic cell. Additions of 0.5 mol.L−1 sodium fluoride (NaF, Lachema CZ) were byretted. Fluoride stock solution was stored in polyethylene flask to avoid interferences by Si4+, which forms with fluoride ion complex and reduces free fluoride concentration in the stock solution.

127

Toothpaste from several suppliers served as real sample. Approximately 0.5 g of the sample was weighed into a 100 mL Teflon beaker. The mixture after addition of 30 mL water was boiled for 5 min to allow total dissolution of the suspension. Than it was infused to column filled with ion exchanger Dowex X-4 in H+ cycle to bond some cations (e.g. Al3+) forming complexes with fluoride to avoid possible interference or decreasing free fluoride amount in the sample. Finally, the effluent was transferred into 50 mL polyethylene volumetric flask and filled at the mark. A commercial planar interdigitated platinum microelectrode array from ALS company (Fig.1) was used. The widths of both microelectrode digits and the gap between them were 5 m. The whole system had 65 (2mm long) digits. Model PAR 273A potentiostat (EG&G, Princeton Applied Research, Princeton, NJ) was employed for electrochemical measurements. The reference electrode was conventional SCE and platinum macroelectrode of area 1 cm2 served as a counter.

Fig. 1. A schematic depiction of commercial Pt IDA microelectrode ALS Co., Ltd., Tokyo, Japan. Width of digit We and gap Wgap are 5 μm, length of digit is 2 mm, number of digits in both arrays is 65, thickness of Pt film is 1 μm. The whole electrode is covered with nonconductive insulating film except active window area of 2 × 4 mm (depicted as a frame). Results and discussion The analytical technique for the detection of fluoride presented in this contribution is based on the chemical complexation of Fe in the solution in which aqueous Fe3+ ion reacts with fluoride anion forming fluoroferric complex. This complex is electroinactive at the potential of the reduction of aqueous Fe3+ cation. Diffusion current of the reduction of Fe3+ to Fe2+ is decreased due to its electrodeactivation by complexation with fluoride. This decreasing is proportional to the concentration of free fluoride anion and can be utilized for its detection. Linear sweep voltammograms of the Fe3+ reduction in the presence of fluoride ions were registered and they are depicted on Fig 2. The peak height was diminished with increasing concentration of fluoride. This diminishing can be utilized for its determination. The dependence of peak decrease on fluoride concentration was investigated and found to be linear in fluoride concentration in the range from 5 10-5 to 8 10-3 mol.L−1 fitting the equation (In-I0) = A +B.cF- , where the I0 is the peak current without addition of fluoride, In is decreased peak current after n additions of fluoride, intercept A is equal to 4.2 A with SDA = 0.13 A and the magnitude of slope B is 7988 A mol-1 L with SDB = 281.3 A.mol-1.L (R=0.997). The detection limit calculated according to 3 SDA criterion was estimated to 4.5 10-5 mol.L−1.

128

Fig. 2. Fluoride influence on IDA voltammetric response of the Fe3+ reduction. Voltammograms of 20 mL of 5 10-3 mol.L−1 Fe3+ in 0.2 mol.L−1 NaCl in voltammetric vessel with additions of 0.5 mol.L−1 NaF solution. 1 - no fluoride, 2 - 0.1 mL, 3 - 0.2 mL, 4 0.3 mL, 5 - 0.4 mL, 6 - 0.5 mL. We also tried to establish a concept of amperometric variant of this technique in the stirred solution. In experiments of this type a constant potential was kept on the value of -0.6 V vs. SCE and current-time characteristics was measured. Amperometric response of Fe3+ was also found to be sensitive to fluoride additions (Fig. 3.).

Fig. 3. Fluoride influence on IDA amperometric response of the Fe3+ reduction. The limiting current time dependence of stirred solution 10 mL 5 10-3 mol.L-1 Fe3+ in 0.2 mol.L−1 NaCl in voltammetric vessel with stepwise additions 0.1 mL, 0.2 mL, 0.3 mL, 0.4 mL, 0.5 mL of 0.5 mol.L−1 NaF solution marked with arrows.

129

Observed sensitivity IDA to fluctuation convection could be significant limitation to this determination. Detection limit of 2.4 10-4 mol.L-1 calculated from the dependence of current on fluoride concentration was calculated using the same criterion as in voltammetric mode showed above and is one order lower than in the case classical voltammetric titration on platinum IDA microelectrode. Model samples analysis was performed for validation of the developed technique. The results are summarized in Table I. Four samples of NaF solutions with fluoride content of 500 μg were analyzed. Multiple standard addition method was used for obtaining the concentration in all analysis. The mean of six parallel determinations does not statistically differ from taken values. Table I. Model samples analysis (6 parallel determinations of each model sample). Taken, μg

Found, μg

SD, μg

500 500 500 500

530 470 460 510

42 41 43 39

Confidence interval for 95% probability, % 106 ± 10 94 ± 11 92 ± 12 102 ± 9

Tooth pastes from different producers served as real samples. The results of their analysis are in Table II. Analyses were performed voltammetrically in an unstirred solution. All samples were also analyzed potentiometrically with fluoride selective ISE. The results obtained by presented voltammetric technique are in good agreement with results obtained by ISE which was original used in analytical practice. Table II. Real samples analysis of fluoride content in toothpaste (4 analyses for both voltammetric and potentiometric methods). F- contenta, SD, F- contentb, SD, F- contentc, µg.g-1 µg.g-1 µg.g-1 µg.g-1 µg.g-1 A 1352 151 1388 127 1450 B 1349 126 1361 118 1400 C 441 39 459 29 500 A: Signal Crystal Gel Fresh & White, Unilever Slovakia, Slovak Republic, Bratislava B: Sensodyne F - Fluoride, GlaxoSmithKline, Czech Republic, Prague C: Aquafresh Kids, GlaxoSmithKline, Czech Republic, Prague a determined by this method b determined by ISE potentiometry as an independent method c declared by manufacturer Sample

Detection limit of proposed technique based on decreasing of reduction current of aqueous iron(III) in NaCl after its complexation with fluoride forming electroinactive hexafluoroferrate 4.5 10-5 mol.L-1 was obtained in the voltammetric variant of the technique in quiet solution. Amperometric variant is faster but has 3 SDA detection limit of 2.4 10-4 mol.L-1 because of large current fluctuations which appeared when the solution was stirred.

130

Our method based on dynamic electrochemistry can be a faster and more precise alternative to ISE potentiometry in the fluoride content monitoring. Conclusions Platinum comb-shaped interdigitated microelectrode array (IDA)was used in development of the method for the determination of fluoride. Proposed technique is based on decreasing of reduction current of aqueous iron(III) in NaCl solution after its complexation with fluoride forming electroinactive fluoroferric complex. Detection limit of 4.5 × 10−5 mol.L−1 was obtained in the voltammetric variant of the technique in quiet (unstirred) solution. Amperometric variant has detection limit of 2.4 × 10−4 mol.L−1 because large current fluctuations appeared when the solution is stirred. The method was applied to the analysis of toothpaste. This method based on dynamic electrochemistry can be considered a faster and more precise alternative to ISE potentiometry. Acknowledgments This work was supported by the Slovak Grant Agency of Sciences, VEGA (Project No. 1/0066/09 and Slovak Research and Development Agency under the contract No. APVV0057-06). References 1. Frant M.S., Ross J.P.: Science 154, 1553 (1966). 2. Shen W., Wang X.D., Cattral R.W.: Electroanalysis 7, 930 (1995). 3. Jeyakumar S., Raut V.V., Ramakumar K.L.: Talanta 76, 1246 (2008). 4. Seo S.M., Cho E.J., Lee S.J., Nam K.C., Park S.-H., Jung J.H.: Micropor. Mesopor. Mater. 114, 448 (2008). 5. Sun M.Z., Wu F.Y., Wu Y.M., Liu W.M., Spectrochim. Acta A: Mol. Biomol. Spectrosc., 2008. doi:10.1016/j.saa.2008.02.024. 6. Lowinsohn D., Richter E.M., Angnes L., Bertotti M.: Electroanalysis 18, 89 (2006). 7. Tomčík P., Bustin D.: Coll. Czech. Chem. Commun. 65, 1029 (2000). 8. Kasai N., Matsue T., Uchida I., Horiuchi T., Morita M., Niwa O.: Denki Kagaku 64, 1269 (1996). 9. Milardovic S., Kerekovič I., Rumenjak V.: Food Chem. 105, 1668 (2007). 10. Paixao T.R.L.C., Matos R.C., Bertotti M.: Talanta 61, 725 (2003). 11. Tomčík P., Mesaroš Š., Bustin D.: Anal. Chim. Acta 374, 283 (1998). 12. Tomčík P., Jenčušová P., Krajčíková M., Bustin D., Manová A., Čakrt M.: J. Electroanal. Chem. 593, 167 (2006).

131

The Electrochemically-Assisted Growth of Lysozyme Crystals at the Surface of Platinum Disc Electrodes Barry R. Silver a, and Patrick R. Unwin b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Department of Chemistry, University of Warwick, Gibbet Hill Road, Coventry, CV4 7AL, United Kingdom, E-mail: [email protected] Abstract The enhanced, rapid, and probably controllable growth of lysozyme crystals at the surface of platinum disc electrodes, using an applied current and a simplified crystallizing solution, is demonstrated. A mechanism based on electrochemically-induced “shifts” in solution conditions are suggested and briefly discussed within the context of the protein/precipitant phase diagram. Key words: Lysozyme, Crystallization, Electrodes, Protein, Nernst diffusion layer. Introduction The formation of protein crystals with good X-ray diffraction quality is a fundamental step in the elucidation of protein structure via X-ray crystallography 1. Methods used to obtain protein crystals are largely trial and error; indeed the precise mechanisms by which many protein crystals nucleate and grow is not completely understood 1. The nucleation and growth of lysozyme crystals from homogeneous solution has been studied over a wide range of pH and solution conditions 1. It has been shown previously that low pH promotes the nucleation process, but leads to the formation of a large number of relatively small crystals 1. Here, we show how electrochemistry can be used to control the growth of protein crystals, exemplified through studies of the protein lysozyme. The approach presented herein may be generic for producing high quality protein crystals for X-ray diffraction studies. Additionally, we tentatively suggest a possible mechanism for the electrochemically-assisted protein crystal growth process. The mechanism is based on electrochemically-induced shifts in initial solution (crystallizing) conditions which may be tracked using protein/precipitant phase diagrams. Experimental A simple two-electrode DC galvanostatic system was used and was housed within Teflon wells of volumes 1 cm3 and 3 cm3 respectively. This arrangement enabled an electrical current to be passed through the lysozyme crystallizing solution. Experiments conducted within the 3 cm3 Teflon well system comprised a „single well‟ arrangement (SW) which comprised a single polished 2 mm platinum (Pt) disc working electrode. Experiments conducted within 1 cm3 well volumes were of a „multi-well‟ arrangement (MW) which comprised a total of six 1 cm3 wells incorporating six hand-made and polished 750 µm diameter Pt disc working electrodes (encased within 7.5 mm resin). Platinum gauze served as the counter electrode, and current densities ranging from 0 – 4.5 A/m2 were applied for a period of 2 hours in all cases. Crystallizing solutions of various composition (vide infra), were made up using equal aliquots of lysozyme (Sigma-Aldrich, UK) and NaCl. Both constituents were separately dissolved in Milli-Q water, added together and then centrifuged for 30 min at 13000 rpm before being loaded into the wells. In some experiments, lysozyme was conjugated to a fluorescent succinimidyl ester, (Alexa Flour 488, Invitrogen, UK). The crystals were made fluorescent by the addition of 0.5% (v/v) Alexa Flour 488 labeled protein to the crystallizing solution (prepared as described above).

132

The fluorescent crystals so obtained were visualized in-situ using confocal laser scanning microscopy (CLSM, model Zeiss LM 510) at various time periods using an excitation wavelength of 488 nm, with detection of emission above 505 nm. All crystals (whether fluorescent or non-fluorescent) were also examined via in-situ optical microscopy. Additionally, some experiments within the SW contained 10 µM fluorescein, added to allow pH changes near the electrode surface to be monitored and visualised using CLSM 2, 3 Crystals formed within the MW were viewed in-situ using optical microscopy after 2 hours of electrolysis. Results and discussion

Fig. 1. A, B and C in-situ optical micrographs of crystals formed with the SW using the 37.5 mg/ml lysozyme and 4.37 (w/v) % NaCl. The scale bar shown in 1.A, 1.B and 1.C is 350 µm and micrographs were taken after 2 hours. (A) Crystals formed with an applied current of 1.6 A/m2 (B) without applied current and (C) without applied current and bulk solution pH set to 3. (D) Fluorescence intensity map perpendicular to the electrode surface within the SW (1.6 A/m2 applied current). White areas indicate solution pH ≥ 6.5 whilst darker areas indicate solution pH < 5. Elongated white areas on the electrode are lysozyme crystals which have incorporated fluorophore during growth. (E) In-situ CLSM micrograph of the electrode interface and the surrounding layer of insulating Bakelite after 45 min of applied current within the SW. The blue line indicates the interface between the electrode and the surrounding insulating material. Dark circles within the blue line are oxygen bubbles formed via electrolysis. (F) Time dependence of background-subtracted fluorescence intensity at the electrode surface as a result of growth and dissolution of fluorescently labeled lysozyme crystals (SW arrangement). From 0–1777 s, 5 µA current was applied. The current was then switched to 12 µA from 1777–1924 s and dissolution was seen. From 1924–2649 s, 5 µA was again applied and growth resumed. For 2649 s onwards a current of 20 µA was applied and rapid dissolution resulted. In-situ CLSM images taken at several times are shown (not background subtracted, area shown 550 mm x 550 mm). Figs. 1.D, 1.E and 1.F contain the same crystallizing solution as that used in Fig. 1.A. An applied anodic current clearly has a large effect on the extent of lysozyme crystallization on the surface of a Pt disc electrode (Fig. 1.A-C and 1.E). Using CLSM, evidence for a crystal 133

dissolution process at higher applied current densities was found (Fig.1.F). A pH gradient (due to water oxidation) above the surface of the Pt electrode is clearly evident (Fig. 1.D). An approximate value for the pH at the electrode surface may be deduced by assuming a linear proton concentration gradient and noting that bulk solution is recovered at a distance of approximately 300 µm, as seen in Fig. 1.D. The distance is of the order of the Nernst diffusion layer as measured at macroscopic electrodes 4. The pH at the electrode surface was therefore calculated to be approximately pH 3 1. Potentials reached during the course of a 2 hour electrolysis experiment were as high as 1.9 V (vs. counter electrode, data not shown).

Fig. 2. A-D. In-situ optical micrographs illustrating the wide extent of lysozyme crystal formation within the MW after 2 hours electrolysis. Crystallization was performed using a range of initial solution conditions in conjunction with a range of applied current densities (indicated by numbers on each panel in A/m2). Initial solution conditions for 2.A were 30 mg/ml lysozyme and 4.5 (w/v)% NaCl , for 2.B, 45 mg/ml lysozyme and 3.5(w/v)% NaCl , for 2.C, 37.5 mg/ml lysozyme and 4.5 (w/v)% NaCl and for 2.D, 45 mg/ml lysozyme and 4.5 (w/v)% NaCl. Pt electrodes, encased in resin, at the centre of each panel were 750 µm in diameter. The extent of lysozyme crystallization at the surface of Pt electrodes after 2 hours electrolysis within the MW, using a wide range of initial solution conditions in conjunction with a wide range of current densities was extremely varied (Fig.2.A-D). The seemingly unpredictable variation cannot be explained via the oxidation of water alone. Since potentials (up to 1.9 V vs. counter electrode) were high enough to initiate chloride oxidation, this electrochemical process must also be considered. We therefore assume that both water and chloride oxidation were major processes at the electrode surface and conjecture therefore that there may be concentration gradients of both H+ (as shown in Fig.1.D) and Cl- in existence. Using these basic, yet reasonable assumptions, the results presented (in Fig. 1 and Fig. 2 for example) may be explained. The growth and dissolution processes evident at the Pt electrode surfaces due to applied current (as evidenced in Fig. 1 and Fig.2) may be rationalised via the use of lysozyme/NaCl phase diagrams initially plotted over a range of pH conditions by Iwai et al. 5. For example, a range of initial starting solution conditions (ISSC) are indicated on Fig.3.B. When an anodic

134

current is first applied, the pH decreases due to proton production. The locally decreased pH (from pH 7.5 to pH 2.5, Fig. 3.B for example) results in ISSC being placed further within the nucleation zone. The result of this particular shift may be many nucleation events with little crystal growth (as seen in Fig. 1.C for example). However, ISSC must remain within the nucleation zone for a certain period of time (termed the induction period) for the formation of critical nuclei. As chloride oxidation may become more prevalent at higher potentials the ISSC may begin to move out of the nucleation zone and into one of the metastable zones. If any nuclei have formed, they will grow favorably in this zone. If no nuclei have formed by the time solution moves out of the nucleation zone then no crystals will be formed on the electrode surface. Additionally, any crystals which are taken into the undersaturated region may begin to dissolve (as is seen in Fig. 1.F at higher current densities). The path from the nucleation zone into the undersaturated region may be easily realized via increases in the extent of water and chloride oxidation at higher current densities.

Fig. 3. A The lysozyme/NaCl phase diagram from Iwai et. al 5drawn at pH 4.5 illustrates the three physical conditions in which a lysozyme crystallizing solution may exist. Fig. 3.B depicts a modified (from Iwai et. al) lysozyme/NaCl phase diagram plotted over a range of pH conditions. Each coloured-line pair corresponds to a different pH. Yellow squares on 3.B indicate initial crystallizing solution compositions, such as that used within Fig. 2 for example. The big wavy arrow in 3.B indicates a shift due to chloride oxidation and the small arrows in 3.B. indicate a shift due to proton production. Unfortunately this simple, yet reasonable mechanism provides only a qualitative view of the process. What is required for high control over the electrochemically-assisted protein growth process is a detailed quantitative approach with high temporal and spatial resolution. However, there are a number of technical issues associated with an analytical approach based traditional electrochemical methods. Three such issues are outlined, for the sake of an example. Firstly, when current is initially applied (to the working electrode), a thick layer of protein coats the electrode surface (data not shown). This blocking layer confounds accurate determination of current efficiency (and hence rates) associated with both water and chloride oxidation. Secondly, lysozyme has complex buffering behavior which confounds accurate pH gradient prediction via CLSM-based methods 2, 3. Thirdly, protein/precipitant diagrams would

135

need to be plotted over a range of pH values in order to provide an accurate „map‟ of the three crystallization zones at different pH values. A crystallization protocol would have to be in existence in order to draw such diagrams for each protein/precipitant system. Despite many technical difficulties associated with the establishment of a more detailed quantitative approach, we suggest the use of a „direct experimental approach‟ in order to accurately map concentration gradients at various heights and at various times above the electrode surface. In this regard, the use of (ion-selective) microelectrodes incorporating nanoscopic spatial control would needed and is therefore strongly suggested for future work aimed at providing a more detailed quantitative picture of the changing concentration gradients of ions at various heights and at various times above the electrode surface. Once these concentration gradients are known, electrochemically-induced shifts in initial solution conditions may be followed using accurately constructed phase diagrams. Conclusions DC electrolysis has been shown to be an effective means to enhance and possibly control the growth of a simple lysozyme crystallizing system. For the first time, a qualitative mechanism has been suggested which can reasonably explain the extent of lysozyme crystallization on Pt electrodes from a wide range of initial starting conditions in conjunction with a wide range of applied current densities. A more detailed quantitative approach is suggested. The quantitative approach may allow a high degree of control of the lysozyme crystal growth process. Acknowledgements B.R.S. is grateful to the Molecular Organization and Assembly in Cells Doctoral Training Centre (MOAC DTC), the Engineering and Physical Sciences Research Council (EPSRC), and GA AV CR (project No. IAA400400806) for providing funding for this research. References 1. Silver B. R., Unwin P. R.: Chem. Commun. 41, 5179 (2008). 2. Rudd N. C., Cannan S., Bitziou E., Ciani I., Whitworth A. L., Unwin P. R.: Anal. Chem. 77, 6205 (2005). 3. Bitziou E., Rudd N. C., Edwards M. A., Unwin P. R.: Anal. Chem. 78, 1435 (2006). 4. Amatore C., Szunerits S., Thouin L., Warkocz J.-S.: J. Electroanal. Chem. 500, 62 (2001). 5. Iwai W., Yagi D., Ishikawa T., Ohnishi Y., Tanaka I., Niimura N.: Journal of Synchrotron Radiation 15, 312 (2008).

136

A Novel Type of Carbon Paste Electrode Modified With Antimony Trifluoride (SbF3) and its Applicability in Electrochemical Stripping Analysis (Nový typ uhlíkové pastové elektrody modifikované fluoridem antimonitým, SbF3 a její možné využití v elektrochemické rozpouštěcí analýze) Matěj Stočes and Ivan Švancara Department of Analytical Chemistry, University of Pardubice, CZ-532 10, Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Fundamental characterization of carbon paste electrodes (CPE) modified by various amount of SbF3 has been done. The optimal amount of SbF3 in carbon paste has been investigated. As a most suitable electrode for detection of cadmium(II) and lead(II) on μg per litre level appears 3% SbF3-CPE This electrode shows good stability linearity at concentration range 0 – 120 μg/L. Key words: Antimony film electrode, Carbon paste, Heavy metals. Úvod Anodická stripping voltametrie (ASV), někdy uváděna jako anodická rozpouštěcí voltametrie, je jednou z nejčastěji pouţívaných elektroanalytických technik pro stanovování těţkých kovů. Díky účinnému nahromadění analytu na povrchu pracovní elektrody během prekoncentračního kroku dovoluje ASV operovat ve velmi nízkých koncentračních úrovních 1 – μg/L aţ ng/L. Velmi frekventovanými pracovními elektroda pro tyto účely jsou kovové filmové elektrody. V minulých letech hojně pouţívané rtuťové filmové elektrody 2,3 začaly být pomalu vytlačovány ekologicky „přívětivějšími“ filmovými elektrodami. Uplatnění našly jak filmy na bázi zlata 4,5, olova 6, cínu 7, tak zejména díky relativně blízkým elektrochemickým vlastnostem i bizmutové 8,9,10 (BiFEs) a antimonové 11 filmové elektrody (SbFEs). Samotné antimonové, respektive antimon / antimon oxidové, elektrody jsou velmi dobře známy jako potenciometrické senzory pro měření pH 12,13. V nedávně době však bylo zaznamenáno úspěšné pouţití SbFEs připravených in situ na povrchu skelného uhlíku a uhlíkových skelných vláken11. V současnosti je jiţ známo několik konfigurací a aplikací SbFEs v oblasti elektrochemické rozpouštěcí analýzy, např. ve formě uhlíkových pastových antimonových elektrod 14,15 (SbF-CPE) nebo jako antimonová diamantová elektroda dopovaná nanočásticemi boru 16. Její pouţití nezůstává jen u samotné techniky ASV, ale v několika pracích je vyuţita i pro chronopotenciometrická měření 11,17,14,15. Většinovým přístupem při přípravě SbFEs elektrod je depozice antimonového filmu in situ nebo ex situ elektrochemickou redukcí antimonového kationtu z roztoku. Na základně analogických vlastnosti s uhlíkovými bizmutovými filmovými elektrodami (BiF-CPE) modifikovanými bizmutový prachem 18 nebo oxidem bismutitým 10, byly připraveny uhlíkové pastové elektrody modifikované oxidem antimonitým 19. U těchto typů elektrod odpadá nutnost přidávání iontu kovu do měřeného roztoku (v případě in situ), či příprava speciální pokovovací lázně (ex situ). Tato práce se zabývá základní studií, charakterizací a aplikací uhlíkové pastové elektrody modifikovaní fluoridem antimonitým (SbF3) pro stanovení nízkých koncentrací olova a kadmia (Pb2+, Cd2+) v prostředí kyseliny chlorovodíkové.

137

Experimentální část Chemikálie Všechny pouţité chemikálie byly čistoty p.a od firmy Aldrich nebo Merck. Standardní roztoky olova a kadmia o koncentraci 1000 mg/L byly zakoupeny od firmy Merck a ředěny dle potřeby na příslušné koncentrace redestilovanou vodou. Příprava pracovních elektrod Uhlíková pastová byla připravena důkladným smícháním 2 g uhlíkového prášku (CR-5, Lučební závody Kolín) s 0.860 g vysoce viskózního silikonového oleje (SO, typ LUKOIL MV 8000; Lučební závody Kolín). Z této uhlíkové pasty byly připraveny tři pracovní elektrody přimísením a homogenizováním SbF3 o obsahu 1% w/w, 3% w/w a 10% w/w (SbF3-CPE). Obdobně byla připravena i uhlíková elektroda s obsahem 3% Sb2O3 (Sb2O3CPE). Vzniklé pasty byly vpraveny do elektrodových pouzder vlastní konstrukce20. Instrumentace Pro všechna měření v reţimu stripping voltametrie bylo pouţito elektrochemické pracovní stanice Autolab PGSTAT12 (Eco Chemie, Utrecht, Nizozemsko) ovládané pomocí softwaru GPES (Eco Chemie). Pracovní elektrodou byla příslušná modifikovaná uhlíková pastová elektroda (1% SbF3-CPE, 3% SbF3-CPE, 10% SbF3-CPE, 3% Sb2O3-CPE); referenční elektroda Ag/AgCl a pomocná platinová elektroda. Všechna měření byla prováděna ve voltametrické nádobce v objemu 20 ml při konstantní laboratorní teplotě (20 ± 2 ºC). Metody a techniky měření Elektrochemická měření byla realizována metodou anodické stripping voltametrie. Akumulace analytu na povrchu pracovní elektrody probíhala při potenciálu -0.9 aţ -1.4 V, po dobu 20 aţ 900 s. Po době klidu (10 s) bylo provedeno voltametrické měření technikou square-wave voltametrie (frekvence 50 Hz, amplituda 50 mV). Před kaţdým měření byla rovněţ prováděna kondicionace elektrody (30 s při potenciálu 0.2 V). Výsledky a diskuse První předběţná měření s SbF3-CPE byla prováděna v modelovém roztoku 0.01M HCl, který obsahoval 90 μg/L olova a kadmia. Srovnání elektrod s rostoucím obsahem SbF3 v uhlíkové pastě je znázorněno na obr. č. 1. Uhlíková pasta s příměsí jednoho procenta SbF3 (1% SbF3CPE) prokazovala nejniţší citlivost k oběma stanovovaným kovům. 3% SbF3-CPE v porovnání s ostatními SbF3-CPE poskytovala jednoznačně za daných podmínek nejvyšší hodnoty proudových signálu daných kovů. Vyšší obsah SbF3 v uhlíkové pastě jiţ měl za následek nejen dramatický pokles signálu olova a mírný pokles signálu kadmia, ale zejména zvýšení proudové pozadí. S ohledem na tato pozorování byla k dalším studiím pouţívána 3% SbF3-CPE. Při optimalizaci akumulačního procesu byla zjišťována jak nejúčinnější hodnota potenciálu, tak i doba akumulace. Dle očekávání docházelo s delší dobou akumulace k nárůstu signálů a naopak nad očekávání nedocházela ke stagnaci signálů při dlouhých dobách doba akumulace (900 s). Hodnota akumulační potenciálu ovlivňovala vyšší měrou signál kadmia, coţ je dáno i jeho více negativní hodnotou reoxidační potenciálu. Signál olova byl změnou potenciálu k více negativním hodnotám ovlivňován jen nepatrně. Pro další experimenty byl zvolen akumulační potenciál -1.1 V.

138

Závislost proudu na koncentraci kadmia a olova v roztoku na povrchu 3% SbF3-CPE zobrazuje Obr. 2. V rozsahu 0 – 120 μg/L oba sledované kovy jeví lineární odezvu (Obr. 3), stejně tak i pro koncentrace řádově desetkrát vyšší (obr. neuveden). Cd Pb 10% SbF3

Current

10 A

3% SbF3

1% SbF3

3% Sb2O3 -1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

Potential (V)

Obr. 1. Porovnání SbF3-CPE s různým obsahem SbF3 v 0.01 M HCl; c(cd) = c(pb)= 90 μg/L. Potenciál akumulace (Edep = -1.1 V;), doba akumulace (tdep = 120 s). Parametry square-wave voltametrie: frekvence 50 Hz, amplituda 50 mV. 25

Pb 20

Current ( A)

Cd 15

10

5

0 -1.0

-0.8

-0.6

-0.4

-0.2

Potential (V)

Obr. 2.: Square-wave stripping voltamogramy pro rostoucí koncentrace olova a kadmia na 3% SbF3-CPE. c(cd) = c(pb)= 0 - 120 μg/L. Ostatní podmínky viz Obr. 1. 25 y = 1.946E-7x - 2.874E-6 2 R = 0.9925

Pb

Peak current ( A)

20

Cd

15

y = 1.39E-7x - 1.557E-6 2 R = 0.9994

10

5

0 20

40

60

80

100

120

Concentration ( g/L)

Obr. 3.: Kalibrační křivka olova a kadmia na 3% SbF3-CPE. Podmínky viz Obr. 2.

139

Závěr Antimonové filmové elektrody připravované modifikací uhlíkové pastové SbF3 vykazují zajímavé elektroanalytické vlastnosti pro současné stanovení olovo a kadmia na koncentrační úrovni μg/L v prostředí 0.01M kyseliny chlorovodíkové. Mnoţství modifikátoru v uhlíkové pastě značně ovlivňuje signál daných kovů. Jak nejvhodnější se jeví 3% SbF3-CPE, která prokazuje nejvyšší citlivost k stanovovaným kovům. Poděkování Tato práce vznikla s podporou projektu MŠMT č.: MSM0021627502 a LC06035. Literatura 1. Wang J.: Analytical Electrochemistry, 3rd ed., Wiley-VCH, Hoboken, NJ, 2006. 2. Economou A., Fielden P. R.: Analyst 128, 205 (2003). 3. Bobrowski A. , Zarebski J.: Curr. Anal. Chem. 4, 191 (2008). 4. Korolczuk M., Rutyna I.: Electrochem. Commun. 10, 1024 (2008). 5. Tanaka T., Ishiyama T., Okamoto K.: Anal. Sci. 16, 19 (2000). 6. Tyszczuk K., Korolczuk M.: Anal. Chim. Acta 624, 232 (2008). 7. Zhu W.-W., Li N.-B., Luo H.-Q.: Talanta 72, 1733(2007). 8. Wang J.: Electroanalysis 17, 1341 (2005). 9. Kokkinos C., Economou A.: Curr. Anal. Chem. 4, 183 (2008). 10. Krolicka A., Pauliukaite R., Švancara I., Metelka R., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher K.,Vytřas K.: Electrochem. Commun. 4, 193 (2002). 11. Hočevar S.B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K., Anal. Chem. 79, 8639 (2007). 12. Brinkman R., Buytendiyk F.J.: J. Biochem. Z 199, 387 (1928). 13. Uhl A., Kestranek W., Monatsh. Chem. 44, 29 (1923). 14. Tesařová E., Baldrianová L., Hočevar S. B., Švancara I., Vytřas K., Ogorevc B.: Electrochim. Acta 54, 1506 (2009). 15. Tesařová E., Vytřas K.: Electroanalysis 21, 1075 (2009). 16. Toghill K.E., Xiao L.,. Wildgoose G.G, Compton R.G., Electroanalysis 21, 1113 (2009). 17. Švancara I., Hočevar S.B., Baldrianová L., Tesařová E., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 13, 5 (2007). 18. Hočevar S.B., Švancara I., Vytřas K., Ogorevc B.: Electrochim. Acta 51, 706 (2005). 29. Pauliukaite R., Metelka R., Švancara I., Krolicka A., Bobrowski A., Norkus E., Kalcher K., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice Ser. A 10, 47 (2004). 20. Švancara I., Metelka R., Vytřas K.: v Sensing in electroanalysis (Vytřas K., Kalcher K., eds.), str. 7-18. Univerzita Pardubice, Pardubice 2005.

140

Bismuth Film Electrode for Voltammetric Stripping Determination of Lead and Thallium in Organic Solvent (Využití bismutové filmové elektrody pro voltametrické stanovení olova a thallia v organických rozpouštědlech) Eva Svobodova a, Ivan Svancara a, Karel Vytras a, and Yukio Nagaosa b a Department of Analytical Chemistry, University of Pardubice, Studentska 573, CZ-532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Department of Applied Chemistry and Biotechnology, Graduate School of Engineering, University of Fukui, Bunkyo, Fukui 910-8507, Japan. Abstract In this contribution, anodic stripping voltammetric determination of lead(II) and thallium(III) in organic solvent, namely propylene carbonate, using the bismuth film electrode plated in-situ is presented. The measurements were performed directly in organic phase after gasstirred liquid-liquid extraction from hydrochloric acid solution and have confirmed the enhancement in sensitivity and selectivity of metal determination similarly to extractionpolarographic methods used some decades ago. Key words: Stripping voltammetry, Bismuth film electrode, Organic solvent, Liquid-liquid extraction, Lead, Thallium. Introduction Bismuth film electrodes (BiFEs), introduced for electrochemical stripping analysis more than ten years ago 1, belongs now to the most accepted alternative to mercury electrodes in this area 2. Their usage is mainly related to metal detection employing anodic or adsorptive stripping protocols in aqueous media. So far, the electrochemical detection in non-aqueous solution was not often studied except two recent attempts of using ionic liquid 3 and propylene carbonate 4. Nevertheless, the application of organic solvents can enhance the selectivity and sensitivity of metal determination as it was shown some decades ago by several extractionpolarographic methods 5, where the target metals were extracted in the form of complexes from water phase to organic phase. Then after establishing of equilibrium and separation of both phases, the metals could be directly detected in organic phase without the need of reextraction. The inconvenient solvent extraction step can be simplified by purging nitrogen through both phases, that carries out deoxygenation of the solution prior to analysis as well 6,7. In this work, we present anodic stripping voltammetric determination of lead(II) and thallium(III) in propylene carbonate using BiFEs. This study extends the previously invented procedure of constant current stripping chronopotentiometric determination of lead(II) after the extraction of its bromide complex into propylene carbonate 4. Experimental part All chemicals and reagents were of analytical grade purity and purchased from TCI - Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. or Wako Pure Chemical Indusries, Ltd. (Japan). All solutions were prepared with deionized and distilled water. Voltammetric analyzer Model P-1000 (Yanaco, Japan) controlled by VoltamRec software was employed for all differential pulse stripping voltammetric measurements. The conventional three-electrode configuration with Ag/AgCl (KCl satd.) reference and Pt-wire auxiliary electrode was used throughout the work. A plastic formed carbon (PFC) disk (BAS, Japan) was used as a working electrode substrate, which was plated in-situ with bismuth film.

141

Extraction and subsequent electrochemical measurements were performed in a onecompartment glass cell. Water phase of 2 mL consisted of 0.05 M HCl, 0.5 M KBr, usually 500ppb Bi(III) for in-situ plating and the target metal ion (Pb(II) or Tl(III)). Organic phase of 2 mL was made of propylene carbonate and 0.2 M tetrabutylammonium bromide (TBAB). The extraction was performed by purging of nitrogen through both phases for 60 s in order to extract the metal bromide complexes into the organic phase. After establishing of equilibrium between both phases, the electrochemical measurements in DPASV mode were carried out in organic phase. Results and discussion Determination of lead The voltammetric behavior of lead in a form of lead(II) bromide complex, which was before extracted from water phase into propylene carbonate phase, was studied by differential pulse anodic stripping voltammetric method. We have optimized the fundamental operational parameters, which influence either the formation of the bismuth film or the final stripping performance of the working electrode. The effect of varying the deposition potential on the peak of lead was studied within the interval from -900 to -1200 mV with the maximum peakheight at -1000 mV. With increasing the deposition time the Pb-peak also increased but not linearly in the whole range tested (30 – 300 s). For higher times than 120 s it started to level off, i.e. to exhibit the attributes of saturation. Deposition time of 120 s was chosen as optimum and used in further experiments. The concentration of Bi(III) ions for in-situ plating of the bismuth film was varied from 250 ppb to 2000 ppb and the highest signal for Pb(II) was obtained for 500 ppb Bi. With optimal operation parameters we continued our investigation of electroanalytical performance of BiFE in propylene carbonate with the examination of some analytical parameters. BiFE exhibited good linear stripping response for lead for increasing concentration from 10 to 100 ppb (Fig. 1.) with the correlation coefficient (R2) of 0.995. The LOD value (3σ) obtained for 120 s accumulation time was 1.1 ppb. Repetitive measurements revealed good reproducibility with relative standard deviation (RSD) for 30 ppb Pb(II) of ±5.8 % (n = 8). Determination of thallium Beside lead also the voltammetric behavior of thallium in propylene carbonate after extraction from water phase into propylene carbonate phase was investigated. Again the operational parameters influencing the accumulation step were optimized. Deposition potential was varied from -900 to -1300 mV. The Tl-peak increased with more negative potential but also changed the shape and deformed, which was particularly evident for potentials -1300 and -1200 mV. On the basis of this observation, the deposition potential of -1000 mV, where no deformation occurs, was chosen for further measurements. The effect of the deposition time was studied for times from 60 to 300 s and the dependence of the peak-height of thallium was almost linear in whole tested interval. Due to lower sensitivity of thallium detection, accumulation time of 180 s was selected as optimum for further experiments. Concerning the concentration of Bi(III) ions for in-situ plating of BiF and its influence upon the Tl-peak the results were similar to those of Pb-peak and the final concentration of 500 ppb Bi was chosen for following measurements.

142

-1,8

Current / A

-1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 -900

-700

-500 Potential / mV

-300

-100

Fig. 1. Calibration dependence for ten successive additions of Pb(II) in 10 ppb steps obtained at in-situ plated BiFE in DPASV mode. Experimental conditions: supporting electrolyte: propylene carbonate + 0.2 M tetrabutylammonium bromide, deposition potential -1 V, deposition time 120 s, equilibration time 20 s, amplitude 50 mV, current range 5 A/V, scan rate 20 mV/s, Bi(III) concentration for BiF creation 500 ppb. After the optimization of operational parameters we determined the analytical parameters for the detection of thallium in propylene carbonate. BiFE revealed linear calibration curve for increasing concentrations from 20 to 100 ppb Tl(III) with the correlation coefficient (R2) of 0.998. Repetitive measurements of 50 ppb Tl(III) disclosed very good reproducibility with RSD of ±2.6 % (n = 10). The LOD value (3σ) in combination with 180 s accumulation time was evaluated as 2.3 ppb Tl(III). Finally, we tried to detect both metals together, what was possible but using above mentioned parameters and composition of water and organic phases just with qualitative resolution of both peaks. Quantitative resolution was possible only for lower concentrations (10 or 20 ppb). For reaching the qualitative resolution also for higher concentrations new optimization of the composition of water and organic phases would be necessary. Conclusion Our study has shown, that direct voltammetric measurement of selected heavy metals, namely Pb(II) and Tl(III), after gas-stirred liquid-liquid extraction is possible, moreover with satisfied results, when using bismuth film electrode plated by in-situ method. These two elements can be determine either alone or simultaneously, but in this case only with qualitative resolution. This proposed method is simple, selective and not time-consuming, because just one minute of purging with nitrogen was enough for extraction of target metals and bismuth in the form of bromide complexes into the organic phase, precisely propylene carbonate. Acknowledgement Financial support from the Ministry of Education, Youth, and Sports of the Czech Republic (projects MSM0021627502 and LC06035) are gratefully acknowledged.

143

References 1. Wang J., Lu J. M., Hocevar S. B., Farias P. A. M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 2. Svancara I., Prior C., Hocevar S. B, Wang J.: Electroanalysis 22, 1405 (2010). 3. Kamio A., Nagaosa Y.: Anal. Sci. 24, 1363 (2008). 4. Xu Y., Kamio A., Nagaosa Y.: Electroanalysis 22, 1499 (2010). 5. Budnikov G.K., Ulakhovich N.A.: Russ. Chem. Rev. 49, 147 (1980). 6. Nagaosa Y.: Fresenius Z. Anal. Chem. 316, 794 (1983). 7. Nagaosa Y., Horita K.: Mikrochim. Acta 108, 151 (1992).

144

Electrochemical Behavior of Metallothioneins on Silver Amalgam Electrodes Ivana Šestáková, and Bogdan Yosypchuk J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Three different types of silver amalgam electrodes (p-AgSAE – polished silver solid amalgam electrode, m-AgSAE – mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode and AgAPE – silver amalgam paste electrode) were applied for voltammetric detection of metals bound in metallothionein (MT) molecule and for Brdička reaction with Co(III). The signals obtained with m-AgSAE and silver amalgam paste electrode correspond to signals observed on hanging mercury drop electrode (HMDE). Only p-AgSAE exhibits different behavior which is explained by the formation of AgMT. Formation of AgMT was demostrated by dissapearance of Cd-Zn-MT peaks and by the increase of new peaks at –573 and –1050 mV, observed by differential pulse voltammetry on HMDE, when silver ions in excess were added to the Cd-Zn-MT solution. Key words: Metallothionein, silver amalgam electrodes, Brdička reaction. Introduction Metallothionein (MT) is a common name for huge group of low molecular weight proteins (67 kDa) with high capability to bind metals through the 20 cysteinyl groups that constitute part of the structure. Mammalian metallothionein were studied most extensively and two metal binding domains are recognized, where 60-61 amino acids form structure with two clusters, able to bind seven divalent metal ions: α -MeII4S11 and β- MeII3 S9. Naturally existing MT form contains only bound zinc. With the exposition of organism to cadmium, synthesis of metallothioneins is induced and cadmium replaces zinc to form the structure Cd5 Zn2 MT. In studies of metal binding reactions in vitro, replacement of Zn(II) by metals with greater binding constant is possible according to order Hg(II) > Ag(I) > Cu(I) > Cd(II) > Zn(II). Because Zn(II) is tetrahedrally coordinated by the thiolate group, considerable reorganization must occur in the binding site when metals adopting trigonal or digonal coordination geometry are bound. Mainly methods of NMR, EXAFS and circular dichroism are important in MT structure studies 1-4. Metallothioneins have been isolated in a wide variety of living organisms and possess several biological functions as metal homeostasis, detoxification and prevention of oxidative stress 5-6. Numerous methods of MT detection and quantification were developed and comprehensive reviews were published lately 7-8. Among electrochemical methods for MT determination, widely used is modified Brdička method based on catalysis of hydrogen evolution in solution with Co(III) salt. Mainly mercury electrodes are used in those studies and great sensitivity and reproducibility has been achieved by application of adsorptive transfer technique, where mercury drop selectively adsorbs MT from the sample 9-14. Silver amalgam electrodes were introduced as solid electrodes with properties close to mercury electrodes and were applied for determination of various inorganic or organic compounds. These electrodes can work with solid amalgam surface or with mercury meniscus. Finally, amalgam paste electrode combines possibility of renewing the working surface and simultaneously maintains high rate of electrode processes 15-20. As amalgam electrodes are perspective in studies of metal transport across the lipid membranes 21, behavior of metallothioneins as important metal-binding ligand in cells on these types of electrodes was studied.

145

Experimental The measurements were carried out by means of computer controlled polarographic/voltammetric analyzer PC-ETP (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic), equipped with MultiElchem v. 2.1 software (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Czech Republic) and with POLAR.PRO software v. 5.1 (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The voltammograms were recorded using an assembly of three electrodes with a pen-type hanging mercury drop electrode (HMDE) (Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic) as a working electrode, an Ag/AgCl/KCl3M (ED, Turnov, Czech Republic) as a reference electrode and Pt-wire as an auxiliary electrode. Prior to the measurements, the analyzed solutions were 10 min degassed with nitrogen and then nitrogen atmosphere was maintained above the solution in the cell. Apart from HMDE, silver amalgam electrodes served in turn as working electrodes: the silver amalgam paste electrode (disk diameter 2.0 mm, surface area ca. 3.14 mm2), the liquid mercury free polished silver solid amalgam electrode (p-AgSAE, disk diameter 0.54 mm, surface area ca. 0.23 mm2) and the mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE, disk diameter 0.54 mm, meniscus area ca. 0.46 mm2). p-AgSAE was prior to the measurement cleaned on a soft emery paper and then polished on alumina. Then the activation was performed in 0.2 M KCl at – 2200 mV for 300 s. Similar activation was applied on m-AgSAE after renewal of mercury meniscus by amalgamation. For silver amalgam paste, a new surface was made by screwing the piston in the holder; the new surface was smoothed on glass surface. Borate buffer was prepared from sodium tetraborate Suprapure (Merck), ammonium buffer of pH 9.5 was prepared from ammonium chloride and ammonia solution (both p.a., Lachema, Brno). Stock solution of Co (III) was prepared from hexamminecobalt trichloride (Fluka). CdZn metallothionein (Cd content 3%, Zn content 1%) was obtained from Sigma-Aldrich. Deionized water from Milli-Q-system (Milli-Q-Gradient, Millipore, USA) was used for preparation of solutions. Solution of silver ions was prepared immediately before use by dissolving silver wire with nitric acid (Suprapure, Merck) and diluting with borate buffer. Results and discussion Brdička reaction, performed on HMDE in ammonia buffer with Co(III) salt is a routine method for MT determination in different tissues. Latest applications are using adsorptive transfer technique in connection with constant current chronopotentiometry. Depending on the MT concentration in analyzed sample, signals named Cat1, Cat 2 and for lowest concentration signal of peak H are employed 10-14. From the silver amalgam electrodes, m-AgSAE and silver amalgam paste (10 and 11% of Ag) gave Brdička response analogous to HMDE. But the response obtained on p-AgSAE differs; only the increasing current could be registered, both on new activated surface or when 30 cycles of regeneration (potentials –100 and –1700 mV) were applied (Fig. 1.).

146

-2000

-2000

A

B

1

-1500 Co a

Cat2

-500

i / nA

i / nA

Cat1 -1000

b

-1000 2

0 500 -800

-1000

-1200

-1400

0 -800

-1600

-900

-1000 -1100 -1200 -1300 -1400 -1500 -1600

E / mV

E / mV

Fig. 1. DP voltammetry of Cd-Zn-MT in ammonia buffer pH 9.5 with 1 mM Co(III) DPV from –800 mV, pulse height –50 mV, scan rate 20 mV s–1. A: HMDE, a – 0.03µM MT, b – 0.06 µM MT, B: 0.06 µM MT, 1 – p-AgSAE , 2 – m-AgSAE. Even when overpotential 22 for proton reduction is lower on Ag than on Hg, such great difference of records cannot be explained. Therefore we examined DPV on HMDE of our CdZn-MT in borate buffer pH 8.5. Such voltammograms were reported many times 23-27 and two peaks belonging to Cd cluster (peak at –822 mV corresponds to the reduction of tetracoordinated Cd (II), peak at –352 mV corresponds to the reduction of mercury compound) and two peaks belonging to Zn cluster (peak at –1175 mV corresponds to the reduction of tetracoordinated Zn (II), and peak at –475mV corresponds to the reduction of mercury compound) can be observed. Similar behavior as on HMDE was observed also on mAgSAE and on silver amalgam paste electrode (10 or 11% Ag). But when p-AgSAE is in the same MT solution, no described peaks could be seen. Instead, new peaks at –573 and – 1050 mV are observed, as is demonstrated on Fig. 2. -150 2

-130 -110

i / nA

-90 -70 -50

1

-30 -10 10 -400

-900

-1400

E / mV

Fig. 2. MT (0.26 µM) in borate buffer pH 8.5. DPV from –100 mV, pulse height –50 mV, scan rate 20 mVs–1. Curve 1 is recorded on HMDE, curve 2 on p-AgSAE (after regeneration in 0.2 M KCl). Height of both peaks visible with p-AgSAE can be increased by adsorptive accumulation: the height of peak with Ep = –1050 mV is increased by the accumulation at –100 mV, the height of peak with Ep = –573 mV by accumulation at –700 mV. As silver ion is very keen to bind to metallothionein, we performed experiment when Cd-Zn-MT was in borate buffer pH 8.5 (the medium where stable voltammetric response is obtained on HMDE). Silver ions in excess were added and the changes on voltammogram followed with HMDE (a new drop after each Ag+ addition). All original peaks were decreasing and the increase of new peaks at potentials 147

–573 mV and –1050 mV were observed. This means that Ag+ substitute Cd and Zn originally bound in MT. Because both, Cd(II) and Zn(II) are tetrahedrally coordinated by the thiolate groups, considerable reorganization must occur as Ag(I) in MT molecule exhibits trigonal or digonal coordination geometries 1. Conclusion Three different silver amalgam electrodes were applied for voltammetric detection of metals bound in MT molecule and for Brdička reaction with Co(III). The signals obtained with m-AgSAE and silver amalgam paste electrode correspond to signals obtained with HMDE. p-AgSAE exhibits different behavior which is explained by the formation of AgMT. This has been demonstrated also by the addition of silver ions into Cd-Zn-MT solution. Acknowledgements The support by the grant P206/11/1638 from GA CR and grant No 1AA 400400806 from GAAV CR is gratefully acknowledged. Literature 1. Klassen C.D.(Ed): Metallothionein IV, Birkhäuser, Basel, 1999. 2. Stillman M.J.: Coord. Chem. Rev. 144, 461(1995). 3. Romero-Isard M. Vasak M.: J. Inorg. Biochem. 88, 388 (2002). 4. Rigby Duncan K.E., Stillman M.J.: J. Inorg.Biochem. 100, 2101 (2006). 5. Roesijadi G.: Cell. Mol. Biol. 46, 357 (2000). 6. Cherian M.G., Apostolova M.D.: Cell. Mol. Biol. 46, 347 (2000). 7. Dabrio M., Rodríguez A.R., Bordin G., Bebiano J., De Ley M., Sestakova I., Vasak M., Nordberg M.: .J. Inorg. Biochem. 88, 123 (2002). 8. Adam V., Fabrik I., Eckschlager T., Stiborova M., Trnková L., Kizek R.: Trends in Anal. Chem.29, 409 (2010). 9. Olafson R.W., Olsson P.E.: Meth. Enzym.205, 205 (1991). 10. Raspor B.: J.Electroanal.Chem. 503, 159 (2001). 11. Kizek R., Trnkova L., Palecek E.: Anal. Chem.73, 4801 (2001). 12. Fabrik I., Krizkova S., Huska D., AdamV., Hubalek J., Trnkova L., Eckschlager T., Kukacka J., Prusa R., Kizek R.: Electroanalysis 20,1521 (2008). 13. Kovarova J., Kizek R., Adam V., Harustiakova D., Celechovska O., Svobodova Z.: Sensors 9, 4789 (2009). 14. Palecek E., Heyrovsky M., Janik B., Kalab D., Pechan Z.: Collect.Czech. Chem. Commun. 74, 1739 (2009). 15. Novotny L., Yosypchuk B.: Chem. Listy 94, 118 (2000). 16. Yosypchuk B., Heyrovsky M., Palecek E., Novotny L.: Electroanalysis 14, 1488 (2002). 17. Yosypchuk B., Sestakova I., Novotny L.: Talanta 59, 1253 (2003). 18. Fisher J., Barek J., Yosypchuk B., Navratil T.: Electroanalysis 18, 126 (2006). 19. Selesovska-Fadrna R., Fojta M., Navratil T., Chylkova J.: Anal.Chim.Acta 582, 344 (2007). 20. Yosypchuk B., Sestakova I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 21. Yosypchuk B., Marecek V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011). 22. Cohen-Atiya M., Mandler D.: J. Electroanal Chem.550, 267 (2003). 23. Rodriguez A.R., Esteban M. .: Cell. Mol. Biol. 46, 237 (2000). 24. Sestakova I., Miholova D., Vodickova H., Mader P.: Electroanalysis 7,237 (1995). 25. Sestakova I., Kopanica M., Havran L., Palecek E.: Electroanalysis 12,100 (2000). 26. Sestakova I., Navratil T.: Bioinorg. Chem. Appl. 3, 43 (2005). 27. Serrano N., Sestakova I., Diaz-Cruz J.M.: Electroanalysis 18, 169 (2008).

148

Electrochemical and Spectrometric Study of FOX-7 in Aprotic Solvents (Elektrochemické a spektrometrické studium FOX-7 v nevodném prostředí) Ludmila Šimková a, Jiří Ludvík a, and Jiří Klíma a a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract 2,2-Dinitroethene-1,1-diamine (FOX-7) is a recently developed and broadly tested energetic material with high efficiency and low sensitivity. Generally, explosion is based on thermally initiated chain of intramolecular redox reactions. Recently it has been found that electrochemical reduction in aqueous solutions is also able to provoke the chain of follow-up processes leading to total decomposition of the parent substance yielding gaseous products analogously like during explosion. Similarly, results from reductive electrolysis of FOX-7 in aprotic solvents show analogous course of degradation. The first transferred electron activates the molecule and initiates the formation of colored radical intermediates that have been spectroscopically characterized. Key words: 2,2-dinitroethene-1,1-diamine, FOX-7, reduction, polarography, electrolysis, aprotic solvents, degradation, mechanism. Úvod 2,2-dinitroethene-1,1-diamine (FOX-7) 1, 2, akronymem DADNE případně DANE, byl poprvé syntetizován v roce 1998. Jedná se o energetický materiál se značným potenciálem díky své nízké citlivosti a vysokému výkonu (okolo 5000 J/g a 8800 m/s). Nedávno byla sepsána rozsáhlá studie 3 shrnující fyzikální a chemické vlastnosti FOX-7. Vedle moţného pouţití je velice zajímavá i struktura této molekuly. Pozoruhodná je především kombinací dvou geminálních snadno redukovatelných nitroskupin v sousedství dvou silně elektrondonorních aminů, díky čemuţ dochází ke stabilizaci elektronovou „push-pull“ delokalizací. Redoxní chování FOX-7 nebylo doposud zkoumáno. První naše experimenty zahrnovaly jak změření DC-polarografie, cyklické voltametrie tak i provedení preparativních elektrolýz a coulometrie ve vodném pufrovaném prostředí i v bezvodých rozpouštědlech. Experimenty popisující redoxní chování FOX-7 ve vodném prostředí jsou publikovány v jiné práci 4. Stejně jako ve vodě jsou i výsledky elektrochemické redukce FOX-7 v nevodném prostředí překvapující. Ačkoli redukce dvou nitroskupin v aprotickém prostředí představuje u běţných nitrolátek spotřebu minimálně osmi elektronů, FOX-7 se na rtuťové kapkové elektrodě redukuje pouze ve dvou jednoelektronových krocích, které navíc vykazují známky reverzibility. Polarografické experimenty navíc prokázaly, ţe produkt primární redukce se silně adsorbuje, coţ se projevuje adsorpční předvlnou. Přítomnost malého mnoţství vlhkosti na redukci nemá velký vliv, přídavek kyseliny však dramaticky mění mechanismus, který se stane multielektronovým. V průběhu preparativní elektrolýzy dochází k intramolekulárnímu rozkladu molekuly na plynné produkty. Doprovázející barevné změny ukazují na přítomnost radikálového intermediátu. H2N

NO 2

H2N NO 2 1,1-diamin-2,2-dinitroethen (FOX-7; DADNE; DANE)

149

Experimentální část Při polarografických a voltametrických experimentech bylo pouţito tříelektrodové zapojení: pracovní elektroda – kapající příp. statická rtuťová elektroda, pomocná elektroda – platinový plíšek a referentní elektroda – nasycená kalomelová elektroda. K měření slouţil Polarographic analyzer PA 4 s xy-zapisovačem (laboratorní přístroje Praha). Jako aprotické prostředí byla vybrána dvě rozpouštědla: dimethylformamid (DMF) a acetonitril (AN). Jako základní elektrolyt byl pouţit chloristan, tetrafluoroboritan nebo hexafluorofosforečnan tetraalkylamonia. Měření probíhala v nedělené nádobce o objemu 5 ml. Pro měření byl pouţíván 0,01 M zásobní roztok FOX-7 v DMF, denně čerstvý. Elektrolýzy na velkoploché rtuťové elektrodě byly prováděny v nádobce typu H s odděleným anodovým a katodovým prostorem. Koncentrace FOX-7 při měřeních na velkoploché elektrodě nepřesahovala 0,05 mol/l. Měření byla provedena za potenciostatického reţimu v roztocích jak AN tak i DMF. Spektroskopická měření byla provedena na UV/VIS spektrofotometru Shimadzu UV1800. Pro všechny experimenty byl pouţíván denně čerstvý zásobní roztok FOX-7 v DMF o koncentraci 0,01 mol/l případně vzorek z probíhající elektrolýzy v aprotickém prostředí AN příp. DMF. Výsledky a diskuse Polarografická redukce FOX-7 v aprotickém prostředí probíhá ve třech aţ čtyřech redukčních dějích. Jak je patrné na grafu limitního proudu na koncentraci (Obr. 1), redukční děj i1 představuje elektrochemickou redukci molekul na čisté elektrodě, kdy se produkt elektrolýzy silně adsorbuje na elektrodu. Tato adsorpce je spontánní a zřejmě dost silná, tedy energeticky výhodná, a proto posouvá první redukční potenciál k méně negativním hodnotám. Tato situace trvá aţ do dosaţení takové koncentrace, kdy se právě povrch elektrody pokryje adsorbovanou látkou. Při vyšší koncentraci se musí solvatované molekuly rozpuštěné výchozí látky redukovat skrz vrstvu jiţ naadsorbovaných molekul produktu na elektrodě, navíc se produkt uţ nemůţe stabilizovat adsorpcí (povrch elektrody je jiţ obsazen) a musí oddifundovat od elektrody zpět do roztoku. Proto je tento děj (i2) méně energeticky výhodný a potenciál redukce je negativnější. Skutečnost, ţe děje i1 a i2 na sebe navazují a ţe při součtu limitních proudů vln i1 a i2 získáme pouze jednu přímkovou závislost, ukazuje na to, ţe jde o redukci s adsorpční předvlnou, tedy o chemicky tentýţ děj, který je v obou oblastech koncentrací řízený difuzí. Proud redukce i2 spolu s adsorpční předvlnou i1 a redukční děj i3 odpovídají stejnému počtu elektronů. Z reverzibility vlny i3 lze usuzovat na jednoelektronový děj. Tedy na redukci FOX-7 v aprotickém prostředí jsou spotřebovány celkem 2 elektrony. 70

70

60

60

50

50

40

i1

30

i2 i3

i

40 30

20

20

10

10

0

i1 + i2 i3

i

0 0

2

4

6

8

10

0

c [mol/l] x 10-4

2

4

6

8

10

c [mol/l] x 10-4

Obr. 1. Závislost polarografických limitních proudů FOX-7 v AN na koncentraci.

150

Při elektrochemické redukci v aprotickém prostředí jsou stabilizovány meziprodukty aniontového charakteru, protoţe nedostatek protonů v roztoku brání jejich rychlé protonizaci a tím i další redukci. Pro lepší celkové pochopení průběhu redukce v různých prostředích byla proměřena oblast propojující aprotické a vodné roztoky. Za tímto účelem se do aprotického rozpouštědla přidávala kyselina (několikanásobný stechiometrický nadbytek oproti studované látce) a sledovaly se případné změny v průběhu redukce. Jako slabá kyselina poslouţil přídavek H2O. Přítomnost malého mnoţství vlhkosti způsobil posun půlvlnových potenciálů k pozitivním hodnotám. Vyšší procento přítomné slabé kyseliny způsobuje výrazný růst proudu a přibývají nové redukční děje (Obr. 2). 45

-2,5

40 -2

35 i1

30

i2 25

i3 i4

i 20

i5 15

E1 E2

-1,5

E3

E1/2

E4 -1

E5 E6

i6

10

-0,5

5 0

0

0

20

40

60

80

0

% H2O

20

40 % H 2O

60

80

Obr. 2. Graf závislosti proudu, resp. půlvlnového potenciálu na přídavku H2O (uvedeno v procentech). Průběh reduktivní elektrolýzy FOX-7 v aprotickém prostředí nemá standardní průběh (Obr. 3). Spotřeba elektronů závisí na volbě potenciálu. V případě preparativní elektrolýzy za potenciálu –1,3 V je spotřeba pouze 1 elektronu na molekulu. Naopak při vyšším zvoleném potenciálu spotřeba odpovídá 2 elektronům.

Obr. 3. Graf závislosti proudu na čase (ve vloţeném obrázku graf závislosti logaritmu proudu na čase) během elektrolýzy FOX-7 v AN při E = –1,3 V. Během elektrolýzy byly pozorovány barevné změny. Na počátku preparativní elektrolýzy v AN měl roztok FOX-7 světle ţlutou barvu. Po průchodu přibliţně 1/3 F/mol se celý roztok zbarvil na oranţovou barvu a při spotřebě zhruba 1 F/mol celý roztok zezelenal. Při ukončení preparativní elektrolýzy se produkt reakce ihned odbarvil ze zelené zpět na oranţovou. Tyto 151

barevné změny byly sledovány pomocí UV/Vis spektrometrie (Obr. 4). Jak ukázala naše měření, rychlost vzniku barevných změn je závislá na potenciálu elektrolýzy. Podle očekávání výrazně rychlejší průběh je při vyšším potenciálu elektrolytické redukce. 0,9

0,9

0,8

0,8 0,7

0,7 0s

0,6

0,6

16 min.

0,5

21 min. 27 min.

0,4

32 min.

0,3

44 min. 1 h.

700

670

640

580 610

550

520

490

460

430

370 400

190

700

670

640

610

580

550

520

490

460

430

400

370

340

0

310

0

280

0,1

250

0,1

220

0,2

190

0,2

340

0,3

280 310

16 min.

250

0,4

220

7 min. 12 min.

Abs

Abs.

2 min. 0,5

nm

nm

Obr. 4. Elektrolýza v AN při E = –1,3V. Spotřeba elektronů na zelektrolyzování 90% 1,16 e– Nárůst absorbance 15min., pak následný nárůst u λ = 375 nm a naopak pokles u λ = 280 nm do 1h. elektrolýzy, pak jiţ spektrum beze změny. Při snaze o identifikaci produktů zmíněné elektrolýzy v aprotickém prostředí (extrakce, tenkovrstvá chromatografie, NMR analýza, hmotnostní spektra,…) byly zachyceny plynné produkty, ale nebyl prokázán ţádný organický produkt. V průběhu elektrolýzy v AN bylo měřeno i EPR spektrum FOX-7. Z výsledků naměřených spekter bylo zjištěno, ţe redukcí vzniká barevný radikálový meziprodukt, který dále reaguje a řadou následných intramolekulárních reakcí způsobí rozpad molekuly FOX-7. Závěr Naše výsledky ukazují, ţe elektrochemická redukce FOX-7 ve vodném tak i v aprotickém prostředí vede k úplnému rozloţení výchozí látky aţ na plynné produkty. Barevné změny doprovázející reduktivní elektrolýzu FOX-7 v aprotickém prostředí ukazují na průběh redukce přes radikálové meziprodukty. Vše nasvědčuje, ţe primární příjem elektronu molekulou při reduktivní elektrolýze je startovacím mechanismem řady následných intramolekulárních redox dějů, které by mohly představovat jistou analogii k procesu exploze, která je zpomalená díky tomu, ţe probíhá v roztoku za nízkých koncentrací a za chlazení rozpouštědlem. Poděkování Tato práce vznikla s podporou grantu KONTAKT (MŠMT) č. ME 09 002. Poděkování patří Ing. Zdeňku Jalovému z Ústavu energetických materiálů FCHT Univerzity Pardubice, který syntetizoval zkoumanou látku. Literatura 13. Latypov N. V., Bergman J., Langlet A., Wellmar U., Bemm U.: Tetrahedron 54, 11525. (1998). 14. Cibulka, R.; Liška, F. a kol.; 1,1-diamino-2,2-dinitroethen (FOX-7), strategie a taktiky syntézy. Zpráva ke smlouvě č. 4621/2004/VÚPCH mezi Explosia, a. s., a VŠCHT. 2004. 15. Šimková L., Liška F., Ludvík J.: Curr. Org. Chem. (2011), accepted. 16. Šimková L.: J. Solid State Electrochem., to be submitted.

152

Polycrystalline Gold Electrode Modified by Thiols Barbora Šustrová a,b, Vladimír Mareček a, and Karel Štulík a,b a J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic; E-mail: [email protected] b Charles University , Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, Hlavova 2030/8, 128 43 Prague 2, Czech Republic Abstract The article reports on our continued investigation of modification of the gold electrode surface by thiolated compounds aimed at construction of an ion-selective sensor. Our previous work was focused on utilization of calix[4]arene molecules as a cavity sized ligand molecule 1, 2 . In this paper, calixarene and linear undecanethiol molecules were used as modifiers. We compared two ways of deposition thiol molecules, namely the spontaneous self-assembly process and the electrochemical deposition, in which the potential was applied on the electrode immersed into an adsorption solution. The concentration, time and potential conditions were optimized from the point of view of the SAM homogeneity. The modifying layers of calixarene and undecanthiol molecules were visualized by atomic force microscopy. Key words: Calix[4]arene; Undecanethiol: Self-assembly process; Electrodeposition, Polycrystalline Gold electrode; Cyclic voltammetry (CV); Atomic force microscopy (AFM). Introduction Surface modification of metal electrodes by thiolated compounds provides a very useful way of the construction of ion-selective electrochemical sensors (ISE) or immunosensors with a high selectivity, and also of the simulation of phospholipid bilayers for investigation of the membrane transport, and of the protection of metal surfaces against corrosion 3-8. The self-assembly processes on platinum 9, copper 10, mercury 11, 12, silver 13 or iron 14 surfaces were described, but the self-assembled monolayers (SAMs) of alkanthiols on gold are probably most studied at present 15. The self-assembly technique is the most common way of the modification. In principle it is a spontaneous formation of a monolayer on a solid surface by amphiphilic molecules 16. The reaction of thiolated compounds with a gold surface may be considered formally as an oxidative addition of the S-H bond to gold, followed by reductive elimination of the hydrogen. Various factors, such as the length of the alkyl chain, temperature, solvent, or oxygen present in the electrolyte solution can influence the SAM stability 17. But it is often a long process taking several hours. In contrast to the spontaneous self-assembly process stands the electrochemical modification of the electrode surface called forth by the applied potential 18, 19. Ron at al 19 described that application of a positive potential led to electrodeposition of thiolated compounds from ethanol solution. The gold oxides formed were simultaneously reduced by ethanol and thiolated compounds were subsequently adsorbed on the bare gold surface. Immobilization, desorption and structural behavior of the self-assembled monolayers (SAMs) could be affected by the electrode potential. The kinetics of the self-assembly process on metal electrodes depends on the electrode potential 20. Our previous studies were dealing with SAM of calix[4]arene molecules and showed that the layer was not compact and small gaps occurred in calix[4]arene layer formed on the gold electrode 1, 2. Side processes which could take place in these gaps prevail over the desired

153

complexation reaction. This unwanted process can be ruled out by simultaneous adsorption of the linear chain molecule of undecanethiol. In the present study, two different deposition processes (spontaneous self-assembly and the electrochemically induced deposition) of thiolated calix[4]arene with 4 –SH groups located on the lower rim and of undecanethiol with linear chain (Fig. 1) are compared. The properties of these modifying layers on gold electrode surfaces are described.

Fig. 1. The structures of A) the calix[4]arene molecule substituted by four –SH functional groups on the lower rim and B) undecanethiol. Experimental The gold electrode was prepared for the adsorption process by a procedure described previously 1, 2. Prior to each electrochemical deposition of thiolated compounds from LiClO4 ethanol solution the electrode was subjected to potential cycling in 0.01 M LiClO4 ethanol solution within an interval from -2 V to 2 V (scan rate 0.5 V s-1, 50 cycles). The SAMs of thiolated compounds on the gold disk electrode were prepared in two ways: a) Without applied potential, by placing a cleaned, activated electrode into a calixarene (undecanethiol) in DMF solution (concentration of 5.00 mM; 0.50 mM and 0.05 mM for both thiolated compounds). b) By electrochemical deposition at a constant applied potential from two supporting electrolytes, namely 0.1 M NaOH dissolved in a 1:1 mixture of ethanol/water and 0.01 M LiClO4 in 96% ethanol solution. The electrochemical cell consisted of a polycrystalline gold disk working electrode (1 mm in diameter), a reference saturated calomel electrode (both purchased from Elektrochemické Detektory, s.r.o., Turnov, Czech Republic) and of a platinum wire auxiliary electrode. The electrochemical measurements were performed using Electrochemical Workstation CHI660C (IJ Cambria Scientific, UK) with a CHI660C software. The reduction processes of the calix[4]arene and undecanethiol modified gold electrodes were determined using cyclic voltammetry (CV) in the supporting electrolyte of 0.1 M NaOH. Properties of the modified gold electrode were determined by CV in the presence of a simple redox system, 0.01 M K4[Fe(CN)6] in the supporting electrolyte of 0.1 M HCl. Each cyclic voltammogram was recorded after 10 min of stirring and degassing with nitrogen. The stirring was stopped during 154

the measurement. The conditions of the CV measurements are specified in the respective paragraphs. The AFM measurement conditions and preparation of the gold platelets (Gold arrandee TM / Au(111) (12 x 12 mm, Dr. Dirc Schroer, Germany) were described previously 1, 2. The SAMs of thiolated compounds on the gold platelet were prepared by dropping 10 µl of the calixarene or undecanethiol solution (5 mM in DMF) onto the middle of the platelet; the adsorption times were 30 s for calixarene deposition, 300 s for undecanethiol deposition. The platelet was then washed with the clean solvent (DMF), aceton, rinsed with deionized water, and dried for 1 hour in the air at laboratory temperature.

I/ A

I/ A

Results and discussion The preliminary CV measurements of the reduction desorption processes of calix[4]arene and undecanethiol indicated that these compounds desorbed in different potential ranges (Fig. 2). The calix[4]arene was reduced on the electrode surface close to -1.45 V, while the undecanethiol reduction peak was located at -1.30 V.

A

B

Fig. 2. The reduction desorption processes and subsequent read-out of peak areas of electrochemically deposited calix[4]arene A) and undecanethiol B) from a gold electrode (E In0.5 V; EH -0.5 V; EL -1.5 V, scan rate 0.1 V∙s-1; base electrolyte: 0.1 M NaOH in a 1:1 mixture of ethanol and water). At first, the self-assembly process of both compounds without any potential applied was studied. SH groups are good electron donors. This causes an increase in electron density near the gold surface, followed by negatively charging of the gold surface atoms. SH bond is thus split and covalent linkage between sulfur and gold atoms is formed. The adsorption time optimization indicated that with both compounds the SAM was formed after 10 min. The measurement was performed with concentration of 5∙10-3 M, 5∙10-4 M, 5∙10-5 M. The surface coverage was optimum with the concentration of 5∙10-5 M for both compounds. The modified electrode charges expressed as reduction peak areas of thiols (Fig. 2), were compared. With the same concentration of thiols and the same adsorption time, the reduction charge of the calixarene modified electrode was 4-times higher than that of the undecanethiol modified electrode. It should be caused by a laying-down position of linear chain molecules of undecanethiol. The gold surface is completely filled up, but the molecules lie on the surface and their amount is lower than in the case of stand-up position. For their reorganization a longer time is needed.

155

Ip / A

The second way of the gold electrode modification was electrochemical, with a constant potential applied. The measurement was performed in 0.1 M NaOH 1:1 water: ethanol solution and in 0.01 M LiClO4 ethanol solution. The dependence of the calix[4]arene reduction peak area on the bulk concentration of the compound in the base electrolyte 0.1 M NaOH 1:1 water: ethanol was presented in our previous study2. The undecanethiol concentration dependence was determined using the same procedure. The adsorption process of both compounds satisfied the Langmuir isotherm equation. The adsorption potential optimization in 0.1 M NaOH indicated that the potential of -1.3 V was optimum for the calix[4]arene SAM preparation, while for undecanethiol it was equal to -1.0 V (Fig.3). The degree of surface coverage depended on the adsorption time. For the formation of a compact undecanethiol layer, a longer adsorption time was required. 2.5 A B

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0 -1.5

-1.3

-1.1

-0.9

-0.7

-0.5 Edep / V

Fig. 3. Dependence of the reduction peak height on the adsorption potential of A) thiolated calix[4]arene, B) undecanethiol (tdep 300 s; CV: EIn = Edep; EH = -0.5 V; EL = -1.5 V, scan rate 0.1 V∙s-1; base electrolyte: 0.1 M NaOH in a 1:1 mixture of ethanol and water). The CV study of electrodeposition from 0.01 M LiClO4 ethanol solution showed that the optimum adsorption potential was 0.7 V and the optimum time of deposition was around 5 min for both thiols. The reduction charge of the calixarene modified electrode was 14.6 C (at optimum adsorption conditions) after electrodeposition from 50 M in 0.01 M LiClO4 ethanol solution, in contrast to electrodeposition of undecanethiol molecules. Concentration of undecanethiol was higher, i.e. 200 M in 0.01 M LiClO4 in ethanol, but the modified electrode reduction charge was only 0.7 C (under the same adsorption conditions). This indicated that the calixarene molecules were deposited by the applied potential more efficiently than the undecanethiol molecules. The dependence of the SAM compactness was measured in the presence of a simple redox system, i.e. K4[Fe(CN)6] in the supporting electrolyte of 0.1 M HCl. The surface of the gold

156

electrode was completely covered by both thiols and the SAM behaved as an insulator (Fig. 4A).

40

I/ A

I/ A

6

Bare Au

5 20

4 0

3 2 1

-20 -0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6 E/V

Au_C4A Au_C11SH

0 -1 -0.4

-0.2

0

0.2

0.4

0.6 E/V

Fig. 4. Cyclic voltammetry measurements on the bare electrode (insertion) and on the undecanethiol and calix[4]arene modified electrode in 0.01 M K4[Fe(CN)6] in 0.1 M HCl, EIn = -0.4 V, EH = 0.6 V, scan rate = 0.1 V∙s-1. Both thiols were adsorbed on Au(111) platelet by spontaneous self-assembly process. The SAMs were scanned using the AFM method. Both thiols form on the gold surface monodisperse globular aggregates. The undecanethiol aggregates were more compact with smaller differences in vertical size. The calixarene aggregates were smaller than undecanethiol aggregates. Conclusions Adsorption of calix[4]arene and undecanethiol on a gold surface and properties of the modified electrodes were compared. In comparison with the SAM of calix[4]arene on gold, undecanethiol in 0.1 M NaOH was reduced at a higher potential. The optimum conditions of self-assembly process without applied potential were determined. Adsorption from 5∙10-5 M DMF solution for 10 min gave maximum surface coverage of both thiols, but the reduction charge of the calixarene modified electrode was 4-times higher than that of the undecanethiol modified electrode. Electrodeposition of thiolated compounds from 0.1 M NaOH water ethanol solution indicated that the optimum adsorption potential was -1.0 V for undecanethiol (compared to the value of -1.3 V for calix[4]arene adsorption) and the degree of surface coverage depended on the adsorption time. For the formation of a compact undecanethiol layer a longer adsorption time was required. The CV study of electrodeposition from 0.01 M LiClO4 ethanol solution showed that the optimum adsorption potential was 0.7 V and the optimum time of deposition was around 5 min for both compounds. However, electrodeposition of calixarene molecules from the mentioned solution was more efficient than that of undecanethiol. These results and the known properties of both compounds will be

157

utilized in preparation of a specific modified gold electrode for monitoring of ion transport processes across artificial and biological membranes. Acknowledgements The authors thank Prof. Ing. Pavel Lhoták, CSc. of the Department of Organic Chemistry, Institute of Chemical Technology Prague for the calixarene preparation and Ing. Pavel Janda, CSc., of the Department of Electrochemical Materials, J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i., for the AFM measurement. Financial support of the Grant Agency of the Academy of Sciences, project No. IAA400400806, of the Grant Agency of Charles University, project SVV 261204, and of the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic, projects No. MSM0021620857 and LC06063 are gratefully acknowledged. References 1. Šustrová B., Mareček V., Štulík K.: Modern Electrochemical Methods XXX, 172 (2010). 2. Šustrová B., Štulík K., Mareček V., Janda P.: Electroanalysis 22, 2051 (2010). 3. Beer P. D., Gale P. A., Chen G. Z.: Coordination Chem. Revs 186, 3 (1999). 4. Casnati A., Pirondini L., Pelizzi N., Ungaro R.: Supramolecular Chem. 12, 53 (2000). 5. Xu J., Li H. L.: J. Colloid Interface Sci. 176, 138 (1995). 6. Konry T., Novoa A., Cosnier S., Marks R. S.: Anal. Chem. 75, 2633 (2003). 7. Wen X. F., He H. Y., Lee L. J.: J Immunol. Methods 350, 97 (2009). 8. Ogier S. D., Bushby R. J., Cheng Y. L., Evans S. D., Evans S. W., Jenkins A. T. A., Knowles P. F., Miles R. E.: Langmuir 16, 5696 (2000). 9. Genorio B., He T., Meden A., Polanc S., Jamnik J., Tour J. M.: Langmuir 24, 11523 (2008). 10. Fonder G., Laffineur F., Delhalle J., Mekhalif Z.: J. Colloid Interface Sci. 326, 333 (2008). 11. Becucci L., Moncelli M. R., Naumann R., Guidelli R.: J. Am. Chem. Soc. 127, 13316 (2005). 12. Krysinski P., Zebrowska A., Michota A., Bukowska J., Becucci L., Moncelli M. R.: Langmuir 17, 3852 (2001). 13. Becucci L., Innocenti M., Salvietti E., Rindi A., Pasquini I., Vassalli M., Foresti M. L., Guidelli R.: Electrochim. Acta 53, 6372 (2008). 14. Ruan C. M., Bayer T., Meth S., Sukenik C. N.: Thin Solid Films 419, 95 (2002). 15. Chen D., Li J. H.: Surface Sci. Reports 61, 445 (2006). 16. Mandler D., Turyan I.: Electroanalysis 8, 207 (1996). 17. Ulman A.: Chem. Revs 96, 1533 (1996). 18. Rifai S., Laferriere M., Qu D., Wayner D. D. M., Wilde C. P., Morin M.: J. Electroanal. Chem. 531, 111 (2002). 19. Ron H., Rubinstein I.: J. Am. Chem. Soc. 120, 13444 (1998). 20. Rohwerder M., de Weldige K., Stratmann M.: J. Solid State Electrochem. 2, 88 (1998).

158

Possibilities and Limitations of Electroanalysis with Bismuth- & Antimony Film-Plated Electrodes in Complex-Forming Media (Možnosti a omezení elektroanalýzy s elektrodami s povlaky antimonu a bismutu v roztocích s komplexotvornými složkami) Ivan Švancara, Karel Bartoš, Matěj Stočes, and Karel Vytřas Department of Analytical Chemistry, Faculty of Chemical Technology, University of Pardubice, Studentská 573 (HB/C), CZ-53210 Pardubice, Czech Republic E-mail: [email protected] Abstract This contribution concerns measurements with bismuth- and antimony film electrodes examined in various supporting electrolytes and complex-forming media, such as buffered solutions, diluted mineral acids, or mixed media containing complex-forming reagents. The effect of the supporting electrolyte composition was studied voltammetrically by observing the behaviour of Cd(II) + Pb(II) in relation with the electroanalytical performance of both electrodes. It has been confirmed that especially the actual pH and the presence of complexing ions (e.g.: F , Br , I and SCN ) may principally affect the respective measurement(s) in both positive and negative sense, revealing also so-far unreported phenomena interesting for practical electroanalysis. Keywords: Stripping voltammetry, bismuth- & antimony film electrodes, complexing media, electroanalytical performance. Úvod Letos je tomu jiţ deset let, co se elektroanalytická skupina na katedře analytické chemie Univerzity Pardubice začala věnovat výzkumu elektrod na bázi bismutu, které po klasické éře potenciometrických čidel z první poloviny minulého století byly „nově“ objeveny na přelomu tisíciletí v podobě bismutové filmové elektrody (BiFE) 1 a jejího vyuţití v elektrochemické rozpouštěcí analýze v souvislosti s moţnou náhradou elektrochemicky příbuzných, ale stále kontroverznějších rtuťových elektrod. S odstupem času lze pocítit něco jako zadostiučinění, ţe právě pardubičtí elektroanalytici byli mezi prvními 2,3, kdo tenkrát vycítili velký potenciál elektrod na bázi bismutu. Toto tvrzení není nijak nadnesené a víceméně podtrhuje loňské výroční bilancování ku příleţitosti desetiletého výročí od objevu BiFE, kterým prošla celá elektroanalýza s bismutovými elektrodami na stránkách časopisu Electroanalysis a na němţ se významnou měrou podílela i naše skupina 4,5. Z retrospektivního pohledu je elektroanalýza s bismutovými a později i dalšími kovovými filmy, především s povlaky antimonu 6, v poněkud paradoxní situaci. Na jedné straně jsou objevovány stále sofistikovanější konstrukce příslušných elektrod, kde vedle základní konfigurace aktivního kovu a zvoleného substrátu specificky funguje celá řada dalších doprovodných sloţek (modifikátory, stabilizátory, kontaktní katalyzátory atd. 5), na druhé straně se aţ tvrdošíjně lpí na jiţ mnohokrát ověřených experimentálních podmínkách, které však při některých speciálních aplikacích nemusí být zdaleka optimální. Typickým příkladem je i pouţívání nosných elektrolytů, jejichţ paleta je aţ překvapivě úzká, uváţíme-li zkušenosti z klasické polarografické éry, kdy např. funkce nejrůznějších komplexotvorných sloţek byla velmi dobře známa a bohatou měrou vyuţívána. U bismutových elektrod se otázkou testování různých směsných médií zabývala i pardubická skupina, a to jak v rané etapě základní charakterizace bismutových elektrod 7, tak i poměrně nedávno, při výzkumu s elektrodami na bázi antimonu 8. Experimentální náplň této práce na obě studie navazuje, a to s cílem je dále rozšířit, neboť pozornost byla nyní věnována podstatně širšímu okruhu nosných elektrolytů. Zda se tento záměr podařilo naplnit, dokládají předloţené výsledky a pozorování.

159

Experimentální část Chemikálie, použité roztoky a činidla Všechny kyseliny, soli a pouţité reagencie pro přípravu roztoků byly čistoty p.a. a pocházely od firem Sigma Aldrich, Fluka a Lachema Brno. Pro přípravu nosných elektrolytů a směsných médií poslouţily příslušné zásobní roztoky, vesměs o koncentraci 1 mol.l 1, u komplexotvorných činidel 0,1 mol.l 1, a u iontů kovů 1 ppm Men+. Všechny roztoky byly uchovávány v plastových nádobách a voda pouţívaná k jejich přípravě, popř. ředění byla získávána destilací deionizované vody v laboratorně sestavené aparatuře. Přístroje, zařízení a příslušenství Voltametrická měření byla prováděna na elektrochemickém analyzátoru PalmSens (Palm Instruments, NL) s laboratorním stojanem pro elektrody, voltametrickou nádobku a magnetickou míchačku s kontrolovanou rychlostí otáček (cca 300 ot.min 1). Hodnoty pH analyzovaných roztoků byly měřeny na přenosném pH-metru (model „CPH 52”; Elteca, Turnov, ČR) s kombinovanou skleněnou pH-elektrodou (model „OP-0808P”; Radelkis, Budapest, HU). Elektrody Podstatou nosné elektrody pro povlaky bismutu či antimonu byla běţná uhlíková pasta z uhlíkového prášku ,,CR-5” (Maziva Týn, CZ) a viskózního silikonového oleje LUKOOIL (typ „MV 12500“; Lučební závody, Kolín; CZ) o sloţení 0,5 g grafitu a 0,3 ml pastové kapaliny (pasta typu „C/SO“). Uhlíkové pasta byla připravena důkladnou homogenizací obou hlavních komponent dle zavedeného postupu 9 a takto získané směsi byly naplněny do plastových pouzder s otočným pístem vlastní konstrukce 10, s průměrem pracovního povrchu = 2 mm. Před kaţdou sérií měření byl povrch uhlíkových past obnoven mechanicky: otřením pouţité vrstvy filtračním papírem. Samotné elektrody typu BiF-CPE a SbF-CPE byly připravovány a operovány v reţimu in situ, o koncentraci 1 10-5 M BiIII (SbIII) v testovaných roztocích. Potřebný tří-elektrodový systém pro měření pak doplňovala pomocná elektroda z Pt-plíšku a srovnávací elektroda typu Ag AgCl 3M KCl. Měřicí postupy Voltametrická měření byla prováděna v reţimu anodické rozpouštěcí voltametrie čtvercových vln (SWASV) s vyuţitím zavedeného postupu, jenţ zahrnoval potenciostatickou akumulaci (nahromaďovací krok) za míchání, dobu klidu a vlastní rozpouštění za řízeného průběhu potenciálu. Není-li uvedeno jinak, experimenty probíhaly v základním elektrolytu daného sloţení (specifikováno níţe, v souvislosti s příslušným experimentem) a typické přístrojové podmínky byly následující: potenciál akumulace, 1,0 V vs. ref.; doba akumulace, 30 s; doba klidu, 15 s; krokování polarizačního potenciálu, 4 mV, amplituda pulse, 50 mV a SWVfrekvence, 25 Hz. Výsledky a diskuse Jednotlivé výsledky a pozorování lze shrnout do následujících konstaování. Především halogenidy a některé pseudo-halogenidy o určité koncentraci výrazně ovlivňovaly citlivost a selektivitu měření na obou elektrodách typu BiF-CPE a SbF-CPE. Výrazný byl vliv fluoridů a jodidů, a to jak samostatně, tak i ve směsných roztocích. Důleţitou roli hrála i příslušná koncentrace obou komplexotvorných iontů a ve většině případů i aktuální hodnota pH. Zajímavé výsledky byly také získány při měřeních s roztoky na bázi citr(on)anu či thiokyanatanu, zatímco příbuzný kyanatan nebo kyanid měly asi nejhorší vliv na sledované odezvy (snad jen s výjimkou totálně maskující EDTA).

160

Neméně zajímavé bylo zjištění, ţe ovlivňování citlivosti a selektivity vůči oběma testovaným kovům bylo moţné realizovat jak společně, tak i jednotlivě. Např. v roztocích 0,05 M HClO4 + 0,01 M C4H6O6 s BiFE a v 0,1 M octanovém pufru s 1∙10-5 M KF bylo dosaţeno značného zvýšení odezvy kadmia, zatímco pík olova zůstal téměř nezměněn. Naproti tomu v roztocích 0,1 M NaI a 0,1 M NaBr resp. 0,1 M NaCl; nebo 0,05 M NaCl + 0,001 M NaI resp. v 0,05 M NaCl + 0,001 M KF (vše s SbFE) a konečně v 0,1 M HClO 4 (na BiFE) byl pozorován totoţný trend, ale ve prospěch olova. Studie také potvrdily skutečnost, ţe detekce kadmia je citlivější neţ u olova. A změnou koncentrace, např. u KF, NaI , NaCl + KF, popř. NaCl + KSCN, při měření s BiFE, bylo moţné kontrolovat a předběţně optimalizovat, jaké koncentrační rozmezí volit u uvedených sloţek, aby výsledná citlivost byla co nejvyšší. Takové ovlivňování citlivosti a selektivity můţe být uţitečné při potlačování negativního vlivu interferencí obou testovaných kovů. Lze totiţ předpokládat, ţe podobné relace budou platit i pro další těţké kovy – jako např. Zn, Tl, In nebo Sn – samozřejmě vţdy za podmínek, příznivých pro ten či onen kov, včetně jeho aktuální koncentrační úrovně. Pb Cd

( Bi ) 3

2 10 A 1 -1,2

-0,7

-0,2

+0,3

E [V] vs Ag / AgCl Fig. 1. SWASV iontů Cd(II) + Pb(II) na BiF-CPE(in-situ) v roztoku s komplexotvorným čimidlem. 1) 0,05 M NaCl + 0,001 M KF + 1 ppm BiIII [pH 2,9]; 2) + 100 ppb Pb2+ + 50 ppb Cd2+; 3) +200 ppb Pb2+ + 110 ppb Cd 2+. Experimentální podmínky: potenciál akumulace: EACC = -1,0 V vs ref.; tACC = 30 s; rozsah potenciálové rampy: EINIT = -1,0 a EFIN = 0,2 V; SW-modulace: fSW = 25 Hz, E = 50 mV, vSW = 5 mV. Redakčně upraveno. Dalším pozoruhodným jevem bylo chování rozpouštěcích píků bismutu a antimonu v médiích s komplexotvornými halogenidy a pseudo-halogenidy, např. v 0,1 M NaI a 0,1 M KF s BiFE (zde se pík bismutu prakticky rozdvojil), či v 0,02 M KF a 0,02 M NaI na BiFE a v 0,05 M NaCl + 0,01 M KSCN s SbFE. Také v roztocích 0,05 M NaCl; 0,001 M KF; 0,05 M NaCl a v 0,01 M KSCN resp. 0,1 M KSCN bylo na BiFE dosaţeno výrazného potlačení jinak dominujícího signálu bismutu. Anebo naopak zvětšení píku antimonu např. v 0,1 M octanovém pufru s 1∙10-5 M NaBr nebo 0,1 M KF (na SbFE). Je totiţ známo, ţe pík antimonu narozdíl od bismutu bývá při měřeních s SbFE za běţných podmínek velmi malý. První eventualita má význam z pohledu moţné korekce pozadí v oblasti potenciálů rozpouštění bismutu a tím i pouţití BiFE ke stanovení iontů s blízkými potenciálovými parametry, např.

161

některých ušlechtilejších kovů. Druhý případ s SbFE, pak nabízí moţnost nepřímého stanovení některých reagens s takto zesilujícím efektem, a to přes kontrolovaný nárůst rozpouštěcího píku antimonu. Dále bylo sledováno, jak se změní velikost intenzity proudu po přídavku malého mnoţství 1 M HClO4 k některým elektrolytům. Např. u 0,1 M NaI s BiFE se pík olova výrazně rozšířil, u 0,02 M NaI se zlepšila citlivost na olovo a u 0,05 M NaCl + 0,05 M KSCN s BiFE a zvětšil se i pík bismutu. Příznivý vliv měl také přídavek halogenidů k octanovému pufru, kdy se zvětšila intenzita proudu a tím i citlivost ke kadmiu i olovu. Z provedených studií vyplynulo, ţe nosné elektrolyty s přídavkem fluoridů byly asi nejlepší pro měření s BiFE, kdy příslušné experimenty mohly být prováděny na výrazně niţší koncentrační úrovni kademnatých a olovnatých iontů. Pro BiFE byl výborným médiem rovněţ 0,1 M octanový pufr v kombinaci s 1∙10-5 M NaI, který také umoţňoval měřit niţší koncentrace iontů Cd(II) a Pb(II); pro prvně jmenovaný byla však měření o něco citlivější. Konečně v případě SbFE byl zřejmě nejlepší směsný roztok 0,01 M HCl + 0,01 M KF, kde došlo ke zvýšení citlivosti stanovení pro oba sledované ionty. Závěr Získané výsledky a pozorování potvrdily a moţná i předčily očekávání, ţe důkladná systematická studie se dvěma momentálně populárními nertuťovými elektrodami můţe přinést některá nová zjištění, co se týče vlivu sloţení základního elektrolytu a funkce některých, dosud opomíjených komplexotvorných sloţek. Především halogenidy a některé pseudohalogenidy o určité koncentraci výrazně ovlivňovaly citlivost a selektivitu měření na obou elektrodách. Výrazný byl vliv fluoridů a jodidů, a to jak samostatně, tak i ve směsných roztocích. Důleţitou roli hrála i příslušná koncentrace obou komplexotvorných iontů a ve většině případů i aktuální hodnota pH. V souvislosti se závěrečným hodnocením je však nutno zdůraznit, ţe celá práce měla povahu počáteční studie, jejíţ výsledky je potřebné dále rozpracovat. Teprve důkladná optimalizační měření, včetně zmíněného ověření s jinými těţkými kovy, popř. i dalšími analyty, definitivně potvrdí, jak dalece lze výše popsaných efektů vyuţít v praktické elektroanalýze. Poděkování Tato práce vznikla za podpory Ministerstva školství, mládeţe a tělovýchovy ČR (projekt č. MSM0021627502 a Výzkumné centrum, LC 06035). Literatura 1. Wang J., Lu J.-M., Hočevar S. B., Farias P. A. M., Ogorevc B.: Anal. Chem. 72, 3218 (2000). 2. Królicka A., Pauliukaitė R., Švancara I., Metelka R., Norkus E., Bobrowski A., Kalcher K., Vytřas K.: Electrochem. Commun. 4, 193 (2002). 3. Vytřas K., Švancara I., Metelka R.: Electroanalysis 14, 1359 (2002). 4. Hočevar S. B., Švancara I.: Electroanalysis 22, 1399 (2010). 5. Švancara I., Prior C., Hočevar S. B., Wang J.: Electroanalysis, 22, 1405 (2010). 6. Hočevar S. B., Švancara I., Ogorevc B., Vytřas K.: Anal. Chem. 79, 8639 (2007). 7. Švancara I., Fairouz M., Ismail Kh., Metelka R., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 9, 31 (2003). 8. Švancara I., Hočevar S. B., Baldrianová L., Tesařová E., Vytřas K.: Sci. Pap. Univ. Pardubice, Ser. A 13, 5 (2007). 9. Švancara I., Schachl K.: Chem. Listy 93, 490 (1999). 10. Švancara I., Metelka R., Vytřas K.; v: Sensing in Electroanalysis (K. Vytřas, K. Kalcher, ed.), str. 7-18. Univerzita Pardubice, Pardubice, 2005.

162

Voltammetric Determination of Phenolic Antioxidants in Selected Petroleum Products (Voltametrické stanovení fenolických antioxidantů ve vybraných ropných produktech) Markéta Tomášková a, Jaromíra Chýlková a, Tomáš Mikysek b, and Renáta Šelešovská a a University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Institute of Environmental and Chemical Engineering, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic, E-mail: [email protected] b University of Pardubice, Faculty of Chemical Technology, Department of Analytical Chemistry, Studentská 573, 532 10 Pardubice, Czech Republic Abstract Voltammetric determination of synthetic antioxidant 2,6-di-terc.-butyl-4-methylfenol (BHT) in an organic isopropanol solvent in the presence of 0.1 mol.l-1 H2SO4 using a gold working electrode and method of DC voltammetry was tested. It was found that the method provides a range of concentrations of 5.48 mg/l to 43.84 mg/l of a linear response to the fixed amount. The quantification limit is 3.82 mg/l and detection limit is 2.62 mg/l respectively. Determination of BHT can be performed directly in samples of mixed oils or diesel, without previous separation. Keywords: Phenolic antioxidants, Voltammetric determination, Gold electrode. Úvod V současné době celosvětově roste význam produkce bionafty. Navíc přimíchání určitého podílu bionafty do fosilní motorové nafty vyţaduje dnes zákon v řadě zemí 1 a do motorových vozidel se tedy tankuje směsná nafta. Jednou z hlavních nevýhod bionafty je její nízká oxidační stabilita ve srovnání s ropnou naftou. Tato nestabilita je způsobena tím, ţe bionafta obsahuje velký podíl nenasycených esterů, které mohou být velice snadno oxidovány 2-5. K oxidaci dochází při kontaktu se vzduchem, vlivem teploty, světla nebo působením různých oxidaci podporujících látek (kovy, peroxidy). Produkty oxidace mohou ovlivnit nejen vlastnosti bionafty jako např. kyselost, viskozitu, hustotu apod., ale mohou rovněţ sniţovat výkon motoru 6. Vzhledem ke špatné oxidační stabilitě bionafty dochází také ke zhoršení této stability ve směsné naftě získávané právě přídavkem bionafty 7-8. Pro zlepšení kvality bionafty a zejména pro zvýšení její oxidační stability se přidávají různé antioxidanty. Antioxidanty tedy prodluţují ţivotnost bionafty a jejích směsí. Nejčastěji pouţívanými jsou 2,6-di-tercbutyl-4-methylfenol (BHT), směs 2- a 3-terc-butyl-4-methoxyfenolů (BHA), 2-tercbutylhydrochinon (TBHQ), propylester kyseliny gallové (PG) a pyrogalol (PA) 9-10. Byla zpracována celá řada studií zabývajících se vlivem jednotlivých syntetických antioxidantů na zvýšení oxidační stability bionafty a jejích směsí 10-14. Vzhledem k vlastnostem těchto antioxidantů jsou vyuţívány také v potravinářském, farmaceutickém a kosmetickém průmyslu, kde slouţí jako prevence rozkladu připravovaných produktů 15 a rovněţ jsou součástí aditiv přidávaných do mazacích olejů. Vhodná metoda stanovení antioxidantů je nezbytná pro určení a kontrolu jejich obsahu v různých typech produktů, jejich vlivu na oxidační stabilitu jednotlivých výrobků a rovněţ při sledování jejich úbytku v závislosti na čase, coţ souvisí například s určením doby ţivotnosti mazacích olejů, nebo moţností skladování bionafty a jejích směsí. Většina metod je ale instrumentálně náročných, drahých, vyţadujících často komplikovanou přípravu vzorku před vlastní analýzou a nejsou vhodné pro analýzu v terénu. Elektrochemické metody představují vhodnou relativně levnou alternativu s nenáročnou instrumentací a s moţností miniaturizace. Vlastní analýza je rychlá a velice citlivá. Navíc antioxidanty jsou látky, které se velmi snadno elektrochemicky oxidují 16. Tato práce je zaměřena na nalezení vhodných

163

podmínek pro přímé stanovení BHT ve směsné motorové naftě s vyuţitím zlaté indikační elektrody. Experimentální část Voltametrické analýzy 2,6-di-t-butyl-4-methylfenolu (BHT) byly realizovány pomocí elektrochemického analyzátoru EP 100VA (HSC servis, Bratislava) v tříelektrodovém uspořádání. Indikační elektroda byla ve tvaru zlatého disku (AuDE, HSC servis, Bratislava). Jako referentní slouţila argentchloridová elektroda, pomocná elektroda byla z platiny. Tento analyzátor je plně řízen počítačem. Jeho funkční vlastnosti, způsob ovládání a moţnosti řešení konkrétních analytických úkonů jsou dány pouţitým programovým vybavením 17. Ke studii reakčního mechanismu byl pouţit potenciostat PGSTAT 30 (AUTOLAB, Metrohm Autolab B. V. Utrecht, Nizozemí) ovládaný pomocí programu GPEs 4.9 od téhoţ výrobce. Měřicí cela byla opět v tříelektrodovém uspořádání, kde pracovní elektrodou byl zlatý disk ( 2 mm), referentní elektrodou saturovaná kalomelová elektroda oddělená od roztoku pomocí solného můstku naplněného základním elektrolytem a jako pomocná elektroda byl pouţit platinový plíšek. Elektrodový systém byl uchováván mezi jednotlivými analýzami v destilované vodě. Vlastní stanovení BHT probíhalo v isopropanolu (čistoty p.a., PENTA; CAS: 67-63-0) za přítomnosti 0,1mol.l-1 H2SO4 připravené z koncentrované kyseliny (90 %, PENTA, CAS: 7664-93-9) a v neutrálním roztoku LiClO4 (čistota 99,99 %, Aldrich; CAS: 7791-03-9) o koncentraci 0,01 mol.l-1 a 0,1 mol.l-1. Elektrochemická oxidace antioxidantu byla realizována metodou DC s lineární změnou potenciálu (Linear sweep voltametry). Indikační elektroda byla polarizována v rozmezí potenciálů 400 mV aţ 1300 mV při rychlosti scanu 40 mV/s. Po celou dobu experimentální práce nebyla elektroda nijak ošetřována či aktivována. Proudový rozsah byl 4 µA. Výsledky a diskuse Nejprve byl prostudován reakční mechanismus oxidace BHT. V minulosti byla věnována pozornost anodické oxidaci fenolických látek a na toto téma vyšlo několik prací 18. V této studii reakčního mechanismu bylo hlavním motivem porovnání jiţ dříve publikovaného mechanismu anodické oxidace BHT 19 s podmínkami pouţitými v této práci. Ze základní charakterizace elektrochemické oxidace BHT pomocí cyklické voltametrie (CV) vyplynulo, ţe se jedná o ireverzibilní proces, a při sledování závislosti potenciálu píku na rychlosti polarizace (scan rate) dochází k posunu potenciálu píku (Ep) směrem k pozitivnějším hodnotám, coţ svědčí o kineticky řízené elektrodové reakci. Ze záznamů voltametrie s rotující diskovou elektrodou (RDV) bylo zjištěno, ţe do této oxidace se zapojují dva elektrony, z čehoţ vyplývá, ţe stejně jako v dříve popisovaném mechanismu 19 dochází ke vzniku intermediátu, který dále reaguje s přítomným nukleofilem (OH skupinou) převáţně za vzniku p- substituovaného cyklohexa-2,5-dienonu (schéma 1). Druhou moţností je deprotonace, kdy se z intermediátu odštěpí proton a vznikne benzylalkohol. Tato moţnost je však za podmínek pouţití vodného roztoku kyseliny sírové a isopropanolu málo pravděpodobná.

Schéma 1

164

Během CV měření bylo v prostředí isopropanol – LiClO4 pozorováno výrazné sníţení proudu anodického píku po prvním skenu spolu s posunem potenciálu píku směrem k méně pozitivním hodnotám (viz Obr. 1). Vzhledem k tomu, ţe cyklohexa-2,5-dienon je relativně stabilní látka, lze tento jev vysvětlit jako moţnou pasivaci elektrody vzniklým produktem, přičemţ v prostředí isopropanol – LiClO4 dochází ke zhoršení reprodukovatelnosti při vlastním stanovení BHT. V případě pouţitého prostředí isopropanol – kyselina sírová nedocházelo k výraznější pasivaci pracovní elektrody, a proto se tento systém jevil vhodnější pro vlastní stanovení BHT.

Obr. 1. CV záznam oxidace BHT; křivky: (a) 1. sken, (b) 2. sken, (c) 3. sken; podmínky: 0.1 M LiClO4 v isopropanolu, c (BHT) = 1.5 mM, v = 100 mV.s-1, počáteční potenciál E = 0 V a vertex potenciál E = + 1.4 V oba vs SCE. K elektrochemickým oxidacím bylo tedy zvoleno prostředí H2SO4 o koncentraci 0,1 mol.l-1 v roztoku isopropanolu, který umoţnil nejen dobrou rozpustnost analytu – BHT, ale i veškerých sloţek reálného vzorku – směsné motorové nafty. Na obrázku 2 jsou uvedeny záznamy získané při elektrochemické oxidaci BHT v rozmezí koncentrací od 5,48 mg/l do 43,84 mg/l. Z obrázku je vidět, ţe výška píků lineárně odráţí stanovované mnoţství. Po statistickém zpracování 20 byla získána závislost ve tvaru h[ A] = (0,022 ± 0,001)c[mg/l] + 0,029 ± 0,024. Dále byly zjištěny mez stanovitelnosti 3,82 mg/l a mez detekce 2,62 mg/l. Z rozboru křivek na obrázku 2 je rovněţ patrné, ţe se vzrůstající koncentrací analytu se posouvá maximum píků směrem k pozitivnějším potenciálům a to v rozmezí Ep 955–990 mV. Vypracovaný postup přímého voltmetrického stanovení BHT byl aplikován na praktické vzorky směsné motorové nafty. Toto stanovení s vyuţitím zlaté indikační elektrody bylo nejprve testováno pomocí opakovaných analýz modelového vzorku se známým obsahem antioxidantu, který byl 524 mg BHT/l směsné motorové nafty. Na obr. 3 jsou dokumentovány křivky získané analýzou tohoto reálného vzorku. Z obrázku je vidět, ţe píky odpovídající anodické oxidaci BHT jsou dobře vyhodnotitelné. Přídavky standardu poskytují reprodukovatelnou odezvu. Průměrná stanovená hodnota z pěti analýz byla 529,4 mg/l se směrodatnou odchylkou 22,1 mg/l.

165

Obr. 2. Záznam křivek anodické oxidace při voltametrickém stanovení BHT v prostředí H2SO4: (0,1 mol.l-1 H2SO4 v isopropanolu; koncentrace BHT v rozmezí od 5,48 mg/l mg/l do 43,84 mg/l) Podmínky stanovení: metoda – DC; počáteční potenciál: 400 mV; konečný potenciál: 1300 mV; rychlost nárůstu potenciálu 40 mV/s; proudový rozsah: 4 µA.

Obr. 3. Záznam křivek anodické oxidace při voltmetrickém stanovení BHT v modelovém vzorku směsné motorové nafty. (0,1 mol.l-1 H2SO4 v isopropanolu; koncentrace 524 mg BHT/l směsné motorové nafty) Podmínky stanovení: metoda: DC; počáteční potenciál: 400 mV; konečný potenciál: 1300 mV; rychlost nárůstu potenciálu 40 mV/s; proudový rozsah: 4 µA. (křivka 1 – záznam anodické oxidace BHT v modelovém vzorku směsné motorové nafty; křivka 2, 3 – záznam anodické oxidace BHT po přídavcích 50 µl standardu o koncentraci 17,67 mg/l). Po ověření správnosti výsledků stanovení BHT, byla metoda aplikována na 5 vzorků směsné motorové nafty, která byla poskytnuta výrobcem, u nichţ byl obsah antioxidantu deklarován technologickým postupem. Nalezené hodnoty přináší tabulka I. Z ní vyplývá, ţe u vzorků č. 2 aţ 5 byl deklarovaný obsah BHT potvrzen. Nalezený obsah BHT ve vzorku č. 1 můţe pocházet podle sdělení výrobce z výchozích surovin, popřípadě z antikorozních přísad.

166

Tabulka I. Výsledky voltametrického stanovení BHT v reálných vzorcích směsné nafty. Číslo měřeného vzorku Deklarováno [ppm] Stanoveno [ppm] 1 0 167,9 2 500 517,7 3 500 509,1 4 1000 1052,5 5 1000 923,0 Závěr Z předloţené práce vyplynulo, ţe voltmetrické stanovení syntetického antioxidantu 2,6-ditert-4-methylphenolu (BHT) v prostředí organického rozpouštědla – isopropanolu za přítomnosti 0,1 mol.l-1 H2SO4 s vyuţitím zlaté indikační elektrody a metody DC poskytuje v rozmezí koncentrací 5,48 mg/l do 43,84 mg/l lineární odezvu na stanovované mnoţství. Mez stanovitelnosti je 3,82 mg/l a mez detekce je 2,62 mg/l. Stanovení BHT, jako nejčastěji pouţívaného fenolického antioxidantu, lze provádět za doporučených podmínek přímo ve vzorcích olejů nebo směsné motorové nafty bez předchozí separace. Poděkování Tato práce byla financována z projektů SGFCHT05 a MSM 0021627502. Autoři děkují. Literatura 1. Directive 2009/28/EC of the European parliament and of the Council. Official J. Eur. Union 52, 16–62, EU, 2009. 2. Ma F., Hanna M.A.: Biosensource Technol. 70, 1 (1999). 3. Issariyakul T., Kulkarni M.G., Dalai A.K., Bakhshi N.N.: Fuel Process Technol. 88, 429 (2007). 4. He H., Wang T., Zhu S.: Fuel 86, 442 (2007). 5. Knothe G., Dunn R.O.: J Am. Oil Chem. Soc. 80, 1021 (2003). 6. Monyem A., Van Gerpen J.H.: Biomass. Bioenerg. 86, 442 (2001). 7. Plessis L.M., Villiers J.B.M., Walt W.V.: J Am. Oil Chem. Soc. 62, 748 (1985). 8. Jain S., Sharma M.P.: Renew. Sust. Energ. Rev. 14, 667 (2010). 9. Dunn O.: Fuel Process. Technol. 86, 1071 (2005). 10. Karavalakis G., Hilari D., Givalou L., Karonis D., Stournas S.: Energy (36), 369, 2011. 11. Xin J., Imahara H., Saka S.: Fuel 88, 282 (2009). 12. Araújo S.V., Luna F.M.T., Rola E.M., Azevedo D.C.S., Cavalcante C.L.: Fuel Process. Technol. 90, 1272 (2009). 13. Domingos A.K., Saad E.B., Vechiatto W.W.D., Wilhelm H.M., Ramos L.: J. Brazil. Chem. Soc. 18, 416 (2007). 14. Ryu K.: Bioresource Technol. 101, S78 (2010). 15. Hudson B.J.F.: Food Antioxidants, Elsevier, London, UK 1990. 16. Korotkova E.I., Korbainov Y.A., Shevchuk A.V.: J. Electroanal. Chem. 518, 56 (2002). 17. HSC SERVIS: Referenční manuál k elektrochemickému analyzátoru EP 100VA, verze 4.2, HSC Servis, Bratislava 1995. 18. Grimshaw J.: Electrochemical Reactions and mechanisms in organic chemistry, Elsevier Science, London, UK 2000. 19. Ronlan A., Parker V. D.: J. Chem. Soc. (C), 19, 3214 (1971). 20. J. N. Miller, J. C. Miller: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry, Pearson Education, Harlow 2005.

167

Contactless Conductivity Detection in Capillary Electrophoresis in Combination with Capillaries with Thin Inner Diameter (Bezkontaktní vodivostní detekce v kapilární elektroforéze ve spojení s kapilárami o velmi malém vnitřním průměru) Petr Tůma, and Eva Samcová Charles University in Prague, Third Faculty of Medicine, Institute of Biochemistry, Cell and Molecular Biology, Ruská 87, 100 00 Prague 10, Czech Republic E-mail: [email protected] Abstract Sensitivity of the capacitively coupled contactless conductivity detector (C 4D) was tested in combination with silica capillaries of inner diameter (i.d.) 10 – 75 µm. The detector response was measured in wide range of specific conductivities of KCl solutions 0 – 1295 mS.m-1 (0 – 100 mmol/L). C4D in combination with wide capillary (i.d. 75 µm) provides a high sensitivity in low conductivity solution. On the other hand the use of thin capillary is more convenient in high conductivity solutions. Advantages of CE/C4D analysis in thin capillaries were demonstrated at the separation of Cs+, NH4+ and K+ ions. Key words: Contactless conductivity detection, Capillary electrophoresis, Limit of detection, Separation efficiency. Úvod Vliv vnitřního průměru (i.d.) kapiláry na citlivost optických detektorů v kapilární elektroforéze (CE) je dobře znám 1, ale nebyl dosud podrobně studován u axiálních bezkontaktních vodivostních detektorů s tubulárními elektrodami běţně označovanými jako contactless capacitively coupled conductivity detectors (C4D) 2-3. Tyto detektory jsou v současné době hojně vyuţívány v CE především pro detekci neabsorbujících analytů 4. U C4D je separační kapilára vsunuta do tubulárních měřících elektrod a povrch měřící elektrody je oddělen od analyzovaného roztoku silnou vrstvou křemene tvořícího stěnu kapiláry 5. V případě 75 µm kapiláry tvoří vnitřní průřez 4.3% z celkové plochy a u 10 µm kapiláry je to pouhých 0.08% (všechny kapiláry o i.d. 5 aţ 100 µm mají z důvodu mechanické pevnosti vnější průměr 360 µm). I přes tyto nevhodné poměry lze prostřednictvím C4D v kombinaci s CE separací dosáhnout LOD na mikromolární úrovni: stanovení anorganických kationtů v moči s LOD od 0.7 µM (Mg2+) do 2.0 µM (NH4+) v 75 µm kapiláře 6, stanovení aminokyselin v klinických vzorcích s LOD 0.1 µM (lysin) aţ 1.7 µM (kyselina asparagová) v 25 µm kapiláře 7. Experimentální část Veškeré pouţité chemikálie dosahovaly analytického stupně čistoty. Při experimentech byly pouţívány křemenné kapiláry s ochrannou vrstvou polyimidu (Composite Metal Services, UK) o id 10, 25, 50 a 75 µm a vnějším průměru 360 µm; celková délka kapilár byla 32.5 cm, délka k C4D 18 cm. Kapiláry byly vloţeny do termostatované kazety se zabudovaným C4D. C4D s tubulárními elektrodami o délce 2.5 mm, detekční mezerou 1.2 mm, pracuje se sinusovým signálem o frekvenci 1.8 MHz a efektivní hodnotou napětí 50 V. Pro minimalizaci šumu je elektronický obvod C4D zapojen tak, ţe poskytuje výstupní napětí v rozsahu 0 – 1 V. Tento detektor byl vyvinut na Katedře fyzikální chemie PřF UK 8 a je v současné době komerčně dostupný (www.hpst.cz). Pro kalibraci C4D byly pouţity roztoky KCl o koncentracích 0 – 100 mM, s hodnotami specifické vodivosti (κ) 0 – 1295 mS.m-1. Při měření odezvy C4D na Δκ(KCl), byla Δκ(KCl) vyvolána zvýšením teploty elektroforetické kazety z 25.0 ºC na 25.5 ºC; κ(KCl) závisí na teplotě (T) dle vztahu κT+ΔT= κT.(1+β. ΔT) s hodnotou teplotního koeficientu β 0.024 K-1 9. Elektroforetická měření byla provedena na přístroji

168

HP3DCE system (Agilent Technologies, Waldbronn, Germany) při teplotě 25 ºC s hydrodynamickým dávkováním vzorku. Výsledky a diskuse Vliv i.d. kapiláry na detekční parametry C4D Základní charakteristikou C4D je závislost výstupního napětí detektoru (signál) na specifické vodivosti (κ) měřeného roztoku 10, která je pro kapiláry o i.d. 10 – 75 µm shrnuta na obr. 1. Kalibrační závislost C4D nevychází z počátku souřadnic, ale pro velmi nízké κ se stáčí ke kladnému úseku na ose y. Tento úsek odpovídá parazitickému přenosu elektrického signálu mezi elektrodami C4D, který není závislý na κ roztoku v kapiláře a je popsán rozptylovou kapacitou náhradního obvodu. Poté následuje strmý lineární úsek, který je z analytického hlediska nejdůleţitější a v tomto rozsahu κ by měl být C4D pouţíván. Pro vysoké κ jiţ C4D nepracuje lineárně, coţ je způsobeno nevhodným poměrem mezi pouţitou frekvencí budícího signálu a κ měřeného roztoku. Z porovnání kalibračních závislostí pro jednotlivé i.d. kapiláry získáváme lineární vztah mezi výstupním napětím a vnitřním průřezem kapiláry (viz. inset obr. 2). Výstupní signál C 4D je úměrný proudu I tekoucího detekční celou, který lze popsat Ohmovým zákonem ve tvaru: I = U∙κ∙π∙(i.d.)2/4d , kde U je budící napětí C4D a d délka mezery mezi elektrodami. Směrnice lineárního úseku kalibrační křiky vzrůstá s druhou mocninou i.d. kapiláry: srovnáme-li 10 a 75 µm kapiláru je strmost kalibrační křivky pro 75 µm 7.52 = 56.3krát vyšší. Poloha lineárního úseku kalibrační křivky se postupně posouvá s rostoucím i.d. kapiláry k menším hodnotám κ. Kapiláry o velkém i.d. jsou pouţitelné pouze při malých hodnotách κ a brzy u nich dochází k přechodu do nelineární oblasti kalibrační závislosti a následně k překročení maximální hodnoty výstupního napětí detektoru.

Obr. 1. Závislost výstupního napětí C4D na specifické vodivosti roztoku v kapiláře o i.d.: 10 µm (■), 25 µm (○), 50 µm (●), 75 µm (□). Inset: závislost směrnice kalibrační křivky na vnitřním průřezu kapiláry. Pro odhad LOD C4D pro různé κ základního elektrolytu (BGE) a i.d. kapiláry je vhodné pouţívat poměr citlivost C4D/šum. Citlivost C4D byla měřena jako odezva C4D na Δ κ(KCl)

169

dělená κ(KCl). Výsledná hodnota poměru citlivost C4D/šum roste s i.d. kapiláry s tím, ţe její poloha maxima se posouvá s rostoucím i.d. k niţším hodnotám κ: maximální poměr citlivost/šum je pro 75 µm kapiláru 20.4 m.mS-1 při κ 32 mS.m-1 a pro 10 µm kapiláru 1.3 m.mS-1 při κ 410 mS.m-1. Pro 75 µm kapiláru je hodnota maxima citlivost/šum 15.7krát vyšší neţ v 10 µm kapiláře, coţ je výrazně méně v porovnání s 56krát větší strmostí kalibrační křivky. V 10 µm kapiláře je niţší hodnota šumu, coţ kapiláru o malém i.d. zvýhodňuje: šum C4D je úměrný proudu tekoucímu detekční celou a vzrůstá se zvyšujícím se κ i s i.d. kapiláry (viz. inset obr. 2). Vezme-li se do úvahy pouze detekční hledisko, je pro dosaţení nízkého LOD vhodné pouţívat kapiláry o vysokém i.d. při nízkých κ.

Obr. 2. Závislost poměru citlivost C4D/šum na specifické vodivosti roztoku v kapiláře. Inset: závislost šumu C4D na specifické vodivosti. i.d. kapiláry: 10 µm (■), 25 µm (○), 50 µm (●), 75 µm (□). Využití kapilár o malém i.d. při CE separaci Optimalizování i.d. kapiláry je nutné vztahovat nejen k detekčním, ale i k separačním parametrům. Pro vzájemné srovnání těchto dvou hledisek byla separace modelové 100 µM směsi kationtů Cs+, NH4+ a K+ provedena v 75 i 10 µm kapiláře (obě kapiláry jsou dlouhé 32.5 cm a nadávkované mnoţství vzorku tvořilo 0.8 % z celkové délky kapiláry, vypočteno dle Hagen-Poiseuille rovnice). V 75 µm kapiláře byla separace provedena v 5 mM LiOH/HAc + 1 mM 18-crown-6 (pH 4.7, κ 38 mS.m-1) a v 10 µm kapiláře v 50 mM LiOH/HAc + 1 mM 18-crown-6 (pH 4.7, κ 333 mS.m-1); zvolené κ BGE odpovídají maximální citlivosti C4D v pro dané i.d. (18-crown-6 byl pouţit jako aditivum pro oddělení NH4+ a K+ 6). V 75 µm kapiláře je výška píku pro Cs+ 35x vyšší a šum 2.5x vyšší v porovnání s 10 µm kapilárou (Table 1). 14x vyšší poměr výška píku/šum v 75 µm kapiláře plně odpovídá odhadu provedeného z měření odezvy C4D na Δκ(KCl). V 10 µm kapiláře je dosaţeno 5x vyššího počtu teoretických pater (N) a rozlišení sousedních píků Cs+/NH4+ je 3.0 v porovnání s hodnotou 1.3 pro 75 µm kapiláru. Mnohem lepší separační parametry v 10 µm kapiláře jsou dány pouţitím BGE o vysokém κ, v kterém je délka zóny analytu kratší v důsledku působení

170

Kohlrauschovy regulační funkce (stejná délka nadávkované zóny Cs+ je při průchodu C4D dlouhá 1.7 mm v 10 µm kapiláře a 3.4 mm v 75 µm).

Obr. 3 CE separace anorganických iontů v 10 µm (A) a 75 µm (B) kapiláře o délce 32.5 cm. Experimentální podmínky: (A) BGE 50 mM LiOH/HAc + 1 mM 18-crown-6 (pH 4.7), dávkování 3000 mbar.s, +10 kV; (B) BGE 5 mM LiOH/HAc + 1 mM 18-crown-6 (pH 4.7), dávkování 50 mbar.s, +10 kV. Vzorek: 100 µM směs Cs+ (1), NH4+ (2) a K+ (3). Tabulka I. Charakteristiky odezvy C4D na pík Cs+ iontů o koncentraci 100 µM v 10 a 75 µm kapiláře. Další experimentální podmínky viz Obr. 3. Parametr 10 µm i.d. 75 µm i.d. Výška píku (µV) 150 5200 Šum (µV) 1 2.5 Výška píku/ šum 150 2080 Šířka píku (mm) 1.7 (0.0) 3.9 (0.1) N (m-1) 326 000 (10 000) 64 000 (2 000) Rozlišení Cs+/NH4+ 3.0 (0.1) 1.3 (0.0) Závěr I kdyţ strmost závislosti výstupního napětí C4D na specifické vodivosti roztoku vzrůstá s druhou mocninou vnitřního průměru kapiláry, není pouţití kapilár o velkém i.d. vţdy výhodné. Kromě toho, ţe s id kapiláry roste i šum C4D, je pouţití kapilár o velkém id omezeno na separace prováděné v ředěných BGE. Na druhou stranu kapiláry s malým id je vhodné pouţívat při separacích v koncentrovaných BGE o vysoké vodivosti. V kapilárách o malém i.d. lze dosáhnout vysoké separační účinnosti a lze je pouţít pro separace prováděné při extrémních hodnotách pH. Poděkování Práce vznikla za finanční podpory Grantové agentury České republiky (projekt P206/10/1231) a Ministerstva školství, mládeţe a tělovýchovy (výzkumný záměr MSM0021620814).

171

Literatura 1. Lauer H.H., Rozing G.P.: High Performance Capillary Electrophoresis. Agilent Technologies, Germany 2010. 2. Kubáň P., Hauser P.C.: Electrophoresis 30, 176 (2009). 3. Kubáň P., Hauser P.C.: Anal. Chim. Acta 607, 15 (2008). 4. Šolínová V., Kašička V.: J. Sep. Sci. 29, 1743 (2006). 5. Zemann A.J.: Electrophoresis 24, 2125 (2003). 6. Tůma P., Samcová E., Duška F.: J. Sep. Sci. 31, 2260 (2008). 7. Tůma P., Málková K., Samcová E., Štulík K.: J. Sep. Sci. 33, 2394 (2010). 8. Gaš B., Zuska J., Coufal P., Van De Goor T.: Electrophoresis 23, 3520 (2002). 9. Sawyer D.T., Roberts J.L., Sobkowiak A.: Electrochemistry for Chemists. John Wiley & Sons Inc, New York 1995. 10. Kubáň P., Hauser P.C.: Electrophoresis 25, 3387 (2004).

172

Development and Utilization of Cylindrical Flow through Amperometric Cell Based on Crystallic Silver Amalgam Jana Tvrdikova, Ales Danhel, and Jiri Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 8, 128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract The single crystal of silver amalgam was used for construction of cylindrical flow through cell and applied for amperometric detection of 1,3-; 1,5- and 1,8-dinitronaphthalene mixture previously separated by conventional RP-HPLC. The developed method is applicable in whole linear concentration range 1 – 100 mol l-1 with limits of detection 1 mol l-1 and errors less than 7 % using 0.05M ammonium acetate buffer pH 4.7 with methanol (27:73) as a mobile phase at flow rate 1.5 ml min-1 and applied potential −1100 mV. Keywords: Amperometric detection, Crystallic silver amalgam, Cylindrical flow cell, Dinitronaphthalenes, Electrochemical detector, HPLC. Introduction As the increasing number of analytical applications indicates, the convenience of silver amalgam electrodes for voltammetric and amperometric detection of inorganic and organic compounds is obvious 1-3. Even if crystallic silver amalgam has been investigated since 1930 (Ref. 4), its electroanalytical application became under investigation since 2009 (Ref. 5). Silver amalgam crystallizes in three crystal structures (phases): cubic ( ) 29 – 32.5 wt.%Ag; hexagonal ( ) 33 – 48 wt.%Ag and face-centered cubic ( >48 wt.%Ag, in dependence on amalgam composition, all needle like crystals 6,7. Attributes such as small proportions of the crystals, smooth surface of prepared working electrode, its high hydrogen over potential comparable with mercury electrodes and high signal to noise ration were advantageously used for voltammetric determination of 4-nitrophenol in aqueous 8 and selected dinitronaphthalenes (DNN) in aqueous-methanol media 9,10. Analogously with previously constructed microcylindrical platinum and cooper flow through detectors 11, similar detection cell based on single crystal of silver amalgam was prepared and utilized for amperometric determination of selected dinitronaphthalenes after their previous separation by RP-HPLC in this work. Experimental Silver powder (2 – 3.5 microns, 99.9+%, Aldrich, Germany), three times distillated polarographic mercury (99.999 %, Polarografie–Praha, Czech Republic) and silver nitrate (AgNO3, p.a., Safina Vestec, Czech Republic) were used for preparation of crystallic silver amalgam. The crystallic amalgam was prepared according to procedure already described8. Mobile phases were prepared from 0.01M acetic acid solution with adjusted pH by 1M NH4OH solution (both p.a. purity) and methanol (HPLC grade, Merck, Germany), deionized water was produced by Milli-Q plus system (Millipore, USA). The 1 10-3 mol l-1 stock solutions of determined compounds: 1,3-dinitronaphthalene (1,3-DNN, 97 %), 1,5dinitronaphthalene (1,5-DNN, 98 %) and 1,8-dinitronaphthalene (1,8-DNN, 97 %), all purchased by Sigma-Aldrich, Germany, were prepared by dissolution of their proper amounts in HPLC grade methanol and further diluted in proper quantities to final ratio 1:1:1. Oxygen was removed by nitrogen 4.0 purity (Linde, Czech Republic). The cylindrical flow through cell (Fig. 1) utilized for amperometric detection of DNN was prepared in approximately 5 cm long Teflon tube (i.d. 1 mm). The Teflon tube was twice

173

transversely perforated in parallel by Insulin syringe (o.d. 0.3 mm). Selected silver amalgam crystal (more than 2 mm long) was laced through the tube and on the one side isolated by the film of polystyrene (30 mg blown polystyrene dissolved in 1 ml of dichlorethane). A contact was mediated by platinum wire (o.d. 0.1 mm) touched with the crystal on the other side and also isolated by polystyrene film. Second platinum wire (o.d. 0.1 mm) was laced through the second perforation in flow direction and it was used as auxiliary electrode. Silver chloride reference electrode (Ag|AgCl, 3M KCl, Monokrystaly Turnov, Czech Republic) was rinsed together with the outlet side of the detector into an overflow glass vessel containing the mobile phase.

Fig. 1. Scheme of cylindrical flow through cell based on crystallic silver amalgam working electrode (WE) and platinum wire auxiliary electrode (AuxE). HPLC system was composed from Organiser, Pump (L-2130), Column Owen (L-2300) and Diode-Array Detector (DAD, L-2450, all Merck Hitachi, USA) and Electrochemical Detector (ED, Bioanalytical Systems, USA) connected to Analog Input Device (EZC/L-2000, Hitachi, USA). HPLC system was operated by software EZChrome Elite (Agilent, USA). HPLC column RP-18 Endcap. (5 m) (LiChroCART 125-4, LiChrospher 100, No. 214551, Merck, Germany) was used for deterination of DNNs in mixture. Mobile phase consisted from the 0.01M ammonium acetate pH 4.7 and methanol in a proper ratio was previously 15 min degassed in ultrasonic bath (PSO2000A, Notus-Powersonic, Slovakia) and bubbled by nitrogen 20 min before and during all chromatographic measurements. Previously 5 min bubbled mixture of DNNs was injected by 20 l manual loop injector (Rheodyne, USA) and separated at RP-HPLC column at 35°C using appropriate flow rate 0.5 – 1.5 ml min-1. Chromatogram obtained by DAD was registered at wavelengths within 220 to 500 nm and inserted potential (Ein) on working electrode of cylindrical flow cell was set within range −400 to −1300 mV (vs. Ag|AgCl, 3M KCl). Results and discussion Composition of mobile phase, flow rate, and detection potential inserted on working electrode are main parameters influencing separation and electrochemical detection in HPLC with electrochemical detection, in general. Firstly, 0.01M ammonium acetate pH 4.7 was selected 174

as base electrolyte according to previous experiences in voltammetric determination of observed DNNs. Composition of mobile phase, convenient ration of base electrolyte and organic modifier (methanol, MeOH), was optimized to reach fast and efficient separation of DNNs using column LiChrospher RP-18 Endcap. (125 4 mm, 5 μm). Ratios 30:70; 27:73; 25:75 and 20:80 (V/V) of 0.01M ammonium acetate pH 4.7 and MeOH were observed at selected flow rates 1.0 ml min-1 and Ein −1100 mV. Using optimal mobile phase composition 0.01M ammonium acetate pH 4.7+MeOH (27/73), hydrovoltammograms at selected Ein −400; −600; −800; −900; −1000; −1100; −1200 and −1300 mV were registered for flow rates 0.50; 0.75; 1.00; 1.25 and 1.50 ml min-1. Finally, chromatograms in dependence on concentration of DNNs within 1 – 100 μmol l-1 were registered using found optimal conditions 0.01M ammonium acetate pH 4.7+MeOH (27/73) at flow rate 1.5 ml min-1 and inserted potential −1100 mV. The chromatograms within concentration range 10 – 100 μmol l-1 are depicted in Figure 2.

Fig. 2. Chromatograms registered by cylindrical flow through cell based on crystallic silver amalgam in dependence on DNNs‟ concentration: (1) 10; (2) 20; (3) 40; (4) 60; (5) 80 and (6) 100 μmol l-1; Ein= −1100 V, mobile phase 0.01M ammonium acetate pH 4.7+MeOH (27:73), flow rate 1.5 ml min-1, column LiChrospher RP-18 Endcap. (125 4 mm, 5 μm). First peak observed in chromatograms correspond to MeOH indicating death time. DNNs were eluted in sequence 1,8-DNN, 1,5-DNN and 1,3-DNN, respectively. Unstable baseline signal under peak of 1,8-DNN corresponds to different content of oxygen in mobile phase and in injected sample. All three DNN were determined in whole linear concentration range 1 – 100 μmol l-1 with limits of detection 1 μmol l-1, evaluated as 3.3 SD/Slope of appropriate calibration straight lines within 1 – 10 μmol l-1. The standard deviation (SD) was calculated from seven repeated measurements at concentration 1 μmol l-1. The developed cylindrical flow through cell provides promising results of amperometric determination of electrochemically reducible nitro-compounds. Conclusion Applicaiton of amperometric detection utilizing cylindrical flow through cell based on single crystal silver amalgam was confirmed in this work. Electrochemically reducible dinitronaphthalenes were determined by this developed method at micromolar concentration

175

level. Other use of this novel electrode material for development of detection cells applicable in micro-scale butch analysis will be object of further research. Acknowledgment Financial support from Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects LC 06035, MSM 0021620857 and RP 14/63), Grant Agency of Charles University (project 89710/2010/B-Ch/PrF) and project SVV 2011-263204 is gratefully acknowledged. References 1.

Yosypchuk B., Navratil T., Barek J., Peckova K., Fischer J., in book: Progress on Drinking Water Research (LeFebvre M.H., Roux M.M., Eds.), chap. 4, p. 143. Nova Science Publishers, New York 2008. 2. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 3. Danhel A., Barek J.: Curr. Org. Chem. (In press). 4. Weryha A.: Z. Kristall. 86, 335 (1933). 5. Danhel A., Yosypchuk B., Barek J.: Moderni elektrochemicke metody - Sbornik prednasek z XXIX. Mezinarodni odborna konference, Jetrichovice, 25. - 28. 5. 2009, Eds.: Navratil T., Barek J.), BEST Servis Usti nad Labem, p. 15, Jetrichovice, Czech Republic 2009. 6. Nirmala K.A., Gowda D.S.S.: J. Appl. Cryst. 8, 6 (1975). 7. Zakrzewski M.A., Burke E.A.J.: Mineral. Mag. 51, 360 (1987). 8. Danhel A., Tvrdikova J., Barek J.: Moderni elektrochemicke metody - Sbornik prednasek z XXX. Mezinarodni odborne konference, Jetrichovice, 24. - 28.5.2010, Eds: Navratil T., Barek J.), BEST Servis Usti nad Labem, p. 22, Jetrichovice, Czech Republic 2010. 9. Tvrdikova J., Danhel A., Barek J.: Chem. Listy 105, s76 (2011). 10. Tvrdikova J.: Diploma thesis. Charles University in Prague, Prague 2011. 11. Peckova K., Mocko V., Opekar F., Swain G. M., Zima J., Barek J.: Chem. Listy 100, 124 (2006).

176

Using Anthraquinone Labeled Nucleotide Triphosphates for Electrochemical Analysis of DNA (Využití antrachinonem značených nukleosid trifosfátů pro elektrochemickou analýzu DNA) a b Pavlína Vidláková , Jana Balintová , Petra Horáková a, Luděk Havran a, Petr Orság a, Miroslav Fojta a, and Michal Hocek b a Institute of Biophysics ASCR,v.v.i., Královopolská 135, 612 65 Brno, Czech Republic, E-mail: [email protected] b Institute of Organic Chemistry and Biochemistry v. v. i., Flemingovo nam. 2, 166 10 Praha 6, Czech Republic Abstract Base-modified anthraquinone-nucleotide triphosphates were used for DNA labeling. Anthraquinone modified nucleotides were incorporated into DNA by primer extension with KOD polymerase. In cyclic and square wave voltammetry at HMDE or PGE antraquinone gave a well developed characteristic signal suitable for differentiation of the labeled DNA from unlabeled one. Key words: DNA, Anthraquinone, Electrochemical analysis, DNA modification, Primer extension. Úvod Elektrochemická analýza je vyuţívána ke studiu přirozených i modifikovaných molekul DNA a oligonukleotidů. Elektrochemická stanovení dosahují citlivosti srovnatelné s optickými metodami při niţších pořizovacích a provozních nákladech. Molekula nemodifikované DNA je elektroaktivní a je moţné ji detekovat na rtuťových i uhlíkových elektrodách 1. Pro zvýšení citlivosti stanovení je moţné pouţít různé elektrochemické značky, které podléhají redoxním reakcím a dávají tak modifikované DNA nové elektrochemické vlastnosti (například látky obsahující organokovové skupiny 2,3, amino- nebo nitroskupinu 4,5). Ke značení DNA je moţné pouţít modifikované nukleosidtrifosfáty, které jsou do DNA inkorporovány pomocí polymeráz. V našem případě byla pouţita technika značení ODN a DNA pomocí nukleosidtrifosfátů modifikovaných antrachinonem. Experimentální část Antrachinonem modifikované nukleosidtrifosfáty byly připraveny Sonogashira cross-coupling reakcí 2-ethynylantrachinonu a N-(-2-propynyl)-antrachinoncarboamidu s halogenovanými nukleosidtrifosfáty. Inkorporace značených nukleosidtrifosfátů byla prováděna metodou prodluţování primeru (PEX). Reakční směs obsahovala KOD XL DNA polymerázu (2,5 U/ l, 0,3 l), dNTP (4mM přirozené, 40 mM značené), primer (3 M, 1 l, 3'-GGGTACGGCGGGTAC-5') a 5„biotinylovaný templát (3 M, 1,5 l, 5'-CTAGCATGAGCTCAGTCCCATGCCGCCCATG3'). Reakční směs byla inkubována 30 minut při 60 oC. Reakce byla ukončena přidáním 40 μl směsi 80 % [v/v] formamidu, 20 mM EDTA, 0.025 % [w/v] bromfenolové modři, 0.025 % [w/v] xylencyanolové violeti a zahřátím na 95 oC. Reakční směs byla analyzována pomocí polyakrylamidové gelové elektroforézy. Oligonukleotidy byly přečistěny pomocí magnetoseparační techniky na magnetických kuličkách Dynabeads-Streptavidin M270 (Dynal A. S., Norway). Voltametrická měření byla prováděna na analyzátoru Autolab (Eco Chemie, Utrecht, The Netherlands) spojeném s VA-Stand 663 (Metrohm, Herisau, Switzerland) ve tříelektrodovém zapojení (Ag/AgCl/3 M KCl jako referenční elektroda, platinový drátek jako pomocná elektroda). Měření bylo prováděno v inertní atmosféře argonu. Jako pracovní elektroda byla

177

pouţívána visící rtuťová kapková elektroda (HMDE) nebo elektroda z pyrolytického uhlíku (PGE). Doba akumulace byla 60 s. Cyklická voltametrie (CV) na HMDE - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, pH 6,9, počáteční potenciál 0,0 V, potenciál bodu obratu -1,85 V nebo -0,8 V. Square wave voltametrie (SWV) na PGE základní elektrolyt 0,2 M acetátový pufr, pH 5, počáteční potenciál -1 V, konečný potenciál 1,6 V. Výsledky a diskuse Elektrochemické chování PEX produktů značených antrachinonem bylo studováno pomocí cyklické voltametrie a square wave voltametrie na HMDE a PGE. V případě CV na HMDE jsou v cyklickém voltamogramu neznačených ODN měřeném při počátečním potenciálu 0 V a potenciálu bodu obratu -1,85 V patrné dva signály příslušející elektrochemickým reakcím bází. Jedná se o katodický pík CA při potenciálu okolo -1,5 V příslušející ireverzibilní redukci cytosinu a adeninu a anodický pík G při potenciálu -0,25 V příslušející oxidaci 7,8dihydrogenguaninu generovaného redukcí guaninu při potenciálech niţších neţ -1,6 V 1,2. Na cyklickém voltamogramu ODN značených antrachinonem je kromě píků CA a G v katodické větvi dobře vyvinutý pík v potenciálové oblasti okolo -0,4 V příslušející redukci antrachinonu (Obr. 2A). V „krátkém“ skenu CV (počáteční potenciál 0 V, potenciál bodu obratu -0,8 V) měřeném na HMDE nebo PGE neznačené ODN neposkytují ţádný signál, zatímco ODN značené antrachinonem poskytují signály příslušející reverzibilní redukci antrachinonu (Obr. 2B). Na square wave voltamogramu nemodifikovaných ODN měřeném na PGE jsou patrné dva píky příslušející oxidacím bází guaninu Gox v oblasti okolo 1,2 V a adeninu Aox v oblasti okolo 1,4 V 1. V případě ODN značených antrachinonem je na voltamogramu kromě signálů příslušejících adeninu a guaninu v DNA patrný i pík antrachinonu při potenciálu okolo -0,4 V (Obr. 3).

Obr. 1. 7-deazaadenosintrifosfát značený propargylkarbamoylantrachinonem cytidintrifosfát značený ethynylantrachinonem pouţívané jako elektrochemické značky.

178

a

24 12

-0.126

0

-0.189

I/ A

-0.063

nezn. s antrachinonem

-0.252

nezn. s antrachinonem

-12 -24

A

-0.315

B

-36

-0.378 -1.60

-1.28

-0.96

-0.64

-0.32

0.00

-0.84

-0.70

-0.56

E/V

-0.42

-0.28

-0.14

E/V

Obr. 2. AdTS CV PEX produktů na HMDE - základní elektrolyt 0,3 M mravenčan amonný, 0,05 M fosforečnan sodný, pH 6,9, A - počáteční potenciál 0.0 V, potenciál obratu -1.85 V, B - počáteční potenciál 0.0 V, potenciál bodu obratu -0,8 V.

12 10 8

I/ A

I/ A

0.000

nezn. s antrachinonem

6 4 2 0 -0.6

-0.4

-0.2

0.8

1.0

1.2

1.4

1.6

E /V Obr. 3. AdTS SWV PEX produktů na PGE – základní elektrolyt 0,2 M acetátový pufr, pH 5, počáteční potenciál -1 V, konečný potenciál 1,6 V. Závěr V této práci prezentujeme metodu značení DNA s vyuţitím nukleosidtrifosfátů modifikovaných antrachinonem. Značenou DNA je moţné elektrochemicky detekovat na HMDE i PGE elektrodách. Během CV a SWV poskytuje zbytek antrachinonu dobře vyvinutý reverzibilní pík v oblasti kolem -0,4 V. Naše další výsledky ukazují, ţe tento signál je moţné pouţít pro analýzu sekvence DNA a pro studium DNA-protein interakcí. Poděkování Tato práce vznikla díky podpoře grantů GA AVČR (IAA400040901), MŠMT ČR (LC06035) a výzkumných záměrů AV0Z50040507 a AV0Z50040702.

179

0.00

Literatura 1. Palecek, E., Jelen, F.: In Electrochemistry of nucleic acids and proteins Towards electrochemical sensors for genomics and proteomics (Palecek, E., Scheller, F., Wang, J., ed.), pp 74-174, Elsevier, Amsterdam 2005. 2. Fojta, M., Havran, L., Kizek, R., Billova, S., Palecek, E.: Biosens. Bioelectron. 20, 985 (2004). 3. Vrabel, M., Horakova, P., Pivonkova, H., Kalachova, L., Cernocka, H., Cahova, H., Pohl, R., Sebest, P., Havran, L., Hocek, M., Fojta, M.: Chem-Eur. J. 15, 1144 (2009). 4. Cahova H., Havran L., Brazdilová P., Pivonkova H., Pohl R., Fojta M., Hocek M.: Angew. Chem. Int. Ed. 47, 2059 (2008). 5. Horakova P., Cahova H., Pivonkova H., Spacek J., Havran L., Hocek M., Fojta M.: Org. Biomol. Chem. 9, 1366 (2011).

180

Determination of Aminoglutethimide Using HPLC-ED on CPE Karolína Vlachová, Jiří Zima, Jiří Barek, and Hana Dejmková Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract This work deals with the determination of aminoglutethimide (AGT) using high performance liquid chromatography with UV spectrophotometric detection (HPLC-UV) and amperometric detection (HPLC-ED) on carbon paste electrode (CPE). AGT was used as anticancer drug, especially for the treatment of breast cancer in postmenopausal women or for the treatment of prostate cancer. The concentration dependences of AGT were measured by HPLC-UV with detection wavelength 242 nm, by HPLC-ED with a working potencial of +1.3 V in mobile phase consisting of 1.10-2 mol l-1 phosphate buffer (pH 4) and methanol 50:50 (v/v). The following limits of detection were achieved : 3.6.10-7 mol l-1 AGT for UV spectrophotometric detection, 2.5.10-7 mol l-1 AGT for amperometric detection. AGT was also determined in model samples of urine. It was not possible to detect AGT with HPLC-UV, because of the interferences of other compounds. With HPLC-ED the detection limit 5.2.10-7 mol l-1 AGT was achieved. Key words: Aminoglutethimide, carbon paste electrode, HPLC, spectrophotometric detection, amperometric detection. Introduction Aminoglutethimide (AGT) is the active compound of drugs Orimethen, Cytadren etc. used in treatment of breast cancer, prostate cancer or Cushing syndrome1. AGT inhibits aromatase enzyme, which catalyzes the transformation of androstenedione and testosterone to estrone and estradione. Reduction of estrogene concentration in human body causes the regression of the carcinoma 2. AGT is a member of the first generation group of aromatase inhibitors. Its unwanted influence on the cytochrome P450 family and adrenal hormones was confirmed 3; therefore, patients had to be substituted by corticosteroid drugs. Also contraindications like headache, nausea and rash appeared 4. AGT was replaced by modern and more efficient drugs, but still appears in literature in connection with doping, because AGT is on list of prohibited compounds for sportsmen 5. As AGT is a drug, plasma and urine are the most common matrices for the determination of AGT. Most often used methods are liquid chromatography on reverse phases (RP-LC) 6 and high performance liquid chromatography on reverse phases (RP-HPLC) with UV spectrophotometric detection 7. Gas chromatography 8 or spectrophotometry 9 was also used. At present time hyphenation of high performance liquid chromatography with mass spectrometry is more frequent 10. Carbon paste electrodes (CPE) have the wide range of usage – analysis of organic compounds, enviromental pollutants, pharmaceutical formulations and drugs. They can also be utilized in electroanalysis of inorganic ions and molecules, and in study and determination of biologically important compounds. CPE can be also used in study of reaction mechanisms or electrochemical behavior of organic compounds 11. Preparation of CPE is very simple and fast and electrode material is inexpensive. CPE can be easily biologically or chemically modified 12.

181

This work is focused on optimization methods for determination of AGT by HPLC with UV spectrophotometric and amperometric detection and following detection of AGT in model samples of urine. Experimental HPLC system consisted of a high-pressure pump HPP 5001, injector valve LCI 30 with 20 µl loop, spectrophotometric UV/VIS detector LCD 2040, amperometric detector ADLC 2 (all Laboratorní přístroje, Praha), column Lichrospher®RP-18, 100 (5 µm), 125 x 4 mm (LichroCART) and software Clarity Lite (Data Apex) working under Windows XP (Microsoft). Wall-jet amperometric detector worked in three-electrode system with CPE used as the working electrode, Ag/AgCl electrode (3M KCl) as the reference electrode and platinum wire as the auxiliary electrode. 20 µl of the sample containing AGT dissolved in a mixture of methanol : water 50:50 (v/v) was injected into the HPLC system. Mobile phase was prepared from phosphate buffer of required pH and methanol 50:50 (v/v). The flow rate of the mobile phase was 1 ml.min-1. The stock solution of AGT (c = 1.10-3 mol l-1) was prepared by dissolving the exact amount of AGT in methanol (for HPLC, Merck, Germany). Solutions of lower concentration were prepared from the stock solution of AGT by diluting the stock solution with the mixture methanol : water 50:50 (v/v). This ratio was the same as in the mobile phase composition. The stock solution of AGT was stored at the refrigerator (5˚C) in the dark. The stability of stock solution was controlled spectrophotometrically for at least four months. Solutions of phosphate buffers were prepared from 1.10-2 mol l-1 sodium dihydrogenphosphate. Its pH was adjusted to the desire value by concentrated phosphoric acid or sodium hydroxide 2.10-1 mol l-1, all p.a., Lachema Brno). The pH of the solutions was measured by pH Meter with combined glass electrode (Jenway, Essex, UK). The model samples of urine were prepared by mixing 1 ml of urine containing required concentration of AGT, 5 ml of methanol and filled up to 10 ml with phosphate buffer. The samples were filtered through syringe filters (0.45 μm, Sartorius, Minisart®, Slovakia) before the injection. Sodium dodecyl sulphate (c = 1.10-3 mol l-1) was added into the mobile phase to form micelles for masking proteins13. Carbon paste was prepared by mixing 250 mg of glassy carbon powder 0.4 - 12 µm (Alpha Aesar, USA) and 100 μl of mineral oil (Fluka Biochemika, Switzerland). Results and Discussion Firstly, the hydrodynamic voltammograms were measured in media of various pH to find optimum conditions for the electrochemical detection. The potential range from +0.6 to +1.5 V and pH of mobile phase 2.5, 4 and 6 were investigated. The mobile phase of pH 4 gave the highest signal; with maximum peak height reached at the potential of +1.3 V. Optimal wave length for UV detector 242 nm was acquired from UV-VIS spectrum of AGT. For confirmation of the response stability of AGT on CPE, repeated measurements were performed; the samples were injected consecutively every 60 seconds thirty times. Relative standard deviation was 1.9 % for spectrophotometric and 1.4 % for amperometric detection. Calibration dependences were measured for both electrochemical and spectrophotometric detection. The concentration range study with electrochemical detection was from 1.10-4 mol l-1 to 2.10-7 mol l-1 and for spectrophotometric detection from 1.10-4 mol l-1 to 4.10-7 mol l-1. The dependences were linear in the whole studied concentration range.

182

Achieved limits of detection were 2.5.10-7 mol l-1 for HPLC-ED and 3.6.10-7 mol l-1 for HPLC-UV. The calculated parameters of the dependences are summarized in Table I. To confirm the possibility to use the developed methods for the determination of AGT in biological materials, AGT was measured in model samples of urine. Calibration dependences were measured in the concentration range from 1∙10−5 mol l−1 to 6∙10−7 mol l−1; their calculated parameters are given in Table I below. HPLC-ED chromatogram of AGT in model samples of urine is shown in Fig. 1. The limit of detection 5.2.10-7 mol l-1 AGT in model samples of urine was achieved with electrochemical detection. It was not possible to use spectrophotometric detection, because the peaks of other compounds present in the sample interfered with AGT peak and eluted at almost the same retention time. Table I. Characteristics of calibration dependences for the determination of AGT using HPLC-UV detection at 242 nm, and HPLC-ED on CPE at +1.3 V, calculated from the peak areas. slope c intercept LQ . detection [mAU mol l-1]/ R [mol l-1] [mAU]/ [nA] [mol l-1] . -1 [mA mol l ] spectrophotometric

4.10-7 - 1.10-4

40.0

28.5

0.9996

3.6.10-7

amperometric

2.10-7 - 1.10-4

115.4

78.7

0.9995

2.5.10-7

amperometrica

6.10-7 - 1.10-5

58.65

34.51

0.9981

5.2.10-7

a – detection in model samples of urine

Fig. 1. HPLC-ED chromatograms of AGT in model samples of urine for concentration 0 (1), 1∙10−6 (2), 1∙10−5 (3) mol l−1. Column Lichrospher®RP-18, 100 (5 µm), 125 x 4 mm (LichroCART), EDET = +1.3 V, mobile phase 1.10-2 mol l-1 phosphate buffer pH 4 : MeOH = 50:50 (v/v). Conclusion HPLC is most common method for determination of AGT utilizing UV spectrophotometric detection. We compared spectrophotometric and amperometric detection on CPE; lower limits

183

of detection were achieved with amperometric detection. This type of detection was also very selective during the detection of AGT in model samples of urine. 5.2.10-7 mol l-1 limit of detection was achieved whereas interfering compounds excluded the spectrophotometric detection of AGT. Acknowledgment This work was financially supported by the Czech Ministry of Education, Youth and Sports (projects MSM 0021620857, RP14/63 and LC06035), KONTAKT (AMVIS) project ME10004 and grant SVV-2011-263204. References 1. Engelhardt, D, Weber, M.M.: J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 49, 261 (1994). 2. Mitwally, M.F., Casper, R.F.: Gynekologie po promoci, Medical Tribune, 2004. 3. Brueggemeier, R. W., Hackett, J. C., Diaz-Cruz, E. S.: Endocrinol. Rev. 26, 331 (2005). 4. Harris, A. L., Powles, T. J., Smith, I. E.: Cancer Res. 42, 3405 (1982). 5. http://www.wada-ama.org/, Downloaded 12th April 2010. 6. Schanche, J.S., Lønning, P.E., Ueland, P.M., Kvinnsland, S.: Ther. Drug Monit. 6, 221 (1984). 7. Kamblawi, M.O., Stevens, R.G., Nicholls, P.J.: J. Chromatogr. 309, 431 (1984). 8. Mareck, U., Sigmund, G., Opfermann, G., Geyer, H., Schänzer, W.: Rapid Commun. Mass Spectrom., 16, 2209 (2002). 9. Abdel-Khalek, M.M., Mahrous, M.S., Daabees, H.G., Beltagy, Y.A.: Anal. Lett. 26, 1109 (1993). 10. Kang, M.-J., Hwang, Y. H., Lee W., Kim, D.-H.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 21, 252 (2007). 11. Švancara, I.: Moţnosti inovací v elektroanalytické chemii. Česká společnost chemická. Praha 2006. 12. Vytřas, K., Švancara I., Metelka, R.: J. Serb. Chem. Soc. 74, 1021 (2009). 13. Elchisak M. A., Carlson J. H.: J. Chromatogr. 233, 79 (1982).

184

Polarographic and Voltammetric Determination of Genotoxic 9-Fluorenone and its Derivatives Vlastimil Vyskočil, Andrea Hájková, and Jiří Barek Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8, CZ-12843 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Polarographic and voltammetric behavior of genotoxic 9-fluorenone (FN) and its genotoxic derivatives, namely 2-nitro-9-fluorenone (2-NFN), 2,7-dinitro-9-fluorenone (2,7-DNFN), and 2-amino-9-fluorenone (2-AFN), has been investigated at a dropping mercury electrode (DME), a hanging mercury drop electrode (HMDE), and a mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). The optimum conditions have been investigated in methanolic-aqueous media buffered using Britton-Robinson buffer. Under optimum conditions, linear calibration curves were measured with nanomolar to micromolar limits of quantification reached. These newly developed polarographic and voltammetric methods have been successfully applied to model samples of drinking and river water spiked with determined substances. Keywords: Polarography, Voltammetry, Dropping mercury electrode, Hanging mercury drop electrode, Mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode, 9-Fluorenone, 2-Nitro9-fluorenone, 2,7-Dinitro-9-fluorenone, 2-Amino-9-fluorenone, Drinking and river water model samples. Introduction The emissions of gasoline and diesel engines contribute significantly to the environmental pollution. Certain part of exhaust particulates consists of nitro, amino, and/or oxo derivatives of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). 9-Fluorenone (FN) belongs to the group of oxygenated PAHs. Its presence in living environment is connected with oxidation of parent PAH fluorene 1,2 and with metabolic or photolytic degradation of fluorene 2-4 and/or another related PAHs (e.g., fluoranthene) 3,4. FN has been shown to be toxic in several bioassays 5,6 and has carcinogenic 7 and mutagenic potential 8. Nitro and amino derivatives of FN, namely 2-nitro-9-fluorenone (2-NFN), 2,7-dinitro-9-fluorenone (2,7-DNFN), and 2-amino-9fluorenone (2-AFN), express genotoxic and/or mutagenic activity as well: 2-NFN and 2,7-DNFN act as unique mutagens formed during the photooxidation of their amino analogues 9,10, 2-AFN was used as a chemical carcinogen in the study of biochemical damage in vivo 11. That is why the need for extremely sensitive and selective methods for the determination of these compounds is still growing 12. Nitro and oxo compounds belong to relatively easy reducible compounds, chemically as well as electrochemically 13,14. Therefore, nitro and/or oxo group containing chemical carcinogens are suitable candidates for the application of modern polarographic and voltammetric techniques15-17. Despite the enormous and ever-increasing importance of solid electrodes 18, mercury and mercury-based electrodes are still the best electrochemical sensors available for these purposes 14,19-21. This work aims at developing sensitive polarographic/voltammetric methods for the determination of FN, 2-NFN, 2,7-DNFN, and 2-AFN using direct current tast polarography (DCTP) and differential pulse polarography (DPP) at a dropping mercury electrode (DME), direct current voltammetry (DCV), differential pulse voltammetry (DPV) and adsorptive stripping DPV (AdSDPV) at a hanging mercury drop electrode (HMDE), and DCV and DPV at a mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode (m-AgSAE). Furthermore, practical applicability of the newly developed methods is verified on the direct

185

determinations of the studied compounds in drinking and river waters and, for 2,7-DNFN, on the DPV determination after solid phase extraction (SPE) from drinking and river water. Experimental The stock solutions of 9-fluorenone (c = 1×10–4 mol L–1; CAS Number: 486-25-9; 98%; Sigma-Aldrich, Prague, Czech Republic), 2-nitro-9-fluorenone (c = 1×10–4 mol L–1; CAS Number: 3096-52-4; 99%; Sigma-Aldrich), 2,7-dinitro-9-fluorenone (c = 1×10–4 mol L–1; CAS Number: 31551-45-8; 97%; Sigma-Aldrich), and 2-amino-9-fluorenone (c = 1×10–3 mol L–1; CAS Number: 3096-57-9; 98%; Sigma-Aldrich) were prepared by dissolving the appropriate pure substance in 100.0 mL of methanol (p.a. purity grade, 99.5%; Lach-Ner, Neratovice, Czech Republic). More dilute solutions were prepared by diluting the stock solutions with methanol. The Britton-Robinson (BR) buffers were prepared in a usual way, i.e., by mixing a solution of 0.04 mol L–1 phosphoric acid, 0.04 mol L–1 acetic acid and 0.04 mol L–1 boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol L–1 sodium hydroxide solution (all p.a. purity grade; Lachema, Brno, Czech Republic). Acetate buffer (AcB) of a concentration of 0.2 mol L−1 and pH 4.0 was prepared by dissolving the calculated amount of sodium acetate trihydrate (p.a. purity grade; Lachema) in the solution of 0.2 mol L–1 acetic acid. Deionized water was produced by Milli-Qplus system (Millipore, Billerica, USA). All the chemicals were used without further purification and all the solutions were maintained in glass vessels in dark at laboratory temperature. The polarographic and voltammetric measurements were performed using an Eco-Tribo Polarograph driven by PolarPro 5.1 software (both Polaro-Sensors, Prague, Czech Republic). The software worked under the operational system Microsoft Windows XP Professional (Microsoft Corporation, Redmond, USA). The polarographic/voltammetric measurements were carried out in a three-electrode system: A platinum auxiliary electrode PPE, a RAE 113 (1 mol L–1 KCl) Ag/AgCl reference electrode (both Monokrystaly, Turnov, Czech Republic) and DME, HMDE (type UMμE; Polaro-Sensors), or m-AgSAE (J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, Prague, Czech Republic) as working electrodes. The scan rates, 4 mV s–1 (for DCTP and DPP) and 20 mV s–1 (for DCV, DPV, and AdSDPV), were used. The pulse amplitude, –50 mV, and pulse width, 100 ms, were used in DPP, DPV, and AdSDPV, with current sampling for last 20 ms. The solution pH was measured by Conductivity & pH meter 4330 (Jenway, Chelmsford, UK) with a combined glass electrode (type 924 005). For SPE techniques, LiChrolut® columns RP-18 E (1000 mg; Merck, Darmstadt, Germany) were used. Before starting the work, as well as after electrode passivation or every a break in the voltammetric measurements longer than 1 hour, the electrochemical activation of m-AgSAE was carried out in 0.2 mol L–1 potassium chloride (p.a. purity grade; Lachema) at –2200 mV under stirring for 300 s followed by rinsing with deionized water. Unless stated otherwise, the general polarographic/voltammetric procedure was as follows: An appropriate amount of the stock solution of the tested substance in methanol was placed in a 10.0 mL volumetric flask, the system was diluted to volume with BR buffer of the required pH and transferred into the voltammetric cell. Oxygen was removed by bubbling with nitrogen (purity class 4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for 5 min and the polarogram/voltammogram at DME, HMDE, or m-AgSAE was recorded. Regeneration of m-AgSAE 22 lasting about 30 s preceded each measurement (except for the investigation of m-AgSAE passivation during measurements without regeneration).

186

The drinking water from the public water pipeline in the building of Faculty of Science of Charles University in Prague or the river waters from Labe river in Nymburk or Vltava river in Prague spiked with an appropriate amount of stock solution of tested substances were used for model samples. For 2,7-DNFN, the BR buffer was replaced by 0.001 mol L–1 sodium hydroxide for simplification (9.0 mL of spiked drinking/river water was filled up to 10.0 mL with 0.01 mol L–1 sodium hydroxide) and, for 2-AFN, the BR buffer was replaced with 0,2 mol L– 1 AcB pH 4.0 in the same way and for the same purpose. The procedure for DPV determination of 2,7-DNFN in model samples of drinking or river water after SPE is described in ref. 23. Results and Discussion The influence of pH on the DC and DP polarograms/voltammograms of studied substances was investigated at DME, HMDE and m-AgSAE in BR buffer – methanol (in volume ratios of 1:1 for FN, 2-NFN, and 2,7-DNFN and 9:1 for 2-AFN) medium in the BR buffer pH range 2.0 – 13.0. Detailed description of this behavior is given in refs. 22-24 for FN 24, 2-NFN 22, and 2,7-DNFN 22,23. For 2-AFN, one well-shaped irreversible cathodic wave/peak was observed in whole pH range and its peak potential shifted towards more negative potentials with increasing pH. The concentration dependences were measured under optimum conditions. Attained limits of quantification (LQ) were dependent on technique and working electrode used and varied from micromolar to nanomolar concentrations (see Table I). The lowest LQs were reached using AdSDPV at HMDE for 2-NFN, 2,7-DNFN, and 2-AFN. Although AdSDPV at HMDE was not successfully used for the determination of 2,7-DNFN in drinking water, the DPV at HMDE after SPE from drinking and river water was advantageously used for further increasing sensitivity. In the case of 2-AFN, AdSDPV at HMDE was successfully applied not only to the matrix of deionized water (extremely high sensitivity of AdSDPV at HMDE is demonstrated by Fig. 1), but even also to the matrix of drinking and river water. These up-to-date results will be presented in the contribution as well.

I, nA

-80 -60

7

-100

Ip, nA

-100

-50 0 0

6 50

100

5

-1

c, nmol L

4

-40

3

-20 0 -550

2 1

-600

-650

-700

E, mV vs. Ag/AgCl

Fig. 1. AdSDP voltammograms of 2-AFN at HMDE in the 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 medium; concentration of 2-AFN (nmol L–1): 0 (1), 10 (2), 20 (3), 40 (4), 60 (5), 80 (6), and 100 (7); accumulation potential, +100 mV; accumulation time, 120 s; polarization rate, 20 mV s–1. The corresponding calibration straight line is in the inset.

187

Table I. Polarographic and voltammetric determination of studied substances at the different types of mercury-based working electrodes. Substance FN

2-NFN

2,7-DNFN

2-AFN

Technique DCTP at DME DPP at DME DPV at HMDE DCV at m-AgSAE DPV at m-AgSAE DCTP at DME DPP at DME DPV at HMDE AdSDPV at HMDE DCV at m-AgSAE DPV at m-AgSAE DPV at m-AgSAE a DPV at m-AgSAE b DCTP at DME DPP at DME DPV at HMDE AdSDPV at HMDE DPV at HMDE a DPV at HMDE c DPV at HMDE d DCV at m-AgSAE DPV at m-AgSAE DPV at m-AgSAE a DPV at m-AgSAE b DCTP at DME DPP at DME DPP at DME a DPP at DME b DCV at HMDE DCV at HMDE a DCV at HMDE b DPV at HMDE DPV at HMDE a DPV at HMDE b AdSDPV at HMDE DPV at m-AgSAE

Medium BR buffer pH 10.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 7.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 3.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 8.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 10.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 8.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 9.0 – methanol (1:1) DW – BR buffer pH 9.0 (9:1) RW – BR buffer pH 9.0 (9:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (9:1) DW – 0.01 mol L–1 NaOH (9:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 11.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (1:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (1:1) DW – BR buffer pH 4.0 (9:1) RW – BR buffer pH 4.0 (9:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (9:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (9:1) DW – 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 (9:1) RW – 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 (9:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (9:1) DW – 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 (9:1) RW – 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 (9:1) BR buffer pH 4.0 – methanol (9:1) DW – 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 (9:1) RW – 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 (9:1) 0.2 mol L–1 AcB pH 4.0 BR buffer pH 4.0 – methanol (9:1)

LQ, mol L–1 3×10–6 5×10–7 2×10–8 9×10–7 5×10–7 1×10–6 2×10–7 2×10–8 4×10–9 5×10–7 4×10–7 4×10–7 5×10–7 1×10–6 1×10–7 2×10–8 4×10–9 2×10–8 2×10–9 4×10–9 5×10–7 2×10–7 3×10–7 4×10–7 5×10–7 1×10–7 1×10–7 1×10–7 2×10–7 1×10–7 2×10–7 1×10–7 8×10–8 2×10–7 4×10–9 2×10–7

Ref. 24 24 24 24 24 14 14 14 14 19,22 19,22 19,22 19,22 14,23 14,23 14,23 14,23 14,23 14,23 14,23 19,22 19,22 19,22 19,22 25 25 –– –– –– –– –– –– –– –– –– 19

a

– Direct determination in drinking water (DW), b – Direct determination in river water (RW), c – Determination after SPE from 500 mL of spiked DW, d – Determination after SPE from 500 mL of spiked RW Conclusions We have determined genotoxic 9-fluorenone, 2-nitro-9-fluorenone, 2,7-dinitro-9-fluorenone, and 2-amino-9-fluorenone using modern polarographic and voltammetric techniques at a dropping mercury electrode, a hanging mercury drop electrode, and a mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode. It follows from obtained results that it is possible to

188

determine nanomolar to micromolar concentrations of these compounds not only in an ideal matrix of deionized water, but also in a model matrix of drinking or river water. Thus presented sensitivity of determination of environmentally hazardous substances illustrates the usefulness of mercury and mercury-based electrodes in analytical chemistry nowadays and reassures us that mercury electrodes are still very useful electrochemical sensors. Acknowledgements Financial support of this work, provided by The Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (Projects MSM0021620857, LC 06035, and RP 14/63) and by the Technological Agency of Czech Republic (Project TA01020565), is gratefully acknowledged. References 1. Albinet A., Leoz-Garziandia E., Budzinski H., ViIlenave E.: Sci. Total Environ. 384, 280 (2007). 2. Chupungars K., Rerngsamran P., Thaniyavarn S.: Int. Biodeterior. Biodegrad. 63, 93 (2009). 3. van Herwijnen R., Wattiau P., Bastiaens L., Daal L., Jonker L., Springael D., Govers H. A. J., Parsons J. R.: Res. Microbiol. 154, 199 (2003). 4. Sabate J., Bayona J. M., Solanas A. M.: Chemosphere 44, 119 (2001). 5. Habe H., Chung J. S., Kato H., Ayabe Y., Kasuga K., Yoshida T., Nojiri H., Yamane H., Omori T.: J. Bacteriol. 186, 5938 (2004). 6. O'Keefe P. W., Ekabo O., Braun-Howland E., Swarr D., Stockholm B.: Bull. Environ. Contam. Toxicol. 75, 1060 (2005). 7. Danz M., Urban H., Schmidt A., Ziebarth D.: Experimentelle Pathologie 16, 109 (1978). 8. Vasilieva S., Tanirbergenov B., Abilev S., Migatchev G., Huttunen M. T.: Mutat. Res. 244, 321 (1990). 9. Bechtold W. E., Henderson T. R., Brooks A. L.: Mutat. Res. 173, 105 (1986). 10. Strniste G. F., Nickols J. W., Okinaka R. T., Whaley T. W.: Carcinogenesis 7, 499 (1986). 11. Carr B. I.: Cancer Res. 47, 5577 (1987). 12. Vyskočil V., Labuda J., Barek J.: Anal. Bioanal. Chem. 397, 233 (2010). 13. Deýlová D., Barek J., Vyskočil V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1443 (2009). 14. Vyskočil V., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 173 (2009). 15. Barek J., Pecková K., Vyskočil V.: Curr. Anal. Chem. 4, 242 (2008). 16. Daňhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Pecková K., Vyskočil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 17. Prchal V., Vyskočil V., Daňhel A., Barek J., Wang J.: Chem. Listy 105, 217 (2011). 18. Barek J., Pecková K., Vyskočil V.: Chem. Listy 103, 889 (2009). 19. Vyskočil V., Daňhel A., Fischer J., Novotný V., Deýlová D., Musilová-Karaová J., Maixnerová L., Pecková K., Barek J.: Chem. Listy 104, 1181 (2010). 20. Fischer J., Vaňourková L., Daňhel A., Vyskočil V., Číţek K., Barek J., Pecková K., Yosypchuk B., Navrátil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007). 21. Vyskočil V., Navrátil T., Daňhel A., Dědík J., Krejčová Z., Škvorová L., Tvrdíková J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 22. Vyskočil V., Navrátil T., Polášková P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 23. Vyskočil V., Barek J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1675 (2009). 24. Vyskočil V., Polášková P., Bologa P., Barek J., in: Sensing in Electroanalysis. (Vytřas K., Kalcher K., Švancara I., eds.), vol. 4, University of Pardubice, Pardubice 2009. 25. Hájková A.: BSc Thesis, Charles University in Prague, Prague 2010.

189

Voltammetric Determination of Anticancer Drug Flutamide at Screen-Printed Carbon Electrodes a Vlastimil Vyskočil , Tomáš Navrátil b, and Jiří Barek a a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Hlavova 2030/8, CZ-12843 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of the AS CR, v.v.i., Dolejškova 3, CZ-18223 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Flutamide, 4-nitro-3-trifluoromethyl-isobutylanilide, is the active component of a synthetic nonsteroidal antiandrogen drug, which is commonly used in the treatment of advanced prostate cancer. In this contribution, optimum conditions have been found for voltammetric determination of flutamide by DC voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) at screen-printed carbon electrodes (SPCEs). Under optimum conditions (BrittonRobinson buffer pH 7.0 – methanol (9:1)), linear calibration curves were measured with limits of quantification 6×10–7 mol L–1 and 8×10–7 mol L–1 for DCV and DPV at SPCEs, respectively. The newly developed methods were successfully applied to the determination of the drug in pharmaceutical formulation Apo-Flutamide (Eulexin® tablets). Keywords: Voltammetry, Screen-printed carbon electrodes, Flutamide, Antiandrogen drug. Introduction Flutamide (4-nitro-3-trifluoromethyl-isobutylanilide, see Fig. 1) is a synthetic antiandrogen which is used for the treatment of prostate cancer 1. Flutamide has been determined by HPLC with detection limit of 11.27 mg mL–1 (ref. 2). Impurities contained in flutamide have been determined by planar chromatography 3 and flutamide in pharmaceutical formulations was determined by gas chromatography 4. HPLC/MS/MS tandem technique was used for detailed investigation of flutamide metabolism 5. Many other analytical methods were described in the literature for the determination of flutamide in bulk form, pharmaceutical formulations, and human plasma, mainly spectrophotometry 6-8 and HPLC 2,9,10. However, these methods are time consuming and expensive and, therefore, they are not too suitable for fast screening purposes. They require several sample preparation steps, including extraction and clean-up procedures, in order to obtain a final extract fully compatible with chromatographic and/or spectrophotometric determination, and they generate a large amount of waste containing organic solvents, which makes the procedure more complicated and expensive. Therefore, attention was paid to fast and inexpensive polarographic 11, voltammetric 12-15 and amperometric 16 methods. The polarographic reduction of flutamide was investigated by direct current polarography, alternating current polarography, normal pulse polarography, and differential pulse polarography at a dropping mercury electrode (DME). The supporting solution was phosphate buffer in limited pH range 6 – 8 containing 5% to 95% ethanol. The reduction process at the DME was diffusion-controlled and irreversible. Extraction with 95% ethanol followed by polarographic reduction was selected as the basis of a method for the determination of flutamide as a pure compound and in tablets 17. More detailed study 1 resulted in the determination of flutamide in tablets using differential pulse polarography at DME down to 2×10–6 mol L–1. Three adsorptive cathodic stripping voltammetric procedures were optimized for determination of flutamide in bulk, tablets, and human serum applying linear-sweep, differential-pulse, and square-wave waveforms. The achieved limits of detection of the bulk drug were 1.9×10–7, 8.7×10–8, and 9.7×10–9 mol L–1 using the optimized differential-pulse, linear-sweep, and square-wave adsorptive stripping

190

voltammetric procedures, respectively 18. Differential pulse voltammetry at a non-toxic mercury meniscus modified silver solid amalgam electrode was used for the determination of flutamide in micromolar concentration range and it was proved to be applicable for the determination of the active substance in APO-Flutamid tablets 19. However, so far no attempt has been made to use modern voltammetric methods, namely direct current voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV), at disposable screen-printed carbon electrodes (SPCEs) for the determination of flutamide and its content in pharmaceutical formulation Apo-Flutamide (Eulexin® tablets). Therefore, the aim of this work was to find optimum conditions for such determinations. O CH3

HN

CH3

CF 3 NO 2

Fig. 1. Structural formula of flutamide. Experimental The stock solution of flutamide (c = 1×10–3 mol L–1; CAS Number: 13311-84-7; SigmaAldrich, Prague, Czech Republic) was prepared by dissolving the appropriate pure substance in 100.0 mL of methanol (p.a. purity grade, 99.5%; Lach-Ner, Neratovice, Czech Republic). More dilute solutions were prepared by diluting the stock solution with methanol. The analyzed pharmaceutical preparation was Apo-Flutamide with the declared flutamide content 250 ± 13 mg (Chanelle Medical, Loughrea, Ireland). The Britton-Robinson (BR) buffers were prepared in a usual way, i.e., by mixing a solution of 0.04 mol L–1 in phosphoric acid, 0.04 mol L–1 in acetic acid and 0.04 mol L–1 in boric acid with the appropriate amount of 0.2 mol L–1 sodium hydroxide solution (all p.a. purity grade; Lachema, Brno, Czech Republic). Deionized water was produced by Milli-Qplus system (Millipore, Billerica, USA). All the chemicals were used without further purification and all the solutions were maintained in glass vessels in dark at laboratory temperature. The voltammetric measurements were performed using µAutolab-III driven by GPES 4.9 software (both Metrohm Autolab, Utrecht, The Netherlands). The software worked under the operational system Microsoft Windows XP Professional (Microsoft Corporation, Redmond, USA). The voltammetric measurements were carried out in a three-electrode system integrated at SPCE type DRP-110 (DropSens, Oviedo, Spain). The scan rate, 20 mV s–1, was used for both DCV and DPV; the pulse amplitude, –50 mV, and pulse width, 100 ms, were used in DPV, with current sampling for last 20 ms. The solution pH was measured by Conductivity & pH meter 4330 (Jenway, Chelmsford, UK) with a combined glass electrode (type 924 005). Unless stated otherwise, the general voltammetric procedure was as follows: An appropriate amount of the stock solution (or diluted stock solution) of flutamide in methanol was placed in a 10.0 mL volumetric flask, the system was diluted to volume with BR buffer of the

191

required pH and transferred into the voltammetric cell. Oxygen was removed by bubbling with nitrogen (purity class 4.0; Linde, Prague, Czech Republic) for 5 min and the voltammogram at SPCE was recorded. The quantitation of flutamide in tablets Apo-Flutamide 250 mg by DCV and DPV at SPCEs was performed as follows: The tablet was finely grinded and dissolved in 250 mL of methanol; 4.0 mL of thus prepared solution were diluted with methanol to 100 mL; 1.0 mL of resulting solution was diluted with BR buffer pH 7.0 to 10.0 mL and transferred into voltammetric cell. DCV and DPV using linear regression calibration method were used for the determination. All the curves were measured 3 times and all the measurements were carried out at laboratory temperature. The DCV and DPV peak height (Ip) was evaluated from the straight line connecting the minima before and after the peak. The calibration curves parameters (slope, intercept, and correlation coefficient (r)) were calculated using the OriginPro 8.0 software (OriginLab Corporation, Northampton, USA) 20. The limit of quantification (LQ) was calculated as the analyte concentration corresponding to tenfold the standard deviation of the ten parallel measurements of the lowest measurable concentration 20. Results and Discussion The influence of pH on DC and DP voltammetric behavior of flutamide was investigated in the mixture of the BR buffer of appropriate pH (2.0 – 12.0) and methanol (9:1). Flutamide yielded one DC/DP voltammetric peak over the whole pH region, similar to its behavior at mercury electrodes 1,17. This voltammetric peak corresponds probably to irreversible fourelectron reduction of the nitro group to the hydroxyamino group 21-23. The peak potential (Ep) values of thus observed peaks shifted toward more negative potentials with increasing pH. This shift can be explained by preliminary protonation of the test substances leading to a decrease in the electron density at the nitrogen atom and resulting in easier electron acceptance at low pH values 24,25. Optimum conditions for voltammetric determination were found to be BR buffer pH 7.0 – methanol (9:1) (for both DCV and DPV). Under these optimum conditions, the DCV and DPV calibration curves were measured over concentration ranges from zero to 1×10–4 mol L–1. DC voltammograms of flutamide measured at SPCE in the concentration range from 2×10–5 to 1×10–4 mol L–1 are depicted in Fig. 2 for the sake of an illustration. The parameters the calibration curves obtained are summarized in Table I. The developed electroanalytical methodologies were modified for quantitation of flutamide in its pharmaceutical preparation. A linear regression calibration method was used for these purposes. The mean values for the percentage content referred to the value declared by manufacturer were 116 22% and 81.2 7.6% obtained using DCV and DPV at SPCEs, respectively. The precision of the DPV method is higher than that of DCV. Nevertheless, the accuracy of the determination is better in the case of DCV at SPCE. It can be concluded that the developed DCV method offers a suitable alternative to the method prescribed in the Czech Pharmacopoeia (UV spectrophotometry at λ = 295 nm) 26.

192

Ip, A

-50

I, A

-40 -30

40 30 20 10 0 0

6 5 50

4

100 -1

c, mol L

3

-20 2

-10 1

0 -500

-600

-700

-800

-900

E, mV vs. Ag/AgCl pseudo-reference SPE

Fig. 2. DC voltammograms of flutamide at SPCE in the BR buffer pH 7.0 – methanol (9:1) medium; concentration of flutamide (µmol L–1): 0 (1), 20 (2), 40 (3), 60 (4), 80 (5), and 100 (6); polarization rate, 20 mV s–1. The corresponding calibration straight line is in the inset.

Table I. Parameters of the calibration straight lines for the voltammetric determination of flutamide at SPCEs in BR buffer pH 7.0 – methanol (9:1). Technique c, µmol L–1 DCV 20 – 100 2 – 10 0.2 – 1 DPV 20 – 100 2 – 10

Slope, mA mol–1 L –366.0 ± 7.8 –344 ± 29 –690 ± 270 –443 ± 25 –1280 ± 110

Intercept, µA –2.60 ± 0.52 –0.21 ± 0.19 –0.16 ± 0.18 –10.1 ± 1.7 +2.10 ± 0.76

r –0.999 –0.986 –0.759 –0.994 –0.984

LQ, µmol L–1 –– –– 0.6 –– 0.8

Conclusions In this contribution, screen-printed carbon electrodes (SPCEs) have been tested as electroanalytical sensors for voltammetric determination of flutamide. Optimum conditions for the determination – using direct current voltammetry (DCV) and differential pulse voltammetry (DPV) – were found to be Britton-Robinson buffer pH 7.0 for both DCV and DPV. Under these conditions, limits of quantification were found to be 6×10–7 and 8×10–7 mol L–1 for DCV and DPV, respectively. The newly developed methods were successfully applied to the determination of the drug in pharmaceutical formulation Apo-Flutamide 250 mg (Eulexin® tablets). According to the procedure based on the linear regression calibration method, the recoveries of known amount of flutamide contained in pharmaceutical preparation were 116 22% (for DCV at SPCEs) and 81.2 7.6% (for DPV at SPCEs). There was no significant difference between the value gained by proposed voltammetric methods and the determination recommended by the Czech Pharmacopoeia regarding the mean values and standard deviations. Acknowledgements Financial support of this work, provided by the Ministry of Education, Youth and Sports of the Czech Republic (projects MSM0021620857, LC 06035, and RP 14/63), by the Grant

193

Agency of the Academy of Sciences of the Czech Republic (project No. IAA400400806), and by the Grant Agency of the Czech Republic (project No. P206/11/1638) is gratefully acknowledged. References 1. Alvarez-Lueje A., Pena C., Nunez-Vergara L. J., Squella J. A.: Electroanalysis 10, 1043 (1998). 2. Farthing D., Sica D., Fakhry I., Walters D. L., Cefali E. A., Allan G.: Biomed. Chromatogr. 8, 251 (1994). 3. Ferenczi-Fodor K., Vegh Z.: J. Planar Chromatogr.-Mod. TLC 6, 256 (1993). 4. Sane R. T., Gangrade M. G., Bapat V. V., Surve S. R., Chonkar N. L.: Indian Drugs 30, 147 (1993). 5. Tevell A., Lennernas H., Jonsson M., Norlin M., Lennernas B., Bondesson U., Hedeland M.: Drug Metab. Dispos. 34, 984 (2006). 6. Nagaraja P., Sunitha K. R., Silwadi M. F.: J. Pharm. Biomed. Anal. 23, 617 (2000). 7. Reddy M. N., Murthy T. K., Rajita K., Reddy M. D., Shankar D. G.: Asian J. Chem. 13, 241 (2001). 8. Rangappa K. S., Nagaraja P., Murthy K. C. S.: Anal. Sci. 16, 637 (2000). 9. Niopas I., Daftsios A. C.: J. Chromatogr. B 759, 179 (2001). 10. Leibinger J., Kapas M.: J. Pharm. Biomed. Anal. 14, 1377 (1996). 11. Vyskočil V., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 173 (2009). 12. Barek J., Pecková K., Vyskočil V.: Chem. Listy 103, 889 (2009). 13. Barek J., Pecková K., Vyskočil V.: Curr. Anal. Chem. 4, 242 (2008). 14. Vyskočil V., Navrátil T., Daňhel A., Dědík J., Krejčová Z., Škvorová L., Tvrdíková J., Barek J.: Electroanalysis 23, 129 (2011). 15. Fischer J., Vaňourková L., Daňhel A., Vyskočil V., Číţek K., Barek J., Pecková K., Yosypchuk B., Navrátil T.: Int. J. Electrochem. Sci. 2, 226 (2007). 16. Daňhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Pecková K., Vyskočil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 17. Snycerski A.: J. Pharm. Biomed. Anal. 7, 1513 (1989). 18. Hammam E., El-Desoky H. S., El-Baradie K. Y., Beltagi A. M.: Can. J. Chem.-Rev. Can. Chim. 82, 1386 (2004). 19. Vyskočil V., Daňhel A., Fischer J., Novotný V., Deýlová D., Musilová-Karaová J., Maixnerová L., Pecková K., Barek J.: Chem. Listy 104, 1181 (2010). 20. Miller J. N., Miller J. C.: Statistics and Chemometrics for Analytical Chemistry. Pearson Education, 5th edition, Harlow 2005. 21. Vyskočil V., Labuda J., Barek J.: Anal. Bioanal. Chem. 397, 233 (2010). 22. Vyskočil V., Barek J.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1675 (2009). 23. Deýlová D., Barek J., Vyskočil V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 74, 1443 (2009). 24. Prchal V., Vyskočil V., Daňhel A., Barek J., Wang J.: Chem. Listy 105, 217 (2011). 25. Vyskočil V., Navrátil T., Polášková P., Barek J.: Electroanalysis 22, 2034 (2010). 26. Czech Pharmacopoeia 2005. Supplement 2006. Grada Publishing, Prague 2006.

194

Monolayers at Electrodes as Basis for Models of Natural Membranes (Monovrstvy na elektrodách jako základ pro modely přírodních membrán) Bogdan Yosypchuk, and Vladimír Mareček J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of AS CR, v.v.i. Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic, E-mail: [email protected] Abstract Properties of thiol (HS(CH2)10COOH) monolayers were investigated at stationary electrodes based on silver, copper, bismuth and cadmium solid amalgams covered by a mercury meniscus or by a mercury film. For comparison, parallel experiments were performed at a classical hanging mercury drop electrode. Dependences of monolayer parameters on time of electrochemical deposition of thiol and on scan rate were performed. Statistical evaluation of all obtained results has confirmed that solid amalgam electrodes are a convenient tool for research of thiol layers. Key Words: Monolayer, Reductive desorption, Voltammetry, Amalgam electrodes. Úvod Mono– a dvojvrstvy na kovových elektrodách se často pouţívají pro přípravu modelových přírodních membrán 1-3 a biosenzorů 4, 5. Podmínkou pro přípravu dvojvrstvy je vytvoření první vrstvy na ideálně rovném povrchu. Z tohoto důvodu jsme jako podloţku pro tyto vrstvy pouţili pevné amalgámy tvořené různými kovy 6 (Ag, Cu, Bi, Cd aj.). Pevné amalgámy se dobře smáčí rtutí, dlouhodobě udrţují na svém povrchu rtuťový meniskus nebo film a spojují tak výhody kapalných a pevných elektrod 7-10. Různé thiolátky tvoří na těchto elektrodách monovrstvy se stejnou povrchovou koncentrací jako na čisté rtuti. Vzhledem k tomu, ţe vlastnosti monovrstvy jsou ovlivněny vazbou kov–síra, vede pouţití amalgámů různého sloţení k vytvoření monovrstev s odlišnými vlastnostmi. Cílem této práce je elektrochemické studium thiolových vrstev na různých amalgamových elektrodách. Experimentální část Voltametrická měření byla prováděna s vyuţitím počítačového Eco-Tribo Polarografu PC-ETP (Polaro-Sensors, Praha) v reţimu cyklické voltametrie (CV). Pro řízení analyzátoru a hodnocení výsledků měření byl pouţit software MultiElchem v. 2.1 (Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR, v.v.i.). Pracovními elektrodami (WE) byly rtuťovým meniskem a rtuťovým filmem pokryté pevné amalgámové elektrody: m-AgSAE (plocha A = 0,00604 cm2), MF-AgSAE (A = 0,00358 cm2), m-CuSAE (A = 0,00466 cm2), m-BiAgSAE (A = 0,00842 cm2) a m-CdSAE (A = 0,00725 cm2). Pro srovnání výsledků měření byla pouţita HMDE (A = 0,00618 cm2). Jako referentní slouţila nasycená kalomelová elektroda na základě stříbrného pevného amalgámu 11 (její potenciál je stejný, jako u klasické kalomelové elektrody), vůči níţ jsou uváděny všechny hodnoty potenciálů. Pomocnou elektrodu tvořil Pt drátek o průměru 1,0 mm a délce 15 mm. Vzdušný kyslík byl z roztoků odstraňován probubláváním dusíkem. Měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Pro přípravu roztoků byla pouţita voda redestilovaná v křemenné aparatuře. Všechny pouţité chemikálie byly čistoty p. a. Výsledky a diskuse Některé vlastnosti thiolových monovrstev na amalgámových elektrodách (potenciál depozici thiolu, adsorpční izotermy, blokování povrchu elektrody thiolem, rozsah potenciálů stability thiolové monovrstvy) byly jiţ popsaný dříve 6. Zde budou uvedeny nově získané výsledky. Doba depozice thiolu Povrchovou koncentraci adsorbované látky vytvořené postupem SAM (self-assembled monolayer) ovlivňuje nejvíce koncentrace této látky v roztoku a doba kontaktu elektrody s roztokem adsorbátu. Při elektrochemické depozici monovrstvy je účinnost adsorpce 195

(chemosorpce) kromě toho ještě závislá na potenciálu elektrody. Během působení tohoto potenciálu se kov(y) elektrodového materiálu oxiduje a tvoří kovalentní vazbu se sírou. V 1 mM roztoku thiolátky a za optimálního potenciálu akumulace se monovrstva na všech studovaných elektrodách vytváří velmi rychle. Po 1–2 min akumulace se plocha (náboj) redukčního desorpčního píku prakticky nemění, coţ potvrzuje jiţ dříve zjištěnou vysokou afinitu rtuti a jiných kovů vůči thiolům. Byla studována závislost míry pokrytí elektrody na době akumulace kyseliny 11-mercaptoundecanové z její roztoků různé koncentrací (základní elektrolyt: 0,5 mol dm–3 NaOH, 48 % ethanol). Nepotvrdila se původní myšlenka, ţe by se dalo docílit stejné povrchové koncentrace zmíněného thiolu na povrchu elektrody prodlouţením doby elektrolytické akumulace ze zředěnějších roztoků (jak je to obvykle v rozpouštěcích analýzách). Kdyţ se depozice monovrstvy na m-AgSAE prováděla 1 min z 1 10–3 mol dm–3 roztoku thiolu, měla vypočítána povrchová koncentrace (Г) hodnotu 9,5 10–10 mol cm-2. Na stejné elektrodě, za 1 min akumulace, ale z 1 10–4 mol dm–3 roztoku thiolu byla dosaţená povrchová koncentrace 5,9 10–10 mol cm–2. Prodlouţení doby akumulace dokonce zmenšilo tuto hodnotu (tac = 5 min, Г = 5,6 10–10 mol cm–2; tac = 60 min, Г = 5,2 10–10 mol cm–2). Ještě menší hodnoty Г byly pozorovány při pouţití 1 10–5 mol dm–3 roztoku kyseliny 11-mercaptoundecanové (tac = 1 min, Г = 3.7 10–10 mol cm–2; tac = 5 min, Г = 4.5 10–10 mol cm–2). Podobné zmenšení povrchové koncentrace z více zředěných roztoků se pozoruje i na HMDE. Příčinou těchto výsledků je nejspíše vzájemné odpuzování záporně nabitých karboxylových skupin v silně alkalickém základním elektrolytu. Po zahájení depozici se na elektrodě velmi rychlé vytvoří film s hustotou úměrnou koncentraci thiolu v roztoku. Povrchová koncentrace se s postupem doby jiţ téměř nemění, protoţe vzniklý záporně nabitý film brání v průchodu k povrchu elektrody záporně nabitých molekul thiolu z roztoku. Rychlost scanu Rychlost scanu ovlivňuje výšku a šířku píku a také jeho polohu na potenciálové ose. V závislosti na typu elektrodového děje mají změny rychlosti scanu různý vliv na výšku píku. Pro elektrodový děj řízený difuzí je proud píku úměrný v1/2, ale stejný vztah muţe platit i pro některé typy adsorpčně/desorpčních procesů. Jestliţe redukce probíhá z adsorbovaného stavu a adsorbované molekuly neinteragují mezí sebou, je závislost ip - v lineární. V našich experimentech se pozorovala nelineární závislost proudu píku redukční desorpce zkoumané látky na rychlosti scanu (není znázorněno), coţ ukazuje, ţe mezí adsorbovanými molekulami existují laterální interakce. V tomto případě zmíněná závislost můţe být úměrná vx, kde x je číslo mezí 0,5 a 1,0 (cit. 12) a pouţívá se x = 0,6 nebo blízké k němu x = 2/3. V našem případě byly nejvyšší hodnoty korelačních koeficientů získány pro x = 0,6 (RHMDE = 0,991; Rm-AgSAE = 0,998; RMF-AgSAE = 0,991; Rm-CuSAE = 0,994). Měření desorpčních voltamogramů pří všech zkoumaných rychlostech se vţdy provádělo se stejným mnoţstvím adsorbátu na povrchu pracovní elektrody. Z tohoto vyplývá, ţe celkový náboj odpovídající desorpci látky z elektrody by neměl záviset na rychlosti scanu. Výsledky experimentů potvrzují tuto úvahu a nepřímo potvrzují, ţe reprodukovatelnost opakovaného vytvoření a odstranění monovrstvy thiolu na všech elektrodách je dobrá. Potenciál a šířka píku redukční desorpci thiolu Pří zvyšování rychlosti scanu se potenciál desorpčního píku posouvá směrem do negativnějších hodnot. Potenciál píku roste lineárně s přirozeným logaritmem rychlosti scanu (korelační koeficienty: RHMDE = 0,999; Rm-AgSAE = 0,997; RMF-AgSAE = 0,999; Rm-CuSAE = 0,998). Tím se potvrzuje, ţe na všech zkoumaných elektrodách proces je redukční desorpce elektrochemicky irreverzibilní děj. Chování rtuťové elektrody a elektrod na základě různých

196

amalgámů je prakticky stejné. Podobný průběh lze pozorovat i pro závislost potenciálu redukčního píku vs. koncentrace thiolu v roztoku. Postupný posun potenciálu píku do negativnějších hodnot můţe být vysvětlen tím, ţe zvýšení koncentrace thiolu v roztoku zvětšuje míru pokrytí elektrody adsorbátem, a tím zesílení laterálních interakcí mezí adsorbovanými molekulami. Kromě toho, vyšší koncentrace thiolu v roztoku vyţaduje více energie pro desorpci této látky z povrchu elektrody. Do obsazení přibliţně poloviny plochy elektrody se potenciál desorpčního píku na amalgámových elektrodách téměř nemění a na HMDE se dokonce mírně posouvá do pozitivnějších hodnot. Při nízkém obsazení povrchu elektrody (Θ) je vzdálenost mezi molekulami thiolu velká, molekuly vzájemně interagují slabě a prakticky neovlivňují polohu píku. Při vyšších hodnotách Θ molekuly adsorbátu se přitahují, začínají vytvářet kompaktní monovrstvu a potenciál píku se na všech elektrodách posouvá do negativnějších hodnot. Podobný průběh studované závislosti byl popsán na elektrodách ze rtuti a z Au(111). Šířka píku redukční desorpce thiolu je důleţitý informativní parametr. Obvykle platí, ţe čím je hustší a uspořádanější film na elektrodě, tím je uţší pík. Nejčastěji se tento parametr uvádí jako šířka píku v polovině jeho výšky (W1/2). Jen při nejniţších koncentracích látky v roztoku (2 10–6 aţ 1 10–5 mol l–1) je desorpční pík na různých elektrodách relativně široký (desítky aţ stovky mV). Potom, se zvýšením koncentrace, hodnota W1/2 rychle klesá na 9–12 mV a zůstává stejnou na všech elektrodách. Průběh této závislosti je na různých studovaných elektrodách velice podobný, i kdyţ při nízkých koncentracích nejširší píky jsou na HMDE a nejuţší na m-CuSAE. Parametr W1/2 by měl být více závislý na koncentraci thiolu na povrchu elektrody, neţ v roztoku i kdyţ tyto koncentrace jsou vzájemně provázané. Do přibliţně 50 % obsazení povrchu elektrody thiolem je desorpční pík na všech elektrodách široký, coţ ukazuje na značné rozdíly v energii desorpce různých molekul a na slabou interakci mezi vzdálenými molekulami. Na měděné amalgámové elektrodě, při nízkých hodnotách Θ, jsou desorpční píky mnohém ostřejší. Tato odlišnost m-CuSAE můţe být vysvětlena tím, ţe elektrochemická depozice thiolu probíhá při podstatně vyšším negativním potenciálu (Eac = −750 mV), neţ je to na AgSAEs a HMDE (Eac = −350 mV). Odpuzování negativně nabité skupiny −COO– je na m-CuSAE větší, následkem čehoţ se molekuly thiolu nachází vůči povrchu elektrody ve vertikální poloze, jsou uspořádanější a mají menší rozdíl v energii desorpce (na HMDE nebo na Ag(111) molekuly thiolu mohou částečně zaujmout i horizontální polohu). Při pokryti WEs kolem 65 % uţ mají píky obvyklý špičatý tvar a hodnoty W1/2 jsou pro zkoumané elektrody v rozsahu 16–23 mV. Od Θ ≈ 80 % aţ do úplného pokrytí povrchu WEs se šířka píků praktický nemění a W1/2 ≈ 9–12 mV. Při pokryti povrchu adsorbátem o 70 % a více je šířka píku pro všechny čtyři elektrody přibliţně stejná a synchronně se sniţuje se zvýšením Θ. Podobný průběh závislosti W1/2 vs. Θ na studovaných elektrodách je v souladu s tím, ţe hodnoty ΔGads jsou na těchto elektrodách téměř stejné. Skutečnost, ţe při maximálním pokrytí všech zkoumaných elektrod hodnoty W1/2 (a taky ΔGads) jsou velmi blízké, ukazuje na podobnost adsorpčně-desorpčních procesů. Při sníţení rychlosti scanu se šířka píků na všech elektrodách mírně zmenšovala. Při v = 1000 mV s–1 byly hodnoty W1/2 na úrovni 9–12 mV a při v = 20 mV s–1 se hodnoty W1/2 zmenšily na 6 mV a to na všech elektrodách. Reprodukovatelnost měření Amalgámové elektrody leštěné nebo pokryté rtutí se dobře regenerují elektrochemickou cestou, tj. aplikací vhodného potenciálu nebo střídavě měnicích se potenciálů. Při zmenšení účinnosti elektrochemické regenerace se povrch elektrody můţe jednoduše obnovit vytvořením nového menisku nebo filmu. Amalgámové elektrody zmíněné v této práci pouţíváme několik let, uschováváme je ve vodě a nezaznamenali jsme změny jejich chování.

197

Tabulka I. Statistické parametry opakovaných měření redukční desorpce thiolu z různých pracovních elektrod. Cyklická voltametrie; základní elektrolyt 0,5 mol dm–3 NaOH, 48% C2H5OH; 1 10–3M HS(CH2)10COOH; tac = 60 s; v = 1000 mV s–1; N = 11. ∆Ep – rozdíl mezí anodickým a katodickým potenciálem píku; W1/2 – šířka píku v polovině výšky; SD – standardní odchylka; RSD – relativní standardní odchylka; A – plocha elektrody; Å2 – plocha odpovídající 1 molekule thiolu. Proudová Hustota Povrchová Statistický hustota náboje koncentrace parametr Ep W1/2 Q Å2 ∆Ep Г, 10–10 mV µA cm–2 mV µC cm–2 mV mol cm-2 HMDE; A = 0,00618 cm2 −5336 Průměrná hodnota −864 12,0 90 Interval spolehlivosti 0,7 -136 SD 1,0 -2,6 RSD, % 0,12 -m-AgSAE; A = 0,00604 cm2 −6629 Průměrná hodnota −863 10,1 261 Interval spolehlivosti 1,3 1,0 394 SD 2,0 1,5 5,9 RSD, % 0,23 15,0 MF-AgSAE; A = 0,00358 cm2 −7524 Průměrná hodnota −859 90 196 Interval spolehlivosti 1,3 -296 SD 2,0 -3,9 RSD, % 0,24 -2 p-AgSAE; A = 0,00358 cm −4066 Průměrná hodnota −835 19,6 39 Interval spolehlivosti 0,3 1,0 59 SD 0,4 1,6 1,5 RSD, % 0,05 8,0 m-BiAgSAE; A = 0,00842 cm2 −6005 Průměrná hodnota −1079 9,5 118 Interval spolehlivosti 1,0 0,8 178 SD 1,5 1,2 3,0 RSD, % 0,14 12,7 m-CuSAE; A = 0,00466 cm2 −5535 Průměrná hodnota −1136 11,2 136 Interval spolehlivosti 1,0 0,9 206 SD 1,6 1,4 3,7 RSD, % 0,14 12,5 m-CdSAE; A = 0,00725 cm2 −4001 Průměrná hodnota −1248 7,4 299 Interval spolehlivosti 0,40 1,0 451 SD 0,60 1,6 11,3 RSD, % 0,05 7,3 198

83,6 1,1 1,7 2,1

8,7 0,12 0,18 2,1

19,2 0,27 0,40 2,1

146,7 1,6 2,4 1,6

93,1 1,4 2,2 2,3

9,7 0,15 0,22 2,3

17,2 0,26 0,39 2,3

132,0 1,7 2,6 2,0

96,6 1,1 1,6 1,7

10.0 0,11 0,17 1,7

16.6 0,18 0,28 1,7

129,2 1,3 2,0 1,5

83,4 0,8 1,1 1,4

8,6 0,08 0,1 1,4

19,2 0,18 0,27 1,4

119,9 0,9 1,3 1,1

79,0 0,3 0,4 0,48

8,2 0,03 0,04 0,48

20,3 0,07 0,01 0,48

119,0 0,7 1,0 0,86

85,9 0,9 1,3 1,6

8,9 0,09 0,14 1,6

18,9 0,19 0,29 1,5

131 1,4 2,1 1,6

41,4 2,0 3,0 7,3

4,3 0,21 0,31 7,3

38,9 1,88 2,83 7,28

113,1 1,2 1,8 1,6

Odlišná situace je pozorována u elektrod z naprášených kovů. Například, thiolové monovrstvy na Ag a Cu lze získat jen na čerstvě naprášeném kovovém filmu a všechny manipulace s elektrodami se musí provádět v atmosféře inertního plynu. Statistické výsledky mnohonásobného opakování vytvoření monovrstvy thiolu a její následné desorpci (viz Tabulka I) potvrzují, ţe stacionární amalgámové elektrody jsou vhodným instrumentem pro zkoumání elektrochemických vlastností thiolových filmů. Jednoduché elektrochemické obnovení vlastností stacionárních amalgámových elektrod a monovrstvy thiolu je jedním ze základních poţadavků pro přípravu spolehlivých biosenzorů a modelových biosystémů jako, např. fosfolipidových membrán. Závěr V 1 mol dm–3 roztoku thiolátky a za optimálního potenciálu akumulace se monovrstva vytváří na všech zkoumaných elektrodách velmi rychle. Po 1 2 min akumulace se plocha (náboj) redukčního desorpčního píku prakticky nemění. Nelineární závislost proudu píku redukční desorpce zkoumané látky na rychlosti scanu ukazuje, ţe mezí adsorbovanými molekulami existují laterální interakce. Pří zvyšování rychlosti scanu se potenciál desorpčního píku posouvá směrem do negativnějších hodnot. Potenciál píku roste lineárně s přirozeným logaritmem rychlosti scanu, čímţ se potvrzuje, ţe na všech zkoumaných elektrodách je proces redukční desorpce elektrochemicky irreverzibilní děj. Do obsazení přibliţně poloviny plochy elektrody se potenciál desorpčního píku na amalgámových elektrodách téměř nemění. Při vyšších hodnotách Θ se potenciál píku na všech elektrodách posouvá do negativnějších hodnot. Závislost šířky píku v polovině výšky W1/2 na míře pokrytí elektrody adsorbátem Θ se projevuje tak, ţe do přibliţně 50 % obsazení povrchu elektrody thiolem je desorpční pík na všech elektrodách široký. Při pokrytí WEs kolem 65 % uţ mají píky obvyklý špičatý tvar a hodnoty W1/2 jsou pro zkoumané elektrody v rozmezí 16–23 mV. Od Θ ≈ 80 % aţ do úplného pokrytí povrchu WEs se šířka píků praktický nemění a W1/2 ≈ 9–12 mV. Statistické výsledky mnohonásobného vytvoření monovrstvy thiolu a její následné desorpce potvrzují, ţe stacionární amalgámové elektrody jsou vhodným instrumentem pro zkoumání elektrochemických vlastností thiolových filmů. Poděkování Tato práce vznikla s finanční podporou GA ČR (projekt čís. P206/11/1638), GA AV ČR (projekt čís. IAA 400400806) a MŠMT (projekt čís. LC 06063). Literatura 1. Finklea H. O., v knize: Encyclopedia of Analytical Chemistry; (Meyers R. A., ed. 11) John Willey & Sons Ltd, New York, 2000. 2. Becucci L., Carbone M. V., Biagiotti T., D'Amico M., Olivotto M., Guidelli R.: J. Phys. Chem. B 112, 1315 (2008). 3. Nelson A.: Cur. Opin. Colloid In. 15, 455 (2010). 4. Mizutani F.: Sens. Actuators B: Chem. 130, 14 (2008). 5. Park J.-Y.: Anal. Chem. 82, 8342 (2010). 6. Yosypchuk B., Mareček V.: J. Electroanal. Chem. 653, 7 (2011). 7. Yosypchuk B., Fojta M., Barek J.: Electroanalysis 22, 1967 (2010). 8. Yosypchuk B., Barek J.: Crit. Rev. Anal. Chem. 39, 189 (2009). 9. Yosypchuk B., Šestáková I.: Electroanalysis 20, 426 (2008). 10. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 15, 121 (2003). 11. Yosypchuk B., Novotný L.: Electroanalysis 16, 238 (2004). 12. Fletcher S.: J. Electroanal. Chem. 118, 419 (1981).

199

Amperometric Determinations of Nitrocompounds with Flow Detector of Silver Solid Amalgam (Amperometrická stanovení nitrosloučenin pomoci průtokového detektoru ze stříbrného pevného amalgámu) Oksana Yosypchuk a, Jiří Barek a, and Bogdan Yosypchuk b a Charles University in Prague, Faculty of Science, Department of Analytical Chemistry, UNESCO Laboratory of Environmental Electrochemistry, Albertov 6, CZ-128 43 Prague 2, Czech Republic, E-mail: [email protected] b J. Heyrovský Institute of Physical Chemistry of ASCR, v.v.i., Dolejškova 3, 182 23 Prague 8, Czech Republic Abstract In this pilot study, a new type of flow tubular amperometric detector based on silver solid amalgam was introduced. The tubular cell was tested under flow injection analysis for determination of 4-nitrophenol in aqueous solutions. The first results show that this type of detector provides high-quality signals of 4-nitrophenol. However, there are some problems with repeatability of signals caused probably of high sensitivity due to the presence of oxygen, which we shall try remove in further research research. Key words: 4-nitrophenol, amperometric detector, tubular electrode of silver solid amalgam. Úvod Mezi hlavní problémy v posledních letech patří znečišťování vodních nádrţí a vodních toků chemickými látkami jako jsou nitrofenoly 1. Jejich výskyt v ţivotním prostředí byl poprvé publikován před 36 lety 2 a jejich toxicita u rostlin a lidí od té doby budí neustálou pozornost. Jeden ze zástupců nitrofenolů, 4-nitrofenol, je přítomný v odpadních vodách textilních továren, závodů na zpracování papíru, celulózy, výrobu plastů a je rovněţ zapojen do syntézy mnoha látek 1. Spolu s 2,4-dinitrofenolem je povaţován za látku cytotoxickou, mutagenní a pravděpodobně karcinogenní 3. Vzhledem k těmto skutečnostem je potřeba neustále vyvíjet nové a spolehlivé techniky stanovení těchto látek pro jejich sledování v ţivotním prostředí. Většina dosavadních metod stanovení nitrofenolů spoléhá na kapalinovou chromatografii s hmotnostní detekcí 4. Protoţe však nitrofenoly patří mezi elektrochemické aktivní látky, nabízí se jako alternativní a levnější metoda jejich stanovení průtoková injekční analýza s elektrochemickou detekcí. Elektrochemické detekce se uţ dlouhou dobu úspěšně pouţívá ve spojení se separačními technikami jako jsou HPLC, FIA nebo CZE. Jejích hlavními výhodami jsou dostatečně vysoká citlivost a poměrně nízká cena a provozní náklady v porovnání s hojně pouţívanou fluorescenční nebo hmotnostní detekcí. V průtokových metodách se tříelektrodový systém pouţívá v uspořádání např. tubulárním, thin-layer nebo wall-jet 5,6. V literatuře se uvádějí tubulární detektory hlavně na bázi zlata a platiny. Např. Santos a kol. 7 navrhly zlatý tubulární detektor pro stanovení antimonu, Cvačka 8 a Li 9 popsali vyuţití platinového tubulárního detektoru v kombinaci s HPLC pro stanovení 1-aminonaftalenu a nitrofenolů. V tomto příspěvku je věnována pozornost vyuţití nového, doposud nepublikovaného typu průtokového tubulárního amperometrického detektoru ze stříbrného pevného amalgámu. Experimentální část Reagencie Zásobní roztok 4-nitrofenolu (98%, Sigma-Aldrich, ČR) o koncentraci 1 10–3 mol dm–3 byl připraven rozpuštěním vypočteného mnoţství krystalického 4-nitrofenolu ve vodě a doplněním vodou na celkový objem 100 ml. Roztoky o niţší koncentraci byly připravovány

200

přesným ředěním zásobního roztoku. Všechny roztoky 4-nitrofenolu byly uchovávány ve skleněných nádobách ve tmě za laboratorní teploty. Acetátový pufr o koncentraci 0,10 mol dm–3 a pH 4,75 byl připraven smícháním vypočtených mnoţství 1 mol dm–3 kyseliny octové a trihydrátu octanu sodného (obojí Lach-Ner s r. o., ČR). pH výsledného roztoku bylo zkontrolováno pH-metrem (Jenway 4330, Jenway, UK). Aparatura Tubulární amperometrický detektor (TAD) na bázi stříbrného pevného amalgámu byl testován jako detektor v průtokové injekční analýze (FIA-ED). FIA byla realizována na LaChrom Elite systému v následujícím uspořádání: gradientová pumpa L-2130 (Merck) a dávkovač Front-Loading Sample Injector Model 7725(i) 20 l (Rheodyne). Závislost proudu na čase (I-t křivky) byla měřena pomocí počítačového Eco-Tribo Polarografu PC-ETP (Polaro-Sensors, ČR) připojeného k FIA systému. Amperometrická cela se skládala z tubulární pracovní elektrody ze stříbrného pevného amalgámu pokrytého rtuťovým filmem, nasycené kalomelové referentní elektrody na základě stříbrného pastového amalgámu (má stejný potenciál jako klasická kalomelová elektroda) a platinového drátku slouţícího jako pomocná elektroda. Všechny uvedené elektrody byly laboratorní přípravy. Pracovní postupy Před kaţdým pouţitím (tedy na začátku pracovního dne) byla s TAD provedena tříkroková rekondice. Nejprve byl TAD pomocí injekční stříkačky naplněn 0,2 mol dm–3 KCl a aktivován při –2200 mV po dobu 300 s pro očištění amalgámového povrchu. Následně byl detektor naplněn 2–3 kapkami rtuti po dobu 300 s za účelem vytvoření rtuťového filmu. Po vypláchnuti rtuti byl TAD znovu aktivován vloţením potenciálu –2200 mV po dobu 300 s v 0,2 mol dm–3 KCl. Pro provedení tohoto postupu byl detektor připojen a připraven pro měření. Mobilní fáze (MF) byla na začátku pracovního dne odvzdušněna ultrazvukem na PSO 200A Ultrasonic Compact Cleaner (Powersonic) po dobu 15 min. Následně byla probublávána dusíkem nejdříve 15 min před prvním měřením a pak i v průběhu celého pracovního dne. Analyzovaný roztok byl rovněţ před kaţdým měřením probubláván 15 min dusíkem. Všechna měření byla prováděna při laboratorní teplotě. Po ukončení měření byla amperometrická cela uchovávaná v deionizované vodě. Výška píku sledované látky byla vyhodnocována od spojnice minim před a za píkem. Výsledky a diskuse Tubulární amperometrický detektor na bázi stříbrného pevného amalgámu je určený primárně pro redukující se látky a byl testován na modelovém vodném roztoku 4-nitrofenolu ve FIA systému. K tomuto účelu byla pouţita mobilní fáze o sloţení H2O: 0,1 M acetátový pufr o pH 4,75 (60:40). Je třeba zdůraznit, ţe pro daná měření je velmi důleţité důkladné odstranění kyslíku jak z mobilní fáze, tak i z měřeného roztoku, protoţe redukce kyslíku významně ovlivňuje signál analytu. Pro dosaţení nejlepšího signálu 4-nitrofenolu byly vyzkoušeny detekční potenciály od –500 do –1800 mV s krokem –100 mV (Obr. 1). Signál analytu se objevil aţ od potenciálu –700 mV a rostl aţ do –1700 mV. Při potenciálu –1800 mV uţ docházelo k poklesu signálu a výraznému zvýšení šumu (Obr. 1, křivka 7). Optimálním byl detekční potenciál –1600 mV (Obr. 2), kdy pík byl dost vysoký a při nepříliš vysokém šumu.

201

E = promenný, v = 1,0 ml/min 1200 1300 1400 1500 1600 1700 1800

7

I, nA

-20000

-15000

6

-10000

5

-5000

4 3 2 1

0

10

20

30

t, s

Obr. 1. FIA-ED záznamy 4-nitrofenolu (c = 1 10–4 mol dm–3) při různém detekčním potenciálu. Potenciál –1200 (1), –1300 (2), –1400 (3), –1500 (4), –1600 (5), –1700 (6) a –1800 mV (7). Mobilní fáze H2O: 0,1M acetátový pufr pH 4,75 (60:40), průtoková rychlost 1,0 ml min–1. Měřeno na TAD metodou FIA-ED.

I, nA

-11000

-10500

-10000

-9500 0

5

10

15

20

25

30

35

t, s

Obr. 2. FIA-ED záznam 4-nitrofenolu (c = 1 10–4 mol dm–3) při potenciálu detekce –1600 mV. Mobilní fáze H2O:0,1M acetátový pufr pH 4,75 (60:40), průtoková rychlost 1,0 ml min–1. Měřeno na TAD metodou FIA-ED. Dále byl zkoumán vliv průtokové rychlosti na odezvu analytu od 0,1 ml min–1 do 1,5 ml min–1 s krokem 0,1 ml min–1. Měření ukazují, ţe při niţších průtokových rychlostech (0,1 aţ 0,5 ml min–1) dochází k výraznějšímu rozmytí zony a většímu šumu, coţ komplikuje vyhodnocení signálu. Proto se doporučuje pouţívat průtoková rychlost od 0,6 ml min–1, kdy je pík dost vysoký, dobře tvarovaný a úzký. Větší problémy se ale vyskytly při měření opakovatelnosti signálu, kdy se výška píku po sobě jdoucích nástřiků pravidelně zvyšuje. Bylo vypozorováno, ţe daný problém je pravděpodobně způsoben velkou citlivosti detektoru na přítomnost kyslíku, který se dostává do měřeného roztoku přes stěny plastové injekční stříkačky a jehoţ koncentrace se rychle mění i po důkladném vybublaní dusíkem. Při dalším výzkumu bude kladen důraz na vhodnější sestavení měřící aparatury pro co nejdůkladnější

202

izolování měřeného vybublaného roztoku od okolního prostředí. Závěr První studie zavedení průtokového tubulárního amperometrického detektoru na bázi stříbrného pevného amalgámu a jeho testování na 4-nitrofenolu ve vodném prostředí ukazuje, ţe daný detektor poskytuje dobrou odezvu 4-nitrofenolu a je tedy vhodný pro detekci redukujících se látek. V dalším výzkumu bude kladen důraz na zlepšení opakovatelnosti signálu a rozšíření pouţití daného tubulárního detektoru na HPLC a na analýzu reálných vzorků. Poděkování Tato práce byla finančně podporována Ministerstvem školství, mládeţe a tělovýchovy (projekty MSM 0021620857, LC 06035, RP 14/63), GA ČR (projekt P206/11/1638), KONTAKT (AMVIS) projekt ME 10004 (NEMVAD)) a projektem SVV 2011–263204. Literatura 1. Mishra K. P., Gogate P. R.: Ultrason. Sonochem. 18, 739 (2011). 2. Nojima K., Fukaya K., Fukui S., Kanno S.: Chemosphere 2, 77 (1975). 3. Huang Q., Wang L., Han S.: Chemosphere 30, 915 (1995). 4. Ganranoo L, Mistra S. K., Azad A. K., Shigihara A., Dasgupta P. K., Breitbach Z. S., Armstrong D. V., Grudpan K., Rappenglueck B.: Anal. Chem. 82, 5838 (2010). 5. Danhel A., Shiu K. K., Yosypchuk B., Barek J., Peckova K., Vyskocil V.: Electroanalysis 21, 303 (2009). 6. Yosypchuk O., Barek J.: Chemické listy 104, s61 (2010). 7. Santos J. R., J. L. F. C. Lima, M. B. Quinaz, Rodriguez J. A., Barrado E.: Electroanalysis 19, 723 (2007). 8. Cvačka J., Opekar F., Barek J., Zima J.: Electroanalysis 12, 39 (2000). 9. Li T., Coufal P., Opekar F., Štulík K., Wang E.: Anal. Chim. Acta 360, 53 (1998).

203

E-mail: [email protected]

tel.: 266 053 877

fax: 286 890 502

DETEKČNÍ SYSTÉM ÚNIKU ROPNÝCH LÁTEK AS-DETECTOIL Detekční zařízení určené ke zjišťování a monitorování přítomnosti ropných látek, olejů, apod. na hladině vody. Zařízení je certifikováno. Zařízení je využitelné zejm. v průmyslu (energetika, čističky odpadních vod, ap.), v odlučovačích ropných látek, v životním prostředí aj. – jako kontrolní a bezpečnostní systém.

POPIS ZAŘÍZENÍ Systém sestává ze sondy o rozměrech 70 x 70 x 30 mm, z vyhodnocovacího přístroje o rozměrech 220 x 50 x 150 mm (napájeného napětím 12 V – akumulátor, trafo) a z výstupu pro instalaci signalizačního zařízení (zvonek, světlo) či pro napojení regulačního, záznamového a jiného systému. Zařízení umožňuje dlouhodobý, spolehlivý a bezúdržbový provoz, i v prostředí s nebezpečím výbuchu. Díky rozměrům sondy lze detektor instalovat např. i do vrtů nebo na odbočky z potrubí.

TECHNICKÉ ÚDAJE připojením na síť 220/50 Hz; 3,5 mA; akumulátor nebo trafo; váha 1,9 kg

204

E-mail: [email protected] tel.: 266 053 877 tel./fax: 286 890 502 Osvědčený analyzátor do každé laboratoře, provozu i terénu, výzkumu i škol moderní, citlivý a široce využitelný s vlastními originálními US patenty, certifikovaný přístroj

PC ECO - TRIBO voltametrický/POLAROGRAFický analyzátor ● vysoká citlivost ● snadná automatizace ● ideální pro speciaci ● stolní nebo přenosná verze (připojení na stolní PC, laptop či notebook) ● verze pro DOS, Win 3.x, 9x, Me, 2000, XP Metody DC a diferenční pulzní voltametrie (DCV a DPV), Cyklická voltametrie, DP a Tast polarografie Chronopotenciometrie s konstantním proudem Možnost návrhu vlastních metod podle potřeby uživatele Elektrody Miniaturní tužková rtuťová Zlatá, uhlíková (pastová i filmová), stříbrná, měděná Pevné amalgamové: stříbrná, zlatá, měděná (menisková, leštěná, filmová)

Použití Pro ekoanalýzu (polarografii a voltametrii) ve vodách, v roztocích a v různých materiálech (podle ČSN, DIN apod.), v běžných podmínkách pro vysoké obsahy i pro stopové koncentrace 10-10 až 10-11 mol/l stanovení kovů (Pb, Cd, Zn, Cu, Fe, Ni, Al, Cr, Hg, As, Mn, Mo, Be), resp. většiny prvků Mendělejevovy tabulky stanovení aniontů (dusičnanů, dusitanů, Cl-, CN-, Br-, J-, SO42-, PO43-, S2-) sledování velkého množství org. látek a škodlivin (saponátů, herbicidů, pesticidů, insekticidů, nitrolátek, barviv, biologicky aktivních látek, surfaktantů atd.). Hodnocení stavu a stupně opotřebení motorů, ropných olejů a maziv v běžných podmínkách, bez demontáže Oblasti aplikací - dosud nejširší laboratorní, provozní, dílenská i terénní praxe vodohospodářství, ekologie, hygiena, zemědělství a potravinářství, medicína, farmacie, geologie, hutnictví, chemické a jiné průmyslové závody, výzkum, školství atd. Analýza všech druhů vod a vodných roztoků; odpadních vod, vod z galvanizoven, průsaků, skládek odpadů, výluhů půd; geologických vzorků; rud; popílků a prachu; zemědělských, chemických a farmaceutických vzorků; pokrytí ČSN a vyhl. na vody z asi 80 % atd.

Samozřejmostí je bezplatná konzultace a předvedení systému. Poskytujeme komplexní, odborný i pogaranční servis, odbornou pomoc a vývoj analytických metodik. Celý systém je, pro svou jednoduchou obsluhu, vhodný pro výukové účely.

205

Obsah A. M. Ashrafi, K. Vytřas New Procedures for Voltammetric Determination of Copper(II) and Mercury(II) Using Antimony Film-Coated Carbon Paste Electrode

7

S. Balasoiu, J. Fischer, J. Barek, R.-I. van Staden, J. F, van Staden, G. L. Radu Comparison of Various Types of Diamond Electrodes for Determination of Biologically Active Organic Compounds

11

Z. Balcarova, S. Holubova, L Trnkova Voltammetric Study of Cytosine Oligonucleotides in Buffered and Non–Buffered Solutions

16

L. Bandžuchová, R. Šelešovská Voltammetric Behavior of Leucovorin on Mercury Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode

20

M. Bartoš, T. Valentová, I. Prchalová, J. Dobeš Photometric Determination of Phosphates after the Electrochemical Reduction of Phosphomolybdate

25

J. Bulíčková, R.Sokolová, S. Giannarelli Determination of Phytohormones in Genetically Modified Nicotiana Plants by Differential Pulse Voltammetry

29

H. Dejmková, J. Barek, J. Zima Determination of 2,4-Dinitrophenol Metabolites in Urine Using HPLC with Amperometric Detection

33

J. Fischer, M. Charvátová, J. Barek Voltammetric Determination of Trace Amount of 2-Methoxy-5-Nitrophenol on Meniscus Modified Silver Solid Amalgam Electrode

38

M. Fojta, H. Pivoňková, K. Němcová, P. Horáková, L. Havran, P. Orság, P. Vidláková, H. Macíčková-Cahová, J. Balintová, M. Hocek Magnetic Beads-Based Electrochemical Techniques for DNA-Protein Interaction Monitoring

42

M. Gál, V. Kolivoška, M. Ambrová, J. Híveš, R. Sokolová, M. Hromadová Properties of Some Radiosensitizers Studied by Means of the Electrochemical Methods

46

L. Havran, H. Macíčková-Cahová, R. Pohl, P. Horáková, J. Špaček, M. Fojta, M. Hocek Electrochemical Properties of Nucleosides, Nucleotides and DNA Labeled by Protected –SH Group

51

M. Heyrovský, B. Yosypchuk, A. Korshunov Unusual Reaction of Gold on Hanging Mercury Drop Electrode

55

Š. Honsová, T. Navrátil Evaluating the Accuracy of Continuous Glucose Monitoring by the Patient through Continuous Glucose Error Grid Analysis

63

M. Jakl, J. Jaklová Dytrtová, E. Čadková An Electrochemical Approach to Study Bis-coordinated Copper/Tebuconazole Complexes

59

206

J. Jaklová Dytrtová, M. Jakl, D. Schröder Ferrocene; a Hyphenation of Voltammetry with Electrospray Ionization Mass Spectrometry

69

K. Málková, E. Samcová, P. Tůma Determination of Neutral Saccharides by Capillary Electrophoresis with Contactless Conductivity Detection

74

V. Mansfeldová, P. Janda Electroanalysis with Phthalocyanine Modified HOPG Electrodes

78

R. Metelka, D. Jirkovská Amperometric Ethanol Detection Using FIA and Screen-Printed Carbon Electrodes Modified with Metal Oxides

82

M. Nádherná, F. Opekar, J. Reiter Amperometric Solid–State NO2 Sensor with Ionic Liquid–Polymer Electrolyte

86

T. Navrátil, I. Šestáková, V. Mareček Transport of Divalent Cations across the Gel Supported Phospholipid Membranes

91

T. Navrátil, E. Kohlíková, M. Petr, M. Heyrovský Elucidation of Metabolic Pathways Affected by Creatine Supplementation Using Electrochemical Methods

96

L. Novotný, R. Šelešovská, B. Vystrčilová, L. Dušek Voltammetric Determination of Dissolved Iron Using the Specified Amalgam Electrodes

101

V. Novotný Direct Voltammetric Determination of Aclonifen in Natural Waters at a Silver Solid Amalgam Electrode

104

F. Opekar, K. Štulík Methodology of Electrophoretic Separations in Short Capillaries

109

M. Petr, E. Kohlíková, T. Navrátil Bioimpedance Methods to Measure Somatometric and Volumetric Changes

114

I. Pilarova, Z. Balcarova, N. Serrano, L. Trnkova The Effect of Ionic Strength on Protonation Equilibria of 6-Benzylaminopurine

118

M. S. Qureshi, J. Fischer, J. Barek, Sirajuddin, M. I. Bhanger Comparison of Voltammetric and UV Spectrometric Determination of Selected Aliphatic Phthalates

123

M. Rievaj, Ľ. Švorc, P. Tomčík, M. Čerňanská, D. Bustin Indirect Voltammetric Analysis of Fluoride Ions in Toothpaste at IDA Microelectrodes 127 B. R. Silver, P. R. Unwin The Electrochemically-Assisted Growth of Lysozyme Crystals at the Surface of Platinum Disc Electrodes

132

M. Stočes, I. Švancara A Novel Type of Carbon Paste Electrode Modified With Antimony Trifluoride (SbF3) and its Applicability in Electrochemical Stripping Analysis 137

207

E. Svobodova, I. Svancara, K. Vytras, Y. Nagaosa Bismuth Film Electrode for Voltammetric Stripping Determination of Lead and Thallium in Organic Solvent

141

I. Šestáková, B. Yosypchuk Electrochemical Behavior of Metallothioneins on Silver Amalgam Electrodes

145

L. Šimková, J. Ludvík, J. Klíma Electrochemical and Spectrometric Study of FOX-7 in Aprotic Solvents

149

B. Šustrová, V. Mareček, K. Štulík Polycrystalline Gold Electrode Modified by Thiols

153

I. Švancara, K. Bartoš, M. Stočes, K. Vytřas Possibilities and Limitations of Electroanalysis with Bismuth- & Antimony Film-Plated Electrodes in Complex-Forming Media 159 M. Tomášková, J. Chýlková, T. Mikysek, R. Šelešovská Voltammetric Determination of Phenolic Antioxidants in Selected Petroleum Products 163 P. Tůma, E. Samcová Contactless Conductivity Detection in Capillary Electrophoresis in Combination with Capillaries with Thin Inner Diameter 168 J. Tvrdikova, A. Danhel, J. Barek Development and Utilization of Cylindrical Flow through Amperometric Cell Based on Crystallic Silver Amalgam 173 P. Vidláková, J. Balintová, P. Horáková, L. Havran, P. Orság, M. Fojta, M. Hocek Using Anthraquinone Labeled Nucleotide Triphosphates for Electrochemical Analysis of DNA 177 K. Vlachová, J. Zima, J. Barek, H. Dejmková Determination of Aminoglutethimide Using HPLC-ED on CPE

181

V. Vyskočil, A. Hájková, J. Barek Polarographic and Voltammetric Determination of Genotoxic 9-Fluorenone and its Derivatives

185

V. Vyskočil, T. Navrátil, J. Barek Voltammetric Determination of Anticancer Drug Flutamide at Screen-Printed Carbon Electrodes 190 B. Yosypchuk, V. Mareček Monolayers at Electrodes as Basis for Models of Natural Membranes

195

O. Yosypchuk, J. Barek, B. Yosypchuk Amperometric Determinations of Nitrocompounds with Flow Detector of Silver Solid Amalgam 200

208

209

210

Název: XXXI. Moderní Elektrochemické Metody Vydal: BEST servis Ústí nad Labem Uspořádali: Navrátil Tomáš, Barek Jiří Autor: Kolektiv autorů Počet stran: 211 Náklad: 75 Formát: A5 ISBN: 978-80-254-9634-3 Jen pro vnitřní potřebu

211

212