Fizika II. tételek kidolgozása (26-45, Molekulaspektroszkópia)
Megjegyzés: a tételsor nem teljes, és nem is feltétlenül hibáktól mentes készítette: Manninger Ádám felhasznált irodalom: Maróti Péter, Laczkó Gábor Orvosi Fizika I.-II. 1
Transzportfolyamatok a biológiában és az orvostudományban: jellemző mennyiségek:
m : m,V,Q,E,N…
áramerősség (I): I= dm/dt (=V/t; =Q/t ) m- anyagmennyiség t- idő áramsűrűség (J): J= dI/dA, J= c*v (<- I=c*A*v) dA- felület I = ∫Jn*dA Ideális Folyadékok és gázok áramlása: Stacionárius áramlás:az áramlás jellemzői, a sebesség és a nyomás nem függnek az időtől. Ekkor a cső keresztmetszetére vonatkozatott áramerősség a cső mentén mindenütt ugyanakkora. kontinuitási egyenlet: v*A= konstans Áramerősség egyszerű meghatározása: injekciós módszer: I= M/c (c=M/I) M=Δm/Δt – jelző anyag injekciójának állandó sebessége c- konc. Δt- az az idő mely alatt a jelzőanyagot a csőbe juttatjuk Fick nulladik törvénye: injekciós módszer alkalmazása a vér által közvetített gáztranszporta I=O/(A-V) O- szövetek oxigénfelhasználásának sebessége A,V- Artériás, Vénás vér Oxigén konc. (M~O , c~ A-V) gázok: p*V=N*k*T ; p*V=n*R*T tulajdonságai: golyó alakú részecskék részecskék nincsenek kölcs.hatásba a szomszédos részecskékkel η=0 gázok viszkozitása 0 rugalmas ütközések térfogatuk elhanyagolható ideális folyadékok: tulajdonságai: összenyomhatatlanok surlódásmentesek (η- elhanyagolható)
2
Bernoulli törvénye mechanikai energiamegmaradás törvénye érvényesül p+ρ*g*h+0,5*ρ*v2 = konst.
p =sztatikai nyomás ρ*g*h =hidrosztatikai nyomás 0,5*ρ*v2 =dinamikai nyomás következmény : ahol nagyobb a sebesség ott kisebb a sztatikus nyomás, sztatikai nyomás: milyen magasan van a folyadék a függőleges nyomásmérő csövekben. Venturi cső sebességével meghatározható a sebesség
Reális (viszkózus) Folyadékok áramlása Newton-féle súrlódási törvény: folyadékrétegek között nyíróerő(F) keletkezik newtoni folyadékok: a sebességesés egyenesen arányos a nyírófeszültséggel: Newton-féle súrlódási törvény: F/A= η*Δv/Δh ; (F= η*A*Δv/Δh) η= viszkozitás SI: 1PA*s nyírófeszültség: F/A Δv: relatív sebesség Δv/Δh: sebességesés Frenkel féle lyukelmélet: a molekulák a mozgásukhoz szükséges szabad teret a hőmozgás által létrehozott atomi méretű ritkulási helyek, lyukak biztosítják. gázok esetén: η/η0= √(T/T0)*((1+C/T0)/(1+C/T)) η0- gázok viszkozitása T0 abszolút hőmérsékleten C- Sutherland állandó Tnő -> ηnő folyadékok esetén: η T-1*eE/k*T k- Boltzmann állandó E- aktivációs energia T- abszolút hőmérséklet Tnő -> ηcsökken
3
Hagen-Poiseuille- törvény mekkora áramerősségű folyadéktranszportot tarthat fenn egy hoszú csőben a cső végei között létesített nyomáskülönbség: V= π/8*1/η*Δp/l*r4*t transzportintenzitás: I= π/8*1/η*Δp/l*r4 (áramerősség) Δp/L – nyomásesés r4 - cső sugarának 4.hatványa η - viszkozitás pl.: ha egy cső sugarát felére csökkentjük tizenhatodára csökken az anyagtranszport sebessége -Æ érelmeszesedés - Ohm törvénnyel analóg: I=U/R V- nyomáskülönbség R – folyadék áramlásával szembeni ellenállás G=1/R vezetőképesség soros kapcs: Reredő= R1+R2+R3… párhuzamos: Geredő= G1+G2+G3… Viszkoziméterek Silanos viszkoziméter két koaxális henger ( torziós szál) forgató nyomaték mérése kapilláris (Oswald) féle viszkoziméter (csak newtoni foly.) pl.: szívinfarktus, koszorúér elzáródás, érelmeszesedés. Lamináris és turbulens áramlás Reynolds törvénye: kritikus sebesség vkrit= Rk*η/ρr Rk –Reynolds szám (sima falú csöveknél=1160, >érdes) ρ - folyadék sűrűsége η - folyadék viszkozitása r – cső sugara I= π/8*1/η*Δp/l*r4 =1/RA’*Δp A*vkritikus=Ikritikus Δpkritikus -az a nyomás ahol a alamináris áramlás turbulens áramlásba megy át Lüktető áramlás… rugalmas fal- kiegyenlítő hatás lásd: kisérlet.. Nem-newtoni folyadékok: pseudo-plastikok: vér, sebességmérés: eleinte jobban folynak, majd viszkozitásuk állandósul.. Vér áramlása …. 4
Mikrotranszport Diffúzó Brown-mozgás következtében Fick I. (x tengely mentén történő diffúzió) J=D*(-dc/dx) J- transzportáló anyag áraműrűsége dc/dx –koncentrácó helytől való függése D- diffúziós együtható ( függ: hőmérséklet, közeg viszkozitása, diffundáló részecskék tömege,- alakja) általános kontinuitási egyenlet dc/dt=-dJ/dx dJ/dx – áramlási sűrűség térbeli vált. dc/dt – konc. változása az időben Fick II. (∂c(x,t)/( ∂t)=D*(∂2c(x,t))/( ∂x2) Egydimenziós szabad diffúzió hogyan terjed szét a diffúzió következtében az eredetileg üres térben T=0 időpontban x-tengely origójánál szabadon engedett anyag. c(x,t)= M/ (2* √(π*D*t)*e-xnégyzet/ 4Dt M – t=0 időpontban felszabadított anyagmenyiség diffúzió során t idő alatt megtett x távolság: x(t)= 2*√(D*t) szöveten belül gyors diffúzió (D) oxigénre:1*10-9m 2s-1 Co2-re :6*10-9m 2s-1 Szövetek Oxigén ellátása Oxigén kémiai és fizikai módon kötött a vérhez a kémiailag kötött O. nem vesz részt diffúzióban a diffúziós folyamatokat az O. parciális nyomása hat.meg. Henry törvénye c=α*p c - oldott O. konc α - O. oldékonysági együtthatója p – O. parciális nyomása gázfázisban U=-L*∂I/∂t [L]Si= 1 Vs/A=1H
5
Bohr effektus, a vér oxigénfelvétele kémiailag kötött o. mennyisége nagyobb mint a fizikailag kötötté hemoglobin (4 hem alegység, 1 mol hemoglobin 4 mol O tud kötni) A vérben ténylegesen feloldott o mennyisége az oxigén parciális nyomásának és a pH-nak függvénye A tüdőben uralkodó 13,4kPa parciális o. nyomás (pH 7,4) mellett a hemoglobin gyakorlatilag 100%-ban telítve van oxigénnel. A szöveti környezetben viszont az oxigén parciális nyomása csupán 5,3kPa, aminek következtében a vér o.telítettsége csak 65%. Az o. leadott hemoglobin protonkhoz való affinitása nagyobb mint az o. megkötött hemoglobiné. Ez a konformáció változás határozza meg a vér o. megkötő képességének pH-függését. Bohr effektus: A vér o.telítési görbéje a vízszintes tengely mentén eltolódik a széndioxid növekvő parciális nyomásával (csökkenő pHval), így bármely (rögzített) parciális o.nyomás értéken csökken a telítettség értéke. 7,4-7,2 csökkenő pH miatt a hemoglobin 10%-több O.-t tud leadni. tüdöbeli magasabb pH ugyanígy kedvez. c=α’*p c - oldott O. konc α’ - O.látszólagos oldékonysági együtthatója p – O. parciális nyomása gázfázisban
Diffúzió félig áteresztő hártyákon, Ozmózis Van’t Hoff törvénye pozm=R*T*∑c c – oldat koncentrációja R – egyetemes gázállandó T – adott hőmérséklet pozm – ozmózisnyomás – az a nyomáskülönbség mely az oldószer beáramlását kompenzálni képes – dinamikai egyensúly áll elő pozm =R*T *( ccukor + (ccukor 2* Vvíz )/2) – cukorra és vízre nézve elősször Pfeffer mutatta ki az ozmótikus nyomásnak az oldott anyag koncentrációjától való függését Pfeffer-féle ozmométer… cukor+deszt.víz+féligáteresztő hártya (ábra) Azonos konc., de különböző anyagi minőségű oldatok ozmózisnyomása állandó hőmérsékleten megegyezik. Ha az oldat állandó konc.-jú, akkor az ozmótikus nyomás a hőmérsékletten egyenes arányban növekszik egyenlő pozm-ú oldatokat izotóniás oldatnak nevezzük Reverz ozmózis: az ozmózis ellenében ható nyomás > ozmózis nyomás - tengervíz tisztítás 6
Ozmométerek Pfeffer-féle ozmométer- tölcsér szálában felemelkedő vízoszlop h magaságából egyensúlyi helyzetben közvetlenül kiszámítható az ozmotikus nyomás pozm=ρ*g*h ρ- oldat sűrűsége dinamikus ozmométer a felemelkedő belső vízoszlopot külső nyomással addig visszaszorítjuk , hogy a folyadékszint kívül és belül azonos legyen. a külső nyomás az ozmótikus nyomással egyenlő koncentráció számítása az oldat fagyáspontcsökkenéséből… ΔT=konst*c Ozmózis fiziológiai jelentősége izotóniás oldat: vér sókoncentrációja 0,15M (0,9%)NaCl ezért a 0,9%-os NaCl oldat izotóniás 5,5% glükóz oldat is izotóniás Hipotóniás oldat: kisebb az ozmózisnyomása az összehasonlító oldathoz képest vérben, a hemoglobin kiszabadul a kipukkadt VVT-kből a vérsejt feloldódik – hemolízis Hipertóniás oldat: ha a nagyobb a nyomása az összehasonlító oldathoz képest VVT-k zsugorodását plazmolízisnek nevezzük ezt használják ki a hashajtók- víz áramlik a bélrendszerbe Starling - effektus A vérplazma fehérjéi képesek az ozmótikus nyomást szabályozni, ami ugyanakkor kihat a test vízháztartására is. ödéma: Ha a plazmafehérjék csak kis mennyiségben vannak jelen, akkor a plazma ozmótikus nyomása lecsökken. A vér kisebb ozmózisnyomása nagyobb (kifelé irányuló) eredő nyomást okoz a hajszálér artériás végén, és kisebb (befelé mutató) vénást nyomást a vénás végén. Ennek folyományaként folyadék halmozódik fel a szövetekben-ödéma. Dialízis makromolekulák membránon keresztüli, ozmózissal történő szétválasztása a tisztítandó anyagot membrán belsejébe helyezik, majd a membránzsákot folymatosan tisztavízre cserélt fürdőbe teszik. A vízoldékony szennyeződés elhagyja a membránt, visszamarad a tiszta anyag. ~vese működése hemodialízis: a véráramból szűri ki a a membrána a salakanyagokat - művese készülék
7
Hőtranszport A test hűtését meghatározó folyamatok: J - hőáram Hővezetés: Jvez= k*(T2-T1)/l k – rúd anyagi minőségére jellemző állandó [k]Si= 1W/mK Hőkonvekció (hőáramlás) anyagok hőtágulása (gázok..) a vér hőt „szállít” Jkonv= konst.*ΔT Hősugárzás hő jut egyik testről a másikra, hogy a közbülső anyag nem melegszik fel nem kell közvetítő közeg azok a testek melegszenek fel, amelyek több sugárzást nyelnek el mint amennyit kibocsájtanak Wien-féle sugárzási törvény: λmax*T=állandó Stefan-Boltzman törvény : Jsug.= b*s*T4 ;ΔE.= b*s*ΔT4 s- univerzális sugárzási állandó (Stefan-Boltzmann féle arányossági tényező) b- a test sugárzást elnyelő tulajdonsága bbőr =1 hősugárzás szempontjából csak az infravörös tartomány számít Párolgás hatásos hűtési módszer 1kg 100 C-os víz 2,26*106 joule energia közlésével alakítható át u.i gőzé 2,4*106 joule/kg a párologtatási látens energia L=Q/m [L]Si=1J/kg L- 1kg anyag elpárolgtatásához szükséges hőt adja meg Newton-féle lehűlési törvény három hőcsere együttes kezelése (párolgás nem) T=Tkörny+ (T0-Tkörny)*e-Kt (T0=Tmax) K – lehűlési állandó K=(Λ*A)/(c*m) Λ- közös hőveszteségi tényező c – kérdéses anyag fajhője m- kérdéses anyag tömege A- felület K=(Λ*A)/(c*ρ*V)= Λ/(c*ρ)*A/V gömbre: K=(Λ*3)/(c*ρ)*1/r
8
Orvosi vonatkoztatás a hőmérséklet diagnosztikai értékű termográf (hőtérkép) Hőelvonás: áram folyik egy áramkörben, a hőt egyikk helyről el lehet szálítani a másikra : PELTIER-elemek Hőkezelés: rákos sejtek elpusztítása Szervek tárolása: hűtéssel
Transzportfolyamatok biológiai membránokon membránok felépítése: kettős lipidréteg,(40-60%), fehérjék(30-50%), szénhidrát(3-10%) vízben micellákat alkot, - hidrofil és hidrofób rész Danielli és Dawson hártya modell Denerváció: a fehérjék sajátos eloszlása a membránon mechanikai tulajdonságuk: a fehérjék is meghatározzák sok fehérje esetén csökken a felületi feszültség ”kapilláraktív anyagok”, detergensek (pl. alkohol) membránok fázisváltozása: lipidekkel kapcsolatos ha növeljük a hőmérsékletet, megváltozik a membránok fluiditása, viszkozitása, az olvadáspont valójában fázisátalakulási pont folyékony mozaik modell, integráns vagy intrinsik fehérjék, periférikus fehérjék specifikus ingerre a fehérje csatornák megnyílnak – konf. változás vizsgáló módszerek: fagyasztva törés a lipid réteg mentén –Freeze fracturing fagyasztva maratás -Freeze etching a domborzati viszonyok megmaradnak, 8-12nm vastagságú intramembrán rész Hidrofil anyagok átjutása, Membránpotenciál kialakulása nyugalmi potenciál: nem gerjesztett állapotú sejtekben, az extracellulláris térhez képest mért elektromos feszültség. Mértéke sejt típustól függ, de ált. kisebb mint 100mV depolarizációs küszöbszignál: ha ennél nagyobb az inger akkor akciós potenciál keletkezik, ha kisebb nem. (mindent vagy semmit törv.) akciós potenciál: külső ingerlésre néhány sejttípus rövid elektromos potenciálváltozással válaszol, mely a nyugalmi potenciálból indul ki majd ugyanoda tér vissza(tranziens potenciálváltozás). Nevezetesebbek a ez ideg- és izomkötegek akciós potenciáljai. A potenciálkülönbséget az ionok egyenlőtlen eloszlása okozza a plazmamembránt körülvevő és extracelluláris oldatokban ~membránpotenciál
9
A membrán nyugalmi potenciálja 100mV, nem nagy abszolút értékben, azonban a sejtmembrán vastagsága igen kicsi (10nm) így ez a meglehetősen kicsi feszültés nagy elektromos térerősséget kelt (107V/m). Diffúziós potenciál: Ugyanolyan összetételű két elektrolitot választ szét a membrán. Egyik oldalon sót adunk hozzá, melynél más a kationnak és anionnak a membránon keresztüli permeabilitása. A só ionjai a konc.-grad mentén a membrán másik oldalal felé kezdenek diffundálni. Az ionok permeabilitása különböző ezért membránon könnyebben áthaladó ionok megelőzik ellentétes töltésű párjukat. A lemaradó ellentétes töltésű ionok elektrosztatikus vonzóerőt gyakorolnak rájuk a membrán elülső oldaláról. Ezzel pozitív és negatív többlettöltések vékony felületi rétege alakul ki a membrán két oldalán. Az elektrosztatikus kettősréteg potenciálkülönbséget kelt a membránban. Ha az anion mozgékonyabb, a hígabb oldat negatív potenciálon lesz a töményebbhez képest, ha pedig a kation mozgékonyabb, akkor fordított helyzet áll elő. A diffúziós potenciál annál nagyobb minél nagyobb a különnemű ionok közötti mozgékonysági különbség és minél nagyobb az érintkező oldatok koncentrációviszonya. A diffúziós feszültség viszonylag hamar kiegyenlítődik. Nernst-egyenlet (elektródpotenciál) ε=ε0+(RT/Fz)ln a ε- elektródpotenciál !! R- általános gázálandó F- Faraday állandó (96500coulomb/g-ekv) T- hőmérséklet z- elektródfém ionjának vegyiértékje a- fémionok oldatbeli aktivitása ε0 –normál elektródpotenciál (25C –on standard e.pot.) Nernst-egyenlet: (elektródpotenciálok különbsége) E=ε1-ε2=RT/zF*ln a1/a2 E –galvánelem elektromos ereje, elektródpotenciálok különbsége U=RT/Fz*ln c +uoT U - membrán potenciál (Nernst potenciál) ln c – egységnyi koncentráció uoT – feszültség érték, függ: anyagi minőségtől, hőmérséklettől (~ε0 ) z- ennyi e- felvételére v. leadására van szükség, h. valamely fém vezető állapotba kerüljön Nernst-egyenlet:
U=RT/Fz*ln c2/c1 Ha U=0 akkor c2≈c1 tehát egyensúly áll fenn.
Donnan-potenciál: Ha az ellentet ionok számára a membrán teljesen átjárhatatlan. pl.:A sejtet alacsony ionerősségú oldatba helyezzük. A sejtben fehérjék oldalláncairól leválnak a pozitív töltésű csoportok, mivel ezek mozgékonyak ”rögzített” negatív ionok 10
halmozódnak fel a sejtben. A disszociációval keletkező kationok mindaddig folytatják a belső fázis elhagyását, míg a kialakuló diffúziós potenciálból és a kationokra vonatkozó koncentráció-gradiensből származó hatások ki nem egyenlítik egymást. A mobilis elemek sem egyenletesen oszlanak el a membrán két oldalán, hanem sajátos egyensúly , Donnan-egyensúly alakul ki. Az egyensúly kialakulása a membrán mentén elektromos kettősréteg képződésével jár együtt és az ehhez tartozó feszültséget Donnan-feszültségnek nevezik. (Donnan-feszültség = tartós diffúziós feszültség, stacionárius) U=(2,3RT)/F*lg (c1+c2)/c1 Elektrogén ionpumpák: magas elektromkémiai potenciált alakítanak ki, Na-ra :156mV stabilizálják a külső és belső oldatokban az ionok koncentrációit, aktív transzportfolyamatokkal. Ionok haladnak a koncentrációeséssel ellentétes irányban metabolikus folyamatokból nyert energia árán. Hozzájárulhatnak a membránpotenciál kialakításához is mivel a membrán síkjára merőleges irányban töltéseket mozgatnak. Csak akkor elektrogén ha a töltéseloszlás nem 0. Goldman- potenciál: élő sejtekben a diffúziós potenciál (konc.különbség) lecsengését Elektrogén ionpumpák által fenntartot aktív iontranszport folyamatok akadályozzák meg. Így a diffúziós potenciál is stacionárius lesz és a membrán nyugalmi állapotában ki is számítható a teljes elektromos áram eltünésének feltételéből. Ionáram sűrűsége(Nernst-Planck egyenlet) J=-u*c*dG/dx u-ion membránon belüli mozgékonysága c- ionkoncentráció x- membrán síkjára merőleges irány (~membránvastagság- w) G- szabadenergia tehát: J=-u*Z* F*(dU/dx)*c -u*R*T*dc/dx Z- ion vegyértéke Goldman-egyenlet: U=(2,3RT)/F*lg (Pk* [K+]b +PNa* [Na+]b +PCl* [Cl-]k) (Pk* [K+]k +PNa* [Na+]k +PCl* [Cl-]b) P- membránnak adott ionra vonatkozó permeabilitása U- diffúziós potenciál P- relatív permeabilitás k- kívül, b- belül Hodgkin-Huxley-Katz féle transzportmodel (Goldman-Hodgkin-Katz egyenlet) - Donnan-modelnél jobban közelíti meg a valós helyzetet - A membránon állandó anyagtranszport megy végbe - Az ionok membránon történő vándorlása erősebben vagy gyengébben gátolt ezáltal a membrán felületén elektromos kettősréteg jön létre.
11
-A nyugalmi potenciál egyenlő az elektromos kettősréteget jellemző potenciálkülönbséggel. A membránpotenciál kísérleti meghatározásának módszerei Elektromos mérések (mikroelektródák) idegrost axoplazmájba elektródot helyezünk (tintahal, vastag idegrost) A membránpotenciált közvetlenül mérhetjük a belső elektróda és az extracelluláris oldatba helyezet referencia elektróda között. A mérési körülményeket az idegrost folyadékfürdője összetételének megválasztásával beállíthatjuk. Általában azonban nem lehet elektródát juttatni axiálisan a citoplazmába. Ezekhez a mérésekhez mikroelektródát használunk. A mikroelektróda hegye kicsi 0,1-0,5μm is lehet. Feszültségrögzítés (Voltage clamp) Cole- dolgozta ki nem hagyjuk hogy megváltozzon a membránpotenciál: ha a membránpotenciál eltér a normálistól, rögzítő áramot juttat a membrán belsejébe, amely kiegyenlíti a membránáramnak a membránkondenzátor feszültségét megváltoztatni igyekvő hatását. A membránpotenciál akkor marad állandó ha a rögzítő áram a membránárammal egyenlő mértékű, de fordított előjelű. A mérés megismételhető különböző feszültségekkel, ezáltal a valódi (áram, permeabilitás) kinetikák megkaphatók, ill az áram-feszültség karakterisztikák megszerkeszthetők. Vizsgálni lehet továbbá a kényszerrel kiváltot membránáram-impulzus időfüggését. Egyetlen ioncsatornára vonatkozó mérések (Patch clamp) A membránáramok zajspektrumai Az ioncsatorna nyitása és zárása a membránpotenciáltól meghatározott idő alatt történik. Egy kiválasztot csatorna kinyitásával együtjáró, nagyon gyenge, áram hozzáadódik a teljes membránáramhoz, melynek nagysága az időben véletlenszerűen változik… A kapuáram közvetlen mérése a többi ionpumpa hatását és a membrán egyéb pórusainak hatását csökkentni (megszüntetni) kell speciális gátlószereket használnak erre, a méréseket a membrán felületének néhány μm átmérőjű darabkáján végzik. Patch clamp a Voltage clamp speciális változata. Finoman polírozott végű pipetta kb. 1μm átmérőjű csúcsában lévő oldat képezi az extraceluláris folyadékot. Ebben az esetben a pipetta csúcsa által határolt membránrészt vizsgáljuk, és ugyancsak lehetőség van a folyadék összetételének változtatására.
12
Optikai módszerek Töltéssel rendelkezö festékek sejten belüli eloszlásának mérésén alapszik. A festékek koncentrációját rutin spektroszkópiai módszerekkel meghatározhatjuk. (abszorpció, fluoreszencia) A memránpotenciált az egyensúlyi Nernst-egyenletből számíthatjuk. kritérium: a festék egyenletes eloszlása a citoplazmában nem képezhet polimereket, dimereket, nem kötődhet sejtorganellumhoz, nem halmozódhat fel sejtalkotóban fluorokrómok: mezocianinok, daminszármazékok Nyugalmi potenciál Kálium ionok a sejt belsejében Nátrium és klorid ionok a az extracelluláris térrészben halmosódnak fel Az elektromos semlegességet az immobilis szerves anionok biztosítják. A kálium és a klorid ionokra számított Donnan-potenciálok jól megközelítik a kisérleti értéket. Nátrium ionra azonban eltér. Arra következtethetünk ebből, hogy az ioncsatornák nyitva vannak a kálium és klorid ionok számára, azonban zártak a nátrium ionok számára. A membrán azonban nem statikussan impermeábilis a Na-ion számára A nátriumpumpák Na-ionokat pumpálnak ki a sejt belsejéből. A dinamikus Na-transzport olyan egyensúlyba kerül, amely kis eredő permeabilitást eredményez Na ionra
Akciós potenciál A sejtek sok típusában akciós potenciál keletkezik, ha a sejt aktív állapotba kerül. A nyomást érzékelő sejtek rövid feszültségimpulzussal reagálnak, ha a nyomás meghalad egy jól meghatározott küszöbértéket,az izomrost összerándul, mihelyt a membránpotenciál rövid időre pozitív irányba, a küszöbb érték fölé ugrik. A membrán igen hamar elveszti polarizáltságát. Az akciós potenciál felfutó szakaszában a membrán 1 ms-nál lényegesen rövidebb idő alatt depolarizálódik, sőt a membránpotenciál nulla értékét is meghaladhatja. Az akciós potenciál csúcsértéke az idegsejtben +30 mV-ot, a membránpotenciál teljes megváltozása (-70mV nyugalmi pot.-ot véve) a +100 mV-ot is eléri. A depolarizáció maximális sebessége akár 100V/s is lehet A gyors felfutást lassúbb repolarizáció követi, amelynek kinematikája sejtenként változik. Idegsejtben az akciós potenciál kb. 1 ms alatt visszatér a nyugalmi szintre, sőt rövid időre még túl is fut rajta. Ezzel a membrán hiperpolarizálttá válik, ez a hiperpolarizáló pozitív utódpotenciál. Innen kerül vissza a sejt a nyugalmi állapotba. A vázizomban kezdeti gyors után lassú a repolarizáció (10 ms)az elhúzódó repolarizációs fázis a negatív utódpotenciál. A szívizomban nagyon lassú a repolarizáció (200-300 ms) Ismételt gerjesztéssel ugyanabban a sejtben akciós potenciálok sorozatát lehet kelteni.
13
Ingerküszöb: Akciós potenciált csak olyan inger vált ki, amelynek hatására a membrán egy bizonyos küszöbértéket meghaladó mértékben depolarizálódik. A küszöbérték nem állandó, függ a rendszer állapotától Minden vagy semmi: Ha a gerjesztés nem éri el a küszöbértéket akkor a sejtben nem vált ki akciós potenciált. Ha eléri akkor kivált a válasz nagysága nem függ a gerjesztés intenzitásától tehát: a sejt vagy teljesen, vagy egyáltalán nem reagál az őt ért ingerre
Önregenerálódás A depolarizációs állapotot a repolarizáció szakasza követi az akciós potenciált kiváltó folyamatok ön-regenartívak, vagyis automatikus, külső beavatkozás nélkül, maguk visszaállítják a nyugalmi állapotot. Holtidő (refrakter periódus) A sejt gerjeszthetőségi küszöbértéke jellegzetesen változik az akciós potenciál alatt. Neuron esetében: A sejtet nem lehet újragerjeszteni egészen addig, míg a feszültség a csúcsfeszültség kb. 1/3-áig le nem csökken. Ezt az időtartományt abszolút holtidőnek nevezzük. Ekkor a gerjesztési küszöbb minden határt meghalad. Az ezután következő, és a negatív utódpotenciál kezdetéig tartó szakasz a relatív holtidő. Ekkora küszöbérték már nem szélsőségesen magas, de magasabb mint a nyugalmi helyzethez tartozó érték. A negatív utódpotenciál ideje alatt a küszöbb alacsonyabb (szuperszenzitív), a pozitív utódpotenciál alatt pedig magasabb mint a nyugalmi állapotban. A neuron holtideje 1 ms-nél kisebb A holtidő vázizomnál valamivel nagyobb, 2ms. Szívizom esetén az abszolúttholtidő kiterjed az összehúzódás teljes idejére (>200 ms) A relatív holtidő a repolarizáció majdnem teljes befejezéséig tart. Ennek élettani jelentősége van. A szívizom a kontrakciós fázis alatt nem gerjeszthető újra, így merevgörcs (tetanusz) nem léphet fel. A szív így nem lenne képes vért pumpálni. Akciós potenciálgörbe jellemzése Hipopolarizáció: ingerlés alatt, ~depolarizáció ~ingerküszöb(?) Depolarizáció: Na ionok elkezdenek beáramlani –100 mV-tól kb.+30 mV-os (maximum) membrán-potenciálig (a potenciálgörbe csúcsáig) Túllövés tartománya: pozitív membrán-potenciál Repolarizációs taromány: a membrán-potenciál újra a negatív érték felé kezd változni
14
K+-ion kezd beáramlani a sejtbe ezalatt: negatív utódpotenciál Hiperpolarizáció: a membrán-potenciál a nyugalmi potenciál értéke alá esik ezalatt: pozitív utódpotenciál Elektromos térerősség E=U/d ΔU/J≡R [R]Si=1V/A=1Ω (ohm) Az akciós potenciál jelenségszintű leírása Ionáramok az Akciós potenciál alatt A negatív nyugalmi potenciál a nátrium és/vagy kalcium ionoknak a membránon keresztüli impermeabilitásával, ill. az extracelluláris térben való felhalmozódásával magyarázható. A küszöbértéket megahaladó gerjesztés a membránt kissé depolarizálja, és a Na (és/vagy kalcium) ionokra nézve permeabilitását erősen megnöveli. Elkezdenek beáramlani a sejtbe. (+30 mv feletti Donnan-potenciál) Befelé áram elősegíti a membrán további depolarizációját, ami tovább növeli a Na+ és Ca ionok vezetőképességét. ->pozitív visszacsatolás, lavinaszerű depolarizációs folyamat. kb. +30 mV membránfeszültség elérésekor a folyamat befejeződik, és megkezdődik a Repolarizáció. Ebben a fázisban a membrán permeabilitása K+-ionra (néhány fajta sejtben Cl--ionra) nézve megnövekszik. A pozitív töltéseknek sejtből való kiáramlása addig tart, míg a membránpotenciál újra el nem éri a nyugalmi potenciált, ami nagyon közel esik a K+és a Cl-ionok egyensúlyi potenciáljához. Az ionáramok időfüggése feszültségrögzítéses módszer alapján Az egyes ionok vezetői sebességének időbeli változása: (membránpermeabilitás mértéke) meghatározható a mért áramokkal: gion= Jion/(U- Uion) U- tényleges(állandónak tartott) membránpotenciál Uion- az ion Donnan-potenciálja Áram feszültség jelleggörbék - nemcsak egyetlen feszültségnél lehet megnézni az áram időfüggését, hanem eltérő tetszőleges értékeknél is. - Depolarizáció alatt a káliumion árama a nyugalmi álapot értékéről indulva monoton növekszik. - A Na árama is kicsi nyugalmi állapotban, azonban –60 mV és –50 mV közötti tartományban meredeken emelkedik és –20 mV körül maximomot ér el. Ennél pozitívabb feszültségnél lineárisan csökken. Csúcspotenciál eléréséig 500szoros permeabilitás figyelhető meg. Holtidőben ez mérhetetlenül kicsi. - Cl-ion permeabilitása állandó marad, passzív szerepet játszik, membránon átjutva Donnan-egyensúly -t alakít ki.
15
Akciós potenciál terjedése Lokális köráram –modell - Az ideg meghatározott helyén gerjesztés történik, - Na- ionok beáramlanak -> a belső térrész kérdéses darabkájának potenciálját pozitívvá változtatják. - Ezek a vátozások az aktív terület szomszédságában csökkentik a membránpotenciált - Ha a megfordított polaritású tartományok határán a potenciál a gerjesztési küszöb alá csökken, akkor ezek a területek is permeabilisakká válnak, a nátriumra nézve. - A határoló tartományok tehát gerjesztődnek - Ilyenmódon depolarizációs hullám halad végig az idegroston. - A depolarizációs hullámnak ezt a formáját passzív terjedésnek nevezzük. - A depolarizálódó membrán élein helyi ionáramok folynak, melyeket lokális köráramnak hívunk Mielin hüvelyű idegrostok - idegsejt anatómiai részletei: o Sejttest vagy szóma, ez tartalmazza a sejtmagot o szómából egy hosszabb – neurit vagy axon o és több rövidebb nyúlvány, dentrit indul ki o Az axon-t membrán veszi körül, belül citoplazma o A membránhoz szorosan simuló sejt: Schwann-sejt o Axon tengelyfonala körüli velőhüvelyt mielinnek nevezzük o A mielin borításban periódikusan nyílások találhatók: Ranvierbefűződés (Ranvier csomó) átlagosan 1 μm szélesek o A mielin jó elektromos szigetelő és emellet kellően vastag is emiatt a mielin borítású axon elektromos kapacitása lényegesen kisebb, mint a csupaasz neurité o Az ember indegrostjainak többsége mielin réteggel borított o A membrán a Ranvier-csomóknál gerjeszthető o Az ionáramok a csomók között folynak o A gerjesztés az egyik csomóról a másikra ugrik o Ez ideálisabb a terjedésnek – nagyobb sebesség, kissebb E. igény o Szaltatórikus áramvezetés A terjedés sebessége Terjedés során, az axon tengelye mentén, longitudinális irányban áram fog folyni melyet Ilong–al jelölünk Mivel a membrán nem idális szigetelő (dielektrikum), ezért a valóságban figyelembe kell venni a membránon keresztüli, Itransz –al jelölt áramot is. Axon belsejében lévő longitudinális áramkomponens (Ohm törv.): Ilong= -σlong*r2*π*(dU’/dx) E=-dU/dx –csökkenő gradiens menti térerősség σ- vezetőképesség σlong- hosszanti irányban mért vezetőképesség r- axon sugara U’- membrán pillanatnyi potenciálja (a nyug.pot.-hoz képest) 16
Axon egysényi darabjában membránon keresztül folyó áramkomponens (Ohm törv.) Itransz= σtransz*(2*r*π)*U’ σtransz- membrán egysényi hosszúságú szakaszának tengelyre merőleges irányban mért vezetőképessége A transzverzális áram ennek megfelelően nagy a csúcsfeszültség helyén ás egyre kisebb attól távolodva, Itransz azzal a sebességgel egyenlő, amellyel a longitudinális áram csillapodik az axon mentén: Itransz= - (d Ilong)/dx csökkenési hosszállandó (L): L=√(( σlong*r)/(2* σtransz)) azta a távolságot jelenti, ahol a membránpotenciál csúcsértéke e-ed részére csökken terjedési sebesség (v): v=konst*L terjedési sebesség (L-ből): v=konst*√(( σlong*r)/(2* σtransz)) *√(r) ezért: nagy axon átmérő, nagy sebesség kis axon átmérő, kis sebesség tejedési sebesség függ még a longitudinális és transzv. irányban mért elektromos vezetőképesség arányától mielin hüvelynél ezért gyors Gerjeszthetőségi gyakoriság A kiváltó inger intenzitását az uniformizált impulzusok frekvenciája fogja mérni. kísérlet: forgó fogaskerék, egy idő után simának érezzük (~100Hz) Molekuláris leírás Modellek melyek, számot tudnak adni a membránpotenciált kiváltó ionáramlásokról Minimális modelként legalább két, egymással összehangoltan müködő molekulaegyüttest kell feltételeznünk. Az egyiknek létre kell hoznia a Na- és K-ionok grádiensét a membránon keresztül (ionpumpa) Ez a molekularendszer pumpálja ki a Na-ionokat a sejt belsejéből, és hozza be kívülről a K-ionokat ezt a feladatot a Na+/K+-függő ATPáz látja el A másiknak a különböző ionokra vonatkozóan a membrán permeabilitását kell feszültség függő módon irányítania. Ez a rendszer olyn ionspecifikus csatornákat jelent, amelyekben lévő kaput a membrán aktuális feszültsége szabályozza (nyitja,zárja) 17
A Na+/K+-ionpumpa - A két ion transzportja erősen csatolt három Na-ion kipumpálása ellenében két K-iont mozgat a sejtbe - A pumpa részlegesen elektrogén, de a membránpotenciálnál sokkal kisebb feszültséget kelt - a szükséges energiát ATP hidrolíziséből nyeri- 3 Na+: 2 K+: 1 ATP - A pumpa megfordítható - A transzport abszolút specifikus a nátriumionra (nem helyettesíthető), Káliumionra nem ennyire szelektív, azonban a hatékonyság ekkor kisebb. Más a belső térben (!!) lévő nukleozid trifoszfátotot is képes felhsználni, de kevésbé hatékonyak mint az ATP - Specifikusan gátolható a transzport digitálisz glükozidokkal pl. ouabainnal –ez a káliumionnal versenyez a külső kötőhelyekért - bizonyos esetekben ez a legjelentősebb ATP fogyasztó, akár 70% is csökkenhet ha ouabainnal kezeljük. ez csak a pumpát gátolja - A transzportrendszer a sejtmembránból standard biokémiai módszerekkel izolálható, és beépíthető mestreséges membránokba az aktivitás számottevő csökkenése nélkül - Integráns membránfehérje. A káliumion és az ouabain kötőhely a membrán külső, ATP kötőhelyei a belső helyén található Feszültségérzékeny ioncsatornák Az idegrostokban az inger által kiváltott ingerülett térbeli kiterjedése (hosszállandó), terjedési sebessége, valamint az akciós potenciál felfutó (depolarizációs) élének meredeksége egyaránt attól függ, milyen gyors a Nacsatornák válasza a membránpotenciálban bekövetkező változásokra. Vannak a csatornáknak olyan elemei, amelyek érzékenyek a membránban uralkodó elektromos térerősségre. A nyugalmi állapotban a csatornát egy kapu(molekula) zárja le. A kapu csatornabeli helyzetét egy, a membrán elektromos terére érzékeny csoport szabályozza. Ha a membrán depolarizációja a küszöbérték fölé nő, akkor a csatorna azonnal kinyit és nátriumion lavina indulhat meg a külsőből a belső tér felé. A kapu azonban csak rövid ideig van nyitva, és egy, még közelebbről nem tisztázott inaktivációs folyamat bezárja. - ionofór tipusú transzport Rögzített helyzetű töltések körbezárják a transzportálandó (Na)iont, amely így átjuthat a hidrofób csatornán. Kis sebességű mert diffúzió vezérli. -
rögzített ionokkal bélelt csatorna A transzport sebessége lényegesen emelhető, ha a membránpórusban az ion töltésével ellentett töltések sorakoznak. Az ilyen csatornaszerkezet azonban rendkívül kedvezőtlen
-
vízzel bélelt csatorna Vízmolekulák gyűrű rendszerét alakítják ki a csatorna belsejében és hidrogénhíd kötésekkel kapcsolódnak egymáshoz és a membránfehérje aminosavjaihoz. Elegendő energia az ion stabilizásásához
18
Idegmérgek Na+/K+-függő ATPáz inaktiválása: ouabainnal történhet.. dinitrofenol vagy cianid – hatásuk oxidatív anyagcserén keresztül Nátriumcsatorna gátlása : tetrodoxin (TTX) sünhal mérge szaxitoxin Na-csatorna külső bejáratához nagy affinitással kötődik gátolva azt helyi érzéstelenítők: kokainból- prokain Na csat. blokk, de a membrán belső felén, gátlóhatása függ a membránfesz.-től Káliumcsatorna blokkolása: tetraetil-ammónia (TEA): , TTX-hez hasonló, kisebb affinitás 4-aminopiridin (4-AP), belülről hat a csat.-ra Rendszer kinetikáját befolyásoló tényezők: akonitin, scorpion venom, veratrum megváltoztatják a Na-csatornák kinyitásának feszültségét
Molekulaspektroszkópia Molekulák energiaszint-rendszere Born-Oppenheimer közelítés: Egyes (elektron-, vibrációs- és rotációs) állapotok egymástól függetlennek tekinthetők, a köztük lévő csatolás elhanyagolható A molekula egészének energiája additívan tevődik össze az elektron-gerjesztési energiából, a vibrációs energiából és a molekula egészének a különböző forgástengelyek körüli forgási energiából. A különböző tipusú energiaállapotok jól elkülöníthetők. Elektronok átrendeződésével járó állapotváltozásokhoz nagy energia szükséges. Ennél kisebb energiát igényel a molekuláris rezgések átrendeződése, mégkissebbet a rotációs szintek közötti átmenet. Energiarendszerben foglaljuk össze: rotációs nívók rendszere
vibrációs energiaszint
Elektrongerjesztési-energiaszint A molekula egészére jellemző energiaszint-rendszer ezekből az egymásba (ra) skatulyázott nívócsoportokból áll
19
Legfontosabb a legalacsonyabb elektrongerjesztési szinthez tartozó alapállapot(S0), és a vele szomszédos első gerjesztett állapot (S1). A molekula most ismertetett energiaszint-rendszere, amelyet gyakran Jablonski-féle termsémának hívnak, iránytű gyanánt szolgál a legkülönbözőbb molekula-spektroszkópiai jelenségeknek. fluoreszcencia : elektronátmenet gerjesztett állapotból- alapállapotba késleltetett fluoreszcencia : elektronátmenet szingluett állapotból gerjesztett állapotba, majd alapállapotba foszforeszcencia : elektronátmenet szingluett állapotból alapállapotba Lumineszencia tulajdonságai: abszorpciósfluoreszenciafoszforeszcencia-spektruma a sugárzás (kvantum)hatásfoka Polarizációfoka élettartama Beer-Lambert tövénye: I=I0*10-ε*(λ)*c*l l- elnyelő rétegvastagság c- koncentráció ε*(λ)- moláris dekadikus extinkciós koefficiens Transzmisszió T=I/I0 Optikai denzitás (E≡) O.D=lg(I0/I) Az abszorpciós spektrum a gerjesztett állapot vibrációs szintrendszerét tapogatja le. Atomoknál a spektrum nagyon keskeny (vonalas), molekulák esetén, oldatban szélesebb, sávos szerkezetű. A fluoreszencia spektrum a gerjesztés hatására bekövetkező fluoreszcencia emisszió intenzitásának a hullámhosztól való függését ábrázolja. az alapállapot vibrációs szint-rendszerét reprezentálja a fluoreszcencia spektrum ezért egyetlen sávból áll, amely kevésbé struktúrált, és az abszorpciós sávhoz viszonyítva eltolódik a spektrum vörös vége felé. Ez a Stokes-féle eltolódás. A foszforeszcencia spektrum a gerjesztés hatására kibocsájtott foszforeszcencia intenzitásának hullámhosztól való függését ábrázolja. Spektruma hasonlít a fluorszcencia spektrumához Lumineszcencia hatásfoka: a (teljes térszögbe kibocsátott) lumineszcencia sugárzás energiája egyenesen arányos a lumineszenciát kiváltó gerjesztő fényből elnyelt energiával, az arányossági tényező a lumineszcencia hatásfoka.
20
Ha az energia helyett az elnyelt ill. kibocsájtott fotonok számát vesszük tekintetbe, akkor a lumineszcencia kvantumhatásfokát kapjuk. Polarizációfok (P) a lineárisan polarizált fény polarizációjának mértékét jellemzi, amelyet a fény polarizátoron keresztül történő megfigyelésével határozhatunk meg: P= (II -I⊥ )/(II +I⊥ ) II- maximális fényintenzitást eredményező polarizátorállásnál mért fényintenzitás I⊥- erre merőleges polarizátor-állásnál mért fényintenzitás
Fluoreszcencia élettartam az az időtartam amely alatt a fluoreszcencia intenzitása a kezdeti érték e-ed részére (37%-ára) csökken. érzékeny indikátora a molekula belső szerkezetének és a környezettel való kölcsönhatásnak. Molekuláris abszorpciós spektroszkópia abszorpció mérése koloriméterrel vagy spektrofotométerrel a koloriméter 4-40nm sávszélességű szűrőkkel és egyszerű detektorral van ellátva, rögzített hullámhossznál egymás utáni méréseket lehet vele végezni. spektrofotométer: fényforrása stabilizált, intenzív, folytonos spektrumú fényt ad a látható, vagy az ultraibolya tartományban A beépített diszperzív elemet tartalmazó monokromátorral a hullámhossz folytonosan változtatható beállított sávszélesség mellett.Az abszorpciós küvettán áthaladó fényt fotoelektromos detektor érzékeli. Ennek jeléből jelfeldolgozó áramkör határozza meg az optikai denzitás ill. transzmisszió mértékét. fajtái: egysugaras, kétsugaras orvos-biológiai alkalmazásai: - altatószerek túladagolásának kimutatása - hiperbilirubinémia diagnosztizálása - A-, B12-vitamin plazmabeli szintjének mérése - hemoglobin oxigenált és dezoxigenált formáinak spektruma Fotodinamikus terápia ráksejtkezelés új módszere megfestett élő sejtek és szövetek megvilágítás hatására károsodást szenvednek. fotoszenzibilizált reakció a festék nyeli el a gerjsztő fényt és elindítja a fotodinamikus reakciót, nem roncsolódik, csak katalizátor hematoporfirin származékok használata a tumorsejtekben nagyobb konc.-ban gyűlik össze
21
Molekuláris fluoreszcencia spektroszkópia fluoriméter: részei: - fényforrás (ívlámpák,gázkisülésű csövek(Higany, Xenon), lézerek) - mintát tartalmazó küvetta - emittált fényt felbontó monokromátor - fotodetektor - jelfeldolgozó egység Rutin klinikai diagnosztika bizonyos vegyületek kimutatása, azonosítása, kvantitatív meghatározása porfirin meghatározás szérumkalcium meghatározás katekolaminok meghatározása vizeletben kortuzol meghatározása emberi vérszérumból adreonokortikorp hormon (ACTH) meghatározása ösztrogénhormonok kimutatása Orvosi/biológiai kutatásban használt fluorszcenciás technikák Immunofluoreszcencia Ismeretlen mennyiségű antigént tartalmazó mintához ismert mennyiségű, fluoreszcens festékkel megjelölt antigént adunk. Jelölt és jelöletlen antigének kapcsolódnak, a kötődés relatív mértékét a jelöletlen antigének mintában lévő mennyiségeinek aránya határozza meg. Megfellő adszorbenssel megköthetjük, esetleg kimoshatjuk a szabad antigéneket. Szétválasztás után mért fluoreszcencia intenzitásából következtethetünk a jelöletlen antigén mennyiségére vegyületek: fluoreszcein-izotiocianát (FITC) alkalmazása: véredények fluoreszcenciás vizsgálata fluoreszcencia-aktivált sejtanalízis és –szeparálás sejtenkénti gyors analízis és szétválasztása folyadékban szuszpendált heterogén sejtpopulációt egyedi sejtekre bontva vezetik a vizsgáló térbe, ahol egyidejűleg több paramétert mérnek, és erre alapozzák az analízist, valaint a sejtek szétválasztását. Ilyen vizsgálati jelemző lehet az egyedi sejtek fluoreszcencia intenzitása, spektruma vagy polarizációfoka, a gerjesztőfény szórása készülék müködési elve: A sejteket saját fluoreszcenciájuk alapján mérjük vagy fluoreszcens jelzőanyaggal jelöljük őket ez lesz az oszt.alapja A vizgálandó sejteket tartalmazó szuszpenziót fúvókába vezetjük. A fúvókából kilépő vékony folyadéksugár egy darabig még együtt marad, azután apró csepekkre bomlik, amelyekben már csak egy-egy sejt van. Mielött a folyadéksugár cseppekre esik intenzív (lézer)sugárral oldalról megvilágítjuk.
22
Az így gerjesztett fluoreszcenciát, és a sejtek által szórt fényt fotomultiplierek detektálják. Minden sejt egyedileg jellemezhető fényszórás és a fluoreszcencia intenzitás mértékével. A jelfeldolgozó elektronikus áramkörök minden egyes sejt ilyen paramétereit tárolják, egyidejűleg jelet küldenek a szeparáló egységnek. A folyadéksugárról való leszakaásuk elötti pillanatban a cseppeket a szeparáló egység a sejten mért paraméterek értékeitől függő mértékben elektromosan feltölti. A cseppeket az eltérítő lemezek közti elektrosztatikus tér eltéríti, így azok a -bennük foglalt sejtekkel együtt- töltésük szerint másmás edénybe esnek. készüléktől függően kb. 10ezer sejt analízise, szétválasztása történhet másodpercenként. orvos-biológiai alkamazása: rákos sejtek analízise és elkülönítése gyógyszerek haásának vizsgálata sejtstruktúrákon kromoszóma-vizsgálatok sejten belüli enzimaktivitás, antigén- antitest kötődés, lektinkötőképesség, DNS és RNS tartalom, stb mérése Fehérjék fluoreszcencia vizsgálata UV gerjesztés hatására fluoreszcenciára képes aminosavak: -fenilalanin, tirozin, triptofán ez a gyenge saját (belső) fluoreszcencia a triptofán és a tirozin rezidumok dominálnak a megfigyelhető fluoreszcencia jellemzőit a fluoreszkáló aminosav mikrokölcsönhatások módosíthatják E kölcsönhatások függnek a fehérje szerkezetében elfoglalt helyzetétől, az intramolekuláris fluoreszcencia kioltókkal való kapcsolatától, stb. Példa: ribonukleáz T1 egyetlen triptofánt tartalmaz, fluoreszcenciája a fehérjét tartalmazó pufferhez adott akrilamiddal kioltható. A kioltás ütközés jellegű, azaz az akrilamidnak a külső oldatból a triptofánhoz kell diffundálnia annak kb. 3ns élettartalmú gerjesztett állapota alatt, hogy hatásos fluoreszcencia kioltát tapasztalhassunk. Minél kevésbé hozzáférhető az oldószer felöl a triptofán, annál kisebb mértékben befolyásolja annak fluoreszcienciáját a kioltó akrilamid. A kioltásra vezető ütközések a fehérje mátrixán keresztüli diffúzió révén valósulhatnak meg. A diffúziós folyamatnak a vízben mért értékéhez képest megemelkedett aktiválási energiájából arra lehet következtetni, hogy a fehérje szerkezete nem merev és nem statikus, hanem a triptofán 3ns-os élettartamával összemérhető időskálán fluktuál. Nukleinsavak fluoreszcenciás vizsgálata a nukleinsavak belső fluoreszcenciája nagyon gyenge ezért csak alkalmas külső festékek felhasználásával végezhatők rajtuk fluoreszcenciás vizsgálatok interkalálódó festékek, a nukleinsavak kettős helixének nagyobb réseibe nemkovalens módon bekötődhetnek
23
A kötődéskor fluoreszcenciájuk kvantumhatásfoka legtöbbször igen jelentősen megemelkedik. A nemkötött festék(etidiumbromid) fluoreszcenciája gyakorlatilag nem zavaró, ezért e festéket széleskörben széles kőrben használják nukleinsavak mennyiségi mérésére ill. kettőshelix-tartalom megállapítására. Egyes csoportok közötti elektrongerjesztési energia átadásának mérésével a nukleinsavak struktúrájának dinamikus intra- és extracelluláris változásaira lehet következteni. Fotodekompozíciót követő fluoreszcencia intenzitás regenerálódásának módszere (FRAP) a sejt membránjában lévő molekulák a membrán síkjában történő (laterális) mozgását ezzel a fluoreszcenciás módszerrel lehet nyomonkövetni receptor ligandokat, vagy egyé vizsgálni kívánt membránkomponenseket fluoreszkáló festékkel megjelölik, majd pillanatszerűen megzavarják eredetileg egyenletes eloszlásukat. A termodinamika II. főtétele értelmében a magára hagyott rendszer visszatér az egyensúlyi eloszláshoz, azt a folyamatot vizsgáljuk az idő függvényben. Lézerimpulzussal kis felület sejtjeit roncsoljuk, majd ennek a felületnek a fluoreszcencia intenzitását mérjük az idő függvényében. A beáramló ép sejtek az idő függvényében fokozatosan növelik a mért fluoreszcenciát. Lézerek tulajdonságai: - párhuzamos nyaláb (kis divergenciájú) - nagy fényteljesítményű (nagyobb teljesítménysűrűség) - rövid fényimpulzusok (piko- femtoszekundum) - kicsi spektrális sávszélesség (monokromatikus) - koherens fényforrás –időben és térben áálandó interferenciakép kialakítására képesek koherenciaidő: tkoh=1/Δν Δν- sávszélesség melyik az a legnagyobb időtartam, amelyen belül a fényforrás által külöböző időpillanatokban kibocsájtott fényhullámok egymással interferenciaképesek térbeli koherencia: S=λ*L/d L- fényforrásnak megfigyelés helyétől vett távolsága d- fényforrás átmérője λ- hullámhossz Lézerműködés fizikai alapjai indukált emisszió Einstein ismerte fel emisszióra kétféle lehetőség: spontán és kényszerített spontán emisszió során a gerjesztett közeg atomjai az energiájukat fény formájában egymástól függetlenül és a tér minden irányában kisugározzák. a kényszerített emisszió az abszorpcióval párhuzamosan fellépő, de azzal ellentet irányú folyamat: a gerjesztett atomok fotontalálat, vagyis külső 24
sugárzási tér hatására sugározzák ki energiájukat. Az indulált emisszió növeli a hullámtér energiáját. A kényszerített emisszió általi növekedés koherens. Az indukált emisszió ugyanabba az irányba halad, mint a kényszerítő sugárzás, valamint frekvenciája és fázisa is ugyanakkora. Î A kényszerített frekvencia irány-, frekvencia- és fázistartó. Populáció inverzió és optikai erősítés populáció inverzió akkor áll fent ha a gerjesztett energianívó benépesítettsége nagyobb, mint az alapszinté. A populáció inverzó létrehozásához energiát kell közölni a rendszerrel, ezt pumpálásnak nevezik. Ez történhet fénnyel, elektronütközéssel, elektromos árammal, kémiai reakcióval. A lézer működése, lézeroszcilátor Stabil, folytonos, előírt tulajdonságokkal rendelkező lézerfény előállításához lézererősítő nem elég, ehhez lézeroszcillátor kell. A lézeroszcillátor az invertált populációjú közeg mellett még pozitív visszacsatolást is tartalmaz, mely oszcillációra vezet. A visszacsatolást a rezonátor valósítja meg. Ez a legegyszerűbb esetben két párhuzamos síktükörből áll, amelyek egyike zárótükör, ez minden fényt visszaver, másik pedig a fény egy részét átengedi, eza kicsatoló tükör. A populáció invertált aktív közeget a rezonátorba helyezik. Az így kapott lézerosszcillátor öngerjesztő. Lézertípusok Szilárdtestlézerek: kristályokba vagy üveganyagokba szennyezőként bevitt fémionok rubinlézer, neodímium-YAG lézer nagy impulzusteljesítmény rövid impulzusidő a neodímium-YAG lézer folytonos üzemmódban is működhet vörös ill. infravöröstarományban sugároznak Gázlézerek Hélium-Neon lézer (infravörös és látható tart) kis teljesítmény alkalmazása: Doppler-visszaverődésen alapuló sebességmérés Szén-dioxid lézer nagy teljesítmény hullámhossztarománya 10μm körüli hangolható lézer (Littrow-elrendezés) 150 ns szélességű impulzusok széles orvostudományi felhasználás Festéklézerek fényerősítő közege szerves festékek híg oldata Széles abszorpciós spektrum a látható tartományban ezért optikailag könnyen gerjeszthetők Festéklézerek pumpálására más impulzuslézer rövid fényimpulzusait, vagy villanólámpát használunk hatásfoka igen nagy 30%
25
teljesítménye 1-100kW néhány ns impulzus idő alatt megközelítheti a gázlézerek divergenciáját impulzusidő femtoszekundunos időtartományig rövidíthető széles tartományú hangolhatóság Lézerek az orvosi gyakorlatban szemészet a lézer fényét a szemfenék vizsgálandó pontjára irányítják Retinaleválás ponthegesztése szemfenék fotokoagulációja Zöldhályog általános sebészet vérzés nélküli operáció lézerszikével széndioxid lézer a sugárzás a szövetekben elnyelődik, akeletkezett hő a sejteket szétroncsolja, elpárologtatja. a vérzés minimális, mert koagulálja az ereket nincs szükség érzéstelenítésre rövidebb gyógyulás nincs hegesedés Urológia neomidium-YAG lézer húgyhólyag, húgycső, hímvessző daganatainak eltávolítása Fogászat nagyenergiájú rubinlézer impulzusok a nagyenergiájú lézer fúróként használható
26
