ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE FAKULTA BIOMEDICÍNSKÉHO INŽENÝRSTVÍ
TÝMOVÝ PROJEKT
2011
Jan Prell
ČESKÉ VYSOKÉ UČENÍ TECHNICKÉ V PRAZE Fakulta biomedicínského inženýrství
Personalizovaná medicína a optimální farmakoterapie Týmový projekt
Vedoucí práce: Studenti:
Ing. Jiří Potůček, CSc. Jan Prell, Miroslav Selčan
Leden 2011
Anotace Cílem práce bylo vyhodnotit farmakokinetický experiment na prasatech připojených na extrakorporální membránovou oxygenaci, který byl proveden na II. interní klinice kardiologie a angiologie Všeobecné fakultní nemocnice v Praze a navrhnout nový, resp. doplňující experiment pro studium kinetiky níže uvedených antibiotik. Hypotéza, kterou měl experiment potvrdit říká, že snížený průtok krve v plicích vede k nižším koncentracím antibiotik v plicích oproti systémovým. Experimentálně se zjišťovaly koncentrace antibiotik vancomycinu a gentamicinu v plicích. Pro simulace kinetiky antibiotik i pro návrh nového experimentu byl z důvodu podobnosti mezi lidskou a prasečí fyziologií použit program MwPharm od firmy Mediware, a.s. Pro vancomycin
byl
využit
jednokompartmentový
model,
pro
gentamicin
byl
využit
dvoukompartmentový. Ze simulací jsme získali doporučené časy odběrů vzorků krve a hodnoty parametrů, ne vždy však s dostatečnou spolehlivostí. Tento nedostatek měl odstranit navržený doplňující experiment. Po provedení simulace tohoto experimentu byly hodnoty některých parametrů sice určeny s vyšší spolehlivostí, u jiných však nebyla dostatečná spolehlivost dosažena. Model je neúplný a příliš zjednodušený. Protože je MwPharm určen pro lidskou fyziologii, není jisté, zda jsou získané výsledky (byť biologicky reálné a dostatečně přesné) přenositelné na fyziologii prasečí.
Annotation The aim of the project was to analyse primarily a pharmacokinetic experiment on pigs connected to extracorporeal membrane oxygenation which was performed in II. internal clinic of cardiology and angiology in Všeobecná fakulní nemocnice in Prague and to design a new one, better a complementary experiment to study kinetics of
the antibiotics mentioned below.
Hypothesis to be confirmed by the experiment said that due to reduced blood flow in the lungs leads to a decreased concentration of antibiotics in the lungs in comparison to the system circulation. Therefore concentrations of antibiotics vancomycin and gentamicin in the lungs were determined experimentally. Because of similarity between human and pig physiology MwPharm programme of Mediware, a.s. was used for simulations of kinetics of antibiotics and for the design of the new experiment too. Vancomycin treatment was modelled by one-compartment method while two-compartment one was used for gentamicin. Performing the simulations we obtained recommended times to collect blood samples and values of parameters, unfortunately sufficient reliability was not achieved in all cases. This problem should be removed by the newly designed experiment. After a simulation of the new experiment the values of some parameters were determined with a greater reliability, but some of them were still not reliable enough. The model seems to be therefore incomplete and simplified excessively. Since MwPharm programme is intended for human physiology, it is not sure whether the obtained results are real in biological principle and determined with sufficient accuracy and then transferable to the physiology of pigs.
Poděkování Autoři by na tomto místě rádi poděkovali vedoucímu projektu, Ing. Jiřímu Potůčkovi, CSc., za podporu a konzultace při práci na projektu. Dále bychom rádi poděkovali MUDr. Olze Matouškové, PhD. za poskytnuté konzultace v oboru personalizované medicíny a genetiky a korekturu rešeršní části; Ing. Jiřímu Doušovi za konzultace
ohledně
programu
MwPharm
a
Ing. Tomáši Boučkovi
a
MUDr. Janu Bělohlávkovi, PhD., z II. interní kliniky kardiologie a angiologie Všeobecné fakultní nemocnice v Praze, za pomoc při interpretaci poskytnutých dat.
ii
Prohlášení
iii
Obsah Anotace Poděkování..................................................................................................................................ii Prohlášení..................................................................................................................................iii Obsah.........................................................................................................................................iv Seznam použitých symbolů a zkratek.........................................................................................v Úvod............................................................................................................................................1 1 Definice a základní principy personalizované medicíny........................................................2 1.1 Definice personalizované medicíny.....................................................................................2 1.2 Základní technologie pro rozvoj personalizované medicíny...............................................3 1.3 Genetické základy personalizované medicíny.....................................................................3 2 Farmakogenetika.....................................................................................................................5 2.1 Molekulární diagnostika ve farmakogenetice......................................................................6 2.2 Farmakogenetika ve farmaceutickém průmyslu..................................................................6 2.2.1 Enzymy vztahující se k metabolismu léčiv.......................................................................7 2.2.2 Genetické variace v transportérech a receptorech.............................................................9 2.2.3 Etnické a pohlavní rozdíly ve farmakogenetice..............................................................10 2.2.4 Význam farmakogenetiky v bezpečnosti léčiv...............................................................10 2.2.5 Fenotypizace, genotypizace............................................................................................12 3 Farmakogenomika.................................................................................................................14 3.1 Farmakogenomika v některých terapeutických oblastech.................................................14 4 Budoucnost personalizované medicíny.................................................................................18 Praktická část............................................................................................................................21 5 Extrakorporální membránová oxygenace (ECMO)..............................................................22 6 Vyhodnocení měření vancomycinu.......................................................................................23 7 Návrh nového experimentu...................................................................................................27 Závěr.........................................................................................................................................29 Seznam použité literatury..........................................................................................................30
iv
Seznam použitých symbolů a zkratek ACE
angiotensin converting enzyme – angiotenzin konvertující enzym
AD
Alzheimer's disease – Alzheimerova choroba
ADR
adverse drug reaction – nepříznivá reakce na léky
ARDS
acute respiratory distress syndrome – syndrom akutní dechové tísně
ATB
antibiotikum
BAL
bronchoalveolární laváž
bp
base pairs – páry bází
CNS
centrální nervová soustava
DNA
deoxyribonukleová kyselina
ECMO
extracorporeal membrane oxygenation – extrakorporální membránová oxygenace
FDA
Food and Drug Administration, organizace ve Spojených státech amerických
HDL
high density lipoprotein – lipoprotein o vysoké hustotě
LDL
low density lipoprotein – lipoprotein o nízké hustotě
PCR
polymerase chain reaction – polymerázová řetězová reakce
RNA
ribonukleová kyselin
SAGE
serial analysis of gene expression – sériová analýza genové exprese
SNP
single nucleotide polymorphism – jednonukleotidový polymorfismus
SSRI
selective serotonin reuptake inhibitor – selektivní inhibitory zpětného vychytávání serotoninu
TK
krevní tlak
v
Úvod Personalizovaná medicína je relativně novou filosofií, východiskem a aplikací vztahu systému zdravotní péče k pacientovi jako k jedinci. Vychází v maximální míře vstříc individuálním potřebám každého pacienta a tím zlepšuje zdravotní péči co se týče diagnózy i terapie. Rešeršní
část
práce
se
zabývá
úvodem
do
personalizované
medicíny,
farmakogenetikou, farmakogenomikou a budoucností personalizované medicíny. V současné době není mnoho ucelených publikací týkajících se personalizované medicíny, spíše jsou to jen kapitoly, popřípadě kratší články ve vědeckých časopisech. Většina literatury je stále řazena pod pojmy farmakogenetiky a farmakogenomiky. Rešerše mimo tyto drobné práce vychází především z jediné ucelené knihy týkající se personalizované medicíny: Textbook of Personalized Medicine od K. K. Jaina. Praktická část se pak zabývá vyhodnocením experimentálních dat získaných měřením koncentrací antibiotik v různých místech a v různou dobu po podání v programu MwPharm. Experiment byl prováděn na prasatech připojených k extrakorporální membránové oxygenaci. Dále se pak zabýváme
návrhem nového, resp. doplňujícího experimentu, pro získání
spolehlivějších parametrů. Důvod, proč byl experiment prováděn, byla hypotéza, že díky sníženému průtoku krve plícemi bude koncentrace antibiotik nižší než v systémovém oběhu. Kvůli prevenci nebo léčbě onemocnění je klíčová dostupnost antibiotik do plic a bude třeba tak upravit dávkování léků. Cílem praktické části projektu bylo získání zkušeností s programem MwPharm, aby bylo v budoucnu v rámci bakalářské práce možno na základě rešeršní části rozšířit MwPharm o farmakogenomický modul. Farmakogenomický modul by v rozhodování o dávkování léčiv bral v potaz genomické parametry jedince.
1
1
Definice a základní principy personalizované medicíny Většina ze současných léků je vyvíjena a schvalována na základě jejich účinku ve
velké populaci a každý z těchto léků je předepisován pacientům s určitou diagnózou. Data z klinických testů a studií nových léků se omezují pouze na průměrné reakce na terapii ve studované skupině pacientů. Nicméně mezi pacienty jsou rozdíly – někteří nevykazují žádnou odpověď na terapii léky, jiní reagují až dramaticky. Důvodem je pouhý 0,1 % rozdíl v sekvenci DNA1, která je jinak mezi dvěma jedinci z 99,9 % (Jain, 2009; Redon et al., 2006; Nussbaum et al., 2004) stejná. V tomto nepatrném rozdílu je klíč k dědičným sklonům k prakticky všem onemocněním. Konvenční medicína je z části založena na zkušenostech lékařů. Nejvíce zřejmé je to na příkladě onemocnění, které vyžaduje více než jeden lék. Výběr léků a jejich dávky2 je zcela na zkušenostech a preferencích lékaře. V některých případech to může vést k neefektivní léčbě nebo k nepříznivým vedlejším účinkům (ADR)3. Mnoho autorů se shoduje, že je třeba individuálnější přístup, než dosud zažitý koncept jednoho léku pro všechny pacienty se stejným
onemocněním
(Jain,
2009;
Mancinelli
et
al.,
2000;
Shastry,
2006;
McCullough, 2006). Cílem personalizované medicíny je najít správný lék pro správného pacienta a v jistých případech i navrhnout léčbu pacienta v závislosti na jeho genotypu a dalších individuálních rysech.
1.1
Definice personalizované medicíny
Zatím není žádná oficiálně uznávaná definice personalizované medicíny. Mnoho literatury vztahující se k personalizované medicíně je stále řazeno pod pojmy farmakogenetika a farmakogenomiky, které jsou zmíněny v kapitolách 2 a 3 této práce. Podle (Abrahams et al., 2005) je personalizovaná medicína „aplikace genomických a molekulárních dat, s cílem lepší zdravotní péče, usnadnění klinického testování nových léčiv 1 DNA sekvence je pořadí nukleotidů v segmentu DNA (Nussbaum et al., 2004). 2 U léčiv se uvádí tzv. účinná dávka. Je však definována jako dávka, která způsobí daný efekt u 50 % populace. 3 Více o ADR viz kapitola 2.2.4.
2
a produktů a určení predispozice pro určité onemocnění nebo poruchu.“ Personalizovaná medicína se dá chápat jako nejvíce vhodná specifická léčba a terapie pro pacienta, ve které hrají důležitou roli genetické faktory a faktory životního prostředí, které mají vliv na reakci organismu na terapii. Personalizovaná medicína umožňuje farmaceutickým společnostem vyvíjet léky, které jsou efektivnější a zároveň mají méně vedlejších účinků. Praktickým lékařům umožňuje efektivněji a bezpečněji využívat stávající léky. Cílem personalizované medicíny je tedy dosáhnout optimálního výběru léku pro pacienta a podaného ve správný čas.
1.2
Základní
technologie
pro
rozvoj
personalizované
medicíny Důležité základy personalizované medicíny pramení z technologií a přístupů uvedených níže v této kapitole. Jedním z přístupů je molekulární diagnostika a to zejména technologie genotypizace4 SNP5. Dalšími základy personalizované medicíny jsou integrace diagnostiky a terapie (hlavně sledování terapie) a bioinformatika, pro zhodnocení a využití dat z různých biotechnologií. Mezi velmi důležité základy patří farmakogenetika, která studuje vliv genetických faktorů na reakci na léky. Dalším z pilířů je farmakogenomika, která aplikuje principy genomiky na vývoj léčiv. S termíny „farmakogenetika“ a „farmakogenomika“ je problém, někteří autoři je rozlišují, někteří ne (detailní rozdíly mezi nimi budou probrány v kapitolách 2 a 3). V neposlední řadě jsou to také farmakoproteomika a farmakometabolomika, které ale nejsou předmětem práce.
1.3
Genetické základy personalizované medicíny
Genetika hraje významnou roli téměř ve všech onemocněních. Riziko nakažení se běžnou nemocí je určeno především prostředím a životním stylem. K celkovému riziku ale přispívají i geny. Například u roztroušené sklerózy má sourozenec postižené osoby ve 4 Více o genotypizaci je uvedeno v kapitole 2.2.5. 5 SNP jsou malé úseky DNA, které se liší jen v jedné bázi.
3
srovnání se zbytkem populace 25krát zvýšené riziko rozvoje nemoci (Jain, 2009). Nejběžnější nemoci jsou způsobeny právě vzájemným působením genů a životního prostředí. Jednotlivé geny a jejich efekty studuje genetika, zatímco genomika studuje jejich strukturu a funkci všech genů v genomu. Sekvenování lidského genomu odhalilo důležité informace studiu genetického základu onemocnění. Identifikace všech lidských genů a jiné pokroky v genetice pomáhají urychlit porozumění molekulárním základům onemocnění a způsobu fungovaní léčiv. Genetické databáze (jako jsou HapMap6 nebo PharmaKBG7, atd.) už nyní pomáhají objasnit funkci genů, odhadnout prevalenci genů v populaci a zjistit, jak geny mohou učinit někoho náchylným nebo ho ochránit před určitým onemocněním (Jain, 2009). Co se týče faktorů ze životního prostředí, mohou onemocnění uspíšit, má-li k němu jedinec genetické dispozice. Nejvíce rozdílných reakcí na farmakoterapii je ale multifaktoriálních, zapříčiněných genetickými i environmentálními faktory (Kalow, 2006).
Obr. 1: Mechanismus, jimiž mutace způsobují onemocnění (Nussbaum et al., 2004).
6 Projekt HapMap se zabývá haplotypovým mapováním lidského genomu. Více na www.hapmap.org. 7 PharmaKBG je veřejná databáze genotypových a fenotypových informací týkajících se farmakogenomiky. Více v práci (Lucinio, 2004).
4
2
Farmakogenetika Farmakogenetika je studium rozdílných reakcí na léčiva na základě genetických
variací mezi jednotlivci (ECGE, 2004; Mancinelli et al., 2000; Shastry, 2006). Studuje vazbu mezi genotypem jednotlivce a jeho schopností metabolizovat cizí sloučeniny. Metabolismus léků je jedním z hlavních determinantů clearence8 léků a je nejčastěji zodpovědný za rozdíly ve farmakokinetice. Role farmakogenetiky ve farmaceutickém průmyslu bude popsána níže v této kapitole. Farmakologický efekt léčiva záleží na farmakokinetice9 a farmokodynamice10. Odhaduje se, že genetika je zodpovědná za 20 – 95 % variability v efektech léků na organismus (Jain, 2009). Genetické polymorfismy v léky–metabolizujících enzymech, přenašečích a receptorech vedou k rozdílům v efektivitě a toxicitě mnoha léčiv mezi jednotlivci. Genetické faktory mají vliv na reakci na léky a jejich efekt a po celý život se nezmění. Přístup
farmakogenetiky
se
rozšiřuje
a
proto
se
někdy
může
prolínat
s farmakogenomikou (Kalow, 2006). Farmakogenomika bude podrobněji probrána
v
kapitole 3. Jak farmakogenetika, tak farmakogenomika jsou velmi důležité pro rozvoj personalizované medicíny. Hlavní rozdíly mezi nimi jsou uvedené v Tab. 1. Farmakogenetika
Farmakogenomika
Zaměření oboru
Variabilita u pacientů
Variabilita účinku léku
Rozsah oboru
Variace sekvencí v ovlivňující reakci na léky
Metody
SNP, profilování genové exprese, Profil genové exprese11 biochemie
Vztah k lékům
Jeden lék, mnoho genomů
Zkoumání efektů léků
Studium jednoho léku in vivo u Zkoumání efektů sloučenin na různých pacientů s genovými expresi genu in vivo nebo in vitro variantami
Předpověď efektivity léku
Nízká
Vysoká
Předpověď toxicity léku
Vysoká
Nízká
genu Celý genom
Mnoho léků, jeden genom
Tab. 1: Rozdíly mezi farmakogenetikou a farmakogenomikou (Jain, 2009). 8 Clearence je veličina, která slouží k zjištění míry glomerulární filtrace. Je to objem krevní plazmy, který se očistí od dané látky za jednotku času. 9 Farmakokinetika studuje distribuci léčiv v organismu v průběhu času po podání (Potůček, 2009). 10 Farmakodynamika zkoumá účinky léků na organismus (žádoucí i nežádoucí). 11 Profil genové exprese je stanovení exprese genu. Slouží k předpovědi léčebného efektu nebo výskytu nežádoucích účinků po podání léku (Matoušková, 2011).
5
2.1
Molekulární diagnostika ve farmakogenetice
Farmakogenetické technologie v personalizované medicíně jsou zobrazeny na Obr. 1.
Obr. 2: Různé technologie ve vztahu k personalizované medicíně (Jain, 2009).
Genetické mutace mohou být vyšetřovány metodami molekulární diagnostiky, například genotypizací. Proces genotypizace se týká identifikace definovaných genetických mutací, díky kterým může vzniknout fenotyp12 se specifickým metabolismem léků. Tyto mutace zahrnují genetické změny vedoucí ke zvýšení exprese (duplikace genu), absence nulové alely, nebo produkce mutantního proteinu se sníženou katalytickou kapacitou.
2.2
Farmakogenetika ve farmaceutickém průmyslu
Geny ovlivňují farmakodynamiku i farmakokinetiku léčiv. Farmakogenetika je klíčová ve třech oblastech farmaceutiky, které mají vztah k rozvoji personalizované medicíny. Pomáhá porozumět metabolismu léčiva a jeho farmaceutickému efektu na organismus. Dokáže také předpovědět geneticky určené ADR. V neposlední řadě pomáhá objevům nových léků a jejich rozvoji a také pomáhá v plánování klinických testů. Většina z léků jsou metabolizovány do nějakého stupně. Metabolismus vede k 12 Fenotyp je vnější projev genů (na fenotyp působí také faktory vnějšího prostředí).
6
detoxikaci nebo eliminaci léku. V některých případech může také vést k aktivaci prekurzoru13 na biologicky aktivní formu. Metabolismus léků ale může bohužel vést k tvorbě toxických metabolitů. Z farmakologického hlediska může být způsob metabolismu léků klasifikován jako Fáze I (oxidace, redukce a hydrolýza) nebo jako Fáze II (acetylace, redukce a hydrolýza). Rozdíly v metabolismu léků zahrnují příčiny jako jsou individuální faktory (věk, pohlaví, váha a tělesný tuk), environmentální faktory (znečištění ovzduší, alkohol a kouření), fyziologické faktory (funkce jater, ledvin, plic a kardiovaskulární soustavy), genetické faktory (polymorfismus léky–metabolizujících enzymů, přenašečů, receptorů a iontových kanálů), současně podávané léky nebo průvodní onemocnění. Možné následky odlišných metabolismů léků jsou například prodloužení nebo zintenzivnění farmakologického efektu; ADR; nedostatečná aktivace prekurzoru; léková toxicita; nedostatečná efektivita předepsané dávky, nutnost jejího zvýšení; metabolizování jinými, často škodlivými cestami; interakce více léků. Znát metabolismus jedince je velmi důležité. Rozdíly v metabolismu mohou vést k závažné toxicitě nebo terapeutickému selhání. Farmakokinetika mnohých léčiv je z největší části určena rozdílnou funkčností jater, popsaná je parametry průtoku krve játry a metabolickou kapacitou.
2.2.1
Enzymy vztahující se k metabolismu léčiv
Pro metabolismus léků jsou velmi důležité enzymy. Zprostředkovávají přeměnu substrátu na produkt. Většina z enzymů jsou bílkoviny (zbytek jsou katalytické RNA, které se účastní úpravy RNA). U lidí existuje více jak 30 skupin enzymů metabolizujících léky a v podstatě každý z nich má své genetické variace (Nussbaum et al., 2004; Jain, 2009). CYP450 Jednou z nejdůležitějších skupin enzymů je skupina CYP450. Enzym cytochrom P450 se účasní syntézy a degradace velkého množství endogenních sloučenin, jako například léčiva, steroidy, cholesterol, vitaminy. Nicméně se účastní i metabolismu exogenních toxinů. Enzymy P450 mohou změnit metabolismus léků a to jak ve smyslu jeho snížení, tak zvýšení. Více než 50 % klinicky užívaných léků je metabolizováno enzymy P450. Většinu z 13 Prekurzor je výchozí látka nebo částice z níž vzniká chemickou přeměnou výsledný produkt.
7
těchto 50 % metabolizují enzymy CYP2D6 a CYP3A4 (isoformy P450) a proto jsou velmi důležité pro vývoj nových léčiv. V Tab. 2 jsou uvedeny hlavní isoformy enzymu P450. Isoforma CYP450
Četnost v metabolismu léků
CYP3A4
50 %
CYP2D6
20 %
CYP2C9
10 %
CYP2C19
5%
CYP1A2, CYP2E1 a neidentifikované formy Tab. 2: Četnost hlavních isoform CYP450.
15 %
Podskupina CYP3A zahrnuje isoformy 3A3, 3A4 a 3A5. Metabolizují mnoho léků, mezi nimi například cyklosporin, erythromycin, lidocain, lovastatin nebo tamoxifen a dále také některé z léků proti rakovině a léky proti odmítnutí transplantátu. Rozdíly v expresi CYP3A přispívají k rozdílné absorbci a clearence léků a rozdílnému účinku blokátorů kalciových kanálů a inhibitorů HIV proteázy. Isoforma CYP2D6 je druhá nejčastější a metabolizuje velké množství léků (cca 60 (Kalow, 2006)). Mezi nejznámější patří kodein, haloperidol, tamoxifen, risperidon, metoprolol nebo tramadol a má také vliv na koncentraci SSRI14 v plazmě. Isoforma CYP2C9 má vliv na katalytické funkce. Při použití například nesteroidních protizánětlivých léků nebo orálních antikoagulancií by měla být zvážena možnost CYP2C9 genotypizace. Mutace isoformy CYP2C19 vede ke špatnému metabolismu (PM) například diazepamu, imipraminu nebo omeprazolu a jiných (Jain, 2009). Isoformy se od jedince k jedinci velmi liší, například CYP3A4 se liší mezi jedinci až 50krát (Jain, 2009). Polymorfismy v CYP3A4 mohou vysvětlit rozdíly v intenzitě a trvání účinku léku a výskyt vedlejších účinků. Porozumění genetickému podkladu rozdílných funkcí CYP3A4 umožní určení dávky léku s optimální terapeutickou odpovědí a minimálními vedlejšími účinky pro každého pacienta. Glukóza-6-fosfát dehydrogenáza Na tomto enzymu byly poprvé (1950) pozorovány rozdílné reakce lidí na léčbu. U pacientů s deficitem G6PD došlo při léčbě antimalariky k hemolýze15. V současné době 14 SSRI jsou antidepresiva III. generace, brání zpětnému vychytávání serotoninu ze synaptické štěrbiny. 15 Hemolýza je porušení plazmatické membrány erythrocytu – vede k jeho předčasnému zániku.
8
existuje mnoho léků, které způsobují hemolytickou anémii při G6PD deficitu, např. primaquin nebo sulfonamidy (Nussbaum et al., 2004; Jain, 2009; Mancinelli et al., 2000). Deficit G6PD je velice rozšířený polymorfismus s více než 400 variantami a postihuje více než 400 miliónů lidí na světě (Nussbaum et al., 2004; Jain, 2009). N-Acetyltransferáza NAT je jaterní enzym Fáze II. Na jedince s fenotypem pomalé acetylace často působí toxicky léky jako jsou isoniazid16 nebo hydralazine17, zatímco jedinci s fenotypem rychlé acetylace nemusí na léčbu těmito léky vůbec reagovat. Jedinci s fenotypem pomalé acetylace mají při léčbě isoniazidem obvykle vysokou hladinu isoniazidu v plasmě a trpí poškozením periferních nervů, zatímco jedinci s fenotypem rychlé acetylace ohroženi nejsou. Fenotyp pomalé acetylace je autosomálně recesivní a jsou zde výrazné etnické rozdíly. Odhaduje se, že přibližně 40 – 60 % bělochů je ohroženo toxicitou léků, protože mají fenotyp pomalé acetylace (Mancinelli et al., 2000). Nejdůležitější polymorfismy enzymu kóduje lokus genu NAT2 a tyto varianty jsou spjaty se zvýšeným rizikem rakoviny.
2.2.2
Genetické variace v transportérech a receptorech
Transportéry18 se účastní přenosu proteinů, peptidů, aminokyselin, iontů a některých léků. Právě transport proteinů hraje významnou roli v regulaci absorbce, distribuce a exkrece mnoha léků. Membránové transportéry kóduje mnoho genů a jejich defekty mohou vést ke změnám v absorbci léků (McCullough, 2006; Shastry, 2006). Jedním z membránových transportérů je P-glykoprotein (multidrug resistance protein, MDR-1), který vytěsňuje některé léky z buněk. Také genetické variace receptorů mohou mít vliv na efektivitu léčiv, variace v neurotransmiterových receptorech mohou vést až k selhání léčby. Příklady polymorfismů v genech kódujících receptory a jejich vliv na reakci na léky jsou uvedeny v Tab. 3.
16 Isoniazid se užívá při léčbě tuberkulózy. 17 Hydralazine se užívá při léčbě hypertenze. 18 Transportér se na jedné straně membrány naváže na transportovanou molekulu a na druhé straně se od ní opět oddělí. Pro transport je třeba koncentračního spádu, jako při difuzi (Silbernagl, Despopoulos, 2004. s. 23.).
9
Gen nebo produkt genu
ACE (Angiotensin Converting Enzyme)
Léčivo
Efekt
ACE inhibitory
Renoprotektivní efekt, snížení TK, redukce svaloviny levé komory
Fluvastatin
Snížení hladiny LDL cholesterolu s regresí koronární aterosklerózy
β2-agonisté19
β2-adrenergní receptor
Bronchodilatace 20
Estrogenové receptory
Konjugované estrogeny , substituční hormonální terapie
Zvýšení hustoty minerálů v kostech, zvýšení HDL cholesterolu
Glykoproteiny IIb, IIIa
Aspirin nebo inhibitory Antikoagulační efekt glykoproteinů IIb a IIIa Tab. 3: Polymorfismy v genech kódujících receptory a jejich význam pro léčbu (Jain, 2009).
2.2.3
Etnické a pohlavní rozdíly ve farmakogenetice
Etnické rozdíly v metabolismu léčiv jsou velmi dobře dokumentovány pro mnoho léků. Genotypizace etnik dokazuje rozdílné frekvence mutací alel. Několik studií dokazuje, že etnické rozdíly v metabolismu jsou zprostředkovány především enzymy CYP2D6 nebo CYP2C19. V bělošské populaci má 93 % jedinců normální metabolismus, 7 % špatný metabolismus a méně než 1 % má ultrarychlý metabolismus. Pro porovnání, například orientálci mají ve své populaci pouze 1 % jedinců se špatným metabolismem (Jain, 2009). Etnický původ je proto velmi důležitý a měl by se brán v úvahu při individualizaci farmakoterapie. Pohlavní rozdíly ve farmakogenetice nebyly prokázány, existují ale jisté rozdíly ve farmakokinetice léčiv. Například muži mají aktivnější enzymy CYP1A2 a CYP2E1. Ženy mají aktivnější CYP2D6.
2.2.4
Význam farmakogenetiky v bezpečnosti léčiv
Variabilita v reakci na léky se mezi pacienty liší, někdy velmi významně. Variabilita je dána více faktory, včetně environmentálních a genetických a je základním problémem v klinické praxi, který zahrnuje selhání léčby, ADR a lékové interakce. Náchylnost k nepříznivým reakcím na léky se liší v závislosti na genetické výbavě jedince a dále pak jeho pohlaví, věku, fyziologii, exogenních faktorech a také stádiu nemoci. 19 β2-agonisté působí na β2-adrenergní receptor a způsobují relaxaci hladkého svalstva a tím dilataci bronchů, vazodilataci ve svalech a játrech, relaxaci svalů močového měchýře a uvolnění inzulinu. 20 Konjugované estrogeny jsou směs estrogenů užívaných např. při léčbě menopausálních symptomů.
10
ADR mohou být různě závažné, od nepříjemných pocitů až k život ohrožujícím reakcím. ADR je velkým problémem u dětí, ať již narozených nebo ne. Děti jsou náchylnější k rozvoji ADR než dospělí, například při terapii anticholinergními prostředky21 (Jain, 2009). Děti mohou být vystaveny lékům již při nitroděložním vývoji nebo při kojení a ADR může negativně ovlivnit rozvoj jejich centrální nervové soustavy, dále může způsobit kognitivní problémy, kardiovaskulární abnormality aj. Jedním z důvodů vysokého výskytu ADR je, že dosavadní farmaceutický průmysl nerespektuje genetickou variabilitu ve farmakokinetice a farmakodynamice potenciálních pacientů. Polymorfismus genů, které kódují léky–metabolizující enzymy, transportéry, receptory a iontové kanály mohou ovlivnit riziko ADR nebo mohou ovlivnit účinnost léčby (Jain, 2009). Riziko výskytu ADR se zkoumá na mutantních alelách lokusu jednoho genu. Tyto mutace produkují fenotypy jedinců, kteří špatně metabolizují nebo ultrarychle metabolizuji některé léky. Příklady ADR s farmakogenetickým základem jsou uvedeny v Tab. 4. Lék
ADR
Gen/mutace
Azathioprine
Karcinogenita
Thiopurin methyltransferáza
Fluorouracil
Zvýšená neurotoxicita
Dihydropyrimidin dehydrogenáza
Inhalační anestetika
Maligní hypertermie
Ryanodinový receptor
Inhibitory protonové pumpy
Snížená efektivita léčby vředů
CYP2C19
Sulfonal
Porfyrie
Porfobilinogen deamináza
Warfarin
Snížený clearence léků vedoucí ke CYP2C9 krvácení
Tab. 4: Příklady ADR farmakogenetickým základem.
Většina z ADR je nepředvídatelná a díky její vzácnosti se nemusí projevit v klinických testech s několika tisíci pacienty. Proto jsou také využívány jiné biomarkery22. Například CYP2C9 se využívá k predikci ADR u tricyklických antidepresiv23 v 5 – 7 % případů nebo enzym UGT1A1*28 k predikci ADR irinotecanu24 až ve 30 – 40 % případů. Dále se využívají například protilátky HLA-B*5701, HLA-B*1502 nebo HLA-DRB1*07. V jistých situacích 21 Anticholinergní prostředky působí proti acetylcholinu, např. atropin. 22 Více o biomarkerech je v kapitole 18 práce (Turck C. W., 2008). 23 Tricyklická antidepresiva (TCA) jsou nejstarším typem antidepresiv, zabraňují zpětnému vychytávání neurotransmiterů. Mají více vedlejších účinků než antidepresiva novějších generací (např. SSRI). 24 Irinotecan se používá např. při léčbě kolorektálního karcinomu.
11
může genotypizace zamezit použití léku u pacienta s náchylností k ADR. Jinak pomáhá k nastavení optimální dávky léku, jako u warfarinové terapie, kterou jsem vybral jako příklad využití farmakogenetiky v léčebné terapii. Warfarin je jeden z nejběžnějších orálních antikoagulancií pro léčbu a prevenci tromboembolických příhod. Využití warfarinu je široké, od prevence tvorby trombů při fibrilaci síní až po léčbu hluboké žilní trombózy dolních končetin25. Má však velké množství vedlejších účinků (krvácení, nekróza, osteoporóza) a interaguje s celou řadou léků. Je také antagonistou vitaminu K, takže je třeba také upravit jídelníček pacienta (SÚKL, 2010a). V neposlední řadě je zde také množství kontraindikací warfarinu, například těhotenství26, žaludeční vředy nebo nedávné mozkové krvácení27. Předpovědět správnou dávku warfarinu je obtížné a rozsah bezpečné dávky se mezi jedinci velmi liší. V současné době se účinnost warfarinu určuje Quickovým testem (INR test), kdy se při pravidelných kontrolách pacienta určuje kolikrát déle trvá sražení krve pacienta ve srovnání s normální dobou srážení. Doba srážení se při warfarinové terapii udržuje 2-3x delší oproti normálu. Při kratší době se dávky zvyšují a naopak. Znalost genotypu varianty alely kódující enzym CYP2C9 může pomoci určit optimální dávku dříve a minimalizovat krvácivé komplikace u pacientů, kteří citlivě reagují a potřebují nižší dávku. Proto vydala americká agentura FDA v roce 2007 doporučení, u pacientů s genetickou variací v genu CYP2C9 a VKORC1 by měla být užita nižší dávka warfarinu. Důkaz vlivu CYP2C9 a VKORC1 zajistil přeštítkování warfarinu tak, aby štítek obsahoval genomické informace a informace k testování (jsou schváleny testy Verigene® Warfarin Metabolism Nucleic Acid Test, respektive Verigene® F5/F2/MTHFR Nucleic Acid Test, pro detekci variant CYP2C9 a VKORC1, respektive pro detekci genových mutací souvisejících s poruchami koagulace). Toto doporučení je milníkem v personalizované medicině, který ji uvedl do popředí (Jain, 2009).
2.2.5
Fenotypizace, genotypizace
Fenotypizace je metodou, kdy se pacientovi podá testovací lék o známém metabolismu, který je závislý jedině na specifických léky–metabolizujích enzymech. 25 Více viz (SÚKL, 2010a). 26 Warfarin má silné teratogenní účinky. 27 Více viz (SÚKL, 2010a).
12
Následuje pak měření metabolického poměru mezi dávkou léku a hladinou metabolitů v séru nebo moči (Jain, 2009). Fenotypizace je důležitá pro porozumění mechanismu nemoci, odlišnostem v jejím průběhu a reakcích pacientů na terapii a je třeba pro porozumění biologickým funkcím genu. Genotypizace zahrnuje identifikaci genetických mutací, které dávají vzniknout fenotypu se specifickým metabolismem léčiv. Mutace jsou popsány v kapitole 2.1. Genotypizace má 100 % jistotu v detekci enzymů CYP2D6 poškozených z genetických důvodů a je proto preferovanou metodou. Fenotypizace (jistota 98 %) poskytuje informace o funkci CYP2D6, jestli je ovlivněna genotypem nebo získaným jaterním onemocněním. Nicméně fenotypizace se úspěšně používá u maligní hypertermie, porfyrií a nedostatku G6PD (Jain, 2009). Příklady využití genotypizace a fenotypizace u některých onemocnění jsou uvedeny v Tab. 5. Onemocnění
Klinické projevy
Deficit α1-antitrypsinu (AAT)
Urychlující faktory
Fenotypizace
Genotypizace
Časný nástup emfyzému Kouření a jaterního selhání
Koncentrace α1-antitrypsinu v plasmě
> 30 mutací AAT genu na chromozomu 14q31-32.3
Cystická fibróza
Hromadění hustého, lepkavého hlenu v dýchacích cestách
Onemocnění jater
Koncentrace chloridů v potu
> 1000 mutací genu CFTR na chromozomu 7q31
Deficit G6PD
Opoždění růstu, hypoglykémie, intravaskulární hemolýza
Léky – antimalarika, sulfonamidy, quinidin
Absence fluorescence erytrocytů indukované UV zářením
Místní mutace genu G6PD na chromozomu Xq28
Tab. 5: Příklady využití genotypizace a fenotypizace (Jain,
2009).
Genetické polymorfismy odkazují na tři hlavní fenotypy, které jsou rozděleny na základě jejich vlivu na metabolismu léčiv. Další skupinou jsou jedinci s částečně nebo úplně deficitním metabolismem, tj. středně rychlí metabolizátoři a pomalí metabolizátoři (IM – intermediate metaboliser a PM – poor metaboliser). V jejich genotypu pozorujeme deleci jedné nebo obou alel, toto je příčinou hromadění léků, které jsou substrátem pro daný enzym. Následkem je nedostatečný farmakoterapeutický efekt a vysoký výskyt nežádoucích účinků (Matoušková, 2011). Poslední skupinou je ultrarychlý metabolismus (UM – ultrarapid metaboliser), který vede ke zvýšenému metabolismu léků. 13
3
Farmakogenomika Genomem je nazýván kompletní genetický materiál organismu, tj. kompletní DNA
sekvence. Genomika studuje všechny geny v organismu a jejich sekvence, strukturu, regulaci, interakce a produkty. Sekvenování lidského genomu napomohlo porozumění genetickým základům nemocí a poskytlo nové cíle pro vývoj nových léků. Farmakogenomika je jedním ze základních pilířů personalizované medicíny a využívá genetické sekvence a genomických informací k snažším rozhodnutím ohledně farmakoterapie. Genetická sekvence a genomické informace mohou být jak o pacientovi (zdravém i nemocném), tak o patogenním organismu. Farmakogenomika aplikuje znalosti z genomiky na vývoj léčiv. To také zahrnuje mechanismus, jak některá léčiva mění expresi genu, včetně léky–metabolizujících enzymů (fenomén indukce). Farmakogenetika má nezanedbatelný vliv na všechny fáze vývoje léků. Pomáhá také při návrhu klinických studií a slibuje tak vývoj bezpečnějších a efektivnějších léků a snaží se odstranit „odhadovaní“ správného léku a dávky lékaři (lékaři by měli v klinické praxi testovat pacienty na specifické SNP, které pomohou určit nejlepší lék pro pacienta). Farmakogenomika mj. objasňuje dědičnou povahu rozdílů v rozmístění („drug disposition“) a efektivitě léků (Mancinelli et al., 2000), čímž zlepšuje jejich vývoj. Nemá ale vliv pouze na nově vznikající léky, ovlivňuje i schválené a používané léky – zejména ty, které jsou velmi toxické nebo mají omezenou účinnost. Právě zde farmakogenomika umožňuje vybrat jedince, u kterých bude daný lék účinný a netoxický (Mancinelli et al., 2000).
3.1
Farmakogenomika v některých terapeutických oblastech
Jednou z hlavních terapeutických oblastí, kde je farmakogenomika využívána, je onkogenomika.
Onkogenomika
se
zabývá
studiem
genů,
způsobujících
rakovinu
(rakovinných genů). Rakovina je multifaktoriální onemocnění, které zahrnuje vzájemné působení environmentálních, hormonálních a dietních vlivů v kombinaci s genetickými predispozicemi. Vývoj buňky z normálního do neoplastického stavu vždy zahrnuje sérii genetických 14
změn, které změní buď regulaci nebo funkci genu. Tyto rakovinné geny se dělí do dvou hlavních kategorií, na onkogeny a tumor supresorové geny. Rozdíl mezi nimi je ten, že vývoj tumoru je u onkogenů podporován overexpresí (zvýšenou expresí genu) nebo nárůstem funkce, naopak u tumor supresorových genů nonexpresí (žádnou expresí genu) nebo ztrátou funkce. Onkogeny jsou geny spojované s neoplastickou proliferací28 následované mutací nebo odchylkou v jejich expresi. Tyto změny vedou k abnormální stimulaci buněčného dělení a proliferace. Onkogeny mají na buněčné úrovni dominantní efekt, tzn. že při aktivaci nebo zvýšené expresi stačí jedna mutantní alela ke změně fenotypu buňky z normálního na maligní (Nussbaum et al., 2004). Tyto geny zahrnují mj. také růstové hormony, receptory, G-proteiny, proteinkinázy nebo transkripční faktory. Tumor supresorové geny („anti-onkogeny“) jsou buněčné geny, které regulují buněčný růst tak, že působí proti onkogenům. Jejich přesná role ještě nebyla definována, nicméně in vitro důkazy jednoznačně podporují jejich existenci (Jain, 2009). Některé přímo regulují buněčný cyklus (tzv. gatekeepers), jiné jsou zapojeny v opravě poškozené DNA (tzv. caretakers) (Nussbaum et al., 2004). Příklady genů jsou uvedeny v Tab. 6.
28 Neoplastická proliferace je šíření nádorových buněk.
15
Geny
Chromozomální lokace Funkce
Související tumory
BRCA1
17q21–22
Neznámá
Zděděný sklon ke karcinomu prsu a vaječníků
BRCA2
13q12–13
Neznámá
Dědičný karcinom prsu
CDK4
12q13
Cyklin-dependentní kináza29
Dědičný melanom 2
DCC
18q21
Buněčná adheze (přilnavost) k povrchům
Kolorektální karcinom
FHIT
3p24.3
Tumor supresorový gen změněný vystavením činidlům prostředí
50 % gastrointestinálních rakovin
RB1
13q14
Regulace transkripčních faktorů, regulace buněčného cyklu
Retinoblastom
TSC2
16p13
Neznámá
Tuberózní skleróza 2
WT1
11p13
Zinc finger-transkripční faktor30
Wilmsův tumor, nefroblastom
Tab. 6: Některé z tumor supresorových genů, jejich lokace, funkce a související tumory (Jain, 2009).
Další z terapeutických oblastí je kardiogenomika (nebo také kardiovaskulární genomika). Popisuje geny související s kardiovaskulárními poruchami a užívá genomické technologie (PCR31, microarrays32 nebo SAGE33) pro diagnózu a léčbu těchto onemocnění. Technologie molekulární genetiky poskytují dostatečně citlivé a efektivní genetické testy pro určení genů kódujících odlišné metabolismy léků, ale také pro identifikaci genů souvisejících s dědičnými kardiovaskulárními poruchami. Další velkou terapeutickou skupinou je neurogenomika, jejíž důležitou součástí jsou farmakogenomika Alzheimerovy choroby (AD), depresí a schizofrenie. Neurogenomika se zabývá neurologickými a psychiatrickými poruchami. Porozumění genům v nervovém systému a mechanismu účinku léků, pomáhá porozumění neurologickým a psychiatrickým poruchám. Jak bylo výše zmíněno, Alzheimerova choroba je jedním z neurologických 29 Skupina kináz regulujících buněčný cyklus. 30 Zinc finger-transkripční faktor je regulační protein, který se s vysokou specifičností váže na DNA a reguluje aktivaci nebo potlačení transkripce genu do mRNA (Matoušková, 2011). 31 PCR je metoda rychlého a snadného zmnožení úseku DNA založená na principu replikace. 32 Microarrays jsou nástroje umožnující současné testování až desítek tisíc genů v jediném vzorku (Šeda et al, 2006). 33 SAGE umožňuje stanovení exprese velkého množství genů současně. Cílem metody je zjistit komplexní soubor genů, které slouží jako kandidátní geny pro identifikaci určité diagnózy (Matoušková, 2011).
16
onemocnění. AD je polygenní porucha nejasného původu. Nicméně u ní bylo identifikováno několik genů a polymorfismů, u kterých se zkoumá do jaké míry jsou rizikové pro rozvoj onemocnění. Část pacientů má familiární AD, která se dědí autosomálně dominantně a byly zjištěny tři geny související s časným nástupem onemocnění – geny, které kódují β-amyloidový prekursorový protein, presenilin 1 a presenilin 2. Zbytek pacientů (většina) jakéhokoliv věku má nefamiliární AD, u které nebyly zjistěny žádné mutace genů pro β-amyloidový prekursorový protein nebo presenilin. Jsou zde ale ještě další genetická rizika, která jsou spjata s AD. Například varianty v genu ApoE, který kóduje apolipoprotein E, složku LDL. ε4 alela tohoto genu kóduje apolipoprotein, který významně zvyšuje riziko pozdní nástup nefamiliární formy onemocnění. Tato alela je proto primárním cílem farmakogenomických studií (Jain, 2009). Mechanismus ukládání plaku v mozku je popsán v knize (Nussbaum et al., 2004, s. 230 – 232, 293 – 294)
17
4
Budoucnost personalizované medicíny Na základě současného pokroku v biotechnologiích a molekulární medicíně, jsou
významné pokroky a průlomy očekávány v druhé dekádě 21. století. To zahrnuje mj. vývoj v hledání léků na rakovinu, které z ní udělají chronické zvládnutelné onemocnění. Mnohé pokroky mohou být učiněny díky nanotechnologiím nebo buněčné terapii, zvláště využitím kmenových buněk. Tkáňové inženýrství by mohlo být schopno opravit poškozenou CNS nebo srdeční vady (Jain, 2009). Velký přínos personalizované medicíny se očekává zejména v oblastech onkologie, kardiovaskulárních a zánětlivých onemocnění, v oblastech neurologických a psychologických poruch, při léčbě bolesti a Parkinsonovy nemoci, u virových infekcí a dalších různorodých onemocnění (Jain, 2009). Pokroky v molekulární diagnostice a objevy mnohých biomarkerů by mohly usnadnit její vývoj. Mezi důležité pokroky, kterých je potřeba dosáhnout, patří například porozumění patomechanismu většiny ze současně známých onemocnění na molekulární úrovni, integrace dat z výzkumů a komerčních zdrojů do klinické praxe, vyřešení etických problémů, využití farmakogenetiky pro zjišťování rizik ADR ((Wedlund et al., 2001) odhadují, že se testy na ADR dostanou do klinické praxe během 10 – 20 let) atd. Další z oblastí budoucího využití personalizované medicíny by mohla být prediktivní medicína, která předpoví riziko onemocnění u jedince. To souvisí také s preventivním přístupem k onemocnění a s léčbou nemoci, která se plně nerozvinula. Postupem času, který je třeba na diagnózu onemocnění, se mohou udat nezvratné změny v organismu. Šance na vyléčení nemoci, jako například rakoviny, by se tímto postupem měly zvýšit. Pokroky v molekulární diagnostice, proteomice, metabolomice a dalších usnadňují rozvoj testů pro prediktivní medicínu. Včasná diagnóza a léčba by tedy mohly vést k podstatnému snížení mortality daného onemocnění a také k redukci nákladů na léčbu a péči. V současné době jsou také určité výhrady k hodnotám genetických testů u predikce multifaktoriálních onemocnění. Genetické testování může zdokonalit předpověď k jaké nemoci máme predispozice, přibližný čas manifestace, její trvání a závažnost, stejně jako pomůže vybrat, která léčba a která léčiva budou nejefektivnější.
18
Novou oblastí pro využití personalizované medicíny by mohla být farmakotypizace. Farmakotypizace je podle (Vozirianakis, 2007) praktickým lékařem individualizovaný výběr a dávka léku, na základě vyhodnocení pacientova genotypu a haplotypu, současně s farmakokinetikou a farmakodynamikou léku. To by znamenalo přesun rozhodnutí o výběru léku od lékaře (často jen na základě jeho zkušeností nebo preferencí) k rozhodnutí, které je založeno na genetických informacích o pacientovi. Další rozvoj personalizované medicíny se dá předpokládat po dokončení haplotypového mapování lidského genomu (projekt HapMap), kde bude možno nalézt rizikové haplotypy pro konkrétní lék nebo lékovou skupinu (Šeda et al., 2006). Pokroky na poli farmakogenetiky a farmakogenomiky poskytnou a již poskytují základ pro rozvoj lepších léků a jejich optimální výběr a dávku pro maximalizaci jejich efektu a minimalizaci jejich toxicity na základě genetických a genomických testů. I když zatím v praxi není vůbec běžné, aby se před nasazením konkrétní léčby testovaly genetické varianty, medicína v tomto směru přece jen pokročila. Dříve byla například prognóza jakéhokoli karcinomu jasně daná orientačním patologickým vyšetřením nebo histologií a zpravidla následoval okamžitý chirurgický zákrok jako jediné možné řešení. Při léčbě maligních onemocnění se farmakogenomika stává nezastupitelnou (rozhodnutí o optimální léčbě – zda je výhodnější chirurgické, radioterapeutické nebo chemoterapeutické řešení) a její vliv na ostatní oblasti medicíny dále narůstá (Cascorbi, 2010). Farmakogenomika je už nyní využívána v klinických testech a stane se standardem, protože farmaceutické společnosti, které farmakogenomické a farmakogenetické testy budou používat, budou oproti ostatním ve výhodě (Jain, 2009; Mancinelli et al., 2000; McCullough, 2006). Podle (Frueh, 2008) se díky farmakogenomickým výzkumům podařilo změnit už 10 % štítků na lécích tak, aby obsahovali farmakogenomické informace. Kompletní seznam je dostupný na internetových stránkách FDA34. Jain (2009) a Mancinelli et al. (2000) ve svých pracech píší, že personalizovaná medicína by měla být široce dostupná do roku 2010. (Khoury, 2010) tvrdí, že éra personalizované medicíny již přišla, jen je zde stále propast mezi novými objevy a jejich klinickým využitím, což je v souladu s názorem Šedy (2006), který se domnívá že, „proces přechodu od globálně aplikovaných léků na danou nemoc k lékům pro konkrétního pacienta v 34 http://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ResearchAreas/Pharmacogenetics/ucm083378.htm
19
rámci individualizované medicíny bude patrně jen velmi pozvolný.“ Ne všechny onemocnění ale potřebují personalizovanou medicínu. Aplikace nových technologií závisí na úsudku a rozhodnutí lékaře v každém z případů. Personalizované postupy budou dostupné a jejich využití se bude očekávat v případech, kdy budou považovány za vhodné. Jain (2009) v závěru své práce slevuje ze svého předchozího odhadu, při dobrých vyhlídkách bude širší přijetí personalizované medicíny možné do roku 2013 v USA, resp. 2015 ve Velké Británii.
20
Praktická část V praktické části se budeme zabývat farmakokinetikou antibiotik (ATB) – vancomycinu a gentamicinu. Cílem projektu bylo v první řadě vyhodnotit měření farmakokinetiky výše uvedených ATB v programu MwPharm. Experimentální data nám poskytla koronární jednotka II. Interní kliniky Všeobecné fakultní nemocnice v Praze, kde prováděli experiment dostupnosti výše uvedených ATB do plic, při napojení na extrakorporální membránovou oxygenaci (ECMO). V druhé řadě bylo úkolem navrhnout nové uspořádání experimentu tak, aby nově získaná data byla přijatelně přesná. Experiment byl prováděn na prasnicích, každá o váze ± 50 kg. Bylo podáno 500 mg vancomycinu v půlhodinové infuzi. Po podání infuze byly měřeny koncentrace vancomycinu v plasmě, a to po 30 a 60 minutách. Vzorky byly odebrány z ECMO oběhu, arterie a plicnice. Dalším parametrem vzorky z bronchoalveolární laváže (BAL), ve kterých se dá koncentrace vancomycinu také dobře detekovat. Hypotéza experimentu byla, že díky sníženému průtoku krve v plicích budou koncentrace ATB v plicích nižší než systémové.*
* Vzhledem k časté záměně malého písmena L s číslem 1 bude pro označení litru použito velké písmeno L.
21
5
Extrakorporální membránová oxygenace (ECMO) Extrakorporální membránová oxygenace je invazivní záchrannou metodou v léčbě
těžkého respiračního nebo kardiálního selhání u dětí a novorozenců – umožňuje dočasně nahradit funkci srdce a plic. V posledních letech je stále více využívána u dospělých (Bělohlávek et al., 2010). Jedná se o jistý druh mimotělního oběhu (Obr. 3), kdy pomocí jednoho katétru je ze žilního systému odebírána krev, která je následně hnána přes oxygenátor a pumpována zpět do těla do žilního nebo arteriálního systému cestou druhého katétru. Rozdíl od klasického mimotělního oběhu je, že ECMO se používá po dobu i několika dní a je třeba pouze lokální anestezie. Podpora ECMO systémem může být zahájena velice rychle a umožňuje tak překlenutí doby potřebné pro rozhodnutí o dalším postupu. Nejčastější indikací k ECMO podpoře je podle (Bělohlávek et al., 2010) postkardiotomický kardiogenní šok, těžké ARDS a kardiogenní šok u infarktu myokardu s rupturou komorového septa. Jak již bylo výše zmíněno, existují dva druhy přístupu: veno-arteriální (V-A) a veno-venózní (V-V). V-A přístup se indikuje převážně u kardiálního selhání, V-V přístup se používá v případě respiračního selhání. Cílem této léčby je prevence rozvoje multiorgánové dysfunkce nebo selhání, stabilizace orgánových funkcí a umožnění spontánní úpravy funkce poškozených orgánů a získání času k rozhodnutí o dalším postupu (zvážení použití dlouhodobějších podpůrných systémů, transplantace orgánů atd.) (Bělohlávek et al., 2010).
Obr. 3: Schémata přístupů ECMO oběhu.
22
6
Vyhodnocení měření vancomycinu Vancomycin je glykopeptidové ATB používané k profylaxi i léčbě infekcí
způsobovaných grampozitivními bakteriemi. Léčba vancomycinem je jednou z posledních možností v případech, kdy ostatní, méně toxická ATB selhala. Vancomycin působí proti správné syntéze buněčné stěny u grampozitivních bakterií (SÚKL, 2010b). Jak bylo uvedeno v úvodu praktické části, vancomycin byl při experimentu podán ve formě infuze, a to 500 mg za půl hodiny. Simulace (křivka) v programu MwPharm (Obr. 4) ukazuje časový průběh koncentrace léčiva v plasmě v ECMO oběhu za předpokladu, že individuální farmakokinetické parametry pacienta odpovídají populačním farmakokinetickým parametrům. Z odchylek bodů vyznačujících hodnoty pozorovaných koncentrací od simulační křivky můžeme pozorovat, jak se pacientovy individuální farmakokinetické parametry liší od populačních.
Obr. 4: Simulace časového průběhu koncentrace vancomycinu v krevní plasmě. Farmakokinetické parametry pacienta odpovídají populačním.
Na Obr. 5 je zobrazena optimalizace křivky upravena dosazením hodnot parametrů získaných optimalizací – metodou nejmenších čtverců. Pro optimalizaci jsou třeba okamžiky měření s naměřenými koncentracemi vancomycinu. Na základě zadaných koncentrací v různých okamžicích lze simulační křivku optimalizovat – přizpůsobit hodnotám změřeným přímo u pacienta. Výstupem optimalizace jsou individuální parametry pacienta (Tab. 7). 23
Obr. 5: Křivka optimalizace.
Individuální parametry
Hodnota
Distribuční objem V1 [L/kg]
0,443
Metabolická clearence CLm [L/h/m2]
1,153
Eliminační konstanta fr [–]
1,624
Tab. 7: Tabulka individuálních parametrů a jejich číselných hodnot získaných optimalizací.
Vhodné okamžiky měření a oblasti spolehlivosti pro individuální parametry jsou zjišťovány z analýzy citlivostní funkce (Obr. 6). Vhodné okamžiky měření (exaktně vypočtené) jsou uvedeny v Tab. 8 a výsledky výpočtů oblasti spolehlivosti spolu s příslušnými hodnotami parametrů jsou v Tab. 9.
24
Obr. 6: Analýza citlivostní funkce.
Doporučené časy měření 5 min 17 s
30 min
30 min 14 s
36 min 58 s
4 h 24 min
Tab. 8: Doporučené časy odběrů vzorků určené z citlivostní analýzy.
Parametr
Hodnota
Relativní interval spolehlivosti
Clm [L/h/m2]
1,153
691472,606 %
V1 [L/kg]
0,443
0,003 %
fr [–]
1,624
0,252 %
Tab. 9: Hodnoty parametrů a jejich intervaly spolehlivosti.
Z Tab. 9 je vidět, že naměřené 2 vzorky k určení parametru metabolické clearence CLm nestačí. Distribuční objem V1 a eliminační konstantu fr je možno určit s dostatečnou spolehlivostí. V době práce na tomto projektu nebyly k dispozici hodnoty z dalších měření a proto se musely využít koncentrace vypočítané programem MwPharm. Pro určení parametru metabolické clearence CLm tedy dosadíme do námi zjistěných vhodných okamžiků měření hodnoty koncentrací ze simulace. Po provedení citlivostní analýzy vyšel interval spolehlivosti parametru CLm 460,384 %, což stále není uspokojující. Parametr je z dostupných hodnot neurčitelný.
25
Obdobně jsme postupovali při analýze vzorku získaných z arterie a plicnice. Souhrn dat z ECMO oběhu je uveden v Tab. 10, z arterie v Tab. 11 a z plicnice v Tab. 12.
ECMO Parametr
Hodnota
Relativní interval spolehlivosti
Clm [L/h/m2]
1,153
460,384 %
V1 [L/kg]
0,443
0,003 %
fr [–]
1,624
0,252 % 5 min 30 min
Doporučené časy odběrů vzorků
31 min 37 min 4 h 24 min
Tab. 10: Souhrn dat z ECMO oběhu.
Arterie Parametr
Hodnota
Relativní interval spolehlivosti
Clm [L/h/m2]
11,419
3,38 %
V1 [L/kg]
0,329
0,027 %
fr [–]
7,037
105,406 % 4 min 5 min
Doporučené časy odběrů vzorků
7 min 8 min 12 min
Tab. 11: Souhrn dat z arterie.
Plicnice Parametr
Hodnota
Relativní interval spolehlivosti
Clm [L/h/m2]
0,921
95,724 %
V1 [L/kg]
0,401
0,004 %
fr [–]
1,562
0,151 % 5 min 8 min
Doporučené časy odběrů vzorků
16 min 37 min 3 h 57 min
Tab. 12: Souhrn dat z plicnice.
26
7
Návrh nového experimentu Jak je možno vidět z Tab. 10 – 15 předchozích dvou kapitol, původní dva vzorky k
určení některých parametrů nestačí. Potůček (2009) ve své práci píše, že počet experimentálně naměřených hodnot musí být větší nebo roven počtu parametrů. Z toho plyne, že dvě naměřené hodnoty nemohly stačit k určení tří parametrů (CLm, V1 a fr). Dále píše, že okamžiky měření t1, … , tn volíme tak, aby byly relativní intervaly spolehlivosti nejlepší (tzn. optimálně menší než 60 %). Pro získání parametrů s lepší spolehlivostí byly z analýzy citlivostních funkcí programem MwPharm vypočteny nové doporučené časy odběrů vzorků, které jsou uvedeny v Tab. 16 pro všechna místa odběrů. Časy měření byly vypočteny exaktně (Tab. 8) a lékař by jistě namítnul, že některé z uvedených časů odběrů nelze z biologického hlediska realizovat – např. odběr v čase 5 min 17 s. Proto byly doporučené časy odběrů zaokrouhleny. Dříve než bude doplňující experiment v praxi realizován, je zde možnost další simulace, kterou jsme také provedli. V doporučených časech odběrů se z grafu simulační křivky odečtou hodnoty koncentrací. Do nové simulace se pak dosadí jako koncentrace léku v doporučené době měření. Po provedení nové simulace bychom měli dostat výsledky s větší spolehlivostí.
27
Lék / místo odběru vzorku
Doporučené časy odběrů vzorků 5 min 30 min
Vancomycin / ECMO
31 min 37 min 4 h 24 min 4 min 5 min
Vancomycin / arterie
7 min 8 min 12 min 5 min 8 min
Vancomycin / plicnice
16 min 37 min 3 h 57 min
Tab. 13: Doporučené časy odběrů vzorků.
28
Závěr Experiment byl prováděn na prasatech a farmakokinetický program MwPharm je určen pro člověka. Ačkoli je fyziologie prasat podobná lidské, dozajista se v některých oblastech také liší. Před vlastní simulací se musí zadat pohlaví a tělesné proporce pacienta – váha, výška a věk. Z tělesných proporcí jsou pak vypočítány další parametry – LBM (lean body mass – tělesná hmotnost bez tuku), BSA (body surface area – povrch těla) a BMI (body mass index – index tělesné hmotnosti), u kterých nevíme, zda se u prasat počítají podle stejných vztahů. Váha byla jednotná, a to 50 kg. Výška byla dalším problematickým místem a byla zvolena na 158 cm. Dalším bodem je věk, který byl přirovnán 17letému člověku (Bouček, 2011). Doporučené časy odběrů (Tab. 16) bylo třeba zaokrouhlit – je evidentní, že nelze udělat odběr krve v čase 5 minut a 17 vteřin nebo 10 vteřin po sobě. Navíc jsou časy doporučeny pro člověka a z výše uvedeného není jasné, jsou-li přenositelné na prase. Po provedení simulace doplňujícího experimentu jsme sice dostali některé parametry s větší spolehlivostí, ale některé parametry zůstaly neurčitelné, což podle Potůčka (2009) svědčí o neúplnosti modelu, s největší pravděpodobností o jeho přílišném zjednodušení. U vancomycinu byl zvolen jednokompartmentový model, ačkoli by v souladu s (Mulla, 2005) byl vhodnější model dvoukompartmentový. U dvoukompartmentového modelu by se muselo fitovat více parametrů opět jen ze dvou naměřených hodnot. Na dvoukompartmentový model by bylo třeba zjistit více parametrů měřením. Mimo odběrů krve se jestě prováděla bronchoalveolární laváž, kde se dá také koncentrace léčiva detekovat, ale některé vzorky byly kontaminovány krví a výsledky proto nebyly průkazné. Dalšími parametry by mohly být vzorky moči a biopsie jater. Díky dalšímu měření by bylo možno realizovat nový model, zaměřený speciálně na prasečí fyziologii. Důležitou roli zde ale také hraje finanční náročnost experimentu a všech testů k zjištění koncentrací antibiotik. Původní hypotéza experimentu, že díky sníženému průtoku krve v plicích budou koncentrace antibiotik v plicích nižší než systémové byla již po prvním experimentu vyvrácena. V plicnici byla koncentrace ve většině případů vyšší, což značí, že je dostupnost antibiotik dobrá a není třeba upravovat dávkování ani přesto, že je distribuční objem díky ECMO oběhu vyšší.
29
Seznam použité literatury ABRAHAMS E., GINSBURG G. S., SILVER M.: The Personalized Medicine Coalition: goals and strategies. 2005. American Journal of Pharmacogenomics 5. s. 345–355. BĚLOHLÁVEK J. et al.: Profil pacientů léčených extrakorporální membránovou oxygenací (ECMO). 2010. Intervenční a akutní kardiologie 9. s. 121–128. BOUČEK T.: Re: farmakokinetika. [elektronická pošta]. Message to: Prell Jan. 12 Dec 2011 [cit. 2011-12-19]. Osobní komunikace. CASCORBI I.: The Promises of Personalized Medicine. 2010. European Journal of Clinical Pharmacology 66. s. 749–754. COLEMAN, W. B.: Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian. 2. vydání. Springer Science, 2006. Personalized Medicine, s. 341–346. ISBN 978-15-88-29356-5. European Commission Group of Experts (ECGE): Ethical, legal and social aspects of genetic testing: research, development and clinical applications. Zpráva nezávislé expertní skupiny, 2004. FRUEH F. W., AMUR S., MUMMANENI P. et al.: Pharmacogenomic biomarker information in drug labels approved by the United States Food and Drug Administration: prevalence of related drug use. 2008. Pharmacotherapy Journal 28. s. 992–998. JAIN K. K.: Textbook of Personalized Medicine. Springer, 2009. 430 s. ISBN 978-1-4419-0768-4. KALOW W.: Pharmacogenetics and pharmacogenomics: origin, status, and the hope for personalized medicine. 2006. The Pharmacogenomics Journal 6, s. 162–165. KHOURY M. J.: Dealing with the evidence dilemma in genomic medicine. 2010. Clinical Pharmacology & Therapeutics 87. s. 635–638. LUCINIO J.: PharmGKB: The Pharmacogenetics and Pharmacogenomics Knowledge Base. 2004. The Pharmacogenomics Journal 4. s. 1. MANCINELLI L., CRONIN M., SADÉE W.: Pharmacogenomics: The Promise of Personalized Medicine. 2000. AAPS PharmSci 2. MATOUŠKOVÁ, O. Farmakogenetika. [elektronická pošta]. Message to: Prell Jan. 9 Dec 2011 [cit. 2011-12-12]. Osobní komunikace.
30
MULLA H., POOBONI S.: Population pharmacokinetics of vancomycin in patients receiving extracorporeal membrane oxygenation. 2005. British Journal of Clinical Pharmacology 60. s. 265–275. NUSSBAUM R., McINNES R., WILLARD H.: Klinická genetika. Triton, 2004. 426 s. ISBN 80-7254-475-6. POTŮČEK J.: Metodologie modelování biologických systémů. ČVUT, 2009. 191 s. ISBN 978-80-01-04412-4. REDON R., ISHIKAWA S., FITCH K. R. et al.: Global variation in copy number in the human genome. 2006. Nature 444. Number 7118. s. 444–454. ISSN 0028-0836. SHASTRY B. S.: Pharmacogenetics and the concept of individualized medicine. 2006. The Pharmacogenomics Journal 6. s. 16–21. SILBERNAGL S., DESPOPOULOS A.: Atlas fyziologie člověka. Grada, 2004. 448 s. ISBN 80-247-0630-X. Souhrn údajů o přípravku [online]. Praha: Státní ústav pro kontrolu léčiv, 2010a [cit. 2011-10-26]. Příloha č. 3 k rozhodnutí o prodloužení registrace. Dostupný z WWW:
Souhrn údajů o přípravku [online]. Praha: Státní ústav pro kontrolu léčiv, 2010b [cit. 2011-12-16]. Příloha č. 3 k rozhodnutí o prodloužení registrace. Dostupný z WWW: ŠEDA O., LIŠKA F., ŠEDOVÁ L.: Aktuální genetika - Multimediální učebnice lékařské biologie, genetiky a genomiky [online]. Ústav biologie a lékařské genetiky 1.LF ÚK a VFN, 2006 [cit. 2011-11-23]. Dostupný z WWW: TURCK C. W.: Biomarkers for Psychiatric Disorders. Springer Science, 2008. DNA Biomarkers for Pharmacogenomics, s. 445–471. ISBN 978-0-387-79251-4. VIZIRIANAKIS I. S.: Clinical translation of genotyping and haplotyping data: implementation of in vivo pharmacology experience leading drug prescription to pharmacotyping. 2007. Clinical Pharmacokinetics 46. Number 10. s. 807–824. WEDLUND P. J., LEON J.: Pharmacogenomic testing: the cost factor. 2001. The Pharmacogenomics Journal 1. s. 171–174.
31
