Jurnal Biologi Indonesia diterbitkan oleh Perhimpunan Biologi Indonesia. Jurnal ini memuat hasil penelitian ataupun kajian yang berkaitan dengan masalah biologi yang diterbitkan secara berkala dua kali setahun (Juni dan Desember). Editor Ketua Prof. Dr. Ibnu Maryanto Anggota Prof. Dr. I Made Sudiana Dr. Deby Arifiani Dr. Izu Andry Fijridiyanto Dewan Editor Ilmiah Dr. Abinawanto, F MIPA UI Dr. Achmad Farajalah, FMIPA IPB Prof. Dr. Ambariyanto, F. Perikanan dan Kelautan UNDIP Dr. Didik Widiyatmoko, Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya-LIPI Dr. Dwi Nugroho Wibowo, F. Biologi UNSOED Dr. Gatot Ciptadi F. Peternakan Universitas Brawijaya Dr. Parikesit, F. MIPA UNPAD Dr. Faisal Anwari Khan, Universiti Malaysia Sarawak Malaysia Assoc. Prof. Monica Suleiman, Universiti Malaysia Sabah, Malaysia Dr. Srihadi Agungpriyono, PAVet(K), F. Kedokteran Hewan IPB Y. Surjadi MSc, Pusat Penelitian ICABIOGRAD Drs. Suharjono, Pusat Penelitian Biologi-LIPI Dr. Tri Widianto, Pusat Penelitian Limnologi-LIPI Dr. Witjaksono Pusat Penelitian Biologi-LIPI
Sekretariat Eko Sulistyadi M.Si, Dewi Citra Murniati M.Si, Hetty Irawati PU, S.Kom Alamat d/a Pusat Penelitian Biologi - LIPI Jl. Ir. H. Juanda No. 18, Bogor 16002 , Telp. (021) 8765056 Fax. (021) 8765068 Email :
[email protected];
[email protected];
[email protected];
[email protected] Website : http://biologi.or.id
Jurnal Biologi Indonesia : Akreditasi: No. 657/AU3/P2MI-LIPI/07/2015.
JURNAL BIOLOGI INDONESIA
Diterbitkan Oleh: Perhimpunan Biologi Indonesia Bekerja sama dengan PUSLIT BIOLOGI-LIPI
OBITUARI Redaksi Jurnal Biologi Indonesia telah kehilangan seorang editor penelaah Dr. Ir Sri Sulandari, M.Sc. yang telah berpulang kerahmat Allah SWT pada tanggal 18 Agustus 2015 Jam 16.10 di RSCM, Jakarta. Jabatan terakhir almarhumah sebagai Peneliti Madya/IVc di Pusat Penelitian Biologi-LIPI sebagai ahli DNA Molekuler yang menekuni kajian DNA pada ayam lokal Indonesia dan berbagai hidupan liar khususnya pada burung. Tiga tahun terakhir sangat aktif berusaha menyelamatkan populasi kambing Gembrong di Kabupaten Karanganyar, Bali. Almarhumah meninggalkan seorang suami Prof. Dr. Muladno, MSA yang bekerja sebagai guru besar di Fakultas Peternakan, Institut Pertanian bogor dan saat ini juga sebagai Direktur Jendral Peternakan dan Kesehatan Hewan, Kementerian Pertanian, serta dua anak laki-laki Aussie Andry Vermarchnanto M. dan Endyea
Mendelian.
Jurnal Biologi Indonesia yang diterbitkan oleh PERHIMPUNAN BIOLOGI INDONESIA bekerjasama dengan PUSLIT BIOLOGI-LIPI. Edisi volume 11 No. 2 tahun 2015 memuat 15 artikel lengkap dan satu artikel tulisan pendek. Penulis pada edisi ini sangat beragam yaitu dari Balai Besar Penelitian Veteriner-Deptan, Balai Besar Penelitian dan Pengembangan Bioteknologi dan Sumberdaya Genetik Pertanian, Bogor, Balai Penelitian Tanaman Sayuran Lembang, Bandung, Departemen Konservasi Sumberdaya Hutan dan Ekowisata, Fakultas Kehutanan-IPB, Dept. Biokimia FMIPA-IPB, Institut Sains dan Teknologi Nasional Jakarta, Pusat Penelitian dan Pengembangan Sumberdaya Pesisir & Laut, Balitbang Kelautan & Perikanan, Kementerian Kelautan & Perikanan, Departemen Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, IPB. Program Studi Manajemen Sumberdaya Perairan, Fakultas Ilmu Kelautan dan Perikanan-Universitas Maritim Raja Ali HajiTual, Pusat Konservasi Tumbuhan Kebun Raya–LIPI, Puslit Biologi-LIPI, Puslit Bioteknologi-LIPI.
Jurnal Biologi Indonesia mengucapkan terima kasih dan penghargaan kepada para pakar yang telah turut sebagai penelaah dalam Volume 11 No 2, Desember 2015: Dr. Niken Tunjung Murti Pratiwi, Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan IPB Dr. Agus Prijono Kartono, Fakultas Kehutanan IPB Ir. Drs. Eko Harsono MSi, Puslit Limnologi-LIPI Dra. Donowati Tjokrokusumo M.Phil, Pusat Teknologi Bioindustri, BPPT Ir. M. Syamsul Arifin Zein MSi, Puslit Biologi LIPI Drh. Anang S. Achmadi MSc, Puslit Biologi LIPI Dr. Yuyu S. Poerba, Puslit Biologi LIPI Ir. Dwi Agustiyani MSc, Puslit Biologi LIPI Dr. Apon Zaenal Mustopa, Puslit Bioteknologi LIPI Dr. Yopi Puslit Bioteknologi LIPI Dr. Joeni S. Rahajoe, Puslit Biologi LIPI Dr. Wartka Rosa Farida, Puslit Biologi LIPI
BIOLOGI
Halaman Efikasi Vaksin Inaktif Bivalen Avian Influenza Virus Subtipe H5N1 (Clade 2.1.3. dan Clade 2.3.2) di Indonesia NLP. Indi Dharmayanti & Risa Indriani
169
Klon-klon Kentang Transgenik Hasil Persilangan Terseleksi Tahan terhadap Penyakit Hawar Daun Phytophthora infestans Tanpa Penyemprotan Fungisida di Empat Lapangan Uji Terbatas Alberta Dinar Ambarwati, Kusmana, & Edy Listanto
177
Penambahan Inokulan Mikroba Selulolitik pada Pengomposan Jerami Padi untuk Media Tanam Jamur Tiram Putih (Pleurotus ostreatus) Iwan Saskiawan
187
Identifikasi Molekular dan Karakterisasi Morfo-Fisiologi Actinomycetes Penghasil Senyawa Antimikroba Arif Nurkanto & Andria Agusta
195
Populasi dan Kesesuaian Habitat Langkap (Arenga obtusifolia Mart.) di Cagar Alam Leuweung Sancang, Jawa Barat Didi Usmadi, Agus Hikmat, Joko Ridho Witono, & Lilik Budi Prasetyo
205
Optimasi Produksi Enzim Amilase dari Bakteri Laut Jakarta (Arthrobacter arilaitensis ) Awan Purnawan, Y. Capriyanti, PA. Kurniatin, N. Rahmani, & Yopi
215
Pengaruh Antioksidan Eksopolisakarida dari Tiga Galur Bakteri Asam Laktat pada Sel Darah Domba Terinduksi tert-Butil Hidroperoksida (t-BHP) Fifi Afiati, Nina Ainul Widad, & Kusmiati
225
Ekosistem Lamun sebagai Bioindikator Lingkungan di P. Lembeh, Bitung, Sulawesi Utara Agustin Rustam, Terry L. Kepel, Mariska A. Kusumaningtyas, Restu Nur Afi Ati, August Daulat, Devi D. Suryono, Nasir Sudirman, Yusmiana P. Rahayu, Peter Mangindaan, Aida Heriati, & Andreas A. Hutahaean
233
Identification of Bioactive Compound from Microalga BTM 11 as Hepatitis C Virus RNA Helicase Inhibitor Apon Zaenal Mustopa, Rifqiyah Nur Umami, Prabawati Hyunita Putri, Dwi susilaningsih, & Hilda Farida
243
Kemampuan Cerna Protein dan Energi Metabolisme Perkici Pelangi (Trichoglossus haematodus ) Rini Rachmatika & Andri Permata Sari
253
Optimasi Enzim α-Amilase dari Bacillus amyloliquefaciens O1 yang Diinduksi Substrat Dedak Padi dan Karboksimetilselulosa Yati Sudaryati Soeka, Maman Rahmansyah, & Sulistiani
259
Kajian Aspek Ekologis dan Daya Dukung Perairan Situ Cilala Niken T.M. Pratiwi, Sigid Hariyadi, Inna Puspa Ayu, Aliati Iswantari, Novita MZ, & Tri Apriadi
267
Halaman Penanda Genetik Tarsius (Tarsius spp.) dengan Menggunakan Gen Cytochrome Oxidase I 275 (COI) DNA Mitokondria (mtDNA) Melalui Metode Sekuensing Wirdateti, Sri Wijayanti Wulandari, & Paramita Cahyaningrum Kuswandi Carboxymethyl Cellulose Hydrolyzing Yeast Isolated from South East Sulawesi, Indonesia Atit Kanti
285
Uji Bakteri Simbiotik dan Nonsimbiotik Pelarutan Ca vs. P dan Efek Inokulasi Bakteri pada Anakan Turi (Sesbania grandiflora L. Pers.) Sri Widawati
295
TULISAN PENDEK Mating behavior of Slow Loris (Nycticebus coucang ) at Captivity Wartika Rosa Farida & Andri Permata Sari
309
Identifikasi Molekular dan Karakterisasi Morfo-Fisiologi Actinomycetes Penghasil Senyawa Antimikroba (Molecular Identification and Morpho-Physiological Characterization of Actinomycetes with Antimicrobial Properties) Arif Nurkanto & Andria Agusta
Pusat Penelitian Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Jl. Jakarta Bogor KM 46, Cibinong, Bogor 16911 Email :
[email protected] Memasukkan: November 2014, Diterima: Maret 2015 ABSTRACT The objectives of study were to identify antimicrobial producing Actinomycetes using 16S rDNA analyses and morphology and physiology characteristics. Eight Actinomycetes strain with the higest antibacterial and antifungal activity were selected and identified using six primers (20F, 520F, 920F, 1500R, 920R, and 520R). Morphological observation and physiology analyses were performed to the selected strain to accurately identify the strains. Morphological characters observed were aerial mycelium, spore chain, colony form, and pigment production. Physiological characterizations were antimicrobial properties, growth temperature, pH tolerance, salinity concentration for growth, sugars assimilation, and some enzymes production (arginine dihydrolase, urease, ß-glucosidase, protease, ß-galactosidase). Based on homology search by BLAST program and phylogenetic tree analyses, all of isolates were identified as the genus Streptomyces. They belong to eight different spesies. Isolates RC-SS-37-4, RC-SS-37-16 and BL-22-3 have been identified as Streptomyces costaricanus (100 %), Streptomyces costaricanus (99.8 %) and Streptomyces parvulus (98.6 %), respectively. Five isolates were identified as Streptomyces spp. (BL-36-1, BL-20-2, BL-14-2, BL-22-1 and BL-06-5) and can be presumed as new species because of the low homology value to their closest related spesies. Keywords : actinomycetes, antimicrobial, morphology, phylogenetic, physiology, 16S rRNA gene. ABSTRAK Tujuan dari penelitian yang dilakukan adalah untuk mengidentifikasi isolat actinomycetes dengan kemampuan antimikroba menggunakan analisis 16S rDNA dan mengkarakterisasinya secara morfologi dan fisiologi. Sebanyak delapan isolat dengan aktivitas antibakteri dan antifungi tertinggi telah diidentifikasi menggunakan 6 primer (20F, 520F, 920F, 1500R, 920R, and 520R). Karakter morfologi dan fisiologi juga diamati dalam penelitian ini. Karakter morfologi diamati berdasarkan parameter kunci berupa miselium aerial, bentuk rantai spora, koloni dan produksi pigmen. Karakter fisiologi berupa aktivitas antimikroba, suhu pertumbuhan, toleransi keasaman (pH), konsentrasi salinitas, asimilasi gula dan produksi enzim khusus (arginin dihidrolase, urease, ß-glukosidase, protease dan ß-galaktosidase). Berdasarkan persamaan homologi melalui metode BLAST dan analisis pohon filogenetik, semua isolat teridentifikasi sebagai Streptomyces. Isolat tersebut teridentifikasi menjadi tujuh jenis. Isolat RC-SS-37-4, RC-SS-37-16 dan BL-22-3 berturut-turut teridentifikasi sebagai Streptomyces costaricanus (100 %), Streptomyces costaricanus (99.8 %) dan Streptomyces parvulus (98.6 %). Lima isolat teridentikasi sebagai Streptomyces spp. (BL-36-1, BL-20-2, BL-14-2, BL-22-1 dan BL06-5) dan merupakan kandidat jenis baru karena memiliki nilai homologi yang rendah terhadap jenis terdekatnya. Kata Kunci : actinomycetes, antimikroba, fisiologi, filogenetik, gen 16S rRNA, morfologi.
PENDAHULUAN Actinomycetes merupakan kelompok bakteri Gram positif dan terdistribusi luas di alam. Actinomycetes dikenal sebagai mikroorganisme saprofitik pada tanah dan seresah (Takisawa et al. 1993). Secara umum, actinomycetes dibedakan menjadi dua kelompok. Kelompok tersebut adalah Streptomyces dan rare-actinomycetes (Kurtboke 2001). Rare-actinomycetes digunakan sebagai istilah untuk menyebut genus selain Streptomyces. Rare-
actinomycetes terdiri dari 201 genus, relatif lebih sulit diisolasi, dan pertumbuhan yang lebih lambat dibandingkan dengan Streptomyces (Miyadoh 1997). Kelas Actinobacteria memiliki 6 ordo, 46 famili, dan 202 genus. Jumlah spesies yang telah ditemukan sebanyak 2.335. Jumlah actinomycetes masih terus bertambah seiring dengan banyak penemuan taksa baru yang didorong oleh penelitian yang intensif. Streptomyces merupakan genus terbesar dengan jumlah spesies lebih dari 500. Selain
Nurkanto & Agusta
Streptomyces, genera dominan yang juga banyak ditemukan di antaranya Nocardia, Actinomadura, Micromonospora, Microbispora, Streptosporangium, dan Actinoplanes (Madigan et al. 2003, Goodfellow et al. 2011). Identifikasi molekuler terhadap actinomycetes dapat dilakukan dengan berbagai pendekatan. Identifikasi gen-gen tertentu yang menjadi penanda suatu tingkat takson dalam actinomycetes telah banyak dikembangkan. Sebagai contoh identifikasi small sub unit (SSU) DNA, large sub unit (LSU) DNA, dan multilocus gene. Analisis gen 16S rRNA dalam SSU merupakan metode identifikasi actinomycetes yang paling sering digunakan (Embley & Stackebrandt 1994). Identifikasi gen 16S rRNA didasarkan pada banyak faktor. Gen 16S rRNA bersifat multi copy karena terdapat sekitar 150-300 copy di dalam genom. Hal tersebut mempermudah untuk mendapatkannya dalam genom. Dalam gen 16S rRNA terdapat daerah variabel dan konservatif yang dapat dijadikan pembeda antar spesies. Secara umum, gen 16S rRNA adalah gen non fungsional dan bersifat lebih konservatif karena evolusi berjalan lambat (Avise 1994; Palys et al. 1997). Database tentang bakteri berdasarkan identifikasi 16S rRNA sudah banyak sehingga memudahkan dalam pembandingan. Perpindahan gen 16S rRNA secara horizontal tidak dapat terjadi sehingga dapat dijadikan penanda spesies. Gen 16S rRNA bersifat universal pada bakteri (Koonin 2003; Santos & Ochman 2004). Identifikasi actinomycetes data sekuen 16S rDNA relatif kompleks. Spesies actinomycetes yang sama umumnya memiliki homologi sequence gen 16S rDNA di atas 98 %. Nilai homologi 98 % atau kurang mengindikasikan spesies yang berbeda (Jauh-Hsun et al. 2002; Patel et al. 2004). Walaupun demikian, dalam beberapa kasus actinomycetes dapat dikelompokkan menjadi spesies baru walaupun homologi 16S rDNA di atas 99 %. Hal tersebut terjadi jika nilai homologi hibridisasi DNA-DNA rendah, atau kurang dari 70 % (Jauh-Hsun et al. 2002; Patel et al. 2004). Karakterisasi morfologi dan fisiologi juga merupakan faktor penting. Adanya data morfologi dan fisiologi dalam tahap identifikasi actinomycetes dapat digunakan untuk mendiskripsikan isolat-isolat
196
yang sudah diidentifikasi secara molekuler. Dalam beberapa kasus, sering dijumpai kemiripan jenis dalam actinomycetes secara molekuler, namun berbeda secara morfologi dan fisiologi. Hal tersebut dapat terjadi jika identifikasi molekuler yang dilakukan hanya terhadap satu atau beberapa gen penanda saja (Madigan et al. 2003). Adanya data morfologi, fisiologi, dan molekuler akan memberikan hasil yang akurat tentang identitas actinomycetes. Karakterisasi tersebut dapat berupa kemampuan asimilasi berbagai jenis gula, toleransi suhu pertumbuhan, toleransi salinitas dan derajat keasaman (pH), produksi beberapa enzim tertentu, observasi morfologi miselium dan spora, serta produksi senyawa tertentu. Perbedaan karakter morfologi, fisiologi, dan biokimia antar isolat actinomycetes, dapat menjadi kunci dalam deskripsi spesies, selain informasi data molekuler. Penelitian bertujuan untuk menemukan identitas isolat-isolat actinomycetes yang memiliki aktivitas antimikroba. Actinomycetes yang diidentifikasi merupakan hasil seleksi dari seratus isolat actinomycetes dengan aktivitas antimikroba tertinggi berdasarkan penapisan yang telah dilakukan pada penelitian sebelumnya. Analisis filogenetik berdasarkan data molekuler juga dilakukan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar isolat yang diidentifikasi maupun isolat actinomycetes lain. Analisis filogenetik yang dilakukan sangat membantu dalam menemukan jenis actinomycetes lain yang memiliki kekerabatan dekat dengan isolat yang sedang diidentifikasi. Karakterisasi morfologi dan fisiologi terhadap isolat tersebut juga dilakukan dalam penelitian ini untuk melengkapi data melekuler yang diperoleh dan digunakan sebagai dasar diskripsi isolat-isolat yang sudah teridentifikasi. BAHAN DAN CARA KERJA Mikroba yang digunakan adalah isolat actinomycetes yang memiliki aktivitas antimikroba berdasarkan hasil penapisan yang telah dilakukan. Isolat tersebut adalah BL-36-1, BL-20-2, BL-14 -2, RC-SS-37-4,RC-SS-37-16, BL-22-1, BL-065 dan BL-22-3. Isolat tersebut ditumbuhkan pada medium yeast starch agar (YSA), Internasional standard Streptomyces 2 (ISP2).
Identifikasi Molekular dan Karakterissasi Morfo-Fisiologi Actinomycetes
DNA diekstraksi menggunakan metode Guanidin EDTA Sarkosil (GES) (Pitcher et al. 1989). Gen 16S rRNA diamplifikasi dengan menggunakan primer universal untuk bakteri sesuai yang dilakukan Suriyachadkun et al. (2010), yaitu 20F (5’-GATTTTGATCCTGGCTCAG–3’) dan 1500R (5-GTTACCTTGTTACGACTT–3’). Proses cycle sequencing dengan menggunakan Kit BigDye Terminator v3.1 (Applied Biosystems) dan primer 20 F, 520 F (5’-GTGCCAGCAGCCGCGG3’, 920 F (5’-AAACTCAAATGAATTGACGG-3’), 520 R (5’-ACCGCGGCTGCTGGC-3’), 920 R (5’CCGTCAATTCATTTGAGTTT-3’) dan 1500 R (Yukphan et al. 2004; Nurkanto et al. 2010). Produk PCR kemudian dianalisis dengan mesin Automated DNA sequencer (ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer; Applied Biosystems). Analisis DNA menggunakan program BioEdit dan program Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) pada database Bank gen National Center for Biotechnology Information (NCBI) (Hall 1999) dan Ribosomal Database Project (RDP). Data NCBI BLAST tersedia pada laman http://www.ncbi.nlm.nih.gov, sedangkan RDP pada laman http://www.rdp.cme.msu.edu. Analisis filogenetik menggunakan program Clustal X versi 1.83 (Thompson et al. 1997). Konstruksi pohon filogenetik berdasarkan jarak kekerabatan genetik dengan metode Neighbor joining (Saitou & Nei 1987). Konstruksi jarak evolusi dalam derajat kepercayaan menggunakan bootstrap value pada program NJ plot dengan 1.000 replikasi bootstrap berdasarkan Felsenstein (1985). Spesies pembanding yang digunakan adalah spesies type. Data sekuen spesies type tersebut diperoleh dari RDP. Uji antimikroba dilakukan terhadap bakteri (E. coli, B. subtilis, S. aureus, M. luteus) dan jamur (C. albicans dan S. cereviceae). Analisis antimikroba dengan menggunakan metode difusi agar (Reller et al. 2009; Jorgensen 1999; Baeur et al. 1996). Karakterisasi dilakukan terhadap delapan isolat terseleksi yang telah di sekuensing. Karakterisasi yang dilakukan berupa pengamatan morfologi dan fisiologi. Karakterisasi morfologi dilakukan dengan mengamati ada tidaknya miselium aerial, bentuk spora, warna koloni, warna miselium, dan produksi pigmen, yang ditumbuhkan pada medium yang berbeda (YSA dan ISP2).
Karakterisasi fisiologi dilakukan dengan mengamati suhu pertumbuhan, toleransi salinitas, toleransi pH, kemampuan asimilasi berbagai sumber karbon dan kemampuan memproduksi enzim tertentu. Masing-masing isolat actinomycetes ditumbuhkan pada medium ISP2 agar kemudian diinkubasi pada suhu 4, 10, 20, 27, 37 dan 45 oC. setelah 14 hari inkubasi, pertumbuhan diamati untuk mendapatkan data toleransi suhu pertumbuhan. Toleransi salinitas juga dilakukan dengan pengamatan pertumbuhan isolat pada medium ISP2 agar dengan penambahan variasi konsentrasi NaCl 0, 1, 3, 5 dan 10% (w/ v). metode yang serupa juga dilakukan untuk memperoleh data toleransi pH, isolat ditumbuhkan pada medium ISP2 dengan variasi pH (3, 5, 7, 9, 11 dan 13) dan diinkubasi pada suhu 28 oC. Kemampuan asimilasi karbon dan produksi enzim tertentu dilakukan dengan menggunakan Api® kit (Biomerieux) dengan metode sesuai dengan instruksi dari penyedia kit. HASIL Sebanyak delapan isolat dengan aktivitas antimikroba telah diseleksi untuk identifikasi. Gambar isolat terseleksi tersebut tersaji pada Gambar 1. DNA delapan isolat telah teramplifikasi seperti ditunjukkan pada Gambar 2. Berdasarkan marker 1 kilobasa (1 kb) yang telah digunakan, terlihat bahwa semua DNA yang teramplifikasi memiliki panjang sekitar 1500 pasang basa (1500 bp). Hal tersebut sesuai dengan target identifikasi gen 16S rRNA, yaitu nukletida dengan panjang sekitar 1500 bp. Hasil sekuensing yang telah dilakukan menggunakan enam jenis primer diperoleh panjang nukleotida yang berbeda untuk tiap primer yang digunakan. Panjang nukleotida untuk tiap primer berkisar antara 325 – 975. Nukleotida yang diperoleh untuk tiap primer telah disambung (contiq) untuk mendapatkan urutan hasil sekuen penuh dari gen 16S rRNA. Kalkulasi hasil sekuensing seperti pada Tabel 1. Hasil contiq yang telah dilakukan, diperoleh urutan nukleotida dari delapan isolat actinomycetes. Panjang nukleotida tersebut berkisar 1400 bp. Identitas isolat actinomycetes telah diperoleh melalui BLAST berdasarkan urutan basa tersebut. Hasil identifikasi molekuler isolat actinomycetes adalah seperti pada Tabel 2.
197
Nurkanto & Agusta
Konstruksi pohon filogenetik Konstruksi pohon filogenetik yang menggambarkan hubungan kekerabatan antar spesies dapat dilakukan untuk mempermudah analisis hasil identifikasi. Konstruksi pohon filogenetik dalam penelitian ini digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan secara kladistik antar isolat actinomycetes terseleksi. Hubungan tersebut ditunjukkan pada Gambar 3. Karakterisasi morfologi dan fisiologi isolat Actinomycetes Pengamatan yang telah dilakukan dengan membandingkan karakter antar isolat. Karakter yang diambil dalam penelitian ini adalah aktivitas antimikroba (Tabel 3), bentuk rantai spora, warna koloni, warna pigmen (Tabel 4), toleransi suhu pertumbuhan, salinitas dan derajat keasaman (pH), kemampuan asimilasi gula dan produksi enzim tertentu (Tabel 5). 1
A
B
C
D
E
F
G
H
2 3
Gambar 1. Bentuk koloni isolat actinomycetes terseleksi aktivitas antimikroba tertinggi, dimana A : isolat BL-36-1; B : isolat BL-06-5; C : isolat BL-20-2; D : isolat RC-SS-37-4; E : isolat RC-SS-37-16; F : isolat BL-14-2; G : isolat BL-22-1; dan H : isolat BL-22-3.
Gambar 2. Hasil elektroforesis produk PCR gen 16S rRNA dari delapan isolat actinomycetes. dari kiri ke kanan : marker 1 kb, BL-36-1, BL-20-2, BL-14-2, RC-SS-37-4, RC-SS-3716, BL-22-1, BL-06-5, BL-22-3 dan BL-225.
198
PEMBAHASAN Berdasarkan hasil identifikasi gen 16S rRNA, delapan isolat actinomycetes masuk dalam genus Streptomyces. Sebanyak lima isolat memiliki persentase homologi terhadap strain type terdekatnya dengan nilai kurang dari 98 %. Isolat tersebut adalah BL-36-1, BL-20-2, BL-14-2, BL-22-1, dan BL-06-5. Menurut Jauh-Hsun et al. (2002) dan Patel et al. (2004), nilai homologi 98 % atau kurang mengindikasikan spesies yang berbeda atau dapat dipertimbangkan sebagai spesies baru. Walaupun demikian, dalam beberapa kasus, actinomycetes dapat dikelompokkan menjadi spesies baru walaupun homologi 16S rDNA di atas 98 %. Hal tersebut terjadi jika nilai homologi hibridisasi DNA-DNA rendah, atau kurang dari 70 % (Jauh-Hsun et al. 2002; Patel et al. 2004). Analisis filogenetik pada Gambar 2 menunjukkan bahwa delapan isolat actinomycetes terpisah menjadi tujuh kelompok. Isolat RC-SS-3716 dan RC-SS-37-4 berada dalam satu cabang dengan spesies terdekatnya, Streptomyces costaricanus (T); NBRC 100773; AB249939. Isolat BL-22-3 berkerabat dekat dengan Streptomyces parvulus (T); NBRC 13193; AB184326. Isolat BL-36-1, BL-20-2, dan BL22-1 secara filogenetik terpisah dengan spesies Tabel 1. Kalkulasi panjang nukleotida hasil sekuensing gen 16S rRNA terhadap delapan isolat actinomycetes dengan menggunakan enam primer yang berbeda
Identifikasi Molekular dan Karakterissasi Morfo-Fisiologi Actinomycetes
terdekatnya. Hasil analisis filogenetik menunjukkan hasil yang hampir sama dengan homologi sekuen DNA dimana lima isolat (BL-36-1, BL20-2, BL-14-2, BL-22-1, dan BL-06-5) merupakan kandidat jenis baru berdasarkan full sequence gen 16S rRNA Gambar 3 menunjukkan hampir semua spesies terdekat dari actinomycetes yang diidentifikasi memiliki aktivitas antimikroba. Hal tersebut menunjukkan bahwa studi filogenetik yang telah dilakukan tidak hanya berperan dalam mengetahui hubungan kekerabatan terhadap spesies
lain maupun perubahan evolusi dari nenek moyang bersama secara genetik. Pengelompokan aktivitas biologi juga dapat diketahui melalui analisis filogenetik. Hal tersebut berarti analisis filogenetik dapat dimanfaatkan untuk studi pencarian senyawa obat yang bersumber dari mikroba. Berdasarkan hasil observasi karakter morfologi dan fisiologi seperti pada Tabel 3-5, diketahui bahwa delapan isolat terpilih memiliki karakter yang berbeda. Semua isolat memiliki kemampuan memproduksi metabolit yang bersifat sebagai antimikroba, namun selektif terhadap jenis mikroba
Tabel 2. Hasil identifikasi gen 16 S rRNA isolat actinomycetes yang memiliki kemampuan antimikroba tertinggi. Kode isolat BL-36-1 BL-20-2 BL-14-2 RC-SS-37-4 RC-SS-37-16 BL-22-1 BL-06-5 BL-22-3
Jumlah nukleotida 1328 1454 1409 1404 1453 1448 1515 1470
Spesies identik Streptomyces mobaraensis (T); NRRL B-3729T; DQ442528 Streptomyces violarus (T); NBRC 13104; AB184316 Streptomyces kanamyceticus (T); NRRL B-2535T; DQ442511 Streptomyces costaricanus (T); NBRC 100773; AB249939 Streptomyces costaricanus (T); NBRC 100773; AB249939 Streptomyces labedae (T); NBRC 15864; AB184704 Streptomyces kunmingensis (T); NRRL B-16240T; DQ442513 Streptomyces parvulus (T); NBRC 13193; AB184326
Persentase homologi 95.2 97.4 93.9 100 99.8 94.6 96.2 98.6
Gambar 3. Pohon filogenetik delapan isolat actinomycetes yang diidentifikasi berdasarkan full sequence gen 16S rRNA, metode Neighbor-Joining dengan 1.000 replikasi bootstrap, Dimana GP = anti bakteri gram positif, GN = antibakteri gram negatif, AF = antifungi, AK = antikanker, dan [--] = tidak memiliki aktivitas antimikroba.
199
Nurkanto & Agusta
Tabel 3. Aktivitas antimikroba isolat actinomycetes setelah 7 hari inkubasi pada medium cair ISP2. Isolat Antimikroba B-36-1 BL-20-2 BL-14-2 RC-S S -37-4RC-S S -37-16 BL-22-1 BL-06-5 BL-22-3 E.coli
-
+
+
-
-
-
-
-
B.subtilis
+
+
S. aureus
+
+
+
-
+
+
-
+
-
+
+
+
-
+
M. luteus
+
+
+
+
+
+
-
+
C.albicans S. cereviceae
-
-
-
-
-
-
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
Tabel 4. Karakterisasi morfologi actinomycetes terseleksi Parameter Pengamatan B-36-1 +
Isolat BL-20-2 BL-14-2 RC-S S -37-4 RC-S S -37-16 BL-22-1 BL-06-5 BL-22-3 + + + + + + +
Aerial mycelium Bentuk rantai spora Rectiflexibiles + Spirales + + Verticillate Rectinaculiaperti Warna koloni, miselium dan pigmen pada medium YS A Warna koloni abu-abu merah merah Produksi pigmen ke media Koloni bawah abu-abu oranye merah Warna koloni, miselium dan pigmen pada medium IS P2 Warna koloni abu-abu coklat merah Produksi pigmen ke media abu-abu Koloni bawah abu-abu coklat merah
tertentu, seperti isolat BL-14-2 hanya memiliki aktivitas antibakteri dan satu isolat BL-06-5 hanya memiliki aktivitas antifungi. Enam isolat yang lain memiliki aktivitas antibakteri dan antifungi. Semua isolat memiliki aerial miselium tetapi memiliki bentuk rantai spora yang berbeda, yang dikatagorikan menjadi empat bentuk. Hal yang unik adalah bahwa dalam satu isolat dapat memiliki warna koloni, miselium, dan produksi pigmen yang tidak selalu sama ketika ditumbuhkan pada medium yang berbeda (ISP-2 dan YSA). Hal tersebut menunjukkan bahwa perbedaan komposisi medium dapat mempengaruhi sebagian karakter morfologi dari actinomycetes. Semua isolat memiliki toleransi suhu dan pH pertumbuhan yang sama, yaitu 20-37 oC dan 7-9. Toleransi salinitas bervariasi, namun tidak lebih dari 3 %. Kemampuan asimilasi gula menunjukkan profil yang berbeda untuk setiap isolat, tidak ada isolat yang memiliki kemampuan menggunakan jenis
200
+ -
+ -
+ -
abu-abu kuning hitam
abu-abu kuning hitam
kuning kuning
putih kuning kuning
putih kuning kuning
kuning kuning
+ -
+ -
Putih abu-abu coklat kuning abu-abu abu-abu coklat coklat coklat
putih putih
gula yang sama persis. Uji produksi enzim menunjukkan hasil yang positif, kecuali pada kemampuan pengasaman glukosa, semua tidak aktif kecuali isolat BL-06-5. Berdasarkan analisis filogenetik dan hasil identifikasi, isolat RC-SS-37-4 dan RC-SS-3716 merupakan spesies yang sama. Kedua isolat tersebut teridentifikasi sebagai Streptomyces costaricanus. Analisis alignment menggunakan program Clustal X 2.0.11 dan BLAST 2 sequences pada NCBI gene bank menunjukkan tidak terdapat berbedaan nukleotida antara kedua isolat dengan homologi sebesar 100 %. Data karakterisasi antara kedua isolat tersebut hampir sama. Walaupun demikian, terdapat sedikit perbedaan dari karakterisasi fisiologi, dimana isolat RC-SS-37-16 dapat menghambat B. subtilis sedangkan RC-SS-37-4 tidak dapat. Isolat RC-SS-37-4 mampu mengasimilasi adipat, malat, dan fenil asetat, sedangkan isolat
Identifikasi Molekular dan Karakterissasi Morfo-Fisiologi Actinomycetes
Tabel 5. Karakterisasi fisiologi actinomycetes terseleksi Isolat
Parame te r pe ngamatan Suhu pe rtumbuhan 4 oC 10 o C 20 o C 27 o C 37 o C 45 o C
B-36-1
BL-20-2 BL-14-2 RC-SS-37-4 RC-SS-37-16BL-22-1
BL-06-5
BL-22-3
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
+ + +
-
-
-
-
-
-
-
-
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
-
-
-
+ -
+ + + -
-
-
+ + +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
+ +
-
-
-
-
-
-
-
-
Asimilasi gula Glukosa Arabinosa Mannosa Mannitol N-acetyl glukosamin Maltosa Glukonat Kaprat Adipat Malat Sitrat Fenil-asetat
+ + + + + -
+ + + + -
+ + + + + + + + + -
+ + + + + + + + +
+ + + + + + -
+ + + + + + + + + -
+ + + + + + + + -
+ + + + + + + + + + + -
Produksi e nz im Pengasaman glukosa Arginin dihidrolase Urease ß-glukosidase Protease ß-galaktosidase
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + +
+ + + + + +
+ + + + +
Tole ransi salinitas 0% 1% 3% 5% 10% Tole ransi pH 3 5 7 9 11 13
RC-SS-37-16 tidak mampu mengasimilasi gula tersebut. Sedikit perbedaan karakter antar kedua isolat diduga hanya menunjukkan perbedaan pada level strain, sedangkan spesiesnya tetap sama, yaitu Streptomyces costaricanus. Analisis menyimpulkan bahwa isolat RCSS-37-4 dan RC-SS-37-16 adalah satu spesies, namun kemungkinan berbeda strain atau sub spesies didukung oleh data penelitian lain.
-
Penelitian yang dilakukan oleh Esnard et al. (1995) menyatakan bahwa actinomycetes dalam satu spesies dapat memiliki karakter morfologi dan fisiologi yang berbeda, seperti yang terjadi pada S. hygroscopicus dan S. hygroscopicus subsp. decoyinus. Kedua spesies S. hygroscopicus tersebut memiliki perbedaan warna koloni, kemampuan asimilasi gula, toleransi salinitas dan pH, serta resistensi beberapa jenis antibiotik. Walaupun 201
Nurkanto & Agusta
demikian, sekuen gen 16S rRNA kedua isolat tersebut identik. KESIMPULAN Berdasarkan full sequence identifikasi menggunakan pendekatan molekuler gen 16S rRNA dan karakterisasi morfologi serta fisiologi, delapan isolat yang memiliki aktivitas antimikroba masuk dalam genus Streptomyces. Isolat RC-SS-37-4 dan RC-SS-37-16 teridentifikasi sebagai S. costaricanus. Isolat BL-36-1 adalah S. mobaraensis (95,2%), isolat BL-20-2 teridentifikasi sebagai S. violarus (97,4%) dan BL-14-2 adalah S. kanamyceticus (93,9%). Sedangkan isolat BL-22-1, BL-06-5 dan BL-22-3 berturut-turut teridentifikasi sebagai S. labedae (94,6%), S. kunmingensis (96,2%) dan S. parvulus (98,6%). UCAPAN TERIMAKASIH Penelitian ini dibiayai oleh DIPA Pusat Penelitian Biologi LIPI serta Kementerian Riset dan Teknologi. Ucapan terimakasih kami ucapkan kepada Dian Alfian dari Puslit Biologi LIPI, atas bantuan selama sekuensing. DAFTAR PUSTAKA Avise, JC. 1994. Molecular Markers, Natural History and Evolution. New York: Chapman & Hall. Embley TM. & E. Stackebrandt. 1994. The Molecular Phylogency and Systematics of the Actinomycetes. Annual Review of Microbiology 48: 257-289. Esnard, J., TL. Potter & BM. Zuckerman. 1995. Streptomyces costaricanus sp. nov., isolated from Nematode-suppresive soil. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 5(4): 775-779. Felsenstein, J. 1985. Confidence limitson phylogenies: an approach using the bootstrap. Journal Organism Evolution. 39: 783-789. Goodfellow, M., P. Kämpfer, HJ. Busse, ME. Trujillo, KI. Suzuki, W. Ludwig & WB. Whitman. 2011. Bergey's Manual of Systematic Bacteriology 2nd Edition volume 5. Springer, New York. Jauh-Hsun, C., T. Vinh, JK. Davies & D. Figdor.
202
2002. Molecular approaches to the differentiation of Actinomycetes spesies. Journal of Molecular Oral Microbiology. 14: 250-256. Jorgensen, TJA. 1999. Antibacterial susceptibility tests: dilution and disk diffusion methods. Manual of Clinical Microbiology, seventh ed. ASM Press, Washington, DC, 1526-1543. Koonin, EV. 2003. Comparative genomics, minimal gene-sets and the last common universal ancestor. Natural Review of Microbiology. 1: 127-136. Kurtboke, I. 2001. Selective isolation of rare Actinomycetes. Queensland, Australia. Madigan, MT., JM. Martiko & J. Parker. 2003. Biology of Microorganisms. Tenth Edition. Pearson Education, Inc. USA. Miyadoh, S. 1997. Atlas of Actinomycetes. Asakura Publishing Co Ltd. Japan. Nurkanto, A., F. Listyaningsih, H. Julistiono & A. Agusta. 2010. Eksplorasi keanekaragaman Actinomycetes tanah Ternate sebagai sumber antibiotik. Jurnal Biologi Indonesiai. 6 (3): 325-339. Palys, T., LK. Nakamura & FM. Cohan. 1997. Discovery and classification of ecological diversity in the bacterial world: the role of DNA sequence data. International Journal Systematic and Evolutionary Microbiology. 47: 1145-1156. Patel, JB., RJ. Wallace Jr., BA. Coklat-Elliott, T. Taylor, C. Imperatrice, DBG. Leonard, RW. Wilson, L. Mann, KC. Jost & I. Nachamkin. 2004. Sequence-based identification of aerobic Actinomycetes. Journal Clinical microbiology. 42 (6): 2530-2540. Pitcher, DG., NA. Saunders & RJ. Owen. 1989. Rapid extraxtion of bacterial genomic DNA with Guanidium thiocyanate. Journal Letter Applied Microbiology. 8: 108 – 114. Reller, L. B., M. Weinstein, JH. Jorgensen, & MJ. Ferraro. 2009. Antimicrobial susceptibility testing: a review of general principles and contemporary practices. Clinical infectious diseases. 49 (11): 1749-1755. Saitou, N. & M. Nei. 1987. The Neighbor-Joining method: a new method for reconstruction
Identifikasi Molekular dan Karakterissasi Morfo-Fisiologi Actinomycetes
phylogenetic tree. Journal Molecular Biology Evolution 4 : 406-425. Santos, SR. & H. Ochman. 2004. Identification and phylogenetic sorting of bacterial lineages with universally conserved genes and protein. Journal Environmental Microbiology. 6: 754759. Suriyachadkun, C., S. Chunhametha, T. Tamura, C. Thawai, W. Potacharoen, K. Kirtikara & JJ. Sanglier. 2010. Planotetraspora thailandica sp. nov., isolated from soil in Thailand. International Journal Systematic and Evolutionary Microbiology 60 (9) : 20762081. Takisawa, M., RR. Colwel & RT. Hill. 1993. Isolation and diversity of Actinomycetes
in the Chesapheake bay. Journal Applied Environmental Microbial. 59: 997– 1002. Thompson, JD., TJ. Gibson, F. Plewniak & DG. Higgins. 1997. Clustal X windows interface: flexible strategies for multiple sequence aligment aided by quality analysis tools. Journal Nucleic Acids Research. 25: 48764882. Yukphan, P., W. Potacharoen , S. Tanasupawat, M. Tanticharoen, & Y. Yamada. 2004. Asaia krungthepensis sp. nov., an acetic acid bacterium in the alpha-Proteobacteria. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 54: 313–316.
203
PANDUAN PENULIS Naskah dapat ditulis dalam bahasa Indonesia atau bahasa Inggris. Naskah disusun dengan urutan: JUDUL (bahasa Indonesia dan Inggris), NAMA PENULIS (yang disertai dengan alamat Lembaga/ Instansi), ABSTRAK (bahasa Inggris, dan Indonesia maksimal 250 kata), KATA KUNCI (maksimal 6 kata), PENDAHULUAN, BAHAN DAN CARA KERJA, HASIL, PEMBAHASAN, UCAPAN TERIMA KASIH (jika diperlukan) dan DAFTAR PUSTAKA. Penulisan Tabel dan Gambar ditulis di lembar terpisah dari teks. Naskah diketik dengan spasi ganda pada kertas HVS A4 maksimum 15 halaman termasuk gambar, foto, dan tabel disertai CD. Batas dari tepi kiri 3 cm, kanan, atas, dan bawah masing-masing 2,5 cm dengan program pengolah kata Microsoft Word dan tipe huruf Times New Roman berukuran 12 point. Setiap halaman diberi nomor halaman secara berurutan. Gambar dalam bentuk grafik/diagram harus asli (bukan fotokopi) dan foto (dicetak di kertas licin atau di scan). Gambar dan Tabel di tulis dan ditempatkan di halaman terpisah di akhir naskah. Penulisan simbol a, b, c, dan lain-lain dimasukkan melalui fasilitas insert, tanpa mengubah jenis huruf. Kata dalam bahasa asing dicetak miring. Naskah dikirimkan ke alamat Redaksi sebanyak 3 eksemplar (2 eksemplar tanpa nama dan lembaga penulis). Penggunaan nama suatu tumbuhan atau hewan dalam bahasa Indonesia/Daerah harus diikuti nama ilmiahnya (cetak miring) beserta Authornya pada pengungkapan pertama kali. Pustaka didalam teks ditulis secara abjad. Contoh penulisan Daftar Pustaka sebagai berikut : Jurnal : Achmadi, AS., JA. Esselstyn, KC. Rowe, I. Maryanto & MT. Abdullah. 2013. Phylogeny, divesity , and biogeography of Southeast Asian Spiny rats (Maxomys). Journal of mammalogy 94 (6):1412-123. Buku : Chaplin, MF. & C. Bucke. 1990. Enzyme Technology. Cambridge University Press. Cambridge. Bab dalam Buku : Gerhart, P. & SW. Drew. 1994. Liquid culture. Dalam : Gerhart, P., R.G.E. Murray, W.A. Wood, & N.R. Krieg (eds.). Methods for General and Molecular Bacteriology. ASM., Washington. 248-277. Abstrak : Suryajaya, D. 1982. Perkembangan tanaman polong-polongan utama di Indonesia. Abstrak Pertemuan Ilmiah Mikrobiologi. Jakarta . 15 –18 Oktober 1982. 42. Prosiding : Mubarik, NR., A. Suwanto, & MT. Suhartono. 2000. Isolasi dan karakterisasi protease ekstrasellular dari bakteri isolat termofilik ekstrim. Prosiding Seminar nasional Industri Enzim dan Bioteknologi II. Jakarta, 15-16 Februari 2000. 151-158. Skripsi, Tesis, Disertasi : Kemala, S. 1987. Pola Pertanian, Industri Perdagangan Kelapa dan Kelapa Sawit di Indonesia.[Disertasi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Informasi dari Internet : Schulze, H. 1999. Detection and Identification of Lories and Pottos in The Wild; Information for surveys/ Estimated of population density. http//www.species.net/primates/loris/lorCp.1.html.
