Een blik in de moleculaire keuken Symposium Moleculaire Biologie 4 oktober 2012
Dr. Apr. Biol. Walter Verstrepen Klinisch Laboratorium ZiekenhuisNetwerk Antwerpen
Dagelijkse kost of delicatesse ?
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 2
Wat is moleculaire biologie ?
• tak van de biologie • moleculaire basis van biologische activiteit • interacties tussen moleculen • meer een aanpak dan arsenaal technieken DNA maakt RNA maakt eiwit Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 3
Hoe het begon
• 1938 Weaver: biologie verklaarbaar door moleculaire processen • 1944 Avery: verband tussen genen en DNA • 1953 Watson & Crick: dubbele DNA helix • 1958 Crick: DNA maakt RNA maakt eiwit • 1961 Jacob & Monod: messenger RNA • 1966 Khorana: genetische code ontcijferd • 1983 Mullis: uitvinding PCR • 1990 eerste commerciële PCR assay (HLA) • 1995 beschrijving TaqMan PCR Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 4
Opzuivering van DNA en RNA ultracentrifugatie op CsCl-gradiënt
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 5
Opzuivering van DNA en RNA phenol chloroform extractie (Trizol)
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 6
Opzuivering van DNA en RNA
anionenuitwisseling op (spin) kolommen (Qiagen)
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 7
Opzuivering van DNA en RNA
(magnetische) silica extractie (Boom)
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 8
(Semi-)automatische extractie
Nuclisens miniMag
Nuclisens easyMag
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 9
(Semi-)automatische extractie
MagNA Pure reeks
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 10
(Semi-)automatische extractie
QiaCube
QiaSymphony
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 11
Amplificatie door klonering
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 12
Southern blot
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 13
Southern blot
•
om specifieke DNA sequenties op te sporen
•
vraagt relatief veel DNA van goede kwaliteit
•
omslachtig en tijdrovend
•
analoge terminologie andere moleculen: •
Northern: RNA
•
Western: eiwitten
•
Southwestern: DNA-bindende eiwitten
•
Eastern: posttranslationele modificaties (suikers/lipiden)
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 14
Hybrid Capture technologie
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 15
Fluorescent In Situ Hybridization
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 16
Polymerase chain reaction Kary Mullis
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 17
PCR
• • • • •
enzymatische amplificatie van het substraat veel sneller resultaat minder gevoelig voor DNA degradatie (korte fragmenten) slechts kleine hoeveelheden DNA nodig toegankelijk voor labs niet gespecialiseerd in moleculaire biologie
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 18
Low tech PCR
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 19
Iets minder low tech
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 20
Automatisatie
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 21
Eerste commerciële thermocycler
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012
Perkin Elmer Cetus 480 22
Verdere evolutie
9600 Perkin Elmer
Een blik in de moleculaire keuken
C1000/S1000 Bio-Rad
PTC-200 MJR
Veriti Life Technologies
4 oktober 2012 23
Kwantitatieve PCR
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 24
Amplicon hybridizatie LIne Probe Assay
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 25
NASBA / TMA Isotherme amplificatie
EasyQ BioMérieux
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 26
Strand Displacement Amplification Isotherme amplificatie
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 27
Loop mediated isothermal amplification (LAMP)
Illumigene Meridian Biosciences Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 28
LAMP
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012
http://vimeo.com/13391184 29
Real-time PCR
• homogeen assay formaat • amplificatie en detectie in dezelfde tube • signaal opbouw tijdens de reactie • sneller want geen post-PCR detectie • minder risico op contaminatie • kwantitatief Een blik in de moleculaire keuken
• verlaagde drempel voor implementatie
4 oktober 2012 30
TaqMan versus Sybr Green
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 31
Kwantitatieve assay aantal cycli (Ct) is omgekeerd evenredig met logaritme van oorspronkelijke template
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 32
Förster Resonance Energy Transfer
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 33
Molecular beacons
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 34
Scorpions
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 35
Minor Groove Binder
• • • •
verhoogde smelttemperatuur kortere probe gevoeliger aan mismatchen opsporen van mutaties
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 36
Combinaties
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 37
Combinaties
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 38
High Resolution Melting
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 39
Eerste real-time PCR cycler
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 40
De opvolging
ABI 5700
ABI 7700
Rotorgene Een blik in de moleculaire keuken
LightCycler 480
ABI 7900 HT
4 oktober 2012 41
Gericht op medische labo’s
Cobas Amplicor
BD Probetec Een blik in de moleculaire keuken
Cobas TaqMan 48
4 oktober 2012 42
De pioniers
• verschillende platformen • verschillende firma’s • verschillende assay condities • beperkt aanbod • weinig standardisatie in-house assays Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 43
Zelf koken?
• relevante sequenties opzoeken www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank • geschikte regio zoeken in uitgelijnde sequenties blast.ncbi.nlm.nih.gov • primers en probes ontwerpen volgens bepaalde richtlijnen • optimalisatie assay condities Een blik in de moleculaire keuken
• methode validatie
4 oktober 2012 44
Wat schaft de pot?
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012
• • • • • • • • • • • •
enterovirus HSV1&2 en VZV parechovirus B. burgdorferi (Lyme) hMPV N. meningiditis en S. pneumoniae B. pertussis en parapertussis Influenzavirus A en B M. pneumoniae, C. pneumoniae en L. pneumophila T. gondii adenovirus …
• • • • •
prothrombine mutatie FV Leiden BCL1 translocatie BCL2 translocatie … 45
… of toch uit eten?
Kits en reagentia • Artus >> Qiagen • Argene >> BioMeriéux • Diagenode - Becton Dickinson • Nanogen >> Elitech • Tibmolbiol - Roche • Seegene • …
Een blik in de moleculaire keuken
Platform met reagentia • Roche • Qiagen • BioMérieux • Abbott • Cepheid • Becton Dickinson • …
4 oktober 2012 46
Waar gaan we naartoe?
• consolidatie door uitbreiding aanbod • integratie extractie – opzetten reactie – assay • meerdere targets tegelijk • eenvoudig te bedienen apparatuur
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 47
Drie gangen
Cobas 4800
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012
Abbott m2000 QiaSymphony SP/AS 48
Multiplex Ligation-Dependent Amplification
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 49
MLPA in real-time
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 50
Het buffet
Doelwit
Een blik in de moleculaire keuken
Interne amplificatiecontrole Rhinovirussen/Enterovirussen Influenza A Influenza B Influenza A H1N1v Humaan metapneumovirus Adenovirus Parainfluenza 1 Parainfluenza 2 Parainfluenza 3 Parainfluenza 4 RSV-A RSV-B Corona NL63 Corona OC43 Corona 229E Corona HKU1 Bocavirus Chlamydophila pneumoniae Mycoplasma pneumoniae Legionella pneumophila Bordetella pertussis
Gen
Polyproteïne gen van encephalomyocarditis virus 5’ UTR Matrix proteïne gen (M1) Matrix proteïne gen (M1) Neuraminidase gen Nucleocapsid proteïne gen (NP) Hexon gen (H) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Haemagglutinin-neuraminidase gen (HN) Major nucleocapsid proteïne gen (NP) Major nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Nucleocapsid proteïne gen (NP) Noncapsid (NP1) gen Major outer membrane (OmpA) gen Cytadhesin proteïne gen (P1) Macrophage inhibitor potentiator gen (mip) Pertussis toxin promoter gen (PT)
4 oktober 2012 51
xTag technologie
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 52
MassTag technologie
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 53
Plex-ID
Een blik in de moleculaire keuken
PCR/ESI-MS
4 oktober 2012 54
Fast food
GeneXpert • • • • • • •
Een blik in de moleculaire keuken
modulair instrument afgesloten cartridge extractie, amplificatie en detectie in één enkele minuten hands-on time beperkte opleiding niet goedkoop aanbod aan testen groeiende • • • • • • • • • •
MRSA VRE MTB + rifaR C. difficile GBS Influenzavirus enterovirus FII mutatie en FV Leiden BCR-ABL …
4 oktober 2012 55
Nieuwe tent
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 56
Opening soon Biocartis
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 57
Alles in één
Een blik in de moleculaire keuken
FilmArray
4 oktober 2012 58
Makkelijk
nu beschikbaar Respiratory panel 24 targets
Een blik in de moleculaire keuken
in ontwikkeling Blood ID panel: bacteria/fungi GI panel: bacteria/virus/protozoa Biothreat panel
4 oktober 2012 59
Sanger sequencing
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 60
Capillaire sequencers
ABI 310
Een blik in de moleculaire keuken
ABI 3500
ABI 3730
4 oktober 2012 61
Next Generation Sequencing Verschillende platformen
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 62
Next Generation Sequencing Werkwijze
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 63
Next Generation Sequencing
GS Junior Roche
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012
Helicos 64
Next Generation Sequencing
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 65
Emulsie PCR
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 66
Emulsie PCR
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 67
Pyrosequencing
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 68
Pyrosequencing
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 69
Pyrosequencing
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 70
Next Generation Sequencing
Specificaties
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 71
Next Generation Sequencing
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 72
Next Generation Sequencing
krachtige maar complexe technologie capaciteit enorm gestegen (500x) goedkoop per base, nog duur per run vereist expertise in moleculaire biologie en bio-informatica • zal technisch nog sterk evolueren • reeds verspreid in medische genetica • mogelijke toepassingen in medisch laboratorium voorlopig nog beperkt: • • • •
• •
somatische mutaties (personalized medicine) pharmacogenomics ?
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 73
Digital PCR
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 74
Nabije toekomst
geïntegreerde systemen • • • • • • •
één platform automatiseerbaar hogere throughput contaminatie? flexibiliteit? grotere schaal centraal
‘black box’ instrumenten • • • • • • • • •
eenvoudige bediening gesloten systeem weinig interpretatie geen speciale opleiding nodig geen speciale omgevingseisen random access dringende en 24/7 onderzoeken kleinere labo’s perifere sites
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 75
Start to PCR?
• behoefte/meerwaarde? • aantal aanvragen? • doorlooptijd? • frequentie? • alleenstaand of in panel? • graad van automatisatie? • koppeling met LIS? • flexibiliteit? • open of gesloten architectuur? Een blik in de moleculaire keuken
• gespecialiseerd personeel? • KOSTPRIJS!
4 oktober 2012 76
Dagelijkse kost of delicatesse?
Een blik in de moleculaire keuken 4 oktober 2012 77
