Vysoké učení technické v Brně Fakulta strojního inženýrství Ústav mechaniky těles, mechatroniky a biomechaniky

Vysoké učení technické v Brně Fakulta strojního inženýrství Ústav mechaniky těles, mechatroniky a biomechaniky

Ing. Michal Pásek, PhD.

Využití výpočtového modelování ve výzkumu elektrofyziologických dějů u srdečních buněk Computational modelling in the research of electrophysiological processes in cardiac cells

Teze habilitační práce Obor: Aplikovaná mechanika

Brno 2010

Klíčová slova: výpočtové modelování, srdeční buňka, transverzálně-axiální tubulární systém, propafenon, haloperidol Keywords: computer modelling, cardiac cell, transverse-axial tubular system, propafenone, haloperidol

Fakulta strojního inženýrství Vysokého učení technického v Brně

© Michal Pásek, 2010 ISBN: 978-80-214-4187-3 ISSN: 1213-418X

OBSAH 1 Úvod…………………………………………………………………………………………….. 5 2 Modelování elektromechanické aktivity u srdečních buněk………………………………... 5 2.1 Historie vzniku a vývoje modelů………………………………………......................…......5 2.2 Nové experimentální poznatky……………………………………………………….......... 7 2.3 Matematický popis transverzálně-axiálního tubulárního systému v modelech srdečních komorových buněk…………………………………………………………………………….... 9 2.3.1 Struktura modelů….…………………………………………………….…………... 10 2.3.2 Elektrická interakce mezi povrchovou a tubulární membránou…….......................... 11 2.3.3 Zastoupení iontových proudů v povrchové a tubulární membráně…………............. 12 2.3.4 Iontová difuze mezi extracelulárním a tubulárním prostorem………………………. 13 2.4 Modelování a analýza funkce transverzálně – axiálního tubulárního systému u srdečních komorových buněk…………………………………………...................................................... 13 2.4.1 Elektrofyziologické děje v buněčných modelech s TATS………………………...... 13 2.4.2 Velikost iontově-koncentračních změn v TATS ……….……………………........... 18 2.4.3 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na iontové proudy …………………..... 19 2.4.4 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na koncentrační změny Ca2+ v buňce….21 2.4.5 Shrnutí výsledků…………………………………………………….......................... 23 3 Modelování účinku farmak na membránové proudy srdečních buněk……….................... 23 3.1 Historie vzniku a vývoje modelů……………………………………………….………….. 23 3.2 Modelování účinku propafenonu na membránový proud INa……………………………… 24 3.2.1 Experimentální základ………………………………………………………………. 24 3.2.2 Matematický popis interakce propafenonu s INa-kanály ………………..…............... 27 3.2.3 Modelování blokády membránového proudu INa propafenonem….………………... 29 3.2.4 Interpretace mechanizmu blokády……………………………………………….......30 3.3 Modelování účinku haloperidolu na membránový proud Ito……………………………… 31 3.3.1 Experimentální základ……………………………………………………………..... 31 3.3.2 Matematický popis interakce haloperidolu s Ito-kanály …………………………….. 33 3.3.3 Modelování blokády membránového proudu Ito haloperidolem……………………. 34 3.3.4 Interpretace mechanizmu blokády……………….…………………………………..35 4 Závěr……..……………………………………………………………………………………. 36 5 Soubor publikací zahrnutých do habilitační práce..……………………………………….. 37 6 Literatura……………………………………………………………………………………... 38 7 Seznam vybraných symbolů..……………………………………………………………....... 40

3

Ing. Michal Pásek, Ph.D. Michal Pásek získal akademický titul Ing. na Fakultě strojního inženýrství Vysokého učení technického v Brně v roce 1995 po absolvování pětiletého studia v oboru Aplikovaná mechanika. Po ukončení inženýrského studia byl ve stejném roce přijat do doktorského studijního programu v oboru Inženýrská mechanika. Hlavním záměrem jeho doktorského studia bylo využití metod výpočtového modelování pro simulaci biologických procesů. Již od samého začátku tohoto studia začal aktivně spolupracovat s Laboratoří celulární elektrofyziologie Fyziologického ústavu Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně, kde probíhal výzkum zaměřený na objasnění role membránových kanálů a přenašečových systémů v regulaci kontraktility srdečních buněk vedený manželi Šimurdovými. Během doktorského studia byl Michal Pásek zapojen do řešení dvou grantových projektů (GAČR 106/96/0652 a GAČR 305/97/0043), v rámci kterých sestavil několik modelů elektromechanické aktivity srdečních buněk a dva modely interakce specifických farmak (propafenon, 4-aminopyridin) s membránovými kanály. Vzhledem k úzké návaznosti této teoretické práce na práci experimentální se v této době (1995-1999) účastnil také mnoha experimentálních měření jejichž cílem bylo vyšetření vlivu některých kardioaktivních látek na charakteristiky membránových proudů u izolovaných srdečních buněk. Doktorské studium ukončil v r. 1999 obhajobou disertační práce na téma „Výpočtové modelování fyziologických procesů na srdečních buňkách (blokáda membránových kanálů)“. V r. 1999 se Michal Pásek stal vědeckým pracovníkem brněnské pobočky Ústavu termomechaniky AVČR a o rok později získal vedlejší pracovní poměr (odborný asistent) na Ústavu fyziologie Lékařské fakulty Masarykovy univerzity v Brně. Právě kombinace experimentálního a výpočtového zázemí, které tyto instituce poskytují, mu vytvořila podmínky pro pokračování v experimentálně-teoretickém výzkumu elektrofyziologických procesů na srdečních buňkách. Od roku 2000 se podílel na řešení několika výzkumných záměrů (AV0Z 2076919, AV0Z 20760514, MŠMT J07/98:141100004, MŠMT MSM0021622402). V roce 2002 získal postdoktorandský grant (GAČR 204/02/D129) a v roce 2004 grant od Britské fyziologické společnosti (Junior Fellowship). Hlavním předmětem jeho vědecké aktivity bylo výpočtové modelování fyziologické funkce membránového transverzálně-axiálního tubulárního systému u srdečních komorových buněk a modelování interakce vybraných farmak s membránovými kanály srdečních buněk.V roce 2003 absolvoval zahraniční stáž v Laboratoři celulární bioenergetiky na Univerzitě Josepha Fouriera v Grenoblu a od roku 2005 čtyři zahraniční stáže na Ústavu fyziologie a farmakologie University v Bristolu. Dlouhodobě spolupracuje s několika zahraničními pracovišti z nichž nejvýznamnější je spolupráce s institutem INSERM v Lyonu (Dr. Georges Christé) a s Ústavem fyziologie a farmakologie University v Bristolu (Prof. Clive H. Orchard). Od roku 2005 je členem Britské fyziologické společnosti. Stěžejní výsledky jeho dosavadní vědecké práce byly představeny na 62 převážně mezinárodních vědeckých konferencích (89 příspěvků) a v pracích publikovaných in extenso v 19 recenzovaných (z toho 15 impaktovaných) vědeckých časopisech. Své pedagogické zkušenosti Michal Pásek uplatňuje na Lékařské fakultě Masarykovy univerzity v Brně, kde je od r. 2000 zapojen do výuky fyziologie. V rámci demonstrací také seznamuje studenty s využitím matematických modelů ve výzkumu biofyzikálních dějů u srdce a u srdečních buněk.

4

1 ÚVOD Výzkum v oblasti elektrofyziologie a biomechaniky srdečního svalu zaznamenal v posledních dvou desetiletích pozoruhodný rozvoj. Vedle stále hlubšího objasňování buněčných procesů zodpovědných za elektrickou a mechanickou aktivitu srdce bylo značné úsilí věnováno také hledání příčin vzniku a možností účinné léčby srdečních onemocnění. Základem obou přístupů byly experimentální práce na izolovaných buňkách nebo multicelulárních preparátech, které podávaly informace nezbytné pro vysvětlení buněčných elektrofyziologických dějů a jejich vztahů k mechanické odezvě. Kromě jiných objevů klíčového významu byly v tomto období získány také nové poznatky o dějích probíhajících v srdečních buňkách na molekulární úrovni. Ukázalo se, že heterogenita srdeční tkáně z hlediska rozložení transportních systémů je podstatně větší než se dříve předpokládalo. Nové poznatky zde vedly k hlubšímu pochopení specifických projevů vazby mezi excitací a kontrakcí a také k porozumění mechanizmů vzniku poruch srdečního rytmu. K nejčastějším srdečním onemocněním v naší populaci patří nepravidelná srdeční aktivita (srdeční arytmie). Podáním specifických látek je možné narušené elektrické vlastnosti srdečních buněk korigovat tak, aby jejich přirozená odolnost proti vzniku nepravidelných excitací byla obnovena. Na druhé straně, některá farmaka používaná pro léčbu zcela jiných onemocnění mohou svými vedlejšími účinky vznik srdečních arytmií podpořit a v některých případech zavinit i předčasnou smrt. Vyšetření vlivu těchto látek na elektrickou aktivitu srdečních buněk a na funkci membránových transportních systémů (zprostředkovávajících přenos iontů mezi buňkou a vnějším prostředím) má z tohoto důvodu nezastupitelný význam pro klinickou praxi. Nedílnou součástí zmíněného výzkumu je výpočtové modelování. Využívá znalostí biofyzikálních principů k formulaci matematických modelů a následně k realizaci simulací, které testují správnost navržených hypotéz a zjevují komplexnost a vzájemnou podmíněnost studovaných jevů. Právě simulace, provedené od r. 2000 na vlastních matematických modelech, výrazně přispěly k vysvětlení výsledků elektrofyziologických měření realizovaných v Laboratoři celulární elektrofyziologie na Fyziologickém ústavu Lékařské fakulty Masarykovy university v Brně a v laboratořích našich zahraničních partnerů (Ústav fyziologie a farmakologie university v Bristolu, institut INSERM v Lyonu). Tyto experimentálně-simulační studie byly zaměřeny do dvou oblastí celulární srdeční elektrofyziologie. Hlavním cílem bylo vysvětlení specifických vlastností transverzálně-axiálního tubulárního systému u srdečních komorových buněk a objasnění jejich významu pro elektrickou a mechanickou buněčnou aktivitu. Dalším záměrem bylo objasnění mechanizmu účinku vybraných farmak (propafenon, haloperidol, perfenazin aj.) na membránové kanály. Stěžejní experimentální údaje a výsledky výpočtového modelování publikované od r. 2001 v recenzovaných převážně impaktovaných pracích (kap. 5) jsou shrnuty v následujícím textu.

2 MODELOVÁNÍ ELEKTROMECHANICKÉ AKTIVITY U SRDEČNÍCH BUNĚK 2.1 HISTORIE VZNIKU A VÝVOJE MODELŮ Historie vzniku matematických modelů popisujících elektrofyziologické děje u srdečních buněk [1] je úzce spojena s rozvojem metod pro měření jejich biofyzikálních projevů. Hlavním mezníkem, který podnítil rozvoj měření elektrických buněčných projevů, byl objev metody, umožňující měřit napětí na buněčné membráně prostřednictvím skleněných mikroelektrod (Ling a Gerard) v roce 1949. Následovala řada experimentálních prácí, jejichž cílem bylo vyšetření a objasnění elektrických vlastností excitabilních buněk. Nejvýznamnějšími z nich byly práce

5

anglických badatelů A. L. Hodgkina a A. F. Huxleyho na membránách nervových vláken sépie (Hodgkin a Huxley, 1952a; 1952b) završené prvotním kvantitativním popisem (Hodgkin a Huxley, 1952c). Tento popis zahrnoval formalizaci tří základních iontových složek (INa, IK, ICl) celkového membránového proudu (Im) a odvození vztahu pro výpočet změn membránového napětí (Vm) na měřeném axonu sépie. Za tuto experimentální a teoretickou práci byla zmíněným badatelům společně s australským neurofyziologem J. C. Ecclesem v roce 1963 udělena Nobelova cena. První pokus o uplatnění Hodgkin-Huxleyho formalizmu u srdečních buněk provedl začátkem šedesátých let anglický elektrofyziolog D. Noble. Ukázal, že s jistou modifikací tohoto kvantitativního popisu lze simulovat také průběh základních membránových proudů a akčního napětí (AN) u Purkyňových vláken - specializovaných buněk vodivého systému srdce (Noble, 1962). Struktura jeho modelu je znázorněna na obr.1. V roce 1969 publikoval společně s R. W. Tsienem průlomovou práci, která představovala matematický popis repolarizace Purkyňova vlákna (Noble a Tsien, 1969b), který byl již navržen na základě experimentálních výsledků získaných u srdečních buněk (Noble a Tsien, 1968; 1969a).

INa

IK1

IK2

Ian

intracellular space

[Na+]i [Ca2+]i

extracellular space

[Na+]e [Ca2+]e [K+]e

[K+]i

sarcolemma

Obr. 1 Struktura prvního modelu Purkyňova vlákna publikovaného v roce 1962. Model zahrnoval následující iontové proudy: sodíkový přechodný proud (INa), draslíkový časově nezávislý proud (IK1), draslíkový zpožděný proud (IK2) a aniontový proud (Ian). Převzato z [1]. S nárůstem experimentálních výsledků v 70-tých letech začala etapa vývoje modelů, jejichž cílem bylo simulovat změny intracelulární vápníkové koncentrace ([Ca]i) a objasnit jejich vztah k vazbě mezi excitací a kontrakcí. První, spíše však popisný model tohoto druhu navrhli Bassingthwaighte a Reuter v roce 1972. Další komplexnější model, který ukazoval roli vápníkového proudu (ICa) v procesu utváření akčního napětí u Purkyňova vlákna, byl publikován v roce 1975 (McAllister et al.). O dva roky později byl navržen model srdeční komorové buňky (Beeler a Reuter, 1977), který již umožňoval simulovat změny [Ca]i během akčního napětí a jejich zpětný vliv na průběh ICa. I přes svoji jednoduchost dokázal tento model adekvátně rekonstruovat výsledky experimentálních měření jako např. pomalé zotavování membránových proudů z inaktivace, frekvenční závislost trvání AN a oscilace klidového membránového napětí. Velkým přínosem pro hlubší objasnění intracelulárních dějů se stal následný zdokonalený model elektrické aktivity Purkyňova vlákna, který v roce 1985 publikovali DiFrancesco a Noble. Tento model byl oproti předcházejícím obohacen o popis funkce membránových výměnných mechanizmů (proteiny zodpovědné za proudy INaCa a INaK) a sarkoplazmatického retikula (SR). Poprvé zde také byly začleněny formulace umožňující simulovat experimentálně pozorované změny všech podstatných iontových koncentrací v cytoplazmě ([Na+]i, [K+]i, [Ca2+]i) při různých koncentračních hladinách

6

extracelulárních iontů či blokádě proudu INaK. Modifikace tohoto modelu provedená za účelem simulace vazby mezi excitací a kontrakcí u síňových myocytů králíka byla publikována v roce 1987 (Hilgemann a Noble). Ačkoliv koncepce modelů navržených v 70-tých a 80-tých letech zůstala zachována dodnes, vytrvalá snaha o rekonstrukci nových experimentálních výsledků vyžadovala upřesnění či zavedení popisu nových buněčných mechanizmů. V sérii modelů elektrické aktivity komorových buněk publikovaných skupinou prof. Rudyho (Luo a Rudy, 1991; Luo a Rudy, 1994; Zeng et al., 1995) byl modifikován popis draslíkových proudů a intracelulárního vápníkového transportu. Simulace na těchto modelech umožnily studovat vliv extracelulární draslíkové koncentrace na trvání AN, podmínky vzniku nepravidelné buněčné aktivity a vliv nově zavedených komponent draslíkového zpožděného proudu (IKr a IKs) na průběh repolarizace a zotavování AN u komorových buněk. Další významnou modifikací modelů bylo zavedení intracelulárních kompartmentů (Nordin, 1993; Nygren et al., 1998) zohledňujících nehomogenní rozložení koncentrace Ca2+ v cytoplazmě během buněčné aktivity. Klíčová interakce mezi vápníkovými kanály typu L v povrchové membráně a vápníkovými kanály v membráně SR (tzv. ryanodinovými receptory) iniciující přechodný nárůst cytoplazmatické koncentrace Ca2+ a následnou kontrakci byla ve stejném období detailněji formulována v modelu komorové buňky morčete (Jafri et al., 1998). Adaptace tohoto modelu na srdeční komorové buňky psa, potkana a myši byly následně publikovány v pracích autorů: Winslow et al. (1999), Pandit et al. (2001) a Bondarenko et al. (2004). V roce 2004, Shannon et al. modifikovali strukturu těchto modelů zavedením dalšího subintracelulárního kompartmentu v modelu komorové buňky králíka. Tato změna umožnila přesněji simulovat gradient Ca2+ pod buněčnou membránou, a tedy i průběh proudů zodpovědných za transmembránový přenos Ca2+ během buněčné aktivity. Závěrem je třeba zmínit též modely zahrnující lokální řízení uvolňování Ca2+ ze zásobních prostor SR (Rice et al., 1999; Greenstein a Winslow, 2002; Hinch et al., 2004; Greenstein et al., 2006) navržené pro studium specifických detailů vazby excitace-kontrakce. Velká složitost a výpočtová náročnost těchto modelů však prozatím ztěžuje jejich širší využití. 2.2 NOVÉ EXPERIMENTÁLNÍ POZNATKY Jak vyplývá z historie vývoje modelů, vedle zpřesňování a doplňování prvků membránového transportního systému byla velká pozornost věnována matematickému popisu iontověkoncentračních změn, ke kterým dochází v intracelulárním prostoru během buněčné aktivity (Beeler a Reuter, 1977; DiFrancesco a Noble, 1985; Hilgemann a Noble, 1987; Jafri et al., 1998; Shannon et al., 2004 a další). Cílem této snahy bylo objasnit buněčné děje zahrnuté ve vazbě mezi excitací a kontrakcí. Z řady experimentálních a modelových prací je dnes již zřejmé, že hlavním iniciátorem buněčné kontrakce je přechodné zvýšení cytoplazmatické koncentrace iontů Ca2+, ke kterému dochází po aktivaci proudu ICa a následném vyplavení iontů Ca2+ ze zásobáren SR (Bers, 2002 - přehled; Soeller a Cannell, 2004 - přehled). Další práce ukázaly, že membránový transport iontů způsobuje v omezeném mezibuněčném prostoru významné iontově-koncentrační změny (např. Attwell et al., 1979; Bers 1983), které zpětně ovlivňují transmembránový iontověkoncentrační gradient, aktivitu iontových přenašečů, a tedy i velikost iontových toků přes buněčnou membránu. Touto zpětnou vazbou tedy dochází k ovlivnění buněčné elektrické aktivity, iontově-koncentračních změn v cytoplazmě a finálně i kontrakce (Šimurda et al., 1992; 1996). Ve své práci publikované v roce 1986 nastínil D.M. Bers hypotézu, že transmembránový přenos Ca2+ probíhá především ve speciálních invaginacích buněčné membrány, které prostupují nitro srdečních komorových buněk. Přes závažnost této hypotézy nebyla v 80-tých letech tomuto

7

membránovému komplexu, který byl vzhledem ke svému tvaru a prostorové orientaci v buňce nazván systémem transverzálně-axiálních tubulů (TATS, Forbes et al., 1984), věnována větší pozornost. Otázka iontového transportu v TATS a jeho důsledků pro buněčnou elektrickou aktivitu a vazbu excitace-kontrakce byla oživena až sérií elektrofyziologických prací publikovaných v 90-tých letech (Yasui et al., 1993; Tourneur et al., 1994; Yao et al., 1997; Shepherd a McDonough, 1998), ze kterých vyplynulo, že během buněčné aktivity dochází také v TATS k významným změnám iontových koncentrací. Měření průběhu změny klidového membránového napětí po rychlé změně extracelulární koncentrace draslíku ([K+]e) stejně jako měření proudu ICa a přechodných změn [Ca2+]i po rychlé změně extracelulární koncentrace vápníku ([Ca2+]e) (Yao et al., 1997) zřetelně ukazovaly, že iontová difuze v TATS komorových buněk potkana a králíka je značně omezena a že vyrovnávání tubulárních iontových koncentrací ([Ca2+]t, [K+]t, [Na+]t) s koncentracemi extracelulárními vyžaduje relativně dlouhý čas řádu stovek milisekund (obr. 2). Obdobná měření na komorových buňkách morčete (Shepherd a McDonough, 1998, obr. 3-4) vedla k podobným závěrům.

A)

B)

e

e

Obr. 2 Vliv rychlého snížení extracelulární koncentrace Ca2+ z 1.08 mM („normal [Ca2+]e“) k nulové hodnotě na velikost ICa u srdečních komorových buněk potkana a králíka. ICa byl aktivován 200 ms trvajícím napěťovým pulzem z -40 mV na 0 mV v různých časech (100, 200, 300, 500 a 1000 ms) po změně [Ca2+]e. A: Průběhy ICa registrované ve vyznačených časech po změně [Ca2+]e. B: Závislosti velikosti ICa na době trvání nulové koncentrace [Ca2+]e. Proud je normalizován k velikosti ICa při [Ca2+]e= 1.08 mM. Převzato z publikace Yao et al. (1997). První přímá měření průběhu změn [Ca2+]t po rychlé změně [Ca2+]e u buněk morčete publikovali ve stejném období Blatter a Niggli (1998). Z jejich analýzy vyplynulo, že iontově-koncentrační změny v hlubších částech TATS mohou být oproti extracelulárním zpožděny dokonce až o několik sekund. Paralelně probíhající výzkum mikrostruktury TATS, který byl založen převážně na elektronové mikroskopii (Page, 1978; Forbes, 1984; Forbes, 1988; Sommer, 1992) přinesl důležité informace o struktuře a lokalizaci TATS uvnitř buněk. Práce, které provedli Amsellem et al. (1995) a Soeller a Cannell (1999) na komorových buňkách morčete a potkana poskytly navíc údaje umožňující

8

provést prostorovou rekonstrukci TATS (obr. 3) a přesnější odhad parametrů nezbytných pro jeho matematický popis. Ukázalo se, že tubulární membrána u savců může tvořit víc jak 50% celkové plochy buněčné membrány zatímco objem TATS pouze 2 - 4% celkového buněčného objemu. K dovršení celkového obrazu o významu TATS přispěly též experimentální práce, které dokumentovaly, že podstatná část membránového transportního systému je lokalizována právě v tubulární membráně. Zdokonalená technika měření a nové experimentální metody jako osmotická detubulace jasně ukazovaly, že některé z iontových proudů, které hrají zásadní roli ve vazbě excitace-kontrakce, mají svůj původ převážně v TATS. Jedná se zejména o ICa (Kawai et al., 1999), INaCa a INaK (Despa et al., 2003).

A)

2 µm

B)

5 µm

Obr. 3 3D rekonstrukce TATS v segmentu srdeční komorové buňky morčete (A) a potkana (B). Převzato z publikací Amsellem et al. (1995) a Soeller a Cannell (1999).

Tato nová odhalení zcela změnila dosavadní převažující názory na funkci TATS a otevřela cestu pro jeho další experimentálně-teoretický výzkum, jehož cílem bylo zodpovědět následující otázky: (i) Jak velké jsou iontově-koncentrační změny v TATS během buněčné aktivity? (ii) Mohou tyto koncentrační změny významně ovlivnit membránové iontové proudy a membránové akční napětí? (iii) Mohou tyto koncentrační změny významně ovlivnit intracelulární iontovou rovnováhu a buněčnou kontrakci? (iv) Jak rozdílné jsou iontově-koncentrační změny v TATS a jejich důsledky u různých druhů zvířat? (v) Jaký vliv by měla redukce TATS, ke které dochází v patologických podmínkách, na funkci srdečních komorových buněk? 2.3 MATEMATICKÝ POPIS TRANSVERZÁLNĚ − AXIÁLNÍHO TUBULÁRNÍHO SYSTÉMU V MODELECH SRDEČNÍCH KOMOROVÝCH BUNĚK Základem teoretické části výzkumu funkce TATS u srdečních komorových buněk je matematický popis tohoto membránového systému a jeho integrace s kvantitativním modelem buněčné elektromechanické aktivity. První průkopnická práce představující kvantitativní integraci TATS s modelem srdeční komorové buňky byla publikována v r. 2003 [2]. Objasnění velikosti a významu iontově koncentračních změn v tubulárním systému u různých druhů zvířat si však vyžádalo sestavení modelů respektujících mezidruhové rozdíly. Tato potřeba vedla k vytvoření

9

modelu srdeční komorové buňky potkana [3] a morčete [4] se specifickými parametry TATS odvozenými z již dostupných experimentálních dat. Struktura těchto modelů, vymezení rozdílů mezi parametry TATS a způsob kvantitativní integrace TATS s popisem buněčné elektromechanické aktivity jsou obsahem následujících kapitol. 2.3.1 Struktura modelů Struktura sestavených modelů srdečních komorových buněk [2, 3, 4] zahrnujících kvantitativní popis TATS je znázorněna na obr. 4. Lze konstatovat, že tato struktura stejně jako matematický popis jsou rozšířením již zmíněných modelů autorů Jafri et al. (1998) a Pandit et al. (2001). Mezi podstatné strukturální prvky modelů s TATS patří: povrchová a tubulární buněčná membrána s iontovým transportním systémem, cytoplazma obsahující intracelulární ionty Ca2+, Na+ a K+, absorbující a uvolňovací kompartment sarkoplazmatického retikula (NSR, JSR), subintracelulární kompartment ([Ca2+]ss) reprezentující úzký prostor v němž dochází k interakci mezi Ca-kanály buněčné membrány a Ca-kanály JSR, intracelulární pufry Ca2+ (kalmodulin, troponin a kalsekvestrin) a vnitřní prostor TATS obsahující tubulární ionty. Základní geometrické parametry modelu buňky potkana [3] a morčete [4] včetně parametrů TATS odvozených z mikroskopických analýz buněčné mikrostruktury u těchto druhů (Amsellem et al., 1995; Satoh et al., 1996; Soeller a Cannell, 1999) specifikuje tab.1. Z uvedených údajů vyplývá, že z celkové plochy buněčné membrány reprezentuje tubulární membrána u modelu potkana 56% a u modelu morčete 52.6%. Naproti tomu, objem TATS tvoří u těchto modelů pouze 3.3% a 2.9% celkového buněčného objemu. surface membrane currents intracellular space

Jup

NSR

B JSR B

ICa,s 2+ B [Ca ]ss

ICa,t

subspace

Jrel

[Na+]i

[Na+]e

[Ca2+]i

[Ca2+]e

[K+]i

[K+]e

tubular membrane currents

[Na+]t [Ca2+]t [K+]t

tubular space

extracellular space

Obr. 4 Obecné strukturální schéma modelů komorových buněk s TATS publikovaných v pracích [2, 3, 4]. Silné oboustranné šipky v povrchové a tubulární membráně reprezentují povrchový a tubulární iontový transport. Černá tečkovaná oboustranná šipka reprezentuje iontovou difuzi mezi extracelulárním prostorem a prostorem TATS. Tenké černé šipky ukazují intracelulární transport Ca2+. NSR, JSR a B označují absorbující a uvolňovací část sarkoplazmatického retikula a intracelulární Ca2+ pufry. Plné obdélníky v membráně JSR označují „ryanodinové“ Ca-kanály uvolňující Ca2+ z JSR do úzkého subintracelulárního prostoru. Převzato z [6].

10

potkan

morče

Vc [µm3]

12739

14362

VTATS [µm3]

420.38

416.49

Sc [µm2]

10000

10688

STATS [µm2]

5605

5623

Tab. 1 Základní geometrické parametry modelu komorové buňky potkana a morčete včetně parametrů TATS. Vc a Sc označují celkový objem buňky a celkovou plochu buněčné membrány. VTATS a STATS označují objem TATS a plochu tubulární membrány. Údaje převzaty z [3] a [4].

2.3.2 Elektrická interakce mezi povrchovou a tubulární membránou Elektrickou interakci mezi povrchovou a tubulární membránou znázorňuje obr. 5. TATS byl popsán jako samostatný kompartment oddělený od povrchové membrány a propojený s extracelulárním prostorem přes náhradní elektrický odpor tubulárního systému (Rst). Příspěvek jednoho tubulu k Rst byl popsán jako odpor válcového vodiče, jehož délka a poloměr jsou dány polovinou efektivní délky (lt) a středním poloměrem (rt) tubulu. Specifický odpor odpovídá extracelulárnímu roztoku (ρext= 83.3 Ω·cm). Z elektrického hlediska reprezentuje TATS paralelní kombinaci všech tubulů (nt) vycházejících z povrchové membrány. Náhradní odpor TATS je tak určen vztahem:

Rst = ρext lt / (2 π rt2 nt). surface membrane

tubular membrane

Im Rel Ims Iis Vms

ionic transport s

Imt Iit

ICs Cs

intracellular space

ICt

ionic transport t

Ct Vmt

Rst extracellular space Obr. 5 Schéma elektrické interakce mezi povrchovou a tubulární membránou. Vms, Ims, Iis, ICs, Cs a Vmt, Imt, Iit, ICt, Ct označují elektrické napětí, celkový proud, iontový proud, kapacitní proud a elektrickou kapacitu povrchové (s) a tubulární (t) membrány. Rel a Rst označují sériový odpor mikroelektrody a odpor TATS. Im je stimulační proud. Převzato z [3].

11

Odpor cytoplazmy, která propojuje povrchovou a tubulární membránu na intracelulární straně elektrického okruhu byl vzhledem ke svému specifickému odporu (ρint ≈ 253 Ω·cm (Daut, 1982; Cooklin et al., 1998)) a podstatně většímu elektricky vodivému prostoru zanedbán. Jak vyplývá ze schématu elektrické interakce (obr. 5), Im je roven součtu celkových proudů procházejících přes povrchovou membránu (Ims) a membránu TATS (Imt): Im = Ims + Imt. V režimu vnuceného proudu „current clamp“ je kromě krátkého intervalu stimulace Im= 0. Mezi membránami tedy cirkuluje společný proud (Icirc): Icirc = Ims = -Imt = (Vms - Vmt) / Rst V režimu vnuceného napětí „voltage clamp“ nabývá naopak Im určité velikosti, kterou lze vyjádřit z napěťového úbytku na sériovém odporu (Rel): Im = (Vel - Vms)/Rel. 2.3.3 Zastoupení iontových proudů v povrchové a tubulární membráně Modelování fyziologické funkce komorových buněk je kriticky závislé na správném nastavení velikostí jednotlivých iontových proudů v povrchové a tubulární membráně. Z experimentálních prací publikovaných v nedávné době (Frank et al., 1992; Yasui et al., 1993; Iwata et al., 1994; Tourneur et al., 1994; Shepherd a McDonough,1998; Kawai et al., 1999; Christé, 1999; Clark et al., 2001; Komukai et al., 2002; Yang et al., 2002; Thomas et al., 2003; Despa et al., 2003, Rasmussen et al., 2004) vyplynulo, že zastoupení některých bílkovin zodpovědných za transport iontů v TATS stejně jako velikosti některých iontových proudů v tubulární membráně vykazují významné rozdíly ve srovnání s membránou povrchovou. V matematických modelech je toto zjištění zohledněno prostřednictvím parametru fx,t, který definuje procentuální zastoupení (frakce) jednotlivých druhů transportních bílkovin v TATS. Pro model komorové buňky potkana a morčete jsou tyto parametry spolu s odkazy na příslušné experimentální práce specifikovány v tab. 2 a 3. Frakce transportních bílkovin v TATS u modelu komorové buňky potkana proud

fx,t [%]

literatura

proud

fx,t [%]

literatura

INa

56

-

INa,b

56

-

ICa

87

a

ICa,b

56

-

IKto

56

b

IKb

56

-

IKss

76

b

INaCa

81

c,d

IK1

56

b

INaK

59

d

If

56

-

IpCa

56

-

Tab. 2 Procentuální vyjádření frakcí transportních bílkovin v tubulární membráně (fx,t) u modelu komorové buňky potkana [3]. Rozdíl 100 - fx,t udává frakce transportních bílkovin v povrchové membráně. Reference: (a) Kawai et al. (1999), (b) Komukai et al. (2002), (c) Yang et al. (2002), (d) Despa et al. (2003). Hodnoty bez citací (56 %) vychází z předpokladu rovnoměrného rozložení příslušných proteinů po celé buněčné membráně.

12

Frakce transportních bílkovin v TATS u modelu komorové buňky morčete proud

fx,t [%]

literatura

proud

fx,t [%]

literatura

INa

57

a

IK(ATP)

52.6

d,e

ICa,L

64

a

INaps

52.6

-

IK,L

64

a

Ins(Ca)

52.6

-

IKr

52.6

b

INab

52.6

-

IKs

52.6

b

ICab

52.6

-

IK1

80

c

INaCa

52.6

f

IKp

52.6

-

INaK

52.6

g

IK(Na)

52.6

-

IpCa

20

-

Tab. 3 Procentuální vyjádření frakcí transportních bílkovin v tubulární membráně (fx,t) u modelu komorové buňky morčete [4]. Rozdíl 100 - fx,t udává frakce transportních bílkovin v povrchové membráně. Reference: (a) Shepherd and McDonough (1998), (b) Rasmussen et al. (2004), (c) Christé (1999), (d) Yasui et al. (1993), (e) Tourneur et al. (1994), (f) Kieval et al. (1992), (g) McDonough et al. (1996). Hodnoty bez citací (52.6 %) vychází z předpokladu rovnoměrného rozložení příslušných proteinů po celé buněčné membráně. 2.3.4 Iontová difuze mezi extracelulárním a tubulárním prostorem Klíčovým parametrem určujícím rychlost výměny iontů K+, Na+ a Ca2+ mezi extracelulárním a tubulárním prostorem v buněčných modelech jsou časové konstanty τK,t, τNa,t a τCa,t. Tyto konstanty závisí na geometrických vlastnostech TATS (průměr a délka tubulů, složitost tubulární sítě aj.), které u různých druhů zvířat vykazují významné odlišnosti. Z tohoto důvodu vyžadují specifické nastavení podle příslušných experimentálních dat. U modelu komorové buňky potkana a morčete byly hodnoty těchto konstant (tab. 4) nastaveny tak, aby umožnily rekonstruovat experimentální výsledky ukazující změny klidového membránového napětí (Vm) nebo membránových proudů (INa a ICa) po rychlé změně extracelulárních iontových koncentrací [K+]e, [Na+]e a [Ca+]e (Yao et al., 1997, Shepherd a McDonough, 1998).

potkan τK,t= 150 ms

τNa,t= 150 ms

morče τCa,t=500 ms

τK,t= 200 ms

τNa,t= 200 ms

τCa,t= 240 ms

Tab. 4 Časové konstanty iontové výměny mezi tubulárním a extracelulárním prostorem v modelu srdeční komorové buňky potkana [3] a morčete [4].

2.4 MODELOVÁNÍ A ANALÝZA FUNKCE TRANSVERZÁLNĚ − AXIÁLNÍHO TUBULÁRNÍHO SYSTÉMU U SRDEČNÍCH KOMOROVÝCH BUNĚK 2.4.1 Elektrofyziologické děje v buněčných modelech s TATS Během aktivity srdečních buněk dochází v buněčné membráně k otevírání a zavírání iontových kanálů. Přenos iontů přes buněčnou membránu doprovázející tento proces a následná změna

13

membránového elektrického náboje způsobuje charakteristické změny membránového napětí zvané akční napětí (AN). Průběhy ustálených AN simulované na modelu srdeční komorové buňky potkana při různých frekvencích stimulace a jejich srovnání s příslušnými experimentálními záznamy [3] vystihuje obr. 6. Charakteristickou vlastností komorových kardiomyocytů potkana, kterou model reprodukuje, je rozšiřování AN s rostoucí stimulační frekvencí. Vyšetření časových průběhů iontových proudů procházejících povrchovou a tubulární membránou stejně jako změn iontových koncentrací v intracelulárním a tubulárním prostoru bylo na modelu provedeno po ustálení (minimální doba stimulace 600 s) při frekvenci stimulace 5 Hz (fyziologická tepová frekvence potkana v klidu). Dynamické změny těchto veličin jsou společně s průběhy AN znázorněny na obr. 7.

A)

B)

Obr. 6 Ustálená akční napětí u komorové buňky potkana pří frekvenci stimulace 0.33, 1, 2, 2.5 a 3.33 Hz. A: Superponované experimentální záznamy, B: Superponované průběhy z modelu. Převzato z [3]. Jak vyplývá z obr. 7A, AN povrchové a tubulární membrány jsou na rozdíl od iontových proudů téměř identická. Tato shoda je důsledkem velké prostorové konstanty TATS (přibližně 240 µm) ve srovnání s délkou jednotlivých tubulů (střední délka 6.87 µm (Soeller a Cannel, 1999)) [2] a vysvětluje monoexponenciální pokles kapacitních proudů experimentálně měřených během napěťových pulzů. Zřetelný rozdíl mezi velikostí iontových proudů v povrchové a tubulární membráně je způsoben rozdílnými frakcemi příslušných transportních bílkovin v obou částech membrány (tab. 2) a do jisté míry také změnami iontových koncentrací v TATS během stimulačního cyklu. Simulaci časových proměn iontových koncentrací v intracelulárních kompartmentech a v TATS u modelu potkana ukazuje obr. 7B. Nejvýznamnější změny v cytoplazmě vykazuje koncentrace Ca2+ (viz [Ca2+]i), která se na začátku AN rychle zvyšuje a posléze, během repolarizace, navrací ke své diastolické hodnotě. Hlavní příčinou tohoto přechodného zvýšení je vyplavení iontů Ca2+ ze zásobáren sarkoplazmatického retikula (viz pokles [Ca2+]JSR)

aktivované proudy ICa,t a ICa,s.

Diastolická hladina [Ca2+]i stanovená na konci cyklu ([Ca2+]i,end = 0.23 µM) je v zobrazeném ustáleném stavu několikanásobně zvýšená oproti klidové hodnotě [Ca2+]i ([Ca2+]i,rest = 0.024 µM). Tento rozdíl odráží experimentálně pozorovanou intracelulární kumulaci Ca2+, ke které dochází

14

A)

B)

Obr. 7 Základní elektrofyziologické děje v modelu komorové buňky potkana při frekvenci stimulace 5 Hz (klidová tepová frekvence potkana). A: Akční napětí a membránové proudy. Plná čára označuje děje v povrchové membráně a tečkovaná čára děje v tubulární membráně. Horizontální linie vyznačují nulové hladiny membránového napětí a proudů. B: Intracelulární a tubulární iontové koncentrace. Horizontální plné linie vyznačují nulovou hladinu intracelulární koncentrace [Ca2+]i a velikost extracelulárních koncentrací [Ca2+]e, [K+]e a [Na+]e. Horizontální tečkované linie ukazují klidové hladiny iontových koncentrací [Ca2+]i, [Ca+]t a [K+]t . Převzato z [3].

15

při zvyšování frekvence buněčné stimulace (Frampton et al., 1991 aj.). Paralelně s nárůstem [Ca2+]i,end došlo též k významnému vzestupu diastolické hladiny [Na+]i ([Na+]i,end = 19.43 mM versus [Na+]i,rest = 4.52 mM) a k poklesu diastolické hladiny [K+]i ([K+]i,end = 124.94 mM versus [K+]i,rest = 140 mM). Přechodné změny [Na+]i a [K+]i během ustáleného stimulačního cyklu se však ukázaly být malé a z hlediska vlivu na buněčné elektrofyziologické děje nepodstatné. Tubulární koncentrace Ca2+ se na začátku AN rychle snižovala (viz průběh [Ca2+]t), a to v důsledku aktivace ICa,t a částečně také vlivem kladné polarity INaCa,t, během které jsou ionty Ca2+ přenášeny z TATS do cytoplazmy. Po inaktivaci ICa,t se její hladina pozvolně vracela k hodnotě [Ca2+]e (1.2 mM), k čemuž vedle difuze Ca2+ z extracelulárního prostoru do TATS zásadně přispělo obrácení polarity INaCa,t a aktivní odčerpávání Ca2+ z cytoplazmy do TATS přes tubulární Ca-pumpu (IpCa,t). Vedle změn koncentrace Ca2+ se v TATS ukázaly významné také změny koncentrace K+ (viz průběh [K+]t). Nárůst [K+]t během AN byl vyvolán aktivací draslíkových proudů IKto,t, IKss,t a IK1,t. Následné odeznění IKto,t a IKss,t, obrácení polarity IK1,t a aktivita INaK,t byly naopak zodpovědné za pozdější snižování [K+]t a její pokles pod úroveň [K+]e ke konci cyklu. Analogické simulace byly provedeny také na modelu morčete [4]. Srovnání simulovaných a experimentálně získaných průběhů AN při různé frekvenci stimulace ukazuje obr. 8. Na rozdíl od srdečních buněk potkana dochází s rostoucí stimulační frekvencí u buněk morčete ke zužování AN (Wang et al., 1988). Analýza tohoto jevu na modelu ukázala, že toto zužování je způsobeno zejména frekvenčně závislou kumulativní inaktivací ICa a rychlejším nástupem draslíkových proudů (IKr a IKs), které se po ukončení repolarizace při vyšší rychlosti stimulace nestačí plně deaktivovat [4]. Časové proměny iontových proudů ICa, INaCa a INaK, které jsou nejvýznamnější z hlediska vazby excitace-kontrakce a udržení intracelulární iontové rovnováhy, jsou společně s průběhy AN a [Ca2+]i znázorněny na obr. 9. Obdobně i zde se projevily rozdíly mezi povrchovou a tubulární složkou membránových proudů dané jak odlišnými frakcemi příslušných transportních bílkovin v obou částech buněčné membrány (tab. 3) tak i iontově-koncentračními změnami v TATS. Pro stimulační frekvenci 4 Hz (fyziologická tepová frekvence morčete v klidu) jsou ustálené iontově-koncentrační změny v TATS ilustrovány na obr. 10. Za významné lze opět považovat přechodné snižování [Ca2+]t na začátku AN (důsledek toku Ca2+ z TATS do cytoplazmy přes ICa,t a INaCa,t) a trvalé zvýšení hladiny [K+]t nad hodnotu [K+]e (důsledek toku K+ z cytoplazmy do TATS přes IKr,t, IKs,t, IKp,t a IK1,t).

A)

B) experiment

model

Obr. 8 Ustálená akční napětí u komorové buňky morčete pří frekvenci stimulace 1, 2, 3, 4 a 5 Hz. A: Superponované experimentální záznamy převzaté z práce Wang et al. (1988) B: Superponované průběhy z modelu. Převzato z [4].

16

Obr. 9 Akční napětí, intracelulární koncentrace [Ca2+]i a membránové proudy ICa (ICaL), INaCa a INaK simulované na modelu komorové buňky morčete při stimulaci z klidového stavu a po dosažení ustáleného stavu při frekvenci stimulace 2, 4 a 6 Hz. Plná čára označuje děje v povrchové membráně a tečkovaná čára děje v tubulární membráně. Převzato z [4].

Obr. 10 Ustálené koncentrační změny Ca2+, K+ a Na+ v TATS během stimulačního cyklu simulované na modelu komorové buňky morčete při frekvenci dráždění 4 Hz (klidová tepová frekvence morčete). Horizontální tečkované linie označují hladiny příslušných iontových koncentrací v klidovém stavu ([Ca2+]t,rest = 1.79 mM, [K+]t,rest = 5.46 mM, [Na+]t,rest = 140 mM) a hladiny iontových koncentrací v extracelulárním prostoru ([Ca2+]e = 1.8 mM, [K+]e = 5.4 mM, [Na+]e = 140 mM). Převzato z [4].

17

2.4.2 Velikost iontově-koncentračních změn v TATS Velikost iontově-koncentračních změn v TATS byla u obou modelů vyšetřena v rozsahu stimulačních frekvencí 1 - 6 Hz (obr. 11) [3, 4, 5]. Odčerpávání iontů Ca2+ z TATS u modelu potkana výrazně převažovalo nad jejich akumulací a zvyšování stimulační frekvence vedlo k nárůstu jeho maximální úrovně ze 7% na 14.5% (viz ∆[Ca2+]t - obr. 11A horní graf, vztaženo k hladině [Ca2+]e). Koncentrace [K+]t současně oscilovala mezi nárůstem v rozsahu 2.7 − 4.1% a poklesem v rozsahu 0.4 − 1.3% (viz ∆[K+]t - obr. 11A spodní graf, vztaženo k hladině [K+]e).

A)

B)

Rat

-4

1

2

3

4

5

6

-8 -12

2+

0

∆ [Ca ]t (%)

4 0 -4

4

4

3

3

0 -1

3

4

5

6

2

+

1

2

-12 -16

2

1

-8

-16

∆ [K ]t (%)

+

∆ [K ]t (%)

2+

∆ [Ca ]t (%)

4

Guinea pig

1

2

3

4

5

6

stimulation frequency (Hz)

1 0 1 2 3 4 5 6 stimulation frequency (Hz)

Obr. 11 Frekvenční závislost ustálených koncentračních změn [Ca2+]t a [K+]t u modelu srdeční komorové buňky potkana (A) a morčete (B). Procentuální velikosti změn jsou vztaženy k hladinám extracelulárních koncentrací (potkan: [Ca2+]e = 1.2 mM, [K+]e = 5.4 mM; morče: [Ca2+]e = 1.8 mM, [K+]e = 5.4 mM) . Převzato z [5]. U modelu komorové buňky morčete vykazovala koncentrace [Ca2+]t jak pokles tak i nezanedbatelný nárůst (viz ∆[Ca2+]t - obr. 11B horní graf). Maximální přechodné snížení [Ca2+]t o 13.8% bylo pozorováno při stimulační frekvenci 1 Hz, zatímco maximální přechodné zvýšení o 4.8% se ukázalo při stimulační frekvenci 2 Hz. Při dalším zvyšování stimulační frekvence obě koncentrační změny klesaly až na 6.1% a 1.3% při 6 Hz. Koncentrace [K+]t mezitím vykazovala trvalý nárůst (viz ∆[K+]t - obr. 11B spodní graf), který v závislosti na stimulační frekvenci dosahoval maximálních hodnot 2.9 - 4%. Z uvedených simulací vyplynulo, že během aktivity dochází v TATS komorových buněk savců k významným iontově-koncentračním změnám z nichž převažuje snižování [Ca2+]t a zvyšování [K+]t [3, 4, 5]. Přes tuto společnou vlastnost obou modelů se však ukázaly významné rozdíly ve

18

velikosti a frekvenční závislosti těchto změn. Zatímco přechodné snižování [Ca2+]t u modelu potkana vykazovalo při zrychlování stimulace nárůst ze 7% na 14.5% u modelu morčete byl pozorován jeho pokles z 13.8% na 6.1%. Hlavní příčinou těchto rozdílů byly odlišné vlastnosti membránového transportního systému u obou modelů určující velikost a frekvenční závislost iontového transportu přes tubulární membránu. 2.4.3 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na iontové proudy Jak vyplynulo z řady doposud publikovaných experimentálních prací (Kawai et al. 1999; Komukai et al. 2002; Despa et al. 2003; Brette et al. 2004 aj.), tubulární složky klíčových iontových proudů, které spouštějí buněčnou kontrakci (ICa), udržují intracelulární iontovou rovnováhu (INaCa) nebo způsobují buněčnou repolarizaci (IKto, IKr, IKs aj.), jsou podstatně větší než jejich ekvivalenty v povrchové membráně. Výsledky provedených simulací [3, 4, 5] ilustrované v předcházející kapitole ukázaly, že tyto proudové složky vedou k významným změnám iontových koncentrací v TATS. Dalším z dílčích cílů naší práce bylo vyšetřit zpětný vliv těchto koncentračních změn na průběh membránových proudů během fyziologické aktivity komorových buněk. U modelu komorové buňky potkana byly pro tento účel porovnány náboje přenesené membránovými proudy během 0.2 s trvajícího stimulačního cyklu před (ustálený stav při stimulační frekvenci 5 Hz) a bezprostředně po fixaci tubulárních iontových koncentrací na extracelulárních hladinách (tab. 5) [3]. Výsledky porovnání ukázaly, že zamezení iontověkoncentračních změn v TATS vede k významnému nárůstu přenesených nábojů QCa, QKto, QKss a QK1, a tedy ke zvýšení příslušných proudů ICa, IKto, IKss a IK1. Vedle těchto změn došlo také ke snížení náboje QNaCa v důsledku omezení záporné a posílení kladné fáze proudu INaCa. V uvedeném modelu tedy koncentrační změny v TATS snižovaly transmembránový tok Ca2+ do buňky a výtok K+ z buňky. A)

B)

Tab. 5 Účinek fixace iontových koncentrací v TATS na velikost nábojů přenesených membránovými proudy u modelu komorové buňky potkana. (A) Iontové náboje přenesené přes buněčnou membránu během jednoho cyklu při frekvenci stimulace 5 Hz. Horní řádek ukazuje hodnoty z modelu s koncentračními změnami v TATS v ustáleném stavu a spodní řádek hodnoty z téhož modelu bezprostředně po fixaci tubulárních iontových koncentrací na extracelulárních hladinách. (B) Procentuální vyjádření změn přenesených nábojů po fixaci tubulárních iontových koncentrací. Převzato z [3].

19

Podobná analýza byla provedena také na modelu komorové buňky morčete, avšak s tím rozdílem, že velikosti nábojů přenesené membránovými proudy za přítomnosti či při absenci iontově-koncentračních změn v TATS byly počítány vždy po dosažení ustáleného stavu, a to při frekvencích stimulace 1, 4 a 6 Hz. Porovnávány byly pouze vybrané nábojové složky přenesené přes tubulární membránu (QCaL,t, QNaCa,t, QK,t a QK1,t), které vykazovaly vysokou citlivost na změny iontových koncentrací v TATS. Tato analýza byla navíc provedena pro dvě varianty modelu (tab. 6A a 6B) [4]. V první byla použita „základní“ časová konstanta τCa,t = 240 ms (tab. 4), umožňující rekonstruovat dynamiku změn amplitudy ICa po rychlém zvýšení extracelulární koncentrace Ca2+ z 0.45 mM na 1.8 mM (Shepherd a McDonough, 1998). Ve druhé byla tato konstanta zvýšena na hodnotu 1.3 s zohledňující podstatně pomalejší rychlost výplachu Ca2+ z TATS, kterou u komorových buněk morčete pozorovali Blatter a Niggli (1998). Jak je z tab. 6A a 6B patrné, změny iontových koncentrací v TATS vedly k významnému snížení přenesených nábojů QCaL,t, QK,t a QK1,t, a tedy i proudů ICaL,t, IK,t a IK1,t při všech třech stimulačních frekvencích u obou variant modelu. Náboj QNaCa,t vykazoval naopak zvýšení, které ve všech případech odráželo pokles kladné a nárůst záporné fáze proudu INaCa,t. Zvýšení časové konstanty τCa,t z 240 ms na 1.3 s způsobilo podstatný nárůst popsaného účinku (s výjimkou náboje QK1,t), a to v důsledku nárůstu iontověkoncentračních změn v TATS. Celkový účinek těchto změn v modelu komorové buňky morčete byl tedy konzistentní s účinkem v modelu komorové buňky potkana a vedl k poklesu jak transmembránového toku Ca2+ do buňky tak i výtoku K+ z buňky. A)

B)

Tab. 6 Procentuální vyjádření změn velikosti nábojů přenesených tubulárními proudy ICaL,t (∆QCaL,t), INaCa,t (∆QNaCa,t), IK,t (∆QK,t=∆QKr,t+∆QKs,t) a IK1,t (∆QK1,t) během jednoho stimulačního cyklu v ustáleném stavu po zavedení iontově-koncentračních změn v TATS u modelu komorové buňky morčete (vztaženo k velikostem ustálených nábojů přenesených příslušnými proudy v modelu s tubulárními iontovými koncentracemi fixovanými na extracelulárních hladinách: [Ca2+]e = 1.8 mM, [K+]e = 5.4 mM, [Na+]e = 140 mM). (A) Výsledky pro základní nastavení časové konstanty Ca2+ výměny mezi tubulárním a extracelulárním prostorem (τCa,t = 240 ms, Shepherd a McDonough, 1998). (B) Výsledky pro τCa,t = 1.3 s (Blatter a Niggli, 1998). Převzato z [4]. Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na membránové proudy byl vyšetřován také během vnucených napěťových pulzů. Výsledky simulací publikované v naší prvotní studii [2] ukázaly, že negativní hodnoty proudu IK1 během hyperpolarizačních pulzů na napětí -100 mV až -160 mV

20

způsobují značné snížení koncentrace K+ v TATS a následkem toho pokles IK1 kopírující změny [K+]t. Podobné odezvy IK1 byly zjištěny během hyperpolarizačních pulzů aplikovaných u komorových buněk kočky (Harvey a Ten Eick, 1988). V jiných experimentech na komorových buňkách myší (Clark et al., 2001) bylo po ukončení depolarizačních pulzů (z -80 mV na -30 až 50 mV) pozorováno pomalé doznívání celkového membránového proudu připisované poklesu proudu IK1 v jeho záporné fázi během snižující se akumulace K+ v TATS. Tento fenomén byl rekonstruován také na modelu [2] po zahrnutí přechodného draslíkového proudu IKto (repolarizační proud zodpovědný za akumulaci K+ v TATS během depolarizace myších komorových buněk) do matematického popisu membránového transportu.

2.4.4 Vliv iontově-koncentračních změn v TATS na koncentrační změny Ca2+ v buňce Výsledky výpočtového modelování vlivu iontově-koncentračních změn v TATS na membránové proudy komorových buněk ukázaly, že tyto změny snižují transmembránový tok Ca2+ do buňky a výtok K+ z buňky [3, 4]. Sekundárním efektem bylo také zvýšení transmembránového toku Na+ do buňky. Hlavním a fyziologicky zajímavým důsledkem náhlé eliminace těchto změn (provedeno fixací tubulárních iontových koncentrací na hladinách iontových koncentrací v extracelulárním prostoru) při pravidelné stimulaci obou buněčných modelů byl postupný vzestup intracelulárních zásob Ca2+ v sarkoplazmatickém retikulu ([Ca2+]NSR) a následně nárůst maximální úrovně přechodného zvyšování koncentrace Ca2+ v cytoplazmě ([Ca2+]i,max) [3, 4]. Pro model komorové buňky potkana stimulovaný proudovými pulzy s frekvencí 1 a 5 Hz je tento účinek ilustrován na obr. 12 a po dosažení ustálených stavů na obr. 13.

Obr.12 Koncentrační změny Ca2+ v NSR ([Ca2+]NSR) a v cytoplazmě ([Ca2+]i) simulované na modelu komorové buňky potkana před (ustálený stav při frekvenci stimulace 1 a 5 Hz - tečkovaná čára) a po náhlé fixaci tubulárních iontových koncentrací na extracelulárních hladinách (plná čára). Převzato z [3]. Ačkoliv při stimulační frekvenci 1 Hz bylo ustálené zvýšení iontových koncentrací [Ca2+]NSR,end (hladina [Ca2+]NSR na konci cyklu) a [Ca2+]i,max poměrně malé (obr. 13 - 1 Hz), při stimulační frekvenci 5 Hz, která odpovídá klidové tepové frekvenci potkana, způsobilo potlačení iontověkoncentračních změn v TATS jejich nárůst o 18.34% (0.28 mM) a 24.5% (0.28 µM, obr. 13-5 Hz) [3]. Lze tedy předpokládat, že v rozsahu fyziologické tepové frekvence potkana (5 – 8 Hz) mohou iontově-koncentrační změny v TATS významně snížit intracelulární náplň Ca2+ u jeho komorových buněk a v konečném důsledku i sílu srdečního stahu.

21

[Ca2+]NSR

5 Hz

[Ca2+]t

[Ca2+]i

1 Hz

Obr. 13 Ustálené koncentrační změny Ca2+ v NSR ([Ca2+]NSR), v cytoplazmě ([Ca2+]i) a v TATS ([Ca2+]t) u modelu komorové buňky potkana před (tečkovaná čára) a po fixaci iontových koncentrací v TATS na extracelulárních hladinách (plná čára) při frekvenci stimulace 1 a 5 Hz. Převzato z [3]. Na modelu komorové buňky morčete byly obdobné simulace provedeny jak pro velikost časové konstanty τCa,t 240 ms (tab. 4) tak i pro její vyšší hodnotu 1.3 s (vysvětleno v kap. 2.4.3). Výsledný účinek iontově-koncentračních změn v TATS na hladinu [Ca2+]NSR,end a [Ca2+]i,max (obr. 14) [4] byl však nižší než u modelu komorové buňky potkana [3, 5], což odráželo rozdíly ve vlastnostech membránového transportního systému a v parametrech TATS u obou druhů. Je tedy zřejmé, že výsledný rozsah iontově-koncentračních změn v TATS a jejich schopnost modulovat buněčnou aktivitu bude vykazovat významné odlišnosti v závislosti na zastoupení a charakteristikách transportních bílkovin v tubulární membráně stejně jako na geometrických parametrech TATS u různých druhů zvířat [4, 5, 7].

1 Hz

6 Hz

Obr. 14 Účinek iontově-koncentračních změn v TATS na hladinu [Ca2+] v NSR ([Ca2+]NSR) a na velikost ustálených přechodných změn [Ca2+] v cytoplazmě ([Ca2+]i) u modelu komorové buňky morčete při frekvenci stimulace 1 a 6 Hz. Plná čára reprezentuje výsledky z modelu s iontovými koncentracemi v TATS fixovanými na extracelulárních hladinách. Přítomnost iontověkoncentračních změn v TATS u modelu s časovou konstantou τCa,t = 240 ms (čárkovaná čára) a 1300 ms (tečkovaná čára) vedla k poklesu hladiny [Ca2+]NSR a následně ke snížení velikosti změn [Ca2+]i . Převzato z [4].

22

2.4.5 Shrnutí výsledků Srdeční komorové buňky obsahují hustou síť membránových tubulů zvanou transversálněaxiální tubulární systém (TATS). Z nedávných experimentálních prací vyplynulo, že klíčové složky membránového transportního systému zodpovědné za iniciaci buněčné kontrakce a za udržení intracelulární iontové rovnováhy se nachází převážně v membráně TATS (Brette a Orchard, 2003 - přehled) a že rychlost iontové výměny mezi TATS a extracelulárním prostorem je značně omezena (Yao et al., 1997; Shepherd a McDonough, 1998; Blatter a Niggli, 1998). Vyšetření fyziologických důsledků funkce TATS prostřednictvím matematických modelů vyústilo v řadu následujících poznatků: • Během elektrické aktivity komorových buněk dochází v omezeném prostoru TATS k významným změnám iontových koncentrací (pokles [Ca2+]t o 7 – 20 %, nárůst [K+]t o 2 – 4 %) [2, 3, 4], jejichž velikost a frekvenční závislost se u různých druhů zvířat liší v závislosti na specifických vlastnostech membránového transportního systému [4, 5]. • Kumulativní účinek změn tubulárních iontových koncentrací (především přechodného snižování [Ca2+]t) může vést k významnému poklesu intracelulární náplně Ca2+ a ke snížení přechodných koncentračních změn Ca2+ v cytoplazmě, které určují sílu buněčné kontrakce [3, 4, 7]. • Změny elektrického napětí mezi povrchovou a tubulární membránou jsou velmi rychle vyrovnávány (během 20 µs) v důsledku silné elektrické vazby mezi oběma membránami. AN obou membránových subsystémů jsou proto téměř identická [4, 6].

3 MODELOVÁNÍ ÚČINKU FARMAK NA MEMBRÁNOVÉ PROUDY SRDEČNÍCH BUNĚK 3.1 HISTORIE VZNIKU A VÝVOJE MODELŮ Historie modelů popisujících mechanizmus účinku farmak na membránové proudy srdečních buněk není příliš dlouhá. Její rozvoj byl podmíněn až rostoucími znalostmi o struktuře a funkci jednotlivých membránových kanálů stejně jako vzrůstajícím množstvím experimentálních výsledků charakterizujících interakci těchto kanálů s vyšetřovanými látkami. Situaci v této oblasti komplikuje skutečnost, že působení řady farmak na membránový transportní systém závisí nejen na koncentraci účinné látky, ale také na membránovém napětí (např. [11, 12, 13]) a na historii buněčné elektrické aktivity (např. Šimurdová et al. 1997). Snaha o vysvětlení této komplexní závislosti vedla k návrhu „hypotézy modulovaného receptoru“, kterou v roce 1977 formuloval Hille a nezávisle také Hondeghem a Katzung. Tato hypotéza předpokládá, že: (i) afinita molekul farmak ke kanálovému receptoru stejně jako rychlost s jakou se tyto molekuly k receptoru vážou závisí na aktuálním stavu kanálu; (ii) vazba molekul farmak ke kanálovému receptoru ovlivňuje rychlost přechodů mezi jednotlivými stavy kanálu, a tedy proces zvaný vrátkování kanálu. Od 80-tých let minulého století byla v souladu s touto hypotézou sestavena již řada modelů, které vysvětlovaly mechanizmus interakce farmakologicky účinných látek z různými druhy membránových kanálů (Hondeghem a Katzung, 1984; Brennan et al., 2009). Kvantitativní popis těchto interakcí je zpravidla odvozen z kinetických schémat vrátkování a blokády kanálů, které jsou navrhovány na základě experimentálních dat a vystihují předpokládané stavy, kterými kanály při interakci s molekulami látky prochází. Charakteristiky příslušných membránových proudů získané z experimentů v kontrolních podmínkách a za působení farmak jsou také podkladem pro stanovení rychlostních konstant mezistavových přechodů u těchto schémat. Ty pak určují vlastnosti vrátkování a blokády kanálů v modelech.

23

3.2 MODELOVÁNÍ ÚČINKU PROPAFENONU NA MEMBRÁNOVÝ PROUD INa Propafenon patří do skupiny antiarytmik, které se používají pro léčbu síňových i komorových tachykardií. U srdečních buněk potlačuje rychlý sodíkový proud (INa) zodpovědný za fázi rychlé depolarizace AN (Capucci a Boriani, 1995). Jeho účinek na INa byl vyšetřován v řadě významných prací, a to na úrovni izolovaných srdcí (Koller a Franz, 1994), multicelulárních preparátů (Kodama et al., 1992; Ye et al. 1993), izolovaných buněk (Schreibmayer a Lindner, 1992; Kodama et al., 1992) a dokonce i samostatných kanálů (Kohlhardt a Fichtner, 1988; Benz a Kohlhardt, 1994). Ukázalo se, že stupeň propafenonem vyvolané blokády INa narůstá během depolarizace a při zvyšování frekvence stimulace. Naproti tomu, jednoznačná a plně přijatelná interpretace mechanizmu působení propafenonu nebyla doposud podána. Cílem našich nedávných prací [14, 15] bylo proto využití výpočtového modelování pro bližší objasnění interakce tohoto antiarytmika s INa-kanály srdečních komorových buněk. 3.2.1 Experimentální základ Základem pro sestavení matematických modelů interakce propafenonu s INa-kanály byly experimentální výsledky získané na izolovaných komorových buňkách laboratorního potkana metodou „patch clamp“ v laboratoři celulární elektrofyziologie LF-MU v Brně (Šimurdová et al. 1997). Frekvenční závislost blokády INa Frekvenční závislost propafenonem vyvolané blokády INa byla vyšetřována v ustáleném stavu při pravidelné frekvenci stimulace 20, 60, 120 a 200 min-1 (obr. 15). Pro stimulaci byly zvoleny napěťové pulzy z -80 mV na -20 mV trvající 200 ms. V kontrolních podmínkách byl pokles velikosti INa s rostoucí frekvencí stimulace (obr. 15 - control) způsoben neúplným zotavením INakanálů z inaktivace, které je závislé na délce intervalu mezi pulzy. Po přidání propafenonu (0.1 µM a 0.2 µM) do extracelulárního roztoku byl pokles INa výraznější v důsledku přídavného účinku blokády. Přibližnou úroveň propafenonem vyvolané blokády INa, kterou lze také definovat jak frakci aktuálně blokovaných INa-kanálů na celé buňce (fbl), bylo pak možné vyjádřit z poměru velikostí INa v kontrolních podmínkách a za působení propafenonu: fbl = (1- INa(propaf)/INa(control)). Jak je patrné z obr. 15, zvýšení frekvence stimulace z 20 na 200 min-1 přivodilo podstatný nárůst úrovně blokády INa.

Obr. 15 Frekvenční závislost propafenonem vyvolané blokády INa. Průměrná velikost blokády (fbl) je vyjádřena ze vztahu: 1-INa(propaf)/INa(control). Převzato z publikace Šimurdová et al. (1997).

24

Vývoj blokády během a po ukončení depolarizace Pro vyšetření vývoje blokády INa-kanálů během depolarizace byl zvolen stimulační protokol, který sestával z časově proměnného depolarizačního pulzu z -80 mV na -20 mV (doba T2), 0.15 s trvajícího klidového intervalu na -80 mV a testovacího pulzu na hladině -20 mV (viz protokol na obr. 16). Během 0.15 s klidového intervalu následujícího po depolarizačním pulzu se INa téměř kompletně zotavil z inaktivace, ale pouze částečně z blokády propafenonem. V kontrolních podmínkách se proto velikost testovacího INa (měřeno během testovacího pulzu) při změně T2 výrazně neměnila (obr. 16 - control). Naproti tomu po aplikaci 0.2 µM propafenonu vedlo prodlužování doby T2 k jeho výraznému dvoufázovému poklesu (obr. 16 - propafenone).

Obr. 16 Závislost velikosti testovacího INa na trvání depolarizačního pulzu (T2) v kontrolních podmínkách a za působení 0.2 µM propafenonu. Průměrné hodnoty± SE (n=5). Převzato z publikace Šimurdová et al. (1997).

Pro vyšetření průběhu blokády po ukončení depolarizace byl použit stimulační protokol, ve kterém byla doba depolarizačního pulzu konstantní (0.5 s), avšak proměnným se stal klidový interval na -80 mV (doba T1- viz protokol na obr. 17) mezi depolarizačním a testovacím pulzem. Podobně jako v předchozím případě byl tento protokol aplikován v kontrolních podmínkách a za působení 0.2 µM propafenonu. Výsledné závislosti velikosti testovacího INa na trvání klidového intervalu v obou podmínkách ukazují průběhy na obr. 17. Na rozdíl od kontrolních podmínek vykazoval nárůst INa při působení propafenonu opět dvoufázový charakter. Aplikací výrazu 1- INa(propaf)/INa(control) na výše naměřené údaje bylo následně možné provést přibližnou rekonstrukci vývoje blokády INa-kanálů během a po ukončení 0.5 s trvajícího depolarizačního pulzu z -80 mV na -20 mV. Výsledný průběh však nebyl kontinuální (obr. 18 přerušovaná čára), jelikož odhad blokády na konci pulzu (z dat na obr. 16) a bezprostředně po jeho

25

Obr. 17 Závislost velikosti testovacího INa na trvání klidového intervalu (T1) v kontrolních podmínkách a za působení 0.2 µM propafenonu. Normalizováno k velikosti INa v kontrolních podmínkách při T1=12 s. Průměrné hodnoty ± SE (n=5). Převzato z publikace Šimurdová et al. (1997).

Obr. 18 Rekonstrukce časového průběhu blokády INa-kanálů během a po ukončení depolarizačního pulzu z dat na obr. 16 a 17. Přerušovaná čára se symboly (D) reprezentuje nekorigovaný odhad frakce blokovaných kanálů (fbl) podle vztahu: fbl = (1 - INa(propaf)/INa(control)). Plná čára se symboly (•) představuje vývoj fbl po zavedení korekce na pokles blokády během 150 ms klidového intervalu mezi depolarizačním a testovacím pulzem (viz stimulační protokol na obr. 16). Čerchovaná čára ukazuje klidovou hladinu blokády (fbl∞) při -80 mV. Převzato z publikace Šimurdová et al. (1997).

26

ukončení (z dat na obr. 17) vykazoval výrazně rozdílné hodnoty. Následná analýza odhalila, že tento rozdíl odpovídá velikosti rychlého poklesu blokády během 150 ms klidového intervalu mezi depolarizačním a testovacím pulzem (viz stimulační protokol na obr. 16) a umožnila tak jeho vysvětlení. Výsledná rekonstrukce průběhu blokády po zahrnutí příslušné korekce je ilustrována na obr. 18 (plná čára). Tato rekonstrukce zřetelně ukázala, že vývoj blokády INa-kanálů během depolarizace stejně jako její pokles ke klidové hodnotě po ukončení depolarizace probíhá ve dvou fázích s výrazně odlišnou rychlostí.

3.2.2 Matematický popis interakce propafenonu s INa-kanály Vysoká rychlost nástupu blokády na začátku depolarizačního pulzu a následný pomalý vzestup blokády během trvání depolarizace (obr. 18) naznačovaly, že se propafenon váže k INa-kanálům nejprve v jejich otevřeném stavu a posléze pomaleji v jejich inaktivovaných stavech (Šimurdová et al., 1997). Tato interpretace vyhovovala také experimentálním výsledkům získaným při sledování účinků diprafenonu (derivátu propafenonu) u kardiomyocytů morčete (Kodama et al., 1992). Naproti tomu vyšetření účinků propafenonu na INa u stejných buněk svědčilo spíše pro výhradní interakci propafenonu s INa-kanály v inaktivovaných stavech (Schreibmayer a Lindner, 1992). Rovněž výsledky měření vlivu propafenonu na aktivitu izolovaných INa-kanálů u neonatálních kardiomyocytů potkana (Kohlhardt a Fichtner, 1988) nevylučovaly tuto možnost. Tato nejednotnost v experimentálních údajích vyžadovala sestavení dvou modelů, které byly publikovány v pracích [14] a [15]. Kinetické schéma prvního modelu (obr. 19) vychází z původního Hodgkin-Huxley formalismu (Hodgkin a Huxley, 1952c), který popisoval otevírání a zavírání INa-kanálů jako funkci třetí mocniny jedné aktivační proměnné (m3) a první mocniny jedné inaktivační proměnné (h). V kinetickém schématu je tato funkce neblokovaného kanálu daná přechody mezi třemi zavřenými stavy (Sc1, Sc2, Sc3), jedním otevřeným stavem (So) a čtyřmi inaktivovanými stavy (Si1, Si2, Si3, Si4). Interakce propafenonu s INa-kanálem je v tomto modelu umožněna ve všech stavech. Navázání propafenonu k receptoru INa-kanálu a jeho případné uvolnění je v kinetickém schématu reprezentováno přechody mezi neblokovanými (S) a blokovanými (B) stavy. V matematické formě představuje toto schéma 16 diferenciálních rovnic prvního řádu jejichž řešením jsou pravděpodobnosti výskytu kanálů v jednotlivých stavech nebo také frakce kanálů nacházející se v jednotlivých stavech na celé buňce. Velikost proudu INa lze pak vyjádřit z Ohmova zákona: INa = gNa⋅so⋅(Um-UNa), kde gNa, so, Um a UNa označují maximální vodivost všech kanálů na buňce, velikost frakce INa-kanálů nacházejících se v otevřeném stavu, membránové napětí a rovnovážné membránové napětí pro Na+. Napěťové závislosti rychlostních konstant αm, βm, αh a βh určujících rychlost mezistavových přechodů u neblokovaného kanálu byly nejprve odvozeny z experimentálních výsledků publikovaných autory Brown et al. (1981) a následně upraveny podle vlastních měření průběhu INa u komorových myocytů potkana. Konstanty určující rychlost vazby propafenonu ke kanálu v jednotlivých stavech (a1, a2, a3, a4), rychlost uvolnění propafenonu (b1, b2, b3, b4) a ovlivnění vrátkování u blokovaného kanálu (kbc, kcb, kib, kbi, k) byly nejprve přibližně odhadnuty z experimentálních průběhů v kap. 3.2.1 a posléze optimalizovány prostřednictvím genetického algoritmu. Jejich hodnoty jsou specifikovány v [14]. Základem kinetického schématu druhého modelu (obr. 20) je novější multistavový model INakanálu (Clancy a Rudy, 2002) zahrnující popis nejen rychlé ale i později objevené pomalé složky

27

3αm

βm

Si1

βh

3βm

Si2

βh

αh

αm 3βm

Sc2

b2⋅kbc

Sc3

3αm⋅kbi

Bi1

a3⋅kib ⋅Cb

αh⋅k3/(kib3⋅kbc3) βm⋅kcb

Bi4

αh

αh⋅k/(kib⋅kbc) 2αm⋅kbc

αm⋅kbc 3βm⋅kcb

2βm⋅kcb

Bc2

Bc1

βh a2⋅Cb

a2⋅kcb⋅Cb

αh⋅k2/(kib2⋅kbc2) 3αm⋅kbc

Bi3

βh⋅k/(kcb⋅kbi)

a2⋅kcb2⋅Cb

a1⋅Cb

αm⋅kbi 3βm⋅kib

Bi2

βh⋅k2/(kcb2⋅kbi2)

a3⋅Cb

2αm⋅kbi

2βm⋅kib

βm⋅kib

So

b2

a3⋅kib2 ⋅Cb

a4⋅Cb

βh⋅k3/(kcb3⋅kbi3)

αh

2αm 2βm

b2⋅kbc2

Si4 b3

αh

3αm βm

βh

b3⋅kbi

αh

Sc1

Si3

βh

b3⋅kbi2

b4

b1

αm

2αm 2βm

Bo

Bc3

Obr. 19 Kinetické schéma modelu INa-kanálu zahrnujícího blokádu propafenonem ve všech kanálových stavech. Sc1-Sc3 – zavřené stavy; Si1-Si4 – inaktivované stavy; So – otevřený (vodivý) stav; Bc1-Bc3, Bi1-Bi4, Bo – obdobné stavy blokovaného kanálu. Rychlostní konstanty kanálového vrátkování (αm, βm, αh, βh) jsou závislé na membránovém napětí zatímco rychlostní konstanty kanálové blokády (a1, b1, a2, b2, a3, b3, a4, b4) jsou uvažovány napěťově nezávislé. Převzato z [14].

BIC3

a11

BIC2

2

c k1 kon

a11 IC2

C3

IF

a4 IM1

b3

C2

b5

a2

a12 b12

IM2

b2 a3

a11 b11

a5

k2 koff

b4

a3

a3

BIM2

c k2 kon

b12 b3

a5b b5b

koff a12

b11

BIM1

b4

koff

b3

a4

c kon

koff

IC3

BIF

k1 b12

k1 b11 c k1 kon

a12

a13

C1

b13

O

Obr. 20 Kinetické schéma modelu INa-kanálu zahrnujícího blokádu propafenonem výlučně v inaktivovaných stavech. C1 -C3 – zavřené stavy; IC3, IC2, IF, IM1, IM2 – inaktivované stavy; O – otevřený (vodivý) stav; BIC3, BIC2, BIF, BIM1, BIM2 – inaktivované stavy kanálu po navázání propafenonu. Pomalá inaktivace je v modelu reprezentována přechody IM1→IM2 a BIM1→BIM2. Převzato z [15].

28

kanálové inaktivace (např. Wang et al. 2000, Veldkamp et al. 2000). Interakce propafenonu s INakanály je v tomto modelu uvažována výhradně v inaktivovaných stavech (přechody IC3→BIC3, IC2→BIC2, IF→BIF a IM1→BIM1) přičemž její popis je stejně jako u předchozího modelu založen na teorii modulovaného receptoru. Většina rychlostních konstant popisujících vrátkování neblokovaného kanálu (a2, b2, a3, b3, a5, b5, a11, b11, a12, b12, a13, b13) byla převzata z původního modelu (Clancy a Rudy, 2002) beze změn. Rychlostní konstanty a4 a b4 byly násobeny faktorem 3, aby model vykazoval přijatelnou shodu s výsledky vlastních měření proudu INa. Ostatní konstanty zahrnuté v popisu interakce propafenonu s kanálovými receptory (kon, koff, k1, k2) a v popisu vrátkování blokovaného kanálu (a5a, b5b) byly nejprve odhadnuty z experimentálních dat (kap. 3.2.1) a posléze optimalizovány prostřednictvím genetického algoritmu [15]. 3.2.3 Modelování blokády membránového proudu INa propafenonem Jak vyplývá z předchozí kapitoly, pro interpretaci mechanizmu blokády INa propafenonem byly navrženy dvě verze modelů. Míra shody, s jakou byly oba modely schopny rekonstruovat experimentální data byla výchozím kritériem pro rozhodnutí, který z navrhovaných modelů věrohodněji reprezentuje skutečný proces blokády. Rekonstrukci experimentálních dat (kap. 3.2.1) provedenou na obou modelech ukazuje obr. 21.

B) propafenone 0.1 µM

model experiment 0.5

0.2 s

-20 mV -80 mV 0 0

50

100

1- INa(p)/INa(c)

1- INa(p)/INa(c)

A) 1

150

200

1 model experiment

0.5

0

1- INa(p)/INa(c)

1- INa(p)/INa(c)

f [cycles/min]

-20 mV

0

1

2

3

4

5

6

1

propafenone 0.1 µM

model experiment 0.5

0.2 s -20 mV -80 mV

0 0

50

100

f [cycles/min]

200

1 experiment model

0.5

0

-20 mV

0

1

2

3

4

5

6

t [s]

t [s] 1

1

fbl

fbl

150

0.5

model

0.5

model 0

0

1

2

3

t [s]

4

5

6

0

0

1

2

3

4

5

6

t [s]

Obr. 21 Výpočtová rekonstrukce experimentálních výsledků charakterizujících frekvenční závislost blokády INa při působení 0.1 µM propafenonu (obr. 15) a vývoj blokády INa-kanálů během a po ukončení 0.5.s trvajícího depolarizačního pulzu z -80 mV na -20 mV při působení 0.2 µM propafenonu (obr. 18). Spodní panely ukazují přímou simulaci vývoje blokády (součet pravděpodobností výskytu kanálu v jednotlivých blokovaných stavech modelu) během a po ukončení depolarizačního pulzu. A: Rekonstrukce na modelu zahrnujícím interakci propafenonu s INa-kanály ve všech stavech (obr. 19). B: Rekonstrukce na modelu zahrnujícím interakci propafenonu s INa-kanály výhradně v inaktivovaných stavech (obr. 20). Převzato z [14] a [15].

29

3.2.4 Interpretace mechanizmu blokády Srovnání výsledků výpočtového modelování publikovaných v pracích [14] a [15] ukázalo, že oba navržené modely reprodukují s dostatečnou přesností experimentálně pozorované účinky propafenonu na INa (obr. 21A a obr. 21B). V souladu s předpokládaným průběhem blokády vyplývajícím z experimentálních dat (obr. 18) také přímé simulace fbl na obou modelech ukázaly, že se během depolarizace hladina blokády INa-kanálů zvyšuje, a během repolarizace naopak snižuje (vlastnost, která je významná z hlediska antiarytmického účinku propafenonu demonstrovaného v obou výše zmíněných pracích). Oba dva děje měly ve shodě s experimentální rekonstrukcí fbl dvoufázový charakter. Naproti tomu, mechanizmus blokády vykazoval u obou modelů podstatné rozdíly. Analýza výsledků simulací provedených na prvním modelu zahrnujícím blokádu INa-kanálů ve všech stavech (viz kinetické schéma na obr. 19) nabídla jeho následující interpretaci: • Počáteční rychlý a následně pomalý nárůst fbl je způsoben rychlou vazbou propafenonu ke kanálům v otevřeném stavu (přechod So→Bo) a později, během inaktivace, pomalejší vazbou propafenonu ke kanálům v inaktivovaném stavu (přechod Si4→Bi4). • Dvoufázové snižování blokády po ukončení depolarizace je způsobeno nejprve rychlým uvolňováním propafenonu z kanálů v blokovaných inaktivovaných stavech (převážně přechod Bi1→Si1) a později z kanálů v blokovaných zavřených stavech (převážně přechod Bc1→Sc1). Obdobná analýza provedená na druhém modelu zahrnujícím blokádu INa-kanálů výhradně v inaktivovaných stavech (viz kinetické schéma na obr. 20) vedla k interpretaci následující: • Počáteční rychlý nárůst blokády na začátku depolarizace je podmíněn přechodem kanálů ze zavřených stavů (C3, C2 a C1) a z otevřeného stavu (O) do inaktivovaných stavů IF a IM1, ve kterých dochází k rychlé vazbě propafenonu na kanálové receptory (přechody IF→BIF a IM1→BIM1 - viz změny příslušných frakcí kanálů na obr. 22). Následující pozvolný přechod kanálů do pomalu inaktivovaného blokovaného stavu BIM2 (viz nárůst frakce bim2 na obr. 22) je zodpovědný za pomalou fázi nárůstu blokády. • K dvoufázovému snižování blokády po ukončení depolarizace dochází v důsledku rychlého uvolňování propafenonu z kanálů v blokovaných inaktivovaných stavech BIM1 a současně vlivem pozvolného uvolňování propafenonu z kanálů v pomalu inaktivovaných blokovaných stavech BIM2 (viz pokles frakcí bim1 a bim2 na obr. 22). -20

-20

mV

-80

-80

0.5

0.5

0

0.5

0.5

c1

0

0

0.5

1

6

bim1

bic3 0 0.5

0.5

bic2

if 4

t [s]

bif

im1

0.5

2

0

2

4

t [s]

mV

0.5

0

o 0

-80

0.5

0

0.5

-20

mV

ic2

0

0 0

-80

ic3

c3 0

-20

mV

6

0

0

2

t [s]

4

bim2 6

0

0

2

t [s]

4

6

Obr. 22 Změny frakcí kanálů ve vybraných modelových stavech během a po ukončení depolarizačního pulzu z -80 na -20 mV při koncentraci propafenonu 0.2 µM. Převzato z [15].

30

Oba dva modely také vykazovaly rozdílnou úroveň klidové blokády při -80 mV (fbl(-80 mV)). Zatímco model zahrnující blokádu INa-kanálů ve všech navrhovaných stavech vykazoval při 0.2 µM propafenonu fbl(-80 mV) < 1% (obr. 21A), u modelu zahrnujícího blokádu výhradně v inaktivovaných stavech byla při této koncentraci blokátoru velikost fbl(-80 mV) ≈ 37% (obr. 21B). Přes tyto rozdíly ve vlastnostech obou navrhovaných modelů nebylo prozatím možné jednoznačně určit, který z nich lépe odráží skutečný proces blokády. Dostupné výsledky experimentálních měření (Šimurdová et al., 1997) mohly být s dostatečnou přesností rekonstruovány na obou modelech. Nicméně, nedávno publikované účinky propafenonu na chování INa-kanálů po genetickém odstranění inaktivace (Edrich et al., 2006) svědčí spíše pro jejich dominantní blokádu v otevřeném stavu, kterou vykazoval pouze první model zahrnující interakci propafenonu se všemi stavy kanálu. 3.3 MODELOVÁNÍ ÚČINKU HALOPERIDOLU NA MEMBRÁNOVÝ PROUD Ito Haloperidol patří do skupiny léků zařazených mezi antipsychotika. V klinické praxi se používá pro léčbu těžké úzkosti, psychotických stavů nebo schizofrenie. Vedle účinků haloperidolu na nervový systém byly po jeho podání pozorovány také vedlejší účinky na funkci srdce. Mezi klinické projevy těchto vedlejších účinků patří zejména prodloužení QT-intervalu na EKG záznamu a vznik život ohrožujících tachyarytmií typu „torsades de pointes“ (Hassaballa a Balk, 2003). Z doposud provedených elektrofyziologických prací vyšlo najevo, že haloperidol prodlužuje repolarizaci a efektivní refrakterní fázi AN komorových buněk (Sugiyama et al., 2001; Sugiyama, 2003; Rasty et al., 2004). Naproti tomu, vliv haloperidolu na repolarizační draslíkové proudy nebyl doposud publikován. Cílem naší nedávné práce [16] bylo proto vyšetřit účinek haloperidolu na přechodný draslíkový proud z buňky (Ito) zodpovědný za počáteční fázi repolarizace a prostřednictvím výpočtového modelování objasnit mechanizmus jeho interakce s příslušnými kanály. 3.3.1 Experimentální základ Účinek haloperidolu na Ito byl vyšetřován na izolovaných komorových buňkách laboratorního potkana při pokojové teplotě s využitím metody „patch-clamp“. Pro vyšetření byla zvolena koncentrace látky 1 µM. Haloperidol způsoboval pokles velikosti a urychlení inaktivace Ito (obr. 23). Při aplikaci depolarizačních pulzů z -75 mV na 60 mV (500 ms, 0.1 Hz) byla celková inhibice Ito průměrně 23% (vyjádřeno z poklesu přeneseného náboje), zatímco průměrný pokles velikosti Ito dosahoval pouze 7.6%. V rozsahu úrovní depolarizace mezi 15 mV a 75 mV nevykazoval tento účinek významnou napěťovou závislost (obr. 24C). c - control τi = 41.1 ± 2.4 ms 2 nA

c 100 ms

h

h - haloperidol τi = 33.3 ± 2.3 ms

Obr. 23 Účinek haloperidolu (1 µM) na draslíkový proud Ito během 500 ms trvajících depolarizačních pulzů z -75 mV na 60 mV aplikovaných s frekvencí 0.1 Hz. Převzato z [16].

31

30

Ito,peak [pA/pF]

25 20 15 10

B)

+75 [mV] -40

-75

20

[ms]

500

control haloperidol

5

0.9

control haloperidol

0.6 0.3 0.0

0 -90

1.5 1.2

Qto [pC/pF]

A)

-60

-30

0

30

60

90

-90

-60

-30

Voltage [mV]

0

30

60

90

Voltage [mV]

Ihal / Icon, Qhal / Qcon

C) 1,0 0,8

Ito,peak(hal) Ito,peak(con)

0,6

Qto(hal) Qto(con) 0,4 -20

0

20

40

60

80

Voltage [mV]

Obr. 24 Napěťová závislost velikosti Ito (A) a přeneseného náboje Qto (B) v kontrolních podmínkách a za působení 1µM haloperidolu. Experimentální protokol: řada depolarizačních pulzů (500 ms, 0.1 Hz) na napětí mezi -75 mV a 75 mV (přírůstek 15 mV) jimž předcházel prepulz (20 ms) z -75 mV na -40 mV pro inaktivaci INa. C: Napěťové závislosti poměrů Ito,peak(hal)/Ito,peak(con) a Qto(hal)/Qto(con), které ukazují přibližnou velikost frakce neblokovaných kanálů dosaženou během aktivace (•) a inaktivace ( ) Ito. Převzato z [16]. Časový průběh zotavování Ito z inaktivace v kontrolních podmínkách (absence farmaka) odpovídal monoexponenciální funkci s časovou konstantou τrec = 40.3 ms. Po aplikaci haloperidolu byl průběh zotavování biexponenciální (obr. 25). Většina kanálů (91%) se zotavovala rychle s časovou konstantou τrec,f = 40.8 ms, která přibližně odpovídala velikostí τrec v kontrolních podmínkách. Bylo tedy zřejmé, že tato frakce kanálů procházela zotavováním z inaktivace. U zbývajících 9% kanálů probíhalo zotavování pomalu s časovou konstantou τrec,s = 1482 ms. Tato složka reprezentovala pomalé zotavování Ito-kanálů z blokády a jejím důsledkem byl kumulativní nárůst blokády při aplikaci depolarizačních pulzů s vyšší frekvencí (obr. 26).

32

1.0

Normalized current

Obr. 25 Zotavování Ito z inaktivace v kontrolních podmínkách a z inaktivace a blokády v přítomnosti 1µM haloperidolu. Experimentální protokol: dva stejné depolarizační pulzy (z -75 na 60 mV, 500 ms) oddělené proměnným časovým intervalem (recovery interval) 5 až 4000 ms na napětí -75 mV. Tečkovaný průběh sestrojený z poměrů průměrných hodnot Ito,peak za působení haloperidolu a v kontrolních podmínkách přibližně ukazuje nárůst frakce neblokovaných kanálů během zotavování. Převzato z [16].

0.8

control

0.6

haloperidol

0.4 +60 [mV] -75

0.2 0.0

500

0

1000

2000

500

3000

Recovery interval [ms]

[ms]

4000

B) +60 [mV] -75

35 30

1.

2.

15. [ms]

250 50

25 20

control

15

haloperidol

1.0

Ihaloperidol Icontrol

Ito,peak [pA/pF]

A)

0.9 0.8 0.7 0.6

10 0

2

4

6

8

10

12

0

14

2

4

6

8

10

12

14

Pulse number

Pulse number

Obr. 26 Kumulace haloperidolem vyvolané blokády Ito-kanálů při stimulační frekvenci 3.3 Hz. Experimentální protokol: 15 depolarizačních pulzů (250 ms) z -75 mV na 60 mV aplikovaných s periodou 300 ms z klidového stavu. (A) Pokles Ito,peak během aplikace pulzů v kontrolních podmínkách a za přítomnosti 1 µM haloperidolu. (B) Poměr Ito,peak(hal)/Ito,peak(con) ukazující, že během stimulace frakce neblokovaných kanálů klesla o 18.7%. Převzato z [16].

3.3.2 Matematický popis interakce haloperidolu s Ito-kanály Základem pro matematický popis interakce haloperidolu s Ito-kanály byl multistavový model Ito-kanálu odvozený z experimentálních dat v naší předcházející práci [11] (viz kinetické schéma na obr. 27 bez stavů IB a OB) . Napěťové závislosti rychlostních konstant popisujících aktivaci a deaktivaci kanálů (αq, βq) byly ponechány beze změny. Napěťové závislosti rychlostních konstant popisujících inaktivaci kanálu a zotavení z inaktivace (αr, βr) byly modifikovány [16], aby model vykazoval lepší shodu s novými experimentálními daty získanými v kontrolních podmínkách. Urychlení inaktivace Ito pozorované za působení haloperidolu (obr. 23) je považováno za typickou známku interakce farmaka s membránovými kanály v otevřeném stavu (Snyders et al. 1992; Clark et al., 1995; Wettwer et al., 1998; Sanchez-Chapula, 1999). Z tohoto důvodu byl model v první fázi doplněn pouze o přechod do otevřeného blokovaného stavu (OB). Časové průběhy Ito simulované na tomto modelu v kontrolních podmínkách a za působení haloperidolu však během inaktivace vykazovaly vzájemné překřížení (důsledek přechodu frakce blokovaných kanálů nacházejících se ve stavu OB do inaktivovaného stavu I přes otevřený stav O v pozdější fázi inaktivace), které nebylo pozorováno u experimentálních záznamů (obr. 23). Tato neshoda naznačovala, že interakce haloperidolu s Ito-kanály neprobíhá pouze v jejich otevřeném stavu, ale

I1

I2

4αq βq

βr αr

C1

I3

3αq 2βq

βr

αr

I4

2αq 3βq

βr

αr

hal

I

αq

kioff

4βq βr

αr

βr

αr

βr

4αq

3αq

2αq

αq

kon

βq

2βq

3βq

4βq

koff

C2

C3

C4

IB

kion

O

αr · K

hal OB

Obr. 27 Kinetické schéma modelu Ito-kanálu zahrnujícího blokádu haloperidolem v otevřeném a otevřeném-inaktivovaném stavu. C1 - C4 – zavřené stavy; I1 - I4 – zavřené-inaktivované stavy, I – otevřený inaktivovaný stav; IB – otevřený inaktivovaný blokovaný stav; O – otevřený stav; OB – otevřený blokovaný stav. Převzato z [16].

33

také v otevřeném inaktivovaném stavu. Po doplnění matematického popisu této interakce v modelu (viz přechody do stavu IB v kinetickém schématu na obr. 27) byl zmíněný rozpor odstraněn a model umožňoval rekonstruovat naměřené experimentální výsledky (obr. 23-26) s dostatečnou přesností. Příslušné rychlostní konstanty mezistavových přechodů jsou specifikovány v [16]. 3.3.3 Modelování blokády membránového proudu Ito haloperidolem Schopnost modelu s dostatečnou přesností simulovat výsledky provedených experimentů je demonstrována na obr. 28. Jeho horní část (obr. 28A) znázorňuje modelovou rekonstrukci účinku haloperidolu (1µM) na časový průběh Ito během depolarizačního pulzu z -75 mV na 60 mV. Obr. 28B ukazuje rekonstrukci experimentálních dat, vystihujících odlišný charakter zotavování Ito v kontrolních podmínkách a za působení haloperidolu a obr. 28C představuje rekonstrukci experimentálních výsledků, charakterizujících kumulaci haloperidolem způsobené blokády Itokanálů při aplikaci pulzů s frekvencí 3.3 Hz.

A) [m V ]

+60 -75

500

[m s]

c - control τi = 41.8 ± 0.1 ms

h - haloperidol

c

τi = 33.7 ± 0.1 ms

h

2 nA 100 ms

B)

C) 1,1 1,0

control

0.8

0,9

τrec = 41.5 ± 0.1 ms

0.6

Ihaloperidol Icontrol

Normalized current

1.0

haloperidol τrec,f = 41.5 ± 0.1 ms τrec,s = 1496 ± 52 ms

0.4 +60 [mV]

0.2

-75

500

500

[ms]

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4

+60

0,3

-75 250

[ms]

50

0,2

0.0 0

1000

2000

3000

Recovery interval [ms]

4000

0

2

4

6

8

10

12

14

Pulse number

Obr. 28 Rekonstrukce experimentálních výsledků prostřednictvím matematického modelu. A: Časový průběh Ito během depolarizačního pulzu z -75 mV na 60 mV (500 ms) v kontrolních podmínkách a za působení 1 µM haloperidolu. B: Zotavení Ito z inaktivace v kontrolních podmínkách a z inaktivace a blokády při působení 1 µM haloperidolu. C: Kumulace haloperidolem navozené blokády Ito-kanálů při aplikaci depolarizačních pulzů (250 ms) s frekvencí 3.3 Hz. Převzato z [16].

34

3.3.4 Interpretace mechanizmu blokády Interpretace mechanizmu blokády Ito haloperidolem, kterou navržený model nabídl, vyplývá z obr. 29. Jsou zde znázorněny časové průběhy velikosti frakcí Ito-kanálů nacházejících se ve vybraných stavech (C1, O, OB, I, IB) během a po ukončení depolarizačního pulzu z -75 mV na 60 mV. Jak je z obrázku patrné, na začátku depolarizace se haloperidol v modelu váže převážně ke kanálům v otevřeném stavu, které tímto blokuje (nárůst frakce oB). Později během inaktivace dochází k vazbě haloperidolu ke kanálům v otevřeném-inaktivovaném stavu a současnému přechodu kanálů ze stavu OB do stavu IB. Důsledkem tohoto procesu je nárůst kanálové frakce iB a pokles frakce oB v pozdější fázi depolarizace. Po ukončení depolarizačního pulzu dochází k postupnému přechodu kanálů ze stavu IB do stavu OB a následně do stavu C1. Frakce oB se proto nejprve rychle zvyšuje, avšak poté nastává její pozvolný pokles, který je příčinou pomalého zotavování kanálů z blokády. Průběh velikosti frakce všech blokovaných kanálů během a po ukončení depolarizačního pulzu (součet oB a iB) má proto vícefázový charakter. +60 [mV] -75

500

[ms]

c1

1.0

control haloperidol

0.5 0.0

o

1.0

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.5

oB

0.0 0.15 0.10 0.05 0.00

i

1.0 0.5

oB + iB

iB

0.0 0.15 0.10 0.05 0.00

0,2 0,1 0,0

Time [ms]

Obr. 29 Simulované časové průběhy velikosti frakcí Ito-kanálů nacházejících se ve vybraných stavech (C1, O, OB, I, IB - obr. 27) během a po ukončení depolarizačního pulzu z -75 mV na 60 mV v kontrolních podmínkách (tečkované čáry) a za působení 1 µM haloperidolu (plné čáry). Součet časových průběhů velikosti frakcí oB a iB charakterizující vývoj blokády Ito-kanálů haloperidolem během a po ukončení depolarizačního pulzu. Převzato z [16].

35

Podobná interpretace mechanizmu blokády a zotavení z blokády vzešla také z modelu sestaveného pro vysvětlení interakce příbuzného antipsychotika perfenazinu s Ito-kanály [17]. Významný vliv obou antipsychotik na Ito-kanály srdečních buněk však lze předpokládat jen v případě silného předávkování těmito látkami, neboť koncentrace způsobující efektivní blokádu Ito jsou u obou látek podstatně vyšší (haloperidol: IC50,rest > 1 µM [16], perfenazin: IC50,rest ≈ 38 µM [17]), než jejich plazmatické koncentrace (< 0.01 µM/l) dosahované při terapii v klinické praxi. Pozorované změny na EKG a tachyarytmie, které v některých případech doprovází léčbu těmito psychofarmaky, jsou proto vyvolány spíše jejich interakcí s jinými druhy iontových kanálů v buněčné membráně popř. kombinací účinků těchto látek s jinými proarytmogenními faktory.

4 ZÁVĚR Předložená publikace shrnuje stěžejní výsledky více jak desetileté práce zaměřené na využití výpočtového modelování pro objasnění specifických biofyzikálních jevů probíhajících na buněčné úrovni srdečního svalu. Systém transverzálně-axiálních membránových tubulů (TATS) srdečních komorových buněk slouží k přenosu vzruchu do buněčného nitra, kde spouští kaskádu dějů vedoucí k buněčné kontrakci. Detailní rozbor dějů probíhajících v TATS sestavených modelů ukázal na modulační roli tubulárních transportních systémů ve vazbě excitace-kontrakce [6, 7]. Ačkoliv svým rozsahem tvoří tubulární membrána přibližně polovinu celkové plochy buněčné membrány [8], objem tubulů vymezený pro transport iontů je značně omezen (2 - 4% celkového objemu buňky). Důsledkem tohoto uspořádání je, že iontový transport přes tubulární membránu způsobuje uvnitř TATS významné změny iontových koncentrací, které zpětně ovlivňují aktivitu tubulárních iontových kanálů a přenašečů. Tímto mechanizmem dochází k ovlivnění tubulárních iontových proudů, intracelulární iontové rovnováhy a finálně i síly buněčné kontrakce. Z výsledků výpočtového modelování vyplynulo, že zmíněné ovlivnění tubulárních iontových proudů (zejména zmenšení vápníkového proudu ICa,t) může způsobit podstatné snížení intracelulární náplně Ca2+ v sarkoplazmatickém retikulu (u modelu potkana při stimulaci 5Hz až o 18%) a následně snížení přechodných koncentračních změn Ca2+ v cytoplazmě (u modelu potkana při stimulaci 5Hz až o 25 %) [2, 3, 4], které určují sílu buněčných stahů. Velikost tohoto účinku u různých druhů zvířat však vykazuje významné odlišnosti, které odráží specifické vlastnosti jejich membránového transportního systému [5]. Přes tyto poznatky o funkci TATS zůstávají mnohé otázky stále nezodpovězeny. Patří sem např. účinek iontově-koncentračních změn v TATS u lidských komorových buněk a jeho ovlivnění v podmínkách vrozených dysfunkcí membránových kanálů [9], vliv těchto koncentračních změn na buněčnou elektrickou restituci [10] a v neposlední řadě také vliv úbytku TATS u některých druhů srdečních onemocnění (Balijepalli et al., 2003, Louch et al., 2004) na buněčnou funkci. Výpočtové rekonstrukce experimentálních výsledků charakterizujících vliv zkoumaných farmak na buněčnou elektrickou aktivitu přinesly cenné informace o mechanizmu interakce těchto látek s membránovými kanály [11, 14, 15, 16, 17]. Ačkoliv v případě antiarytmika propafenonu nebylo možné jednoznačně určit, který z navrhovaných modelů [14, 15] lépe reprezentuje reálný mechanizmus blokády INa-kanálů, nové experimentální údaje (Edrich et al., 2006) ukazují spíše na jejich dominantní blokádu v otevřeném stavu, kterou vykazoval pouze první model zahrnující interakci propafenonu se všemi stavy kanálu. Také modelování účinku antipsychotika haloperidolu a později též perfenazinu na proud Ito u srdečních buněk ukázalo, že kombinace interakce těchto látek s Ito-kanály v otevřeném a inaktivovaném stavu je pravděpodobným mechanizmem zodpovědným za blokádu těchto kanálů [16, 17]. Je tedy zřejmé, že i látky používané v klinické psychiatrii mohou za určitých podmínek srdeční aktivitu významně ovlivnit.

36

5 SOUBOR PUBLIKACÍ ZAHRNUTÝCH DO HABILITAČNÍ PRÁCE [1] Pásek M.: Computer modelling in cardiac cell electrophysiology. Eng. Mech., 2008, 15: 365-372. [2] Pásek M., Christé G., Šimurda J.: A Quantitative model of the cardiac ventricular cell incorporating the transverse-axial tubular system. Gen. Physiol. Biophys., 2003, 22: 355-368. [3] Pásek M., Šimurda J., Christé G.: The functional role of cardiac T-tubules in a model of rat ventricular myocytes. Phil. Trans. R. Soc. A, 2006, 364: 1187-1206. [4] Pásek M., Šimurda J., Orchard C.H., Christé G.: A model of the guinea-pig ventricular cardiac myocyte incorporating a transverse-axial tubular system. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2008, 96: 258-280. [5] Pásek M., Šimurda J., Orchard C., Christé G.: Physiological role of transverse-axial tubular system in cardiac ventricular myocytes: a simulation study. Comp. Cardiol., 2005, 32: 993-995. [6] Pásek M., Šimurda J., Christé G., Orchard C.H.: Modelling the cardiac transverse-axial tubular system (review). Prog. Biophys. Mol. Biol., 2008, 96: 226-243. [7] Orchard C.H., Pásek M., Brette F.: The role of mammalian cardiac t-tubules in excitationcontraction coupling: experimental and computational approaches (review). Exp. Physiol., 2009, 94: 509-519. [8] Pásek M., Brette F., Nelson A., Pearce C., Qaiser A., Christé G., Orchard C.H.: Quantification of t-tubule area and protein distribution in rat cardiac ventricular myocytes. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2008, 96: 244-257. [9] Christé G., Chahine M., Chevalier P., Pásek M.: Changes in action potentials and intracellular ionic homeostasis in a ventricular cell model related to a persistent sodium current in SCN5A mutations underlying LQT3. Prog. Biophys. Mol. Biol., 2008, 96: 281-293. [10] Šimurda J., Šimurdová M., Pásek M., Bravený P.: Quantitative analysis of cardiac electrical restitution. Eur. Biophys. J., 2001, 30: 500-514. [11] Bébarová M., Matejovič P., Pásek M., Šimurdová M., Šimurda J.: Effect of ajmaline on transient outward current in rat ventricular myocytes. Gen. Physiol. Biophys., 2005, 24: 27-45. [12] Bébarová M., Matejovič P., Pásek M., Šimurdová M., Šimurda J.: Effect of ajmaline on action potential and ionic currents in rat ventricular myocytes. Gen. Physiol. Biophys., 2005, 24: 311-25. [13] Bahníková M., Matejovič P., Pásek M., Šimurdová M., Šimurda J.: Ajmaline-induced block of sodium current in rat ventricular myocytes. Scripta Medica, 2002, 75: 169-178. [14] Pásek M., Šimurda J.: Quantitative modelling of interaction of propafenone with sodium channels in cardiac cells. In: Proceedings of the International Federation for Medical and Biological Engineering, 2001, 1028-1031, Pula (Chorvatsko). [15] Pásek M., Šimurda J.: Quantitative modelling of interaction of propafenone with sodium channels in cardiac cells. Med. Biol. Eng. Comput., 2004, 42: 151-157. [16] Bébarová M., Matejovič P., Pásek M., Nováková M.: Effect of haloperidol on transient outward potassium current in rat ventricular myocytes. Eur. J. Pharm., 2006, 550: 15-23. [17] Bébarová M., Matejovič P., Pásek M., Jansová D., Šimurdová M., Nováková M., Šimurda J.: Effect of antipsychotic drug perphenazine on fast sodium current and transient outward potassium current in rat ventricular myocytes. Naunyn-Schmied. Arch. Pharmacol., 2009, 380: 125-133.

37

6 LITERATURA Amsellem J. et al.: Biol. Cell, 1995, 85: 43-54. Attwell D. et al.: Proc. R. Soc. London., 1979, 206: 145-161. Balijepalli R.C. et al.: Cardiovasc. Res., 2003, 59: 67-77. Bassingthwaighte J.B., Reuter H.: Academic Press, New York, 1972. Beeler G.W., Reuter H.: J. Physiol. 1977, 268: 177-210. Benz I., Kohlhardt M.: J. Membr. Biol., 1994, 139: 91-201. Bers D.M.: Am. J. Physiol., 1983, 244: H462–H468. Bers D.M., MacLeod K.T.: Circ. Res., 1986, 58: 769-782. Bers D.M.: Nature, 2002, 415: 198–205. Blatter L.A., Niggli E.: Cell Calcium, 1998, 23: 269-279. Bondarenko V.E. et al.: Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol., 2004, 287: H1378-H1403. Brennan T. et al.: Eur. J. Pharm. Sci., 2009, 36: 62-77. Brette F., Orchard C.H.: Circ. Res., 2003, 92: 1182-1192. Brette F. et al.: Circ. Res., 2004, 95: e1-e7. Brown A.M. et al.: J. Physiol., 1981, 318: 479-500. Capucci A., Boriani G.: Drug Saf., 1995, 12: 55-72. Clancy C.E., Rudy Y.: Circulation, 105: 2002, 1208-1213. Clark R.B. et al.: Br. J. Pharmacol., 1995, 115: 335-343. Clark R.B. et al.: J. Physiol., 2001, 537: 979-992. Cooklin M. et al.: Exp. Physiol., 1998, 83: 763-770. Daut J.: J. Physiol., 1982, 330: 221-242. Despa S. et al.: Biophys. J., 2003, 85: 3388-3396. DiFrancesco D., Noble D.: Phil. Trans. Roy. Soc. London., 1985, 307: 353-398. Edrich T. et al.: J. Membrane Biol., 2006, 207: 35-43. Forbes M.S. et al.: Am. J. Anat., 1984, 170: 143-162. Forbes M.S., van Neil E.E.: Anat. Rec., 1988, 222: 362-379. Frampton J.E. et al.: Am. J. Physiol., 1991, 261: C739-C750. Frank J.S. et al.: J. Cell Biol., 1992, 117: 337-345. Greenstein J.L., Winslow R.L.: Biophys. J., 2002, 83: 2918-2945. Greenstein J.L. et al.: Biophys. J., 2006, 90: 77-91. Harvey R.D., Ten Eick R.E.: J. Gen. Physiol., 1988, 91: 593-615. Hassaballa H.A., Balk R.A.: Am. J. Ther., 2003, 10: 58-60. Hilgemann D.W., Noble D.: Proc. Roy. Soc. London B., 1987, 230: 163-205. Hille B.: J. Gen. Physiol., 1977, 69: 497-515. Hinch R. et al.: Biophys. J., 2004, 87: 3723-3736. Hodgkin A.L., Huxley A.F.: J. Physiol., 1952a, 116: 449-472. Hodgkin A.L., Huxley A.F.: J. Physiol., 1952b, 116: 473-496. Hodgkin A.L., Huxley A.F.: J. Physiol., 1952c, 117: 500-544. Hondeghem L.M., Katzung B.G.: Biochim. Biophys. Acta., 1977, 472: 373-98. Hondeghem L.M., Katzung B.G.: Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 1984, 24: 387-423. Christé G.: J. Mol. Cell. Cardiol., 1999, 31: 2207-2213. Iwata Y. et al.: FEBS Lett., 1994, 355: 65-68. Jafri M.S. et al.: Biophys. J., 1998, 74: 1149-1168. Kawai M. et al.: Am. J. Physiol., 1999, 277: H603-H609. Kieval R.S. et al.: Am. J. Physiol., 1992, 263: C545-C550.

38

Kodama I. et al.: Br. J. Pharmacol., 1992, 107: 813-820. Kohlhardt M., Fichtner H.: J. Membr. Biol., 1988, 102: 105-119. Koller B., Franz M.R.: J. Cardiovasc. Pharmacol., 1994, 24: 753-760. Komukai K. et al.: Pflügers Arch., 2002, 444: 532–538. Ling G., Gerard R.W.: J. Cell. Physiol., 1949, 34: 383-96. Louch W.E. et al.: Cardiovasc. Res., 2004, 62: 63-67. Luo C.H., Rudy Y.: Circ. Res., 1991, 68: 1501-1526. Luo C.H., Rudy Y.: Circ. Res., 1994, 74: 1071-1096. McAllister R.E. et al.: J. Physiol., 1975, 251: 1-59. McDonough A.A. et al.: Am. J. Physiol., 1996, 270: C1221-C1227. Noble D.: J. Physiol., 1962, 160: 317-352. Noble D., Tsien R.W.: J. Physiol., 1968, 195: 185-214. Noble D., Tsien R.W.: J. Physiol., 1969a, 200: 205-231. Noble D., Tsien R.W.: J. Physiol., 1969b, 200: 233-254. Nordin C.: Am. J. Physiol., 1993, 34: H2117-H2136. Nygren A. et al.: Circ. Res., 1998, 82: 63-81. Page E.: Am. J. Physiol., 1978, 235: C147-C158. Pandit S.V. et al.: Biophys. J., 2001, 81: 3029-3051. Rasmussen H.B. et al.: Am. J. Physiol., 2004, 286: H1300-H1309. Rasty S. et al.: Chest, 2004, 125: 1821-1829. Rice J.J. et al.: Biophys. J., 1999, 77: 1871-1884. Sanchez-Chapula J.A.: J. Pharmacol. Exp. Ther., 1999, 290: 515-523. Satoh H. et al.: Biophys. J., 1996, 70: 1494-504. Shannon T.R. et al.: Biophys. J., 2004, 87: 3351-3371. Shepherd N., McDonough H.B.: Am. J. Physiol., 1998, 275: H852-H860. Schreibmayer W., Lindner W.: J. Cardiovasc. Pharmacol., 1992, 20: 324-331. Snyders D.J. et al.: Mol. Pharmacol., 1992, 41: 322-330. Soeller C., Cannell M.B.: Circ. Res., 1999, 84: 266–275. Soeller C., Cannell M.B.: Prog. Biophys. Mol. Biol., 2004, 85: 141-162. Sommer J.R., Jennings R.B.: Raven Press, New York, 1992. Sugiyama A. et al.: Toxicol. Appl. Pharmacol., 2001, 173: 120-128. Sugiyama A.: Nippon. Yakurigaku. Zasshi, 2003, 121: 393-400. Šimurda J. et al.: J. Physiol., 1992, 456: 49-70. Šimurda J. et al.: Mol. Cell Biochem., 1996, 161: 5-12. Šimurdová M. et al.: Scripta Medica, 1997, 70: 263-275. Thomas M.J. et al.: J. Mol. Cell. Cardiol., 2003, 35: 1325-1337. Tourneur Y. et al.: J. Membr. Biol., 1994, 142: 337-347. Veldkamp M.W. et al.: Circ. Res., 2000, 86: E91–E97. Wang D.Y. et al.: Am. J. Physiol., 1988, 255: C798-C807. Wang D.W. et al.: Circ. Res., 2000, 87: E37-E43. Wettwer E. et al.: Br. J. Pharmacol., 1998, 125: 659-666. Winslow R.L. et al.: Circ. Res., 1999, 84: 571-586. Yao A. et al.: Cell Calcium, 1997, 22: 431-438. Yang Z. et al.: Circ. Res., 2002, 91: 315-322. Yasui K. et al.: Pflügers Arch., 1993, 422: 371-379. Ye V.Z. et al.: J. Cardiovasc. Pharmacol., 1993, 21: 47-55. Zeng J. et al.: Circ. Res., 1995, 7: 140-152.

39

7 SEZNAM VYBRANÝCH SYMBOLŮ [X]e [X]t [X]i [X]i,end [X]i,rest [X]t,rest [Ca2+]JSR [Ca2+]NSR [Ca2+]JSR,end [Ca2+]NSR,end [Ca2+]ss [ATP]i Vm, Um Vms Vmt Im INa INaps ICa,L, ICa IK,L IKto, Ito IK IKr IKs IKss IKp IK1 IK(Na) IK(ATP) Ins(Ca) IpCa INaK INaCa If INa,b ICa,b IK,b ICl Ix,max Ix,t Ix,s Qx fx,t fbl IC50

40

extracelulární koncentrace iontů X tubulární koncentrace iontů X intracelulární koncentrace iontů X intracelulární koncentrace iontů X na konci cyklu intracelulární koncentrace iontů X v klidovém stavu tubulární koncentrace iontů X v klidovém stavu koncentrace iontů Ca2+ v JSR koncentrace iontů Ca2+ v NSR koncentrace iontů Ca2+ v JSR na konci cyklu koncentrace iontů Ca2+ v NSR na konci cyklu koncentrace iontů Ca2+ v subintracelulárním prostoru intracelulární koncentrace ATP membránové napětí napětí na povrchové membráně napětí na tubulární membráně celkový membránový proud sodíkový přechodný proud sodíkový perzistentní proud vápníkový přechodný proud typu L draslíkový přechodný proud typu L draslíkový přechodný proud draslíkový zpožděný proud rychlá složka draslíkového zpožděného proudu pomalá složka draslíkového zpožděného proudu draslíkový proud s pomalou inaktivací draslíkový proud aktivovaný během fáze plató AN draslíkový časově nezávislý proud draslíkový časově nezávislý proud citlivý na Na+ draslíkový časově nezávislý proud citlivý na ATP nespecifický časově nezávislý proud citlivý na Ca2+ proud vápníkového přenašeče závislého na ATP proud sodíko-draslíkového přenašeče závislého na ATP proud sodíko-vápníkového přenašeče sodíko-draslíkový proud aktivovaný hyperpolarizací sodíkový lineární proud vápníkový lineární proud draslíkový lineární proud chlorový proud maximální velikost proudu Ix složka proudu Ix protékající tubulární membránou složka proudu Ix protékající povrchovou membránou náboj přenesený proudem Ix frakce transportních bílkovin v tubulární membráně frakce blokovaných kanálů koncentrace blokátoru způsobující pokles proudu na 50%