VOORWOORD
Langs deze weg zou ik iedereen willen bedanken die mij geholpen heeft bij het tot stand brengen van mijn eindwerk. Allereerst wil ik Professor dr. Zeger Debyser bedanken opdat hij mij de mogelijkheid heeft gegeven enkele veelgebruikte technieken in verband met recombinant DNA bij te brengen aan de afdeling IRC van de K.U.L. campus Kortrijk. In het bijzonder wil ik ook mevrouw Christiane Duportail bedanken voor het aanleren van deze technieken en de verdere praktische begeleiding gedurende de twee maanden stage. Alsook voor het feit dat ze me kritisch liet aankijken tegenover het onderwerp was een grote hulp om een beter inzicht te krijgen inzake de materie. Verder ook nog Dr. sc. Annika Janssens en Dr. Rik Gijsbers voor het verschaffen van theoretische informatie en het zorgvuldig opvolgen van het eindwerk. Ik wil deze personen ook nog eens bedanken omdat ze voortdurend klaarstonden als ik problemen ondervond zowel theoretisch als praktisch. Als laatste wil ik ook nog een dankwoordje richten tot mijn ouders die tijdens mijn opleiding altijd in mij zijn blijven geloven. Hun morele steun samen met die van mijn broer, zus en vriendin was een grote hulp tijdens het verwezenlijken van dit eindwerk.
INHOUDSOPGAVE
1. Lijsten
1
1.1 Lijst met figuren
1
1.2 Lijst met tabellen
2
1.3 Lijst met afkortingen
2
2. Samenvatting
4
3. Doelstelling en situering
5
4. Literatuurstudie
6
4.1 Lentivirale vectoren
6
4.1.1
Structuur van HIV-1
6
4.1.2
Replicatie van HIV-1
9
4.2 HIV-1 afgeleide vectoren
12
4.2.1
Transferplasmide
14
4.2.2
Packaging plasmide
15
4.2.3
Enveloppe plasmide
15
4.3 Uitleg omtrent het te construeren construct
16
4.3.1
Central polypurine tract (cPPT) / Central termination sequence (CTS) 17
4.3.2
Humaan cytomegalovirus (hCMV)
17
4.3.3
Multiple cloning site (MCS)
17
4.3.4
Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element (WPRE) 17
4.3.5
Zelfinactiverende vector (SIN)
18
4.3.6
Internal ribosome entry site (IRES)
18
4.3.7
Enhanced green fluorescent protein (eGFP)
19
4.4 PCR
20
4.4.1
Algemeen
20
4.4.2
Principe
20
4.5 Sequentie-analyse volgens Sanger
22
4.5.1
Algemeen
22
4.5.2
Principe
23
5. Experimentele sectie 5.1 Materiaal en methoden
26 26
5.1.1
Inleiding
26
5.1.2
Transformatie
27
5.1.3
Plasmide DNA purificatie
29
5.1.4
Restrictiedigestie
30
5.1.5
Agarosegelelektroforese
31
5.1.6
Fragmentisolatie of opzuivering van DNA uit gel
32
5.1.7
Ligatie
33
5.2 Resultaten
35
5.2.1
Vergelijkende studie in verband met plasmide DNA purificatie
35
5.2.2
Constructie van pCHMWS MCS-IRES-eGFP
41
6. Besluiten
51
7. Referenties
55
1. Lijsten 1.1 Lijst met figuren Figuur 1
Structuur en genoom van HIV-1
Figuur 2
Infectie van een CD4 doelcel met HIV-1
Figuur 3
Replicatieproces van een retrovirus
Figuur 4
Principe van HIV-1-afgeleide lentivirale vectoren
Figuur 5
Schematisch overzicht van reverse transcriptie van HIV-1
Figuur 6
Transferplasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP
Figuur 7
Principe van de PCR
Figuur 8
Dideoxyribonucleosidetrifosfaat
Figuur 9
Methode van Sanger (oude versie)
Figuur 10
Vernieuwde methode van Sanger
Figuur 11
Principe van de algemene kloneringsstrategie
Figuur 12
Schematische weergave van een transformatie
Figuur 13
Mogelijke elutiekolommen (= Qiagentips)
Figuur 14
Opstelling van een agarosegelelektroforese
Figuur 15
Principe van sticky end ligatie
Figuur 16
Interactie tussen DEAE en negatief geladen Fosfaatgroep
Figuur 17
PickPen 1-M
Figuur 18
Methodiek van magnetische purificatie
Figuur 19
Constructieschema van pCHMWS MCS-IRES-eGFP
Figuur 20
Controlegel voor de inbouw van de MCS
Figuur 21
Controlegel van de Bcl I / Spe I digestie
Figuur 22
Fragmentisolatie
Figuur 23
Het resultaat van de PCR reactie
Figuur 24
Analytisch Afl III restrictie digest van het finaal recombinant plasmide
Figuur 25
Finale controle van het finaal plasmide
1.2 Lijst met tabellen Tabel 1: Overzicht van de verschillende genen en bondige beschrijving Tabel 2: Waarnemingsuitkomsten verkregen met NucleoSpin® Plasmid QuickPure Tabel 3: Waarnemingsuitkomsten verkregen met QuickPick Plasmid DNA Tabel 4: Prijsvergelijking NucleoSpin® Plasmid QuickPure / QuickPick Plasmid DNA Tabel 5: De vijf verschillende ligatiemengsels Tabel 6: Verwachtingen na digestie met BamH I/Spe I, Bcl I en Afl III 1.3 Lijst met afkortingen A
Adenine
AIDS
Acquired Immune deficiency syndrome
Amp
Ampicilline
bp
Basenparen
C
Cytosine
cDNA
Complementair DNA
cPPT
centrale polypurine tract
CTS
centrale terminatie sequentie
ddNTP
Dideoxyribonucleosidetrifosfaat
DEAE
Diethylaminoethanol
DNA
Deoxyribonucleic acid of desoxyribonucleïnezuur
dNTP
Deoxyribonucleosidetrifosfaat
dsDNA
Double-stranded DNA of dubbelstrengs DNA
eGFP
enhanced green fluorescent protein
env-gen
Envelop gen
G
Guanine
Gag-gen
Groepsspecifiek antigeen gen
gp
Glycoproteïne
hCMV
humaan cytomegalovirus
HIV-1
Humaan Immunodeficiëntie virus type 1
IRES
Internal ribosome entry site
LTR
Long terminal repeats
mRNA
Messenger RNA
MCS
Multiple cloning site
Nef-gen
Negatieve regulatiefactor gen
PBS
Primer-binding site
PCR
Polymerase chain reactie (polymerase-kettingreactie)
Pol-gen
Polymerase
Rev-gen
Regulator of expression of virion gen
RNA
Ribonucleic acid of ribonucleïnezuur
rpm
rotation per minute
RRE
Rev-responsive element
RT
Reverse Transcriptase
SIN
Zelfinactiverend
ssRNA
Single-stranded RNA of enkelstrengs RNA
T
Thymine
TAE
Tris acetaat EDTA
Taq
Thermus aquaticus
Tat-gen
Transactivator gen
tRNA
transfer-RNA
vif-gen
virion-infectiviteitsfactor
VSV-G
Vesiculair Stomatitis Virus-G proteïne
WPRE
Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element
wtGFP
Wildtype green fluorescent protein
2. Samenvatting Dit eindwerk kadert in een onderzoeksproject rond gentherapie voor neurodegeneratieve aandoeningen met behulp van lentivirale vectoren, toegepast op de ziekte van Parkinson en Alzheimer. Stereotactische injectie van deze lentivirale vectoren in de hersenen van muizen of ratten zorgen ervoor dat therapeutische genen tot expressie kunnen komen. De eerste doelstelling van dit eindwerk bestond er in een geschikte lentivirale transferplasmide, namelijk pCHMWS MCS-IRES-eGFP te construeren. Uit het plasmide pCHMWS eGFP-IRES-Hygro wordt de eGFP-sequentie verwijderd. Vervolgens wordt de MCS geligeerd in bovenstaande vector (zonder eGFP) zodat het plasmide pCHMWS MCS-IRES-Hygro wordt gevormd. Van dit plasmide wordt dan nog de Hygro-sequentie verwijderd. Ondertussen wordt uit het plasmide pCHCMV eGFPWS Isa de eGFP-sequentie gedigesteerd. Finaal worden dan beide fragmenten geligeerd ter vorming van het uiteindelijk gewenst plasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP. De IRES-sequentie speelt hierbij een belangrijke rol. Deze sequentie maakt het mogelijk om twee genen tegelijkertijd tot expressie te laten komen onder controle van één promotor. Deze twee genen zijn enerzijds het gen dat ingebouwd zal worden in de Multiple cloning site (MCS) en anderzijds het merkergen dat codeert voor de groene fluorescentie (Green Fluorescent
Protein).
Deze
groene
fluorescentie
kan
makkelijk
met
een
fluorescentiemicroscoop waargenomen worden. Uit studies is gebleken dat het gen (in de MCS) vóór de IRES-sequentie vijfmaal meer tot expressie komt dan het gen na de IRES. Controlegels en een sequentie-analyse wezen uit dat de constructie van het plasmide geslaagd was.
Een tweede doelstelling was een vergelijkende studie van plasmide DNA purificatie kits. Hierbij werden twee verschillende technologieën met elkaar vergeleken, namelijk een silicamembraan technologie en een technologie gebaseerd op magnetische silica bolletjes.
3. Doelstelling en situering Dit eindwerk kadert in een globaal onderzoeksproject over de ontwikkeling van gentherapeutische strategieën voor neurodegeneratieve aandoeningen (waaronder de ziekte van Parkinson en Alzheimer) met behulp van lentivirale vectortechnologie. De ontwikkeling en optimalisatie van de lentivirale vectoren vormt een belangrijk aspect in dit onderzoek. Met behulp van enkele aangeleerde technieken werd het gewenste transferplasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP geconstrueerd. Door middel van de IRES-sequentie (internal ribosome entry site) kunnen twee proteïnen tot expressie gebracht worden uitgaande van een enkel mRNA, namelijk de enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) en het gen dat ingebouwd wordt in de Multiple Cloning Site (MCS).
Daarnaast werd ook een vergelijkende studie uitgevoerd van plasmide DNA purificatie kits.
Deze techniek werd ook gebruikt bij de constructie van het plasmide.
Bij deze
vergelijkende studie werden zes stalen onderzocht met twee verschillende technologieën, namelijk een silica-membraan technologie en een technologie gebaseerd op magnetisme. De zuiverheid en de kostprijs van deze technologieën werden vergeleken en daaruit werd een conclusie getrokken. Deze vergelijkende studie wordt beschreven in 3.2.3.
4. Literatuurstudie 4.1 Lentivirale vectoren Lentivirale vectoren zijn vectoren afkomstig van de retroviridae (retrovirussen). Het best gekende voorbeeld van dit type virus is het Humaan Immunodeficiëntie Virus (HIV). Dit lentivirus kan ook niet-delende cellen, zoals neuronen en macrofagen, gaan infecteren in tegenstelling tot de gewone retrovirussen. De HIV-afgeleide lentivirale vectoren bezitten eveneens deze eigenschap, zodat ze kunnen aangewend worden voor in vivo gentherapie op niet-delende cellen (= het genetisch materiaal rechtstreeks in het doelweefsel inbrengen met behulp van een vector). De lentivirale vectoren vertonen ook een lange en stabiele expressie. Ze kunnen zich echter niet verder repliceren wegens het ontbreken van essentiële genen. HIV is een heel effectieve lentivirale vector omdat het zodanig geëvolueerd is om T- cellen en andere macrofagen te infecteren en zijn genen erin tot expressie te brengen. HIV is onderverdeeld in twee grote groepen namelijk HIV-1 en HIV-2. HIV-2 veroorzaakt een mildere vorm van AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome) dan HIV-1. Tegenwoordig zijn 99 % van de AIDS-gevallen te wijten aan HIV-1, daarom wordt alleen dit type verder besproken. Hieronder volgt eerst een beschrijving van de structuur en de replicatie van HIV-1. Daarna volgt er een bespreking van HIV-1 afgeleide lentivirale vectoren.
4.1.1
Structuur van HIV-1
HIV-1 (zie figuur 1) is in 1986 voor het eerst beschreven door de Fransman Luc Montagnier en later bevestigd door de Amerikaan Robert Gallo. Het is ongeveer 100 nanometer in diameter en heeft de vorm van een icosaëder. Het HIV-1-genoom bestaat uit ongeveer 9750 nucleotiden. Van het HIV-1-genoom zijn momenteel negen genen geïdentificeerd.
Het HIV-1-genoom bestaat uit twee identieke enkelstrengen van RNA (ssRNA).
Het
enkelstrengige RNA is nauw verweven met een nucleokapsel van proteïnen, p7 en enzymen (reverse transcriptase (RT), protease en integrase) die onmisbaar zijn voor de ontwikkeling van het virion. Dit geheel wordt op zijn beurt omgeven door een conisch kapsel van virale proteïnen (p24). Een matrix, samengesteld uit virale proteïnen (p17), is rond dit kapsel gebouwd. Hierrond is een fosfolipidenlaag terug te vinden met twee belangrijke glycoproteïnen, namelijk gp120 en gp41.
Deze laatste verankert de structuur in het virale enveloppe.
Glycoproteïne gp120 is van belang bij de infectiecyclus, want het receptorproteïne CD4 van T-cellen herkent dit glycoproteïne.
Figuur 1: Structuur en genoom van HIV-1 (Bron: http://en.wikipedia.org/wiki/HIV)
Aan weerszijden van het genoom bevinden zich long terminal repeats (LTRs). Deze coderen niet voor eiwitten, maar initiëren de expressie van virale genen. Ze blijken ook bepalend te zijn voor de plaats waar het virale DNA in het gastheer-DNA wordt geïntegreerd. Een Psisequentie ligt nabij het 5’ einde van het RNA-genoom, deze verzorgt het inpakken van het virale genomische RNA in een viruskapsel om zo de infectie van HIV-1 verder te zetten in de gastheercel.
Zoals eerder aangehaald wordt er in het RNA-genoom gecodeerd voor negen genen, namelijk gag, pol, env, tat, rev, nef, vif, vpr en vpu. Tabel 1 geeft een bondige beschrijving van de functie van de verschillende genen. Gag, pol en env worden structurele genen genoemd. De zes andere zijn regulerende of accessoire genen. Tat en rev zijn essentieel voor HIV-1 replicatie, terwijl de andere (nef, vif, vpr en vpu) de infectie- en replicatiecyclus gaan optimaliseren.
gag Codeert voor de kerneiwitten. pol Codeert voor de virale enzymen (reverse transcriptase, integrase en protease ). env Codeert voor de virale envelopeiwitten. tat
Codeert voor Tat-eiwit en zorgt voor een verhoogde expressie van zowel structurele als regulerende genen. (= positieve regulatie)
rev Codeert voor Rev-eiwit. Activiteit varieert van latente infectie tot een heel actieve replicatie. (= differentiële regulatie) nef Codeert voor Nef-eiwit. Onderdrukt de transcriptie van het virale DNA. (= negatieve regulatie) vif Essentieel voor de infectiviteit van het virus. vpr Draagt bij tot het nucleair transport van het HIV-1 preïntegratiecomplex (PIC) in nietdelende cellen. vpu Noodzakelijk voor het efficiënt vrijlaten van viruspartikels uit geïnfecteerde cellen. Tabel 1: Overzicht van de verschillende genen met bondige beschrijving
4.1.2
Replicatie van HIV-1
De HIV-1 infectiecyclus (zie figuur 2) begint wanneer het virus door middel van het gp120 glycoproteïne aan het receptorproteïne CD4 van de macrofagen of de T-cellen bindt. Het HIV-1 bindt tevens aan een chemokinecoreceptor (CCR5 en CXCR4).
CCR5 is een
coreceptor, vereist voor de binding tussen HIV-1 en macrofagen. CXCR4 is tevens een coreceptor, maar zorgt voor de binding tussen HIV-1 en T-cellen.
Vervolgens treedt
membraanfusie op en komt het HIV-1 kapsel vrij in de cel.
Figuur 2: Infectie van een CD4 doelcel met HIV-1 (a): Specifieke binding tussen HIV-1 gp120 met de CD4 receptor en CCR5 coreceptor van macrofagen. (b): Fusie van het HIV-1 enveloppe met de gastheercelmembraan met 1) de interactie tussen het virus en de receptor/coreceptor. 2) Virale enveloppe smelt samen met het membraan van de gastheercel. 3) Nucleokapsel dringt binnen in de gastheercel, waardoor de virale infectie kan beginnen. (Bron: MADIGAN, M., MARTINKO, J., Biology of Microorganisms, USA, Pearson Education, 2006, 992 blz.)
Bij aanvang van de replicatiecyclus (zie figuur 3) zal het virale kapsel de cel binnendringen, waarna het reverse transcriptase het enkelstrengige RNA overschrijft in viraal complementair DNA (cDNA). Dit proces wordt ook wel omgekeerde transcriptie genoemd. Vervolgens maakt het reverse transcriptase van het cDNA template een complementaire DNA streng om zo dubbelstrengig viraal DNA (dsDNA) te vormen. Dit dsDNA wordt dan geïntegreerd in het gastheergenoom. De integratie komt tot stand door het virale enzym integrase. Hierdoor wordt een stabiel genetisch element verkregen, provirus genaamd.
Het
geïntegreerde provirale DNA wordt door een cellulair RNA polymerase vertaald in RNA transcripts. Deze RNA transcripts worden samengevoegd en ingekapseld in nucleokapsels in het cytoplasma.
Zo wordt er een virion gevormd.
Deze
ondergaat een budding uit de
gastheercel. Dan ontstaat er een zogenaamd immatuur virion. Verdere rijping tot mature virions wordt verwezenlijkt door het protease. Het virus is dan capabel om een andere cel te gaan infecteren.
Figuur 3: Replicatieproces van een retrovirus (Bron: MADIGAN, M., MARTINKO, J., Biology of Microorganisms, USA, Pearson Education, 2006, 992 blz.)
Nadat het virus de cel is binnengedrongen, treedt dus reverse transcriptie op. Figuur 4 geeft een schematisch overzicht van de reverse transcriptie van HIV-1.
Figuur 4: Schematisch overzicht van reverse transcriptie van HIV-1 (Bron: http://www.web-books.com/moBio/Free/Ch4J1.htm)
(1) tRNA treedt op als primer en bindt aan de complementaire sequentie, de primer-binding site (PBS) genaamd. (2) Vanaf het tRNA wordt een DNA sequentie gevormd, gebaseerd op het retroviraal RNA. (3) De virale R en U5 sequenties worden verwijderd door RNase H. (4) Eerste sprong: de DNA sequentie bindt aan de R sequentie aan het 3’ einde. (5) Verdere synthese van de negatieve streng vanaf het 3’ einde. (6) Het meeste virale RNA wordt afgebroken door RNase H. (7) Vorming van de positieve DNA streng vanaf het virale RNA (cPPT). (8) Zowel tRNA als het overgebleven RNA worden verwijderd door RNase H. (9) Tweede sprong: de PBS van de tweede streng bindt zich aan de PBS van de eerste. (10) Verlenging van beide strengen.
4.2 HIV-1 afgeleide lentivirale vectoren Lentivirale vectoren zijn, net als het wildtype virus, in staat om zowel delende als nietdelende cellen te infecteren. Een vector onderscheidt zich van een virus doordat een vector zich niet kan repliceren. Het proces waarbij een vector een cel binnendringt en integreert in het gastheer genoom wordt transductie genoemd. Om een lentivirale vector te verkrijgen, moet een reportergen of therapeutisch gen gekloond worden in een vectorsequentie dat aan beide uiteinden geflankeerd wordt door LTRs en de Psi-sequentie van HIV-1. De LTRs zijn nodig om het therapeutisch gen in het genoom van de doelcel te brengen. De Psi-sequentie dient voor het inpakken van RNA met het reportergen in vectorpartikels. De lentivirale vectoren bevatten zo weinig mogelijk virale genen. Alle genetische informatie nodig voor de aanmaak van vectorpartikels wordt over drie verschillende plasmiden verspreid omwille van de bioveiligheid, namelijk packaging-, enveloppe- en transferplasmide. Het is het transferplasmide dat het reportergen (in ons geval eGFP achter de IRES) alsook het gen of interest draagt. De drie plasmiden worden in een productie-cel (293T HEK) gebracht via transfectie. De vectorpartikels bevatten enkel de sequenties van het transferplasmide zodat het virus zich niet kan repliceren na integratie in het genoom van de gastheercel. De drie plasmiden worden hierna achtereenvolgens beschreven (zie figuur 5).
LTR
U VIF
GAG
ψ
RRE
POL
PRO
LTR
ENV R TAT
U3 R U5
REV
NEF
HIV PROVIRUS
TRANSFER PLASMIDE LTR
LTR
RRE CM V
GA
ψ
transgene
+
CMV
VSV-G
SD
polyA
SA
ENVELOPPE PLASMIDE + U CM V
ψ
RRE
VIF
GAG PRO
POL
polyA R TAT
SD
REV
PACKAGING PLASMIDE
NEF
RRE
improved SIN transfer plasmid
C M
ψ
CDS
RRE
U
2nd generation packaging construct
VIF
GAG
C M
polyA
ψ
PRO
POL
R
TAT REV
heterologous envelope plasmid
C M
NEF
VSV-G polyA
293T producer cells
lentiviral vector
Figuur 5: Principe van HIV-1 afgeleide lentivirale vectoren (Bron: http://biology.kenyon.edu/slonc/gene-web/Lentiviral/Lentivi2.html)
4.2.1
Transferplasmide
Dit plasmide bevat cis-acting genetische sequenties, zoals LTR, Rev-responsive element (RRE) en de Packaging signal. Deze zijn nodig voor het infecteren van de doelcel en voor het transport van het reportergen of therapeutisch gen. Ze bevat tevens restrictieplaatsen voor de insertie van de gewenste genen. De originele envelop, gag en pol genen zijn verwijderd en worden via twee andere plasmiden ter beschikking gesteld (zie punt 4.2.2 en 4.2.3).
4.2.2
Packaging plasmide
Het Packaging plasmide is de ruggengraat van het vectorsysteem en staat tevens bekend als pCMVAR9. In dit plasmide worden de elementen teruggevonden die nodig zijn voor het inpakken van het RNA, met name structurele proteïnen (gag), HIV-1 genen zoals tat en rev (behalve env, die codeert voor de infectie van T-cellen, anders zou de vector enkel deze cellen kunnen transduceren) en de enzymen (pol) die vectorpartikels genereren. Dit plasmide bevat tevens het humaan cytomegalovirus (hCMV) die verantwoordelijk is voor de expressie van virale proteïnen. De Psi-sequentie is verwijderd zodat de packaging sequenties niet zullen ingebouwd worden in het virusgenoom. Daarnaast zijn ook de LTRs verwijderd zodat er geen reverse transcriptie mogelijk is. Door de uitschakeling van deze twee sequenties zal het virus niet reproduceren nadat het de cel geïnfecteerd heeft.
4.2.3
Enveloppe plasmide
Dit plasmide specifieert welk type cel er moet geïnfecteerd worden in plaats van T-cellen. Normaal gezien kan HIV enkel T-cellen infecteren via het interactiesysteem van gp120 met de CD4 receptor. Het is mogelijk om het HIV-1 enveloppe proteïne te vervangen door een ander enveloppe proteïne, dit is pseudo-typering. Meestal wordt er gebruik gemaakt van het Vesiculair Stomatitis Virus-G proteïne (VSV-G). Dit geeft de HIV lentivirale vector een brede waaier aan mogelijke doelcellen. Het enveloppe plasmide construct bestaat dus enkel uit het VSV-G gen, dat onder controle staat van de CMV promotor.
4.3 Uitleg omtrent het te construeren construct Het te construeren construct was het transferplasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP (zie figuur 6).
GFP
Spe I
EMCV IRES Bam HI MCS2 hCMV ie
WPRE dNEF 3'-LTR Hs chr.3 flanking seq.
cPPT/CTS SA RRE
pCHMWS MCS-IRES-eGFP 11584 bp
GAG gag frame shift packS SD 5'-LTR
bla (Amp R) pUC backbone
SV40 polyA SV40 prom/enh gpt
Figuur 6: Transferplasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP pCHMWS MCS-IRES-eGFP staat voor: C: cPPT/CTS;
centrale polypurine tract/centrale terminatie sequentie
H: hCMV;
humaan cytomegalovirus (promotor)
M: MCS;
multiple cloning site
W: WPRE;
woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element
S: SIN;
zelfinactiverende vector
IRES;
internal ribosome entry site
eGFP;
enhanced green fluorescent protein
In onderstaande paragrafen worden bovenstaande begrippen verduidelijkt.
4.3.1
Central polypurine tract (cPPT)/ Central termination sequence (CTS)
HIV-1 bezit een polypurine tract centraal in het genoom (cPPT). cPPT speelt een belangrijke rol in de infectiecyclus met name in het transport van dsDNA naar de nucleus, maar de precieze rol is nog niet gekend. Introductie van de sequentie in virale vectoren verhoogt de transductie-efficiëntie.
4.3.2
Humaan cytomegalovirus (hCMV)
Deze promotor is de enige promotor die in dit eindwerk werd gebruikt. De hCMV promotor wordt geplaatst vóór het transgen en heeft het voordeel dat hij expressie in vrijwel alle weefseltypen verzekerd (universele promoter).
4.3.3
Multiple cloning site (MCS)
De multiple cloning site, ook wel polylinker genaamd, is een kunstmatig geconstrueerde sequentie bestaande uit een aantal unieke herkenningssites voor restrictie-enzymen. Op deze manier kunnen gemakkelijk reportergenen of therapeutische genen in het transferplasmide gekloneerd worden.
4.3.4
Woodchuck hepatitis posttranscriptional regulatory element (WPRE)
Het expressie-niveau van de genen in lentivirale vectoren is vaak suboptimaal en dus een belemmerende factor in het toepassen van gentherapie. WPRE is een RNA stabiliserende sequentie van het Woodchuck hepatitis virus. De insertie van WPRE in HIV-1 afgeleide vectoren resulteert in een duidelijke toename (vier à zesmaal ten opzichte van de afwezigheid van WPRE) van de expressie van reportergenen (zoals eGFP). Dit geldt enkel als de WPRE in de sense oriëntatie wordt geplaatst. Indien ze anti-sense wordt georiënteerd, heeft ze een belemmerend effect op het expressieniveau.
4.3.5
Zelfinactiverende vector (SIN)
Om het mechanisme van de zelfinactiverende vectoren te kunnen begrijpen, is een goed inzicht in het mechanisme van de reverse transcriptie (zie punt 4.1.2) essentieel. Bij SIN vectoren zijn de promotor en enhancer sequenties verwijderd uit de 3’ LTR van de vector. Hierdoor mist de geïntegreerde vector na reverse transcriptie een functionele LTR (promoter activiteit valt terug naar 10%). Hierdoor is er een lagere promoter activiteit van de LTR sequenties na integratie in het gastheergenoom. Het gebruik van deze SIN vectoren heeft dus bijgedragen aan een hogere bioveiligheid.
4.3.6
Internal ribosome entry site (IRES)
De EMCV IRES-sequentie is een nucleotidesequentie, afkomstig van het poliovirus (Familie: Picornaviridae), die start met de translatie in het midden van een messenger RNA (mRNA) sequentie. Op deze manier kunnen twee genen tegelijkertijd tot expressie gebracht worden. Normaal gezien kan de translatie bij eukaryoten enkel starten aan het 5’ einde van het mRNA molecule omdat 5’ CAP herkenning vereist is voor het samenstellen van het initiatiecomplex. De IRES-sequentie ‘imiteert’ de 5’ CAP structuur. Als het IRES-segment ligt tussen twee reportergenen (bij ons finaal construct tussen het gen in de MCS en eGFP gen) zal een gen ingebouwd in de MCS afgeschreven worden vanaf de 5’ CAP structuur, terwijl het eGFP gen zal afgeschreven worden vanaf de IRES-sequentie. De translatie teweeggebracht vanaf de IRES-sequentie is wel minder efficiënt (namelijk vijfmaal minder) dan deze vanaf de CAP structuur. Vandaar dat het eigenlijke therapeutische gen voor de IRES-sequentie zal ingebouwd worden.
4.3.7
Enhanced green fluorescent protein (eGFP)
GFP is een proteïne van 238 aminozuren afkomstig van Aequorea victoria dat een groene fluorescentie vertoont wanneer het blootgesteld wordt aan blauw licht (488 nm excitatie). Deze fluorescentie is erg stabiel en kan bovendien rechtstreeks waargenomen worden met een fluorescentiemicroscoop. De GFP is daarom een erg populair en aantrekkelijk reportergen voor genexpressie. Het wild-type GFP (wtGFP) heeft een emissiepiek bij 510 nm. Deze is terug te vinden in het groene gedeelte van het spectrum. Daarnaast zijn er ook mutanten van het gen ontwikkeld zoals enhanced GFP (eGFP; to enhance = versterken) die tevens gebruikt worden als reportergen. Ze vertonen onder andere een verhoogde helderheid en fluorescentie in vergelijking met het wild-type GFP.
4.4 PCR 4.4.1
Algemeen
De polymerase-kettingreactie (polymerase chain reaction: PCR) is een cyclisch proces waarbij het doelwit DNA, bijvoorbeeld een gen, in vitro wordt vermeerderd. Een cyclus van de PCR (zie figuur 7) bestaat uit drie stappen, namelijk: denaturatie, primerbinding en ketenverlenging.
Deze stappen worden bij verschillende temperaturen
uitgevoerd. De drie temperatuurtrajecten die achtereenvolgens moeten doorlopen worden zijn 90-95 °C, 37-55 °C en 60-70 °C. De snelle temperatuurwijzigingen en incubatietijden kunnen met een PCR- apparaat ingesteld worden. Door veelvuldige herhaling van deze cyclus neemt de concentratie van het DNA exponentieel toe. De PCR is in 1985 ontwikkeld. De ontdekking van het thermostabiele DNA-polymerase uit de bacterie Thermus aquaticus (Taq) heeft het gebruik van de PCR sterk bevorderd. Deze bacterie leeft in de omgeving van heetwaterbronnen en kan een temperatuur van ongeveer 90 °C doorstaan. Het enzym van deze bacterie wordt aangeduid als Taq-polymerase. Voor de uitvoering van de PCR zijn twee primers nodig, één aan elke kant van het doelwit DNA. Na hybridisatie kan vanaf elke primer polymerisatie plaatsvinden in de richting 3’ => 5’. Om de primers te kunnen maken, moeten de nucleotidensequenties van het doelwit DNA bekend zijn. 4.4.2
Principe
Door verwarming tot ± 95 °C denatureert het doelwit DNA, waardoor twee afzonderlijke strengen ontstaan. Vervolgens wordt het medium afgekoeld, zodat de twee primers kunnen hybridiseren met het doelwit DNA. Hierna wordt de temperatuur verhoogd tot 60 à 70 °C, waarbij het Taq-polymerase de primers verlengt. De primers van beide strengen zijn niet gelijk, zodat de nieuwe strengen in tegenovergestelde richting worden gesynthetiseerd. De twee nieuwe DNA-moleculen zijn identiek aan het oorspronkelijke DNA-molecule. Bij elke herhaling van deze temperatuurcyclus treedt in theorie een verdubbeling op van het aantal DNA-moleculen.
Indien wordt uitgegaan van één DNA-molecule bedraagt de
opbrengst na n cycli 2n moleculen.
Na één cyclus zijn de dochterstrengen nog aan één zijde verlengd. Na n cycli zijn er twee typen moleculen. De vanaf het doelwit DNA gevormde dochtermoleculen zijn aan één zijde verlengd. Na n cycli bedraagt het aantal 2n. Het tweede type dochtermolecule wordt het amplimeer genoemd. Dit wordt gevormd of vanaf de eerste dochtermoleculen of vanaf zichzelf. Het aantal amplimeren na n cycli bedraagt: 2n – (2n + 2). In werkelijkheid is de opbrengst geringer. Omdat het mengsel na de PCR bijna uitsluitend amplimeer bevat, is dit het enige molecuul dat na elektroforese zichtbaar zal zijn.
Figuur 7: Principe van de PCR (Bron: BIEMANS, A., JOCHEMS, J., SPRANGERS, H., DNA, een blauwdruk, Houten, Bohn Stafleu Van Loghum, 1993, 228 blz.)
Samengevat kun je stellen dat het reactiebuisje waarin de PCR wordt uitgevoerd, volgende componenten bevat: Het doelwit DNA Buffer met Magnesiumchloride, omdat Mg2+ een cofactor is voor het enzym Taqpolymerase Taq-DNA-polymerase Vier verschillende nucleotiden: A, T, G en C (= dNTPs) Twee oligonucleotide primers
4.5 Sequentie-analyse volgens Sanger 4.5.1
Algemeen
Het bepalen van de nucleotiden-sequenties volgens Sanger is gebaseerd op de beëindiging van de synthese van een nucleotiden-keten. Het beëindigen vindt plaats door de inbouw van een bepaald dideoxyribonucleotide (ddNTP) (zie figuur 8).
Dit is een nucleotidetrifosfaat
waarvan het atoom C3’ van de suiker geen OH-groep bevat zoals bij een dNTP, maar in de plaats daarvan een H-atoom. Na inbouw van zo’n ddNTP stopt de synthese omdat er geen vrije 3’-OH groep meer is.
Figuur 8: Dideoxyribonucleosidetrifosfaat (Bron: BIEMANS, A., JOCHEMS, J., SPRANGERS, H., DNA, een blauwdruk, Houten, Bohn Stafleu Van Loghum, 1993, 228 blz.)
Voor het begin van de eigenlijke reactie moet het DNA enkelstrengig zijn. Dit wordt verkregen door net zoals bij de PCR het DNA te gaan verwarmen in een PCR-apparaat. Daarna wordt één primer toegevoegd. Deze is complementair aan dat gedeelte van de vector dat aansluit bij het 5’-einde van het te sequencen DNA-fragment. Vanaf het 3’-einde van deze primer kan nu een nieuwe keten gesynthetiseerd worden met het te sequencen fragment als matrijs.
Door inbouw van een bepaalde ddNTP stopt de synthese van DNA.
De
hoeveelheid ddNTP is in ondermaat aanwezig in vergelijking met dNTP. Daardoor ontstaan fragmenten van verschillende lengte. Via elektroforese wordt informatie verkregen over de sequentie.
4.5.2
Principe
In het epje dat bijvoorbeeld ddCTP (= het C-vaatje) bevat, zal het volgende (zie figuur 9) gebeuren. Bij de groei van de nieuwe DNA-keten zal het DNA-polymerase tegenover elke C moeten kiezen tussen dCTP en ddCTP.
Er is een overmaat aan dCTP, zodat meestal
laatstgenoemde zal worden ingebouwd. Als echter een ddCTP wordt ingebouwd, stopt de DNA-synthese wegens het ontbreken van een OH-groep aan het 3’-einde. In het C-vaatje ontstaan op deze manier DNA-fragmenten van verschillende lengte, maar allemaal beginnend met de primer. In de vaatjes met de andere ddNTPs vinden analoge reacties plaats.
Figuur 9: Methode van Sanger (oude versie) (Bron: BIEMANS, A., JOCHEMS, J., SPRANGERS, H., DNA, een blauwdruk, Houten, Bohn Stafleu Van Loghum, 1993, 228 blz.)
Het reactiebuisje waarop de sequentie-analyse wordt uitgevoerd, bevat: Het te sequencen DNA Buffer met Magnesiumchloride, omdat Mg2+ een cofactor is voor het enzym Taqpolymerase Taq-DNA-polymerase Vier verschillende nucleotiden: A, T, G en C (= dNTPs) Een kleine hoeveelheid ddNTP. Er worden vier verschillende energierijke ddNTPs gebruikt, respectievelijk ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP, elk in een afzonderlijk reactiebuisje. Eén primer
Opmerking
De hierboven beschreven methode van Sanger is het basisprincipe. In het labo werd gebruik gemaakt van vier ddNTPs, die elk een ander fluorescerend label hebben, waardoor ze alle vier fluorescent licht gaan uitstralen van een verschillende golflengte (zie figuur 10). Er hoeft dan slechts één reactie uitgevoerd te worden in plaats van vier! Deze vernieuwde methode is eenvoudiger en goedkoper, maar er kunnen foute interpretaties optreden omwille van interferenties (dit vertaalt zich in pieken met verschillende hoogtes). Deze zijn dan voornamelijk te wijten aan de zuiverheidsgraad van het te sequencen DNA, namelijk hoe onzuiverder het DNA, hoe meer interferenties!
Figuur 10: Vernieuwde methode van Sanger De vier verschillende basen worden gedetecteerd en op een chromatogram voorgesteld als ‘pieken’ van verschillende kleuren, waaruit de basesequentie kan afgeleid worden, zoals te zien bovenaan de figuur. (Bron: http://en.wikipedia.org/wiki/Image:Sanger_sequencing_read_display.gif)
5. Experimentele sectie 5.1 Materiaal en methoden 5.1.1
Inleiding
Bij de constructie van het uiteindelijke plasmide, pCHMWS
MCS-IRES-eGFP, werd
gebruik gemaakt van enkele standaardtechnieken. Onderstaande paragrafen verschaffen meer uitleg betreffende deze technieken. Figuur 11 toont het algemeen principe van een kloneringsstrategie en is tevens een treffende samenvatting van de verschillende technieken.
Figuur 11: Principe van de algemene kloneringsstrategie Het DNA wordt door middel van EcoRI restrictie-enzym uitgeknipt en in de EcoRI-plaatsen van het plasmide geligeerd.
Vervolgens wordt het plasmide getransformeerd (zie 5.1.2
Transformatie). Enkel de kolonies die het plasmide (met een antibioticum resistentiegen) hebben opgenomen, overleven op een voedingsbodem en cultuur met antibioticum. (Bron: http://www.accessexcellence.org/AB/GG/plasmid.html)
5.1.2
Transformatie
Onder transformatie (zie figuur 12) verstaat men het proces waarbij DNA van vreemde herkomst, het zogenaamde donor-DNA, wordt opgenomen door een acceptorcel. Bij het transformatieproces kan men volgende fasen onderscheiden: het competent maken van de bacteriën, de binding en opname van DNA en tenslotte de handhaving van het vreemde DNA in de gastheercel.
Men spreekt van competentie wanneer een bacterie in staat is om DNA op te nemen. Een bekende methode om de competentie te induceren, bestaat uit een behandeling met een ijskoude oplossing van CaCl2, ook wel Frozen Buffer (FB) genaamd (zie bijlage 7.1). Mogelijk veroorzaakt calciumchloride een neerslag van het donor-DNA op de celwand of zorgt het door celwandveranderingen voor een betere DNA-binding. Men voegt 0,5 à 2 µl DNA (~ 100 à 500 ng) toe aan 100 µl competente cellen en laat dit rusten op ijs gedurende 30 minuten.
Vervolgens wordt een heat-shock (hitteschok)
uitgevoerd op 42 °C gedurende 30 seconden.
Door deze snelle temperatuursverhoging
verandert tijdelijk de membraanvloeibaarheid door een wijziging van de rangschikking van de fosfolipiden. Dit heeft tot gevolg dat er kortstondige ‘lekkages’ optreden, zodat het vreemde DNA naar binnen kan. Daarna plaatst men het mengsel in voedingsrijk niet-selectief medium, namelijk een SOCmedium (zie bijlage 7.2) gedurende één uur al schuddend op 37 °C. Dan plaat men ze uit op een antibioticumvoedingsbodem en worden ze geïncubeerd op 37 °C. Na een overnacht incubatie vertoont de voedingsbodem enkel kolonies die resistent voor het antibioticum zijn en dus bijgevolg het plasmide hebben opgenomen.
Figuur 12: Schematische weergave van een transformatie (Bron: BIEMANS, A., JOCHEMS, J., SPRANGERS, H., DNA, een blauwdruk, Houten, Bohn Stafleu Van Loghum, 1993, 228 blz.)
De kolonies worden geselecteerd op basis van een snelle miniprep en een restrictie-analyse. Enkel op de goede kolonies wordt vervolgens een Midiprep uitgevoerd (zie 5.1.3 Plasmide DNA purificatie).
5.1.3
Plasmide DNA purificatie
Om vervolgens het DNA van de geselecteerde kolonies te testen, wordt een Midiprep uitgevoerd. Er wordt één kolonie opgeënt en overnacht opgekweekt in 25 ml LB-medium (zie bijlage 7.2) met specifiek antibioticum in een schudincubator op 37 °C.
De
bacteriesuspensie wordt dan afgecentrifugeerd gedurende 15 minuten aan 7000 rpm. Het supernatans wordt afgenomen en de pellet kan bewaard worden op - 70 °C. Naast de Midi-Kit zijn ook nog andere Qiagenkits beschikbaar, namelijk een Mini-, Maxi-, Mega- en Giga-Kit. De keuze voor één van deze kits is afhankelijk van de grootte van de opgekweekte cultuur.
De pellet wordt geresuspendeerd in 4 ml Qiagenbuffer P1 met RNase A (samenstelling gebruikte buffers; zie bijlage 7.1). Vervolgens wordt 4 ml Qiagenbuffer P2 toegevoegd; deze veroorzaakt de lyse (door de aanwezigheid van NaOH en SDS) van de cellen waardoor het DNA vrijkomt. Dit is een erg agressieve buffer en mag daarom MAXIMAAL 5 minuten inwerken. Na 5 minuten wordt 4 ml Qiagenbuffer P3 toegevoegd ter neutralisatie (door de aanwezigheid van KAc). De suspensie wordt dan een kwartier in ijs geplaatst waarna deze 30 minuten wordt gecentrifugeerd aan 15 000 rpm. Ondertussen wordt de elutiekolom (zie figuur 13) gewassen met 4 ml QBT buffer. Na het centrifugeren wordt het supernatans op de kolom geplaatst. Deze fase wordt het binden van het DNA genoemd.
Figuur 13: Mogelijke elutiekolommen (= Qiagentips) De middelste kolom werd gebruikt bij de Midiprep. (Bron: http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/INT/plklit.aspx#plasmid)
Nadat het supernatans is doorgelopen, wordt de kolom tweemaal gewassen met 10 ml QC buffer. Daarna wordt de kolom boven een nieuwe plastic proefbuis gemonteerd en wordt ± 5 ml QF buffer toegevoegd om het DNA van de kolom te elueren. Aan de proefbuis wordt ook nog 3,5 ml isopropanol toegevoegd om het DNA te precipiteren. Vervolgens wordt er gedurende 45 minuten gecentrifugeerd aan 10 000 rpm. Het supernatans wordt gedecanteerd en de pellet gewassen met 2 ml 70 % ethanol.
Deze suspensie wordt gedurende 10 minuten
gecentrifugeerd aan 10 000 rpm. Opnieuw wordt het supernatans afgenomen en wordt de pellet gedroogd in de SpeedVac (onder vacuüm). Finaal wordt de pellet dan opgelost in 100 µl MilliQ water en wordt de concentratie en de zuiverheid van het DNA spectrofotometrisch bepaald.
5.1.4
Restrictiedigestie
Restrictie-enzymen zijn in bacteriën voorkomende enzymen die de bacteriën in staat stellen om voor hen vreemd DNA af te breken.
Ze maken dus deel uit van hun natuurlijk
afweersysteem. Het zijn endonucleasen waarvan de officiële naam luidt: restrictie- endodeoxyribonucleasen. Ze worden gemakshalve aangeduid met de term restrictie-enzym. Restrictie-enzymen herkennen bepaalde specifieke basenvolgorden (meestal 4 tot 6 basenparen) in het DNA en kunnen dit dubbelstrengig DNA vervolgens splitsen, ook wel knippen genaamd. Het begrip digesteren wordt eveneens gebruikt. De herkenningsplaats of site is dikwijls een palindroom, dit wil zeggen dat de basenvolgorden in de beide ketens elkaars spiegelbeeld zijn. De naam van het enzym is afgeleid van het micro-organisme waardoor het enzym wordt geproduceerd (Eco voor E. coli). Soms wordt de naam gevolgd door een stamaanduiding. Omdat een bacteriestam vaak verschillende restrictie-enzymen produceert, geeft men door middel van een Romeins cijfer de volgorde van de ontdekking aan.
Elk restrictie-enzym wordt geleverd met een buffer waarin het zijn optimale activiteit bereikt. Daarnaast speelt ook de incubatietemperatuur een belangrijke rol.
De meeste enzymen
vertonen een optimale werking bij 37 °C, maar uitzonderingen (Bcl I bijvoorbeeld vertoont een optimale werking bij 50 °C) zijn mogelijk. Na incubatie wordt het digest ter controle op een agarosegel geladen. De restrictie-enzymen die gebruikt werden om het uiteindelijk plasmide (pCHMWS MCSIRES-eGFP) te construeren, zijn terug te vinden in bijlage 8.3 met de incubatietemperaturen, de samenstelling van de buffers en de herkenningsplaatsen.
5.1.5
Agarosegelelektroforese
Elektroforese, de migratie van ionen in een elektrisch veld, wordt gebruikt om DNA moleculen van elkaar te scheiden op basis van hun lengte. Bij neutrale pH dragen DNA moleculen een negatieve lading. Dit heeft als gevolg dat ze onder invloed van een elektrische veld naar de positieve pool of anode migreren. De snelheid van migratie is afhankelijk van de grootte van de moleculen, de poriëndichtheid van het gelmedium, de nettolading van het deeltje en de veldsterkte.
Agarosegels, gebruikt voor de elektroforese (zie figuur 14) van DNA, bestaan uit een complex netwerk van cross-links (polymeer) zodat er poriën met moleculaire dimensies gevormd worden. De DNA moleculen gaan hier doorheen migreren naar de positieve pool toe. Hoe groter de moleculen, hoe trager ze zullen migreren doorheen deze gelporiën. Een hoger percentage aan agarose verkleint de poriën van de gel. Daarom worden korte DNAfragmenten gescheiden op een gel met een hoog percentage aan agarose. Een standaard agarosegel bevat 0,5 tot 3% agarose. De agarosegel wordt ondergedompeld in een 1x TAE buffer, waarna de DNA stalen in de slots (wells) gebracht worden. Deze buffer creëert de optimale pH en voorziet tevens ionen die de geleidbaarheid bevorderen.
Aan elk staal wordt ladingsbuffer of Loading Dye
(Fermentas) toegevoegd, waardoor het staal verzwaard (door de aanwezigheid van glycerol en kleurstof) wordt en dus in de slots zakt. Bovendien bevat deze ladingsbuffer een kleurstof (broomfenolblauw) die toelaat het elektroforeseproces te volgen.
Figuur 14: Opstelling van een agarosegelelektroforese Het negatief geladen DNA migreert naar de anode wanneer er een potentiaalverschil over de gel wordt aangebracht. (Bron: BOS, T., Optimalisatie van lentivirale vectorconstructies, 2002-2003, 108 blz.)
De DNA banden worden gevisualiseerd met SYBR Safe. Dit product is minder toxisch en cancerogeen bevonden dan ethidiumbromide waardoor er dus voor SYBR Safe werd gekozen. Waar EtBr intercaleert met dubbelstrengig DNA, vormt SYBR safe een omhulsel rond het DNA mocule. Beiden fluoresceren bij UV-bestraling. Uit ervaring bleek wel dat SYBR Safe een lager fluorescerend vermogen heeft in vergelijking met ethidiumbromide. Het fluoresceert beter onder belichting met blauw licht, wat tegelijk als voordeel inhoudt dat er geen schadelijke UV straling (en de daaropvolgende enkelstrengige breuken in het DNA) meer nodig is voor de visualisatie.
5.1.6
Fragmentisolatie of opzuivering van DNA uit gel
Bij fragmentisolatie wordt een specifieke band, afkomstig van een digestie, uit een agarosegel geïsoleerd. Hiervoor wordt de gel bestraald met black light, dit is niet schadelijk UV-licht. Gewoon UV-licht heeft een degraderend effect op DNA. Hierbij kan het DNA fragment naar keuze uitgesneden worden.
Het agarosegelfragment wordt gewogen en met behulp van de Nucleospin Extract II kit wordt het DNA uit de gel geïsoleerd. De gel wordt eerst opgelost door 200 µl NT buffer per 100 mg gel toe te voegen. Het geheel wordt 5 à 10 minuten verwarmd op 50 °C totdat de gel is opgelost.
Daarna wordt het staal op de Nucleospin Extract kolom geladen en
afgecentrifugeerd gedurende 1 minuut aan 11 000 g. De kolom wordt vervolgens gewassen met 600 µl NT3 buffer. Na het wassen wordt het silicamembraan gedroogd door 2 minuten te centrifugeren aan 11 000 g. Finaal vindt de elutie van het DNA plaats door 50 µl MilliQ water toe te voegen en vervolgens te centrifugeren aan 11 000 g gedurende 1 minuut boven een zuiver eppendorfje. Na de fragmentisolatie wordt het DNA staal met behulp van gelelektroforese gecontroleerd.
5.1.7
Ligatie
Ligatie is het proces waarbij het te kloneren stukje DNA in de vector wordt ingebouwd. Zo wordt het gewenst plasmide bekomen. Meer specifiek, houdt de DNA ligatie in dat er in beide strengen van het DNA een fosfodiësterbinding gevormd wordt tussen de 3’ hydroxylgroep van de ene nucleotide en de 5’ fosfaatgroep van de naburige nucleotide. Het enzym T4 DNA ligase wordt gebruikt om DNA fragmenten te ligeren. Dit enzym stamt af uit de T4 bacteriofaag. T4 DNA ligase kan DNA fragmenten met sticky ends gaan ligeren zoals weergegeven in onderstaande figuur 15. Tevens kan ze ook fragmenten met blunt ends gaan ligeren, maar dan moet er een hogere concentratie (ongeveer 20 maal hoger) van zowel het enzym ligase als van het DNA gebruikt worden. Dit is noodzakelijk omdat de kans dat blunt ends precies tegenover elkaar komen te liggen, zodat het enzym ligase de koppeling kan uitvoeren, zeer gering is in vergelijking met sticky ends. De voorkeur gaat dus uit naar het koppelen van fragmenten met sticky ends. Er wordt namelijk gebruik gemaakt van de stabiliserende werking ten gevolge van de basenparing tussen de complementaire overhangen.
Figuur 15: Principe van sticky end ligatie De complementaire strengen worden samengebracht en T4 DNA ligase creëert de fosfodiësterbindingen. (Bron: http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html)
Het ligatiemengsel bevat naast water nog drie andere ‘ingrediënten’: Twee of meer DNA fragmenten met ofwel sticky ofwel blunt ends T4 DNA ligase Buffer die ATP bevat
De optimale incubatietemperatuur voor T4 DNA ligase is 16 °C.
Wanneer een hoge
efficiëntie vereist is, wordt deze temperatuur aangeraden. Nochtans is T4 DNA ligase ook actief bij andere temperaturen, zoals 4 °C of kamertemperatuur. Er werd overnacht geligeerd bij 16 °C.
5.2 Resultaten
5.2.1
Vergelijkende studie in verband met plasmide DNA purificatie
NucleoSpin® Plasmid QuickPure
QuickPick Plasmid DNA
Doel van de studie
Deze vergelijkende studie had als doel om twee verschillende technologieën voor plasmide DNA purificatie te analyseren en met elkaar te vergelijken: de NucleoSpin® Plasmid QuickPure (Macherey-Nagel) die gebruik maakt van de Silica-membraan technologie, en de QuickPick Plasmid DNA (Bio-Nobile) die een technologie op basis van magnetisme (ook wel PickPen technologie genaamd) hanteert. Op basis van zes stalen werden beide technologieën onderzocht. Bij alle stalen werden de zuiverheid en concentratie bepaald. Tevens werd een prijsvergelijking uitgevoerd.
Methodiek Bij NucleoSpin® Plasmid QuickPure (Macherey-Nagel) wordt de celpellet eerst geresuspendeerd (met 250 µl buffer A1), vervolgens gelyseerd (met 250 µl buffer A2) en finaal geneutraliseerd (met 300 µl buffer A3). Het mengsel wordt daarna gecentrifugeerd aan 11 000 rpm gedurende 10 minuten. Dan wordt het supernatans op de NucleoSpin® Plasmid QuickPure kolom geladen. Onzuiverheden zoals RNA en nucleasen worden verwijderd door middel van één enkele ‘wasbeurt’ (met 450 µl buffer AQ). Finaal wordt het plasmide DNA geëlueerd (met 50 µl buffer AE). Deze methode maakt dus gebruik van elutiekolommen met anionenuitwisselingshars, wat ook wel de silica-membraan technologie wordt genaamd.
Plasmide purificatie via deze
technologie is gebaseerd op de ionische interactie (zie figuur 16) tussen de negatief geladen fosfaatgroepen van het DNA en de positief geladen DEAE (diethylaminoethanol) groepen aan het oppervlak van het hars. DEAE wordt toegepast bij grotere columns (maxi en giga), waartegen silica-membranen worden gebruikt bij kleinere columns. anionenwisselaars.
Beiden zijn wel
Figuur 16: Interactie tussen DEAE en negatief geladen fosfaatgroep (Bron: http://www1.qiagen.com/literature/brochures/Plasmid_Purification_Bro.aspx)
De zoutconcentratie en de pH condities van de buffers bepalen of het DNA gebonden of geëlueerd wordt. Onzuiverheden zoals RNA en proteïnen worden weggewassen van het hars door middel van een medium-zout buffer, terwijl het DNA gebonden blijft dankzij een buffer met hoge zoutconcentratie.
Bij QuickPick Plasmid DNA (Bio-Nobile) wordt de celpellet eerst geresuspendeerd (met 40 µl buffer A), vervolgens gelyseerd (met 40 µl buffer B) en finaal geneutraliseerd (met 40 µl buffer C). Het mengsel wordt gecentrifugeerd aan 18 000 rpm gedurende 2 à 10 minuten. Deze stappen verlopen analoog aan de eerste stappen van bovenstaande methodiek. Vervolgens wordt er gebruik gemaakt van de PickPen 1-M (zie figuur 17), en niet van een elutiekolom zoals in bovenstaande methodiek.
Figuur 17: PickPen 1-M (Bron: http://www.bio-nobile.com/products/products.asp)
Deze PickPen bezit een uitschuifbare magnetische kop en maakt dus gebruik van magnetische purificatie. De methodiek is gebaseerd op de affiniteit tussen het DNA en magnetische partikels. Dit komt doordat de magnetische partikels een speciale coating bezitten waardoor het DNA bij een hoge zoutconcentratie (Bindingsbuffer) zich aan deze partikels gaat hechten.
Het gebonden DNA scheidt zich van de magnetische partikels wanneer het ondergedompeld wordt in een buffer met lage zoutconcentratie (Elutiebuffer). Het supernatans bekomen na bovenvermelde centrifugatie wordt in een eerste epje overgebracht samen met 5 µl MagaZorb Magnetic Particles en 125 µl Binding Buffer (zie figuur 18). Als het DNA gebonden is aan de magnetische partikels, wordt het DNA van de oplossing gescheiden door middel van de PickPen. De partikels worden dan overgebracht in een tweede epje waarin 200 µl Wasbuffer zit. Finaal worden ze dan overgebracht naar een derde epje met 40 µl Elutiebuffer. De magnetische partikels worden verwijderd door middel van de PickPen. Het derde epje bevat tenslotte het gezuiverd plasmide DNA.
(a) (b) Figuur 18: Methodiek van magnetische purificatie.
(c)
(a): het epje met de mix van het DNA en de magnetische partikels; (b): de PickPen met uitgeschoven magnetische top neemt de magnetische partikels met het gebonden DNA mee; (c): enkel de Bindingsbuffer blijft in het epje over (Bron: http://www.bio-nobile.com/magnetic/magnetic_pickpen.asp)
Op zes stalen worden beide methoden toegepast, waarna de zuiverheid en de concentratie worden bepaald. Dit gebeurt door van elk staal de absorbantie te meten bij 260 en 280 nm (OD260 en OD280) door middel van een spectrofotometer (Ultraspec 1100 pro). De zuiverheid wordt bepaald aan de hand van de verhouding tussen OD260 en OD280 (OD260/OD280). Ideale verhouding of referentiewaarde = 1,8 De concentratie wordt berekend aan de hand van deze formule: OD260 1 = 50 ng/µl Verdunningsfactor x 50 ng/µl x OD260
Eerst wordt nagegaan of de waarnemingsuitkomsten normaal verdeeld zijn alvorens het rekenkundig gemiddelde te berekenen samen met het 95%-betrouwbaarheidsinterval. Vervolgens volgt er een prijsvergelijking. Resultaten 1. NucleoSpin® Plasmid QuickPure Tabel 2 toont de waarnemingsuitkomsten alsook de berekende zuiverheid en concentratie.
Staal 1 Staal 2 Staal 3 Staal 4 Staal 5 Staal 6
OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280
Zuiverheid Concentratie (ng/µl) 0,135 1,6463 229,5 0,082 0,125 1,6234 212,5 0,077 0,134 1,5952 227,8 0,084 0,127 1,4941 215,9 0,085 0,103 1,5147 260,1 0,068 0,137 1,5393 232,9 0,089
Tabel 2: Waarnemingsuitkomsten verkregen met NucleoSpin ® Plasmid QuickPure Voor de berekening van de concentratie, bedraagt de verdunningsfactor voor alle stalen 34, behalve voor staal 5, daar is de verdunningsfactor 50,5. 2. QuickPick Plasmid DNA Tabel 3 toont de waarnemingsuitkomsten alsook de berekende zuiverheid en concentratie.
Staal 1 Staal 2 Staal 3 Staal 4 Staal 5 Staal 6
OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280 OD260 OD280
0,135 0,098 0,146 0,088 0,138 0,1 0,134 0,094 0,093 0,064 0,184 0,114
Zuiverheid Concentratie (ng/µl) 1,3776 229,5 1,6591
248,2
1,3800
234,6
1,4255
227,8
1,4531
158,1
1,6140
312,8
Tabel 3: Waarnemingsuitkomsten verkregen met QuickPick Plasmid DNA Voor de berekening van de concentratie, bedraagt de verdunningsfactor voor alle stalen 34.
Om te controleren of de waarnemingsuitkomsten normaal verdeeld zijn, wordt de ShapiroWilk test uitgevoerd. Daartoe moet : Wberekend ≥ Wtabelwaarde
De tabelwaarde voor zes waarnemingsuitkomsten bedraagt 0,788. De berekende waarden voor beide technologieën worden gevonden met het programma Statistix:
Shapiro-Wilk Normality Test (met behulp van Statistix ) - zuiverheden Variable Nucleospin Quickpick
N 6 6
W 0.9323 0.8379
In beide gevallen is Wberekend ≥ Wtabelwaarde, zodat de waarnemingsuitkomsten in beide gevallen normaal verdeeld zijn. Er kan een rekenkundig gemiddelde met standaardafwijking opgesteld worden voor beide technologieën. Met behulp van de standaardafwijking kan dan het 95%betrouwbaarheidsinterval opgesteld worden. Dit gebeurt aan de hand van onderstaande formule: λ95 = (s.t)/√ √n s: standaardafwijking t: 2,571 => 6 – 1 vrijheidsgraden n: aantal waarnemingen = 6
1. NucleoSpin® Plasmid QuickPure
Gemiddelde Standaardafwijking
1,5689 0,0617
λ95 = 0,0648
Zuiverheid = (1,57 ± 0,06) (λ95, n = 6).
2. QuickPick Plasmid DNA
Gemiddelde Standaardafwijking
1,4849 0,1217
λ95 = 0,1278
Zuiverheid = (1,48 ± 0,13) (λ95, n = 6).
Daarnaast is ook het financieel aspect belangrijk om tot een conclusie te komen. Telkens wordt de kostprijs voor één staal of één bereiding uitgerekend (zie tabel 4). NucleoSpin® Plasmid QuickPure QuickPick Plasmid DNA Kostprijs kit # stalen
233 € 250
25 € 8
Prijs per staal
0,93 €
3,13 €
Tabel 4: Prijsvergelijking NucleoSpin® Plasmid QuickPure / QuickPick Plasmid DNA
Daarnaast moet bij QuickPick Plasmid DNA ook nog de PickPen 1-M aangeschaft worden, het prijskaartje hiervan bedraagt ± 350 €.
De conclusie wordt teruggevonden in punt 6. Besluiten.
5.2.2
Constructie van pCHMWS MCS-IRES-eGFP
De doelstelling van dit eindwerk bestond er in een geschikte lentivirale vector transferplasmide, namelijk pCHMWS MCS-IRES-eGFP te construeren. Figuur 19 geeft het constructieschema weer.
In een eerste stap wordt uit het plasmide pCHMWS eGFP-IRES-Hygro de eGFP-sequentie verwijderd via digestie met BamH I en Xho I en vervangen door de multiple cloning site MCS zodat het plasmide pCHMWS MCS-IRES-Hygro wordt gevormd. Van dit plasmide wordt dan de Hygro-sequentie verwijderd via digestie met Bcl I en Spe I en vervangen door de eGFP-sequentie bekomen na digestie met BamH I en Spe I van het plasmide pCHCMV eGFPWS Isa. Deze laatste ligatie levert het uiteindelijk gewenst plasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP op.
De MCS heeft onderstaande sequentie: GATCCATCGATTCTAGATAATCAGGCGCGCCGCTAGCGTACG GTAGCTAAGATCTATTAGTCCGCGCGGCGATCGCATGCAGCT
SA RRE GAG gag frame shift packS SD 5'-LTR
cPPT/CTS hCMV ie Bam HI GFP Xho I EMCV IRES
SV40 polyA Hygro R pCHMWS eGFP-IRES-hygro 12564 bp
gpt
WPRE dNEF 3'-LTR
SV40 prom/enh
Hs chr.3 flanking seq. pUC backbone bla (Amp R)
MCS inbouwen MCS2 hCMV ie cPPT/CTS SA RRE GAG gag frame shift packS SD 5'-LTR
gpt EMCV IRES Bcl I Hygro R
SV40 polyA SV40prom/enh
Spe I WPRE dNEF 3'-LTR
bla AmpR
pCH CMV eGFPWS Isa
pCHMWS MCS2-IRES-hygro
11031 bp
11863 bp
SV40 polyA
5' LTR SD packS gag frame shift GAG RRE env SA cPPT/CTS
Hs chr.3 flanking seq.
CMV Bam HI GFP
gpt SV40 prom/enh
bla (Amp R) pUC backbone
poly A 3'LTR-SIN
GFP
Spe I
EMCV IRES Bam HI MCS2 hCMV ie
WPRE dNEF 3'-LTR Hs chr.3 flanking seq.
cPPT/CTS SA RRE GAG gag frame shift packS SD 5'-LTR
pCHMWS MCS-IRES-eGFP 11584 bp
bla (Amp R) pUC backbone
SV40 polyA SV40 prom/enh gpt
Figuur 19: Constructieschema van pCHMWS MCS-IRES-eGFP
Spe I WPRE dNEF
De inbouw van de MCS in het plasmide pCHMWS MCS-IRES-Hygro wordt via gelelektroforese gecontroleerd. Figuur 20 toont de controlegel voor de inbouw van de MCS. Met behulp van het softwareprogramma Vector NTI wordt gevonden dat het verkregen plasmide éénmaal geknipt wordt door Nhe I. Deze unieke knipplaats ligt gelokaliseerd in de ingebouwde MCS. Het plasmide pCHMWS eGFP-IRES-Hygro bezit deze knipplaats niet waardoor het zich onderscheidt van het plasmide pCHMWS MCS-IRES-Hygro.
pCHMWS MCS-IRES-Hygro : Nhe I
λ
pCHMWS eGFP-IRES-Hygro : Nhe I
Figuur 20: Controlegel voor de inbouw van de MCS De eerste vier lanen bevatten het gevormde plasmide pCHMWS MCS-IRES-Hygro, geknipt door Nhe I. De volgende laan is het λ DNA geknipt met Pst I. De lengtes van de bandjes worden teruggevonden in bijlage 7.4. De laatste laan is het plasmide pCHMWS eGFP-IRESHygro, behandeld met Nhe I. Het is duidelijk niet geknipt door Nhe I.
Vervolgens moet de Hygro-sequentie verwijderd worden uit het plasmide pCHMWS MCSIRES-Hygro via digestie met Bcl I en Spe I. Opdat Bcl I zou kunnen knippen, moet het plasmide DNA getransformeerd worden in SCS cellen. Bcl I is namelijk Dam gevoelig; dit is een modificatie waarbij er een methylering van een base plaatsvindt zodat het restrictieenzym niet kan inwerken op het DNA. In een eerste stap wordt er geknipt met Bcl I:
30 µl DNA (pCHMWS MCS-IRES-Hygro) 10 µl NEBuffer 3 7 µl Bcl I 53 µl MilliQ water -----------------------100 µl
- Concentratie: 1655 ng/µl
Na incubatie van twee uur op 50 °C, wordt het DNA neergeslagen en vervolgens geknipt met Spe I. Het neerslaan van het DNA houdt in dat er aan bovenvermeld mengsel een gelijk volume SureClean (Bioline) moet toegevoegd worden. Dit is een snelle en goedkope manier om nucleïnezuren te zuiveren, het verwijdert namelijk onder andere de aanwezige buffers. Het bekomen mengsel wordt 10 minuten op kamertemperatuur gehouden alvorens het te centrifugeren aan 14 000 rpm gedurende 10 minuten. Het supernatans wordt verwijderd en er wordt 200 µl 70 % ethanol toegevoegd om te wassen. Er wordt opnieuw gecentrifugeerd aan 14 000 rpm gedurende 10 minuten. Het supernatans wordt opnieuw verwijderd en de pellet wordt gedroogd. Finaal kan de pellet geresuspendeerd worden in een gewenste hoeveelheid MilliQ water. Het DNA kan dan geknipt worden met Spe I: 73 µl MilliQ water (met DNA) 10 µl NEBuffer 2 10 µl BSA 7 µl Spe I --------------100 µl Na incubatie van twee uur op 37 °C wordt er een controle van dit preparatief digest via gelelektroforese uitgevoerd. Er worden twee bandjes verwacht, namelijk één van 1045 bp (= Hygro-sequentie) en een ander van 10 818 bp (= vector; pCHMWS MCS-IRES) Figuur 21 toont de controlegel van deze digestie.
Figuur 21: Controlegel van de Bcl I / Spe I digestie De eerste laan bevat ongeknipt (Ong.) pCHMWS MCS-IRES-Hygro als referentie.
De
tweede laan toont duidelijk de twee fragmenten (1045 bp en 10 818 bp). Vervolgens wordt het volledige preparatief digest ook op gel geplaatst zodat dan het gewenste fragment van 10 818 bp (= vector) kan geïsoleerd worden via fragmentisolatie (beschreven in 5.1.6). Figuur 22 toont de foto van deze fragmentisolatie. λ
p CHMWS MCS-IRES-Hygro Bcl I / Spe I
1 kb DNA
Figuur 22: Fragmentisolatie Het gewenste fragment (pCHMWS MCS-IRES-Hygro waarvan de Hygro-sequentie is uitgeknipt door Bcl I en Spe I) is uitgesneden en de Hygro-sequentie blijft over. De waarden van de 1 kb DNA ladder worden teruggevonden in bijlage 8.5.
Finaal is het de bedoeling om het insert (eGFP-sequentie uit het pCHCMV eGFPWS Isa) in de vector (bekomen na vorige fragmentisolatie) in te bouwen. Daartoe wordt het vector DNA eerst gedefosforyleerd om zelfsluiting te voorkomen, door middel van het Antartic Fosfatase. Dit enzym klieft de 5’ fosfaat-groep van elke streng af en vertoont
een
maximale
werking
in
een
specifieke
defosforylatiebuffer
bij
een
incubatietempertatuur van 37 °C. De eGFP-sequentie wordt uit het plasmide pCHCMV eGFPWS Isa verwijderd door middel van een BamH I en Spe I digestie. Er werden vijf verschillende ligatiemengsels (zie tabel 5) met elk een totaal volume van 20 µl aangemaakt. Deze mengsels verschillen van elkaar in de verhouding tussen insert en vector: A
B
C
D
E
Vector
6 µl
10 µl
6 µl
4 µl
1 µl
Insert
0 µl
1,75 µl
1,75 µl
1,75 µl
10 µl
T4
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
T4 Ligase
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
2 µl
MQ water
10 µl
4,25 µl
8,25 µl
10,25 µl
5 µl
Ligatiebuffer
Tabel 5: De vijf verschillende ligatiemengsels Na een overnachtligatie op 16 °C wordt 4 µl van elk ligatiemengsel toegevoegd aan 100 µl DH5α competente cellen. De transformatiemengsels worden uitgeplaat op een ampicilline agarplaat voor een overnachtincubatie bij 37 °C. De inbouw van het insert in de vector wordt gecontroleerd door middel van PCR en een analytisch restrictie digest.
Voor de PCR-controle werden twee primers gebruikt namelijk CMV Forward en PDGF b 151 Reverse. Na de PCR reactie wordt een bandje van 918 bp verwacht. Onderstaand reactiemengsel werd samengesteld: 5 µl Mastermix met Taq Polymerase 1 µl forward primer (CMV Forward) 1 µl reverse primer (PDGF b 151 Reverse) 1 µl DNA (ligatiemengsel E op pagina 45) 2 µl MilliQ water -------------------10 µl Op basis van de smelttemperaturen van de hierboven vermelde primers werd onderstaand programma voor de PCR reactie opgesteld: 95 °C
30 seconden
95 °C 56 °C 72 °C
30 seconden 45 seconden 1 minuut 45 seconden
72 °C
10 minuten
12 °C
∞
35 cycli
Figuur 23 toont het resultaat van de PCR reactie. Deze reactie werd uitgevoerd voor 12 stalen.
Figuur 23: Het resultaat van de PCR reactie De referentie is tweemaal pCHMWS MCS-IRES-Hygro. Bij de 12 stalen is telkens het bovenste bandje het gewenste bandje van 918 bp. De eerste laan van de 12 stalen vertoont wel een aspecifiek bandje en zou dus bijgevolg niet genomen worden. Volgens de PCR reactie is het insert dus wel degelijk ingebouwd in de vector ter vorming van het plasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP.
Voor het analytisch restrictie digest wordt het ligatieproduct (wat dus eigenlijk het finaal recombinant plasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP moet zijn) en de referentie pCHMWS MCS-IRES-Hygro geknipt met het Afl III restrictie-enzym. Hierbij worden bandjes van verschillende lengtes verwacht: pCHMWS MCS-IRES-eGFP 5036 2835 1927 864 747 175
pCHMWS MCS-IRES-Hygro (Ref.) 5035 2835 1927 1144 747 175
Figuur 24 toont dit analytisch restrictie digest.
pCHMWS MCS-IRES-eGFP : Afl III
Ref. 1 kb DNA : Afl III
Figuur 24: Analytisch Afl III restrictie digest van het finaal recombinant plasmide Het fragment van 1144 bp van de referentie is duidelijk zichtbaar, waardoor ook hier kan besloten worden dat het insert goed is ingebouwd in de vector.
Naast deze twee bovenstaande controles werd er eveneens nog een grondige controle uitgevoerd.
Hierbij werden de drie plasmides pCHMWS MCS-IRES-Hygro (Ref 1),
pCHMWS eGFP-IRES-Hygro (Ref 2) en het finaal plasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP geknipt met BamH I / Spe I, Bcl I en Afl III en daarna aan een gelelektroforese onderworpen (zie figuur 25). Met behulp van het softwareprogramma Vector NTI werden de verwachte groottes van de fragmenten berekend (geknipt of ongeknipt) (zie tabel 6):
BamH I / Spe I Bcl I Afl III
pCHMWS MCSIRES-eGFP 10 195 1389 Ongeknipt 5036 2835 1927 864 747 175
pCHMWS MCSIRES-Hygro 10 195 1668 Eénmaal geknipt 5035 2835 1927 1144 747 175
pCHMWS eGFPIRES-Hygro 10 195 2369 Ongeknipt 5736 2835 1927 1144 747 175
Tabel 6: Verwachtingen na digestie met BamH I/Spe I, Bcl I en Afl III
MCS-IRES-eGFP
Ongeknipt
MCS-IRES-eGFP
Ref 1 Ref 2 MCS-IRES-eGFP
: BamH I/ :Spe I
: Bcl I
Ref 1 Ref 2 MCS-IRES-eGFP
Ref 1 Ref 2 1 kb
: Afl III
Figuur 25: Finale controle van het gewenst plasmide Alle verwachtingen, achterhaald met Vector NTI, zijn in orde, zodat er kan besloten worden dat het finaal plasmide geconstrueerd is.
Het finale plasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP moet nog een sequentie-analyse ondergaan. Hiertoe worden vier verschillende primers gebruikt, namelijk CMV Forward, PDGF b 151 Reverse, MCS-sense en WPRE reverse. De reagentia voor de sequentie-analyse zijn:
4 µl Terminator Ready Reaction Mix 4 µl DNA (Regel: 250ng / 3 kbp - 1 µl) 1 µl primer 1 µl MilliQ water --------------------10 µl
Op deze 10 µl wordt de PCR uitgevoerd volgens volgend protocol:
96 °C
30 minuten
96 °C 55 °C 60 °C
10 seconden 10 seconden 2 minuten
12 °C
∞
25 cycli
Elk staal dat de sequentiecyclus heeft doorlopen wordt geprecipiteerd met isopropanol. Hiervoor wordt aan elk eppendorfje 10 µl MilliQ water toegevoegd. Vervolgens wordt 80 µl 75 % isopropanol toegevoegd.
Dit wordt gevortext alvorens 15 minuten op
kamertemperatuur te laten staan.
Vervolgens wordt gedurende 20 minuten op 4 °C
gecentrifugeerd aan 14 000 rpm. Het supernatans wordt afgenomen en de pellet wordt gewassen met 80 µl 70 % ethanol. Hierna wordt 10 minuten gecentrifugeerd op 4 °C. Opnieuw wordt het supernatans afgenomen en de pellet wordt gedroogd. Nadat de pellet volledig droog is, wordt 15 µl formamide toegevoegd. Deze oplossing wordt 2 minuten gekookt en meteen op ijs bewaard tot de sequentie wordt bepaald. Het formamide zorgt ervoor dat het smeltpunt verlaagd wordt en zorgt er eveneens voor dat het DNA gedenatureerd blijft.
6. Besluiten Een eerste doelstelling van dit eindwerk was een vergelijkende studie uitvoeren betreffende plasmide DNA purificatie. Hierbij werden twee verschillende technologieën, namelijk een silica-membraan technologie en een technologie gebaseerd op magnetisme vergeleken. Het besluit van de vergelijkende studie is gebaseerd op de berekende zuiverheid van de zes stalen en een vergelijking qua kostprijs. Op basis van de zuiverheid kan er besloten worden dat NucleoSpin ® Plasmid QuickPure zuiverder is dan QuickPick Plasmid DNA, omdat de verkregen waarde dichter aanleunt bij de referentiewaarde. Ook qua prijs is NucleoSpin® Plasmid QuickPure gunstiger dan z’n concurrent, want de prijs om één staal te bereiden is ruim driemaal voordeliger! Daarnaast moet je bij QuickPick Plasmid DNA ook nog de PickPen 1-M aanschaffen met een prijskaartje van ± 350 €. Daartegenover biedt QuickPick Plasmid DNA wel visualisatie doorheen het proces. NucleoSpin® Plasmid QuickPure met Silica- membraan technologie geniet de voorkeur omdat deze methode zowel kwalitatief als financieel de gunstigste is.
De hoofddoelstelling was het construeren van het gewenste transferplasmide pCHMWS MCS-IRES-eGFP.
Dit
kadert
in
een
onderzoeksproject
naar
neurodegeneratieve
aandoeningen waarbij de ontwikkeling en optimalisatie van lentivirale vectoren een belangrijk aspect vormen. De aanwezigheid van de IRES-sequentie speelt hierbij een cruciale rol omdat hiermee twee genen tot expressie kunnen gebracht worden, namelijk het gen dat codeert voor eGFP en het gen dat ingebouwd zal worden in de MCS. Na elke constructiestap werden controlegels gelopen, met behulp van agarosegelelektroforese. Deze controlegels waren telkens in orde waardoor er kan besloten worden dat het insert effectief is ingebouwd in de vector ter vorming van het gewenste plasmide. Uit de sequentie-analyse bleek effectief het gewenste plasmide te zijn geconstrueerd. Het transferplasmide is ondertussen een standaardplasmide geworden in het laboratorium, waarbij in de MCS verschillende Parkinson gerelateerde genen werden gekloneerd waarvoor momenteel nog geen antilichamen bestaan. Dit construct laat toe om expressie van het Parkinson-gen indirect op te volgen door de detectie van het eGFP proteïne.
7. Referenties BOEKEN EN ARTIKELS
AUTEUR ONBEKEND, Qiagen Plasmid Handbook, juni 2005, Third Edition. BIEMANS, A., JOCHEMS, J., SPRANGERS, H., DNA, een blauwdruk, Houten, Bohn Stafleu Van Loghum, 1993, 228 blz. BOS, T., Optimalisatie van lentivirale vectorconstructies, 2002-2003, 108 blz. DEBYSER, Z., A Short Course on Virology/ Vectorology/ Gene Therapy., Current Gene Therapy, 2003, Volume 3, blz 495-499. MADIGAN, M., MARTINKO, J., Biology of Microorganisms, USA, Pearson Education, 2006, 992 blz. NEW ENGLAND BIOLABS, INC, Catalog and Technical Reference, 2005-2006. PERNEEL, J., Toegepaste statistiek en kwaliteitszorg voor chemie-ingenieurs.Deel I Tabellen, KHBO, 2004. ZUFFEREY, R., DONELLO, J., TRONO, D., HOPE, T., Woodchuck Hepatitis Virus Posttranscriptional Regulatory Element Enhances expression of Transgenes delivered by Retroviral Vectors, 1998.
INTERNETBRONNEN
BIO-NOBILE, Purification made easy, Internet, 2006. (http://www.bio-nobile.com) CELBIOLOGIE, DNA/Elektroforese, Internet, 2006. (http://coofarm.fmns.rug.nl/celbiologie/ond4_alg.html) FERMENTAS, DNA Electrophoresis, Internet, 2006. (http://www.fermentas.com/index.html) GENETICS, Agarose gel electrophoresis of DNA, Internet, 15 januari 2000. (http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html) GENETICS, DNA Ligation, Internet, 20 oktober 1999. (http://www.vivo.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/enzymes/ligation.html) GERAERTS, M., Optimization of Lentiviral Vector Technology for gene Transfer into adult neuronal stem cells, Internet, 2006. (http://repository.libis.kuleuven.be/dspace/bitstream/1979/296/5/thesis+finaal_R2.pdf) MACHEREY-NAGEL, Plasmid DNA purification: Transfection-grade DNA and plasmid Minipreps, Internet, 2006. (http://www.mn-net.com) PRACTICUM GENTECHNOLOGIE, Handleiding, Internet, 27 september 2005. (http://www.biw.kuleuven.be/dp/logt/practicum2001/handleiding2006.pdf) RESOURCE CENTER, Cloning into a plasmid, Internet, 1999. (http://www.accessexcellence.org/AB/GG/plasmid.html)
THE JOURNAL OF YOUNG INVESTIGATORS, Targeting the HIV-1 Reverse Transcriptase, Integrase, P27, By expression of RNAi Oligonucleotides from engineered Human Artificial Chromosome, Internet, 2006. (http://www.jyi.org/research/re.php?id=637) WIKIPEDIA, Diverse onderwerpen, Internet, 2006. (http://en.wikipedia.org)