Viková, M. : MIKROSKOPIE V Mikroskopie V M. Viková

Viková, M. : MIKROSKOPIE V

Mikroskopie V M. Viková LCAM DTM FT TU Liberec, [email protected]

Přednášky z : Textilní fyzika


Hloubka ostrosti – problém velkých zvětšení

Objektiv 5x tloušťka T vrstvy vzorku kolmé k optické ose, kterou vidíme ostře zobrazenou

Objektiv 50x

Objektiv 100x Přednášky z : Textilní fyzika


Minskyho patent Idea konfokálního mikroskopu pochází od Marvina Minského, který si ji patentoval již r. 1957. V té době však zůstala bez odezvy, neboť Minsky nenašel vhodný zdroj světla pro konstrukci funkčního přístroje. O deset let později M. Petráň a M. Hadravský z Lékařské fakulty UK v Plzni patentovali konfokální mikroskop na bázi rotujícího Nipkowova kotouče. S tímto přístrojem byly poprvé získány kvalitní optické řezy silným preparátem, konkrétně mozkovou tkání.

Marvin Minsky Přednášky z : Textilní fyzika


Konfokální mikroskopie I

Rozdělení: 1. LSCM (Laserová skenovací konfokální mikroskopie) 2. TSM (Tandemová skenovací mikroskopie) Fotodetektor Emisní filtr

Eliminační apertura Polopropustné zrcadlo

Expanze paprsku

laser Objektiv mikroskopu

pozadí

Zaostřená rovina

sledovaný objem Přednášky z : Textilní fyzika

Odlišnosti konfokálního způsobu od klasického SM •osvětlen je jen jeden bod a signály od okolních bodů (vedle, pod a nad) jsou omezeny otvorem - eliminační aperturou • režim osvětlení: epi (reflexní) nebo fluo – (fluorescenční) • konfokální kondenzor = objektiv (méně odrazů) • skenování: rozmítání laserového svazku, příčné posouvání vzorku před objektivem, případně posouvání objektivu nad vzorkem • konfokální obrazy jsou vždy zaostřené a představují optické řezy vzorkem (pro λ = 488 nm tloušťka = 0,4 μm)


Tandemová konfokální mikroskopie I Využívá Nipkowův disk:

Aperturní otvory jsou uspořádány v Archimédových spirálách

Původní Petráňův systém



Tandemová konfokální mikroskopie II vzorek se většinou pozoruje okem (nebo chlazenou CCD kamerou) v reálném čase (okulárem) Důležitý doplněk: Nipkowův kotouč desítky až stovky tisíc otvorů (200 tis) uspořádaných v Archimedových spirálách kotouč rotuje (až desítky Hz) otvory konjugované (v dopadajícím a detekovaném světle) světlo může procházet také stejným souborem otvorů



LSCM (laserová skenovací konfokální mikroskopie) Laserový Paprsek (488nm)

Dichroické zrcadlo

Emisní filtr řádkovací zrcadla

Detektor

Dírková clona Spektrální charakteristika dichroického zrcadla

objektiv Fokální rovina Přednášky z : Textilní fyzika


Řádkovací zrcadla Vzorek

2D scanning X

Y

Y

X

optika 3D scanning X

pohyblivé zrcadlo Y Laser


Z


Konfokální mikroskopie II

Fluorescenční mikroskop

Konfokální mikroskop Přednášky z : Textilní fyzika


Konfokální mikroskopie III



Konfokální mikroskopie vs. Fluorescenční mikroskopie

Fluorescenční m. Přednášky z : Textilní fyzika

Konfokální m.


Komerční realizace konfokální mikroskopie I

Olympus FluoViewTM FV300

Nikon D-ECLIPSE C1/E600 Přednášky z : Textilní fyzika


Komerční realizace konfokální mikroskopie II



Multifluorescenční konfokální mikroskopie I (nahrazení fotonásobiče spektrometrem)

Klasický přístup pomocí pásmových filtrů

Využití spektrometru umožňuje odlišení jednotlivých struktur i v případě fluorochromů s blízkými emisními maximy. (Zeiss LSM510 Meta, Leica TCS SP2…)

Dr. Bernhard Zimmermann, Product Management Laser Scanning Microscopy, Advanced Imaging Microscopy, Carl Zeiss Jena GmbH



Multifluorescenční konfokální mikroskopie II

rekonstrukce dendritické buňky dierencované z kostní dřeně geneticky modifikované myši Přednášky z : Textilní fyzika


Multifluorescenční konfokální mikroskopie III Spetrální verze konfokální hlavy fy Olympus

Skenovací jednotka pro inverzní mikroskop OLYMPUS IX81

3 lasery (multi–line Ar laser, HeNe-G and HeNe-R) Přednášky z : Textilní fyzika


Multifluorescenční konfokální mikroskop ZEISS



Konfokální mikroskopie v materiálovém výzkumu I



Konfokální laserový rastrovací mikroskop OLYMPUS LEXT OLS 3000 – materiálový výzkum



Rastrování I



Rastrování II

SM

KM



Rastrování III



Identifikace vláken

Tuz. Vlna nepraná

Mohér. koza nepraná Austr. Vlna PVD – úpr. omaku

Austr. Vlna PVD -Ag



3D zobrazení vláken na LSCM

Vlákno Alpaky

Vlákno bavlny Přednášky z : Textilní fyzika


Tiskařské síto 2D obraz – RAW data



Tiskařské síto 3D obraz – vliv filtrování obrazu I

3D obraz vzorku před úpravou

Odstranění šumu z hladkého povrchu Přednášky z : Textilní fyzika


Tiskařské síto 3D obraz – vliv filtrování obrazu II

Odstranění šumu z výstupku

Odstranění šumu ze zubatého povrchu Přednášky z : Textilní fyzika


Tiskařské síto 3D obraz – vliv filtrování obrazu III

Odstranění šumu pro polokulové tvary

Odstranění šumu pomocí kombinace filtrů + barevné rozlišení tloušťky vzorku Přednášky z : Textilní fyzika


Porovnání konfokální a světelné mikroskopie

Světelná mikroskopie – dopadající světlo BF

OLYMPUS LEXT – KM Přednášky z : Textilní fyzika


Porovnání konfokální a elektronové mikroskopie



Porovnání AFM a konfokálního mikroskopu v případě nanovláken

PSIA XE - AFM

TESCAN VEGA – SEM Přednášky z : Textilní fyzika

OLYMPUS LEXT – KM


16x…

.

Tiling



PIXEL

Omezení konfokální mikroskopie From Laterální rozlišení: Source Airyho funkce n1 photons

α1

λ1

δy

δz

VOXEL δx

Kde k je vlnočet.

x,y,z α2 n2 photons

λ2

Rozlišení CM:

To Detector Přednášky z : Textilní fyzika


Mikrotomografie I

Mikrotomografie představuje neinavzivní mikroskopickou techniku založenou na absorpci rentgenového záření Přednášky z : Textilní fyzika


Mikrotomografie II

Princip mikrotomografie je založen na rekonstrukci 3D zobrazení získaného semikruhovým plošným snímačem Přednášky z : Textilní fyzika


Mikrotomografie III • Ukázka animací 3D rekonstrukcí C-C kompozitu a aktivního uhlíku


Viková, M. : MIKROSKOPIE V Mikroskopie V M. Viková

Recommend Documents