Faculteit Bio-ingenieurswetenschappen Academiejaar 2012 – 2013
Okselgeurbestrijding door microbiële transplantaties
Tess Plaquet Promotors:
Prof. dr. ir. Nico Boon Prof. dr. ir. Tom Van de Wiele
Tutor:
ir. Chris Callewaert
Masterproef voorgedragen tot het behalen van de graad van Master in de bio-ingenieurswetenschappen: Milieutechnologie
AUTEURSRECHT ‘The author and the promoters give the permission to use this thesis for consultation and to copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis’. ‘De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie’. Ghent, June 7th 2013
DANKWOORD Deze masterproef, de bekroning van mijn opleiding, is tot stand gekomen door de hulp van een aantal bijzondere figuren. Ik maak dan ook dankbaar gebruik van de gelegenheid om deze personen te kunnen bedanken. Allereerst gaat mijn dank uit naar mijn begeleider, ir. Chris Callewaert, om me de kans te geven onderzoek te voeren naar zo’n boeiend onderwerp. Ook zijn geduld, enthousiasme, feedback en aanmoedigingen stelde ik enorm op prijs. Hetzelfde geldt voor mijn promotors prof. dr. ir. Nico Boon en prof. dr. ir. Tom Van de Wiele, die me steeds weer konden inspireren en me altijd weer op het juiste spoor konden zetten. Graag complimenteer ik prof. dr. Jo Lambert, dr. Jessica Bostoen en Mireille van Gele, van de dienst dermatologie van het UZ Gent, voor de aangename samenwerking. Uiteraard zou dit onderzoek niet mogelijk geweest zijn zonder de vrijwillige deelnemers waarover ik me mocht ontfermen en mijn fantastische geurpanel, dat bleef volharden ondanks de onaangename geurtjes waarmee ze werden geconfronteerd. Ik prijs mezelf gelukkig dat ik terecht ben gekomen bij LabMET, in een atmosfeer die vriendelijkheid en behulpzaamheid uitstraalt. In het bijzonder wil ik Tim, waarbij ik altijd voor elk probleem terecht kon, en FM, waarmee ik samen de wereld van de statistiek veroverde, vermelden. Voorts wil ik mijn thesiscollega’s, Nelle, Sofie, Benjamin, Jelke en Thijs bedanken. Samen met jullie experimenten trotseren in het labo voelde niet altijd aan als werken, het was soms puur vermaak. Tot slot wil ik mijn dank betuigen aan mijn familie en vrienden, in het bijzonder Katrien, Sammy en Laurens. Bedankt om er altijd te zijn voor mij en te geloven in mij.
Tess Plaquet, juni 2013
SAMENVATTING Het doel van deze studie was te onderzoeken of microbiële transplantaties op de oksel succesvol konden worden uitgevoerd en of dit een invloed had op de aangenaamheid van de okselgeur. Een andere ambitie was uitzoeken of bacteriotherapie met Staphylococcus epidermidis een verbetering van de okselgeur met zich mee bracht. Finaal werd ook de potentiële invloed van de verschillende behandelingen op de structuur en diversiteit van de bacteriële okselgemeenschappen onderzocht. Dit gold vooral voor Corynebacterium spp., aangezien hun aanwezigheid de voornaamste oorzaak van een kwalijke geur is. Drie verschillende behandelingen werden toegepast. De eerste behandeling betrof het periodiek uitvoeren van microbiële transplantaties van twee donoren met een discrete lichaamsgeur naar twee acceptoren met zeer onaangename okselgeur. De tweede behandeling hield het tweemaal daags gebruik van een spray met S. epidermidis in door drie patiënten. De laatste behandeling omhelsde het periodiek aanbrengen van een hoge concentratie opgegroeide S. epidermidis op de oksel. Geurveranderingen werden nagegaan met behulp van een geurpanel dat gedragen watten beoordeelde. DGGE werd ingezet als moleculaire karakteriseringstechniek. De resultaten van deze studie geven aan dat microbiële transplantaties op de oksel succesvol kunnen worden uitgevoerd, verschuivingen in de microbiële okselgemeenschap kunnen induceren en mogelijk geurhinder kunnen reduceren. Het gebruik van sprays leverde twijfelachtige resultaten op aangaande verrijking van de okselregio met S. epidermidis en gaf geen indicatie van geurverbetering. Aanbrengen van hoge concentraties opgegroeide S. epidermidis bracht noch een wijziging in microbiële samenstelling, noch een daling van lichaamsgeur met zich mee. De voornaamste conclusie van dit onderzoek was dat microbiële transplantaties mogelijk zijn, doch suggereren de resultaten dat deze transplantaties enkel langdurig en succesvol in het bestrijden van geurhinder zijn wanneer donor en acceptor verwant zijn.
Kernwoorden: oksel, lichaamsgeur, bacteriële gemeenschap, DGGE, transplantatie, bacteriotherapie, Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.
microbiële
ABSTRACT The purpose of this study was to investigate whether subaxillary microbial transplantations could be carried out successfully and if this had an influence on the pleasantness of armpit odor. Another aim was to find out if bacteriotherapy with Staphylococcus epidermidis caused an improvement on armpit odor. Finally, the possible influence of the different treatments on the structure and diversity of the axillary microbiota was examined. This particularly applied to Corynebacterium spp., since there presence is the main cause of malodor. Three different treatments were applied. The first treatment concerned periodical microbial transplantations from two donors with a modest body odor to two acceptors with foul armpit odor. The second treatment included the twice daily use of a spray with S. epidermidis by three patients. The last treatment comprised the periodical applying of a high concentration of cultured S. epidermidis on the armpit. Changes in odor were assessed by an odor panel through worn cotton pads. DGGE was utilized for community fingerprinting. The results of the study indicate that subaxillary microbial transplantations can be accomplished efficaciously, may cause shifts in the microbial community of the armpit and perchance reduce odor nuisance. The use of sprays gave doubtful results concerning the enrichment of the subaxillary region with S. epidermidis and gave no indication of odor reducement. The applying of a high concentration of cultured S. epidermidis didn’t reveal any transformation in microbial composition nor a decline in body odor. The principal conclusion was that subaxillary microbial transplantations are possible, but the results suggest that they are only long-lasting and successful in reducing odor nuisance if donor and acceptor are relatives.
Keywords: armpit, body odor, bacterial community, DGGE, microbial transplantation, bacteriotherapy, Staphylococcus spp., Corynebacterium spp.
INHOUDSOPGAVE 1
Lijst met afkortingen ......................................................................................................... i
1
INLEIDING ..................................................................................................................... 1
2
LITERATUURSTUDIE .................................................................................................... 3 2.1
Structuur en functies van de huid ............................................................................ 3
2.2
Microbiota van de huid ............................................................................................ 4
2.2.1 2.2.2
De huid als milieu voor microbiële groei ........................................................... 4 Beschermingsmechanismen van de huid ......................................................... 5
2.2.3
Bescherming door huid-commensale bacteriën................................................ 5
2.2.4 Samenstelling van de huidmicrobiota ............................................................... 5 2.3 Drijvende krachten achter de diversiteit van de huidmicrobiota ............................... 5 2.3.1
Inter-species interacties ................................................................................... 5
2.3.2 Transmissie...................................................................................................... 6 2.3.3 Demografische karakteristieken van de gastheer............................................. 6 2.3.4 Genetica van de gastheer ................................................................................ 6 2.3.5 Gedrag van de gastheer .................................................................................. 6 2.3.6 Milieufactoren ................................................................................................... 7 2.4 Okselbacteriën ........................................................................................................ 7 2.4.1 2.4.2
Staphylococcus spp. ........................................................................................ 7 Coryneforme bacteriën ..................................................................................... 9
2.4.3 Propionibacterium ...........................................................................................10 2.5 Klieren in de oksel ..................................................................................................10 2.5.1 Exocriene klieren.............................................................................................10 2.6 Het ontstaan van zweetgeur ...................................................................................11 2.6.1
Volatiele vetzuren ............................................................................................12
2.6.2 Hormonen .......................................................................................................13 2.6.3 Zwavelcomponenten .......................................................................................14 2.6.4 Okselgeur en menselijk genetica ....................................................................15 2.7 Remedies tegen geurhinder ...................................................................................16
3
2.7.1
Deodoranten ...................................................................................................16
2.7.2 2.7.3
Anti-perspiranten .............................................................................................16 Geur neutraliseerders .....................................................................................17
2.7.4 Geurabsorbeerders .........................................................................................17 MATERIALEN EN METHODEN ....................................................................................19 3.1
Proefpersonen .......................................................................................................19
3.2
Staalname van de okselmicrobiota .........................................................................19
3.3
Geurbeoordeling ....................................................................................................19
3.4
Behandeling 1: Rechtstreekse donors ....................................................................20
4
3.5
Behandeling 2: Spraybehandeling ..........................................................................21
3.6
Behandeling 3: hoge concentratie opgegroeide S. epidermidis ..............................21
3.7
DNA-extractie .........................................................................................................22
3.8
Polymerase Chain Reaction (PCR) ........................................................................22
3.9
Agarose gel elektroforese ......................................................................................23
3.10
Sequenering ...........................................................................................................24
3.11
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) .................................................24
3.12
Analyse van de DGGE resultaten ...........................................................................25
3.13
Analyse van de geurpanel resultaten .....................................................................26
RESULTATEN ..............................................................................................................27 4.1
Behandeling 1 ........................................................................................................27
4.1.1
Patiënt 1 (P1) ..................................................................................................27
4.1.2 Patient 2 (P2) ..................................................................................................33 4.2 Behandeling 2 ........................................................................................................37 4.2.1 4.2.2 4.2.3 4.3
Patiënt 1 ..........................................................................................................37 Patiënt 2 ..........................................................................................................41 Patiënt 3 (P3) ..................................................................................................44
Behandeling 3 ........................................................................................................47
4.3.1 Patiënt 3 ..........................................................................................................47 4.4 Moving Window Analysis ........................................................................................51 4.5
Geurpanel: verkenning van de data .......................................................................53
4.5.1 4.5.2 4.5.3 5
Pairwise scatterplot .........................................................................................53 Box-and-whisker plots .....................................................................................54 Correlation heatmaps ......................................................................................56
DISCUSSIE ...................................................................................................................59 5.1
Bacteriële transplantatie tussen verwanten vs. niet-verwanten...............................59
5.2
Bacteriotherapie met een S. epidermidis spray ......................................................60
5.3
Bacteriotherapie met een hoge concentratie S. epidermidis ...................................60
5.4
Optimalisatie van microbiële transplantatie/bacteriotherapie ..................................60
5.5
Invloeden op de okselgeur .....................................................................................61
5.6
Een geurpanel als adequate techniek voor geurevaluatie ......................................63
5.7
Probiotica op de huid..............................................................................................64
5.8
Toekomstig onderzoek ...........................................................................................67
6
Conclusie ......................................................................................................................69
7
Literatuurlijst ..................................................................................................................71
8
BIJLAGEN .....................................................................................................................81 I.
Figuur S1: DGGE-profiel isolaten vs. patiënten ......................................................81
II.
Figuur S2: Volledig DGGE-profiel P1 .....................................................................82
III.
Figuur S3: Volledig DGGE-profiel P2 ..................................................................83
IV. Figuur S4: Volledig DGGE-profiel P3 ..................................................................84 V. Figuur S5: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P2, B1 ...............................................85 VI. VII.
Figuur S6: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P2, B1 ......................................86 Figuur S7: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P1, B2 ............................................87
VIII.
Figuur S8: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P1, B2 ......................................88
IX. Figuur S9: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P2, B2 ............................................89 X. Figuur S10: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P2, B2 .......................................90 XI. Figuur S11: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P3, B2 ..........................................91 XII. Figuur S12: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P3, B2 ....................................92 XIII.
Figuur S13: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P3, B3 ..........................................93
XIV. XV.
Figuur S14: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P3, B3 ....................................94 Tabel S1: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P1, B1 ..........95
XVI.
Tabel S2: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P1, B1 ....95
XVII. Tabel S3: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P2, B1 ......96 XVIII. Tabel S4: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P2, B1 96 XIX. Tabel S5: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P1, B2 ..........97 XX. Tabel S6: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P1, B2 ....97 XXI. Tabel S7: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P2, B2 ..........98 XXII. Tabel S8: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P2, B2 98 XXIII.
Tabel S9: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P3, B2 99
XXIV.
Tabel S10: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P3, B2 99
XXV. XXVI.
Tabel S11: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P3, B3 ..100 Tabel S12: Community organization en aantal banden: Actinobacteria, P3, B3 100 Broncode in R-Studio ....................................................................................101
XXVII.
1
Lijst met afkortingen
3M2H Agr
E-3-methyl-2-hexeenzuur Accessory gene regulator
Al2O3
Aluminiumoxide
AMP APS
Antimicrobiële proteïne Ammoniumpersulfaat
BLAST Ca2+
Basic Local Alignment Search Calciumion
Cl-
Chloorion 2+
Cu DGGE
Koperion Denaturing Gradient Gel Electrophoresis
DHT
Dihydrotestosteron
EDTA FDA 3+ Fe GAS GC-MS GRAS
Ethyleendiaminetetra-azijnzuur Food and Drug Administration Ijzerion Groep A Streptococcus Gaschromatografie-massaspectrometrie Generally Regarded as Safe
GWAS HCO3
Genome-wide association studies Waterstofcarbonaat
HS-SPME INDEL + K Kve
Headspace-solid phase microextraction Insertie-deleties Kaliumion Kolonie vormende eenheid
Mg(OH)2 Mg2+ MHC
Magnesiumhydroxide Magnesiumion Major Histocompatibility Complex
MRSA
Methicilline-resistente S. aureus
MSA MSH
Mannitol Salt Agar R/(S)-3-methyl-3-sulfanylhexaan-1-ol
+
Na
Natriumion
NMR
Solid-state nuclear magnetic resonance
NaCl OESO OTU
Natriumchloride Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling Operational taxonomic unit
PBS PCA
Phosphate buffered saline Principal component analysis
PCR SALT
Polymerase chain reaction Skin-associated lymphoid tissue
SD-Ag
Zilversulfadiazine i
SiO2
Siliciumoxide
SNP
Single nucleotide polymorphism
Spp. SSSS
Species Staphylococcal scalded skin syndrome
TAE TiO2
Tris-acetaat-EDTA Titaniumoxide
TLR
Toll-like receptor
TSS TSST VOC WHO
Toxic shock syndrome Toxic shock syndrome toxin Vluchtige organische component World Health Organization
ii
1
INLEIDING
Op de menselijke huid gedijen bacteriën, virussen en fungi die allen verweven zijn in complexe netwerken. Recente metagenomische studies gewagen van een aanzienlijke diversiteit binnen deze gemeenschappen en in het licht van deze studies wordt steeds duidelijker dat microbiota een veel grotere invloed hebben op de menselijke gezondheid en de werking van het immuunsysteem van de gastheer dan voordien werd aangenomen. Het evenwicht tussen deze micro-organismen en de menselijke gastheer is delicaat en kan bij verstoring aanleiding geven tot allerlei ziektebeelden. Het is cruciaal dat betere inzichten worden verworven in de interacties tussen gastheer en microbiota en de factoren die het kolonisatieproces drijven. Op die manier kunnen probiotica toegediend worden of kunnen microbiële transplantaties of bacteriotherapie ingezet worden om het immuunsysteem van de gastheer te stimuleren of om kolonisatie door pathogenen te verhinderen. Een mogelijke andere toepassing kan het verbeteren van de lichaamsgeur inhouden. Het onderzoek naar lichaamsgeur staat op heden nog steeds in zijn kinderschoenen. Verschillende factoren kunnen een invloed hebben, gaande van de genetische informatie van de gastheer, gedrag van de gastheer tot omgevingsaspecten. Het staat vast dat de aanwezige huidmicrobiota een cruciale rol spelen in de omzetting van huideigen vetzuren, hormonen en aminozuren naar vluchtige componenten. Het soort micro-organismen op de huid en in de oksel bepalen in grote mate of iemand een goede of minder goede lichaamsgeur bezit, iets wat bovendien door elk individu op een subjectieve manier wordt ervaren. Recente studies tonen aan dat elk individu een uniek microbioom bezit. Over het algemeen blijkt de microbiële okselgemeenschap vrij stabiel te zijn doorheen de tijd. Toch blijken drastische veranderingen mogelijk, waaruit kan geconcludeerd worden dat een verandering van het mirobioom van de oksel haalbaar is. Tot op heden werd weinig aandacht besteed om bacteriën aan te wenden voor cutaan gebruik. In deze studie wordt een microbiële transplantatie uitgevoerd op de huid van de ene persoon naar de andere persoon. Er wordt onderzocht of het overbrengen van de okselgemeenschap van goed-ruikende donoren met een hoog gehalte aan staphylococcen enerzijds en bacteriotherapie met Staphylococcus epidermidis via verschillende behandelingswijzen anderzijds een invloed hebben op de aangenaamheid van de okselgeur van patiënten waarvan de okselregio gedomineerd wordt door corynebacteriën. Dominantie van bepaalde corynebacteriën gaat namelijk gepaard met een sterk onaangename okselgeur. Aangezien de okselgemeenschap meestal gedomineerd wordt door ofwel staphylococcen ofwel corynebacteriën, zal gepoogd worden de aanwezige corynebacteriën te verdringen door aanbrengen van staphylococcen
1
2
LITERATUUR
2 2.1
LITERATUURSTUDIE Structuur en functies van de huid
Met een gemiddelde oppervlakte van 1,8 m² is de huid het grootste orgaan van het menselijke lichaam. De huid treedt op als fysische barrière en beschermt het lichaam tegen mogelijke invasies van lichaamsvreemde organismen en toxische substanties, waarbij het tegelijkertijd lichaamsvocht en nutriënten vasthoudt (Proksch et al., 2008). De huid vormt het contactoppervlak met de buitenomgeving en wordt gekoloniseerd door talrijke microorganismen, waaronder bacteriën, fungi en virussen (Chiller et al., 2001). De huid is opgebouwd uit een epidermis van 0,5 tot 3 mm dik, met daaronder de dermis en het onderhuidse weefsel. De epidermis is de buitenste huidlaag en is opgebouwd uit vier soorten cellen (zie Tabel 1): keratinocyten, melanocyten, Langerhanscellen en Merkelcellen (Van de Wiele, 2012). Tabel 1: Soorten cellen van de epidermis (Van de Wiele, 2012). Huidcel
Beschrijving
Keratinocyten
Komen het meest voor (90%); worden geproduceerd in het stratum basale en ondergaan verhoorning terwijl ze naar het huidoppervlak geduwd worden, waar ze verwijderd worden door vervelling; migratie van keratinocyten naar het huidoppervlak duurt 4 weken; de keratine in
Melanocyten
de cellen beschermt de onderliggende lagen tegen hitte, microorganismen en chemische stoffen Tweede meest voorkomende soort cellen; produceren het pigment melanine, dat wordt doorgegeven aan keratinocyten waar het de huid beschermd door UV-licht te absorberen
Langerhanscellen Merkelcellen
Spelen een rol bij de immunologische respons bij microbiële indringers Geassocieerd met zintuiglijke neuronen; gerelateerd aan tastvermogen
De epidermis omvat, van buiten naar binnen, vijf lagen: stratum corneum, stratum lucidum, stratum granulosum, stratum spinosum en stratum basale, zoals weergegeven in Figuur 1 en beschreven in Tabel 2.
3
LITERATUUR
Figuur 1: 2008).
Dwarsdoorsnede en belangrijkste componenten van de huid (McGrath et al.,
Tabel 2: Verschillende lagen van de epidermis (Van de Wiele, 2012). Huidlaag
Beschrijving
Stratum corneum
Opgebouwd uit zo’n 15 lagen dode cellen; verschillende vetten bezetten de intercellulaire ruimten Bestaat uit ongeveer 5 lagen afgeplatte dode cellen; komt enkel voor bij de handpalmen en voetzolen
Stratum lucidum Stratum granulosum Stratum spinosum
Stratum basale
Zo’n 5 lagen afgeplatte keratinocyten; scheiden granule bevattende vetten uit om een waterafstotende laag te vormen Bestaat uit 8-10 lagen keratinocyten die vetten secreteren in intercellulaire ruimtes; ook opgebouwd uit Langerhanscellen en melanocyten Enkele laag met keratinocyten, melanocyten, Langerhanscellen en merkelcellen
2.2
Microbiota van de huid
2.2.1 De huid als milieu voor microbiële groei Door de talrijke huidplooien, invaginaties en gespecialiseerde niches wordt de huid gekoloniseerd door een brede waaier aan micro-organismen, waaronder bacteriën, fungi en virussen. Vele micro-organismen zijn onschadelijk en beschermen de huid tegen kolonisatie door schadelijke en pathogene organismen. Kolonisatie wordt bepaald door de dikte van de huid, huidplooien en de hoeveelheid haarfollikels en klieren (Tagami, 2008). De soort en het aantal bacteriën is afhankelijk van de anatomische locatie, de geproduceerde hoeveelheid zweet en talg, de lokale vochtigheid en de hormonale toestand en leeftijd van de gastheer (Aly, 1991). 4
LITERATUUR
2.2.2 Beschermingsmechanismen van de huid De huid vormt een barrière die weerstand biedt tegen kolonisatie en groei van pathogenen. Verdedigingsmechanismen van de huid zijn de mechanische rigiditeit van het stratum corneum en diens lage vochtigheidsgehalte, de lage zuurtegraad, antimicrobiële vetzuren aanwezig in het stratum corneum, productie van lysozymen en antimicrobiële proteïnen (AMPs) (Harder et al., 1997). De huid is koeler dan de doorsnee lichaamstemperatuur, heeft een zuurtegraad van 5 en bestaat uit veel droge regio’s, wat bacteriële replicatie moeilijker maakt (Chiller et al., 2001).
2.2.3 Bescherming door huid-commensale bacteriën Commensale bacteriën die de huid koloniseren beschermen de huid tegen kolonisatie door pathogenen en dit op zowel directe als indirecte manier. Directe methoden omvatten het produceren van bacteriocines en toxische metabolieten, het induceren van een lage redoxpotentiaal, het verhinderen van de aanhechting van concurrerende bacteriën, het belemmeren van translocatie, het uitputten van essentiële nutriënten en het afbreken van toxische stoffen. Te beschouwen als indirecte methoden zijn het stimuleren van fagocytose, verdedigingsmechanismen en de antilichamenproductie van de gastheer (Chiller et al., 2001).
2.2.4 Samenstelling van de huidmicrobiota Op de huid worden zowel transiënte als residente microbiële species teruggevonden. Transiënte species zijn species die de huid niet permanent kunnen koloniseren, doordat de milieucondities van de huid hun groei en reproductie beletten. Voorbeelden hiervan zijn Escherichia coli, Bacillus species, Staphylococcus aureus en Pseudomonas aeruginosa. Residente bacteriën die de huid permanent koloniseren en waarvan iedereen drager is, behoren tot de genera Propionibacterium, Staphylococcus, Micrococcus, Corynebacterium en Acinetobacter. Andere residente micro-organismen zijn de gist Malassezia en verschillende bacteriofagen (Grice et al., 2011).
2.3
Drijvende krachten achter de diversiteit van de huidmicrobiota
2.3.1 Inter-species interacties Inter-species interacties kunnen een grote invloed hebben op de aanwezigheid van microorganismen op de huid. Naast synergetische relaties komen ook antagonistische relaties voor te wijten aan competitie of predatie (Little et al., 2008). Enkele mechanismen die bacteriën gebruiken om in eenzelfde gemeenschap te interageren zijn de productie van bacteriocines en toxische metabolieten, inductie van lage reductie-oxidatie potentiaal, depletie van nutriënten en inhibitie van adhesie en translocatie (Chiller et al., 2001).
5
LITERATUUR
2.3.2 Transmissie Transmissie kan indirect plaatsvinden via het in aanraking komen met besmette voorwerpen of direct via contact met andere individuen. Factoren zoals beroep, vrije tijdsactiviteiten, in contact komen met scholen of kinderopvang en woon-werkverkeer kunnen een invloed hebben op de samenstelling van de huidmicrobiota (Rosenthal et al., 2011).
2.3.3 Demografische karakteristieken van de gastheer De microbiële gemeenschappen op de huid worden bepaald door de huidcondities, hormonale huishouding, leeftijd, geslacht en etniciteit van de gastheer (Fierer et al., 2008; Fredericks, 2001; Roth & James, 1988).
2.3.4 Genetica van de gastheer Het immuunsysteem van de huid speelt mogelijk een rol in de opbouw van de microbiële huidgemeenschap. Het aangeboren immuunsysteem van de huid bevat Langerhanscellen, T-lymfocyten, mastocyten en keratinocyten, die Toll-like receptors (TLRs) tot expressie brengen en cytokines, chemokines, β-defensines, RNase7 en andere antimicrobiële peptiden produceert (Pivarcsi et al., 2005). Het lymfatisch weefsel, geassocieerd met de huid, (skin-associated lymphoid tissue, SALT) kan immunoglobinen produceren en secreteren, antigenen aanreiken en T-cellen activeren, wat de samenstelling van de microbiële gemeenschap kan beïnvloeden. Hedendaags duiken genoom-gespreide associatie studies (genome-wide association studies, GWAS) op die trachten te onderzoeken of genetische variaties in het menselijke genoom de microbiële samenstelling kunnen beïnvloeden. Veel voorkomende genetische varianties omvatten enkel-nucleotide polymorfisme (single nucleotide polymorphism, SNP), niet-SNP varianten en insertie-deleties (INDEL). Benson et al. (2010) kon zo aantonen dat het genotype van de gastheer gedeeltelijk de variatie in darmmicrobiota verklaarde.
2.3.5 Gedrag van de gastheer Gedragsfactoren als medicatiegebruik (vb. antibiotica, hormonen), cosmeticagebruik (vb. crèmes, lotions) en hygiënegewoonten (persoonlijk en huishoudelijk) kunnen allemaal een invloed hebben de structuur van de microbiële gemeenschap van de huid (Fierer et al., 2008; Larson, 2001; Roth & James, 1988). Zo gaat het wassen van de huid gepaard met transepidermaal waterverlies, een verandering van de resistentiecapaciteit van het stratum corneum en een wijziging van de pH (Larson, 2001). Hoewel de potentiële invloed van factoren als dieet en voeding, blootstelling aan de zon en roken op de samenstelling van de huidmicrobiota nog niet werd onderzocht, wordt ervan uitgegaan dat deze een effect uitoefenen op de huid (Rosenthal et al., 2011).
6
LITERATUUR
2.3.6 Milieufactoren Vochtigheid, temperatuur en blootstelling aan UV-straling kunnen de condities van de huid wijzigen, wat een invloed op de microbiële structuur van de gemeenschap kan uitoefenen. Het huidoppervlak vormt een vrij droog milieu en aanwezig vocht hierop heeft een relatief hoge osmotische druk, waardoor Gram-positieve bacteriën begunstigd worden, terwijl Gramnegatieve species eerder uitgesloten worden (Van de Wiele, 2013). Ook kan een droge huid de binding van micro-organismen aan specifieke receptoren van de epitheelcellen van de gastheer belemmeren (Romero-Steiner et al., 1990). De temperatuur van de okselhuid is hoger in vergelijking met andere sites van de huid, wat leidt tot een verhoogde zweetproductie. Dit gaat gepaard met een effect op het vochtgehalte en op de aanwezigheid van nutriënten (Van de Wiele, 2013). UV-straling vertoont een bacteriocidale werking op huidbacteriën (Dotterud et al., 2008). Individuen zijn continu onderhevig aan de microbiële fluctuaties van de omgeving waarin ze zich bevinden, grotendeels bepaald door hun beroepsactiviteit (Rintala et al., 2008). Er is echter slechts weinig geweten over de microbiële compositie van verscheidene omgevingen en hoe dit de structuur van de huidmicrobiota beïnvloedt (Feazel et al., 2009).
2.4
Okselbacteriën
Door de aanwezigheid van haarfollikels en een groot aantal talgklieren, eccriene zweetklieren en apocriene klieren kan de oksel tot een van de huidregio’s met het grootste aantal bacteriën gerekend worden (Jackman & Noble, 1983). De bacteriële okselcompositie, met dichtheden tussen 500.000/cm2 en 10.000.000/cm2 (Leyden et al., 1981), is vrij divers wanneer verschillende individuen met elkaar vergeleken worden. Zelfs subtiele verschillen tussen linker- en rechteroksel van eenzelfde individu zijn waarneembaar (Kuhn & Natsch, 2009). In hoofdzaak bestaat de residente bacteriëngemeenschap uit Gram-positieve bacteriën van de genera Staphylococcus, Corynebacterium en Propionibacterium. Daarnaast kunnen kleine hoeveelheden Micrococci en enkele Gram-negatieve bacteriën worden waargenomen (Hopwood et al., 2005). De okselregio wordt hoofdzakelijk gedomineerd door Staphylococcus of Corynebacterium species, hoewel dominantie door Propionibacterium species ook kan optreden (Taylor et al., 2003).
2.4.1 Staphylococcus spp. Staphylococci zijn Gram-positieve, facultatief anaerobe niet-beweeglijke kokken die onregelmatige clusters vormen. Ze worden aanzien als commensale huidmicrobiota die kunnen ingedeeld worden in twee groepen: coagulase positieve bacteriën en coagulase negatieve bacteriën.
7
LITERATUUR S. epidermidis S. epidermidis vormt kleine witte of beige kolonies (1-2 mm diameter). S. epidermidis is gemakkelijk te onderscheiden van andere bacteriën van hetzelfde genus door zijn gevoeligheid voor desferrioxamine, het niet produceren van de suiker trehalose uit een zuur en zijn coagulase-negatieve eigenschappen. Hoewel deze bacterie over het algemeen als onschadelijk wordt beschouwd, kan S. epidermidis verantwoordelijk zijn voor ziekenhuisinfecties bij risicogroepen. Grote bronnen van besmetting zijn kunstorganen, prothesen of katheters. Verschillende studies doen suggereren dat er tussen S. epidermidis en zijn gastheer geen commensale, maar een mutualistische relatie heerst. Veel verschillende stammen van S. epidermidis produceren namelijk lactobiotica (lanthioninebevattende antibacteriële peptiden), zoals epidermine, epilancine K7, epilancine 15X en Pep 5 (Ekkelenkamp et al., 2005; Bierbaum et al., 1996; Sahl, 1994). De bacterie produceert dus peptides die toxisch zijn voor andere organismen, waaronder S. aureus en groep A Streptococcus (GAS, S. pyogenes), waardoor de huid beter beschermd wordt tegen pathogenen. S. epidermidis zorgt voor verdere bescherming via feromonen cross-inhibitie. Gemodificeerde peptideferomonen, geproduceerd door de accessory gene regulator (agr) locus, werken op de agr systemen van verscheidene species door ‘self’ agr loci te activeren en ‘nonself’ agr loci te inhiberen (Otto et al., 2001). Via quorum-sensing wordt aan andere species doorgegeven wanneer een gepaste dichtheid bereikt is en neemt verdere kolonisatie af (Otto et al., 1999).
S. aureus S. aureus verenigt zich in goudgele kolonies. Bij uitplaten van deze coagulase-positieve bacterie op bloedplaten vindt β-hemolyse plaats. S. aureus wordt vaak beschouwd als een pathogeen, die huidinfecties zoals impetigo, furunkels, folliculitis en subcutane abcessen veroorzaakt. Door het vrijgeven van exotoxines kan Pemphigus neonatorum (staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS) ontstaan (Iwatsuki et al., 2006). Daarnaast kan de bacterie ook aanleiding geven tot osteomyelitis, pneumonie, septische artritis, septicaemia, endocarditis en meningitis. Stammen van S. aureus die de specifieke exotoxine TSST-1 (toxic shock syndrome toxin) produceren kunnen het toxic shock syndrome (TSS) teweeg brengen (Iwatsuki et al., 2006; Foster, 2005; Lowy, 1998). Risicogroepen vatbaar voor deze aandoeningen zijn o.a. patiënten die leiden aan atopische dermatitis (Baker, 2005) of waarbij een katheter werd ingebracht (Sadoyma et al., 2006). Infecties te wijten aan S. aureus worden behandeld met antibiotica en indien nodig door het verwijderen van geïnfecteerde implantaten (Viale & Stefani, 2006). Echter, het aantal antibioticaresistente S. aureus stammen, waarvan methicilline-resistente S. aureus (MRSA) het bekendste voorbeeld is, neemt gestaag toe (Foster, 2005). Hoewel S. aureus vaak wordt afgeschilderd als pathogeen, is deze bacterie bij gezonde personen eerder te beschouwen als commensaal. Bepaalde stammen produceren immers bacteriocines, waaronder staphylococcin 462, waardoor de groei van andere S. aureus 8
LITERATUUR stammen geïnhibeerd worden (Hale & Hinsdill, 1975). Ook wordt de bacterie dikwijls beschouwd als transiënt, ondanks een studie van Peacock, De Silva, & Lowy (2001) die stelt dat 20% van de totale wereldbevolking permanent gekoloniseerd wordt, 60% een tijdelijke gastheer vormt en de overige 20% nooit gekoloniseerd wordt.
Andere staphylococcen Andere staphylococcen die vaak voorkomen op de huid zijn S. hominis en S. haemolyticus. S. hominis wordt vooral aangetroffen in regio’s met veel apocriene klieren, zoals de oksel en de schaamstreek. De bacterie is doorgaans onschadelijk, en kan enkel infectie veroorzaken bij mensen met een zwak immuunsysteem. S. haemolyticus wordt voornamelijk gedetecteerd ter hoogte van de oksels, het perineum en de liesstreek. Het is een moeilijk te behandelen opportunistische pathogeen die infecties kan veroorzaken en vaak geassocieerd wordt met het inbrengen van medische apparaten (Kloos & Schleifer, 1975).
2.4.2 Coryneforme bacteriën Coryneforme bacteriën zijn Gram-positieve, niet-beweeglijke, facultatief anaerobe, staafvormige bacteriën die in onregelmatige, knotsvormige of V-vormige clusters voor komen. Op de huid komen corynebacteriën vooral voor in regio’s waar twee huidoppervlakken elkaar raken, zoals de oksels, waar groei gestimuleerd wordt door hyperhidrose (Chiller et al., 2001). Deze bacteriën kunnen ingedeeld worden in twee species: C. diphteriae en diphteroiden (Cogen et al., 2007).
Corynebacterium jeikeium C. jeikeium, behorend tot de diptheroiden, wordt aanzien als deel uitmakend van de normale huidmicrobiota. Kolonisatie treedt voornamelijk op de in oksel- en perineale regio en ter hoogte van de liesstreek (Wichmann et al., 1985). C. jeikeium kan infecties teweeg brengen bij patiënten met een verzwakt immuunsysteem (Prospero et al., 1997). Hoewel C. jeikeium resistent is voor meerdere antibiotica, is deze bacterie gevoelig voor glycopeptiden en verloopt behandeling met vancomycine of teicoplanine succesvol (Cogen et al., 2007; Coyle & Lipsky, 1990). Meestal is de aanwezigheid van C. jeikeium echter onschuldig en door zijn alomtegenwoordigheid wordt de bacterie beschouwd als commensaal. Hypotheses die suggereren dat C. jeikeium epidermale bescherming biedt wijzen zelfs in de richting van een mutualistisch karakter. Door mangaanopname beschermt deze bacterie zich tegen superoxide radicalen, geproduceerd door andere bacteriën of de gastheer (Storz & Imlay, 1999). Echter, het enzym superoxide dismutase zou mogelijks ook dienen om oxidatieve schade aan het epidermaal weefsel van de gastheer te voorkomen. Ook neemt C. jeikeium naast mangaan ook ijzer op, beiden noodzakelijk voor overleving, waardoor kolonisatie van andere microbiota verhinderd zou worden. Daarnaast produceert de bacterie ook nog bacteriocine-achtige componenten (Fujita et al., 2007). 9
LITERATUUR Corynebacterium minutissimum C. minutissimum wordt voornamelijk aangetroffen in vochtige regio’s zoals de liesstreek, oksels, huidplooien en waar huidoppervlakten met elkaar in contact komen. De bacterie veroorzaakt de chronische huidaandoening erythrasma (Blaise et al., 2008).
2.4.3 Propionibacterium Propionibacteriën zijn Gram-positieve, onbeweeglijke staafjes genoemd naar hun vermogen om propionzuur te synthetiseren. Bij gezonde individuen zijn propionibacteriën dominant in de haarfollikels van talgklieren en op talgrijke huidoppervlakten op hoofd, borstkas en rug. Hun aanwezigheid zorgt voor stabilisatie van de huidmicrobiota. Ze vertonen slechts een laag niveau van virulentie. Drie species van propionibacteriën worden onderschreven als commensalen van de menselijke huid: P. acnes, P. granulosum en P. avidum (Marples & McGinley, 1974). Naast de huidconditie acne vulgaris kan P. acnes ook postoperatieve infecties teweegbrengen na het inbrengen van medische apparaten (Zeller et al., 2007), die kunnen resulteren in sepsis of endocarditis (Mohsen et al., 2001). Ook P. granulosum wordt gelinkt aan acne (Higaki et al., 2001). P. avidum wordt vooral teruggevonden ter hoogte van de oksels waarbij diens voorkomen vergroot bij de pubertijd (Nordstrom & Noble, 1984).
2.5
Klieren in de oksel
In de oksel zijn eccriene en apocriene zweetklieren aanwezig. Hoewel zweet hoofdzakelijk uit water bestaat (99,5%), bevat het vele bestanddelen waaronder ureum, proteïnen, melkzuur en aminozuren. De pH kan variëren van 5 bij lage zweetproductie tot 6,5 - 7 bij hoge zweetproductie. Naast deze zweetklieren bevat de oksel ook holocriene klieren of talgklieren.
2.5.1 Exocriene klieren Exocriene klieren geven hun secretieproducten af in het darmlumen of naar de buitenwereld via afvoergangen. Er zijn drie soorten exocriene klieren: eccriene, apocriene en holocriene klieren.
Eccriene klieren Eccriene klieren komen voor op nagenoeg alle huidoppervlakken. In de okselregio is er sprake van aantallen boven de 25.000. Eccriene klieren brengen het huidoppervlak continu in contact met hun kleurloze, geurloze secretie (zie Tabel 3), dat grotendeels bestaat uit water en elektrolyten, waarbij die kliercel heel blijft. Door de verdamping van dit water komt latente warmte vrij, waardoor thermoregulatie wordt verkregen. Daarnaast verzuren deze klieren de huid, waardoor kolonisatie en groei van bacteriën wordt afgeremd (Grice & Segre, 2011). 10
LITERATUUR Tabel 3: Samenstelling van eccrien zweet (Piérard et al., 2003). Organische componenten
Azijnzuur, ammoniak, ascorbinezuur, boterzuur, capronzuur, caprylzuur, citroenzuur, mierenzuur, melkzuur, propionzuur, ureum
Anorganische componenten
NaCl, K+, Ca2+, Mg2+, Cu2+, Fe3+
Apocriene klieren Apocriene klieren worden teruggevonden op de oksels, de tepels en de genito-anale regio. De okselregio bevat tien keer meer apocriene klieren dan eccriene klieren (Quinton et al., 1999). Ze worden functioneel in de puberteit en produceren een melkachtige, viskeuze, geurloze secretie waarbij ook een deel van de kliercel wordt afgescheiden. Als reactie op adrenaline kunnen apocriene klieren worden geactiveerd (Grice & Segre, 2011). Dit apocrien zweet, gevormd in klierblaasjes in de diepe dermis en hypodermis, wordt gesecreteerd in naburige haarkanalen waarna het in contact komt met de huid. Het is rijk aan vetten, stikstof, lactaten en verscheidene ionen zoals Na+, K+, Ca2+ , Mg2+ , Cl- en HCO3- (Piérard et al., 2003).
Holocriene klieren Holocriene klieren staan meestal in verbinding met een haarfollikel. Deze klieren zijn relatief anoxisch en vormen een goede groeiplaats voor facultatief anaeroben, zoals Propionibacterium acnes (Leeming et al., 1984). Ze scheiden talg uit, dat een hydrofobe laag vormt die bescherming biedt tegen micro-organismen, waarbij de kliercellen in het geheel worden verwijderd (Grice & Segre, 2011). Talg bestaat uit een mengsel van triglyceriden, wasesters, cholesterol en andere sterolen, cholesterolesters, squalenen, en koolwaterstoffen (Kanlayavattanakul & Lourith, 2011).
2.6
Het ontstaan van zweetgeur
In de okselregio zijn eccriene, apocriene en holocriene klieren gesitueerd die geurloze secreties uitscheiden. Wanneer bacteriën deze geurloze secreties transformeren tot volatiele componenten ontstaat een zweetgeur (Shelley et al., 1953). Vooral de Corynebacterium species dragen bij tot een intense zweetgeur (Taylor et al., 2003), waarbij de belangrijkste geurvormende substraten, zijnde middellange (C6-C10) volatiele vetzuren en thioalcoholen (Figuur 2), van de apocriene klieren afkomstig zouden zijn (Leyden et al., 1981). Leyden et al. (1981) toonden een duidelijke correlatie aan tussen corynebacteriën en zweetgeur. Hoewel er een significante associatie tussen Micrococcus species en de geurintensiteit bestaat, zorgen het weinig voorkomen en de lage dichtheid van dit genus voor een verwaarloosbare bijdrage tot de geurontwikkeling (James, Hyliands, et al., 2004; James, Casey, et al., 2004). Taylor et al. (2003) vonden geen associatie tussen zweetgeur en staphylococcen, propionibacteriën of de Malassezia schimmel. 11
LITERATUUR
Figuur 2: Schematische weergave van de microbiologische en chemische oorsprongen van okselzweetgeur (James et al., 2013). Metabolisme van vertakte alifatische aminozuren tot korte keten α
(C2-C5) volatiele vetzuren zijn door staphylococcen, hydrolyse van N -acylglutaminen tot middellange keten (C6-C10) volatiele vetzuren door corynebacteriën en de vorming van thioalcoholen van Lcysteine en/of L-cysteinylglycine conjugaten door staphylococcen en/of corynebacteriën zouden de belangrijkste routes zijn (Austin & Ellis, 2003; James, Casey, et al., 2004; James, Hyliands, et al., 2004; Natsch et al., 2003; Natsch et al., 2004; Natsch et al., 2006; Starkenmann et al., 2005; Emter & Natsch, 2008).
2.6.1 Volatiele vetzuren De belangrijkste bron van korte volatiele vetzuren in de okselregio is de biotransformatie van alifatische aminozuren met zijketens, in sterk geurende (C4-C5) volatiele vetzuren met methylvertakkingen (zie Figuur 2). De meest prominente is de omzetting van L-leucine in isovaleriaanzuur, weergegeven in Tabel 4 (James, Hyliands, et al., 2004; James, Casey, et al., 2004). Aminozuren komen voor in eccrien zweet, in apocriene secreties door bacteriële proteasen en op de okselhuid door de afbraak van proteïnen van de keratiniserende epidermis (Holland, 1993). Corynebacteriën degraderen partieel (via β-oxidatie) structureel ongewone langketen vetzuren, zoals vetzuren met methylvertakkingen, tot korte en middellange keten vetzuren (Figuur 2) (James, Hyliands, et al., 2004; James, Casey, et al., 2004). Staphylococcen en propionibacteriën fermenteren glycerol, afkomstig van triacylglycerol en melkzuur, natuurlijk voorkomend op de huid, in azijnzuur en propionzuur (Figuur 2) (James, Hyliands, et al., 2004; James, Casey, et al., 2004). Natsch et al. (2003; 2006) postuleerden dat structureel ongewone middellange volatiele vetzuren, zoals E-3methyl-2-hexeenzuur (3M2H, zie Figuur 3) en 3-hydroxy-3methyl hexaanzuur, aanwezig zijn in het apocrien zweet via een covalente binding met L-glutamine. Dit wordt op het okseloppervlak gebracht via het enzym Nα-acylglutamine aminoacylase, dewelke 12
LITERATUUR corynebacteriën bezitten. Deze visie wordt gesteund door Troccaz et al. (2009), die significante hoeveelheden Nα-3-hydroxy-3-methylhexanoyl-L-glutamine, precursor van 3methyl-3-mercaptohexaan-1-ol, in okselzweet maten (zie Tabel 4).
Figuur 3 : E-3-methyl-2-hexeenzuur (3M2H). 3M2H wordt beschouwd als een van de belangrijkste componenten die bijdragen voor een typische scherpe geur. Deze component wordt vooral in aanwezigheid van corynebacteriën gesynthetiseerd (Natsch et al., 2003; 2006).
2.6.2 Hormonen Gower et al. (1994) stelden dat de in het mannelijke lichaamszweet aanwezige 16androstenen 5α-androstenol en 5α-andostrenon (zie Figuur 4), componenten met een lage geurdrempel, grotendeels verantwoordelijk zijn voor de zweetgeur.
Figuur 4: Afbraak van hormonen tot volatiele geurcomponenten (Kanlayavattanakul & Lourith, 2011).
Een studie van Austin & Ellis (2003) gaf aan dat okselbacteriën enkel 16-andostrenen kunnen produceren uit precursors die de C-16 dubbele binding reeds bevatten. De verschillende bacteriële gemeenschappen dienen samen te werken voor de vorming van geurige hormonen en interactie tussen de okselbacteriën is een vereiste voor efficiënte 13
LITERATUUR transformatie. Slechts weinig organismen die in staat zijn om 16-andostrenen te transformeren, konden worden geïsoleerd uit de okselregio. In dit kader en door de vaak optredende anosmie voor 16-androstenen (Amoore, 1977), wordt gesteld dat deze hormonen een veel lagere bijdrage met betrekking tot zweetgeur hebben dan eerder gedacht.
2.6.3 Zwavelcomponenten Studies identificeerden vier thioalcoholen op de okselhuid die in relatie stonden met okselgeur: 3-mercaptopentaan-1-ol, 3-methyl-3-mercaptohexaan-1-ol, 3-mercaptohexaan-1ol en 2-methyl-3-mercaptobutaan-1-ol (Natsch et al., 2004; Troccaz et al., 2004; Hasegawa et al., 2004). Natsch et al. (2004) en James et al. (2013) leidden af dat thioalcohol precursors conjugaten van S-hydroxyalkyl-L-cysteine zouden zijn, waarbij S-((2-hydroxy-1isopropyl)ethyl)-L-cysteine de directe precursor van 2-methyl-3-mercaptobutaan-1-ol zou vormen. Zulke precursoren, gesecreteerd in apocrien zweet, zouden op het huidoppervlak gesplitst worden door bacteriële C-S β-lyases. Zowel corynebacteriën als staphylococcen bezitten deze C-S β-lyase activiteit, hoewel de activiteit van eerstgenoemden hoger bleek (James et al., 2013). Een alternatieve hypothese voor thioalcohol productie, gebaseerd op het glutathion detoxificatie reactiepad, wordt naar voor geschoven door Starkenmann et al. (2005). Zij stelden dat de directe precursors S-hydroxyalkyl-L-cysteineglycines zijn, afgeleid van S-hydroxyalkylglutathion conjugaten in de apocriene klier. Deze visie wordt gesteund door (Troccaz et al., 2009),die significante hoeveelheden S-[1-(2-hydroxyethyl)-1methylbutyl]-(L)-cysteinylglycine, precursor van 3-methyl-3-mercaptohexaan-1-ol, in okselzweet maten (zie Tabel 4). Het is niet duidelijk of splitsing gebeurt enkel door tussenkomst van een β-lyase of door een combinatie van een carboxypeptidase of dipeptidase met een C-S β-lyase. Volgens Emter & Natsch (2008) zijn L-cysteineglycine conjugaten de meest gesecreteerde thioalcohol precursors en is een sequentiële actie van corynebacterieel dipeptidase en C-S β-lyase noodzakelijk voor splitsing van 3-methyl-3mercaptohexaan-1-ol uit diens peptide precursor.
14
LITERATUUR Tabel 4: Hoofdvertegenwoordigers van de grootste structurele klassen van verantwoordelijken voor okselgeur en hun precursors, aangeduid met de metabolische routes en soorten bacteriën (James et al., 2013).
2.6.4 Okselgeur en menselijk genetica Kuhn & Natsch (2009) onderzochten of genetica een aandeel heeft in lichaamsgeur en in het bijzonder okselgeur. Hun hypothese stelde dat een gemeenschappelijk patroon volatiele vetzuren een bijdrage leverde aan de geërfde individuele lichaamsgeur, een visie ondersteund door hun studie met 12 paar monozygotische menselijke tweelingen. Yoshiura et al. (2006) bewezen dat een enkel-nucleotide polymorfisme in het ABCC11 gen (538G?A), ook bepalend voor het type oorsmeer, een genetische invloed op de okselgeur heeft. Het product van dit ABCC11 gen, een apicale efflux pomp, is verantwoordelijk voor de secretie van L-glutamine conjugaten van 3M2H en 3-hydroxy-3-methylhexaan zuur alsook het Lcysteineglycine conjugaat van 3-methyl-3-mercaptohexaan-1-ol uit de apocriene klieren van de oksel (Martin et al., 2010). De GG en GA genotypen, overeenstemmend met nat oorsmeer, corresponderen met hoge niveaus van deze stinkende componenten en hun aminozuurconjugaten in okselzweet, terwijl bij het AA genotype, correlerend met droog oorsmeer, deze geurstoffen en precursors bijna niet aanwezig zijn. Het dominante G-allel komt vooral voor bij Europeanen en Afrikanen, terwijl het A-allel vooral gevonden wordt bij Oost-Aziaten (Yoshiura et al., 2006).
15
LITERATUUR
2.7
Remedies tegen geurhinder
2.7.1 Deodoranten Deodoranten worden voornamelijk gebruikt om slechte geuren te maskeren, vaak door incorporatie van geurmaskerende aroma’s (Woodruff, 1994). Verder kunnen ze specifieke parfumprecursors bevatten, die interageren met de huid en een aangename geur vrijgeven, of chemische neutraliseerders (natriumbicarbonaat en zinkcarbonaat) van geurende C6-C11 vetzuren. Bestanddelen zoals zink ricinoleaat en metaaloxiden verminderen de onaangename geur na binding met geurende vetzuren, aminen en mercaptanen (Piérard et al., 2003). Zinkglycinaat, triethylcitraat en verscheidene bacteriële exo-enzym inhibitoren met β-lyase als hoofdtarget, beperken de splitsing van apocriene precursoren van geurende componenten (Lukacs et al., 1991). Ingrediënten, als ethanol, triclosan, quaternaire ammoniumverbindingen, esters gevormd uit glycerol, sucrose en octoxyglycerol, verlenen antimicrobiële eigenschappen tegen S. epidermidis en Corynebacterium spp. Adhesie wordt verhinderd door sucrose myristraat en lauraat en andere sacchariden (Piérard et al., 2003).
2.7.2 Anti-perspiranten Anti-perspiranten worden gebruikt om zweetsecretie te verminderen door de excretiekanalen van zweetklieren te blokkeren. Meestal bevatten ze metallische zouten omwille van hun antibacteriële activiteit (Labows et al., 1999).
Aluminiumzouten Anti-perspiranten bevatten doorgaans aluminiumzouten in een oplossing met zure pH van 2,5 tot 3. Bij een pH van 6 tot 7 polymeriseren deze zouten (in het bijzonder aluminiumchloorhydraat, aluminiumsulfaat, aluminiumchloorhydraat lactaat en aluminiumchloride) met vorming van aluminiumhydroxide gel plugs in het zweetkanaal, waardoor zweet niet tot aan het huidoppervlak kan migreren (Labows et al., 1999). Het effect is echter van tijdelijke aard en de aciditeit van de zouten kan leiden tot huidirritatie. Om dit in te perken kan een combinatie van salicylzuur en aluminiumchloorhydraat gebruikt worden (Benohanian et al., 1998). Onderzoek van Darbre et al. (2011) stelt dat aluminium in antiperspiranten en deodoranten potentieel oncogeen, mutageen en carcinogeen is. Echter, dit onderzoek werd ter discussie geplaatst.
Zinkzouten Om lichaamsgeur te bestrijden kan de anti-dihydrotestosteron (anti-DHT) activiteit van zinkgluconaat, zinkglycerinaat, zinkacetaat, zinksulfaat, zinkoxide, zinkcitraat en zinkchloride gebruikt worden in combinatie met andere anti-perspiranten, natuurlijke androgeen receptor expressie inhibitoren en kwalijke geur carrier proteïnen inhibitoren (Li & Liu, 2002). Wateroplosbare zouten (zinkpidolaat, zinkpyrrolidine carboxylaat, zinkchloride, 16
LITERATUUR zinkgluconaat, zinklactaat, zinkfenolsulfaat en zinksulfaat) zijn in staat om menselijke okselgeuren te absorberen (Ascione et al., 2003). Een combinatie van zinkoxide poeder, sesquiterpeen alcoholen en volatiel silicoon levert een droge textuur deodorant op die microbiële groei verhindert door vochtabsorptie (Brahms et al., 2005).
Mangaanzouten Poreus mangaan vertoont antibacteriële activiteit (Noguchi et al., 2007). Daarenboven reduceren bivalente mangaanzouten (mangaanchloride, mangaansulfaat) lichaamsgeuren (Courbiere & Forestier, 2003).
mangaanacetaat
en
2.7.3 Geur neutraliseerders Metaaloxide silicaten (calciumsilicaat in het bijzonder) kunnen optreden als geur neutraliseerders aangezien volatiele geurstoffen en vetzuren gemakkelijk aan de oppervlakken van de partikels adsorberen. Hierdoor evaporeren minder vetzuren waardoor een minder intense lichaamsgeur wordt waargenomen (Gustafsson et al., 1999).
2.7.4 Geurabsorbeerders Door vochtabsorptie zorgen silicaten, silica en carbonaten voor een reductie in bacteriën die aanleiding geven tot lichaamsgeur. Cyclodextrines absorberen naast vocht ook geur veroorzakende moleculen (Withiam et al., 2004; Withiam et al., 2005). Polyamines gehybridiseerd met anorganische oxiden (SiO2, TiO2, Al2O3, Mg(OH)2) zijn ook in staat om geur te absorberen (Soane & Fujdala, 2005).
17
18
M ATERIALEN EN M ETHODEN
3
MATERIALEN EN METHODEN
3.1
Proefpersonen
Binnen de studie werd gewerkt met 3 proefpersonen, waarvan 2 mannen en 1 vrouw, allen gekenmerkt door een zeer onaangename okselgeur. Omwille van privacy redenen wordt naar deze patiënten verwezen als P1, P2 en P3. Alle personen waren in het bezit van de Belgische nationaliteit. Leeftijden varieerden van 24 tot 27 jaar. Allen verkeerden in uitstekende gezondheid, hadden niet af te rekenen met dermatologische aandoeningen of andere medische afwijkingen en leden niet aan huidinfecties. Voor en gedurende het onderzoek was er geen sprake van inname van antibiotica. Verder werd er geen rekening gehouden met mogelijke invloeden door eet- en hygiënegewoonten. Aan het begin van de studie werd gekozen om een willekeurige oksel te behandelen en de andere oksel als referentie te beschouwen. Behandeling 1 werd uitgevoerd op P1 en P2, behandeling 2 op alle patiënten (P1, P2 en P3) en behandeling 3 op P3. Deze studie werd goedgekeurd door het Gents Universitair Ethisch Comité met goedkeuringsnummer B670201214044. Klinisch identificatienummer van de procedure: CinicalTrials.gov NCT01581112.
3.2
Staalname van de okselmicrobiota
Staalname van de okselmicrobiota tijdens de behandelings- en opvolgingsperioden gebeurde wekelijks en indien mogelijk op dezelfde dagen en tijdstippen. Stalen werden in triplicaat genomen van beide oksels door gedurende 15 s met een steriel wattenstaafje, bevochtigd met steriel fysiologisch water, over de okselregio te strijken. Het wattenstaafje werd gedurende 20 s krachtig rondgedraaid in een steriele eppendorf gevuld met 1 mL steriel fysiologisch water om de bacteriën over te brengen. De bacteriële stalen werden vervolgens onmiddellijk ingevroren bij -20°C voor verdere DNA-extractie.
3.3
Geurbeoordeling
De okselgeur werd bekomen door middel van een wattenprop, die door de patiënten gedurende 4 uur onder de oksel werd gedragen. Daarna werd de wattenprop overgebracht in een geurloze, genummerde glazen bokaal. De bokalen werden voorgelegd aan een geurpanel van 8 tot 10 geselecteerde en gescreende geurpanelleden. Deze panelleden werden gekozen uit een grote groep vrijwilligers op basis van een voorafgaande test. Elke vrijwilliger moest drie opstellingen met telkens drie flacons doorlopen, die telkens een andere concentratie verdund afvalwater of soms een blanco bevatten. De vrijwilliger werd gevraagd om elke flacon te schudden, te ontdoen van dop en er vervolgens aan te ruiken. Op een evaluatieblad diende de persoon te noteren of ze iets roken of dachten met een blanco te maken te hebben. Als er sprake was van twijfel diende dit gemeld te worden. Desgewenst 19
M ATERIALEN EN M ETHODEN
mocht de vrijwilliger binnen elke triade de flacons herevalueren. Elke vrijwilliger doorliep deze test op drie verschillende dagen, met telkens minstens een dag tussen. Op basis van alle bevindingen werden uit de vrijwilligers zorgvuldig de panelleden gekozen. Vrijwilligers die bij de blanco aangaven iets te ruiken werden ongeschikt verklaard. Personen die extreem vatbaar of extreem ongevoelig waren voor geur werden ook uitgesloten. Er werden evenveel mannen als vrouwen geselecteerd. De panelleden waren bijgevolg vertrouwd met olfactometrische procedures en voldeden bovendien aan volgende voorwaarden: (i) ouder dan 16 jaar en bereid om de instructies op te volgen; (ii) niet roken, eten of drinken (behalve water) gedurende 30 min voor de quotering; (iii) vrij van verkoudheden, allergieën en andere infecties; (iv) geen inmenging van parfums, deodoranten, body lotions, cosmetica of eigen lichaamsgeur; (v) geen communicatie tijdens de beoordeling. De stalen werden beoordeeld op 8 geurkarakteristieken: hedonische waarde (tussen -4 en +4), intensiteit (schaal 0 tot 10), kaasachtig (schaal 0 tot 10), ammoniak (schaal 0 tot 10), zweterig (schaal 0 tot 10), muf (schaal 0 tot 10), zuur (schaal 0 tot 10) en scherpte (schaal 0 tot 10). De hedonische waarde geeft de aangenaamheid van een geur weer zoals die door het geurpanel wordt vastgesteld, waarbij de waarde ‘-4’ als ‘uiterst onaangenaam’ en de waarde ‘+4’ als ‘uiterst aangenaam’ wordt gekwalificeerd. De waarde ‘0’ drukt ‘noch aangenaam, noch onaangenaam’ uit. De intensiteit staat voor de mate waarin een geur doordringt. Dit hangt niet zozeer af van de concentratie dan wel van het soort geur, zonder daar een waardeoordeel over te geven (van Campen, 2003).
3.4
Behandeling 1: Rechtstreekse donors
Gedurende de eerste behandelingsperiode werden bacteriëngemeenschappen rechtstreeks overgebracht van donors D1 en D2 naar patiënten P1 en P2. D1, eeneiige tweelingbroer van P1 en D2, een gezonde vrouw, werden beiden zeer gunstig gequoteerd door het geurpanel. Tijdens elke behandeling werden beide oksels van de patiënt ontsmet door deze enkele minuten te deppen met 70% ethanol. De donor schraapte gedurende 15 s van beide oksels een deel van zijn bacteriëngemeenschap af met behulp van een steriel wattenstaafje. De te behandelen
oksel
van
de
patiënt
werd
vervolgens
geïnoculeerd
met
de
bacteriëngemeenschap van de donor door gedurende 1 min met dit wattenstaafje over de te behandelen okselregio te wrijven. Beide patiënten werden 3 maal behandeld in 8 dagen tijd, waarbij eerst stalen van de microbiota van de behandelde en de niet-behandelde oksel werden genomen. Daarna werd de behandeling uitgevoerd en vervolgens droegen de patiënten 4 u lang watten onder beide oksels. In de daaropvolgende 8 dagen werden nog 3 keer stalen van de okselgemeenschappen genomen waarna de patiënten 4 u lang watten onder beide oksels droegen.
20
M ATERIALEN EN M ETHODEN
3.5
Behandeling 2: Spraybehandeling
Tijdens de eerste dag van de spraybehandeling werden beide oksels van patiënten P1, P2 en P3 ontsmet met Umonium 38 zeep en vervolgens enkele minuten met ethanol gedept. Vervolgens werd op de te behandelen oksel enkele keren gespoten met een spray met daarin S. epidermidis in steriel fysiologisch water. De sprayinhoud werd verkregen door voorafgaand aan de behandeling een reincultuur van S. epidermidis uit te platen op MSA (Mannitol Salt Agar) en na isolatie een week lang op te groeien in falcon buisjes met nutrient broth bij 37°C. Deze falcon buisjes werden vervolgens gecentrifugeerd, de pellets werden behouden en in nieuwe falcon buisjes met steriel fysiologische water gebracht. Deze buisjes werden opnieuw gecentrifugeerd en de bekomen pellets werden in steriele sprays met steriel fysiologisch water gebracht. De grootteorde van de concentratie S. epidermidis in de sprays bedroeg 106 kolonievormende eenheden (kve)/mL. De patiënten werden gevraagd om de spray gedurende 1 week dagelijks ’s ochtends en ’s avonds te gebruiken. Daarna kregen de patiënten een nieuwe spray die bekomen werd op dezelfde manier als hierboven beschreven. Ook deze spray dienden ze 1 week lang 2 maal daags te gebruiken. De patiënten werden na gebruik van de sprays nog 2 weken opgevolgd. Gedurende de gehele periode werden meerdere keren per week stalen van beide okselgemeenschappen genomen en droegen de patiënten 4 u lang watten onder beide oksels om de geur te laten beoordelen door het geurpanel.
3.6
Behandeling 3: hoge concentratie opgegroeide S. epidermidis
Tijdens de eerste dag van de derde behandeling werden beide oksels van patiënt P3 eenmalig ontsmet met iso-betadine om een volledige afdoding van de bestaande microbiota te bekomen. Beide oksels werden enkele minuten met ethanol gedept. Op de te behandelen oksel van de patiënt werd vervolgens gedurende 1 min met behulp van een wattenstaafje een hoge concentratie S. epidermidis aangebracht. Deze hoge concentratie werd verkregen door voorafgaand aan de behandeling S. epidermidis uit te platen op MSA en na isolatie een week lang op te groeien in falcons met nutrient broth bij 37°C. Na centrifugatie werd de pellet overgebracht in een nieuwe falcon met steriel fysiologisch water en opnieuw gecentrifugeerd, waarna de pellet behouden en gebuikt werd voor de behandeling. Na aanbrengen van de pellet werd nog een extra hoeveelheid S. epidermidis (opgegroeid op een MSA plaat) op de te behandelen oksel aangebracht met een wattenstaafje. In een tijdspanne van 2 weken werd P3 tot 3 keer toe behandeld. Bij de eerste behandeling werd eerst een hoge concentratie S. epidermidis aangebracht, daarna werden stalen genomen van de microbiota van beide oksels, waarna de patiënt 4 u lang watten onder de oksel droeg. Bij de twee volgende behandelingen werden eerst stalen van de microbiota van beide oksels genomen, vervolgens werd een hoge concentratie S. epidermidis aangebracht, waarna de patiënt 4 u lang watten onder de oksels droegen. Daarna volgde een opvolgingsperiode van 2 weken waarbij nog 3 keer stalen van de okselgemeenschappen werden genomen en de patiënt vervolgens 4 u lang watten droegen. 21
M ATERIALEN EN M ETHODEN
3.7
DNA-extractie
DNA-extractie gebeurde volgens de methode beschreven door Rodríguez-Lázaro et al. (2004). De 2 mL eppendorf microbuisjes werden 12 min gecentrifugeerd bij 13000 rpm waarna het supernatans verwijderd werd. De pellet werd gewassen in 200 µl PBS (Phosphate Buffered Saline) 1x en opnieuw gecentrifugeerd. De bekomen pellet werd geresuspendeerd in 100 µL 6% Chelex-100 oplossing en geïncubeerd bij 56°C gedurende 20 min. Chelex-100 oplossing is een ionenuitwisselende hars die specifiek ontworpen werd voor extractie van DNA waarop naderhand PCR (Polymerase Chain Reaction) dient uitgeoefend te worden. PCR inhibitoren worden verwijderd doordat de hars bindt met contaminerende metaalionen die anders zouden zorgen voor het katalyseren van DNA afbraak. Daarna werden de stalen grondig gemengd en verder geïncubeerd bij 100°C gedurende 8 min. Vervolgens werden de stalen gemengd, 5 min afgekoeld op ijs en gecentrifugeerd bij 13000 rpm voor een periode van 12 min. Het bekomen supernatans met daarin het DNA werd onttrokken en overgebracht in 1.5 mL eppendorf microbuisjes voor bewaring bij -20°C in de diepvriezer. De Chelex oplossing zorgde ervoor dat de metaalionen, die soms in deodoranten en antiperspiranten aanwezig zijn, werden gecapteerd en geen interferentie veroorzaakten bij de PCR.
3.8
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Het benodigde volume PCR Master Mix Fermentas® werd verkregen door het aantal stalen en controles te vermenigvuldigen met 25 µL. Afhankelijk van het berekende benodigde volume werden de overeenkomstige hoeveelheden uit Tabel 5 gepipetteerd in een 2 mL tube, gebruik makend van een Fermentas® PCR kit (Fermentas International Inc., Burlington, Canada). Amplificatie van het 16S rRNA gen van de Bacteria via PCR gebeurde met behulp van de forward primer 338F (sequentie ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) en de reverse primer 518R (sequentie ATTACCGCGGCTGCTGG) (Muyzer et al., 1993; Ovreås et al., 1997). Exact 24 µL mastermix werd gepipetteerd in elk PCR eppendorf microbuisje. Om contaminatie van de mastermix na te gaan werd het eerste eppendorf microbuisje onmiddellijk gesloten, dit fungeerde als eerste negatieve controle. Daarna werd van elke staal 1 µL geëxtraheerd DNA in een eppendorf microbuisje gepipetteerd en werd dit onmiddellijk gesloten. Als tweede negatieve controle werd gedurende dit proces een eppendorf microbuisje blanco (zonder DNA) open gelaten om contaminatie gedurende de handeling na te gaan. Als positieve controle werd een gekende, positieve staal toegevoegd in een eppendorf microbuisje. Vervolgens werden de stalen in de PCR machine geplaatst en ondergingen ze volgende cycli: 1) 94°C, voor 5 min; 2) 95°C, voor 1 min; 53°C, voor 2 min (tweede stap werd 35 keer herhaald); 3) 72°C, voor 10 min. Daarna werd het toestel op 4°C gebracht tot de stalen bij -20°C in de diepvriezer werden bewaard.
22
M ATERIALEN EN M ETHODEN
Tabel 5 : Samenstelling Master Mix Fermentas® MASTERMIX 100 PCR water
200
77,25 154,5
300
400
500
600
700
800
900
1000
231,75 309
386,25 463,5
540,75
618
695,25 772,50
10X TAQ buffer +KCl - 10 MgCl2
20
30
40
50
60
70
80
90
100
MgCl2
6
12
18
24
30
36
42
48
54
60
dNTP (elk 10mM)
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Primer 1
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Primer 2
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
BSA
0,25
0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
2
2,25
2,5
Taqpolymerase
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
5
150
250
350
450
550
650
750
850
950
MASTERMIX 50 PCR water
38,63 115,88 193,13 270,38
347,63 424,88 502,13 579,38 656,63 733,88
10X TAQ buffer +KCl - 5 MgCl2
15
25
35
45
55
65
75
85
95
MgCl2
3
9
15
21
27
33
39
45
51
57
dNTP (elk 10mM )
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
Primer 1
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
Primer 2
1
3
5
7
9
11
13
15
17
19
BSA
0,125 0,375
0,625
0,875
1,125
1,375
1,625
1,875
2,125
2,375
Taqpolymerase
0,25
1,25
1,75
2,25
2,75
3,25
3,75
4,25
4,75
3.9
0,75
Agarose gel elektroforese
Op de PCR-producten werd agarose gel elektroforese toegepast. Agarose gels werden verkregen door 1 g agarose (Invitrogen, Carlsbad, VS) in 100 mL 0.5X Tris-acetaat-EDTA (TAE) buffer (AppliChem, Darmstadt, Duitsland) op te lossen door gedurende 1-2 min in de microgolf te plaatsen. Het mengsel werd afgekoeld door stromend leidingwater tot ca. 50°C waarna 2 µL ethidiumbromide werd toegevoegd. Vervolgens werd het mengsel in een gelhouder met kammen gegoten om gedurende 20 min te stollen. Na verwijdering van de kammen werd de gestolde agarose gel in het elektroforese apparaat geplaatst en werden de stalen en MassRuler™ DNA Ladder Mix (MBI Fermentas, Duitsland) geladen. Elektroforese vond plaats gedurende 20 min op 100 V waarna de gel ontwikkeld werd in de OptiGo UVtransilluminator (Isogen Life Science, Sint-Pieters-Leeuw, België). Aanwezigheid van duidelijk zichtbare banden suggereerde dat er geen aspecifieke amplificatie optrad. 23
M ATERIALEN EN M ETHODEN
3.10
Sequenering
Geïsoleerde reinculturen werden geïdentificeerd door middel van sequenering van het 16S rRNA gen. Pure kolonies werden 3 keer overgeënt op een nieuwe agar plaat opdat contaminatie uitgesloten kon worden. De reincultuur werd overgebracht in een epje met nuclease-vrij water. De bacteriële primers 63 F en 1378 R werden gebruikt voor de amplificatie van een 1315 baseparen lang fragment. Het sequeneren werd uitbesteed aan LGC Genomics, die gebruik maken van het geautomatiseerde ABI 3730 XL platform (Applied Biosystems). De bekomen sequentie werd geïdentificeerd aan de hand van een BLAST doorzoeking (Basic Local Alignment Search Tool). De geïsoleerde reinculturen werden op een DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) gel geladen samen met okselstalen van de drie patiënten om te proberen achterhalen over welke bacteriënsoorten zij beschikken (zie Figuur S1 in Bijlagen ).
3.11
Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)
Gebaseerd op het protocol van Muyzer et al. (1993) werd Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) uitgevoerd met behulp van het INGENYphorU System (Ingeny International BV, Goes, Nederland). Voor analyse van de PCR producten (180-200 bp) werden 8% polyacrylamide gels gemaakt met gradiënten lopende van 45% tot 60%. Denaturerende buffers van 0% en 60% werden gemaakt zoals beschreven in Tabel 6. Denaturerende buffer van 45% werd bekomen door menging van 18 mL 60% buffer en 6 mL 0% buffer. Een oplossing van ammoniumpersulfaat (APS) werd verkregen door 0,1 g 10% APS (Bio-Rad, Hercules, Californië, VS) in 1 mL milli-Q water op te lossen. De gereinigde glasplaten, spacers en kammen werden in de gelhouders geplaatst. De bottom gel werd bereid door bij 2 mL 60% denaturatie buffer 40 µL APS 10% en 2 µL tetramethylethyleendiamine (TEMED) (Applichem, Darmstadt, Duitsland) toe te voegen en het mengsel via een injectiespuit tussen de glasplaten te spuiten. De denaturerende gel werd gemaakt door bij 24 mL 60% buffer en 24 mL 45% buffer telkens 130 µL APS 10% en 8 µL TEMED toe te voegen, waarna beide buffers in aparte compartimenten werden gebracht. Deze compartimenten, met elkaar in verbinding via een klep, stonden op een magnetische roerder en waren aangesloten op een pomp. De roerder werd aangezet waarna gelijktijdig de klep werd opengedraaid en de pomp werd aangezet op 35. De pomp werd afgezet van zodra de gel tot ongeveer 1 cm onder de kam kwam. Daarna werd de gelhouder bedekt met aluminiumfolie om de gel minstens 2 u te laten stollen. Als laatste werd de stacking gel gemaakt door bij 5 mL 0% denaturerende buffer 5 µL TEMED en 100 µL APS 10% toe te voegen. Het mengsel werd bovenop de gel gebracht met een injectiespuit tot aan de rand van de kam. Het geheel werd bedekt met aluminiumfolie om het gedurende 15 min te laten stollen. Daarna werden de onderste schroeven van de gelhouder volledig open gedraaid en werd de spacer naar beneden geduwd waarna de kam verwijderd werd. Vervolgens werd de gelhouder in de INGENYphorU System tank geplaatst bij 60°C op een laag voltage, werden de overeenkomstige draden geconnecteerd en de stalen geladen. 24
M ATERIALEN EN M ETHODEN
Een in house merker werd toegevoegd om de verschillende gels te kunnen normaliseren en onderling met elkaar te vergelijken. Elektroforese gebeurde bij 60°C en 120 V gedurende 16 uren. Daarna werd de gelhouder uit de tank gehaald en werd de gel in een bak met 300 mL 0.5 TAE buffer overgebracht. In de ethidiumbromide kamer werd 16 µL SYBR Green I nucleïnezuur kleurstof (Eugene, Oregon, VS) toegevoegd en werd de bak goed geschud. Na 10 min werd de tray opnieuw grondig geschud. Nogmaals 10 min later werd de gel onder een SYBR Green filter lens op de OptiGo UV trans illuminator geplaatst. Foto’s werden genomen met behulp van het computerprogramma Proxima AQ-4.
Tabel 6: Compositie van de 60% en de 0% denaturatiebuffer voor 8% polyacrylamide gels. 0% Denaturatiebuffer Acrylamide (40% stock) (Bio-Rad, Hercules, Californië, VS) BisAA (2% stock) (Bio-Rad, Hercules, Californië, VS)
60% Denaturatiebuffer
10 ml
Acrylamide (40% stock) (Bio-Rad, Hercules, Californië, VS)
10 ml
2,5 ml
BisAA (2% stock) (BioRad, Hercules, Californië, VS)
2,5 ml
TAE (50x stock)
1 ml
Ureum (Sigma-Aldrich Chemie, Steinheim, Duitsland)
12,5 g
Totaal volume (met Milli-Q)
50 ml
Formamide (Applichem, Darmstadt, Duitsland)
12 ml
TAE (50x stock)
1 ml
Totaal volume (met Milli-Q)
50 ml
3.12
Analyse van de DGGE resultaten
Normalisatie en analyse van de bekomen gelpatronen gebeurde met BioNumerics software 5.10 (Applied Maths NV, Sint-Martens-Latem, België). Gedurende dit proces werden de verschillende lanen aangeduid, achtergronden afgetrokken, verschillen in intensiteit tussen de verschillende lanen gecompenseerd en banden aangeduid. Similariteitsmatrixen voor de dendogram types van de DGGE-profielen werden berekend op basis van de Jaccard correlatie coëfficiënten. Deze coëfficiënten werden omgevormd tot afstanden en gebruik makend van de Unweighted Pair Group with Aritmetic Mean (UPGMA) algoritme werden clusteringen bekomen. Op basis van Formule 1 werden de 25
M ATERIALEN EN M ETHODEN
similariteitspercentages omgerekend tot percentages van veranderingen. De matrix met veranderingspercentages werd gebruikt om Moving Window Analysis (MWA) toe te passen door het plotten van waarden van opeenvolgende geobserveerde waarden van de variabele (Marzorati et al., 2008). % verandering = 100 - %similariteit
(1)
De gelijkheid (evenness) werd bepaald aan de hand van de Gini coëfficiënt, waaruit de community organization werd gehaald. Hieruit werd de functionele organisatie (Fo) berekend, die grafisch werd weergegeven aan de hand van Pareto-Lorenz curves. Deze werden bekomen door voor elke laan de banden te rangschikken van hoog naar laag, gebaseerd op de intensiteiten. Op de x-as worden het cumulatief genormaliseerde aantal banden weergegeven, terwijl de corresponderende cumulatief genormaliseerde intensiteiten afgebeeld worden op de y-as (Wittebolle et al., 2008; Mertens et al., 2005). Op basis van de DGGE-profielen werd visueel een opsplitsing gemaakt tussen de Firmicutes, waartoe de staphylococcen behoren, en de Actinobacteria, waartoe de corynebacteriën behoren. Voor deze twee phyla werden de Gini coëfficiënten apart berekend en de Pareto-Lorenz curves apart afgebeeld om zo een beter beeld te krijgen van de invloed van de verschillende bacteriën op enerzijds staphylococcen en anderzijds corynebacteriën.
3.13
Analyse van de geurpanel resultaten
De okselgeuren van de behandelde en niet-behandelde oksels van alle patiënten werden door het geurpanel beoordeeld op verschillende sensorische variabelen. Deze beoordelingen werden onderworpen aan een uitgebreide statistische analyse in R-Studio 0.97.336. Per behandeling en per patiënt werden voor alle sensorische variabelen box-andwhisker plots gemaakt voor de behandelde en niet-behandelde oksel. Alle data (alle behandelingen, patiënten en behandelde en niet-behandelde oksel) werden beschouwd voor het vervaardigen van een pairwise scatterplot, box-and-whisker plots en Spearman en Kendall correlation heatmaps. Broncodes hiervan zijn terug te vinden in Bijlage XXVII. Voorts werden in Microsoft Excel per behandeling en per patiënt grafieken gebouwd om de gemiddelde hedonische waarde tussen de behandelde en onbehandelde oksel enerzijds en de gemiddelde intensiteit anderzijds te vergelijken gedurende verschillende behandelingsperiodes.
26
RESULTATEN
4
RESULTATEN
4.1
Behandeling 1
De eerste behandeling werd uitgevoerd om te onderzoeken of rechtstreekse microbiële transplantaties van goed-ruikende donoren met een hoog gehalte aan staphylococcen naar slecht-ruikende patiënten met een hoog gehalte aan corynebacteriën invloed hadden op de aangenaamheid van hun okselgeur. De intentie van de behandeling was het verdringen van de dominante corynebacteriën door staphylococcen. In een periode van 8 dagen werd deze behandeling 3 keer toegepast op de te behandelen oksel van P1 en P2. Daarna werden P1 en P2 nog gedurende 8 dagen opgevolgd. Gedurende de behandelings- en opvolgingsperiode werden stalen genomen van beide oksels van P1 en P2, voor analyse van de okselgemeenschap en quotering van de okselgeur.
4.1.1 Patiënt 1 (P1) Een eerste behandeling werd uitgevoerd op een eeneiige mannelijke tweeling, waarvan de ene tweelingbroer een lichaamsgeur bezat en de andere niet. Tijdens deze behandelingsperiode werden op de te behandelen oksel van patiënt P1 okselbacteriën rechtstreeks overgebracht van donor D1, diens eeneiige tweelingboer, via een steriel wattenstaafje.
Figuur 5: DGGE profielen van P1 en diens eeneiige tweelingbroer D1 voor de start van behandeling 1. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) of donor (hier D1) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. In kolom B staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel van P1 zoals gequoteerd door het geurpanel. De linkse omkadering duidt aan waar de staphylococcen gelegen zijn, de rechtse omkadering waar de corynebacteriën gesitueerd zijn.
Figuur 5 toont de DGGE profielen van P1 en D1 alvorens de start van behandeling 1. Het profiel van P1 vertoont zwakke banden van Staphylococcus, wat op een geringe aanwezigheid van dit bacteriële genus wijst. Voorts vertoont P1 veel en sterke banden van corynebacteriën wat duidt op dominantie van deze bacteriën bij P1. Hoewel diens eeneiige 27
RESULTATEN
tweelingbroer D1 ook veel banden ter hoogte van de corynebacteriën heeft, vertoont deze patiënt een zeer duidelijke dominantie van staphylococci, waaronder S. epidermidis.
Figuur 6 geeft het DGGE profiel weer van P1 voor, tijdens en na de behandelingsperiode. De eerste vier lanen tonen de microbiële gemeenschap van beide oksels in de beginsituatie, voor de start van behandeling 1. De zwakke banden in de linkse omkadering wijzen op de geringe aanwezigheid van S. epidermidis. De vele verschillende banden in de rechtse omkadering wijzen op een dominantie van corynebacteriën. Laan 5 in het DGGE profiel vertoont de microbiële gemeenschap van de behandelde oksel de dag na de eerste behandeling. Er is een duidelijke aanrijking van S. epidermidis te zien. Laan 6, de microbiële gemeenschap van de niet-behandelde oksel, vertoont geen aanrijking. Hetzelfde is ook te zien de dagen na de tweede donatie (lanen 7 tot 11). Na de derde donatie is er zelfs een aanrijking van S. epidermidis voor de niet-behandelde oksel waar te nemen (laan 13). De aanwezigheid van S. epidermidis op beide oksels blijft ook duidelijk waarneembaar gedurende de opvolgingsperiode (lanen 14 tot 17), tot 2 weken na de eerste behandeling. Daarnaast dient opgemerkt te worden dat er een band ter hoogte van de corynebacteriën verdwijnt vanaf laan 7 voor zowel behandelde als niet-behandelde oksel en niet meer terug keert.
Figuur 6:
DGGE-profiel van patiënt 1 (P1) gedurende behandeling 1. Kolom A duidt de
datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met donor 1 (D1). In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel, tenzij er die dag geen quotering gebeurde (/). De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën zich bevinden.
28
RESULTATEN
Figuur 7 toont de Pareto-Lorenz curves van de Firmicutes van P1 tijdens de eerste behandelingsperiode. Tot dit phylum behoren voornamelijk de staphylococcen. De beginsituatie, voor de start van de behandeling, wordt in de grafiek aangeduid door een accolade. Deze vier aangeduide curves liggen uiterst links en bovenaan. Vanaf de start van de behandeling liggen de curves van beide oksels enigszins meer naar rechts en naar onder. Dit wijst op een stijging van de gelijkheid, waarbij het evenwicht verschuift naar een groter aantal staphylococcen. Deze resultaten duiden aan dat de diversiteit van de staphylococcen verhoogde na de microbiële transplantatie.
Figuur 7: Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 1 (P1), gedurende de eerste behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P1 werd de linkeroksel behandeld. De curves aangeduid met een accolade staan voor de beginsituatie, voor de start van de behandeling (12 09 17 en 12 09 24). Deze curves liggen het meest naar links en naar boven. Vanaf de start van behandeling 1 tot in de opvolgingsperiode liggen de corresponderende curves voor beide oksels enigszins lager en meer naar rechts, hoewel het verschil miniem is. Behandeling vond plaats op 12 09 24, 12 09 26 en 12 10 01.
In Figuur 8 worden de Pareto-Lorenz curves met betrekking tot de Actinobacteria van P1 gedurende de eerste behandelingsperiode afgebeeld. Tot dit phylum behoren onder andere de corynebacteriën. De beginsituatie, voor de start van de behandeling, wordt in de grafiek aangeduid door een accolade. Deze vier aangeduide curves liggen rechts onderaan. Vanaf de start van de behandeling schuiven de curves van beide oksels meer naar linksboven. Dit wijst op een daling in diversiteit, minder gelijkheid en een daling van het aantal corynebacteriën. De daling van de corynebacteriën kon gelinkt worden met een daling in lichaamsgeur. 29
RESULTATEN
Figuur 8:
Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 1 (P1), gedurende de eerste
behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P1 werd de linkeroksel behandeld. De curves aangeduid met een accolade staan voor de beginsituatie, voor de start van de behandeling (12 09 17 en 12 09 24). Deze curves liggen onderaan rechts. Vanaf de start van behandeling 1 tot in de opvolgingsperiode liggen de corresponderende curves voor beide oksels meer naar links en hoger. Behandeling vond plaats op 12 09 24, 12 09 26 en 12 10 01.
Tabellen S1 en S2 (zie Bijlagen) geven de community organization en het aantal bandjes weer van respectievelijk de Firmicutes en de Actinobacteria van de behandelde en onbehandelde oksel van P1 tijdens behandeling 1. Er is geen duidelijk verschil te bemerken tussen de gemiddelden van deze waarden voor de behandelde en onbehandelde oksel. Om na te gaan of behandeling 1 tot een verandering in okselgeur leidde voor de behandelde oksel in vergelijking met de niet-behandelde oksel van P1, werd een geurpanel ingeschakeld om geurstalen van beide oksels te quoteren op verschillende sensorische variabelen. Figuren 9 en 10 geven het verschil tussen de behandelde en niet-behandelde oksel van P1 weer op basis van de gemiddelde hedonische waarde en de gemiddelde intensiteit gedurende de eerste behandelingsperiode. Vanaf de eerste behandeling (12-09-24) neemt de aangenaamheid van de okselgeur voor de behandelde oksel toe (hedonische waarde stijgt), terwijl de sterkte van de geur afneemt (intensiteit daalt). Dit kan gerelateerd worden aan de aanrijking van S. epidermidis vanaf de eerste behandeling te zien in het DGGEprofiel voorgesteld in Figuur 6 (laan 5). Na de derde behandeling (12 10 01) doet dit fenomeen zich ook voor bij de onbehandelde oksel, wat wordt vertaald in Figuur 6 (laan 13) met een aanrijking van S. epidermidis. 30
RESULTATEN
Figuur 9: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde hedonische waarde voor patiënt 1 (P1) gedurende de eerste behandelingsperiode. Behandeling vond plaats op 12-09-24, 12-09-26 en 12-10-01. Voor de behandelde oksel is er een verbetering in hedonische waarde vast te stellen vanaf de eerste behandeling. Dit verschijnsel doet zich ook voor bij de onbehandelde oksel vanaf de derde behandeling.
Figuur 10: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde intensiteit voor patiënt 1 (P1) gedurende de eerste behandelingsperiode. Behandeling vond plaats op 12-09-24, 12-09-26 en 12-10-01. Er is een verlaging in intensiteit van de okselgeur waar te nemen na de eerste behandeling voor de behandelde oksel en na de derde behandeling voor de onbehandelde oksel.
Om de verdeling van elk van de univariate zintuiglijke variabelen te achterhalen, werd gebruik gemaakt van ‘box-and-whisker’ plots, weergegeven in Figuur 11 voor P1. Betreffende de aangenaamheid van de geur blijkt hieruit dat de behandelde oksel beter 31
RESULTATEN
scoort, aangezien de mediaan hoger ligt dan voor de niet-behandelde oksel. Omgekeerd liggen de medianen van de variabelen ‘ammoniak’, ‘zweterig’, ‘muf’ en ‘zuur’ lager voor de behandelde oksel, waardoor deze oksel ook beter scoort voor genoemde variabelen. Voor de variabelen ‘intensiteit’ en ‘scherp’ kwam er geen verschil tussen beide oksels naar voor. De variabele ‘kaasachtig’ werd weinig in verband gebracht met okselgeur.
Figuur 11: ‘Box-and-whisker’ plots van behandeling 1 voor patiënt 1 (P1). Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Hoe hoger de mediaan van de hedonische waarde ligt, hoe aangenamer de geur. Voor alle andere variabelen geldt het omgekeerde verband. Gebaseerd op de medianen scoort de behandelde oksel beter voor de variabelen ‘hedonische waarde’, ammoniak’, ‘zweterig’, ‘muf’ en ‘zuur’ en is er geen verschil in beide oksels waarneembaar voor de variabelen ‘intensiteit’, ‘kaasachtig’ en ‘scherp’.
Uit bovenstaande resultaten blijkt dat voor P1 een duidelijke aanrijking van S. epidermidis en een afname van bepaalde corynebacteriën waarneembaar was als gevolg van de donaties, en dit voor zowel de behandelde als later ook voor de niet-behandelde oksel. Ook werd over het algemeen een verbetering van de okselgeur voor beide oksels vastgesteld. Er kan besloten worden dat de rechtstreekse transplantatie van okselbacteriën van D1 naar P1, een monozygotische mannelijke tweeling, succesvol was.
32
RESULTATEN
4.1.2 Patient 2 (P2) De behandeling werd ook uitgevoerd op een man met een sterke okselgeur. Tijdens deze behandelingsperiode werden op de te behandelen oksel van patiënt P2 okselbacteriën rechtstreeks overgebracht van donor D2, een vrouw met aangename lichaamsgeur waarvan de okselmicrobiota voornamelijk bestonden uit staphylococcen, via een steriel wattenstaafje. Figuur 12 toont de DGGE profielen van P2 en D2 alvorens de start van behandeling 1. Het profiel van P2 vertoont zwakke banden van Staphylococcus, wat op een geringe aanwezigheid van dit bacteriële genus wijst. Voorts vertoont het profiel veel en sterke banden van corynebacteriën, wat duidt op dominantie van deze bacteriën bij P2. Het profiel van D2 vertoont dominantie van staphylococcen.
Figuur 12:
DGGE profielen van P2 en D2 voor de start van behandeling 1. Kolom A duidt de
datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) of donor (hier D2) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. In kolom B staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel van P2 zoals gequoteerd door het geurpanel. De linkse omkadering duidt aan waar S. epidermidis gelegen is, de rechtse omkadering waar de corynebacteriën gesitueerd zijn.
Figuur 13 geeft het DGGE profiel weer van P2 voor, tijdens en na de behandelingsperiode. De eerste vier lanen tonen de microbiële gemeenschap van beide oksels in de beginsituatie, voor de start van behandeling 1. De zwakke banden in de linkse omkadering wijzen op de geringe aanwezigheid van S. epidermidis. De vele verschillende banden in de rechtse omkadering wijzen op de aanwezigheid van vele corynebacteriën. Laan 5 toont de behandelde oksel van P2 de dag na de eerste behandeling. Er is een duidelijke aanrijking van S. epidermidis en andere staphylococcen waarneembaar. Hetzelfde fenomeen is te zien de dag na de behandeling uitgevoerd op 12 10 02 (laan 11). Ondanks deze aanrijkingen blijft de dominantie van corynebacteriën duidelijk zichtbaar voor de behandelde oksel. De microbiële gemeenschap van de onbehandelde oksel ondervindt geen invloed van de aanrijkingen. Lanen 13 en 15 (3 respectievelijk 7 dagen na de laatste behandeling) getuigen dat het effect van aanrijking slechts van korte duur was.
33
RESULTATEN
Figuur 13: DGGE-profiel van patiënt 2 (P2) gedurende behandeling 1. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met donor 2 (D2). In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel, tenzij er die dag geen quotering gebeurde (/). De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën gesitueerd zijn.
Figuur S5 (zie Bijlagen) toont de Pareto-Lorenz curves van de Firmicutes van P2 tijdens de eerste behandelingsperiode. Tot de Firmicutes behoren onder andere de staphylococcen. De curves die corresponderen met de tijdstippen vooraleer behandeling werd uitgevoerd (12 09 19 en 12 09 25), behoren tot de meest rechtse en laagst gelegen curves. De curves die uiterst links en bovenaan liggen komen overeen met stalen 12 09 26 RO, 12 09 28 RO, 12 09 28 LO en 12 10 03. De DGGE-profielen van deze stalen vertonen de duidelijke aanwezigheid van S. epidermidis in grote aantallen, wat aanleiding geeft tot een lagere diversiteit en minder gelijkheid. In Figuur S6 (zie Bijlagen) worden de Pareto-Lorenz curves van de Actinobacteria van P2 weergegeven. Uit deze curves kan geen duidelijke invloed van de behandeling worden bemerkt.
Tabellen S3 en S4 (zie Bijlagen) geven de community organization en het aantal bandjes weer van respectievelijk de Firmicutes en de Actinobacteria van beide oksels van P2 gedurende behandeling 1. Er is geen duidelijk verschil waar te nemen tussen de gemiddelden van deze waarden voor de behandelde en onbehandelde oksel. Om na te gaan of behandeling 1 tot een verandering van de okselgeur leidde van de behandelde oksel in vergelijking met de niet-behandelde oksel van P2, werd een geurpanel 34
RESULTATEN
ingeschakeld om geurstalen van beide oksels te quoteren op verschillende sensorische variabelen. Figuren 14 en 15 geven het verschil in geur tussen de behandelde en niet-behandelde oksel van P2 weer gedurende de eerste behandelingsperiode voor de variabelen ‘hedonische waarde’ en ‘intensiteit’. Het geurpanel merkte geen verschil op tussen beide oksels wat betreft de hedonische waarde en de intensiteit. Noch is er voor beide oksels een stijgende of dalende trend waarneembaar voor deze variabelen.
Figuur 14:
Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en niet-
behandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde hedonische waarde voor patiënt 2 (P2) gedurende de eerste behandelingsperiode. Behandeling vond plaats op 12-09-25, 12-09-28 en 12-10-02. Er wordt geen verschil opgemerkt tussen beide okselgeuren wat betreft de gemiddelde hedonische waarde.
Figuur 15: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en niet behandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde intensiteit voor patiënt 2 (P2) gedurende de eerste behandelingsperiode. Behandeling vond plaats op 12-09-25, 12-09-28 en 12-10-02. Er wordt geen verschil opgemerkt tussen beide okselgeuren wat betreft de gemiddelde intensiteit.
35
RESULTATEN
Om de verdeling van elk van de univariate zintuiglijke variabelen te achterhalen, werd gebruik gemaakt van ‘box-and-whisker’ plots (Figuur 16). Hieruit kan worden afgeleid dat er geen verschil is tussen beide okselgeuren voor de variabelen ‘hedonische waarde’, ‘intensiteit’, ‘muf’, ‘zuur’ en ‘scherp’ bemerkt werd door het geurpanel. De behandelde oksel wordt slechts iets beter gequoteerd dan de niet-behandelde oksel voor de variabelen ‘kaasachtig’, ‘ammoniak’ en ‘zweterig’.
Figuur 16: ‘Box-and-whisker’ plots van behandeling 1 voor patiënt 2 (P2). Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Rekening houdend met de medianen is er enkel een zeer klein verschil waar te nemen tussen beide okselgeuren aangaande de variabelen ‘kaasachtig’, ‘ammoniak’ en ‘zweterig’ in het voordeel van de behandelde oksel.
Bovengenoemde resultaten geven weer dat bij P2 een aanrijking van S. epidermidis waarneembaar was voor de behandelde oksel als gevolg van overbrenging van de okselgemeenschap van D1. Deze aanrijking was echter slechts tijdelijk en had bovendien geen invloed op de dominantie van corynebacteriën. De onbehandelde oksel werd niet beïnvloed door de transplantaties. Het geurpanel merkte geen verandering wat betreft de okselgeur.
36
RESULTATEN
4.2
Behandeling 2
De tweede behandeling had als doel te onderzoeken of het gebruik van een spray die S. epidermidis bevatte invloed had op de okselgeur van slecht-ruikende patiënten met een hoog gehalte aan corynebacteriën in de okselregio. Ook werd gestreefd om de dominantie van corynebacteriën te verbreken en een dominantie van staphylococcen tot stand te brengen. Aan P1, P2 en P3 werd gevraagd om gedurende twee weken tweemaal per dag een spray te gebruiken met als inhoud S. epidermidis in steriel fysiologisch water. Vervolgens werden de
patiënten
nog
twee
weken
opgevolgd.
Gedurende
de
behandelings-
en
opvolgingsperiode werden stalen genomen van beide oksels van P1, P2 en P3, voor analyse van de okselgemeenschap en quotering van de okselgeur. De volledige DGGE-profielen van P1 en P2 gedurende behandelingsperiodes 1 en 2 kunnen teruggevonden worden in Figuren S2 en S3 (Bijlagen).
4.2.1 Patiënt 1
DGGE-profiel van patiënt 1 (P1) gedurende behandeling 2. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en dies linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met spray 1 en spray 2. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel. De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën gesitueerd zijn. Figuur 17:
Figuur 17 beeldt het DGGE-profiel van P1 af voor, tijdens en na het gebruik van beide sprays met S. epidermidis als inhoud. Behandeling met spray 1 resulteerde in een duidelijke aanrijking van deze bacterie voor de behandelde oksel (laan 3) en een duidelijke afname van de andere aanwezige species. Ook aanwenden van spray 2 (laan 5) mondde uit tot een toename in S. epidermidis voor de behandelde oksel, hoewel de andere aanwezige species 37
RESULTATEN
hierdoor niet werden verdrongen. Het effect van de aanrijking nam tijdens (laan 8) en na de behandeling (laan 12) af. De onbehandelde oksel ondervond geen invloed van de behandeling. Figuur S7 (zie Bijlagen) toont de Pareto-Lorenz curves van de Firmicutes van P1 tijdens de tweede behandelingsperiode. Tot de Firmicutes behoren onder andere de staphylococcen. Op 12 11 21 werd er gestart met het gebruik van spray 1, wat weerspiegeld wordt door de bovenaan links gelegen curve van de behandelde oksel (LO). Verder gebruik van spray 1 (tot 12 11 28) en spray 2 (12 11 28 – 12 12 05) zorgde niet voor een duidelijke verandering in ligging van de curves t.o.v. de beginsituatie (curves van 12 11 21). In Figuur S8 (zie Bijlagen) worden de Pareto-Lorenz van de Actinobacteria (waartoe de corynebacteriën behoren) van P1 tijdens de eerste behandelingsperiode afgebeeld. De curves van 12 11 21 refereren naar de beginsituatie. De invloed die de start van de behandeling met spray 1 op de Actinobacteria van P1 had wordt weergegeven door de ligging van curve 12 11 23 LO linksboven. Dit wijst op een daling van het aantal Actinobacteria (waartoe de corynebacteriën behoren), minder gelijkheid en een daling in diversiteit. Dit effect is slechts tijdelijk, de curve van 12 11 28 LO ligt onderaan rechts. Het gebruik van spray 2 (12 11 28 – 12 12 05) had, t.o.v. de referentiecurves, geen significante invloed op de ligging van curves 12 12 30 en 12 12 07. Tabellen S5 en S6 (zie Bijlagen) geven de community organization en het aantal bandjes weer van respectievelijk de Firmicutes en de Actinobacteria van de behandelde en onbehandelde oksel van P1 gedurende behandeling 2. Er is geen duidelijk merkbaar tussen de gemiddelden van deze waarden voor de behandelde en onbehandelde oksel. Figuren 18 en 19 geven het verschil weer tussen de behandelde en niet-behandelde oksel op basis van de gemiddelde hedonische waarde en intensiteit gedurende de eerste behandelingsperiode voor P1. Gedurende de behandeling met spray 1 (12-11-23) werd de geur van de behandelde oksel aangenamer beoordeeld. Dit was echter ook het geval nog voor de start van de behandeling (12-11-21). Gebruik van spray 2 resulteerde niet in noemenswaardig verschil tussen beide oksels wat betreft hedonische waarde en intensiteit. Het geurpanel beoordeelde de behandelde oksel beduidend beter voor zowel de aangenaamheid van de geur als de intensiteit op 12-11-21, 12-11-23 en 12 12 13. Indien het DGGE-profiel van P1 (Figuur 17) geraadpleegd wordt op deze data (lanen 1, 3 en 10) dan is duidelijk dat op de twee laatst genoemde data S. epidermidis in hoge mate vertegenwoordigd werd, terwijl er nauwelijks sprake was van corynebacteriën.
38
RESULTATEN
Figuur 18: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de hedonische waarde voor patiënt 1 (P1) gedurende de tweede behandelingsperiode. Behandeling vond tweemaal daags plaats met spray 1 van 12-11-23 t.e.m. 1211-28 en met spray 2 van 12-11-28 t.e.m. 12-12-05. Bij de start van gebruik van spray 1 (12-11-23) werd de geur van de behandelde oksel aangenamer beoordeeld. Dit was echter ook al zo voor de start van de behandeling (12-11-21). Het aanwenden van spray 2 resulteerde niet in een noemenswaardig verschil tussen beide oksels wat betreft de hedonische waarde.
Figuur 19: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde intensiteit voor patiënt 1 (P1) gedurende de tweede behandelingsperiode. Behandeling vond tweemaal daags plaats met spray 1 van 12-11-23 t.e.m. 12-11-28 en met spray 2 van 12-11-28 t.e.m. 12-12-05. Tijdens het gebruik van spray 1 (12-1123) werd de intensiteit van de behandelde oksel lager beoordeeld. Dit was echter ook al zo voor de start van de behandeling (12-11-21). Het aanwenden van spray 2 resulteerde niet in een duidelijk verschil tussen beide oksels inzake de intensiteit.
39
RESULTATEN
Om de verdeling van elk van de univariate zintuiglijke variabelen te achterhalen, werd gebruik gemaakt van ‘box-and-whisker’ plots. Uit de boxplot van P1 (Figuur 20) blijkt dat, volgens de quoteringen van het geurpanel, de tweede behandeling nagenoeg geen effect had op de hedonische waarde. Wederom werd de variabele ‘kaasachtig’ weinig in verband gebracht met okselgeur. Voor alle andere sensorische variabelen nemen de medianen corresponderend met de behandelde oksel lagere waarden aan dan de medianen gerelateerd aan de niet-behandelde oksel: de okselgeur van de behandelde oksel wordt beter bevonden voor de beschouwde variabelen.
Figuur 20: ‘Box-and-whisker’ plots van behandeling 2 voor patiënt 1 (P1). Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Bij het beschouwen van de medianen blijkt dat de behandelde oksel duidelijk beter beoordeeld wordt op de variabelen ‘intensiteit’, ‘ammoniak’, ‘zweterig’, ‘muf’, ‘zuur’ en ‘scherp’. Er is echter nagenoeg geen verschil te rapporteren tussen beide oksels wat betreft de hedonische waarde.
Uit bovengemelde resultaten kan geconcludeerd worden dat het gebruik van zowel spray 1 als spray 2 voor een tijdelijke aanrijking van S. epidermidis zorgde voor de behandelde oksel van P1. Deze aanrijking had mogelijkerwijs een tijdelijke onderdrukking van corynebacteriën tot gevolg. De behandeling had geen invloed op de microbiële samenstelling van de onbehandelde oksel. De behandelde oksel werd voor enkele sensorische variabelen duidelijk beter beoordeeld dan de onbehandelde oksel.
40
RESULTATEN
4.2.2 Patiënt 2 Figuur 21 toont het DGGE-profiel van P2 voor, tijdens en na het gebruik van beide sprays met daarin S. epidermidis. Het gebruik van spray 1 leidde niet tot een duidelijke aanrijking van deze bacterie. Het is opmerkelijk dat gedurende de behandeling met spray 1 de aanwezigheid van S. epidermidis vooral duidelijk waarneembaar was voor de onbehandelde oksel. Hoewel de inhoud van beide sprays gelijkwaardig was, kon bij het aanwenden van spray 2 geen aanwezigheid van S. epidermidis geconstateerd worden.
Figuur 21: DGGE-profiel van patiënt 2 (P2) gedurende behandeling 2. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met spray 1 en spray 2. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel. De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën gesitueerd zijn.
De Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 2, gedurende de tweede behandelingsperiode, zijn terug te vinden in Figuur S9 (zie Bijlagen). De curves van 12 11 21 geven de situatie voor de start van de behandeling weer. Behandeling vond plaats met spray 1 (12 11 23 – 12 11 28) of spray 2 (12 11 28 – 12 12 05). Overeenkomstig met de DGGEprofielen van 12 11 23 LO, 12 11 28 LO en 12 11 28 RO, die een duidelijke aanwezigheid van staphylococcen tonen, liggen de corresponderende curves onderaan rechts. De staphylococcen konden de gemeenschap niet domineren en zorgden enkel voor een toevoeging van extra banden, naast de bestaande microbiële gemeenschap. Dit zorgde ervoor dat een rijkere en meer gelijke gemeenschap bekomen werd. De Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 2 zijn afgebeeld in Figuur S10 (zie Bijlagen). Uit deze grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waargenomen worden. 41
RESULTATEN
Tabellen S7 en S8 (zie Bijlagen) geven de community organization en het aantal bandjes weer van respectievelijk de Firmicutes en de Actinobacteria van beide oksels van P2 gedurende behandeling 2. Er is geen duidelijk waar te nemen tussen de gemiddelden van deze waarden voor beide oksels.
Figuur 22: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de hedonische voor patiënt 2 (P2) gedurende de tweede behandelingsperiode. Behandeling vond tweemaal daags plaats met spray 1 van 12-11-23 t.e.m. 1211-28 en met spray 2 van 12-11-28 t.e.m. 12-12-05. Er werd geen noemenswaardige verbetering vastgesteld in hedonische waarde van de okselgeur.
Figuur 23: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde intensiteit voor patiënt 2 (P2) gedurende de tweede behandelingsperiode. Behandeling vond tweemaal daags plaats met spray 1 van 12-11-23 t.e.m. 12-11-28 en met spray 2 van 12-11-28 t.e.m. 12-12-05. Er werd geen noemenswaardige verbetering vastgesteld inzake de intensiteit van de okselgeur.
42
RESULTATEN
Om na te gaan of behandeling 2 tot een verandering in okselgeur leidde van de behandelde oksel in vergelijking met de niet-behandelde oksel van P2, werd een geurpanel ingeschakeld om geurstalen van beide oksels te quoteren op verschillende sensorische variabelen. Figuren 22 en 23 geven het verschil tussen de behandelde en niet-behandelde oksel weer op basis van de gemiddelde hedonische waarde en gemiddelde intensiteit gedurende de tweede behandelingsperiode voor P2. In de periode van het gebruik van spray 1 (12-11-23 t.e.m. 12-11-28) daalt in vergelijking met de onbehandelde oksel de aangenaamheid van de geur en neemt de intensiteit toe van de behandelde oksel. Het aanwenden van spray 2 (1211-28 t.e.m. 12-12-05) vertoont voor geen van beide sensorische variabelen een duidelijke trend. Om de verdeling van elk van de univariate zintuiglijke variabelen te achterhalen, werd gebruik gemaakt van ‘box-and-whisker’ plots, afgebeeld in Figuur 24 voor patiënt P2. Gedurende het verloop van de tweede behandeling nam het geurpanel weinig verschil waar in okselgeur voor beide oksels van P2. Er is enkel een verschil te merken in de variabele ‘ammoniak’, die iets slechter gequoteerd wordt voor de behandelde oksel, en een verschil in de variabele ‘zweterig’, waarbij de behandelde oksel beter scoort.
Figuur 24: ‘Box-and-whisker’ plots van behandeling 2 voor patiënt 2 (P2). Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Rekening houdend met de medianen scoort de behandelde oksel beter voor de variabele ‘zweterig’ doch iets slechter voor de variabele ‘ammoniak’. Voor de overige variabelen werd geen verschil bemerkt.
43
RESULTATEN
De aangehaalde resultaten leidden tot de constatering dat gebruik van spray 1 niet tot een duidelijke aanrijking van S. epidermidis zorgde en geen beduidende geurverandering teweeg bracht bij P2. Gedurende het gebruik van spray 2 verdween de aanwezigheid van S. epidermidis en ook hier werd evenmin een invloed op de geur vastgesteld.
4.2.3 Patiënt 3 (P3) Figuur 25 toont het DGGE-profiel van P3 voor, tijdens en na de behandeling met spray 1 en spray 2. Op basis van deze figuur kan gesteld worden dat noch spray 1, noch spray 2 leidde tot een verandering in de microbiële okselcompositie. Figuur S11 (zie Bijlagen) geeft de Pareto-Lorenz curves weer voor de Firmicutes van patiënt 3 (P3), gedurende de tweede behandelingsperiode. De curves van 12 11 21 geven de situatie voor de start van de behandeling weer. Behandeling vond plaats met spray 1 (12 11 23 – 12 11 28) of spray 2 (12 11 28 – 12 12 05). Uit deze figuur kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Firmicutes waargenomen worden.
Figuur 25: DGGE-profiel van patiënt 3 (P3) gedurende behandeling 2. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met spray 1 of spray 2. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel. De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën gesitueerd zijn.
In Figuur S12 (zie Bijlagen) worden de Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 3 (P3), afgebeeld (zie Bijlagen). Ook uit deze grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waargenomen worden. Tabellen S9 en S10 (zie Bijlagen) geven de community organization en het aantal bandjes weer van respectievelijk de Firmicutes en de Actinobacteria van beide oksels van P3 44
RESULTATEN
gedurende de tweede behandeling. Er is geen duidelijk merkbaar tussen de gemiddelden van deze waarden voor de behandelde en onbehandelde oksel. Om na te gaan of behandeling 2 tot een verandering in okselgeur leidde van de behandelde oksel in vergelijking met de niet-behandelde oksel van P3, werd een geurpanel ingeschakeld om geurstalen van beide oksels te quoteren op verschillende sensorische variabelen. Figuren 26 en 27 geven het verschil tussen de behandelde en niet-behandelde oksel weer op basis van de gemiddelde hedonische waarde en gemiddelde intensiteit gedurende de tweede behandelingsperiode voor P2. Enkel bij de start van de behandeling met spray 1 (1211-21 t.e.m. 12-11-23) werd de behandelde oksel beter gequoteerd aangaande de hedonische waarde. Ook de intensiteit werd gedurende die periode het laagst gequoteerd voor de behandelde oksel, hoewel deze steeds lager bleef dan de intensiteit van de onbehandelde oksel.
Figuur 26: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de hedonische waarde voor patiënt 3 (P3) gedurende de tweede behandelingsperiode. Behandeling vond tweemaal daags plaats met spray 1 van 12-11-21 t.e.m. 1211-28 en met spray 2 van 12-11-28 t.e.m. 12-12-05. Bij aanvang van de behandeling met spray 1 (1211-21 t.e.m. 12-11-23) werd de behandelde oksel beter gequoteerd wat betreft de hedonische waarde. Het verdere gebruik van deze spray en het gebruik van spray 2 leidden tot enigszins slechtere quotaties voor de behandelde oksel in vergelijking met de onbehandelde oksel.
45
RESULTATEN
Figuur 27: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde intensiteit voor patiënt 3 (P3) gedurende de tweede behandelingsperiode. Behandeling vond tweemaal daags plaats met spray 1 van 12-11-21 t.e.m. 12-11-28 en met spray 2 van 12-11-28 t.e.m. 12-12-05. Bij aanvang van de behandeling met spray 1 werd de intensiteit van de behandelde oksel zeer laag bevonden. Verder gebruik van spray 1 en het aanwenden van spray 2 leidden tot hogere intensiteiten. De intensiteit van de niet-behandelde oksel werd steeds hoger gequoteerd dan de intensiteit van de behandelde oksel.
Figuur 28: ‘Box-and-whisker’ plots van behandeling 2 voor patiënt 3 (P3). Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Bij het bestuderen van de medianen worden enkel voor de variabelen ‘ammoniak’, ‘zweterig’ en ‘zuur’ kleine verschil waargenomen, waarbij de behandelde oksel telkens beter scoorde.
46
RESULTATEN
Om de verdeling van elk van de univariate zintuiglijke variabelen te achterhalen, werd gebruik gemaakt van ‘box-and-whisker’ plots, weergegeven in Figuur 28 voor patiënt P3. Deze geeft aan dat het geurpanel bij P3 slechts een miniem verschil in okselgeur bemerkte voor de drie sensorische variabelen ‘ammoniak, ‘zweterig’ en ‘zuur’. Deze parameters werden beter gequoteerd voor de behandelde oksel. Bovenstaande resultaten leidden tot de conclusie dat het gebruik van sprays met daarin S. epidermidis noch de samenstelling van de okselmicrobiota, noch de okselgeur van P3 beïnvloedden.
4.3
Behandeling 3
Deze behandeling had als intentie na te gaan of transplantaties van hoge concentraties aan S. epidermidis een invloed hadden op de okselgeur van slecht-ruikende patiënten en of deze tot een verschuiving zouden leiden van een dominantie van corynebacteriën naar een dominantie van staphylococcen. In een tijdspanne van 2 weken werd op de te behandelen oksel van P3 tot 3 keer toe een hoge concentratie van opgegroeide S. epidermidis met een steriel wattenstaafje aangebracht. P3 werd daarna nog 2 weken opgevolgd. Gedurende de behandelings- en opvolgingsperiode werden stalen genomen van beide oksels P3 voor analyse van de okselgemeenschap en quotering van de okselgeur. Het volledige DGGE-profiel van P1 gedurende behandelingsperiodes 2 en 3 kan teruggevonden worden in Figuur S4 (Bijlagen).
4.3.1 Patiënt 3 Figuur 29 geeft het DGGE profiel weer van P3 tijdens en na de behandelingsperiode. Laan 2 toont een duidelijke aanrijking met S. epidermidis voor de behandelde oksel na de eerste behandeling. Deze aanrijking verzwakt echter naarmate de tijd vordert, zoals blijkt uit lanen 4 en 6 (2 en 7 dagen na de eerste behandeling).Uit de staal genomen 2 dagen na de tweede behandeling (laan 8) kan geen aanrijking worden waargenomen. Laan 12, de dag na de derde behandeling (laan 12), vertoont opnieuw een aanrijking met S. epidermidis. Ook dit fenomeen verdwijnt na verloop van tijd (lanen 14, 16 en 18). Op basis van het DGGE-profiel kan geconcludeerd worden dat op de dagen waarbij een duidelijke aanrijking van S. epidermidis te zien is, de intensiteit van de banden van de corynebacteriën zwakker is. De behandelingen hadden geen effect op de microbiële samenstelling van de onbehandelde oksel (alle oneven lanen).
47
RESULTATEN
Figuur 29: DGGE-profiel van patiënt 3 (P3) gedurende behandeling 3. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met een hoge concentratie S. epidermidis. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel, tenzij er die dag geen quotering gebeurde (/). De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën gesitueerd zijn.
De Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 3 (P3) gedurende de derde behandelingsperiode zijn terug te vinden in Figuur S13 (zie Bijlagen). Behandeling vond plaats op 13-03-06, 13-03-13 en 13-03-20. De curve corresponderend met de eerste dag van behandeling situeert zich bovenaan links, wat kan wijzen op een ongelijke gemeenschap met vooral staphylococcen (zoals ook te zien op het DGGE-profiel). De curves overeenkomstig met de andere twee dagen van behandeling liggen meer rechts onderaan, wat een meer gelijk verdeelde gemeenschap voorstelt. Op die dagen kon de gemeenschap zich wellicht sneller aanpassen en konden de aangebrachte staphyloccen zich moeilijker nestelen of uitgroeien. Uit de figuur kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Firmicutes vastgesteld worden. Figuur S14 (zie Bijlagen) beeldt de Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 3 (P3) af. Uit de grafiek is het niet mogelijk een duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waar te nemen. Tabellen S11 en S12 (zie Bijlagen) geven de community organization en het aantal bandjes weer van respectievelijk de Firmicutes en de Actinobacteria van de behandelde en onbehandelde oksel van P3 gedurende de derde behandeling. Er is geen duidelijk merkbaar tussen de gemiddelden van deze waarden voor beide oksels.
48
RESULTATEN
Om na te gaan of behandeling 3 tot een verandering in okselgeur leidde van de behandelde oksel in vergelijking met de niet-behandelde oksel van P3, werd een geurpanel ingeschakeld om geurstalen van beide oksels te quoteren op verschillende sensorische variabelen.
Figuur 30: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de hedonische voor patiënt 3 (P3) gedurende de derde behandelingsperiode. Behandeling vond plaats op 13-03-06, 13-03-13 en 13-03-20. Er werd door het geurpanel geen beduidend verschil tussen beide okselgeuren opgemerkt inzake de hedonische waarde.
Figuur 31: Grafiek met het verschil in verloop in de tijd voor de behandelde (B) en nietbehandelde (NB) oksel inzake de gemiddelde intensiteit voor patiënt 3 (P3) gedurende de derde behandelingsperiode. Behandeling vond plaats op 13-03-06, 13-03-13 en 13-03-20. Er werd door het geurpanel geen beduidend verschil waargenomen tussen beide okselgeuren inzake de variabele intensiteit.
49
RESULTATEN
Figuren 30 en 31 geven het verschil tussen de behandelde en niet-behandelde oksel weer op basis van de gemiddelde hedonische waarde en gemiddelde intensiteit gedurende behandeling 3 voor P3. Uit de quoteringen van het geurpanel bleek dat er in deze periode geen verschil werd opgemerkt tussen beide oksels wat betreft de hedonische waarde en de intensiteit. Uit de boxplots van Figuur 32 kan worden afgeleid dat het geurpanel wat betreft de derde behandelingsperiode geen onderscheid maakt tussen de geur van beide oksels van P3 aangaande de variabelen ‘hedonische waarde’, ‘muf’ en ‘scherp’ bij het beschouwen van de medianen. De behandelde oksel resulteert in een betere score voor de variabele ‘zweterig’, maar scoort slechter voor de variabelen ‘intensiteit’, ‘kaasachtig’, ‘ammoniak’ en ‘zuur’.
Figuur 32: ‘Box-and-whisker’ plots van behandeling 3 voor patiënt 3 (P3). Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Bij het beschouwen van de medianen scoort de behandelde oksel iets beter voor de variabele ‘zweterig’, doch ietwat slechter voor de variabelen ‘intensiteit’, ‘kaasachtig’, ‘ammoniak’ en ‘zuur’. Voor de overige parameters werd er geen verschil opgetekend.
Uit de resultaten aangaande patiënt 3 blijkt dat behandeling 3 zorgde voor tijdelijke aanrijkingen met S. epidermidis, waarbij de intensiteit van de banden van de corynebacteriën verzwakte. Dit geldt enkel voor de behandelde oksel, de onbehandelde oksel werd hierbij niet beïnvloed. Op basis van de bevindingen van het geurpanel kan geconcludeerd worden dat de aanrijkingen geen significante invloed hadden op de okselgeur van P3.
50
RESULTATEN
4.4
Moving Window Analysis
De Moving Window Analysis, berekend voor beide oksels van P1 gedurende beide behandelingsperioden, wordt afgebeeld in Figuur 33. Gedurende de eerste periode (microbiële transplantatie vond plaats in tijdsintervallen 2, 4 en 5) lijkt de verandering van de okselmicrobiota van de onbehandelde oksel sterk op deze van de onbehandelde oksel, maar dan steeds met 1 tijdsinterval vertraging. Dit stemt overeen met het DGGE-profiel van P1 (zie Figuur 6), waarbij na verloop van tijd ook de onbehandelde oksel een aanrijking van S. epidermidis vertoonde. Het gebruik van de twee sprays (tijdsinterval 9 en 10) zorgde niet voor een duidelijk verschil tussen beide oksels inzake de microbiota.
Figuur 33: Moving Window Analysis (MWA) van beide oksels van patiënt 1. De grafiek geeft de verandering in de bacteriële okselgemeenschap weer (uitgedrukt in %) gedurende behandeling 1 en 2 voor de behandelde (B) en onbehandelde (NB) oksel, voor opeenvolgende tijdstippen van staalname. De tijdsintervallen worden verduidelijkt in de rechtse lijst. De drie eerste verticale strepen geven de tijdsintervallen weer waarin een bacteriële transplantatie werd uitgevoerd, de twee laatste strepen duiden de tijdsintervallen aan waarin spraygebruik plaatsvond.
Figuur 34 toont de Moving Window Analysis voor beide oksels van patiënt 2, voor zowel de eerste als de tweede behandeling. Tijdens het uitvoeren van microbiële transplantaties (tijdsinterval 1, 4 en 8) vertoonden beide oksels dezelfde trend qua verandering. De pieken van de behandelde oksel ter hoogte van tijdsinterval 4 en van de onbehandelde oksel bij tijdsinterval 5 kunnen verklaard worden als de bijhorende DGGE-profielen (lanen 5 en 7 en lanen 8 en 12 in Figuur 13) geanalyseerd worden. Voor, tijdens (tijdsinterval 10 en 11) en na spraygebruik vertonen beide oksels een groot verschil, waarbij beiden tegengesteld een grote simulariteit of verandering vertonen. De piek van NB ter hoogte van tijdsinterval komt overeen met wat de overeenkomstige DGGE-profielen (lanen 13 en 15 in Figuur 21) vertonen. Gedurende beide behandelingsperiodes vertonen beide oksels veel verandering doorheen de tijd.
51
RESULTATEN
Figuur 34: Moving Window Analysis (MWA) van beide oksels van patiënt 2. De grafiek geeft de verandering in de bacteriële okselgemeenschap weer (uitgedrukt in %) voor de behandelde (B) en onbehandelde (NB) oksel gedurende behandeling 1 en 2, voor opeenvolgende tijdstippen van staalname. De tijdsintervallen worden verduidelijkt in de rechtse lijst. De drie eerste verticale strepen geven de tijdsintervallen weer waarin een bacteriële transplantatie werd uitgevoerd, de twee laatste strepen duiden de tijdsintervallen aan waarin spraygebruik plaatsvond.
Figuur 35: Moving Window Analysis (MWA) van beide oksels van patiënt 3. De grafiek geeft de verandering in de bacteriële okselgemeenschap weer (uitgedrukt in %) voor de behandelde (B) en onbehandelde (NB) oksel gedurende behandeling 2 en 3, voor opeenvolgende tijdstippen van staalname. De tijdsintervallen worden verduidelijkt in de rechtse lijst. De twee eerste verticale strepen duiden de tijdsintervallen aan waarin spraygebruik plaatsvond, de drie laatste wanneer een hoge concentratie S. epidermidis werd aangebracht.
In Figuur 35 wordt de Moving Window Analysis voor beide oksels van patiënt 3 afgebeeld, en dit voor zowel de eerste als de tweede behandelingsperiode. Beide oksels vertonen gedurende de twee periodes steeds dezelfde trend qua verandering in samenstelling van de microbiota, behalve voor tijdsinterval 2, waarin spray 1 gebruikt werd. In de tijdsintervallen waarin voor de tweede (tijdsinterval 9) en derde (tijdsinterval 11) keer een hoge concentratie 52
RESULTATEN
S. epidermidis op de oksel word gebracht, vertonen de microbiële gemeenschappen van beide oksels meer simulariteit.
4.5
Geurpanel: verkenning van de data
Er werden 3 verschillende behandelingen op patiënten uitgevoerd met als doel de okselgeur te verbeteren en de dominantie van corynebacteriën te verbreken. Om dit eerste na te gaan werd beroep gedaan op een geurpanel, dat watten, gedragen door de patiënten, moest beoordelen op verschillende geurkarakteristieken. Om een beter beeld te krijgen van de werking en de bevindingen van het geurpanel werden àlle zintuiglijke data (van de 3 behandelingen, alle patiënten en zowel de behandelde als de niet behandelde oksel) verkend door het uitvoeren van een pairwise scatterplot (Figuur 36), een Pearson en een Kendall correlatie analyse. Voorts werden voor elke behandeling ‘boxand-whisker’ plots uitgewerkt, door het beschouwen van de data van alle patiënten voor beide oksels (zie Figuren 37, 38 en 39).
4.5.1
Pairwise scatterplot
Figuur 36: Pairwise scatterplot van de ruwe numerieke data van de ganse dataset. Hiervoor werden alle zintuiglijke data (3 behandelingen, alle patiënten en zowel de behandelde als de niet-behandelde oksel) beschouwd.
53
RESULTATEN
Uit de pairwise scatterplot in Figuur 36 is het duidelijk dat, ondanks dat er enkele (semi-) lineaire relaties kunnen geobserveerd worden, een grote hoeveelheid ‘ruis’ in de data een duidelijke inschatting van de interacties verhindert.
4.5.2 Box-and-whisker plots Om de verdeling van elk van de univariate zintuiglijke variabelen na te gaan, werden per behandeling box-and-whisker plots opgesteld. Deze werden bekomen door per behandeling alle quoteringen van het geurpanel (voor beide oksels, van alle patiënten) in rekening te brengen. Uit Figuren 37, 38 en 39 blijkt dat het moeilijk is om op basis van de zintuiglijke variabelen een onderscheid te maken tussen de behandelde en de niet-behandelde oksel. Uit de boxplots voor behandeling 1, weergegeven in Figuur 37, blijkt bij het beschouwen van de medianen dat het geurpanel enkel een verschil in okselgeur opmerkte tussen de behandelde en niet behandelde oksels voor de variabelen ‘zweterig’ en ‘ammoniak’.
Figuur 37: Box-and-whisker plots voor behandeling 1. Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Gelet op de medianen kan er enkel een verschil in okselgeur tussen behandelde en niet-behandelde oksel geobserveerd worden voor de variabelen ‘ammoniak’ en ‘zweterig’.
54
RESULTATEN
De boxplots voor behandeling 2 worden getoond in Figuur 38. Deze geven weer dat het geurpanel de behandelde okselgeur beter quoteerde op de variabelen ‘hedonische waarde’, ‘scherp’, ‘zweterig’, ‘muf’ en ‘intensiteit’. Er werd geen verschil tussen beide okselgeuren gemerkt wat betreft de variabelen ‘zuur’ en ‘kaasachtig’.
Figuur 38: Box-and-whisker plots voor behandeling 2. Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Bij het bestuderen van de medianen kan een verschil tussen de okselgeur van de behandelde en niet-behandelde oksel geobserveerd worden voor de variabelen ‘scherp’, ‘zweterig’, ‘muf’, ‘hedonische waarde’ en ‘intensiteit’.
De boxplots weergegeven in Figuur 39 omschrijven de verdeling van de zintuiglijke variabelen voor behandeling 3. Bij het in acht nemen van de medianen kunnen verschillen opgemerkt worden voor de variabelen ‘zuur’, ‘ammoniak’, ‘zweterig’ , ‘intensiteit’ en ‘kaasachtig’. Van deze variabelen beoordeelde het geurpanel de behandelde oksel enkel beter voor de variabele ‘zweterig’
55
RESULTATEN
Figuur 39: ‘Box-and-whisker’ plots voor behandeling 3. Alle variabele scores werden herschaald naar corresponderende waarden tussen 0 en 1. Het geurpanel merkte een verschil in okselgeur op voor de behandelde en niet-behandelde oksel voor de variabelen ‘zuur’, ‘ammoniak’, ‘zweterig’, ‘intensiteit’ en ‘kaasachtig’. De behandelde oksel scoorde enkel beter voor de variabele ‘zweterig’.
4.5.3 Correlation heatmaps Zowel de correlation heatmap van Spearman als die van Kendall uit Figuren 40 en 41 geven aan dat alle geurkarakteristieken omgekeerd gecorreleerd zijn met de hedonische waarde. Afhankelijk van de gebruikte methode zijn ofwel de intensiteit (Spearman; -0.733) ofwel de scherpheid (Kendall; -0.624) het meest omgekeerd gecorreleerd met de hedonische waarde. Een duidelijk recht evenredig verband kan waargenomen worden tussen intensiteit en scherpheid (Spearman; 0.809, Kendall; 0.691), tussen zweterigheid en scherpheid (Spearman; 0.742, Kendall; 0.651) en intensiteit en zweterigheid (Spearman; 0.707, Kendall; 0.588). Beide methodes duiden aan dat kaasachtigheid slechts een zwakke correlatie met alle andere geurkarakteristieken heeft.
56
RESULTATEN
Figuur 40::
Correlation heatmap van de absolute waarden van alle data met de Spearmans ρ
klasse correlatiecoëfficiënt. Ook worden voor elke paarsgewijze vergelijking de werkelijke waarden getoond.
Figuur 41: Correlation heatmap van de absolute waarden van alle data met de Kendalls τ klasse correlatiecoëfficiënt. Ook worden voor elke paarsgewijze vergelijking de werkelijke waarden getoond.
57
58
DISCUSSIE
5
DISCUSSIE
In deze studie werd getracht te onderzoeken of microbiële transplantaties van goed-ruikende donoren met een hoog gehalte aan staphylococcen enerzijds en bacteriotherapie met Staphylococcus epidermidis via verschillende behandelingswijzen anderzijds een invloed hadden op de aangenaamheid van de okselgeur van patiënten waarvan de okselregio gedomineerd werd door corynebacteriën. De okselbacteriëngemeenschap kent immers doorgaans een dominantie van ofwel staphylococcen ofwel corynebacteriën, waarbij het merendeel van laatstgenoemden zorgen voor een onaangename okselgeur (Taylor et al., 2003). Er werd getracht om de dominantie van deze corynebacteriën te doorbreken.
5.1 In
Bacteriële transplantatie tussen verwanten vs. niet-verwanten deze
thesis
werd
voor
het
eerst
een
rechtstreekse
transplantatie
van
de
okselgemeenschap uitgeprobeerd van goed-ruikende donoren naar patiënten met een onaangename okselgeur. In een periode van 8 dagen werden de patiënten drie keer behandeld. Dezelfde oksel werd telkens opnieuw behandeld, zodat de andere oksel als referentie kon fungeren. Op de oksel van een eerste mannelijke patiënt P1, waarvan de gemeenschap gedomineerd was door corynebacteriën, werd de microbiële okselgemeenschap van zijn monozygotische tweelingbroer aangebracht, die een dominantie van staphylococcen kende. Er werd een duidelijke verrijking van S. epidermidis opgemerkt, gepaard gaande met een duidelijke afname van bepaalde corynebacteriën. Zowel de rijkheid als de gelijkheid van de corynebacteriën daalden aanzienlijk, terwijl het aandeel Firmicutes duidelijk steeg en een opkomende dominantie van S. epidermidis te observeren was. Na de derde donatie trad dit verschijnsel ook op bij de onbehandelde oksel. In overeenkomst hiermee bemerkte het geurpanel een verbetering van de okselgeur van beide oksels. De okselmicrobiota van een vrouw, die vooral bestond uit S. epidermidis, werd overgebracht op de oksel van een tweede mannelijke patiënt P2, met dominantie van corynebacteriën. Donor en patiënt waren in dit geval niet verwant. Op het moment van donatie en één tot twee dagen hierop volgend werd telkens een verrijking van S. epidermidis geobserveerd voor de behandelde oksel. Deze verrijking was echter van tijdelijke aard en had geen invloed op de dominantie van corynebacteriën. De onbehandelde oksel werd niet beïnvloed door de transplantaties. Het geurpanel merkte ook geen verandering op wat betreft de okselgeur. De bacteriële transplantatie werd uitgevoerd tussen twee verwante personen en tussen twee niet-verwante personen. Wat betreft fecale bacteriotherapie worden individuen die intiem fysiek contact met de ontvanger hebben gehad beschouwd als meest geschikte donors. Hierbij wordt eerst de voorkeur gegeven aan de partner van de patiënt, daarna volgt een familielid en tenslotte elk gezond, niet-verwant individu (Aas et al., 2003). 59
DISCUSSIE
5.2
Bacteriotherapie met een S. epidermidis spray
In een volgende fase werd getracht een aanrijking van S. epidermidis te bekomen door het rechtstreeks aanbrengen van een cultuur van S. epidermidis. Tweemaal daags werd een spray met S. epidermidis gebruikt door P1, P2 en een derde, vrouwelijke patiënte P3 op de oksel in en dit gedurende 2 weken. De spray werd steeds op dezelfde oksel aangebracht, zodat de andere oksel als referentie kon dienen. Zowel spray 1 als spray 2 zorgden voor een tijdelijke verrijking van S. epidermidis voor de behandelde oksel van P1. Deze verrijking had mogelijkerwijs een tijdelijke onderdrukking van corynebacteriën tot gevolg. De behandeling had geen invloed op de microbiële samenstelling van de onbehandelde oksel. De behandelde oksel werd duidelijk beter beoordeeld dan de onbehandelde oksel voor enkele sensorische variabelen. Het gebruik van spray 1 door P2 leidde niet tot een duidelijke verrijking van S. epidermidis. Het aanwenden van spray 2 bracht zelfs de verdwijning van S. epidermidis met zich mee. Er werd geen invloed op de okselgeur vastgesteld. Aanwenden van beide sprays bracht evenmin een verandering van de samenstelling van de microbiële okselgemeenschap van P3 met zich mee. Ook de okselgeur werd niet beïnvloed door deze behandeling.
5.3
Bacteriotherapie met een hoge concentratie S. epidermidis
In de volgende behandeling werd opnieuw bacteriotherapie toegepast. Er werd gestreefd naar een grondigere desinfectiemethode om een betere afdoding van de oorspronkelijke okselgemeenschap te bekomen. Ook werd er gewerkt met veel hogere concentraties S. epidermidis die rechtstreeks op de oksel werden aangebracht in plaats van met behulp van een spray. De derde behandeling vond plaats bij P3 en bedroeg het aanbrengen van een hoge concentratie opgegroeide S. epidermidis op steeds dezelfde oksel. De andere oksel werd als referentie gebruikt. In een tijdspanne van 2 weken werd P3 tot 3 keer toe behandeld. Deze wijze van behandelen zorgde voor tijdelijke verrijkingen van de behandelde oksel van P3 met S. epidermidis. Er werd geen effect vastgesteld op de aanwezigheid van andere species. De onbehandelde oksel ondervond geen invloed van de verrijkingen. Het geurpanel melde geen significante invloed op de okselgeur van P3.
5.4
Optimalisatie van microbiële transplantatie/bacteriotherapie
Er werd getracht een volledige afdoding te verkrijgen van alle aanwezige okselmicrobiota op de te behandelen oksel van de patiënten. Om dit te bekomen werd de desinfectiestap doorheen de behandelingen geoptimaliseerd. Gedurende behandelingsperiode 1 werd voor 60
DISCUSSIE
elke transplantatie de oksel ontsmet met 70% ethanol. Om echter de mogelijkheid uit te sluiten dat daarbij ook de aangebrachte bacteriën van een vorige aanrijking zouden afgedood worden, werd tijdens behandelingsperiode 2 en 3 de oksel enkel voor de allereerste aanrijking gedesinfecteerd. Voor behandeling 2 hield dit eerst wassen met Umonium 38 zeep in en vervolgens ontsmetten met 70% ethanol. Een efficiëntere ontsmetting werd toegepast bij de start van behandeling 3, waarbij eerst iso-betadine op de oksel werd aangebracht en aansluitend ethanol gebruikt werd. Zeeuwen et al. (2012) bestudeerden het proces van microbiële herkolonisering van de menselijke huid door het toebrengen van oppervlakkige letsels. Ze observeerden dat het nieuw ontwikkelende microbioom meer gelijkenissen vertoonde met dat van de dieper gelegen stratum corneum lagen dan met dat van het initiële huidoppervlak. Dit deed hen suggereren dat het microbioom van de dieper gelegen huidlagen en niet dat van de buitenste huidlaag kan beschouwd worden als het gastheer-eigen microbioom. Indien deze hypothese zou kloppen dient een manier gevonden te worden om ook de afdoding van bacteriën in de dieper gelegen huidlagen te verkrijgen, gevolgd door microbiële transplantaties of bacteriotherapie op dat niveau. Dit zou kunnen gebeuren door, naast een adequate afdoding op de huid, ook een selectieve antibioticumkuur in te lassen die de probleem veroorzakende bacteriën van binnenuit kan afdoden op en in de huid. Ook de manier van staalname van de microbiële okselgemeenschappen zou best worden aangepast naar een methode die meer informatie kan verschaffen over de microbiële gemeenschap aanwezig in de diepere huidlagen. Blanpain et al. (2007) wijzen erop dat microbiota verkregen via staalname met wattenstaafjes de geschiedenis van de huiddifferentiatie vertegenwoordigen, aangezien de migratie van keratinocyten naar het huidoppervlak vier weken duurt. Deze periode dient dan ook in het achterhoofd gehouden te worden met betrekking tot de opvolgingsperiode na een behandeling. Een potentiële verklaring voor de twijfelachtige resultaten die behandeling 2 opleverden is het gebruik van te lage concentraties S. epidermidis als sprayinhoud. Daarom werd voor de behandeling 3 overgeschakeld naar het rechtstreeks aanbrengen van hoge concentraties S. epidermidis. Aangezien ook deze behandeling weinig vruchten afwierp kan de reden mogelijk gezocht worden in de manier van cultiveren. De staphylococcen werden opgegroeid op nutrient agar en vervolgens in nutrient broth, gekenmerkt door een hoge concentratie aan suiker en eiwitten. Bij overbrengen naar de okselhuid dienen de bacteriën over te schakelen op schaarse voedingsmiddelen. Wellicht waren de staphylococcen niet in staat zich aan te passen aan de veranderde omgeving.
5.5
Invloeden op de okselgeur
Heden ten dage is het nog steeds niet duidelijk of de specifieke lichaamsgeur van individuen (gedeeltelijk) genetisch bepaald is. Kuhn & Natsch (2009) bestudeerden het vrijgeven van vluchtige carbonzuren, gekend voor hun bijdrage aan een slechte okselgeur, bij 12 paar 61
DISCUSSIE
monozygotische tweelingen. Via gaschromatografie werden de vrijgegeven vetzuren geanalyseerd en de bekomen patronen waren gelijkaardig voor monozygotische tweelingen onderling. Een veel groter verschil werd geobserveerd bij het vergelijken van niet gerelateerde individuen. Bijgevolg concludeerden zij dat lichaamsgeur, waarin deze vluchtige vetzuren een groot aandeel hebben, deels genetisch bepaald wordt. Evenwel werd het microbieel profiel van de oksel van de tweelingen niet nader onderzocht. Studies van Wedekind & Füri (1997) en Wedekind et al. (1995) wezen uit dat ook Major Histocompatibility Complex (MHC) allelen deels bepalend zijn voor het soort lichaamsgeur van een individu. Het voorkomen van een monozygotische tweeling met sterk verschillende microbiële okselgemeenschap en derhalve zeer verschillende okselgeur, zoals waarmee in deze studie gewerkt werd, is een eerder uitzonderlijke situatie. De geslaagde transplantatie tussen de monozygotische tweelingbroers P1 en D1 en de onsuccesvolle poging tussen de nietverwanten P2 en D2 is mogelijk te verklaren door een grotere diversiteit in anti-microbiële peptide (AMP) productie door de huid bij niet-verwanten (Zeeuwen et al., 2013). AMP’s maken deel uit van het aangeboren immuunsysteem. Ze oefenen antimicrobiële activiteiten uit op targetcellen via membraandestabilisatie (Giuliani et al., 2008). Ook het geslacht van een individu is mee bepalend voor de soort afgescheiden lichaamsgeur. Troccaz et al. (2009) incubeerden zweet van zowel mannen als vrouwen met S. haemolyticus en kwamen tot de conclusie dat, ondanks incubatie met dezelfde bacterie, het zweet afkomstig van vrouwen een veel intensere, zwavelachtige geur bezat. Ze ontdekten dat de precursor cysteinylglycine-S-conjugaat in grotere hoeveelheden aanwezig is in de okselsecreties van vrouwen dan van mannen, wat wijst op het potentieel van vrouwen om beduidend meer vluchtige zwavelcomponenten, zoals R/(S)-3-methyl-3sulfanylhexan-1-ol (MSH), uit te scheiden. Waarschijnlijk liggen genetische of hormonale verschillen aan de basis van dit verschil (Emter & Natsch, 2008). Een identieke behandeling met eenzelfde soort bacteriën kan dus, afhankelijk van het geslacht, een andere soort okselgeur met zich meebrengen. In deze studie werden beide geslachten enkel in behandeling 2 samen vertegenwoordigd en waren er voor deze behandeling geen relevante geslachtsafhankelijke veranderingen in sensorische variabelen, zoals gequoteerd door het geurpanel, op te merken. Ook werd er met een te beperkt aantal proefpersonen gewerkt om hierover een duidelijke uitspraak te doen. Naast genetica en geslacht spelen ook omgevingsfactoren, specifiek voor elk individu, een rol in de kolonisatie van de huid door microbiota en de daarmee gepaard gaande lichaamsgeur (Grice & Segre, 2011). Potentiële invloeden op de aanwezige okselgemeenschap door het gebruik van verzorgingsproducten en kledingskeuze, werden gedurende de verschillende behandelingsperioden zoveel mogelijk uitgeschakeld. Zo werden de patiënten opgedragen om zich te wassen met geurloze zeep van Widmer, geen deodorant of anti-transpirant te gebruiken en na behandeling enkele dagen witte katoenen 62
DISCUSSIE
T-shirts te dragen, gewassen op 90°C zonder wasmiddel. Kohoutová et al. (2011) stellen dat het effect van scheren miniem is op de perceptie van okselgeur, er werd dan ook geen rekening gehouden met scheergewoonten. Ook met eventuele effecten van factoren als emotionele status, hormonale cycli, dieet en beroep kon geen rekening worden gehouden. In deze studie werd steeds een oksel behandeld en werd de andere oksel als referentie gebruikt, waarbij er van uitgegaan werd dat linker- en rechteroksel van eenzelfde individu over dezelfde microbiële compositie beschikten en bijgevolg ook overeenstemden qua geur. In de literatuur bestaat hierover onenigheid. Zo gaan Ferdenzi et al. (2009), Rennie et al. (1991) en Leyden et al. (1981) akkoord met deze gedachtegang, terwijl Hopwood et al. (2005) van het tegendeel overtuigd zijn. Onderzoek door Egert et al. (2011) en Callewaert et al. (submitted article) wezen uit dat kleine verschillen kunnen voorkomen in microbiele gemeenschap tussen de linker- en rechter oksel van dezelfde persoon. Deze verschillen kwamen voor bij ongeveer de helft van de onderzochte personen. In deze onderzoeken werd evenwel het geurprofiel niet onderzocht.
5.6
Een geurpanel als adequate techniek voor geurevaluatie
In deze studie werd gewerkt met een geurpanel, bestaande uit geselecteerde en gescreende individuen, om geurstalen van de behandelde en onbehandelde oksels van de patiënten te beoordelen op verschillende sensorische variabelen. Allen waren vertrouwd met de olfactometrische procedures en voldeden aan de vooropgestelde criteria (zie 2.3 Geurbeoordeling). Het inzetten van een geurpanel gaat gepaard met een aantal voordelen. Zo kan een duidelijke perceptie verkregen worden over hoe diverse individuen de verschillende behandelingen ervaarden. Ook is het een snelle, gemakkelijk uitvoerbare en bovendien gevoelige methode om verschillen in geur te detecteren. De gebruikte methode brengt echter ook enkele nadelen met zich mee. Het risico bestaat dat de panelleden gedurende het proces van het ruiken en het beoordelen van de geuren op verschillende variabelen vermoeid geraken of hun reukzin verzadigd raakt. Bias kan optreden wanneer de beoordelaars blootgesteld worden aan afleidingen of simpelweg hun interesse verliezen. Het omzetten van percepties naar quoteringen kan voor sommige leden een moeizaam proces betekenen. Individuele variaties in gevoeligheid voor verschillende geuren en factoren zoals leeftijd, geslacht, gezondheid en persoonlijke gewoonten hebben een effect op de geurbeleving (Pan et al., 2007; Rappert & Muller, 2005). Om precisie te verzekeren en interpretatie van de beschrijvende data mogelijk te maken, zijn meerdere beoordelaars vereist. Training van de verschillende individuen is noodzakelijk om subjectiviteit te overwinnen, maar dit kan een kostelijk en tijdrovend proces zijn. Hierdoor is het ook niet vanzelfsprekend om een panellid te vervangen. Tenslotte kan de interpretatie van de bekomen resultaten problematisch en onderhevig aan discussie zijn. Een alternatief, de elektronische neus (e-neus), is een instrument ontworpen om de functie van de menselijke neus na te bootsen. Met behulp van een groep sensoren, opgesteld 63
DISCUSSIE
volgens een bepaald geometrisch patroon, kan het apparaat complexe geuren detecteren en van elkaar onderscheiden (Göpel, 1998). De detectie en kwantificatie van een bepaalde geurstof is gebaseerd op een uniek reactiepatroon door combinatie van alle sensoren. Verscheidene voordelen zoals het gebruiksgemak, de responssnelheid en de objectiviteit zijn gekoppeld aan het gebruik van de e-neus. Voor de detectie van lichaamsgeur vormt zweet een belangrijk obstakel. Afhankelijk van het milieu en uitgeoefende activiteiten varieert de zweetproductie van een individu dagelijks. Aangezien de meeste gassensoren in zekere mate gevoelig zijn voor vochtigheid, kan deze variërende hoeveelheid geproduceerd zweet een probleem vormen voor de meting van okselgeur (Pearce et al., 2002). Wongchoosuk et al. (2009) ontwikkelden twee oplossingen voor dit obstakel. Een eerste oplossing is een hardware-gebaseerde methode, waarbij in die mate omgegaan wordt met de stalen zodanig dat deze bijna dezelfde vochtigheid als de achtergrond verkrijgen. De tweede oplossing, een software-gebaseerde benadering, steunt op een mathematisch model die de weerstand van elke gassensor bij verschillende vochtigheidslevels kalibreert om deze af te trekken van het vochtigheidssignaal van het totale signaal. Bijkomende nadelen zijn de beperkte herhaalbaarheid, saturatie, drift en de noodzaak om de e-neus accuraat en specifiek te calibreren. Ook het onvermogen om het dynamische bereik en de selectiviteit van de menselijke neus na te bootsen vormen een groot probleem (Wilson & Baietto, 2009). Een andere manier om het unieke geurprofiel van een individu in kaart te brengen is gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS). Aangezien geur echter een complex verschijnsel is, veroorzaakt door verschillende vluchtige organische componenten (VOC’s), vaak aanwezig in concentraties lager dan de instrumentele detectielimiet en die bovendien kunnen interageren met elkaar, is de inzet van deze techniek gelimiteerd (Yuwono & Lammers, 2004; Craven, Gardner, & Bartlett, 1996). Een adequate sampling aan de hand van headspace-solid phase microextraction (HS-SPME) biedt soelaas. SPME is een eenvoudige monstervoorbereidingsmethode die bovendien sensitief, selectief, efficiënt en accuraat is en het gebruik van solventen uitspaart. In combinatie met HS wordt een hoge gevoeligheid en een goede selectiviteit gegarandeerd voor de analyse van VOC’s (Zhang et al., 2005). GC-MS is echter een kostelijke techniek die geen informatie omtrent menselijke perceptie biedt (Di Francesco et al., 2001). Om dit laatste het hoofd te bieden kan alsnog een geurpanel ingeschakeld worden.
5.7
Probiotica op de huid
Het meest bekende voorbeeld van bacteriotherapie is fecale bacteriotherapie, een proces waarbij vloeibare suspensie van stoelgang van een gezonde donor in het gastro-intestinale kanaal wordt gebracht (Aas et al., 2003). Deze methode lijkt veelbelovend om gastrointestinale infecties te bestrijden. Infecties te wijten aan Clostridium difficile zijn vaak het gevolg van het systematisch gebruiken van antibiotica. Hiertoe behoren diarree en colitis waaronder pseudomembraan colitis en ulceratieve colitis. Hoewel het gebruik van antimicrobiële middelen bij meer dan 90% van de patiënten soelaas biedt (Kyne et al., 64
DISCUSSIE
2000), hervalt nadien toch 5 tot 50% van de gevallen (Bartlett, 1996; Cleary, 1988; Fekety, 1997; Bowden et al., 1981). Aas et al. (2003) behandelden 16 patiënten die leden aan C. difficile colitis, waarvan 15 (94%) met succes verlost werden van de aandoening. Daarnaast worden fecale transplantaties ook gebruikt als behandeling tegen chronische constipatie (Andrews & Borody, 1993), chronische darmontstekingen (Borody et al., 2003), chronische pouchitis (Gionchetti et al., 2000) en prikkelbaar darmsyndroom. Gionchetti et al. (2000) behandelden 20 patiënten met chronische pouchitis met een mengsel probiotica (4 Lactobacillus stammen, 3 Bifidobacterium stammen en 1 Streptococcus stam) en 20 patiënten met een placebo. Hiervan kenden 3 patiënten (15%) respectievelijk 20 patiënten (100%) een terugval. Tot nog toe werd in de literatuur weinig aandacht besteed aan het principe om probiotica voor cutaan gebruik in te zetten. Een eerste melding werd gedaan door Ouwehand et al. (2003), die de mogelijkheid onderzochten om propionzuurbacteriën aan te wenden als huidprobiotica. Er werd gewerkt met propionzuurbacteriën uit zuivelproducten, omdat de huidbacteriën soms gerelateerd worden aan huidziekten (Jakab et al., 1996). De adhesie aan menselijk keratine werd onderzocht samen met de productie van antimicrobiële substanties tegen enkele pathogenen. Ondanks de in vitro hoge adhesielevels aan keratine van twee bestudeerde stammen werd er geen inhibitie op de adhesie van huidpathogenen waargenomen. Dit resultaat suggereerde dat het onvermogen van sommige goed hechtende probiotica om de adhesie van pathogenen te inhiberen zou liggen aan het gebruik van andere, spatiaal van elkaar gescheiden binding sites (Ouwehand et al., 2001). Guéniche et al. (2008; 2006) stelden vast dat Vitreoscilla filiformis extracten anti-irriterende en wondhelende eigenschappen vertoonden en de symptomen van seborroïsch eczeem verlichtten. Deze studies suggereerden dat V. filiformis extracten in huidverzorgingsproducten kunnen aangewend worden om atopische dermatitis symptomen te verhelpen. Peral et al. (2009) onderzochten het aanwenden van Lactobacillus plantarum als alternatief voor zilversulfadiazine (SD-Ag) bij de cutane behandeling van brandwonden om het risico op infecties te beperken. Deze onschadelijke bacteriën zijn concurrenten van wondpathogenen, waarbij ze het milieu van de wond wijzigen en weefselherstel stimuleren. Uit dit onderzoek bleek dat er nagenoeg geen verschil was tussen beide methodes met betrekking tot het vermijden van infecties, het stimuleren van de vorming van granulair weefsel en het genezen van wonden. Buiten deze studie zijn nog geen andere studies uitgevoerd omtrent het inzetten van probiotica voor het bestrijden van lichaamsgeur. Masdea et al. (2012) en Burton et al. (2006) onderzochten de mogelijkheid om competitieve bacteriën zoals S. salivarius K12 in te zetten als middel tegen halitose. Deze studies demonstreerden dat S. salivarius K12 antimicrobiële activiteit vertoont tegen bacteriën die betrokken zijn bij een slechte adem en suggereerden 65
DISCUSSIE
dat de bacterie een waardevolle bijdrage kan leveren in het ontwikkelen van een antimicrobiële therapie tegen halitose. In
navolging
van
de
talrijke
probiotische
producten
die
onder
de
vorm
van
voedingssupplementen op de markt aanwezig zijn, groeit de interesse om probiotica in te zetten voor klinische toepassingen. Vooraleer probiotica in de medische sector kunnen ingezet worden, dient hun heilzaam vermogen medisch en wetenschappelijk gevalideerd te worden. Dit brengt strenge klinische onderzoeken en een evaluatie van de wetgeving met zich mee (Tannock, 2003). Wassenaar & Klein (2008) maken namelijk melding van volgende potentiële risico’s: 1) occasionele aanwezigheid van virulentiefactoren in probiotische bacteriële stammen, 2) horizontale genoverdracht kan resulteren in overdracht van virulentiegenen of antimicrobiële resistentie in probiotische bacteriën, 3) de antimicrobiële resistentie in probiotische bacteriën kan zich uitbreiden naar andere endogene bacteriële populaties. Deze worden aangevuld door Snydman (2008) met het optreden van ziekte, door bacteremia, sepsis of endocarditis. Liong (2008) postuleerde dat sommige probiotische stammen kunnen migreren en schadelijke gezondheidseffecten kunnen opwekken bij patiënten met een verzwakt immuunsysteem. Hoewel bovengenoemde auteurs stellen dat probiotica in het algemeen veilig zijn, is er onmiskenbaar nood aan een Europese wetgeving met duidelijke veiligheidscriteria omtrent het gebruik van levende bacteriën voor therapeutische doeleinden. Hedendaags beschikt de Europese Unie niet over een wettelijke definitie van de term probiotica en bestaat er geen specifieke wet- of regelgeving omtrent dit onderwerp (Narayanan, 2013). De Europese Autoriteit voor Voedselveiligheid (EAV) communiceerde tot nog toe negatief inzake de gezondheidseffecten van probiotica naar de Europese Commissie (Katan, 2012). De richtlijnen van de Organisatie voor Economische Samenwerking en Ontwikkeling (OESO) inzake het testen van de veiligheid van chemicaliën kunnen aangewend worden om de toxiciteit van probiotica op korte en op lange termijn te evauleren. De World Health Organization (WHO) omschrijft probiotica als “levende microorganismen die, bij toedienen van adequate hoeveelheden, een gezondheidsvoordeel opleveren voor de gastheer”. De Food and Drug Administration (FDA) van de VS classificeert probiotica onder de term live biotherapeutics. Dit houdt levende microorganismen in, inclusief bacteriën en gist, met een voorgenomen heilzaam effect op mensen, die ingezet worden voor het voorkomen of behandelen van ziektes. Onder deze termen vallen probiotica voor klinisch gebruik (Hoffman, 2008). Heden ten dage wordt ook deze term niet gebruikt in enige wet- of regelgeving van de VS. De aanduiding GRAS (Generally Regarded as Safe) van het FDA wordt regelmatig verkeerd gebruikt voor probiotica met medische toepassingen, aangezien de term GRAS gelimiteerd is tot voedseladditieven.
66
DISCUSSIE
5.8
Toekomstig onderzoek
Een eerste succesvolle okseltransplantatie weerspiegelt een waaier aan perspectieven. Niettemin dient verder onderzoek te worden uitgevoerd op een grotere groep patiënten. Meer mannelijke en vrouwelijke patiënten, van verschillende leeftijdscategorieën en diverse etnische groepen moeten hierbij beschouwd worden. Ook dienen verschillende stappen in het behandelingsproces te worden geoptimaliseerd en moet er rekening gehouden worden met verschillende factoren. Zo is een adequate afdoding van de bestaande microbiota op de okselhuid noodzakelijk, eventueel gecombineerd met het bestrijden van de microbiota die voorkomen in de dieper gelegen huidlagen. Dit zou bekomen kunnen worden door naast ontsmetting van de huid met iso-betadine of eventueel chloorhexidine de patiënt ook een selectieve, tijdelijke antibioticumkuur te laten doorlopen, die de aanzet kan vormen voor de ontwikkeling van een nieuw huidmicrobioom. Wat betreft microbiële transplantaties is het aan te raden om aanvankelijk de focus te leggen op bloedverwanten of te werken met donoren en patiënten met gelijkaardige AMP genexpressie profielen. De expressie van AMP’s kent echter een zeer grote interindividuele variatie (Zeeuwen et al., 2012). Het zou uitermate interessant zijn om de AMP profielen van de homozygotische tweelingbroers P1 en D1, waarmee in deze studie gewerkt werd, in kaart te brengen en hoe deze proteïnen reageren op de bacteriën die worden aangebracht. De beste manier om AMP’s te bestuderen is via solid-state nuclear magnetic resonance (NMR) in een nagebootst membraanmilieu, aangezien interactie met de celmembraan de drijvende kracht is voor de werking van deze proteïnen (Giuliani et al., 2008). Deze techniek staat echter nog niet helemaal op punt voor het bestuderen van AMP’s. Echter, door de toenemende belangstelling voor AMP’s als potentiële kandidaten om de groeiende antibioticaresistentie te overwinnen, worden in de nabije toekomst een toenemend aantal solid-state NMR aanwendingen voor deze moleculen verwacht (Ramamoorthy, 2009). Aangaande bacteriotherapie is het noodzakelijk om te werken met hoge concentraties bacteriën. Deze worden best opgegroeid in een zweetmedium, zodat ze beter voorbereid zijn op de milieucondities die heersen in de okselregio. Zo’n medium is echter nog in ontwikkeling en ook simulatiemodellen van humaan zweet vormen slechts een basis (Callewaert et al., 2013). Ook dient er een afweging gemaakt te worden of het best pure culturen, zoals in deze studie, of mengculturen worden ingezet. Het gebruiken van mengculturen kan enkele voordelen bieden. Zo is een mengcultuur een betere representatie van de werkelijkheid kan zo’n cultuur een groter aanpassend vermogen vertonen bij aanbrengen op de okselregio. Voorts bestaan er tussen deze micro-organismen ingewikkelde relaties en werken ze samen om de kolonisatie van pathogenen te verhinderen. Het werken met mengculturen is dus veel complexer en moeilijker te bestuderen. Ook dient de optimale compositie van zo’n mengcultuur achterhaald te worden 67
DISCUSSIE
en exact gedefinieerd te zijn, zodat de veiligheid van de patiënten gegarandeerd kan worden. Interessant is ook na te gaan wat het effect is van het aanbrengen van niet-huideigen bacteriën, met name probiotische sporen die slechte bacteriën kunnen inhiberen. Er bestaan reeds probiotische reinigingsproducten die gebruik maken van Bacillus sporen. Deze sporen produceren, bij ontkieming, eiwitten die een inhiberend effect hebben op andere microorganismen. Wanneer de resultaten van bovenstaande suggesties gunstig blijken, kunnen de technieken ook toegepast worden op andere geur gerelateerde problemen, zoals halitose of bromhidrose van de voeten. Ook complicaties die niet noodzakelijk met geurhinder gepaard gaan, zoals schimmelinfecties, kunnen mogelijk op deze manier onder handen worden genomen. Het is hierbij belangrijk om een gebruiksvriendelijke manier uit te werken waardoor de patiënt zichzelf kan behandelen, bijvoorbeeld in de vorm van een spray, een zalf of een poeder. Een ander belangrijk aspect waarmee dient rekening gehouden te worden is de kostprijs. Stel dat 1 cel over een massa beschikt van 10-12 g en 1 kg droge stof € 800 kost. Stel voorts dat het product een volume heeft van 150 mL, waarbij de benodigde concentratie bacteriën 109 kve/mL (1000 keer meer dan in de sprays van behandeling 2) bedraagt. Dit betekent dat elk product 0,15 g bacteriële cellen moet bevatten, wat overeenkomt met een prijs van € 0,12. Uit deze berekening kan besloten worden dat een dergelijk product op een competitieve wijze kan geplaatst worden op de markt.
68
CONCLUSIE
6
Conclusie
Met deze thesis werden voor het eerst microbiële okseltransplantaties uitgevoerd. De resultaten suggereren dat deze transplantaties langdurig en bovendien succesvol zijn in het bestrijden van geurhinder wanneer donor en acceptor verwant zijn. Mogelijk kan dit worden uitgebreid tot personen die gelijkaardige AMP-profielen vertonen. Uit de behandelingen waarbij bacteriotherapie werd toegepast konden geen eenduidige conclusies getrokken worden. Het staat vast dat zowel voor de microbiële transplantaties als voor bacteriotherapie de cultiveringsstap geoptimaliseerd dient te worden. Ook moet er gestreefd worden naar een doeltreffendere afdoding van de microbiota op de huid, die eventueel moet doorgetrokken worden naar de microbiota gelegen in de diepere huidlagen. Aangaande bacteriotherapie is het aanbrengen van voldoende hoge concentraties levende bacteriën een belangrijk aandachtspunt, waarbij eventueel moet overgeschakeld worden naar het inzetten van mengculturen in plaats van reinculturen. Naast welgekende toepassingen als fecale bacteriotherapie en probiotica onder de vorm van voedingssupplementen, maakt dit onderzoek gewag van de mogelijkheid om bacteriën in te schakelen om lichaamsgeur op een meer natuurlijke wijze te reduceren. Heden worden vooral deodoranten en anti-perspiranten ingezet tegen dit probleem, die de door de bacteriën geproduceerde geur maskeren en het zweet doen verminderen doordat aluminiumzouten de zweetklieren blokkeren. Dit onderzoek opent voor het eerst de mogelijkheid om op een selectieve wijze de bacteriën die aanleiding geven tot een slechte okselgeur te inhiberen. Hoewel in deze studie de focus werd gelegd op het verminderen van de okselgeur, kan dit in de toekomst uitgebreid worden naar bijvoorbeeld halitose en bromhidrose van de voeten. Het is duidelijk dat dit een grondige, praktisch en commercieel haalbare uitwerking vergt. Voor de behandelingswijze kan het gebruiken van bijvoorbeeld deodoranten, zelfklevende pads, zalven of poeders overwogen worden. Hierbij dient rekening gehouden te worden met de shelf life van deze producten. Vooraleer dergelijke artikelen echter kunnen worden aangeboden zijn er verdere, uitgebreide onderzoeken nodig. Het is aan te raden om hierbij mannen en vrouwen, van verschillende leeftijdscategorieën en deel uitmakend van verschillende etnische groepen, te behandelen.
69
70
LITERATUURLIJST
7
Literatuurlijst
Aas J, Gessert C & Bakken J (2003) Recurrent Clostridium difficile colitis: case series involving 18 patients treated with donor stool administered via a nasogastric tube. Clinical Infectious Diseases 36: 580–585 Aly R (1991) Cutaneous microbiology. Orkin M Maibach H & Dahl M (eds). Dermatology. Los Altos: Appleton & Lange Amoore J (1977) Specific anosmia and the concept of primary odors. Chemical Senses 2: 267–281 Andrews P & Borody T (1993) “Putting back the bugs”: bacterial treatment relieves chronic constipation and symptoms of irritable bowel syndrome. Medical Journal of Australia 159: 633–634 Ascione J, Forestier S & Rollat-Corvol I (2003) Deodorant composition comprising a watersoluble zinc salt as odor-absorbing agent. Austin C & Ellis J (2003) Microbial pathways leading to steroidal malodour in the axilla. The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 87: 105–110 Baker B (2005) The role of microorganisms in atopic dermatitis. Clinical & Experimental Immunology 144: 1–9 Bartlett J (1996) Management of Clostridium difficile infection and other antibiotic-associated diarrhoeas. European Journal of Gastroenterology and Hepatology 8: 1054–1061 Benohanian A, Dansereau A, Bolduc C & Bloom E (1998) Localized hyperhidrosis treated with aluminium chloride in a salicylic acid gel base. International Journal of Dermatology 37: 701–703 Benson AK, Kelly SA, Legge R, Ma F, Low SJ, Kim J, Zhang M, Oh PL, Nehrenberg D, Hua K, Kachman SD, Moriyama EN, Walter J, Peterson DA & Pomp D (2010) Individuality in gut microbiota composition is a complex polygenic trait shaped by multiple environmental and host genetic factors. Proceedings of the National Academy of Sciences 107: 18933–18938 Bierbaum G, Götz F, Peschel A, Kupke T, Van de Kamp M & Sahl H (1996) The biosynthesis of the lantibiotics epidermin, gallidermin, Pep5 and epilancin K7. Antonie Van Leeuwenhoek 69: 119–127 Blaise G, Nikkels A, Hermanns-Lê T, Nikkels-Tassoudji N & Piérard G (2008) Corynebacterium-associated skin infections. International Journal of Dermatology 47: 884–890 Blanpain C, Horsley V & Fuchs E (2007) Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell 128: 445–458 Blomberg L, Henriksson A & Conway P (1993) Inhibition of adhesion of Escherichia coli K88 to piglet ileal mucus by Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology 59: 34–39 Borody T, Warren E, Leis S, Surace R & Ashman O (2003) Treatment of ulcerative colitis using fecal bacteriotherapy. Journal of Clinical Gastroenterology 37: 42–47 71
LITERATUURLIJST
Bowden TJ, Mansberger AJ & Lykins L (1981) Pseudomembraneous enterocolitis: mechanism for restoring floral homeostasis. The American Surgeon 47: 178–183 Brahms J, Mattai J, Jacoby R, Chopra S & Guenin E (2005) Dry deodorant containing a sesquiterpene alcohol and zinc oxide. Publication nr: WO2005087181 A3 Burton J, Chilcott C, Moore C, Speiser G & Tagg J (2006) A preliminary study of the effect of probiotic Streptococcus salivarius K12 on oral malodour parameters. Journal of Applied Microbiology 100: 754–764 Callewaert C, Buysschaert B, Vossen E, Van Gele M, Van de Wiele T, Boon N (2013) The SCIN simulation: A novel in vitro technique to study microbial colonization in the axillary region. 18th National Symposium on Applied Biological Sciences (NSABS2013). Ghent, Belgium. 8 February 2013. Poster presentation Callewaert C, Kerckhof F-M, Granitsiotis MS, Van Gele M, Van de Wiele T, Boon N (2013) Characterization of the Staphylococcus and Corynebacterium cluster in the human axillary region. Submitted to PLoS One. Van Campen N (2003) Van geur naar hinder. Een onderzoek naar een duidelijke relatie tussen stankpotentieel en hinderpotentieel. febrari 20. Nieuwdorp G & Korevaar E (eds) Utrecht: Chemiewinkel Utrecht Chiller K, Selkin BA & Murakawa GJ (2001) Skin microflora and bacterial infections of the skin. Journal of Investigative Dermatology Symposium Proceedings 6: 170–174 Cleary R (1988) Clostridium difficile-associated diarrhea and colitis: clinical manifestations, diagnosis, and treatment. Diseases of the Colon & Rectum 41: 1435–1449 Cogen A, Nizet V & Gallo R (2007) Staphylococcus epidermidis functions as a component of the skin innate immune system by inhibiting the pathogen Group A Streptococcus. Journal of Investigative Dermatology 127: S131 Courbiere C & Forestier S (2003) Divalent manganese salts for reducing odour resulting from bacterial decomposition of human perspiration. Coyle M & Lipsky B (1990) Coryneform bacteria in infectious diseases: clinical and laboratory aspects. Clinical Microbiology Reviews 3: 227–246 Craven M, Gardner J & Bartlett P (1996) Electronic noses -Development and future prospects. Trends in Analytical CHemistry 15: 486–493 Darbre P, Pugazhendhi D & Mannello F (2011) Aluminium and human breast diseases. Journal of Inorganic Biochemistry 105: 1484–1488 Dotterud L, Wilsgaard T, Vorland L & Falk E (2008) The effect of UVB radiation on skin microbiota in patients with atopic dermatitis and healthy controls. International Journal of Circumpolar Health 67: 254–260 Ekkelenkamp M, Hanssen M, Danny Hsu S, De Jong A, Milatovic D, Verhoef J & Van Nuland N (2005) Isolation and structural characterization of epilancin 15X, a novel lantibiotic from a clinical strain of Staphylococcus epidermidis. FEBS Lett. 579: 1917– 1922 Emter R & Natsch A (2008) The sequential action of a dipeptidase and a beta-lyase is required for the release of the human body odorant 3-methyl-3-sulfanylhexan-1-ol from 72
LITERATUURLIJST
a secreted Cys-Gly-(S) conjugate by Corynebacteria. Journal of Biological Chemistry 283: 20645–20652 Feazel LM, Baumgartner LK, Peterson KL, Frank DN, Harris JK & Pace NR (2009) Opportunistic pathogens enriched in showerhead biofilms. Proceedings of the National Academy of Sciences 106: 16393–16399 Fekety R (1997) Guidelines for the diagnosis and management of Clostridium difficileassociated diarrhea and colitis. The American Journal of Gastroenterology 92: 739–750 Ferdenzi C, Schaal B & Roberts SC (2009) Human axillary odor: are there side-related perceptual differences? Chemical Senses 34: 565–571 Fierer N, Hamady M, Lauber CL & Knight R (2008) The influence of sex,handedness, and washing on the diversity of handsurface bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences 105: 17994–17999 Foster T (2005) Immune evasion by staphylococci. Nature Reviews Microbiology 3: 948–958 Di Francesco F, Lazzerini B, Marcelloni F & Pioggia G (2001) An electronic nose for odour annoyance assessment. Atmosperhic Environment 35: 1225–1234 Fredericks DN (2001) Microbial ecology of human skin in health and disease. Journal of Investigative Dermatology 6: 167–169 Fujita K, Ichimasa S, Zendo T, Koga S, Yoneyama F, Nakayama J & Sonomoto K (2007) Structural analysis and characterization of lacticin Q, a novel bacteriocin belonging to a new family of unmodified bacteriocins of gram-positive bacteria. Applied and Environmental Microbiology 73: 2871–2877 Gionchetti P, Rizzello F, Venturi A, Brigidi P, Matteuzzi D, Bazzocchi G, Poggioli G, Migliol M & Campieri M (2000) Oral bacteriotherapy as maintenance treatment in patients with chronic pouchitis: a double-blind, placebo-controlled trial. Gastroenterology 119: 305– 309 Giuliani A, Pirri G, Bozzi A, Di Giulio A, Aschi M & Rinaldi A (2008) Antimicrobial peptides: natural templates for synthetic membrane-active compounds. Cellular and Molecular Life Sciences 65: 2450–2460 Gower D, Holland K, Mallet A, Rennie P & Watkins W (1994) Comparison of 16-androstene steroid concentrations in sterile apocrine sweat and axillary secretions: interconversions of 16-androstenes by the axillary microflora--a mechanism for axillary odour production in man? The Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 48: 409–418 Grice E & Segre J (2011) The skin microbiome. Nature Reviews Microbiology 9: 244–253 Gustafsson A, Berstad A, Lund-Tønnesen S, Midtvedt T & Norin E (1999) The effect of faecal enema on five microflora-associated characteristics in patients with antibioticassociated diarrhoea. Scandinavian Journal of Gastroenterology 34: 580–586 Gustafsson A, Lund-Tønnesen S, Berstad A, Midtvedt T & Norin E (1998) Faecal short-chain fatty acids in patients with antibiotic-associated diarrhoea, before and after faecal enema treatment. Scandinavian Journal of Gastroenterology 33: 721–727 Guéniche A, Cathelineau A, Bastien P, Esdaile J, Martin R, Queille Roussel C & Breton L (2008) Vitreoscilla filiformis biomass improves seborrheic dermatitis. European Academy of Dermatology and Venereology 22: 1014–1015 73
LITERATUURLIJST
Guéniche A, Hennino A, Goujon C, Dahel K, Bastien P, Martin R, Jourdain R & Breton L (2006) Improvement of atopic dermatitis skin symptoms by Vitreoscilla filiformis bacterial extract. European Journal of Dermatology 16: 380–384 Göpel W (1998) Chemical imaging: I. Concepts and visions for electronic and bioelectronic noses. Sensors and Actuators B: Chemical 52: 125–142 Hale E & Hinsdill R (1975) Biological activity of staphylococcin 162: bacteriocin from Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy 7: 74–81 Harder J, Bartels J, Christophers E & Schroder J (1997) A peptide antibiotic from human skin. Nature 387: 861 Hasegawa Y, Yabuki M & Matsukane M (2004) Identification of new odoriferous compounds in human axillary sweat. Chemistry & Biodiversity 1: 2042–2050 Higaki S, Nakamura M, Kitagawa T, Morohashi M & Yamagishi T (2001) Effect of lipase activities of Propionibacterium granulosum and Propionibacterium acnes. Drugs Under Experimental and Clinical Research 27: 161–164 Hoffman FA (2008) Development of probiotics as biologic drugs. Clinical Infectious Diseases 46: S125–127 Holland K (1993) Nutrition of cutaneous resident microorganisms Noble W (ed) Cambridge: Cambridge University Press. 33-72 Hopwood D, Farrar M, Bojar R & Holland K (2005) Microbial colonization dynamics of the axillae of an individual over an extended period. Acta Dermato-Venereologica 85: 363– 364 Iwatsuki K, Yamasaki O, Morizane S & Al. E (2006) Staphylococcal cutaneous infections: invasion, evasion and aggression. Journal of Dermatological Science 42: 203–214 Jackman P & Noble W (1983) Normal axillary skin microflora in various populations. Clinical and Experimental Dermatology 8: 259–268 Jakab E, Zbinden R, Gubler J, Ruef C, Von Graevenitz A & Krause M (1996) Severe infections caused by Propionibacterium acnes: an underestimated pathogen in late postoperative infections. Yale Journal of Biology and Medicine 69: 477–482 James A, Austin C, Cox D, Taylor D & Calvert R (2013) Microbiological and biochemical origins of human axillary odour. FEMS Microbiology Ecology 83: 527–540 James A, Casey J, Hyliands D & Mycock G (2004a) Fatty acid metabolism by cutaneous bacteria and its role in axillary malodour. World Journal of Microbiology and Biotechnology 20: 787–793 James A, Hyliands D & Johnston H (2004b) Generation of volatile fatty acids by axillary bacteria. International Journal of Cosmetic Science 26: 149–156 Kanlayavattanakul M & Lourith N (2011) Body malodours and their topical treatment agents. International Journal of Cosmetic Science 33: 298–311 Katan MB (2012) Why the European Food Safety Authority was right to reject health claims for probiotics. Beneficial Microbes 3: 85–89
74
LITERATUURLIJST
Kloos W & Schleifer K (1975) Isolation and characterization of staphylococci from human skin. International Journal of Systematic Bacteriology 25: 50 –79 Kohoutová D, Rubešová A & Havlíček J (2011) Shaving of axillary hair has only a transient effect on perceived body odor pleasantness. Behavioral Ecology and Sociobiology 66: 569–581 Kuhn F & Natsch A (2009) Body odour of monozygotic human twins: a common pattern of odorant carboxylic acids released by a bacterial aminoacylase from axilla secretions contributing to an inherited body odour type. Journal of the Royal Society Interface 6: 377–392 Kyne, Warny M, Qamar A & Kelly C (2000) Asymptomatic carriage of Clostridium difficile and serum levels of IgG antibody against toxin A. New England Journal of Medicine 342: 390–397 Labows J, Reilly J, Leyden J & Preti G (1999) Axillary odor detection, formation and control. Antiperspirants and Deodorants 20: 59–82 Larson E (2001) Hygiene of the skin: when is clean too clean? Emerging Infectious Diseases 7: 225–230 Leeming J, Holland K & Cunliffe W (1984) The microbial ecology of pilosebaceous units isolated from human skin. Journal of General Microbiology 130: 803–807 Leyden J, McGinley K, Hölzle E, Labows J & Kligman A (1981) The microbiology of the human axilla and its relationship to axillary odor. The Journal of Investigative Dermatology 77: 413–416 Li W & Liu M (2002) Method and composition for preventing sweat-related odor. Publication nr: US6426061 B1 Liong M (2008) Safety of probiotics: translocation and infection. Nutrition Reviews 66: 192– 202 Little AEF, Robinson CJ, Peterson SB, Raffa KF & Handelsman J (2008) Rules of engagement: interspecies interactions that regulate microbial communities. Annual Review of Microbiology 62: 375–401 Lowy F (1998) Staphylococcus aureus infections. New England Journal of Medicine 339: 2026–2027 Lukacs A, Korting H, Braun-Falco O & Stanzl K (1991) Efficacy of a deodorant and its components: triethylcitrate and perfume. Journal of the Society of Cosmetic Chemists 42: 159–166 Marples RR & McGinley KJ (1974) Corynebacterium acnes and other anaerobic diphtheroids from human skin. Journal of Medical Microbiology 7: 349–357 Martin A, Saathoff M, Kuhn F, Max H, Terstegen L & Natsch A (2010) A functional ABCC11 allele is essential in the biochemical formation of human axillary odor. The Journal of Investigative Dermatology 130: 529–540 Marzorati M, Wittebolle L, Boon N, Daffonchio D & Verstraete W (2008) How to get more out of molecular fingerprints: practical tools for microbial ecology. Environmental Microbiology 10: 1571–1581 75
LITERATUURLIJST
Masdea L, Kulik E, Hauser-Gerspach I, Ramseier M, Filippi A & Waltimo T (2012) Antimicrobial activity of Streptococcus salivarius K12 on bacteria involved in oral malodour. Archives of Oral Biology 57: 1041–1047 McGrath JA, Eady RAJ & Pope FM (2008) Anatomy and organization of human skin, in Rook’s Textbook of Dermatology Seventh Ed. Burns T Breathnach S Cox N & Griffiths C (eds) Blackwell Publishing, Inc., Malden, Massachusetts, USA. 45-128 Mertens B, Boon N & Verstraete W (2005) Stereospecific effect of hexachlorocyclohexane on activity and structure of soil methanotrophic communities. Environmental Microbiology 7: 660–669 Mohsen A, Price A, Ridgway E, West J, Green S & McKendrick M (2001) Propionibacterium acnes endocarditis in a native valve complicated by intraventricular abscess: a case report and review. Scandinavian Journal of Infectious Diseases 33: 379–380 Muyzer G, De Waal E & Uitterlinden A (1993) Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 59: 695–700 Narayanan R (2013) Current legislations on probiotic products. Journal of Agriculture Sciences 1: 18–24 Natsch A, Derrer S, Flachsmann F & Schmid J (2006) A broad diversity of volatile carboxylic acids, released by a bacterial aminoacylase from axilla secretions, as candidate molecules for the determination of human-body odor type. Chemistry & Biodiversity 3: 1–20 Natsch A, Gfeller H, Gygax P, Schmid J & Acuna G (2003) A specific bacterial aminoacylase cleaves odorant precursors secreted in the human axilla. The Journal of Biological Chemistry 278: 5718–5727 Natsch A, Schmid J & Flachsmann F (2004) Identification of odoriferous sulfanylalkanols in human axilla secretions and their formation through cleavage of cysteine precursors by a C-S lyase isolated from axilla bacteria. Chemistry & Biodiversity 1: 1058–1072 Noguchi T, Watanabe Y & Sasaki F (2007) Porous magnesia and process for preparing the same. Publication nr: WO2007093258A2 Nordstrom N & Noble W (1984) Colonization of the axilla by Propionibacterium avidum in relation to age. Applied and Environmental Microbiology 47: 1360–1362 Otto M (2001) Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis peptide pheromones produced by the accessory gene regulator agr system. Peptides 22: 1603–1608 Otto M, Echner H, Voelter W & Al. E (2001) Pheromone cross-inhibition between Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis. Infection and Immunity 69: 1957–1960 Otto M, Sussmuth R, Vuong C & Al. E (1999) Inhibition of virulence factor expression in Staphylococcus aureus by the Staphylococcus epidermidis agr pheromone and derivatives. FEBS Letters 450: 257–262 Ouwehand A, Båtsman A & Salminen S (2003) Probiotics for the skin: a new area of potential application? Letters in Applied Microbiology 36: 327–331
76
LITERATUURLIJST
Ouwehand A, Tuomola E, Tölkkö S & Salminen S (2001) Assessment of adhesion properties of novel probiotic strains to human intestinal mucus. International Journal of Food Microbiology 64: 119–126 Ovreås L, Forney L, Daae F & Torsvik V (1997) Distribution of bacterioplankton in meromictic Lake Saelenvannet, as determined by denaturing gradient gel electrophoresis of PCR-amplified gene fragments coding for 16S rRNA. Applied and Environmental Microbiology 63: 3367–3373 Pan L, Yang S & DeBruyn J (2007) Factor analysis of downwind odours from livestock farms. Biosystems Engineering 96: 387–397 Peacock S, De Silva I & Lowy F (2001) What determines nasal carriage of Staphylococcus aureus? Trends in Microbiology 9: 605–610 Pearce T, Schiffman S, Nagle H & Gardner J (2002) Handbook of machine olfaction, electronic nose technology Weinheim, Germany: Wiley-VCH Peral MC, Martinez M a H & Valdez JC (2009) Bacteriotherapy with Lactobacillus plantarum in burns. International Wound Journal 6: 73–81 Pivarcsi A, Nagy I & Kemeny L (2005) Innate immunity in the skin: how keratinocytes fight against pathogens. Current Immunology Reviews 1: 29–42 Piérard GE, Elsner P, Marks R, Masson P & Paye M (2003) EEMCO Guidance for the efficacy assessment of antiperspirants and deodorants. Skin Pharmacology and Physiology 16: 324–342 Proksch E, Brandner J & Jensen J (2008) The skin: an indispensable barrier. Experimental Dermatology 17: 1063–1072 Prospero E, Raffo M, Bagnoli M, Appignanesi R & D’Errico M (1997) Diphtheria: epidemiological update and review of prevention and control strategies. European Journal of Epidemiology 13: 527–534 Quinton P, Elder H, Jenkinson D & Bovell D (1999) Structure and function of human sweat glands. Antiperspirants and Deodorants 20: 17–58 Ramamoorthy A (2009) Beyond NMR spectra of antimicrobial peptides: dynamical images at atomic resolution and functional insights. Solid State Nuclear Magnetic Resonance 35: 201–207 Rappert S & Muller R (2005) Odor compounds in waste gas emissions from agricultural operations and food industries. Waste Management 25: 887–907 Rennie P, Gower D & Holland K (1991) In-vitro and in-vivo studies of human axillary odour and the cutaneous microflora. British Journal of Dermatology 124: 596–602 Rintala H, Pitkäranta M, Toivola M, Paulin L & Nevalainen A (2008) Diversity and seasonal dynamics of bacterial community in indoor environment. BMC Microbiology 8: 1–13 Rodríguez-Lázaro D, Jofré A, Aymerich T, Hugas M & Pla M (2004) Rapid quantitative detection of Listeria monocytogenes in meat products by real-time PCR. Applied and Environmental Microbiology 70: 6299–6301 Romero-Steiner S, Witek T & Balish E (1990) Adherence of skin bacteria to human epithelial cells. Journal of Clinical Microbiology 28: 27–31 77
LITERATUURLIJST
Rosenthal M, Goldberg D, Aiello A, Larson E & Foxman B (2011) Skin microbiota: microbial community structure and its potential association with health and disease. Infection, Genetics and Evolution 11: 839–48 Roth RR & James WD (1988) Microbial ecology of the skin. Annual Review of Microbiology 42: 441–461 Sadoyma G, Diogo Filho A & Gontijo Filho P (2006) Central venous catheter- related bloodstream infection caused by Staphylococcus aureus: microbiology and risk factors. Brazilian Journal of Infectious Diseases 10: 100–106 Sahl H (1994) Staphylococcin 1580 is identical to the lantibiotic epidermin: implications for the nature of bacteriocins from Grampositive bacteria. Applied and Environmental Microbiology 60: 752–755 Shelley W, Hurley HJ & Nichols A (1953) Axillary odor; experimental study of the role of bacteria, apocrine sweat, and deodorants. A.M.A Archives of Dermatology and Syphilology 68: 430–446 Snydman D (2008) The safety of probiotics. Clinical Infectious Diseases 46: S104–S111 Soane D & Fujdala K (2005) Polymeric odor absorption ingredients for personal care products. Publication nr: WO2003088931 A3 Starkenmann C, Niclass Y, Troccaz M & Clark A (2005) Identification of the precursor of (S)3-methyl-3-sulfanylhexan-1-ol, the sulfury malodour of human axilla sweat. Chemistry & Biodiversity 2: 705–716 Storz G & Imlay J (1999) Oxidative stress. Current Opinion in Microbiology 2: 188–194 Tagami H (2008) Location-related differences in structure and function of the stratum corneum with special emphasis on those of the facial skin. International Journal of Cosmetic Science 30: 413–434 Tannock G (2003) Probiotics: time for a dose of realism. Current Issues in Intestinal Microbiology 4: 33–42 Taylor D, Daulby A, Grimshaw S, Jamesy G, Mercerz J & Vaziri S (2003) Characterization of the microflora of the human axilla. International Journal of Cosmetic Science 25: 137– 145 Troccaz M, Borchard G, Vuilleumier C, Raviot-Derrien S, Niclass Y, Beccucci S & Starkenmann C (2009a) Gender-specific differences between the concentrations of nonvolatile (R)/(S)-3-methyl-3-sulfanylhexan-1-Ol and (R)/(S)-3-hydroxy-3-methylhexanoic acid odor precursors in axillary secretions. Chemical Senses 34: 203–210 Troccaz M, Starkenmann C, Niclass Y, Van de Waal M & Clark A (2004) 3-Methyl-3sulfanylhexan-1-ol as a major descriptor for the human axilla-sweat odour profile. Chemistry & Biodiversity 1: 1022–1035 Viale P & Stefani S (2006) Vascular catheter-associated infections: a microbiological and therapeutic update. Journal of Chemotherapy 18: 235–249 Van de Wiele T (2012) Interphase processes of host associated microorganisms. Course. Ghent, Belgium. Faculty of Bioscience Engineering. pp. 214
78
LITERATUURLIJST
Van der Waaij D, Berghuis-de Vries J & Lekkerkerk-van der Wees J (1971) Colonization resistance of the digestive tract in conventional and antibiotic-treated mice. Journal of Hygiene 69: 405–411 Wassenaar T & Klein G (2008) Safety aspects and implications of regulation of probiotic bacteria in food and food supplements. Journal of Food Protection 71: 1734–1741 Wedekind C & Füri S (1997) Body odour preferences in men and women: do they aim for specific MHC combinations or simply heterozygosity? Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 264: 1471–1479 Wedekind C, Seebeck T, Bettens F & Paepke A (1995) MHC-dependent mate preferences in humans. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences 260: 245–249 Wichmann S, Wirsing von Koenig C, Becker-Boost E & Finger H (1985) Group JK corynebacteria in skin flora of healthy persons and patients. European Journal of Clinical Microbiology 4: 502–504 Wilson AD & Baietto M (2009) Applications and advances in electronic-nose technologies. Sensors 9: 5099–5148 Withiam M, Conley D & Simone M (2005) Compositions comprising odor neutralizing metal oxide silicates.Publication nr: WO2005034888 A1 Withiam M, Liu S, Conley D & Simone M (2004) Compositions comprising odor neutralizing calcium silicate. Publication nr: WO2004002407 A3 Wittebolle L, Vervaeren H, Verstraete W & Boon N (2008) Quantifying community dynamics of nitrifiers in functionally stable reactors. Applied and Environmental Microbiology 74: 286–293 Wongchoosuk C, Lutz M & Kerdcharoen T (2009) Detection and classification of human body odor using an electronic nose. Sensors 9: 7234–7249 Woodruff J (1994) On the scent of deodorant trends. Manufacturing Chemist 65: 34–38 Yoshiura K, Kinoshita A, Ishida T, Ninokata A, Ishikawa T & Kaname T (2006) A SNP in the ABCC11 gene is the determinant of human earwax type. Nature Genetics 38: 324–330 Yuwono A & Lammers P (2004) Odor pollution in the environment and the detection instrumentation. International Agricultural Engineering Journal 4: 1–33 Zeeuwen PL, Boekhorst J, Van den Bogaard EH, De Koning HD, Van de Kerkhof PM, Saulnier DM, Van Swam II, Van Hijum SA, Kleerebezem M, Schalkwijk J & Timmerman HM (2012) Microbiome dynamics of human epidermis following skin barrier disruption. Genome Biology 13: R101 Zeller V, Ghorbani A, Strady C, Leonard P, Mamoudy P & Desplaces N (2007) Propionibacterium acnes: an agent of prosthetic joint infection and colonization. Journal of Infection 55: 119–124 Zhang Z-M, Cai J-J, Ruan G-H & Li G-K (2005) The study of fingerprint characteristics of the emanations from human arm skin using the original sampling system by SPME-GC/MS. Journal of Chromatography B 822: 244–252
79
80
BIJLAGEN
8
BIJLAGEN I.
Figuur S1: DGGE-profiel isolaten vs. patiënten
Figuur S1: DGGE-profiel van enkele isolaten versus enkele stalen van P1, P2 en P3. Er werd getracht om de microbiële okselcomposities van patiënten P1, P2 en P3 te achterhalen door overeenkomstige okselstalen op DGGE gel te zetten, samen met de DGGE-profielen van enkele isolaten. Uit het bekomen DGGE-profiel kon echter geen duidelijke informatie worden gehaald wat betreft de microbiële okselgemeenschappen van de patiënten.
81
BIJLAGEN
II.
Figuur S2: Volledig DGGE-profiel P1
Figuur S2: DGGE-profiel van patiënt 1 (P1) gedurende behandeling 1 en 2. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, met donor 1 (D1) of spray 1 of 2. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel, tenzij er die dag geen quotering gebeurde (/). De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën zich bevinden.
82
BIJLAGEN
III.
Figuur S3: Volledig DGGE-profiel P2
DGGE-profiel van patiënt 2 (P2) gedurende behandeling 1 en 2. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, met donor 2 (D2) of spray 1 of 2. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel, tenzij er die dag geen quotering gebeurde (/). De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën zich bevinden. Figuur S3:
83
BIJLAGEN
IV.
Figuur S4: Volledig DGGE-profiel P3
Figuur S4: DGGE-profiel van patiënt 3 (P3) gedurende behandeling 2 en 3. Kolom A duidt de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en diens linker- (LO) of rechteroksel (RO) aan. Kolom B wijst erop of de staalname gebeurde voor de behandeling (-), dan wel van de behandelde (B) of de niet-behandelde oksel (NB). Kolom C geeft de datum van de laatste behandeling voor desbetreffende staalname weer. Kolom D vermeldt de behandelingsmethode, hier met spray 1 of 2 of een hoge concentratie opgegroeide S. epidermidis. In kolom E staat de gemiddelde hedonische waarde van de oksel gequoteerd door het geurpanel, tenzij er die dag geen quotering gebeurde (/). De linkse omkadering geeft weer waar de banden van S. epidermidis gesitueerd zijn, de rechtse omkadering waar de banden van corynebacteriën zich bevinden.
84
BIJLAGEN
V.
Figuur S5: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P2, B1
Figuur S5: Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 2 (P2), gedurende de eerste behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P2 werd de rechteroksel behandeld. De curves voor de start van de behandeling (12 09 19 en 12 09 25) van beide oksels behoren tot de curves die zich het meest rechts en onderaan situeren. Behandeling vond plaats op 12 09 25, 12 09 28 en 12 10 02. De curves links bovenaan komen overeen met stalen 12 09 26 RO, 12 09 28 RO, 12 09 28 LO en 12 10 03. De corresponderende DGGE-profielen van deze stalen vertonen een duidelijke aanwezigheid van S. epidermidis in grote aantallen, wat leidt tot een lagere diversiteit en minder gelijkheid.
85
BIJLAGEN
VI.
Figuur S6: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P2, B1
Figuur S6:
Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 2 (P2), gedurende de eerste behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P2 werd de rechteroksel behandeld. De curves voor de start van de behandeling (12 09 19 en 12 09 25) behoren tot de curves die zich het meest rechts en onderaan situeren. Behandeling vond plaats op 12 09 25, 12 09 28 en 12 10 02. Uit bovenstaande grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waargenomen worden.
86
BIJLAGEN
VII.
Figuur S7: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P1, B2
Figuur S7: Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 1 (P1), gedurende de tweede behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P1 werd de linkeroksel behandeld. De curves van 12 11 21 refereren naar de beginsituatie en behoren tot de middelste curves. Op 12 11 21 werd er gestart met het gebruik van spray 1, wat weerspiegeld wordt door de linksboven gelegen curve van de behandelde oksel (LO). Verder gebruik van spray 1 (tot 12 11 28) en spray 2 (12 11 28 – 12 12 05) zorgde niet voor een duidelijke verandering in ligging van de curves t.o.v. de beginsituatie.
87
BIJLAGEN
VIII.
Figuur S8: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P1, B2
Figuur S8: Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 1 (P1), gedurende de tweede behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P1 werd de linkeroksel behandeld. De curves van 12 11 21 refereren naar de beginsituatie. De invloed die de start van de behandeling met spray 1 op de Actinobacteria van P1 had wordt weergegeven door de ligging van curve 12 11 23 LO linksboven. Dit wijst op een daling van het aantal Actinobacteria (waartoe de corynebacteriën behoren), minder gelijkheid en een daling in diversiteit. Dit effect is slechts tijdelijk, de curve van 12 11 28 LO ligt onderaan rechts. Het gebruik van spray 2 (12 11 28 – 12 12 05) had, t.o.v. de referentiecurves, geen significante invloed op de ligging van curves 12 12 30 en 12 12 07.
88
BIJLAGEN
IX.
Figuur S9: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P2, B2
Figuur S9: Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 2 (P2), gedurende de tweede behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P2 werd de rechteroksel behandeld. De curves van 12 11 21 geven de situatie voor de start van de behandeling weer. Behandeling vond plaats met spray 1 (12 11 23 – 12 11 28) of spray 2 (12 11 28 – 12 12 05). Overeenkomstig met de DGGEprofielen van 12 11 23 LO, 12 11 28 LO en 12 11 28 RO, die een duidelijke aanwezigheid van staphylococcen tonen, liggen de corresponderende curves onderaan rechts. De staphylococcen konden de gemeenschap niet domineren en zorgden enkel voor een toevoeging van extra banden, naast de bestaande microbiële gemeenschap. Dit zorgde ervoor dat een rijkere en meer gelijke gemeenschap bekomen werd.
89
BIJLAGEN
X.
Figuur S10: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P2, B2
Figuur S10: Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 2 (P2), gedurende de tweede behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P2 werd de rechteroksel behandeld. De curves van 12 11 21 geven de situatie voor de start van de behandeling weer. Behandeling vond plaats met spray 1 (12 11 23 – 12 11 28) of spray 2 (12 11 28 – 12 12 05). Uit bovenstaande grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waargenomen worden.
90
BIJLAGEN
XI.
Figuur S11: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P3, B2
Figuur S11: Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 3 (P3), gedurende de tweede behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P3 werd de rechteroksel behandeld. De curves van 12 11 21 geven de situatie voor de start van de behandeling weer. Behandeling vond plaats met spray 1 (12 11 23 – 12 11 28) of spray 2 (12 11 28 – 12 12 05). Uit bovenstaande grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Firmicutes waargenomen worden.
91
BIJLAGEN
XII.
Figuur S12: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P3, B2
Figuur S12: Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 3 (P3), gedurende de tweede behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P3 werd de rechteroksel behandeld. De curves van 12 11 21 geven de situatie voor de start van de behandeling weer. Behandeling vond plaats met spray 1 (12 11 23 – 12 11 28) of spray 2 (12 11 28 – 12 12 05). Uit bovenstaande grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waargenomen worden.
92
BIJLAGEN
XIII.
Figuur S13: Pareto-Lorenz curve: Firmicutes P3, B3
Figuur S13: Pareto-Lorenz curves voor de Firmicutes van patiënt 3 (P3), gedurende de derde behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P3 werd de rechteroksel behandeld. Behandeling vond plaats op 13-03-06, 13-03-13 en 13-03-20. De curve corresponderend met de eerste dag van behandeling situeert zich bovenaan links, wat kan wijzen op een ongelijke gemeenschap met vooral staphylococcen (zoals ook te zien op het DGGE-profiel). De curves overeenkomstig met de andere twee dagen van behandeling liggen meer rechts onderaan, wat een meer gelijk verdeelde gemeenschap voorstelt. Op die dagen kon de gemeenschap zich wellicht sneller aanpassen en konden de aangebrachte staphyloccen zich moeilijker nestelen of uitgroeien. Uit bovenstaande grafiek kan geen duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Firmicutes vastgesteld worden.
93
BIJLAGEN
XIV.
Figuur S14: Pareto-Lorenz curve: Actinobacteria P3, B3
Figuur S14: Pareto-Lorenz curves voor de Actinobacteria van patiënt 3 (P3), gedurende de derde behandelingsperiode. In de legende staan de datum van staalname (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en de linker- (LO) of rechteroksel (RO). Bij P3 werd de rechteroksel behandeld. Behandeling vond plaats op 13-03-06, 13-03-13 en 13-03-20. Uit bovenstaande grafiek is het niet mogelijk een duidelijke invloed van het spraygebruik op de diversiteit en gelijkheid van de Actinobacteria waar te nemen.
94
BIJLAGEN
XV.
Tabel S1: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P1, B1
Tabel S1: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Firmicutes van patiënt 1 gedurende de eerste behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De linkeroksel van patiënt 1 werd behandeld. Staal 12 09 17 P1 LO 12 09 24 P1 LO 12 09 25 P1 LO 12 09 26 P1 LO 12 09 27 P1 LO 12 10 01 P1 LO 12 10 03 P1 LO 12 10 05 P1 LO 12 10 09 P1 LO Gemiddelde
XVI.
Tabel
Co 88,51 89,94 78,37 79,10 78,77 85,59 77,76 83,95 82,01 82,67
S2:
# Banden 7 6 12 15 10 7 11 8 8 9,33
Community
Staal 12 09 17 P1 RO 12 09 24 P1 RO 12 09 25 P1 RO 12 09 26 P1 RO 12 09 27 P1 RO 12 10 03 P1 RO 12 10 05 P1 RO 12 10 09 P1 RO
Co 86,76 87,04 85,83 83,27 79,38 79,46 81,66 78,66
# Banden 7 8 9 10 8 10 10 9
Gemiddelde
82,76
8,88
organization
en
aantal
banden:
Actinobacteria, P1, B1 Tabel S2: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Actinobacteria van patiënt 1 gedurende de eerste behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De linkeroksel van patiënt 1 werd behandeld. Staal 12 09 17 P1 LO 12 09 24 P1 LO 12 09 25 P1 LO 12 09 26 P1 LO 12 09 27 P1 LO 12 10 01 P1 LO 12 10 03 P1 LO 12 10 05 P1 LO 12 10 09 P1 LO Gemiddelde
Co 66,26 68,30 71,21 66,19 81,58 85,63 79,65 87,16 79,93 76,21
# Banden 12 11 12 11 7 5 9 5 6 8,67
95
Staal 12 09 17 P1 RO 12 09 24 P1 RO 12 09 25 P1 RO 12 09 26 P1 RO 12 09 27 P1 RO 12 10 03 P1 RO 12 10 05 P1 RO 12 10 09 P1 RO
Co 62,11 68,31 70,88 75,83 82,13 95,65 88,49 89,00
# Banden 13 11 10 9 8 1 4 3
Gemiddelde
79,05
7,38
BIJLAGEN
XVII.
Tabel S3: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P2, B1
Tabel S3: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Firmicutes van patiënt 2 gedurende de eerste behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 2 werd behandeld. Staal 12 09 19 P2 LO 12 09 25 P2 LO 12 09 26 P2 LO 12 09 27 P2 LO 12 09 28 P2 LO 12 10 03 P2 LO 12 10 05 P2 LO 12 10 09 P2 LO Gemiddelde
XVIII.
Tabel
S4:
Co 77,79 79,23 72,48 78,26 90,11 76,48 87,40 82,59 80,54
# Banden 9 6 10 7 4 8 4 6 6,75
Community
Staal 12 09 19 P2 RO 12 09 25 P2 RO 12 09 26 P2 RO 12 09 27 P2 RO 12 09 28 P2 RO 12 10 03 P2 RO 12 10 05 P2 RO 12 10 09 P2 RO Gemiddelde
organization
en
Co 80,38 68,56 96,00 80,84 91,63 86,23 82,88 89,73 84,53
aantal
# Banden 6 9 1 6 4 5 6 5 5,25
banden:
Actinobacteria, P2, B1 Tabel S4: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Actinobacteria van patiënt 2 gedurende de eerste behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 2 werd behandeld. Staal 12 09 19 P2 LO 12 09 25 P2 LO 12 09 27 P2 LO 12 09 28 P2 LO 12 10 03 P2 LO 12 10 05 P2 LO 12 10 09 P2 LO
Co 76,12 82,71 85,81 82,94 88,49 90,11 84,81
# Banden 8 5 6 9 6 4 5
Gemiddelde
84,43
6,14
Staal 12 09 19 P2 RO 12 09 25 P2 RO 12 09 26 P2 RO 12 09 27 P2 RO 12 09 28 P2 RO 12 10 03 P2 RO 12 10 05 P2 RO 12 10 09 P2 RO Gemiddelde
96
Co 78,71 60,83 78,45 85,37 88,91 84,83 87,43 84,89 81,18
# Banden 7 12 8 6 4 9 7 7 7,50
BIJLAGEN
XIX.
Tabel S5: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P1, B2
Tabel S5: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Firmicutes van patiënt 1 gedurende de tweede behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De linkeroksel van patiënt 1 werd behandeld. Staal 12 11 21 P1 LO 12 11 23 P1 LO 12 11 28 P1 LO 12 11 30 P1 LO 12 12 07 P1 LO 12 12 13 P1 LO 12 12 19 P1 LO Gemiddelde
XX.
Tabel
Co 73,31 81,64 68,20 58,79 68,84 72,47 57,74 68,71
S6:
# Banden 7 8 9 10 8 7 9 8,29
Community
Staal 12 11 21 P1 RO 12 11 23 P1 RO 12 11 30 P1 RO 12 12 07 P1 RO 12 12 13 P1 RO 12 12 19 P1 RO
Co 65,87 65,27 73,70 61,69 84,68 51,98
#Banden 8 8 6 9 3 10
Gemiddelde
67,20
7,33
organization
en
aantal
banden:
Actinobacteria, P1, B2 Tabel S6: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Actinobateria van patiënt 1 gedurende de tweede behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P1) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De linkeroksel van patiënt 1 werd behandeld. Staal 12 11 21 P1 LO 12 11 23 P1 LO 12 11 28 P1 LO 12 11 30 P1 LO 12 12 07 P1 LO 12 12 13 P1 LO 12 12 19 P1 LO Gemiddelde
Co 70,07 89,56 86,36 78,36 84,01 91,16 84,76 83,47
# Banden 9 2 4 6 4 3 10 5,43
97
Staal 12 11 21 P1 RO 12 11 23 P1 RO 12 11 30 P1 RO 12 12 07 P1 RO 12 12 13 P1 RO 12 12 19 P1 RO
Co 77,15 81,33 67,23 73,78 81,53 82,10
# Banden 7 4 9 8 5 5
Gemiddelde
77,19
6,33
BIJLAGEN
XXI.
Tabel S7: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P2, B2
Tabel S7: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Firmicutes van patiënt 2 gedurende de tweede behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 2 werd behandeld. Staal 12 11 21 P2 LO 12 11 23 P2 LO 12 11 28 P2 LO 12 11 30 P2 LO 12 12 05 P2 LO 12 12 07 P2 LO 12 12 12 P2 LO 12 12 19 P2 LO Gemiddelde
XXII.
Tabel
Co 87,00 80,10 77,91 89,46 87,62 95,65 92,21 80,67 86,33
S8:
# Banden 4 8 9 4 4 1 2 11 5,38
Community
Staal 12 11 21 P2 RO 12 11 23 P2 RO 12 11 28 P2 RO 12 11 30 P2 RO 12 12 05 P2 RO 12 12 07 P2 RO 12 12 12 P2 RO 12 12 19 P2 RO Gemiddelde
organization
en
Co 85,31 84,66 66,61 85,59 90,40 89,77 95,65 93,01 86,38
aantal
# Banden 5 5 12 5 3 3 1 2 4,50
banden:
Actinobacteria, P2, B2 Tabel S8: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Actinobacteria van patiënt 2 gedurende de tweede behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P2) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 2 werd behandeld. Staal 12 11 21 P2 LO 12 11 23 P2 LO 12 11 28 P2 LO 12 11 30 P2 LO 12 12 05 P2 LO 12 12 07 P2 LO 12 12 12 P2 LO 12 12 19 P2 LO Gemiddelde
Co 83,19 84,28 78,25 73,96 86,77 91,25 89,53 84,65 83,99
# Banden 6 6 10 11 6 5 5 6 6,88
Staal 12 11 21 P2 RO 12 11 23 P2 RO 12 11 28 P2 RO 12 11 30 P2 RO 12 12 05 P2 RO 12 12 07 P2 RO 12 12 12 P2 RO 12 12 19 P2 RO Gemiddelde
98
Co 72,73 84,26 76,93 81,32 77,52 85,46 90,57 92,70 82,68
# Banden 9 6 9 9 11 7 5 4 7,50
BIJLAGEN
XXIII.
Tabel
S9:
Community
organization
en
aantal
banden:
Actinobacteria, P3, B2 Tabel S9: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Firmicutes van patiënt 3 gedurende de tweede behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 3 werd behandeld. Staal 12 11 21 P3 LO 12 11 23 P3 LO 12 11 28 P3 LO 12 11 30 P3 LO 12 12 05 P3 LO 12 12 07 P3 LO 12 12 12 P3 LO 12 12 19 P3 LO Gemiddelde
XXIV.
Tabel
Co 74,09 64,52 71,79 57,63 71,44 71,55 62,32 78,44 68,97
S10:
# Banden 7 12 7 12 9 8 11 6 9,00
Community
Staal 12 11 21 P3 RO 12 11 23 P3 RO 12 11 28 P3 RO 12 11 30 P3 RO 12 12 05 P3 RO 12 12 07 P3 RO 12 12 12 P3 RO 12 12 19 P3 RO Gemiddelde
organization
en
Co 71,58 64,96 71,64 58,54 60,03 72,19 62,30 76,52 67,22
aantal
# Banden 7 11 10 11 12 8 10 9 9,75
banden:
Actinobacteria, P3, B2 Tabel S10: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Actinobacteria van patiënt 3 gedurende de tweede behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 3 werd behandeld. Staal 12 11 21 P3 LO 12 11 23 P3 LO 12 11 28 P3 LO 12 11 30 P3 LO 12 12 05 P3 LO 12 12 07 P3 LO 12 12 12 P3 LO 12 12 19 P3 LO Gemiddelde
Co 69,83 75,26 74,66 66,06 78,30 74,58 68,92 82,33 73,74
# Banden 8 6 6 10 5 6 8 5 6,75
Staal 12 11 21 P3 RO 12 11 23 P3 RO 12 11 28 P3 RO 12 11 30 P3 RO 12 12 05 P3 RO 12 12 07 P3 RO 12 12 12 P3 RO 12 12 19 P3 RO Gemiddelde
99
Co 82,61 67,46 72,42 52,68 71,80 74,55 70,72 72,72 70,62
# Banden 5 8 7 13 6 6 8 9 7,75
BIJLAGEN
XXV.
Tabel S11: Community organization en aantal banden: Firmicutes, P3, B3
Tabel S11: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Firmicutes van patiënt 3 gedurende de derde behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 3 werd behandeld. Staal 13 03 06 P3 LO 13 03 08 P3 LO 13 03 13 P3 LO 13 03 15 P3 LO 13 03 20 P3 LO 13 03 21 P3 LO 13 03 25 P3 LO 13 03 27 P3 LO 13 04 04 P3 LO Gemiddelde
XXVI.
Tabel
S12:
Co 55,04 66,89 61,17 69,68 62,09 73,83 79,59 49,63 72,63 65,62
# Banden 14 9 11 11 11 9 8 13 8 10,44
Community
Staal 13 03 06 P3 RO 13 03 08 P3 RO 13 03 13 P3 RO 13 03 15 P3 RO 13 03 20 P3 RO 13 03 21 P3 RO 13 03 25 P3 RO 13 03 27 P3 RO 13 04 04 P3 RO Gemiddelde
organization
en
Co 82,30 67,85 64,09 77,53 63,88 76,14 69,83 69,60 64,50 70,64
# Banden 7 9 10 9 11 8 9 8 10 9,00
aantal
banden:
Actinobacteria, P3, B3 Tabel S12: Community organization (Co) en het aantal banden op DGGE betreffende de Actinobacteria van patiënt 3 gedurende de derde behandelingsperiode. De benaming van de staal weergeeft de datum (jj mm dd), de patiënt (hier P3) en linker- (LO) of rechteroksel (RO). De rechteroksel van patiënt 3 werd behandeld. Staal 13 03 06 P3 LO 13 03 08 P3 LO 13 03 13 P3 LO 13 03 15 P3 LO 13 03 20 P3 LO 13 03 21 P3 LO 13 03 25 P3 LO 13 03 27 P3 LO 13 04 04 P3 LO Gemiddelde
Co 83,28 83,73 79,76 70,33 69,02 61,62 72,85 49,81 75,79 71,80
# Banden 2 3 3 4 4 5 5 8 3 4,11
Staal 13 03 06 P3 RO 13 03 08 P3 RO 13 03 13 P3 RO 13 03 15 P3 RO 13 03 20 P3 RO 13 03 21 P3 RO 13 03 25 P3 RO 13 03 27 P3 RO 13 04 04 P3 RO Gemiddelde
100
Co 72,70 82,83 81,54 82,92 79,37 78,94 78,97 76,91 83,73 79,77
# Banden 3 2 2 2 3 3 3 3 2 2,56
BIJLAGEN
XXVII.
Broncode in R-Studio
Bibliotheken laden en data inlezen \documentclass[a4]{article} \usepackage{rotate} \usepackage{verbatim} \usepackage[plainpages=false]{hyperref} \hypersetup{ pdftitle = {Report statistical analysis}, pdfsubject = {Microbial diversity, multivariate, statistics}, pdfkeywords = {multivariate analysis} } \usepackage{pdflscape} %activate lscape instead of pdflscape for printing \begin{document} \SweaveOpts{concordance=TRUE} \title{Report mulitvariate analysis \\ Data Tess Plaquet} \author{ir. Frederiek - Maarten Kerckhof} \date{\today} \maketitle \tableofcontents \section[EDA]{Exploratory data analysis} <
>= ####inlezen van bibs#### library(reshape2) library(ggplot2) library(GGally) library(lattice) library(MASS) library(vegan) library(gplots) library(RColorBrewer) require(Rcpp) require(inline) library(mvnormtest) library(Hotelling) ####Inlezen van data#### #setwd("~/Dropbox/_PhD/Statistics_data/Tess/Masterfiles") Beh1<-read.csv2('Behandeling 1.csv') Beh2<-read.csv2('Behandeling 2.csv') Beh3<-read.csv2('Behandeling 3.csv') ####Verwijderen nutteloze R&K #### 101
BIJLAGEN
Beh1<-Beh1[2:255,1:13] Beh2<-Beh2[,1:13] Beh3<-Beh3[,1:13] Pairwise scatterplot #eerst alle nuttige variabelen selecteren Beh1.X<-Beh1[,5:12] Beh2.X<-Beh2[,5:12] Beh3.X<-Beh3[,5:12] Beh3.X.num<-transform(Beh3.X, Hedonische_waarde=as.numeric(as.character(Hedonische_waarde)), Intensiteit=as.numeric(as.character(Intensiteit)), Kaasachtig=as.numeric(as.character(Kaasachtig)), Ammoniak=as.numeric(as.character(Ammoniak)), Zweterig=as.numeric(as.character(Zweterig)), Muf=as.numeric(as.character(Muf)), Zuur=as.numeric(as.character(Zuur)), Scherp=as.numeric(as.character(Scherp))) Beh.X<-rbind(Beh1.X,Beh2.X,Beh3.X) Beh.X.num<-sapply(Beh.X,as.numeric) @ \begin{figure}[H] \begin{center} \setkeys{Gin}{width=1.2\textwidth} <>= pairs(Beh.X.num) #vrij subjectief @ \end{center} \end{figure} \begin{landscape} \begin{figure}[H] \begin{center} \setkeys{Gin}{width=\textwidth} <>= pairskernelcor
BIJLAGEN
\end{figure} \end{landscape} Box-and-whiskerplots \subsection{Box-and-whiskerplots} \begin{figure}[H] \begin{center} \setkeys{Gin}{width=\textwidth} <>= Beh1.X.stand<-decostand(Beh1.X,method="range",na.rm=T) Beh1.BNB.X<-cbind(Beh1$B.NB,Beh1.X.stand) names(Beh1.BNB.X)[1]<-"BNB" B1BNB.X.melt<-melt(Beh1.BNB.X) par(mfrow=c(1,1)) bwplot(value~BNB|variable,data=B1BNB.X.melt,main="Behandeling 1") @ \caption{Box-and-whiskerplots of treatment 1. All variable scores were rescaled to a range between 0 and 1, on a per-variable basis. Clearly only differences can be seen for the variable 'zweet' and 'ammonium'. \label{fig:bwplot1}} \end{center} \end{figure} \begin{figure}[H] \begin{center} \setkeys{Gin}{width=\textwidth} <>= Beh2.X.stand<-decostand(Beh2.X,method="range",na.rm=T) Beh2.BNB.X<-cbind(Beh2$B.NB,Beh2.X.stand) names(Beh2.BNB.X)[1]<-"BNB" B2BNB.X.melt<-melt(Beh2.BNB.X) bwplot(value~BNB|variable,data=B2BNB.X.melt,main="Behandeling 2") @ \caption{Box-and-whiskerplots of treatment 2. All variable scores were rescaled to a range between 0 and 1, on a per-variable basis.\label{fig:bwplot2}} \end{center} \end{figure} \begin{figure}[H] \begin{center} \setkeys{Gin}{width=\textwidth} <>= 103
BIJLAGEN
Beh3.X.stand<-decostand(Beh3.X.num,method="range",na.rm=T) Beh3.BNB.X<-cbind(Beh3$B.NB,Beh3.X.stand) names(Beh3.BNB.X)[1]<-"BNB" B3BNB.X.melt<-melt(Beh3.BNB.X) bwplot(value~BNB|variable,data=B3BNB.X.melt,main="Behandeling 3") @ \caption{Box-and-whiskerplots of treatment 3. All variable scores were rescaled to a range between 0 and 1, on a per-variable basis.\label{fig:bwplot2}} \end{center} \end{figure} \begin{landscape} <>= Beh1.BNB.X.P<-cbind(Beh1$Patiënt,Beh1.BNB.X) names(Beh1.BNB.X.P)[1]<-'Pat' Beh1.BNB.X.P$BNB<-as.factor(as.character(Beh1.BNB.X.P$BNB)) locs<-vector(mode="numeric",length=((length(names(Beh1.BNB.X))-1)*2)) locs[1]<-1 for(i in 2:length(locs)) { if(i%%2==0) { locs[i]<-locs[i-1]+0.5 }else{ locs[i]<-locs[i-1]+1 } } colorvect<-c("green","red") Pat.X<-split(Beh1.BNB.X.P,Beh1.BNB.X.P$Pat) #par(mfrow=c(1,(length(Pat.X)-1))) for(i in 2:length(Pat.X)) { Pat.plot<-Pat.X[[i]] filename<-paste("Boxplot_T1_",Pat.plot$Pat[1],".pdf",sep="") pdf(file=filename,height=6,width=8) boxplot(do.call("c",lapply(decostand(Pat.plot[,3:ncol(Pat.plot)],method="range",na.rm=T),fun ction(v) split(v,Pat.plot$BNB))),col=colorvect, boxwex=0.2, at=locs, las=2, axes=F, main=paste("Boxplot for patiënt ",Pat.plot[1,1],sep="")) axis(2) treatment<-c("B","NB")
104
BIJLAGEN
locsmeanv<-seq(2,24,3) axis(1, labels = colnames(Beh2.BNB.X)[-1], at = locsmeanv, las=2, cex.axis=0.8) box() legend(1,0.95,treatment,fill=c('green','red')) dev.off() cat("\\begin{figure}[H]\n") cat("\\begin{center}\n") cat("\\setkeys{Gin}{width=1.2\\textwidth}\n") cat("\\includegraphics{",filename,"}\n\n",sep="") cat(paste("\\caption{Box-and-whiskerplots of treatment 1 for patient ",Pat.plot$Pat[1],". All variable scores were rescaled to a range between 0 and 1, on a per-variable basis.\\label{fig:bwplot3:",Pat.plot$Pat[1],"}}",sep="")) cat("\\end{center}") cat("\\end{figure}") } @ <>= Beh2.BNB.X.P<-cbind(Beh2$Patiënt,Beh2.BNB.X) names(Beh2.BNB.X.P)[1]<-'Pat' locs<-vector(mode="numeric",length=((length(names(Beh2.BNB.X))-1)*2)) locs[1]<-1 for(i in 2:length(locs)) { if(i%%2==0) { locs[i]<-locs[i-1]+0.5 }else{ locs[i]<-locs[i-1]+1 } } colorvect<-c("green","red") Pat.X<-split(Beh2.BNB.X.P,Beh2.BNB.X.P$Pat) par(mfrow=c(1,(length(Pat.X)))) for(i in 1:length(Pat.X)) { Pat.plot<-Pat.X[[i]] filename<-paste("Boxplot_T2_",Pat.plot$Pat[1],".pdf",sep="") pdf(file=filename,height=6,width=8) boxplot(do.call("c",lapply(decostand(Pat.plot[,3:ncol(Pat.plot)],method="range",na.rm=T),fun ction(v) split(v,Pat.plot$BNB))),col=colorvect, boxwex=0.2, at=locs, las=2, axes=F, main=paste("Boxplot for patiënt ",Pat.plot[1,1],sep="")) 105
BIJLAGEN
axis(2) treatment<-c("B","NB") ind<-seq(1,length(locs)) locsE<-locs[even(ind)] locsO<-locs[odd(ind)] locsmeanv<-apply(rbind(locsE,locsO),MARGIN=2,FUN=mean) axis(1, labels = colnames(Beh2.BNB.X)[-1], at = locsmeanv, las=2, cex.axis=0.8) box() legend(10,0.95,treatment,fill=c('green','red')) dev.off() cat("\\begin{figure}[H]\n") cat("\\begin{center}\n") cat("\\setkeys{Gin}{width=1.2\\textwidth}\n") cat("\\includegraphics{",filename,"}\n\n",sep="") cat(paste("\\caption{Box-and-whiskerplots of treatment 2 for patient ",Pat.plot$Pat[1],". All variable scores were rescaled to a range between 0 and 1, on a per-variable basis.\\label{fig:bwplot4:",Pat.plot$Pat[1],"}}",sep="")) cat("\\end{center}") cat("\\end{figure}") } @ <>= Beh3.BNB.X.P<-cbind(Beh3$Patiënt,Beh3.BNB.X) names(Beh3.BNB.X.P)[1]<-'Pat' locs<-vector(mode="numeric",length=((length(names(Beh3.BNB.X))-1)*2)) locs[1]<-1 for(i in 2:length(locs)) { if(i%%2==0) { locs[i]<-locs[i-1]+0.5 }else{ locs[i]<-locs[i-1]+1 } } colorvect<-c("green","red") Pat.X<-split(Beh3.BNB.X.P,Beh3.BNB.X.P$Pat) #par(mfrow=c(1,(length(Pat.X)))) for(i in 1:length(Pat.X)) { Pat.plot<-Pat.X[[i]] filename<-paste("Boxplot_T3_",Pat.plot$Pat[1],".pdf",sep="") 106
BIJLAGEN
pdf(file=filename,height=6,width=8) boxplot(do.call("c",lapply(decostand(Pat.plot[,3:ncol(Pat.plot)],method="range",na.rm=T),fun ction(v) split(v,Pat.plot$BNB))),col=colorvect, boxwex=0.2, at=locs, las=2, axes=F, main=paste("Boxplot for patiënt ",Pat.plot[1,1],sep="")) axis(2) treatment<-c("B","NB") ind<-seq(1,length(locs)) locsE<-locs[even(ind)] locsO<-locs[odd(ind)] locsmeanv<-apply(rbind(locsE,locsO),MARGIN=2,FUN=mean) axis(1, labels = colnames(Beh2.BNB.X)[-1], at = locsmeanv, las=2, cex.axis=0.8) box() legend(10,0.95,treatment,fill=c('green','red')) dev.off() cat("\\begin{figure}[H]\n") cat("\\begin{center}\n") cat("\\setkeys{Gin}{width=1.2\\textwidth}\n") cat("\\includegraphics{",filename,"}\n\n",sep="") cat(paste("\\caption{Box-and-whiskerplots of treatment 3 for patient ",Pat.plot$Pat[1],". All variable scores were rescaled to a range between 0 and 1, on a per-variable basis.\\label{fig:bwplot4:",Pat.plot$Pat[1],"}}",sep="")) cat("\\end{center}") cat("\\end{figure}") } @ \end{landscape} Spearman en Kendall heatmaps \section{Correlation analysis} \begin{figure}[H] \begin{center} <>= fullcor.spearman<-cor(Beh.X.num,use="na.or.complete",method="spearman") lichtnrdonkerpal<-brewer.pal(9,"YlOrRd") heatmap.2(abs(fullcor.spearman),trace="none",col=lichtnrdonkerpal,dendrogram="none",cell note=signif((fullcor.spearman),digits=3),notecex=1,notecol="black") @ \end{center} \end{figure} \begin{figure}[H] 107
BIJLAGEN
\begin{center} <>= fullcor.kendall<-cor(Beh.X.num,use="na.or.complete",method="kendall") lichtnrdonkerpal<-brewer.pal(9,"YlOrRd") heatmap.2(abs(fullcor.kendall),trace="none",col=lichtnrdonkerpal,dendrogram="none",cellnot e=signif((fullcor.kendall),digits=3),notecex=1,notecol="black") @ \end{center} \end{figure} <>= library(xtable) Beh.X.num<-sapply(Beh.X,as.numeric) Beh.X.num.hedinv<-as.data.frame(Beh.X.num) names(Beh.X.num.hedinv)[1]<-"Hedon" Beh.X.num.hedinv$Hedon<- -(Beh.X.num.hedinv$Hedon) Beh.X.std<-decostand(Beh.X.num.hedinv,method="range",na.rm=T) #Beh.X.hedinv<-as.data.frame(Beh.X.num) #Beh.X.hedinv$Hedon<- -(Beh.X.hedinv$Hedon) #invert hedonic value for alternative hypothesis #names(Beh.X.hedinv)[1]<-"Hedon" #combkol<-combn(1:ncol(Beh.X.hedinv),2) combkol<-combn(1:ncol(Beh.X.std),2) pvals<-matrix(0,nrow=ncol(combkol),ncol=1) compchars<-character(length=ncol(combkol)) for(i in 1:ncol(combkol)) { k1<-Beh.X.std[,combkol[1,i]] k2<-Beh.X.std[,combkol[2,i]] nk1<-names(Beh.X.std)[combkol[1,i]] nk2<-names(Beh.X.std)[combkol[2,i]] a
BIJLAGEN
correction
was
used.","Spearman
correlation
significance"),label="tab:spearsig",digits=4,display=c("f","s","g")),caption.placement="top",inc lude.rownames=F) @ <>= library(xtable) Beh.X.hedinv<-as.data.frame(Beh.X.num) Beh.X.hedinv$Hedon<- -(Beh.X.hedinv$Hedon) #invert hedonic value for alternative hypothesis names(Beh.X.hedinv)[1]<-"Hedon" combkol<-combn(1:ncol(Beh.X.hedinv),2) pvals<-matrix(0,nrow=ncol(combkol),ncol=1) compchars<-character(length=ncol(combkol)) for(i in 1:ncol(combkol)) { k1<-Beh.X.hedinv[,combkol[1,i]] k2<-Beh.X.hedinv[,combkol[2,i]] nk1<-names(Beh.X.hedinv)[combkol[1,i]] nk2<-names(Beh.X.hedinv)[combkol[2,i]] a
rank
correlation
coefficient on the full dataset with inverted hedonic value and hence single sided alternative hypothesis of correlation values greater than 0. An asymptotic t-approximation with continuity correction was used.","Kendall correlation significance"),label="tab:kendallsig",digits=3,display=c("f","s","g")),caption.placement="top",i nclude.rownames=F)
109
