Genetikai változatosság (állat csoportok) Pénzes Zsolt, Bihari Péter és Raskó István SZBK Genetika Intézet A pályázati munkatervnek megfelelően első évben elsősorban a részletes elemzésre kiválasztott fajjal (Umbra krameri) foglalkoztunk, célunk a módszerek optimalizálása volt. Azonban a tervektől eltérően EcoTILLING helyett mikroszatellit elemzést végzünk. Ahogy a pályázatban (5. oldal) is említettük, ez utóbbi a populáció szerkezeti kérdések elemzésének egyik leginkább bevált módszere, amelyet széles körben alkalmaznak (ezt igazolja a szakterület vezető folyóiratában, a Molecular Ecology-ban folyamatosan megjelenő cikkek sokasága, de hasonlóan meghatározó a természetvédelmi orientációjú vizsgálatokban is, pl. Conservation Genetics). Alkalmazhatóságának alapvető korláta az, hogy előzetes szekvencia információkat igényel: ahhoz, hogy az egyedeket genotipizálni tudjuk, a genom régiókra specifikus PCR primerekre van szükség. Ez egyik kiválasztott fajra sem állt rendelkezésre a pályázat benyújtása idején. Új mikroszatellitek izolálása meglehetősen költséges, illetve a fajok közötti alkalmazhatóság még közeli rokon fajok esetén is nagyon bizonytalan. Ezért javasoltuk kiindulásképpen az EcoTILLING módszert, amely lényegesen nagyobb kapacitást és költséget igényel, így ezzel a módszerrel kevesebb minta elemezhető a rendelkezésre álló keretből. De semmivel nem ad több információt, mint a mikroszatellit, így az EcoTILLING használata értelmetlen, ha a mikroszatellit elemzés kivitelezhető. 2009 évben 9 mikroszatellit régiót közöltek le az általunk is vizsgált fajra (Winkler és Weiss 2009). Ezek a mikroszatellit lokuszok tetranukleotid ismétlődő egységekből állnak, lehetővé téve az allélok egyértelmű azonosítását. Továbbá kipróbálásra kerültek Magyarországról származó mintákra is, így a régióban mutatott változatosságáról is informálódhattunk. Célunk ezeknek a kipróbálása, optimalizálása volt, első körben két populációra (Gögő-SzenkeNagyszekeres és Pocsaj, minták forrása: BLKI). Ez a következő főbb lépéseket jelenti:
DNS izolálása, tisztítása (eljárási lépések az 1. függelékben) PCR körülmények optimalizálása (2. és 3. függelék) PCR termékek ellenőrzése (szekvencia meghatározása, összevetése a leközölttel, 4. függelék) Teszt különböző populációkból származó egyedekre.
Mivel korábban már végeztünk mikroszatellit elemzést (Liker et al 2009), a kiértékeléshez szükséges szoftverek és tapasztalat rendelkezésre áll. Egy lokusz monomorfnak bizonyult (Tet9, ezt monomorfnak találta Winkler és Weiss is, mi sem találtuk jelét a változatosságnak). A Tet2 és Tet3 lokuszok azonosak (a két különböző primer pár ugyanazt a genomi régiót szaporítja fel), amelyből a Tet3 tisztább képet adott, ezért ezt tartottuk meg. Ilyen módon 7 régiónk maradt, amelyre az eljárási lépéseket sikerült optimalizálni és alkalmazhatónak tűnnek. Mivel az eljárás során az egyszerűbb agaróz gélen történő elválasztást használtuk, pillanatnyilag nehéz lenne megítélni a változatosságot. De 5 lokusz az eddigiek alapján (agaróz gél és szekvencia) is polimorfnak tűnik (3. és 4. függelék), pillanatnyilag a Tet6 és Tet8 lokuszokra ez kevésbé egyértelmű (de Winkler és Weiss alapján várhatóan polimorf). A PCR termékek mérete minden esetben a várt méret tartományba esett. Mindezek alapján a következő lépés a primerek fluoreszcens jelölése és az esetleges multiplex PCR lehetőségek feltérképezése, majd ezután következik a különböző populációkból
származó egyedek genotipizálása. Ez utóbbit kapilláris szekvenátor készüléken végezzük, ez a legbiztosabb eljárás a genotípus egyértelmű azonosítására. Tekintettel arra, hogy az EcoTILLING helyett mikroszatellit elemzést tudunk végezni, egy további fajt is be tudtunk vonni a részletesebb elemzésbe, ez a Gobio gobio. Mivel itt elsősorban taxonómiai kérdések tisztázása a cél, feltehetően DNS szekvenciák elemzése lesz a célravezető módszer. Leközölt információk alapján (Mendel et al 2008) a DNS izolálást megkezdtük (ez az 1. függelék szerint történik), a PCR primereket megrendeltük. A kivitelezéshez minden eszköz, szoftver és tapasztalat (pl. Bihari et al 2011) rendelkezésre áll.
Referencia Bihari P., Sipos B., Melika G., Fehér B., Somogyi K., Stone GN, Pénzes Zs (2011) Western Palearctic phylogeography of an inquiline gallwasp: Synergus umbraculus Olivier 1791 (Hymenoptera: Cynipidae: Synergini). Biol J Linn Soc 102:750–764. Liker A, Bókony V, Kucsár A, Tóth Z, Szabó K, Kaholek B, Pénzes Zs (2009) Genetic relatedness in wintering groups of house sparrows (Passer domesticus). Molecular Ecology 18:4696-4706 Mendel et al (2008) Molecular phylogeny of the genus Gobio Cuvier, 1816 (Teleostei: Cyprinidae) and its contribution to taxonomy. Molecular Phylogenetics and Evolution 47:1061–1075 Winkler K.A. és Weiss T. (2009) Nine new tetranucleotide microsatellite DNA markers for the European mudminnow Umbra crameri. Conservation Genetics 10:1155–1157
Függelék 1. DNS izolálás Az izolálás 96%-os etanolban tárolt uszony darabból történt, amelynek egyharmadát használtuk fel. Az izolálás főbb lépései az alábbiak („proteináz K” protokoll, ahol a protK emésztést fenol-kloroform-izoamil alkoholos tisztítás követi, Hoelzel 1998 alapján):
75 µl extrakciós puffer + 1.5 µl Prot K (20mg/ml), a minta szétdörzsölése steril pipettaheggyel, majd 120 perc inkubálás 55 ºC-on, időnként kevergetve, majd lefugálva 75 µl fenol-kloroform-izoamil alkohol elegy (PCI, 25:24:1 arányban) hozzáadása, forgatva keverés, kb. 5 perc inkubálás szobahőmérsékleten 5 perc centrifugálás (7000g) a felső, vizes fázis áthelyezése új Eppendorfba ehhez a vizes fázishoz 75 µl kloroform-izoamil alkoholt (CI, 24:1 arányban) adva, forgatva keverés kb. 5 percig szobahőmérsékleten 3 perc centrifugálás (7000g) felső fázist új Eppendorfba téve ehhez 0.1 térfogat (7-8 µl) 3M nátrium-acetátot és 22.5 térfogat (kb 150 µl) 96 %-os -20 ºC-os etanolt adunk, majd -20 ºC-on inkubáljuk (overnight).
5-7 perc centrifugálás (11000g) felülúszót eltávolítjuk, majd a maradékhoz 150 µl 70% etanolt adunk 5-7 perc centrifugálás (11000g) felülúszót leszívjuk feloldás 100 µl TE pufferben
Extrakciós puffer: 50 mM Tris pH 7,5, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1% (w/v) SDS TE puffer: 10 mM Tris pH 8, 1mM EDTA pH 8. Hivatkozás: Hoelzel A. R. (1998) Molecular genetic analysis of populations, a practical approach. Oxford University Press, Oxford, UK. 2. Mikroszatellit PCR protokoll A PCR reakció összetétele, 10 µl végtérfogatban: 1.5 mM MgCl2 250 µM mindegyik dNTP ből, 0.25 µM mindkét primerből 0.5 U Taq polymerase (Fermentast használtunk). Alap PCR program: 95 ºC (3 perc) 35 ciklus: 95 ºC (45 másodperc), Tm 20 mp, 72 ºC (30 mp) 72 ºC (7 perc) Gradiens PCR a hőmérséklet optimalizáláshoz: 42, 44, 45.4, 47.1, 49.2, 50.9, 53.1 ºC További optimalizálás (tet4, tet7): 53, 54.2, 55, 57.2, 59 ºC További optimalizálás (tet6, tet7, tet8): 45, 47.8, 51, 53.5, 55 ºC Az optimális annealing hőmérsékletek az alábbiak: tet1: 53 ºC tet2: 51 ºC tet3: 53.1 ºC tet4: 59 ºC tet5: 53.1 ºC tet6: 55 ºC tet7: 59 ºC tet8: 59 ºC tet9: 42-től 53.1 ºC-ig bármi jó A tet4 végül csak egy ,touchdown PCR programmal működött megbízhatóan: 1. ciklus 65 ºC, 2.: 63 ºC, 3.: 61 ºC, 4. ciklustól 59 ºC, illetve összesen ugyanúgy 35 ciklus, mint az alap PCR programban. A kipróbált PCR primerek szekvenciája (5'-3') Winkler és Weiss (2009) alapján: UkrTet1: UkrTet2: UkrTet3: UkrTet4:
F: F: F: F:
CATCAAATGTTGGCAGACTTGC AACACACAGACAGGACGTTCC GGGTGCCAGGCTGTTCTC AGACGGCAGCACATAAGAA
R: R: R: R:
GGGAAACCGCTATCCTGAC GGGAGAAAGATGGGTGCC ATCAATCGGACTAACGGTTCG ATTATTGGTGTCCATCCCTGTC
UkrTet5: UkrTet6: UkrTet7: UkrTet8: UkrTet9:
F: F: F: F: F:
TCACCGCACAAAAGAAACAC ATCGGTTTTTGCCCATCAGT CAATAGTTCCCCAATCCTGG CTTGGCTGTGGTGGTTGAA CACAGTCTCAATGGGGGAAA
R: R: R: R: R:
AACACCAGGGAACTGCAGTCT CCGCAGATCGAAAGTTTGAC GTCTCGACCACCAAGCG GGGGGAGTCCCTGC CCAAGCCTAACCTGCTAAAGA
Tet2 és Tet9 lokuszokat kivéve a többi használhatónak tűnik. 3. PCR optimalizálás példa Tet8 (baloldali ábra) és Tet6 (jobboldali ábra) PCR optimalizálása. A kapott PCR termékek elválasztása agaróz gélen történt, az ábra a hőmérséklettől való függést (és az optimalizálás jelentőségét) szemlélteti az U46 és U47 mintákra (Gögő-Szenke-Nagyszekeres). Feltehetően a Tet8 lokuszra mindkét egyed heterozigóta. Az egyedek tényleges genotípusának meghatározása már nagyobb felbontású, 1 bp különbség kimutatására alkalmas módszerekkel fog történni. Mivel a mikroszatelliteink 4 bp hosszúságú ismétlődő egységekből állnak, agaróz gélen az 1 vagy 2 egység (< 10 bp) eltérés nem különíthető el. A PCR körülmények optimalizálásához azonban ez elegendő.
Tet7 lokuszon a két minta (U46 és U47) közötti eltérés egyértelmű agaróz gélen is (több különböző hőmérsékleten látjuk). Az U46 minta esetén egy intenzív csíkot látunk, de az egyed lehet, hogy heterozigóta. Az U47 egyed egyértelműen heterozigóta, a két allél között legalább 20 bp a különbség (5 ismétlődő egység). Winkler és Weiss (2009) Szlovákia és Magyarország területén összesen 9 allélt talált ezen a lokuszon, a 200-248 bp méret tartományban, az ábrán látható allélok is ebben a tartományban vannak.
4. PCR optimalizálás és ellenőrzés szekvenálással. A Tet1 PCR optimalizálása az U1, U2 és U3 mintákkal (Pocsaji láp). A kapott PCR termékek elválasztása agaróz gélen történt, az ábra a hőmérséklettől való függést szemlélteti. Winkler és Weiss (2009, 1. táblázat) alapján a GATA motívum ismétlődik 29 alkalommal.
A gélből kivágott fragmentet megszekvenálva igazoltuk, hogy a megfelelő régiót szaporítottuk fel:
A szekvenciákból az is kiderült, hogy U1 és U2 egyedek feltehetően eltérő allélt hordoznak.
