Kvalitativní imunochromatografický test pro detekci cTn I v plné krvi, séru a plazmě POUŽITÍ Gecko cTnI je rychlý orientační imunochromatografický test pro kvalitativní detekci srdečního troponinu I (cTnI) ve vzorcích plné krve, séra nebo plazmy, s cut-off koncentraci 0,5 ng / ml. Test pomáhá při prvotní diagnostice akutního infarktu myokardu . Kvalitativní test nemůže sloužit k monitorování léčby nebo průběhu onemocnění ! Výsledky testů by měl posoudit lékař společně s výsledky jiných vyšetření a klinickými příznaky pacienta.
SOUHRN a VYSVĚTLENÍ TESTU Při infarktu myokardu (MI) je nedostatečně zásobena určitá oblast myokardu kyslíkem.K buněčné smrti dochází bez kyslíku již do 10-15 minut. To má za následek uvolnění určitých bílkovin z cytoplasmy do krevního oběhu. Některé tyto proteiny jsou specifické pro srdeční sval, využívají se tedy jako markery poškození myokardu a jsou stanovovány ve vzorcích krve pacientů metodami specifických imunoassayí 1,3 Srdeční troponin I, je jedním biochemických markerů záchytu časné fáze akutního infarktu myokardu(AIM), nestabilní anginy pectoris (UA), a městnavého srdečního selhání (CHF) UA. Troponin je proteinový komplex kosterního a srdečním svalu. Komplex se skládá ze tří polypeptidových komponent, troponinI (TnI), troponinT (TnT), a troponinC (TnC), a hraje zásadní roli při přenosu intracelulárního vápníku v interakcích aktin-myosin5. TnC srdeční tkáně, je identický v kosterní tkáni, ale TnI a TnT srdeční izoformy jsou odlišné od kosterních izoforem, což umožnilo vývoj specifických srdečních protilátek6.Hladina cTnI se zvyšuje v krvi následkem poškození myokardu nebo nekrózy. Proto se cTnI používá jako pomocné vyšetření při diagnostice infarktu7,8 Studie kinetiky uvolňování ukazují, že cTnI není nejčasnějším ukazatelem nekrózy myokardu.( Tím je myoglobin, který je ovšem nespecifickým markerem). TroponinI se objeví krvi ( séru) do 3-6 hodin po nástupu příznaků, podobně jako enzym CK-MB.,ale, cTnI zůstává zvýšený za 4-9 dny po AMI a je až 13krát hojnější v myokardu než CK-MB.9-10 Kromě přínosu v diagnostice, dávají zvýšené hladiny cTnI prognostické informace zvýšeného rizika úmrtí
PRINCIP Gecko cTn je imunochromatografický test pro kvalitativní detekci cTnI v plné krvi, séru nebo plazmě. Na chromatografické membráně se ve výsledkovém okně mají vytvořít dvě linie: jedna testovací a jedna kontrolní. V testu je použita streptavidin biotinylovaná protilátka proti cTnI a králičí protilátka proti kozímu IgG v kontrolním systému. Vzorek se aplikuje do označené jamky a nasákne do membrány. Zde se srdeční markery ( sTnI) , pokud jsou přítomny ve vzorku ,naváží na specifickou protilátku, značenou koloidním zlatem na partikulích. Imunokomplexy pak prosakují nitrocelulózovou membránou a naváží se na streptavidin vázaný v místě testovací linie. Imunokomplexy bez markerů prosakují dále, kde jsou zachyceny králičí protilátkou proti kozí IgG v kontrolní linii. Pokud je koncentrace TnI ve vzorku vyšší, než cut.off, vytvoří se červená linie v oblasti testu i v kontrolní oblasti výsledkového okna. Pokud je koncentrace markeru ve vzorku je nižší než cut-off, vytvoří se pouze kontrolní linie Kontrolní linie se musí vždy objevit, protože potvrzuje správnou funkci testu a tedy platný výsledek Pokud se barevná kontrolní linie neobjeví, je výsledek testu nehodnotitelný a test je nutno zopakovat s novou kazetou.
SKLADOVÁNÍ A STABILITA Testy by měly být skladován při teplotě mezi 2- 30 ° C (za pokojové teploty nebo v chladničce) v původním uzavřeném obalu. Test je citlivý na přímé sluneční světlo, vlhkost a vyšší teplotu. Testování se doporučuje provést ihned po vyjmutí kazety z obálky.. Nepoužívejte test po uplynutí doby použitelnosti.
BEZPEČNOSTNÍ POKYNY 1. Test je určen pouze pro profesionální in vitro diagnostiku. 2. Při manipulaci se vzorky dodržujte zásady práce s infekčním materiálem (nejezte, nekuřte, používejte ochranné rukavice). 3. Pro zabránění kontaminace použijte pro každý vzorek novou pipetu ( kapátko) 4. Nepoužívejte testovací kazetu, pokud byl její obal poškozen nebo otevřen. 5. Nepoužívejte testovací kazety po uplynutí doby použitelnosti.
ODBĚR A PŘÍPRAVA VZORKU •Tento test lze použít pro vzorky plné krve, plazmy, a séra. Pokud mají být použity vzorky séra, odebírá se krev do zkumavky bez antikoagulantů a srážení probíhá alespoň 25 minut před centrifugací. Vzorky plné krve nebo plazmy pro vyšetření Troponinu se odebírají do heparinu..Jiné antikoagulanty nebyly doporučeny. Používejte pouze plasmu bez hemolýzy.. • Vzorky se odebírají za standardních laboratorních podmínek. • Nejlepších výsledků bylo dosaženo, při provedení testu bezprostředně po odběru. Vzorky plné krve by měly být zpracovány nejdéle do 4 hodin po odběru. Plazma nebo sérum může být uloženo v chladu po dobu 24 hodin při teplotě 2-8 ° C. Pokud test nelze provést do 24 hodina pro přepravu vzorků, se doporučuje zmrazení na-20 o C.12, 13 • Azid sodný může být přidán jako konzervační přísada do 0,1% bez vlivu na výsledky testu. • Chlazený nebo zmrazený vzorek je třeba před testováním vytemperovat na pokojovou teplotu a promíchat.
REAGENTY Gecko cTnI Test obsahuje všechny potřebné reagencie pro detekci cTnI v plné krvi, séru a plazmě.Kazeta obsahuje membránu potaženou streptavidinem a biotinylovanou polyklonální kozí protilátku proti-cTnI, koloidním zlatem značené partikule se specifickou protilátkou proti-cTnI a králičí protilátku proti kozímu IgG. Stabilizátor 0,05%azid sodný a BSA v suché formě.
DODANÝ MATERIÁL
MATERIÁL DOPORUČENÝ, ALE NEDODANÝ
Testovací kazeta v uzavřené obálce s vysoušedlem Návod k použití
časoměřič ( minutky) zkumavky na vzorky krve , plasmy nebo séra
Jednorázové pipetky
pozitivní a negativní kontroly
Postup pro odběr a správnou aplikaci 80 µl vzorku mikrokapátkem (pokud není k dispozici jiná kvantitativní pipeta) 1.- odběr vzorku do pipety Stiskněte pevně balonek v horní části pipety Ponořte špičku pipety do vzorku Pomalu uvolněte balonek Vzorek naplní- pipetku Měla by se naplnit celá kapilárka, mírný přebytek ( jeli nasáto více vzorku) přeteče Do přepadové nádržky ( spodního balonku) kde by mělo zůstat na dně přepadové nádržky jako v příkladu A Přesně nabraný objem 80 µl ukazuje obr. B Nedostatek nasátého vzorku = obr. C Na obr. D a E je nadměrné množství vzorku, špatně nasáté i s bublinami, které by při aplikaci vzorku mohlo způsobit zaplavení testovacího pole
POSTUP TESTU 1. Odebrat vzorky podle pokynů v části "Odběr". 2. Testovací kazetu v uzavřeném obalu a vzorky( pokud byly v chladničce) vytemperovat na pokojovou teplotu (20°-30C°) 3. Vyjměte testovací kazetu z obalu těsně před použitím.Na štítku zaznamenejte identifikaci pacienta 4. Pipetkou aplikujte 80 µl vzorku do kulaté jamky na kazetě. Držte pipetu kolmo nad jamkou pro vzorek a stiskněte horní balonek. Vzorek, který byl nasát do kapiláry, se vyprázdní do určené jamky. ! Nemačkejte spodní balonek ( nádržku !) 5. Odečtěte výsledky za 15 minut.
INTERPRETACE VÝSLEDKU. Gecko cTnI je určen pro vizuální vyhodnocení . Výsledky jsou vztaženy k předem stanovené mezní hodnotě cut-off= 0,5 ng / ml. Pro cTnI byla stanovena v porovnání s kvantitativním stanovením na systému Beckman Coulter, Access AccuTnITM.. Pokud kontrolní laboratoř používá jiný sytém, než Beckman Coulter, Access AccuTnITM, doporučuje se provést porovnání hraniční hodnoty.
Pozitivní nález= 2 linie ve výsledkovém okně. Výsledek znamená, že koncentrace cTnI ve vzorku je vyšší než 0,5ng/ml
Negativní nález= pouze 1 kontrolní linie ve výsledkovém okně – linie TnI se nezobrazila Neplatný nález = nehodnotitelný, pokud se nezobrazila kontrolní linie Pozn: odstín barvy se může lišit od obrázku
pozitivní
negativní
neplatné nálezy(chybí kontrolní linie)
Protože zbarvení může kolísat, považujte každý slabý odstín testovací linie za průkaz pozitivity
KONTROLA KVALITY Růžová linka v kontrolní oblasti (C) je vnitřní kontrolou postupu.Potvrzuje dostatečný objem vzorku a správný postup Pokud je k dispozici externí kontrolní materiál může být použit k ověření že činidla jsou v pořádku a že výsledky jsou správné. Doporučuje se kontrolní testování v pravidelných intervalech podle SLP ( správné laboratorní praxe) Uživatelé by měli dodržovat příslušné místní předpisy pro externí kontrolu kvality.
OMEZENÍ TESTU • Test je určen pro profesionální in-vitro diagnostiku. • Pozitivní výsledek testu může být použit pouze jako orientační ukazatel poškození myokardu a vyžaduje další potvrzení. • Jako u všech diagnostických testů, výsledky musí být posuzovány lékařem spolu s dalšími klinickými informacemi • Negativní výsledek nevylučuje zcela infarkt myokardu Jako u všech diagnostických testů nemůže být klinická diagnóza založena na výsledku jediného testu. Výsledek testu je třeba hodnotit ve spojení s ostatními klinickými informacemi, jako klinické příznaky a další . • Vzorky obsahující velmi vysoké titry proti myším nebo králičím antigenům, mohou mít vliv na funkci testu14 (Studie nejsou provedeny) • Některé vzorky obsahují velmi vysoké titry heterofilních protilátek nebo revmatoidní faktor(RF) To může mít vliv na výsledek testu. •Je možné, že test je nehodnotitelný, pokud vzorky plné krve mají vysokou viskozitu, nebo v případě, že vzorky plné krve byly uloženy déle než 2 dny. V tomto případě by se test opakovat s novou testovací kazetou s čerstvým vzorkem téhož pacienta. • Falešně negativní výsledky testu: Ve vzácných případech mohou autoprotilátky v krvi pacienta pacienta zabránit reakci antigenprotilátka během testu. To může vést k falešně negativním výsledkům testů. Tento problém se týká všech testů na principu detekce proteinů pomocí protilátek.Proto rychlé testy nejsou vhodné jako jediné kritérium pro konečné rozhodnutí o stavu pacienta.
OČEKÁVANÉ HODNOTY Mezní hodnota cut-off pro Gecko cTnI test byly stanoveny ve srovnání s kvantitativním stanovením, Access AccuTnITM, Beckman Coulter. Cutoff TnI je 0,5 ng / ml. Vzorky obsahující cTnI v koncentraci rovné nebo vyšší než cut-off dávají pozitivní výsledek. Cut-off se může lišit u jiných používaných metod a laboratorních systémů
VLASTNOSTI TESTU Cutoff metody-ověření Směsná plazma pacientů obsahující cTnI, byla naředěna normálním humánním sérem na koncentrace blízké cut.off.. Koncentrace naředěných vzorků byly potvrzeny kvantitativní metodou Access AccuTnITM společnosti Beckman Coulter.Bylo testlváno 15 kazet pro každý ze vzorků o koncentracích 0,31, 0,57 a 1,07 ng / ml cTnI. Byl testován na 15 kazetách Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce. Cutoff koncentrace byla potvrzeny 0,5 ng / ml TnI.
Analytická specificita Potenciálně interferující látky,běžně se vyskytující v séru, byly rozpuštěny v sérech o normálním složení a ve směsném séru pacientů,obsahujícím cTnI v koncentraci 1,5 krát větší než cut-off.Uvedené sloučeniny neovlivňují výsledek testu Gecko cTnI.
Byly ověřeny potenciálně zkříženě reagující endogenní proteiny, přidané do normálního lidského séra. V uvedených koncentracích neovlivňují výsledek testu
Přesnost testu Na dvou klinických pracovištích a 1praktika byly otestovány připravené vzorky. Vzorky sér pacientů,s vysokým obsahem cTnI byly naředěny normálním lidským sérem aby byly získány pozitivní vzorky různých koncentrací. Normální lidské sérum bylo použito jako negativní kontrolu testu. Z každého vzorku bylo testováno na každém pracovišti 5 alikvotních částí. Výsledky jsou uvedeny v následující tabulce ukazují100% shodu mezi sériemi, stejně jako mezi pracovišti
Recovery studie Studie byla provedena se séry pacientů séra naředěných v normálním lidském séru. Sérem pacienta s vysokým obsahem cTnI bylo postupně ředit normálním lidským sérem na různé koncentrace.Každý zředěný vzorek byl testován pomocí Gecko cTnI Test 6x opakovaně. Údaje uvedené v tabulce níže ukazují výtěžnost mezi pozorovanými výsledky a shodu 100%
Korelace mezi vzorky plazmy a séra Byly připraveny vzorky séra a heparinizované plazmy paralelně od téhož pacienta Vzorky byly rozděleny de čtyřech úrovní: 1.2-1.8, 0.5-1.0, 0.3-0.5 a <0,06 ng / ml cTnI. Deset vzorků v každé skupině bylo testováno íGecko cTnI tesem.Výsledky uvádí tabulka:
Korelace mezi testem z plné krve a plazmy Byla ověřena korelace výsledků testu mezi vzorky plazmy a plné krve .Plná krev byla obohacena klinickými vzorky obsahujími cTnI na tři různé koncentrace mezi negativními a 4čtyřnásobnou hodnotou cut-off.Pět vzorků v každé skupině bylo testováno pomocí Gecko
cTnI test před odstraněním buněk a po odstranění buněk centrifugací. Výsledky testů je znázorněn v následující tabulce:
Porovnání s kvantitativní metodou Vzorky plazmy byly získány od 206 pacientů pohotovosti, kteří byli přijati,pro podezření na srdeční příhodu. Kromě toho bylo 50 vzorků odebráno ambulantním pacientům s jinou diagnozou., Těchto 256 klinických vzorků bylo testováno paralelně pomocí Gecko cTnI testu a kvantitativní metodou Beckman Coulter Access Výsledky jsou shrnuty níže.
LITERÁRNÍ ODKAZY 1.Panteghini M,Pagani F,Bonetti G.(1999) the sensitivity of cardiac markers:an evidence-based approach.ClinChem Lab Med. 37(11-12):1097-106 2. Wu AH. (1997) Use of cardiac markers as assessed by outcomes analysis. Clin Biochem. 30(4):339-50 3. Apple FS. (1992) Acute myocardial infarction and coronary reperfusion. Serum cardiac markers for the 1990s. Am J Clin Pathol. 97(2):217-26 4. Alan H.B. Wu, Fred S. Apple, W. Brian Gibler, Robert L. Jesse, Myron M. Warshaw, and Roland Valdes, Jr. (1999) The National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice: Recommendations for the use of cardiac markers in coronary artery diseases. The National Academy of Clinical Biochemistry Laboratory Medicine Practice Guidelines 5. Mehegan JP, Tobacman LS. (1991) Cooperative interactions between troponin molecules bound to the cardiac thin filament. J Biol Chem. 266(2):966-72 6. Bodor GS, Porter S, Landt Y, Ladenson JH (1992) Development of monoclonal antibodies for an assay of cardiac troponin-I and preliminary results in suspected cases of myocardial infarction. Clin Chem. 38(11):2203-14 7. Adams JE 3rd, Bodor GS, Davila-Roman VG, Delmez JA, Apple FS, Ladenson JH, Jaffe AS (1993) Cardiac troponin I. A marker with high specificity for cardiac injury. Circulation. 88(1):101-106 8. Adams JE 3rd, Sicard GA, Allen BT, Bridwell KH, Lenke LG, Davila-Roman VG, Bodor GS, Ladenson JH, Jaffe AS (1994) Diagnosis of perioperative myocardial infarction with measurement of cardiac troponin I. N Engl J Med. 330(10):670-674 9. Mair J, Morandell D, Genser N, Lechleitner P, Dienstl F, Puschendorf B. (1995) Equivalent early sensitivities of myoglobin, creatine kinaseMB mass, creatine kinase isoform ratios, and cardiac troponins I and T for acute myocardial infarction. Clin Chem. 41(9):1266-72 10. Mair J, Genser N, Morandell D, Maier J, Mair P, Lechleitner P, Calzolari C, Larue C, Ambach E, Dienstl F, Pau B, Puschendorf B.(1996) Cardiac troponin I in the diagnosis of myocardial injury and infarction. Clin Chim Acta. 245(1):19-38 11. Antman EM, Tanasijevic MJ, Thompson B, Schactman M, McCabe CH, Cannon CP, Fischer GA, Fung AY, Thompson C, Wybenga D, Braunwald E.(1996) Cardiac-specific troponin I levels to predict the risk of mortality in patients with acute coronary syndromes. N Engl J Med. 335(18):1342-9 12 The Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) (2004) Approved Guideline H18; Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens, Third Edition. 13 Kazmierczak, S.,Catrou, P., Briley, K. (2000), Transient Nature of Interference Effects from Heterophile Antibodies: Examples of Interference with Cardiac Marker Measurements. Clin Chem Lab Med; 38(1):33-9
český překlad –říjen2031
