P U P O
Magisterská práce
In vitro studie mezenchymálních kmenových buněk značených magnetickými nanočásticemi
Autor Vedoucí práce Studijní obor Forma studia Rok
Bc. Markéta Svatáková Mgr. Kateřina Poláková, Ph.D. Nanotechnologie Prezenční 2012
B
Jméno a příjmení autora Název práce Typ práce Pracoviště Vedoucí práce Rok obhajoby práce Počet stran Počet příloh Jazyk Abstrakt
Klíčová slova
Bc. Markéta Svatáková In vitro studie mezenchymálních kmenových buněk značených magnetickými nanočásticemi magisterská Katedra experimentální fyziky Mgr. Kateřina Poláková, Ph.D. 2012 80 3 český Mezenchymální kmenové buňky značené SPIO (Superparamagnetic Iron Oxides) nanočásticemi jsou v současnosti nadějí pro cílenou regeneraci tkání. Lékaři mohou na základě magneticky značených buněk sledovat cílenou buněčnou léčbu in vivo pomocí metody magnetické rezonance (MRI). Nanočástice však mohou být pro buňky toxické a vyvolat řadu fyziologických a morfologických změn. Naše in vitro studie se soustředila na vliv SPIO nanočástic s různým povrchem (funkcionalizující slupkou) na chování (proliferaci a viabilitu) potkaních mezenchymálních kmenových buněk (rMSCs). Ke značení buněk byly použity dva nové typy superparamagnetických nanočástic maghemitu (bez obalu s negativním nábojem a s obalem složeným z PLA - PEG polylactic acid - graft - polyethylenglycol). Biokompatibilita a MRI signál těchto nanočástic byl porovnán s komerčním kontrastním činidlem Resovist. Přímé pozorování subcelulárních komponent a jejich charakterizace je základem pro porozumění fyziologických funkcí buněk. Změny morfologie magneticky značených buněk a výskyt nanočástic v/na buňkách byly zobrazovány různými mikroskopickými technikami (světelnou a fluorescenční mikroskopií, elektronovou mikroskopií a mikroskopií atomárních sil). Bylo potvrzeno, že nanočástice se po internalizaci vyskytují v endo / lyzosomech. Podařila se zachytit počáteční invaginace nanočástic plazmatickou membránou do intracelulárního prostředí a přerozdělení nanočástic během fáze buněčného dělení. nanočástice, mezenchymální kmenové buňky, elektronová mikroskopie, MRI
B
Author’s first name and surname Title Type of thesis Department Supervisor Year of presentation Number of pages Number of appendices Language Abstract
Keywords
Bc. Markéta Svatáková In vitro study of mesenchymal stem cells labeled with magnetic nanoparticles master Department of Experimental Physics Mgr. Kateřina Poláková, Ph.D. 2012 80 3 czech Stem cell therapy is nowadays one of the most promising treatments of many until now no - effectively treated diseases. Superparamagnetic nanoparticles of iron oxides (SPION) are the most effective contrast agents for in vivo noninvasive visualization of stem cells by MRI (Magnetic Resonance Imaging). Extending knowledge about the consequences of SPION incorporation by stem cells are important because superparamagnetic iron oxide nanoparticles with different surfaces are being widely used for various biomedical applications. In this study we have demonstrated the influence of coated and uncoated SPIONs to rat mesenchymal stem cells (rMSCs). For cell labeling we have used two new types of superparamagnetic maghemite nanoparticles: uncoated SPIONs with OH-groups on their cover (called FeNV nanoparticles) and polyacted acid (PLA) coated SPION with modified cover by polyethylene glycol (PEG) (called Mag PLA-PEG nanoparticles). Cellular uptake this nanoparticles was compared to commercial carboxydextran coated SPIONs – Resovist, which was in 2010 canceled from market because of economic reasons. Direct observation of subcellular structures and their characterization is essential for understanding physiological functions of the magnetic labeled cells. To observe endocytic internalizing or cell surface attachment of SPION we have used advanced microscopy methods - light inverted microscopy with phase contrast, fluorescence microscopy, time – lapse microscopy, electron microscopy and atomic force microscopy. These techniques have enabled imaging of localization different SPIO nanoparticles around and inside the cells, changes of the cell proliferation or morfology and redistribution of internalized nanoparticles during cell division. Futhermore, we reached to image nanoparticles inside endo / lysosomes by scanning electron microscopy. nanoparticles, mesenchymal stem cells, electron microscopy, MRI
P
Prohlašuji, že jsem předloženou diplomovou práci vypracoval samostatně pod vedením Mgr. Kateřiny Polákové, Ph.D., a že jsem použil zdrojů, které cituji a uvádím v seznamu použitých zdrojů.
V Olomouci dne . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
................................ podpis
Děkuji vedoucí diplomové práce,Mgr..Kateřině Polákové, Ph.D., za motivaci a skvělou spolupráci během celého magisterského studia, Mgr. Josefovi Skopalíkovi za konzultace a doc. Kubínkovi za zprostředkování vzdělávacích kurzů, které mi pomohly propojit teoretické poznatky s praxí. Také bych ráda poděkovala celému týmu z RCPTM v Holicích za přátelské pracovní prostředí. Tato diplomová práce vznikla díky mnoha ochotným lidem, kteří mi pomohli ať už věcnými radami nebo poskytnutím pracovních podmínek. Proto bych velice ráda poděkovala Ing. Vítězslavovi Březinovi z Laboratoře tkáňových kultur v Nových Hradech a celé Laboratoři elektronové mikroskopie JCU v Českých Budějovicích, bez jejichž pracovišť zaměřených na biologické vzorky bych nedosáhla tolika poznatků a výsledků. Za odborné IT rady a pomoc při psaní této diplomové práce v LATEXu velice děkuji Bc. Pavlovi Benáčkovi a Dr. Milanovi Vůjtkovi. V neposlední řadě velice děkuji své rodině, svému příteli a kamarádům, kteří byli moji velkou oporou i při velké časové tísni.
Obsah
Úvod
9
Literární přehled
11
1 Charakterizace SPIO nanočástic
12
1.1
1.2
Strukturní formy magnetitu a maghemitu . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12 1.1.1
Magnetit (F e3 O4 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12
1.1.2
Maghemit (γ - F e2 O3 ) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13
1.1.3
Jednodoménovost . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14
1.1.4
Superparamagnetismus
1.1.5
Struktura SPIO nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15
Stabilizace SPIO nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17 1.2.1
Typy funkcionalizačních látek v bioaplikacích . . . . . . . . . . . . . 18
2 Magnetické nanočástice v MRI
19
2.1
Základní princip MRI . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19
2.2
SPIO nanočástice jako kontrastní látky . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20
2.3
Vliv funkcionalizační slupky na kontrast v MRI . . . . . . . . . . . . . . . . 21
2.4
In vivo detekce SPIO nanočástic uvnitř buněk . . . . . . . . . . . . . . . . . 22
3 Transport nanočástic přes buněčnou membránu
23
3.1
Endocytóza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24
3.2
Dělení buněk s nanočásticemi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26
4 Značení mezenchymálních kmenových buněk SPIO nanočásticemi 4.1
27
Urychlení internalizace nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27
6
5 Fyziologické změny magneticky značených buněk
30
5.1
Vliv SPIO nanočástic na proliferaci buněk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30
5.2
Vliv SPIO nanočástic na adhezi buněk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32
5.3
Vliv SPIO nanočástic na diferenciaci buněk . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33
6 Toxicita nanočástic 6.1
Testy viability
35
. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
6.1.1
Trypanová modř . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 35
6.1.2
MTT test . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
6.1.3
Fluorescenční barvení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36
7 Mikroskopické zobrazení SPIO nanočástic v buňkách 7.1
Světelná mikroskopie (LM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38 7.1.1
7.2
38
Barvení nanočástic pruskou modří . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38
Fluorescenční mikroskopie(FM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 7.2.1
Fluorescenční značení nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
7.3
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40
7.4
Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42
Cíle práce
44
Experimentální část
45
8 Materiály a metody
46
8.1
Buněčné kultury . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46 8.1.1
Kultivace . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46
8.1.2
Pasážování . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47
8.2
Superparamagnetické nanočástice oxidů železa (SPIO nanočástice) . . . . . 47
8.3
Inkubace nanočástic s buněčnou kulturou . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50
7
8.3.1 8.4
Počítání značených buněk při stanovení proliferace . . . . . . . . . . 50
Použité mikroskopy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51
9 Výsledky - Mikroskopické techniky 9.1
9.2
Světelný a fluorescenční mikroskop (LM a FM) . . . . . . . . . . . . . . . . 54 9.1.1
Problematika zobrazení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54
9.1.2
Interakce nanočástic s rMSCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55
Skenovací elektronová mikroskopie (SEM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57 9.2.1
9.3
9.4
54
Problematika zobrazení . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58
Detekce nanočástic na povrchu buněčné membrány . . . . . . . . . . . . . . 61 9.3.1
SEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61
9.3.2
AFM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62
Detekce nanočástic uvnitř buněk . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64 9.4.1
Světelná mikroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64
9.4.2
SEM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
10 Výsledky - Proliferace a viabilita magneticky značených buněk 10.1 Stanovení proliferace a viability naznačených buněk
72
. . . . . . . . . . . . . 72
10.1.1 FeNV-rMSCs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74 11 Výsledky - Magnetická rezonance
77
11.1 MRI měření negativního kontrastu nanočástic . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 Závěr
79
Literatura
81
Přílohy
97
Seznam zkratek . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97 Přehled polymerů . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98 Grafy . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99
8
Úvod
Nanotechnologie a výzkum kmenových buněk jsou dvě různá odvětví, která se v posledních letech velmi rychle vyvíjejí. Teoretické a experimentální studie nanomateriálů i kmenových buněk jsou v současné době předmětem velkého zájmu a stále více narůstá také jejich aplikační potenciál v medicíně při diagnostice nebo regenerativní terapii postižených tkání a orgánů [1]. Kmenové buňky jsou nediferencované živočišné buňky, které mají schopnost se dále dělit (proliferovat) a vyvinout se v jiný buněčný typ (diferencovat)[2]. V kostní dřeni se vyskytuje heterogenní populace kmenových buněk, které se liší velikostí, povrchovými markery a schopností proliferovat a diferencovat. Prvním typem jsou hematopoetické kmenové buňky (HSCs), které diferencují do krevních buněk, dále mezenchymální kmenové buňky (MSCs) diferencující do buněk pojivových tkání (např. chondrocytů, osteoblastů, myocytů) a buňky progenitorové, které vytvářejí např. cévní endotel při neovaskularizaci[3]. Těchto vlastností se využívá v celulární (buněčné) terapii [4], při které se transplantací nediferencovaných MSCs indukuje angiogeneze a tím se regeneruje poškozená tkáň; např. infarktem postižený myokard [5]. Superparamagnetické nanočástice oxidů železa (SPION) jsou stále více používané jako kontrastní činidla pro in vivo sledování transplantovaných kmenových buněk magnetickou rezonancí (MRI) [6]. In vitro studie, tedy experimenty na buněčných kulturách žijících mimo živý organismus, se v současnosti věnují přípravám a funkcionalizacím biokompatibilních SPIO nanočástic vhodných pro značení kmenových buněk. Intenzivně se také studují buněčné mechanismy internalizace a biodegradace nanočástic. Vhodným výběrem různých parametrů (povrchová funkcionalizující slupka, velikost a morfologie magnetického jádra, koncentrace Fe, doba inkubace, aj.), se vědci snaží připravit optimální nanočásticový SPIO systém, který nebude mít negativní vliv na životní funkce buněk a současně poskytne kvalitní kontrast v magnetické rezonanci. Rešerše této diplomové práce pojednává o vlivu superparamagnetických nanočástic s odlišnou tzv. funkcionalizující slupkou na chování buněčných kultur. První část se zabývá
9
fyzikálně - chemickou charakterizací SPIO nanočástic používaných pro značení buněk; nejčastěji jsou to polymorfy oxidu železitého - maghemit a magnetit. V další části jsou rozebrány základní mechanismy, jakými se magnetické nanočástice do buněk inkorporují (procesy internalizace), kde se v buněčném těle vyskytují a jakým způsobem degradují. Poslední část se věnuje popisu nejdůležitějších experimentálních technik, které se využívají v in vitro studiích značení kmenových buněk SPIO částicemi. Kapitola Mikroskopické techniky je zaměřená na problematiku zobrazování magneticky značených MSCs pokročilými mikroskopickými technikami (světelná a fluorescenční mikroskopie, elektronová mikroskopie a mikroskopie atomárních sil), které jsou potřebné k detekci nanočástic na povrchu nebo uvnitř buněk. V kapitole Proliferace a viabilita magneticky značených buněk se testuje biokompatibilita dvou nových typů SPIO nanočástic s komerční kontrastní látkou Resovist. V poslední kapitole se rozebírají MRI kontrastní účinky samotných SPIO nanočástic, a také detekovatelnost magneticky značených buněk na základě hypointenzního MRI signálu.
10
Literární přehled
11
1. Charakterizace SPIO nanočástic Nanočástice oxidů železa používané v bioaplikacích se nejčastěji dělí do tří kategorií a to podle různé velikosti na: a) VSOP (very small superparamagnetic iron oxide particles) o rozměru < 10 nm, b) USPIO (ultrasmall superparamagnetic iron oxide), které mají rozměr 20 nm a c) SPIO (superparamagnetic iron oxide), jejichž velikost je v rozmezí 30 až 100 nm[7]. SPIO nanočástice obsahují dvě strukturní formy oxidů železa a to maghemit (γ - F e2 O3 ) a / nebo magnetit (F e3 O4 ). Díky jejich spinelové struktuře mají ferimagnetické uspořádání magnetických momentů, navíc ve formě nanočástic vykazují jednodoménovost a superparamagnetismus. Tyto unikátní magnetické vlastnosti spolu s netoxicitou je předurčují k hojnému využití v biomedicínských aplikacích [8].
1.1 1.1.1
Strukturní formy magnetitu a maghemitu Magnetit (F e3 O4 )
Magnetit, také známý jako magnetovec, je černý magnetický minerál běžně se vyskytující v přírodě (v horninách i organismech) [9]. Velmi zajímavým zdrojem přirozeně syntetizovaných nanočástic magnetitu jsou magnetotaktické bakterie, které si v sobě biomineralizací vytváří pravidelné magnetické nanokrystaly obalené lipidovou membránou [10]. Tyto nanočástice se nazývají magnetosomy a slouží bakteriím k magnetotaxi [11]. Magnetit (F e3 O4 ) vykazuje inverzní kubickou spinelovou strukturu, ve které je vyvážená koncentrace F e2+ a F e3+ v oktaedrických pozicích společně s počtem F e3+ iontů umístěných v tetraedrických pozicích struktury [12]. Anionty kyslíku jsou uspořádané do plošně centrované kubické mřížky (FCC) s mřížkovým parametrem a = 0, 839 nm, ionty železa kyslík obklopují v tetraedrálním nebo oktaedrickém uspořádání a tím vytvářejí dvě submřížky (viz obr. 1.1). Uspořádání iontů se dá také zapsat stechiometricky jako F e3+ [F e2+ F e3+ ]O4 [12].
12
Antiparalelně orientované magnetické momenty dávají magnetitu ferimagnetický charakter. Stejný počet vzájemně opačně orientovaných F e3+ iontů se vyruší a magnetické vlastnosti způsobují pouze F e2+ ionty. U maghemitu magnetické vlastnosti zajišťují F e3+ ionty v oktaedrických pozicích [13].
Obrázek 1.1: Spinelová struktura magnetitu; stechiometrický zápis se znázorněnou orientací magnetických momentů [14] [12]
1.1.2
Maghemit (γ - F e2 O3 )
Maghemit (γ - F e2 O3 ) je červenohnědý magnetický minerál, vzniká oxidací magnetitu a vykazuje inverzní spinelovou kubickou strukturu s vakancemi [9]. Tetraedrické a oktaedrické pozice tudíž představují dvě neekvivalentní krystalické pozice a vytvářejí dvě magnetické podmřížky, ve kterých je poměr F e3+ iontů v tetraedrických a oktaedrických pozicích 1 : 1, 67. Z magnetického hlediska se tedy jedná o kolineární ferimagnetický materiál s nevykompenzovaným antiparalelním uspořádáním atomových magnetických momentů [15]. Stechiometrický zápis maghemitu je F e3+ [F e3+ 5/3 V1/3 ]O4 , kde indexy vyjadřují poměr subspekter okta/tetraedrálních pozic a V značí vakance [12].
13
Maghemit je tedy isostrukturní s magnetitem, který žádné vakance nemá. Jejich podobné strukturní a magnetické vlastnosti jsou těžko rozlišitelné, a proto se v textech uvádí magnetit a/nebo maghemit [9].
Obrázek 1.2: Porovnání spinelové struktury magnetitu (a) a maghemitu (b) [16]
1.1.3
Jednodoménovost
Makroskopický magnetický materiál je rozdělen do Weissových domén (velikost domén v krystalu magnetitu je 0,1 µm)[13]. Mezi jednotlivými doménami je doménová stěna, jejíž vlastnosti závisí na energetických, krystalografických a geometrických parametrech [17]. V jednotlivých doménách se nachází různě orientované magnetické momenty kvůli zachování zákona minimální energie. Se snižováním velikosti částic, počet jednotlivých domén ubývá. Pod kritickou velikostí (Dc) již není vytváření domén energeticky výhodné a částice začne vykazovat jednodoménový charakter [12] a [13]. V jednodoménové částici směřují všechny atomové magnetické momenty do jednoho směru (tj. snadný směr určený magnetickou anizotropií) a kooperují spolu skrz celou nanočástici (viz obr. 1.3). Taková nanočástice pak navenek vykazuje obrovský magnetický moment (tzv. superspin), jehož velikost se pohybuje v řádu tisíců až deseti tisíců
14
Bohrových magnetonů (µB = 9, 27 · 10−24 J/T ) [12]. Proto mají nanomateriály odlišné fyzikální a chemické vlastnosti od těch, které měly v makroskopickém měřítku [13].
Obrázek 1.3: Srovnání velikostí domén makroskopického magnetitu s velikostí nanočástice [13]
1.1.4
Superparamagnetismus
Zmenšováním rozměrů jednodoménového magnetického materiálu vzniká, pod určitou hranicí velikosti, danou strukturním typem a morfologií nanočástic, unikátní jev spojený s konečným rozměrem částic zvaný superparamagnetismus [18]. V okamžiku, kdy částice začne vykazovat superparamagnetické chování, nastává stav, kdy se anizotropní energie stane srovnatelná s energií teplotních fluktuací. Dochází ke spontánnímu překlopení magnetického momentu z jednoho snadného směru do druhého i bez přítomnosti vnějšího magnetického pole. Superparamagnetismus je tedy výsledek soutěžení anizotropní energie a teplotní fluktuace [19]. Superparamagnetismus je jev závislý na teplotě. Hraniční teplotou je blokovací teplota. Při teplotě nižší dochází k poklesu energie termálních fluktuací, ke zvýšení energie anizotropní bariéry a tím k fixaci (zablokování) magnetického momentu ve snadném směru. Nad blokovací teplotou energie termálních fluktuací je vyšší než energetická bariéra. V tomto případě dojde ke fluktuaci celkové magnetizace a následkem toho je celková magnetizace během času pozorování rovná nule. S jevem superparamagnetismu úzce souvisí
15
Obrázek 1.4: Přechod více doménového magnetického materiálu na jednodoménový; fluktuace superspinu v superparamagnetické nanočástici [18] pojem relaxační čas τ , což je doba, po kterou směr magnetického momentu setrvává ve snadném směru, než zaujme další snadný směr magnetizace [20] [19]. Pokud jsou superparamagnetické nanočástice vloženy do slabého magnetického pole, vybudí se v nich vnitřní magnetizace o ohromné intenzitě. Po vypnutí vnějšího magnetického pole bude magnetizace rovna nule, avšak bez remanentní magnetizace. Chovají se podobně jako paramagnetika, která ale na rozdíl od superparamagnetik na vnější pole reagují s mnohem nižší intenzitou [19].
1.1.5
Struktura SPIO nanočástic
SPIO nanočástice určené pro bioaplikace se skládají z magnetického jádra (core) a z povrchové obalující vrstvy (shell). Velikost a morfologie jádra nanočástic oxidů železa ovlivňuje jejich magnetické vlastnosti [21]. Slupka slouží jako jeho ochrana před narušením okolním prostředím (např. před redukční reakcí) a udává konečnou velikost nanočástice (tzv. hydrodynamický poloměr). Vnější vrstva slupky musí zajišťovat biokompatibilní vlastnosti a stabilitu celé nanočástice v krevním oběhu. Její povrch může být různými způsoby modifikován - nést určité receptory, ligandy, barviva, léčiva, proteiny, nebo protilátky podle toho, s jakým biomédiem nebo biomolekulami bude nanočástice reagovat (viz obr. 4) [7] [21] [22]. Využití těchto SPIO nanočástic je široké, protože jsou nejméně toxické v porovnání s jinými magnetickými nanočásticemi (např. s kobaltovými nanočásticemi) [23]), jsou
16
Obrázek 1.5: Struktura nanočástice a možnosti modifikace jejího povrchu vzhledem k různým bioaplikacím [7] biokompatibilní a organismus je přirozeně rozloží [8]. Monodisperzní nanočástice s vysokou saturační magnetizací a vhodným povrchem [21] se používají v biomedicínských a biologických aplikacích jako kontrastní činidla pro magnetickou rezonanci (MR), nebo při biomagnetické separaci, hypertermii či jako nosiče léčiv [8]. Různé typy povrchů SPIO nanočástic ovlivňují efektivnost značení buněk a jejich viabilitu.
1.2
Stabilizace SPIO nanočástic
V roztoku bývají nanočástice uspořádané do různých tvarů - prstencovité útvary, otevřené smyčky, řetízky. Příčinou uspořádání je vzájemná magnetická dipól - dipólová interakce [21]. Jedná se o přímou interakci celkových magnetických momentů jednotlivých nanočástic, která dominuje na větších vzdálenostech. Pokud jsou nanočástice blízko sebe, dochází k magnetické interakci přes povrch nanočástic - atomy na povrchu jedné nanočástice interagují s povrchovými atomy druhé nanočástice. Jde o výměnnou magnetickou interakci a se vzdáleností velmi rychle ubývá její síla [24].
17
Aby koloidní roztoky nanočástic oxidů železa neagregovaly v biologickém médiu ani v magnetickém poli, provádí se jejich stabilizace [21]. Speciální povrch, tzv. funkcionalizující vrstva, která se na nanočástice nanáší přímo při syntéze nebo až po ní, zajišťuje rovnováhu mezi přitažlivými a repulzními silami [21] [25]. Magnetické nanočástice oxidů železa mají dostatečně velkou plochu povrchu a mohou být funkcionalizovány řadou chemických sloučenin, které zlepšují jejich vlastnosti [26].
1.2.1
Typy funkcionalizačních látek v bioaplikacích
Funkcionalizační vrstva zajišťuje biokompabilitu a stabilitu nanočástic. Nejčastěji se jedná o přírodní nebo syntetické biodegradabilní polymery. Mezi přírodní biodegradabilní polymery se řadí polysacharidy: např. dextran, alginát, chitosan, a proteiny: kolagen, albumin a želatina. Mezi syntetické biodegradabilní polymery patří polyestery: např. poly(lactic acid) (PLA), polyetery: např. polyethylene glycol (PEG), polyanhydridy: např. poly(sebacic acid) a další, viz přehled rozdělení polymerů používaných k funkcionalizaci nanočástic oxidů železa (Přílohy, tab. 1) [18] Vnější vrstva nanočástic je velmi důležitá, protože interaguje s buněčnou membránou a indukuje internalizaci (uptake) nanočástic do cytoplazmy [27]. Nanočástice mající povrch z PEG jsou odolné proti adsorpci proteinů (opsonizaci) séra a prodlužují cirkulaci v krevním oběhu [28]. Tento hydrofilní polymer nevyvolává imunitní reakce, protože není rozpoznán makrofágy, které by PEG - nanočástice rozložili [18] [29]. PEG je na povrchu nanočástic kovalentně imobilizovaný, náboj má téměř neutrální a při značení buněk zvyšuje prostupnost nanočástic přes buněčnou membránu [30]. Dalším nadějným povrchovým biomateriálem je poly(lactic acid) (PLA). Tento materiál je studován od roku 1960 a jeho výhodou je postupné přirozené odbourání organismem. PLA nejprve podléhá hydrolýze a vzniká z ní kyselina mléčná (lactic acid), která je přirozeně odbourána při glykolýze. Srovnatelné vlastnosti má i kyselina poly(lacticco-glycolic acid) (PLGA), která se často vyskytuje společně s PLA vytvářející vhodnou biokompatibilní matrici [31] [32].
18
2. Magnetické nanočástice v MRI Magnetické nanočástice mohou být využívány v medicíně při terapii i diagnostice nejrůznějších onemocnění. K léčbě se nejčastěji SPIO podávají intravenózně - nanočástice jsou v krevním oběhu nasměrovány magnetickým polem do postiženého místa (např. nádoru), který mají zničit (princip hypertermie), nebo jsou jako nosiče léčiv doručeny do postiženého místa, ve kterém mají uvolnit léčivo. Stejný postup se používá i při neinvazivních vyšetřovacích metodách (např. MRI), kdy se intravenózně podává SPIO kontrastní látka pro efektivnější zobrazení postiženého místa [33]. Další možností je aplikovat nanočástice přímo v buňkách (inkubace in vitro). Magnetické nanočástice uvnitř buněk jsou chráněny před rozpoznáním a degradací imunitním systémem (imunoprotekce nanočástic). Autoři Bulte a kol. tento postup pro intravenózní aplikace nanočástic preferují. V buněčné terapii se však využívá SPIO nanočástic pouze jako magneticky detekovatelné značky, která umožní lékařům sledovat neinvazivně biodistribuci nově transplantovaných kmenových buněk, pomocí MRI [27]. Transplantované buňky se mohou sledovat i dalšími zobrazovacími technikami: počítačovou tomografií (CT), pozitronovou emisní tomografií (PET), jednofotonovou emisní počítačovou tomografií (SPECT). Monitoring buněk magnetickou rezonancí (MRI) však nevystavuje pacienta ionizujícímu záření a poskytuje anatomické a patologické informace okolních tkání (včetně edémů) [34].
2.1
Základní princip MRI
Magnetická rezonance je neinvazivní tomografická zobrazovací technika založená na nukleární magnetické rezonanci [35] a v medicíně se používá pro vysoce kvalitní zobrazování anatomických struktur lidského těla [36]. Magnetické látky jsou složené z atomů, jejichž jádro má vlastní magnetické pole vyjádřené vektorem magnetizace. Makroskopická magnetizace se dělí na dvě složky: longitudiální (podélnou) Mz , která je orientována podél vnějšího magnetického pole B0 a transverzální
19
(příčnou) Mxy , která je kolmá ke směru B0 . Působením vnějšího magnetického pole je transverzální složka nulová a longitudiální složka rovna velikosti B0 [37]. Bez vnějšího magnetického pole je makroskopická magnetizace jader v termální rovnováze rovna nule. Jakmile je látka vložena do statického magnetického pole B0 , hodnota makroskopické magnetizace začne exponenciálně narůstat až do dosažení nové termální rovnováhy (tj. její maximální dosažená hodnota při těchto podmínkách). Aplikací radiofrekvenčního (RF) pulzu, tzn. oscilujícího magnetického pole, dojde k vychýlení makroskopické magnetizace z termální rovnováhy [37]. Při procesu návratu z vychýlené polohy do stavu termální rovnováhy se relaxace rozděluje na dvě skupiny: T1 relaxaci popisující obnovení podélné (longitudiální) složky a T2 zobrazující úbytek příčné (transverzální) složky. Obě složky relaxace závisí na vlastnostech měřeného objektu a síle magnetického pole [37]. Vysoký T2 hypointenzivní kontrast žádané patologické oblasti označené SPIO nanočásticemi činí tento materiál velmi dobrým kandidátem pro tzv. negativní kontrastní látky [27].
2.2
SPIO nanočástice jako kontrastní látky
MRI kontrastní látky se používají k zesílení kontrastu tkání zkrácením T1 nebo T2 relaxačních časů okolních vodíkových jader. Mezi kontrastní látky urychlující T1 relaxační dobu patří látky paramagnetické (např. gadolinium, resp. cheláty na bázi gadolinia), vykazující pozitivní hyperintenzivní signál. Kontrastní látky zkracující T2 relaxaci jsou anorganické látky na bázi SPIO nanočástic [38]. SPIO kontrastní látky byly zpočátku používány pro zobrazování jater [39] [40], protože po intravenózní aplikaci jsou nanočástice primárně vychytávány jaterními Kupfferovými buňkami, které mají charakter tkáňových makrofágů [41]. První kontrastní látkou na bázi SPIO nanočástic byl na trh uveden roku 1996 Endorem (Feridex) [42] [43] [44]. Od té doby se postupně aplikace SPIO kontrastních látek rozšířila pro zobrazování dalších orgánů (ledvin, lymfatických uzlin, slinivky břišní, střev a nebo cév - konkrétně artheroscklerotických
20
plátů [45], [27], [46]). Avšak v souvislosti se značením buněk byla zjištěna inhibice chodrogenetické diferenciace buněk po inkubaci s Endoremem, což motivovalo vědce k syntéze nových typů SPIO nanočástic [47]). Přehled komerčně vyráběných kontrastních látek je uveden v tab. 2.1 (tabulka je z roku 2008) [38]. Aktuálně je většina z nich stažena z trhu: koncem roku 2008 - Feridex/Endorem (dextran - SPIO nanočástice se záporným nábojem na povrchu, hydrodynamický průměr 50 - 180 nm), v roce 2010 - Ferucarbotran/Resovist (karboxydextran - SPIO, hydrodynamický průměr 62 nm) [34] [48].
Tabulka 2.1: Přehled komerčních kontrastních látek [38] Nově se na trhu objevují nanočástice firmy BioPAL (Worcester, MA): FeREX (50 150 nm) a Molday ION (∼30 nm), které jsou dostupné s různými funkcializačními povrchy jako jsou amino - nebo karboxyl - skupiny a/nebo s fluorescenčně aktivními molekulami. Prozatím však nejsou tyto nové kontrastní látky v klinické praxi hojně využívány [49] [50] [51] [34].
2.3
Vliv funkcionalizační slupky na kontrast v MRI
Modifikace povrchu nanočástic silně ovlivňuje relaxivitu nanočástic maghemitu (γ - F e2 O3 ) v dané tkáni. Nanočástice bez polymerního povrchu dosahují nejvyšší r2 relaxivity, protože vzdálenost mezi molekulami vody a nanočásticemi je nejmenší. Tím dojde k velmi rychlé vzájemné interakci mezi magnetickými momenty (spiny) nanočástic a protony v okolní tkáni, nastane ztráta fázové koherence a tudíž velmi rychlá relaxace protonů v transversální rovině T2 [29].
21
Tabulka 2.2: Porovnání relaxivity r2 u nanočástic s a bez polymerní vrstvy; jednotky s−1 /mM [29]
2.4
In vivo detekce SPIO nanočástic uvnitř buněk
In vivo detekce „magnetických buněk“ je limitována několika faktory. Nanočástice se při dělení buněk rozdělují do buněk dceřiných a tím se snižuje příslušná dávka Fe na jednotlivé transplantované buňky - slábne jejich signál v MRI. Dalším možným problémem se zdá být fagocytóza odumřelých značených buněk makrofágy nebo uvolněných nanočástic z transplantovaných buněk. Následkem těchto vlivů může docházet k zeslabené nebo zkreslené detekci magneticky značených kmenových buněk [52]. I přes tyto nevýhody jsou in vivo studie buněčné terapie velkou výzvou novodobého přístupu léčení řady nevyléčitelných chorob a proto je potřeba najít optimální podmínky pro značení buněk SPIO nanočásticemi. Problematika syntézy nanočástic a in vitro značení buněk otevírá spoustu nových otázek pro správné porozumění celého mechanismu buněčného uptaku a internalizace nanočástic do buněčného těla.
22
3. Transport nanočástic přes buněčnou membránu Z biofyzikálního pohledu jsou buňky otevřený termodynamický systém vyměňující energii a látky s jejich okolím. K veškerému transportu do buněk dochází přes buněčnou permeabilní membránu, která propouští molekuly a ionty přímo skrz lipidovou dvouvrstvu nebo specializovanými membránovými kanály a pumpami [53]. Transportní děje (difúze, osmóza aj.) skrz lipidovou dvouvrstvu zajišťují rovnováhu systému. Všechny tyto děje popisuje termodynamika.
Obrázek 3.1: Buňka je otevřený systém, stacionární stav je udržován neustálým tokem energie, látek a informací mezi buňkou a okolím [54] Nanočástice mohou přes membránu prostupovat dvojím způsobem v závislosti na povrchové funkcionalizující vrstvě [55]. Vlastnosti obalové vrstvy nanočástic mohou být hydrofóbní nebo hydrofilní, s nábojem nebo neutrální, případně s adsorbovanými proteiny. Nanočástice oxidů železa vstupují do buněk endocytózou, nanočástice s polymerní vrstvou pronikají skrz membránu samovolně (free - floating) [55], viz obr. 3.2.
23
Obrázek 3.2: Prostup molekul a nanočástic přes buněčnou membránu - bílé nanočástice znázorňují difúzní transport, tmavé nanočástice znázorňují endocytózu, molekuly (např. léčiva) přes tuto membránu prostupují difúzí [55]
3.1
Endocytóza
V případě endocytózy buňka obklopí nanočástice buněčnou membránou a vmezeří je do endosomu [56]. Vytvoří se váček (vezikul), který se pohybuje v cytoplazmě a nese na svém povrchu receptory specifické pro určitou organelu. Po splynutí endosomu s organelou dojde ke zpracování dopraveného obsahu [57]. Pokud je ale ve vezikulu látka pro buňku potenciálně nebezpečná - nanočástice, váček splyne s lysosomem, ve kterém dojde k enzymatickému rozštěpení obsahu. Tímto způsobem jsou degradovány i nanočástice oxidu železa. Přesný metabolismus biodegradace je závislý na mnoha faktorech a není zatím plně objasněn. Aby byly buňky označené nanočásticemi co nejdéle kontrastní v in vivo MRI, je potřeba, aby nanočástice v lysosomu podlehly rozkladu co nejpomaleji. Proto se potahují různými, již zmíněnými funkcionalizačními vrstvami - dextranem, citrátem apod. [58]. Existuje několik různých typů endocytóz (fagocytóza, pinocytóza, mediátorově podmíněná endocytóza), všechny jsou však založené na tvorbě intracelulárních váčků invaginací plazmatické membrány [61]. Fagocytóza („cell eating“) je vyvolána navázáním antigenů (např. bakterie, viru, nanočástice) na membránové receptory, čímž se aktivuje formace vezikul. Schopnost fagocytózy nemají všechny typy buněk (např. mesenchymální
24
Obrázek 3.3: Modelové schéma endocytózy - tvorba endosomu (váčku) [59]
Obrázek 3.4: Snímek z TEM - lokalizace nanočástic v cytoplazmě: a) počátek endocytózy, b) rámeček 1 znázorňuje pohlcení dalších nanočástic, v rámečku 2 jsou nanočástice již uzavřené v endosomu [60] kmenové buňky - MSCs), fagocytující jsou především buňky imunitního systému - makrofágy, které zbavují organismus škodlivých antigenů (fagocytovány jsou obvykle i větší částice ˜ 0,5 µm). Pinocytóza („cell drinking“) probíhá u buněk simultánně při internalizaci tekutiny (např. živného média) z extracelulárního prostředí. Společně s roztokem jsou nespecificky pinocytovány i malé částice. [62], [54] [61]. Endocytóza může být ještě zprostředkovaná pomocí mediátorů (např. clathrinu, nebo caveolinu). Clathrinová endocytóza probíhá jen na specifických částech membrány (tam, kde je přítomný clathrin proteinový receptor), k endocytóze tedy dojde po navázání látky afinitní k danému receptoru [63] [64]. Přehled všech typů endocytózy je znázorněn na obr. 3.5. Složení funkcionalizující vrstvy a navázaných ligandů na povrchu nanočástic má zásadní
25
vliv na mechanismus buněčného uptaku. Nejčastěji prostupují nanočástice plazmatickou membránou přes clathrin tzv. závislou endocytózu [60]. Jedná se o endocytózu, pomocí níž buňky přijímají esenciální živiny a regulují povrchové signální receptory membránových pump [56].
Obrázek 3.5: Přehled buněčných mechanismů, kterými se nanočástice mohou dostat do buněk [65]
3.2
Dělení buněk s nanočásticemi
Během buněčného dělení dojde k rovnoměrnému rozdělení endosomů s magnetickými nanočásticemi do dceřiných buněk. Výskyt endosomů na obou stranách mitotického vřeténka byl znázorněn magnetickým polem (viz Wilhelm, Gazeau, 2008) [58]. Minimální množství železa na jednu buňku, dostatečné pro MRI zobrazení, je 1,4 3,0 pg Fe / buňka [66]. Při předpokladu symetrického buněčného dělení, tzn. při rovnoměrném rozdělení nanočástic do dceřiných buněk, by tedy optimální značení na buňku mělo být 25 pg. Podle minimálního množství, které bylo uvedené (1,4 - 3,0 pg Fe / buňka), by buňka i po čtvrté mitóze obsahovala detekovatelné množství Fe (viz Bulte, Kraitchman, 2004). Magneticky značené transplantované buňky jsou pak viditelné po dobu 6 týdnů [67].
26
4. Značení mezenchymálních kmenových buněk SPIO nanočásticemi Značící techniky musí být k buňkám co nejšetrnější a nesmí inhibovat schopnost jejich diferenciace [68]. SPIO nanočástice by měly být specifické a co nejlépe proniknout do buněk, ale tyto požadavky mohou být limitované např. agregací nanočástic nebo nízkou penetrací nanočástic do buněk [22]. Nanočástice s buňkami reagují různým způsobem podle jejich povrchových vlastností. Afinita nanočástic k buněčné membráně může být ovlivněna typem polymeru, nábojem a hydrofilním nebo hydrofóbním charakterem povrchu nanočástic [69]. Mezi nanočásticemi a buněčnou membránou dochází k elektrostatickým interakcím a adsorbované nanočástice vyvolají aktivní endocytózu. Pokud ale nanočástice mají polymerní vrstvu, která adsorpci zabraňuje sterickým efektem, neinteragující nanočástice jsou pinocytovány s extracelulární tekutinou (médiem) [58]. Plasmatická membrána má velké negativně nabité domény a malé kladně nabité oblasti, na které se běžně vážou záporně nabité molekuly - např. ferritin (11 nm), peptidy nebo liposomy [70]. Kladně nabité nanočástice s membránou snadno interagují a rychleji ji prostupují, než nanočástice záporné nebo neutrální. Nanočástice, které nemají vhodné povrchové vlastnosti pro snadný transport přes plazmatickou membránu, se často používají v kombinaci s chemickými nebo fyzikálními metodami, které usnadňují jejich internalizaci [71] [72].
4.1
Urychlení internalizace nanočástic
Některé typy povrchů nanočástic zabraňují efektivní a rychlé endocytóze (př. dextran, PEG aj). Aby se inkubační doba, potřebná pro internalizaci nanočástic do buněk zkrátila, používají se tzv. transfekční činidla [73] [74]. Transfekční činidlo (transfection agent - TA) slouží jako prostředník mezi neúčinným povrchem nanočástic a povrchem buňky. Musí se však použít vhodná koncentrace,
27
která není pro buňky toxická [75] [76]. Polykationtové TA se naváží na aniontový povrch nanočástic a tento roztok komplexu TA - nanočástice se přidá do živného média buněk. Kladně nabité nanočástice se adsorbují na záporně nabitou membránou buněk a tím usnadňují endocytózu [67]. Schéma mechanismu působení TA je znázorněno na obr. 10. Mezi komerčně dostupná TA patří např. poly - L - lysin (PLL) (MW = 350 - 400 kDa), protamin sulfát nebo lipofectamin [77] [78].
Obrázek 4.1: Schéma funkce transfekčního činidla PLL, který se naváže na záporně nabité SPION [79] Široce používanými metodami, které urychlují proces buněčného uptaku nanočástic, jsou metody založené na narušování stability buněčné membrány elektroporací [80] [18], magnetoelektroporací (MEP) [81] [82] nebo sonoporací - ultrazvukovými pulzy [62] [83]. Elektroporace, také nazývána elektropermeabilizace, je fenomén, který byl pozorován po vystavení buněk vysokému napětí. Zvýšení transmembránového potenciálu vede k vytvoření nanometrových pórů, kterými nanočástice membránu prostoupí. Tvorba pórů může být reverzibilní nebo ireverzibilní v závislosti na pulzních paramatrech a charakteru buněk. Porace membrány vzniká během nanosekund a energetická bariéra je v rozsahu 45 - 50 kT [84]. Při MEP jsou pro rozvolnění membrány a indukci endocytózy používané nízko napěťové pulzy, a proto je šetrnější než elektroporace. MEP se používá pro značení různých typů
28
kmenových buněk i buněk progenitorových, aniž by se projevil pokles viability nebo změny v metabolismu [85] [86]. Magnetoporace se může také používat v kombinaci s TA [87].
29
5. Fyziologické změny magneticky značených buněk 5.1
Vliv SPIO nanočástic na proliferaci buněk
Při in vitro studiích značených buněk SPIO nanočásticemi došlo k zajímavému objevu v souvislosti s rychlostí buněčné proliferace. Reakce buněčných kultur na přítomnost nanočástic byla nečekaná, protože nastala stimulace růstu. Příčiny tohoto chování vědci přiřazují dvěma možným dějům, které jsou dále popsány a schématicky znázorněny na obr. 5.1 [88].
Obrázek 5.1: Metabolismus SPIO nanočástic v lidských mesenchymálních kmenových buňkách [88] Na obrázku 5.1 jsou znázorněny dva děje, které by mohly být příčinou zvýšené proliferace: a) SPIO nanočástice slouží jako redukční činidlo intracelulárního peroxidu vodíku H2 O2 a/nebo b) SPIO po lysosomálním štěpení jsou zdrojem volných Fe iontů (mediátorů pro zrychlení buněčného růstu) [88] Jak bylo zmíněno v kapitole věnované endocytóze (3.1), nanočástice pohlcené buňkou jsou prostřednictvím endosomů směrované do lysosomů, ve kterých díky rozkladu SPION dochází ke vzniku volných iontů železa a k jejich následnému uvolněním do cytoplasmy [89] [90].
30
Je dobře známé, že železo hraje důležitou roli při buněčné progresi, proliferaci a apoptóze. Po endocytóze nanočástic se následkem volných Fe iontů zvýší exprese proteinu p53, aktivují se proteinové regulátory a to způsobuje urychlení buněčného cyklu a proliferace [88]. Vliv volných iontů železa na rychlost buněčného růstu je tedy první možnou příčinou. Druhým potencionálním faktorem je působení nanočástic na hladinu peroxidu vodíku. Proliferaci a buněčnou smrt řídí v buňkách metabolismus peroxidu vodíku H2 O2 . SPIO nanočástice jsou pravděpodobně peroxidázně aktivní a způsobují snížení H2 O2 uvnitř buněk a tím ovlivňují buněčné dělení [91]. Stimulace zvýšené proliferace magneticky značených buněk je zřejmě způsobená právě zmíněným poklesem H2 O2 , protože nedostatek H2 O2 má vliv na expresi regulačních molekul a proteinů, které řídí fáze buněčného cyklu a dochází k jeho urychlení [88]. Vědci Huanga a Hsiaob et al. 2009 chemickými testy prokázali, že k rapidnímu snížení peroxidu vodíku v buňce dojde již po jedné hodině inkubace s Resovistem. Potvrdilo se tím, že Resovist má peroxidázovou aktivitu a rozkládá H2 O2 . V grafu je vyjádřená závislost koncentrace nanočástic na procentuálním zastoupení peroxidu vodíku v buňce [88].
Obrázek 5.2: Vyjádření úbytku peroxidu vodíku při různých koncentracích použitých nanočástic (Resovistu), ± standardní chyba (∗ ∗ ∗p < 0, 001) [88] Na druhou stranu prodloužením času inkubace nanočástic s buňkami nebo použitím toxické koncentrace nanočástic dochází ke zpomalení proliferace. Při testování toxicity Resovistu, magnetoliposomů a Endoremu nastalo zpomalení proliferace do třetího dne,
31
u VSOP nanočástic pokrytých citrátem došlo k výraznému snížení už po prvním dni. Potvrdila se tedy značná toxicita VSOP při vysokých koncentracích [92].
5.2
Vliv SPIO nanočástic na adhezi buněk
Buňky neustále monitorují chemické a fyzikální signály z jejich okolí a podle nich reagují na různé změny okolního prostředí. Interakce mezi buňkami a různým mikroprostředím hraje velkou roli při embryonické morfogenezi, tkáňové tvorbě a především při různých fyziologických funkcích. Na povrchu buněk je buněčná membrána, která separuje vnitřní prostředí - cytoplasmu od vnějšího - extracelulární matrix. Přes tuto bariéru dochází k transportu různých molekul a tím k udržování optimálního pH a iontové koncentrace, které jsou nezbytné pro život buňky [93]. K adhezi slouží buňkám cytoskelet, který se skládá ze tří typů protáhlých molekul: mikrofilament (obsahují aktin), mikrotubulů (obsahují tubulin) a středních filament (viz obr. 5.3). Při dynamické či morfologické změně na povrchu buňky (během buněčných procesů) se tato informace díky cytoskeletu přenese do vnitřního prostředí (cytoplazmy) [93].
Obrázek 5.3: Adheze a popis živočišné buňky [93] Důležitou funkci v buňce zajišťuje aktin, který se nachází ve zmíněných mikrofilamentech. Aktinová vlákna zachovávají tvar buňky, umožňují její pohyb a reagují na buněčnou diferenciaci nebo smrt [54]. V průběhu endocytózy nanočástic do buněčné cytoplazmy dochází ke změně buněčného
32
tvaru - většinou ke zmenšení a tím i ke změně aktinových vláken, které následně ovlivňují adhezi i proliferaci buněk. Tyto změny se mohou pozorovat specifickým obarvením aktinových vláken, jádra a tubulinu, rozdílně fluorescenčně aktivními barvivy. Porovnáním snímků z fluorescenční mikroskopie se pak vyhodnotí rozdílné chování a obranné mechanismy buněk podle podaných koncentrací a druhů nanočástic [92]. Změny morfologie buněčného těla podle použité koncentrace Resovistu byly studovány skupinou (Soenen a kol., 2011). Na obr. 5.4 je ukázka z této studie, kde jsou tyto morfologické změny zachyceny pomocí konfokálního mikroskopu [92].
Obrázek 5.4: Změna morfologie buňky podle množství pohlcených nanočástic [92]
5.3
Vliv SPIO nanočástic na diferenciaci buněk
První studie zaměřené na značení kmenových buněk Feridexem (Endorem) nepotvrdily negativní vliv této komerční kontrastní látky na diferenciaci buněk. Opakovanými experimenty se sice prokázala částečná inhibice chondrogeneze, ale zároveň žádné změny u adipogeneze a osteogeneze [47] [94] [34]. U Ferukarbotranu (Resovistu) vědci potvrdili inhibici osteogenické diferenciace [95]. Při použití vysoké koncentrace těchto nanočástic se zastavila diferenciace dokonce do všech typů tkání [96]. Autoři Chang a Liu (2011) zkoumali změny diferenciace buněk značených N H 3+ modifikovanými SPIO nanočásticemi a v této studii potvrdili inhibiční vliv amino - SPIO
33
nanočástic na osteogenezi i na chondrogenezi. Adipogeneze byla beze změn [97]. Řada experimentálních studií ale změny diferenciační kapacity SPIO značených mezenchymálních kmenových buněk vyvrací [98] [99] [100].
34
6. Toxicita nanočástic Pro in vivo aplikace nanočástic je nutnou podmínkou studium jejich toxicity (tzv. nanotoxikologie). Sledují se různé interakce nanočástic se subcelulárními komponenty a organelami buněk nejprve in vitro a poté na zvířecích modelech [56]. V jaké části buněčného těla se nanočástice koncentrují, záleží na jejich povrchu, tvaru a velikosti [21]. Lokalizace nanočástic se mění podle jejich použité koncentrace. Při nízké koncentraci se nanočástice shlukují v cytoplazmě převážně v okolí jádra, při vysoké koncentraci se nalézají i v pseudopodiích [101]. Toxicita nastává ve chvíli, kdy se nanočástice penetrují do jádra. Uvnitř jádra může dojít následkem oxidativního stresu k inhibici replikace, transkripce a buněčné proliferace [102]. Obecně platí, že s klesajícím rozměrem nanočástic se zvětšuje jejich plocha povrchu. S tím ale bohužel také souvisí rostoucí toxicita nanočástic. Nanočástice o velikosti 15 nm (povrch ∼ 268 m2 ·g −1 ) způsobuje větší oxidativní stres než částice o velikosti 46 nm (povrch ∼ 53 m2 ·g −1 ) [103]. Nejrozšířenější metody pro stanovení toxicity (resp. viability) SPIO nanočástic jsou rozebrány v následujících podkapitolách.
6.1
Testy viability
6.1.1
Trypanová modř
Při testu viability se používá trypanová modř (Trypan blue). Jedná se o barvivo obsahující chromofor, které je negativně nabité a reaguje pouze s narušenou buněčnou membránou. Protože mrtvé buňky mají membránu deformovanou, trypanová modř do nich pronikne a obarví je tmavě modře. Živé buňky barvivo do intracelulárního prostředí nepropustí. Podle toho se při počítání rozlišují mrtvé a živé buňky [4]. Viabilita se vypočítá následovně: viabilita =
(Ns −Nd ) Nd
∗ 100%, kde Ns je počet všech
buněk a Nd počet mrtvých buněk Tento výpočet se stanoví u neznačených MSCs a porovnává se s viabilitou buněk značených SPIO nanočásticemi [4].
35
6.1.2
MTT test
Methyltetrazoliová (MTT) sůl reaguje s buněčnými enzymy. Podle aktivity mitochondriálních dehydrogenáz živých buněk se mění barva roztoku ze žluté na fialovou (živé buňky = roztok fialový), absorbance se měří spektrofotometricky. Za toxickou dávku je označena taková koncentrace látky, při které nastane buněčná smrt u 50% buněk (IC 50). U této metody však záleží na buněčné metabolické aktivitě, která se může v průběhu reakce s MTT měnit i bez vlivu toxické látky [104].
6.1.3
Fluorescenční barvení
Fluorescenční mikroskopie také umožňuje počítat poměr živé / mrtvé buňky a stanovit procentuální hodnotu viability. Oproti světelné mikroskopii je tato metoda přehlednější. Sytými barvami jsou od sebe odlišeny buňky živé/mrtvé (live / dead) a speciální modul k programu pro digitální zpracování obrazu práci s počítáním ulehčuje. Fluorescenční barviva pro live/dead analýzu můžeme různě kombinovat (viz tab. 6.1).
Tabulka 6.1: Přehled fluorescenčních barviv pro stanovení buněčné viability [105] Barviva do mrtvých buněk pronikají podobným principem, jako např. trypanová modř prostoupí poškozenou buněčnou membránou. Na trhu se vyskytuje široká nabídka live/dead kitů, nejčastěji obsahují barvivo ethiodium homodimer 1, který se váže na nukleovou kyselinu a červeně zvýrazní jadernou oblast mrtvých buněk. K zabarvení živých buněk se používá kalcein, který pronikne přes neporušenou membránu, uvnitř buněk specificky
36
reaguje s ionty v cytoplazmě a emituje zelenou barvu [106]. Viabilita se stanoví stejným výpočtem jako při barvení trypanovou modří.
Obrázek 6.1: Zelené buňky jsou živé (obarvené kalceinem), červeně jsou zvýrazněná jádra mrtvých buněk [107]
37
7. Mikroskopické zobrazení SPIO nanočástic v buňkách 7.1
Světelná mikroskopie (LM)
Běžným světelným mikroskopem se zobrazují struktury, které se liší absorpcí viditelného světla. Po průchodu světla pozorovaným objektem se změní amplituda vlnění a to rozeznáváme jako rozdíly v barvě vzorku (např. histologického preparátu) a v intenzitě světla. Při průchodu světla bezbarvými objekty (buňkami) nastane pouze posunutí fáze světelné vlny, a proto struktury nemají dostatečný kontrast pro zobrazení v běžném světelném mikroskopu [108]. K pozorování buněčných kultur je nutné mít světelný mikroskop vybavený fázovým kontrastem [109], který přeměňuje neviditelné fázové rozdíly vlnění na změnu intenzity světla, kterou rozeznáváme [110].
Obrázek 7.1: A) průchod světla obarveným vzorkem (amplitudovým objektem), B) průchod světla bezbarvým vzorkem (fázovým objektem) [111]
7.1.1
Barvení nanočástic pruskou modří
Barvení pruskou modří F e4 [F e(CN6 )]3 [112] se používá při kvantitativní analýze SPIO nanočástic. Obarvená místa pruskou modří zvýrazňují výskyt železa - internalizované SPIO v buňkách (viz obr. 7. 2) [113].
38
Obrázek 7.2: SPIO nanočástice obarvené pruskou modří uvnitř rMSCs, (vlevo) šipka znázorňuje nanočástice neinkorporované do buněk ([114]), (vpravo) šipka demonstruje SPIO uvnitř buňky; měřítko je 100 µm [22]
7.2
Fluorescenční mikroskopie(FM)
Fluorescenční mikroskopie zastupuje unikátní pozici v optických zobrazovacích metodách. Fluorescenční barviva vybíráme a kombinujeme podle objektů, které chceme ve vzorku pozorovat, protože se specificky vážou na buněčné struktury (např. při zobrazení jader použijeme jiné fluorescenční barvivo, než při zvýraznění buněčných membrán [105]. Superparamagnetické nanočástice oxidů železa mohou být po syntéze dále modifikovány navázáním vrstvy fluoroforu. Tím se SPIO stávají tzv. bifunkční kontrastní látkou (magnetickou pro MRI, fluorescenční pro FM), viz 1.1.5, obr. 1.5 [7].
Obrázek 7.3: Buňky značené fluorescenčně modifikovanými nanočásticemi (SPION s rhodaminem): a) nanočástice na povrchu membrány, b) nanočástice inkorporované v buňkách; zobrazeno fluorescenčním mikroskopem [115]
39
7.2.1
Fluorescenční značení nanočástic
SPIO nanočástice se mohou obarvit např. fluorescenčním barvivem PMI, které emituje záření v zelené spektrální oblasti (viz obr. 7.4). Pro buňku je nejvíc toxické, když se nanočástice dostanou do jádra, mitochondrií nebo do Golgiho aparátu, proto se jednotlivé organely značí barvivem, aby se zviditelnila jejich lokalizace. Snímek byl pořízen konfokální laserovou skenovací mikroskopií (CLSM) [116].
Obrázek 7.4: Snímky fluorescenčně aktivních nanočástic v buňkách; konfokální laserový skenovací mikroskop (CLSM): na levém snímku jsou oranžově viditelné buněčné membrány obarvené barvivem CellMaskTM Orange [117], na pravém snímku jsou DAPI značená jádra buněk; zeleně svítí SPIO nanočástice [116]
7.3
Transmisní elektronová mikroskopie (TEM)
Transmisní elektronová mikroskopie je nepostradatelnou technikou při in vitro studiích magneticky značených buněk. Jedná se o obdobu světelné mikroskopie, ale zobrazovací funkci plní urychlené elektrony namísto fotonů a skleněné čočky jsou nahrazené čočkami elektrostatickými a elektromagnetickými [118]. Elektrony mají kratší vlnovou délku než je vlnová délka viditelného světla, a proto jimi lze zobrazit menší objekty než světelnou mikroskopií [119]. TEM poskytuje detailní zobrazení buněčných ultrastruktur a přesného výskytu nanočástic v jednotlivých organelách, avšak příprava vzorku pro toto mikroskopické zobrazení je velice časově náročná. Biologické vzorky se musí chemicky fixovat a dehydratovat, zalít do pryskyřice, nakrájet na ultratenké řezy (pod 100 nm) a kontrastovat elektrodenzními
40
chemikáliemi (citrátem olova, uranyl acetátem) [120]. Díky delším časovým prodlevám mezi jednotlivými kroky trvá laboratorní příprava vzorku přibližně pět dní. Výsledné snímky nám ale poskytnou důležité informace o chování nanočástic uvnitř buněk.
Obrázek 7.5: TEM snímek magneticky značených hMSCs; šipka ukazuje výskyt nanočástic uvnitř endosomu [121] Pokud jsou nanočástice pro buňku toxické, mohou se vyskytovat v tzv. autofagosomech (viz obr. 7.5) ([22]). Autofagie je katalický proces probíhající v cytoplazmě buněk, který zajišťuje odstranění nepotřebných proteinů a poškozených organel. Při tomto ději se v cytoplazmě vytvoří membrána, ze které postupně vznikne vezikul (autofagosom) uzavírající nepotřebné látky a organely. Osud autofagosomu končí fúzí s lyzosomem, ve kterém dojde k rozštěpení obsahu. Autofagie u buněk běžně probíhá a není hlavním příznakem patologie buňky. Jelikož se jedná o ne zcela objasněný proces, funkce tohoto děje při programované smrti (apoptóze) buňky jsou stále předmětem bádání (viz Ravikumar B. a Sarkar S. (2010) [122] a Tsujimoto Y, Shimizu S (2005) [123]). V transmisní elektronové mikroskopii fokusovaný svazek urychlených elektronů prochází vzorkem, zatímco ve skenovací elektronové mikroskopii primární svazek elektronů interaguje s povrchem preparátu, ze kterého vyráží další elektrony (sekundární (SE) a zpětně odražené (BSE) elektrony). Tyto elektrony dopadají na detektory, kde vzniká signál pro zobrazovací soustavu, která vytvoří obraz povrchové struktury vzorku [124] [119].
41
Obrázek 7.6: TEM snímek rMSCs značených SPIO nanočásticemi bez funkcializační vrstvy; šipky demonstrují výskyt nanočástic, A - autofagosom, N - jádro [22]
7.4
Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)
Výskyt nanočástic na buněčné membráně se dá potvrdit detekcí zpětně odražených elektronů, které zajišťují materiálový kontrast podle rozdílných atomových čísel prvků. Na snímku získaném pomocí zpětně odražených elektronů (11 kV), je zřejmé, že HEDP SPIO nanočástice jádro (Nu) pouze obklopily v prenukleární oblasti, ale přes jadernou membránu nepronikly [113].
Obrázek 7.7: Prenukleární oblast buňky s nanočásticemi (viz bílá šipka) [113] Příprava vzorku pro SEM není tak časově náročná jako v případě TEM mikroskopie. První kroky jsou stejné - fixace, dehydratace, ale u SEM následuje už jen sušení a případné pokovení vzorku. Výhodou TEM je však zobrazení vnitřních struktur buňky, které běžným
42
postupem ve skenovací elektronové mikroskopii nezískáme. Mikroskopické techniky se vzájemně prolínají. Je proto žádoucí, aby jednou připravený vzorek mohl být proměřen pomocí různých mikroskopických technik - zkrátila by se tím doba přípravy a náklady spojené s přípravou vzorku. I při výběru barviva pro fluorescenční mikroskopii je možné pomyslet na pozdější přípravu vzorku pro elektronový mikroskop. Aby fluorescenčně naznačený vzorek podrobený fixaci, dehydrataci a odvodnění pro elektronovou mikroskopii zůstal fluorescenčně aktivní, musí se zvolit speciálně modifikovaný fluorofor. Chemicky modifikované barvivo je zachované i po zmíněných krocích a případně i po mrazové substituci. Zobrazování živých buněk v optickém mikroskopu až po snímky z elektronové mikroskopie se využívá především v buněčné biologii, kde se sledují stejné struktury vzorku různými mikroskopy [105] [125]. Přehled všech fluorescenčních značek a jejich aplikací je popsán v knize: Fluorescence Applications in Biotechnology and Life Sciences, 2009 [105].
43
Cíle práce
• In vitro studie značených mezenchymálních kmenových buněk novými typy nanočástic a porovnání s komerční kontrastní látkou Resovist • Zobrazení magneticky značených buněk mikroskopickými technikami (světelná a fluorescenční mirkoskopie, SEM, AFM) • Stanovení optimální koncentrace nanočástic, která bude mít minimální vliv na proliferaci a viabilitu buněk a současně kvalitní signál při MRI
44
Experimentální část
45
8. Materiály a metody 8.1
Buněčné kultury
Mesenchymální kmenové buňky potkana (rMSCs) byly izolovány z kostní dřeně potkanů podle speciálního protokolu Mgr. Josefem Skopalíkem na Lékařské fakultě (MU Brno).
8.1.1
Kultivace
V in vitro studiích se buněčné linie pozorují mimo živý organismus, proto se jim musí přizpůsobit podmínky (teplota, atmosféra, zdroj živin), ve kterých budou viabilní (živé). Postup kultivace a pasážování byl čerpán z Gallo 2007 [126]. rMSCs se kultivují ve sterilních kultivačních panelech. Počet jamek na destičku je variabilní (6 - 96). Pro naše experimenty bylo optimální použít 24 jamek, protože buňky v každé z jamek narostou do potřebné konfluence (množství) a současně je dostatečný počet jamek pro rozdílné pokusy. Zdroj živin zajišťuje živné médium (Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium (IMDM), Invitrogen), které obsahuje RPMI + 10 % FBS + 2 % PEN/STR; pozn.: RPMI - roztok pro kultivaci buněk - zdroj cukrů, FBS - fetální bovinní sérum - zdroj bílkovin, PEN / STR - penicilin/streptomycin - prevence před infekcí. Výměna média se provádí každý třetí den, za sterilních podmínek ve „flow“ boxu, aby nedošlo ke kontaminaci buněčné linie. Stálé inkubační podmínky (37 ◦ C a o 5 % CO2 obohacenou atmosféru), při kterých se buněčné kultury kultivují, zajišťuje inkubátor. Jedná se o napodobené prostředí, které by bylo ve zvířecím, případně i v lidském těle, tedy in vivo. Viabilita, proliferace a morfologie buněk se pravidelně kontroluje pomocí světelného mikroskopu. Pokud konfluence buněk dosáhne 80% a více, buňky je nutné pasážovat rozsadit do více jamek po menším množství, aby měly prostor na další nárůst. Mezenchymální kmenové buňky jsou adherentním typem buněk, rostou tedy adherované na dně kultivační jamky. Při nadměrné konfluenci dochází ke kontaktní inhibici. Buňky nemají prostor na přilnutí ke dnu a postupně se deadherují, což vede k buněčné smrti.
46
Obrázek 8.1: Kontrola buněčné kultury světelným mikroskopem
8.1.2
Pasážování
Aby nedošlo při nadměrném nárůstu konfluence ke kontaktní inhibici, pravidelně se buňky pasážují. Při pasážování se nejprve odebere médium a poté se jamky promyjí pufrem PBS, který odstraní zbytek média a tím zlepší enzymatické působení trypsinu. Následně se dno jamek pokryje trypsinem (zahřátým na 37 ◦ C) a nechá se působit max. 8 min. Tento krok zajistí, že se buňky deadherují ode dna jamky. Tryspsinová enzymatická reakce se zastaví přidáním kultivačního média obsahující bovinní sérum (FBS). Suspenze se dále centrifuguje při 3000 rpm po dobu 5 min. Supernatant se odstraní a pelet se resuspenduje v kultivačním médiu na požadovaný objem (záleží na počtu jamek, do kterých se buňky rozsadí). Nově pasážované buňky mají nejdříve kulatý tvar (následek trypsinizace). V jamkách se však opět adherují na dno a postupně nabývají svého typického protáhlého tvaru (viz obr. 8.2).
8.2
Superparamagnetické nanočástice oxidů železa (SPIO nanočástice)
Ke značení rMSCs byly použity dva nové typy SPIO nanočástic a komerční MRI konc trastní látka Resovist ( Schering AG 2002).
47
Obrázek 8.2: Postupná adherace buněk ke dnu jamky - 3 hod po trypsinizaci Prvním typem zvoleným pro značení buněk byly nanočástice nazvané FeNVs. Z magnetických a strukturních charakteristik bylo prokázáno, že jsou to superparamagnetické nanočástice maghemitu (γ - F e2 O3 ) s OH - skupinami na svém povrchu, které zajišťují negativní náboj částic. Velikost částic byla stanovena z TEM mikroskopie a nabývá hodnoty v rozmezí 20 - 40 nm. I přesto, že FeNV nanočástice nemají žádný organický ani anorganický obal, jsou stabilní a jejich koloidní roztok je snadno resuspendovatelný. Díky stabilitě a schopnosti reverzibilně vázat specifické molekuly na svůj povrch mohou být používány jako nosiče organických molekul (např. enzymů). Povrch nanočástic je ještě možné modifikovat fluorescenční značkou. Pro snadnou a levnou syntézu, možný duální značící charakter - magnetický signál při MRI a fluorescenční signál využitelný nejen pro fluorescenční mikroskopii, by mohly být FeNV nanočástice využity při in vitro i in vivo monitoringu kmenových buněk, a proto jsme věnovali těmto superparamagnetickým nanočásticím maghemitu větší pozornost. Detailní popis jejich syntézy a fyzikálních vlastností viz Magro M., Sinigaglia G. 2012 (in press [127]).
48
Obrázek 8.3: TEM snímek nanočástic: vlevo FeNV nanočástice (měřítko 50 nm), vpravo Mag nanočástice (100 nm) Druhým typem nanočástic testovaných pro značení buněk byly zvoleny částice nazvané Mag. Jsou to také superparamagnetické nanočástice maghemitu. Velikost jednotlivých nanočástic je 10 nm. Povrch mají pokrytý polylactic acid (PLA), která eliminuje tvorbu aglomerátů. Jednotlivé povrchově modifikované nanočástice jsou navíc uspořádané v superklastrech uvnitř micel tvořených hydrofóbním polymerem - polyethylenglykolem (PEG). Velikost těchto micelárních útvarů obsahujících nanočástice maghemitu se pohybuje v rozmezí 30 - 100 nm. Inkorporované nanočástice v hydrofóbních superklastrech jsou biokompatibilní a jejich využití se směřuje na biomedicínské aplikace - léčbu nádorů hypertermií nebo cílené uvolňování léčiv pomocí magnetického pole (léčiva by mohla být navázaná na povrchu jednotlivých nanočástic a polymerní PEG vrstva by částice chránila před nespecifickými reakcemi s okolním prostředím). Postup přípravy a charakterizace těchto částic je uvedena v článku A. Bakandritsos 2010 [128]. Resovist (ferucarbotran) je klinicky schválená a komerčně dostupná kontrastní látka pro zobrazení jater v magnetické rezonanci. Obsahuje SPIO nanočástice o hydrodynamickém průměru 62 nm pokryté karboxydextranem, dodávané v suspenzi o koncentraci 28 mg Fe / ml roztoku [48].
49
8.3
Inkubace nanočástic s buněčnou kulturou
U FeNV i Mag nanočástic se buňkám aplikovala koncentrace shodná s koncentrací běžně podávanou při značení Resovistem. Koncentrace nanočástic FeNV (0,2 mg Fe· ml−1 ) a Mag (0,35 mg Fe· ml−1 ) jsou ve srovnání s Resovistem (28 mg Fe· ml−1 ) velmi nízké (cca 100 krát menší). Aby se mohly porovnávat kontrastní i toxické vlastnosti všech tří typů nanočástic, byly všechny naředěny na stejnou koncentraci a to na 50µ g Fe· ml−1 média. Nanočástice byly s buněčnou kulturou inkubované vždy 48 hod. Po této době se vyměnilo médium a na světelném mikroskopu byla provedena kontrola buněčné konfluence, viability i morfologie. Podle záměru experimentu se buňky v jednotlivé dny počítaly a stanovovala se jejich proliferace.
8.3.1
Počítání značených buněk při stanovení proliferace
Do kultivačních jamek byly nasazeny buňky o stejném počtu a to 5×103 buněk / cm2 . Sledoval se nárůst nanočásticemi značených buněk během jednotlivých dnů. V každé jamce se buňky počítaly z 20 zorných polí při zvětšení 200 a to i u kontrolních - neznačených buněk. V jamkách s většími shluky nanočástic nebo při dlouhodobějším pozorování, kdy už je konfluence buněk velmi vysoká, se vzorek značil fluorescenčním barvivem kalceinem (Ex / Em = 494 nm / 517 nm). Jedná se o fluorochrom vázající se na membránu živých buněk, který zvýrazní přesný výskyt buněk, viz obr. 10.1.
Obrázek 8.4: Kalceinem značené rMSCs; a) fázový kontrast - množství nanočástic zamezuje počítání buněk; b) fluorescenční mód - zeleně svítící buňky; c) složený snímek fázového kontrastu a fluorescenčního módu - zobrazení nanočástic i buněk
50
8.4
Použité mikroskopy
Pro stanovení viability a proliferace buněk byl využíván světelný mikroskop s fluorescenčním módem Olympus IX 70 , obsahující objektivy modifikované pro fázový kontrast se zvětšením 10 a 40 a objektiv modifikovaný pro fázový kontrast i fluorescenční mód se zvětšením 20. Snímky byly zachycovány kamerou Olympus DP72. Přímý monitoring interakce buněk s nanočásticemi byl zachycen time - lapse mikroskopem Bio Station (Nikon). Jedná se o automatizovaný kompaktní inkubační a monitorovací systém navržený pro monitorování buněčných kultur. Suspenze buněk a nanočástic se vložila do prostoru mikroskopu s kultivačními podmínkami. Černobílé snímání každou minutu probíhalo paraleně ve čtyřech zorných polích. Měření jsem provedla v Laboratoři tkáňových kultur v Nových Hradech. Přítomnost nanočástic v buňkách a kontrola morfologie povrchu buněk byly stanovovány pomocí skenovacího elektronového mikroskopu (SEM) Hitachi SU6600 s detektorem signálu SE i BSE: rozlišení 1,2 nm pro SE a 3,5 nm pro BSE. Zdrojem emise je Schottkyho katoda (W - ZrO) a maximální zvětšení mikroskopu je 600 000. Mikroskop je vybaven spektrometrem EDX pro prvkovou analýzu (Energy Dispersive X - Ray Spectrometer) • Použité povrchy pro kultivaci buněk: ThermanoxTM firmy Nunc: Polymerní povrch speciálně upraven pro adhezi a růst buněk, tloušťka 0,2 mm, sterilní a rezistentní k chemikáliím (alkoholu, aldehydům, uhlovodíkům, slabým kyselinám a zásadám), vhodný k přípravě trvalých preparátů pro světelnou mikroskopii (LM), TEM i AFM [129]. c FTO sklíčko firmy Solaronix Sklíčko, potažené vodivou vrstvou cínu dopovanou fluorem a určené pro technologii solárních článků, je vodivé a odolné vůči vysoké teplotě (do 450 ◦ C). Jeho tloušťka je 2,2 mm [130].
51
Obrázek 8.5: Typy matrix: podložka Thermanox v různých tvarech (vlevo), FTO sklíčka (vpravo) [129] [130] • Příprava vzorku pro SEM Hitachi SU6600 Během pasážování byly rMSCs rozsazené do jamek s Thermanoxem nebo FTO sklem. Po nárůstu buněk na 60 % konfluenci se povrchy z jamek odebraly, promyly v PBS (fosfátový pufr, pH = 7,4) a fixovaly. 1. Fixace vyorku převrstvením Thermanoxu / FTO skla 2,5 % glutaraldehydem (GA) v PBS (1 hod, pokojová teplota (RT)), promytí v PBS (3 × 5 min.) 2. Odvodnění etanolovou řadou 25 %, 50 %, 75 %, a 2 × 100 % (ethanol byl ředěn PBS, v každé koncentraci se vzorek promýval na přístroji Vertex po dobu 10 min., v 75 % etanolu byl vzorek ponechaný 30 min.). 3. Sušení proběhlo přes noc v Petriho misce na parafilmu. Skenovací elektronový mikroskop s autoemisní tryskou (FESEM) JEOL 7401F, GB (Gentle Beam) mód a r-filtr, rozlišení 1,5 nm při 1 kV, detektory SE, YAG detektor BSE (modifikovaný Autratou); Laboratoř elektronové mikroskopie JCU, České Budějovice • Příprava vzorku pro SEM FESEM JEOL 7401 1. Promytí FTO skla s narostlými buňkami (3 × 5 min) a fixace vzorku 3 % GA ve fosfátovém pufru (1 × 10 min, po výměně roztoku 1 × 20 min.), vypírání v 0,2 M fosfátovém pufru s pH 7,2 (2 × 5 min) 2. Odvodnění ethanolovou řadou 30 % (10 min), 50 % (10 min), 60 % (10 min), 70 % (přes noc při 4 ◦ C), 80 %, 90 %, 95 %, 100 % (3 × 15 min)
52
3. sušení přes noc při RT Transmisní elektronová mikroskopie. Vlastní snímky z TEM nejsou z technických důvodů součástí této práce, ale polotenké řezy byly zobrazené světelným mikroskopem. Přípravu i krájení vzorku jsem provedla v Laboratoři elektronové mikroskopie JCU v Českých Budějovicích. • Příprava vzorku pro TEM 1. Fixace peletu buněk: GA 2,5 % (3 hod) - mikrovlnizace po každé půl hodině (80 W, 1 min), promytí v 0,1 M fosfátovém pufru s 4 % sacharózou (2 × 15 min) 2. Zalití do agaru: 2 % agar (62 ◦ C, 10 min), po centrifugaci 5 min při 4 ◦ C, vyříznutí zalitého peletu v agaru 3. Postfixace: 2 % OsO4 (2 hod) 4. Dehydratace: acetonová řada 30 % (15 min), 50 % (15 min), 70 % (48 hod při 4 ◦ C), 80 % (15 min), 90 % (15 min), 95 % (15 min), 100 % (15 min) 5. Prosycení pryskyřicí Epon, polymerizace 48 hod při 60 ◦ C 6. Krájení polotenkých řezů na ultramikrotomu Ulracut E Reichert Jung Morfologie buněk a přítomnost nanočástic ve vzorku byla snímána také pomocí mikroskopu atomárních sil (AFM) NTEGRA Aura (NT - MDT: skenovací rozsah 100 µm a 35 µm, skenovací rychlost 0,3 - 0,7 Hz, poklepový mód (semi - contact), vzorek fixovaný, dehydratovaný (viz výše uvedená příprava vzorku pro elektronový mikroskop), typ hrotů CSG 10, NT - MDT (koncový poloměr hrotu 10 nm, délka kantilevru 225 ± 5µm, šířka kantilevru 30 ± 5 µm, rezonanční frekvence 8 - 39 kHz, tvrdost kantilevru 0,01 - 0,5 N / m.
53
9. Výsledky - Mikroskopické techniky 9.1
Světelný a fluorescenční mikroskop (LM a FM)
Díky fázovému kontrastu a fluorescenčnímu módu, kterým je světelný mikroskop Olympus IX 70 vybaven, je možné pozorovat bezbarvé buněčné struktury, které mají velice podobný index lomu a téměř totožnou absorpci světla jako okolní prostředí (kultivační médium) [110] [109].
Obrázek 9.1: Neznačené mezenchymální kmenové buňky potkana (rMSCs) zobrazené světelným mikroskopem Olympus IX 70 vybaveným fázovým kontrastem; zvětšení 400
9.1.1
Problematika zobrazení
Světelný mikroskop umožňuje snadnou a rychlou kontrolu proliferace, viability a diferenciace buněk. U vzorků buněk značených nanočásticemi se pozoruje adheze nanočástic na buněčný povrch a přibližná lokažlizace nanočástic po jejich inkorporaci dovnitř buněčné struktury [110] [109]. Dokonalému zaostření vzorků zabraňuje suspenze nanočástic v médiu. Nanočástice mají koloidní charakter, proto jsou po inkubaci s buňkami rozptýleny v roztoku média a způsobují rozptyl světla. Obraz buněk pak nelze dobře zaostřit (především v prvních dvou dnech inkubace, viz obr. 9.2). Po výměně média zůstanou v kultivační jamce pouze nanočástice pevně adsorbované na buňky a menší množství nanočástic zanechané nedokonalým
54
odpipetováním suspenze. Buňky pak lze zaostřit sice lépe, ale nanočástice se vyskytují v jiné rovině zaostření než buňky a to způsobuje mírné rozostření konečného snímku.
Obrázek 9.2: Snímek buněk značených Mag nanočásticemi před výměnou média nevýrazné zobrazení buněk; zvětšení 200; velikost měřítka 100 µm
9.1.2
Interakce nanočástic s rMSCs
Během prvního dne inkubace buňky postupně adsorbují nanočástice na svůj povrch a následně je endocytují (Resovist a FeNV). V případě Mag nanočástic buňky soustředí nanočástice podél jedné strany buněčné membrány (viz obr. 9.3 c)). Resovist a FeNV nanočástice buňky lokalizují a adsorbují na rozdílných místech své membrány. Tento jev je přisuzován odlišným vlastnostem (velikost, povrch, náboj na povrchu) jednotlivých typů nanočástic. Způsob inkorporace a tedy i typ endocytózy závisí na charakteru nanočástic. Pokud nanočástice netvoří velké shluky (Mag částice), jsou inkorporovány velmi rychle, zřejmě difůzí, skrz buněčnou membránu. Během krátké doby tak musí buňka spustit naplno degradační mechanismy pro odstranění cizího objektu, což může výrazně narušit její viabilitu. FeNV nanočástice mají tendenci se v blízkosti buněčné membrány shlukovat do větších celků 9.3 a), buňky je tak endocytují mnohem pomaleji. Buňka se stíhá vyrovnat s příjmem železa, a proto nejsou zaznamenávány žádné výrazné změny ve viabilitě (viz 10.1). Viabilita je také úzce spojena s buněčnou morfologií. Rozdílné změny tvaru buněk po inkubaci s nanočásticemi jsou znatelné na obr. 9.4. Nejvíce je morfologie těla buněk
55
Obrázek 9.3: Výskyt nanočástic (znázorněný bílými šipkami); a) FeNV, b) Resovist, c) Mag zachovaná při značení velmi kontrastními FeNV nanočásticemi, které jsou viditelné jako tmavé oblasti v extracelulárním prostředí obr. 9.4 a). Výrazně zakulacený tvar buněk a jejich tendence deadherovat se ode dna kultivační jamky je zachycen na obr. 9.4 c), který zobrazuje buňky inkubované s Mag nanočásticemi. Negativní vliv Mag nanočástic na viabilitu rMSCs je popsán v kapitole 10.1 „Stanovení proliferace a viability naznačených buněk“.
56
Obrázek 9.4: Porovnání změny morfologie značených buněčných kultur (rMSC); 4 dny po inkubaci s NČ: a) FeNV, a) Resovist c) Mag (znatelný kulatý tvar buněk), měřítko 100 µm
9.2
Skenovací elektronová mikroskopie (SEM)
Z předchozích kapitol je zřejmé, že světelná mikroskopie je vhodnou metodou pro okamžitou kontrolu buněk, je však omezená difrakčním limitem. Vyšší rozlišení i zvětšení buněčných subkomponent a nanočástic zajišťuje elektronová mikroskopie. Detailní zobrazení buněčné morfologie a jádra magneticky neznačených buněk viz obr. 9.5.
Obrázek 9.5: A) Morfologie mezenchymální kmenové buňky potkana; B) Detailní snímek buněčného jádra (černá šipka) se třemi jadérky (bílá šipka); SEM Hitachi SU6600
57
Stabilita vzorku závisí na chemické přípravě vzorku (fixaci, dehydrataci), na sušení, ale také na pokovení. Pozlacení povrchu buněk s adsorbovanými nanočásticemi však není vhodné, protože by došlo ke zkreslení výsledků. Nevodivý nepokovený vzorek je při vyšším urychlovacím napětí velmi nestabilní - elektrony se hromadí na povrchu vzorku a jejich signál přehltí detektor. Proto je v případě zobrazení buněk nejlepší zvolit vhodný povrch, na kterém se adherentní buňky zafixují.
9.2.1
Problematika zobrazení
Povrch pro buněčnou kultivaci a následnou přípravu vzorků musí být odolný proti fixačním chemikáliím, vodivý a současně netoxický pro buňky. Komerčně dostupné a běžně používané jsou polymerní podložky Thermanox, které mají povrch přizpůsobený k adhezi a růstu buněk. Thermanox je v SEM stabilní jen při nízkém urychlovacím napětí (do 2 kV), protože není vodivý. Jako matrix jsme proto zvolili jiný materiál, svými vlastnostmi vhodný pro SEM.
Obrázek 9.6: Porovnání stability povrchů Thermanox a FTO v SEM; a) Kontrast rMSCs fixovaných na Thermanoxu, urychlovací napětí 1 kV, b) Kontrast rMSCs fixovaných na FTO podložce, urychlovací napětí 1 kV, c) Zobrazení samotného Thermanoxu při 5 kV, značné nabíjení vzorku, D) Snímek stabilního FTO skla při 5 kV
58
Kvalitní zobrazení buněk v SEM nám zajistil povrch FTO od firmy Solaronix, standardně používaný pro jiné účely než biologické aplikace. FTO materiál se prokázal být odolný vůči chemikáliím potřebným k přípravě vzorku a jeho tepelná odolnost zamezila poškození povrchu při autoklávování. Adherované buňky fixované na FTO čirém skle vykazují nápadný kontrast (při urychlovacím napětí 1 - 15 kV), který dovoluje výbornou orientaci na vzorku (oceněné i při práci na AFM) a umožní tím zobrazení stejných míst pomocí více mikroskopických technik LM, SEM a AFM. Nevýhodou FTO sklíček je snad jen tvar, který není vhodný do jamek kruhového průřezu o průměru 15,5 mm. Na obrázku 9.6 je znázorněn nízký kontrast buněk na Thermanoxu a jeho deformace při urychlovacím napětí 5 kV. U vodivého FTO skla je jasně patrný vyšší kontrast buněk při 1 kV a stabilní topografický kontrast při 5 kV zobrazující hrubší strukturu povrchu, která zřejmě vyhovuje přilnavosti a růstu buněk. Využití FTO skla v jednotlivých mikroskopických technikách viz obr. 9.7.
59
Obrázek 9.7: Využití FTO skla pro různé mikroskopy: a) Fixovaná FeNV značená mezenchymální kmenová buňka (Světelný mikroskop, fázový kontrast, zvětšení 400), b) Detailní snímek Resovistem značené buňky: jádro (černá šipka) s jadérkem (bílá šipka); Počet jadérek v jádře, jejich velikost a morfologie není konstantní, závisí na metabolické aktivitě eukaryotické buňky. (SEM, zvětšení 2 200), c) AFM zobrazení imobilizovaných FeNV značených rMSCs na FTO sklu; bílé šipky znázorňují výskyt nanočástic na buněčném povrchu; skenovací rozsah 100 µm
60
9.3 9.3.1
Detekce nanočástic na povrchu buněčné membrány SEM
Zobrazení nanočástic na buněčné membráně dává první informace o tom, do jakých oblastí membrány si buňka nanočástice adsorbuje. Ze snímku 9.8 je patrné, že lokalizace nanočástic není v oblasti jádra a to znamená, že nanočástice do jádra neprostupují. Jedná se tedy o první známku (ne)toxicity nanočástic - výskyt nanočástic v jádře by způsobil poškození životně důležitých funkcí buňky. Přesný výskyt nanočástic lze potvrdit materiálovým kontrastem nebo prvkovou analýzou EDS. K tomuto zobrazení je nutné, aby byl vzorek dostatečně stabilní při použití vyššího napětí (15 kV) a zpětně odražených elektronů (BSE).
Obrázek 9.8: Výskyt FeNV nanočástic na povrchu buněk fixovaných na FTO sklu; a) Topografický kontrast - detekcí SE signálu při urychlovacím napětí 15 kV, nanočástice = bílé tečky; b) Materiálový kontrast stejné buňky - detekce BSE signálu, nanočástice = černé tečky; šipky na obou snímcích demonstrují oblast jádra; (SEM Hitachi SU6600 )
61
Výskyt nanočástic zobrazený sekundárními elektrony (SE) na obr. 9.8 a) byl potvrzen detekcí zpětně odražených elektronů (BSE), které dávají rozdílný signál v závislosti na typu materiálu - světleji se jeví místa obsahující prvky s vyšším atomovým číslem a tmavé jsou oblasti s lehkými prvky. Nanočástice na obr. 9.8 b) jsou zobrazeny černě, protože atomové číslo železa je nižší než cínu, ze kterého je vrstva na povrchu FTO skla. Výskyt FeNV nanočástic v prenukleární oblasti byl potvrzen prvkovou analýzou EDS (viz obr. 9.9).
Obrázek 9.9: Spektroskopická analýza EDS; Nu - oblast jádra, oranžový bod 1 - místo EDS měření, bílá šipka - výskyt nanočástic FeNV; Spektrum EDS potvrzuje kromě prvků, ze kterých je složená buňka (C, O, Si, P), i výskyt cínu a železa. Pozn.: měření bylo provedeno i mimo oblast nanočástic a prokazatelné stopy železa se zde nevyskytovaly
9.3.2
AFM
Mikroskopie atomárních sil představuje další mikroskopickou techniku pro zobrazení povrchu vzorku. K tvorbě obrazu nevyužívá urychlených elektronů jako SEM, ale mapuje rozložení atomárních sil na povrchu vzorku [131]. Interakce sondy s povrchem probíhá skrz hrot umístěný na konci pružného nosníku (raménka - kantilevru), jehož poloměr udává nanometrové rozlišení. Na část kantilevru s hrotem svítí laserová dioda, která se od něho odráží na fotodetektor. Topografický obraz tedy vzniká rozdílným ohybem skenujícího ramínka, který se projeví jako změna polohy laserového paprsku na detekční fotodiodě [132]. Při zobrazování buněčných struktur byl použit poklepový mód mikroskopu, který je doporučen pro zobrazování biologických vzorů. V tomto módu osciluje raménko nad
62
Obrázek 9.10: Schéma mikroskopu atomárních sil [133] povrchem vzorku a v pravidelných krocích se zkoumaného povrchu dotkne. Povrch je mapován na základě detekce změn rezonanční frekvence kantilevru [131] [132]. Výhodou AFM je možnost zobrazení nativních (tzn. nefixovaných) biologických vzorků. Zobrazování adherentních buněk v růstovém médiu je však velmi náročné. Je také nutné mít mikroskop vybaven kapalinovou celou s regulací teploty a přívodem CO2 . Na hrot ponořený do kapaliny se přenášejí vibrace a tzv. ladění laseru trvá delší dobu než při zobrazování za sucha, jelikož dochází k násobným odrazům laserové stopy v kapalině. Při časově ˙ CO2 ) by dochánáročném skenování vzorku bez stálých kultivačních podmínek (37 ◦ C, 5% zelo k deadheraci buněk a následné kontaminaci hrotu buněčnou hmotou. Pro zobrazení nanočástic na povrchu buněčné membrány byly mezenchymální kmenové buňky fixovány glutaraldehydem na podložku Thermanox a na FTO sklo (podle protokolu přípravy vzorků pro SEM, viz 8. Jelikož vzorek pro AFM nemusí být vodivý, pracovalo se i s buňkami narostlými na Thermanoxu, FTO sklo ale umožňovalo snazší orientaci na vzorku při použití pomocného optického mikroskopu, protože jsou na něm buňky kontrastnější. Barva AFM snímku neodpovídá skutečné barvě vzorku, světlejší místa jsou způsobené vyšším ohybem katilevru - tzn. větším signálem.
63
Obrázek 9.11: a) AFM snímek FeNV rMSCs na Thermanoxu; skenovací rozsah 100 µm; černá šipka demonstruje nanočástice na povrchu buňky, bílá šipka nanočástice inkorporované v buňce, b) Detail AFM snímku a); skenovací rozsah 35 µm; černá šipka - nanočástice na povrchu buňky, bílá šipka nanočástice inkorporované v buňce
9.4 9.4.1
Detekce nanočástic uvnitř buněk Světelná mikroskopie
FeNV nanočástice v médiu postupně klesají ke dnu kultivační jamky, kde vytvářejí shluky. Nespecifická adsorpce shluků na buněčnou membránu pravděpodobně indukuje endocytózu. Výskyt nanočástic v intracelulárním prostředí je prokazatelný po 48 hod inkubace. Obarvením vzorku pruskou modří se od sebe lépe odliší nanočástice uvnitř buněk od nanočástic zbylých v médiu. Je to rychlá a přehledná metoda, která poskytuje informaci o efektivnosti značení nanočástic (viz obr. 9.12).
64
Obrázek 9.12: Nanočástice obarvené pruskou modří; modré šipky ukazují nanočástice uvnitř buněk, bílé šipky ukazují nanočástice v médiu; jádra jsou zbarvená červeně; zvětšení 200,Olympus IX 70
Obrázek 9.13: Polotenký řez FeNV značených rMSCs, koncentrace nanočástic 25 µg Fe / ml; černé šipky ukazují nanočástice, bílé šipky jádro a červené šipky jadérka; Olympus IX 70, imerzní olej, zvětšení 1000, velikost měřítka 20 µm Dalším způsobem, jakým se dají internalizované nanočástice prokázat a určit přesně lokalizaci nanočástic v buněčných subkomponentách je TEM mikroskopie. Vzorek buněk se však musí pečlivě připravit, zalít do pryskyřice (viz příprava vzorků pro TEM v kap. 8.4) a ultramikrotomem nakrájet na tenké řezy 1 . Na obr. 9.13 jsou zobrazeny polotenké řezy obarvené toluidinovou modří. Ze snímků je patrné, že nanočástice se vyskytují v in1
polotenké řezy 0,5 - 2 µm, ultratenké řezy (60 - 80 nm)
65
tracelulárním prostředí. Ke sledování přesné lokalizace nanočástic v cytoplazmě je nutné nakrájet vzorek na ultratenké řezy a zobrazit ho v TEM. Posledním důkazem výskytu nanočástic uvnitř buněk a zároveň zachycení buněčného cyklu během procesu internalizace nanočástic bylo pozorování buněk přímým 96 hod monitoringem pomocí time - lapse mikroskopu Bio Station (Nikon). Videa zachytila nejen pohyb nanočástic během adsorpce na buněčnou membránu, ale i dělení buněk s nanočásticemi - buňky si nanočástice předávaly společně s cytoplazmou. Dělení magneticky značených buněk bylo zachyceno i běžným inverzním mikroskopem (viz obr. 9.14 a 9.15).
Obrázek 9.14: Nanočástice v dělící se buňce (profáze); zvětšení 400, Nikon Eclipse TS 100 Buňka se rozmnožuje komplexním sledem jednotlivých fází, ve kterých nejprve zdvojí svůj obsah a pak se dělí na dvě dceřiné buňky. Tento cyklus duplikace a dělení, známý jako buněčný cyklus, je základním mechanismem, při kterém se dělí jádra (karyokineze) a následně i cytoplazma (cytokineze). Celý buněčný cyklus je rozdělen na různé fáze, ve kterých probíhají procesy jako je replikace DNA, růst buňky, duplikace organel, syntéza bílkovin a další děje, které zde nebudou zmiňovány [111]. Na snímku 9.14 je znázorněn počátek mitózy (profáze) a na obrázku 9.15 je znázorněna konec cytokineze. Během buněčného cyklu mitózu (karyokinezi a cytokinezi) střídá interfáze, ve které dochází k duplikaci organel [111] a pravděpodobně i k reorganizaci endo/lyzosomů s nanočásticemi. Jelikož je počáteční adsorpce nanočástic na membránu nerovnoměrná, stejně bude nepravidelná i jejich internalizace dovnitř buněk. Buněčná populace je heterogenní, tzn. že se liší velikostí, rychlostí metabolismu a délkou trvání mitóz. Kvalita značení buněk
66
Obrázek 9.15: Nanočástice rozdělené do dceřiných buněk; zvětšení 400, Nikon Eclipse TS 100, schématický obrázek převzat z [134] je tedy různá a rozdělení do dceřiných buněk je asymetrické [135], což je v rozporu s tvrzením ve článku [58] (viz kap. 3.2 Dělení buněk s nanočásticemi v rešeršní části).
Obrázek 9.16: Asymetrické rozdělení endo / lyzosomů s nanočásticemi do dceřiných buněk [135]
9.4.2
SEM
Voda představuje 70 % hmotnosti buňky a většina reakcí uvnitř buňky se odehrává ve vodném prostředí [111]. Dehydratací a sušením vzorku popraská membrána v okolí endosomů plných nanočástic, které vystoupí na povrch. Je tedy možné zobrazit nanočástice v endosomech i skenovací elektronovou mikroskopií a to přináší především jednu velkou výhodu - odpadá časově i laboratorně náročná příprava vzorku pro TEM. Mohla by být kladena otázka, jak v SEM odlišíme nanočástice, které se opravdu vyskytují na buněčné
67
membráně od nanočástic vystupujících na povrch následkem dehydratace vzorku. Rozdíl je znatelný na detailním snímku 9.17, kde jsou zobrazeny shluky nanočástic zanořené v síti pozůstalého dehydratovaného cytoskeletu.
Obrázek 9.17: Detailní snímek lyzosomů s nanočásticemi (bílé šipky); endo / lyzosomy jsou membránové organely, červené šipky demonstrují zbylou část těchto membrán a pozůstalého cytoskeletu (vzájemně nerozlišitelné); zvětšení 12 000, FESEM JEOL 7401F
Obrázek 9.18: Buňka nasycená nanočásticemi; šipky ukazují endo / lyzosomy s nanočásticemi, N = jádro; zvětšení 3 300; materiálový kontrast YAG detektorem, FESEM JEOL 7401F
68
U zobrazování biologických vzorků je záměrem mikroskopie dodávat do studovaného objektu minimum energie a zabránit jeho radiačnímu poškození [136]. Vhodný matrix (FTO sklo) v kombinaci se skenovacím elektronovým mikroskopem s autoemisní tryskou (FESEM), který má i při nízkém napětí vysoké rozlišení, se staly vhodnou metodou k získání potřebných informací, aniž by byl narušen tvar buněk. Jak již bylo zmíněno výše, FTO sklo zajišťuje stabilitu vzorku pod svazkem urychlených elektronů a je možné potvrdit lokalizaci nanočástic i materiálovým kontrastem nebo prvkovou analýzou EDS pod dostatečným urychlovacím napětím. Na obr. 9.18 je materiálový kontrast zobrazen YAG detektorem zpětně odražených elektronů, ze kterého je znatelný četný výskyt lyzosomů s nanočásticemi v celé buňce. Při větším zvětšení krajních oblastí adherovaných membrán byl zachycen i počátek inkorporace nanočástic do buňky a primární endosomy s nanočásticemi (obr. 9.19 a)). Z obrázku 9.19 b) je znatelné, že nanočástice jsou do buněk inkorporované v různém množství - endosomy se liší velikostí - velký endosom je několika násobně větší než ostatní primární endosomy v jeho okolí.
Obrázek 9.19: a) invaginace nanočástic plazmatickou membránou - počátek endocytózy, zvětšení 5 500, b) primární endosomy s nanočásticemi (šipky), černé šipky demonstrují hrubost podložky, zvětšení 12 000, FESEM JEOL 7401F
69
Skenovacím elektronovým mikroskopem s autoemisní tryskou lze tedy mapovat výskyt nanočástic uvnitř buněk i bez speciálních postupů na odhalení vnitřních ultrastruktur, např. mrazového lámání. Buňky jsou adherované na stejném povrchu, na kterém jsou i zafixované a vložené do mikroskopu. Dehydratací a sušením vzorku dojde k dostatečnému prostoupení nanočástic na povrch a ty se pak stanou snadno detekovatelnými. Jedná se tedy o velmi šetrný způsob (buňky nejsou vystaveny několikanásobné centrifugaci jako při přípravě vzorku pro TEM), jakým zachytit přirozený „uptake“ nanočástic do buněk. Výsledky z této metody jsou překvapivě srovnatelné se snímky tenkých řezů buněk náročně připravených na TEM (TEM snímky převzaty z [29]), (viz obr. 9.20).
70
Obrázek 9.20: Srovnání snímků z TEM [29] se snímky z FESEM JEOL 7401F ; Bílé šipky ukazují výskyt endo / lyzosomů s nanočásticemi; N = jádro, n = jadérko, m = mitochondrie; měřítka u TEM: 1A) 10 µm, 1B) a 1C) 5 µm
71
10. Výsledky - Proliferace a viabilita magneticky značených buněk 10.1
Stanovení proliferace a viability naznačených buněk
V rámci in vitro studie byly studovány základní charakteristiky buněk po označení nanočásticemi jako je viabilita a proliferace. Do média adherovaných buněk byl přidán roztok různých typů nanočástic (FeNV, Resovist a Mag) o koncentraci 50 µg Fe ·ml−1 . Při sledování proliferace značených buněk se tato koncentrace u Mag nanočástic jevila jako nevhodná. Byl prokázán vliv nadměrné dávky Fe na jejich proliferaci (viz obr. 10.1). Proliferace FeNV značených rMSCs (FeNV - rMSCs) byla podobná hodnotám kontroly a buňky nevykazovaly žádné morfologické změny ani při dlouhodobém pozorování. Proliferace Resovist - rMSCs byla oproti FeNV - rMSCs a kontrolním buňkám pomalejší a tvar buněk se postupně „krabatil“. Výrazné změny proliferace ovšem nastaly u Mag nanočástic. Nárůst buněk prudce vzrostl hned po inkubaci s nanočásticemi (viz graf na obr. 10.1, kategorie 0 H), další prudký nárůst nastal 48 hod po výměně média (viz graf na obr. 16.1, kategorie 48 H), kde počet naznačených buněk přerostl kontrolní (neznačené) buňky. Srovnatelný počet buněk kategorie 0 H a 24 H byl způsoben výměnou média, při které byly odpipetovány i deadherované buňky - mrtvé buňky. Dělení Mag - rMSCs sice probíhalo rychleji než u FeNV - rMSCs a Resovist - rMSCs, ale následkem velké a rychlé inkorporace Mag nanočástic nastala u určitého množsví buněčná smrt. Při přímém monitoringu buněk (viz obr. 10.2) v time - lapse mikroskopu Bio Station byly Mag nanočástice (o koncentraci 25 µg Fe ·ml−1) smíchané se suspenzí buněk a sledovala se jejich schopnost adherace v přítomnosti nanočástic. Buňky vystavené těmto nanočásticím s polymerním povrchem se neadherovaly a nastala okamžitá patologie buněk (do čtvrt minuty). Pokus byl prováděn paralelně ve třech zorných polích. Přesná toxická dávka Mag nanočástic byla stanovená MTT testem, IC 50 nastalo již při koncentraci 0,0097 µg Fe ·ml−1) .
72
Obrázek 10.1: Porovnání proliferace značených rMSCs; použitá koncentrace všech typů nanočástic je 50 µg Fe ·ml−1)
Obrázek 10.2: Zobrazení patologie buněk; bílé šipky ukazují na nekrotické buňky, černé šipky zobrazují tzv. „blebbing“ plazmatické membrány (následek rozkladu cytoskeletu) většinou charakteristický příznak apoptózy (programované smrti buňky) [137]; objektiv 20, Bio Station (Nikon) Experimenty nasvědčují, že Mag nanočástice jsou pro značení rMSCs a buněčnou terapii nevhodné, proto jim bude dále věnována jen malá část. Větší pozornost bude zaměřena na FeNV - rMSCs, protože v testech nevykazovaly žádné extrémní změny.
73
10.1.1
FeNV-rMSCs
Magnetické nanočástice, vhodné pro značení buněčných kultur, které mohou být následně použity in vivo v regenerativní medicíně, musí splňovat především dvě hlavní podmínky. Musí být biokompatibilní a současně vykazovat signifikantní kontrast v magnetické rezonanci. Dnešní studie se zabývají syntézami a testováním stále nových typů nanočástic, které by splňovaly nároky pro komerční využití. Většina SPIO nanočástic nese na svém povrchu biokompatibilní obal (např. polyethylenglykolový - Mag nanočástice nebo karboxydextranový - Resovist), který je netoxický, chrání magnetické jádro před degradací v biologickém prostředí a zároveň zajišťuje stabilitu a koloidní charakter nanočástic.
Obrázek 10.3: Porovnání Mag PLA - PEG značených rMSCs (a) a FeNV značených rMSCs (b); na snímku a) je vidět, že některé buňky jsou adherované a jiné jsou zakulacené následkem uptaku Mag nanočástic; na snímku b) jsou všechny buňky bez známek morfologických změn a FeNV nanočástice jsou ukázkově soustředěny kolem jader; zvětšení 400, velikost měřítka 50 µm, Olympus IX 70 FeNV nanočástice mají na svém povrchu přítomné pouze OH - skupiny a přesto nevykazují negativní vliv na adhezi, proliferaci, ani na viabilitu mezenchymálních kmenových buněk (viz testy níže). Pomocí světelného mikroskopu byly porovnány morfologické změny buněk vyvolané Mag PLA - PEG a FeNV nanočásticemi. Ze snímků je znatelné, že FeNV nanočástice buněčný tvar nedeformují a pro jejich výraznou barvu je zřetelná i lokalizace nanočástic uvnitř buněk (viz obr. 10.3). FeNV nanočástice jsou velmi kontrastní i při detekci magnetickou rezonancí (viz kap. 11.1), kde byl jejich negativní kontrast porovnán s Resovistem.
74
Testy proliferace byly prováděny s paralelním opakováním (5 testů proliferace u značených buněk, 5 testů proliferace u kontrolních buněk). Počet buněk se počítal z 20 zorných polí z každé kultivační jamky a následně byl stanoven počet buněk na cm2 . Na obr. 10.4 je uveden graf z průměrných hodnot opakovaných testů (grafy jednotlivých testů viz příloha). Z vyhodnocených dat je patrný lineární nárůst FeNV - rMSCs. Pokles počtu kontrolních buněk (viz kategorie 48 H) byl způsoben deadherací přerostlých buněk a jejich odstraněním při výměně média. Počáteční hodnota buněk na cm2 byla počítána Bürkerovou komůrkou (tzn. pouze jednou), proto kategorie „Začátek inkubace s NČ“ nemá uvedenou chybovou úsečku.
Obrázek 10.4: Graf změny proliferace FeNV - rMSCs ve srovnání s kontrolními rMSCs Viabilita buněk označených FeNV nanočásticemi byla stanovena průtokovou cytometrií, která umožňuje simultánní, multiparametrickou analýzu fyzikálně - chemických vlastností. Roztok fluorescenčně značených buněk byl nasáván z nádoby vzorku do kapilár, kterými buňky prochází jednotlivě. Po ozáření paprskem došlo k excitaci fluorescenční značky (propidium iodidu navázaném na buňkách) a k následné emisi záření, které bylo zachycováno detektory. Podle fluorescenční aktivity jednotlivých buněk přístroj stanovil procentuální hodnoty viability a současně i celkový počet buněk, který analyzoval [138]. Průtokovým cytometrem byla stanovena viabilita těchto vzorků: kontrolních rMSCs, Resovist - rMSCs a FeNV - rMSCs. Od každého typu vzorku byla provedena tři měření, ze kterých jsou v grafu porovnané průměrné hodnoty. Viabilita magneticky značených buněk je srovnatelná s buňkami kontrolními, přestože
75
Obrázek 10.5: Graf viability magneticky značených buněk v porovnání s viabilitou buněk kontrolních procentuální hodnota viability kontrolních buněk je nižší (hodnoty jsou srovnatelné v rámci směrodatných odchylek). FeNV nanočástice o koncentraci 50 µ g Fe ·ml−1) tedy nepůsobí na mezenchymální kmenové buňky toxicky i přesto, že na svém povrchu nemají žádnou funkcionalizační vrstvu jako Resovist.
76
11. Výsledky - Magnetická rezonance 11.1
MRI měření negativního kontrastu nanočástic
Kmenové buňky značené magnetickými nanočásticemi se studují za účelem jejich využití v regenerativní medicíně. Po transplantaci magneticky značených buněk (intravenózně nebo přímo do postižené oblasti) do těla pacienta se monitoruje pohyb jejich působení pomocí neinvazivní magnetické rezonance. Mezenchymální kmenové buňky značené nanočásticemi jsou nadějí pro cílenou regeneraci tkání - např. diabetických noh nebo srdeční tkáně po infarktu myokardu, protože umožňují diagnostikovat působení a výskyt kmenových buněk na základě rozdílné intenzity signálu mezi označenými buňkami a daným orgánem či tkání. Negativní kontrastní efekt námi vybraných SPIO nanočástic byl porovnán magnetickou rezonancí v nemocnici v Prostějově. Fantomy obsahující nanočástice FeNV a Resovistu o stejných koncentracích (koncentrační řada 10, 20,30, 40 a 80 µl F e2 O3 · ml −1 ) byly rozsuspendovány ve 2 % agaru. Poté se měřil jejich negativní signál (stupeň šedi) v T2 vážených sekvencích v magnetickém poli 1,5 T (GE Signa HORIZON Lx), obrázek 11.1.
Obrázek 11.1: Koncentrační řada samotných nanočástic FeNV a Resovistu Na obrázku 11.2 je šipkou znázorněn vyšší kontrastní efekt (více hypointenzní signál) u FeNV značených buněk ve srovnání se stejným počtem buněk značených Resovistem
77
o stejné koncentraci. Negativní signál samotných nanočástic je porovnáván na obrázku 11.1, kde horní snímek zachycuje fantomy obsahující koncentrační řadu nanočástic v agaru. Dolní snímek ukazuje srovnání koncentračních řad mezi Resovistem a FeNV. Pouze u koncentrace 10 µg · ml −1 je Resovist více kontrastní, se zvyšující se koncentrací je intenzita negativního signálu srovnatelná. Je třeba poukázat na fakt, že i když je kontrastní efekt samotných nanočástic FeNV a Resovistu srovnatelný, do buněk se při inkubaci lépe a více inkorporují nanočástice FeNV, což vede k vyššímu kontrastnímu efektu a tedy k lepší identifikaci značených buněk in vivo (viz obr. 11.2).
Obrázek 11.2: Kontrast nanočástic v buňkách: FeNV nanočástice (vlevo), Resovistu (vpravo)
78
Závěr
Mezenchymální kmenové buňky značené SPIO nanočásticemi jsou nadějí pro cílenou regeneraci tkání - např. diabetických noh a srdeční tkáně po infarktu myokardu, protože lze magnetickou rezonancí detekovat výskyt nově implantovaných buněk. Avšak nanočástice mohou být pro buňky toxické a vyvolat řadu fyziologických a morfologických změn. Naše in vitro studie se soustředila na vliv SPIO nanočástic s různým povrchem (funkcionalizující slupkou) na chování (proliferaci a viabilitu) mezenchymálních kmenových buněk. Byly porovnávány dva nové typy superparamagnetických nanočástic maghemitu (FeNV a Mag) s komerčním kontrastním činidlem Resovist, který byl z finančních důvodů v roce 2010 stažen z trhu. Podle provedených testů nejsou Mag PLA-PEG nanočástice vhodné pro značení mezenchymálních kmenových buněk potkana i přesto, že mají na svém povrchu biokompatibilní obal. FeNV nanočástice (o koncentraci 50 µg Fe · ml −1 ) u buněk nevyvolaly toxické účinky ani morfologické změny (viz světelná a elektronová mikroskopie) a navíc kontrastní efekt Resovistu i FeNV byl na MRI srovnatelný. Rozdíl v negativním kontrastu nastal u nanočástic inkorporovaných v buňkách, kde byly FeNV značené buňky kontrastnější. Syntéza FeNV nanočástic je rychlá a levná, což je předpokladem pro komerční využití těchto nanočástic v bioaplikacích např. jako kontrastní látky v MRI. Změny morfologie magneticky značených buněk a výskyt nanočástic v/na buňkách byly zobrazovány různými mikroskopickými technikami (světelnou a fluorescenční mikroskopií, elektronovou mikroskopií a mikroskopií atomárních sil). Čím lépe buněčné struktury zobrazíme, tím lépe porozumíme jejich biologickým reakcím na nanomateriály, proto je důležité optimalizovat přípravu vzorků pro mikroskopické techniky. FTO sklo s vrstvou cínu se ukázalo být jako velice vhodná matrix pro kultivaci buněk určených ke sledování skenovací elektronovou mikroskopií. Při detailním zobrazení magneticky značených buněk skenovacím elektronovým mikroskopem s autoemisní tryskou jsme dosáhly výsledků srovnatelných se snímky pořízených z TEM. Nejen, že byly na snímcích inkorporované nanočástice v endo/lyzosomech jasně znatelné, ale byl zachycen i počátek invaginace nanočástic
79
plazmatickou membránou do intracelulárního prostředí. Díky stabilitě vzorku pod elektronovým svazkem byly zobrazené nanočástice i materiálově prokazatelné. Světelnou mikroskopií a time - lapse mikroskopií bylo zachyceno předávání FeNV nanočástic během dělení buněk, což přispívá k dalšímu potvrzení toho, že magneticky značené mezenchymální kmenové buňky mají fyziologické chování jako buňky neznačené. Výskyt nanočástic uvnitř buněk byl stanoven zobrazením polotenkých řezů vzorku prosyceného pryskyřicí. V následných vědeckých letech bych chtěla aplikovat poznatky z našich in vitro studií na zvířecí modely a pokračovat ve studiu interakcí buněčných kultur s novými hybridními nanosystémy. Dále bych se chtěla zaměřit i na mechanismus uptaku nanočástic do buněk, protože tato problematika je stále málo probádaná.
80
Literatura
[1] Zheng Wang, Jing Ruan, and Daxiang Cui. Advances and prospect of nanotechnology in stem cells. Nanoscale research letters, 4(7):593–605, January 2009. [2] Jennifer M Ryan, Frank P Barry, J Mary Murphy, and Bernard P Mahon. Mesenchymal stem cells avoid allogeneic rejection. Journal of inflammation (London, England), 2:8, July 2005. [3] Marc S. Penn. Stem Cells and Myocardial. Humana Press, Totowa, New Jersey, 2007. [4] Yun Seob Song and Ja Hyeon Ku. Monitoring Transplanted Human Mesenchymal Stem Cells in Rat and Rabbit Bladders Using Molecular Magnetic Resonance Imaging. Neurourology and Urodynamics, 593(August 2006):584–593, 2007. [5] Jun-ichiro Jo, Ichio Aoki, and Yasuhiko Tabata. Design of iron oxide nanoparticles with different sizes and surface charges for simple and efficient labeling of mesenchymal stem cells. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 142(3):465–73, March 2010. [6] Chang Kyu Sung, Kyung Ah Hong, Shunmei Lin, Yuwon Lee, Jinmyung Cha, JinKyu Lee, Cheol Pyo Hong, Bong Soo Han, Sung Il Jung, Seung Hyup Kim, and Kang Sup Yoon. Dual-modal nanoprobes for imaging of mesenchymal stem cell transplant by MRI and fluorescence imaging. Korean journal of radiology : official journal of the Korean Radiological Society, 10(6):613–22, 2009. [7] Zhe Liu, Fabian Kiessling, and Jessica Gätjens. Advanced Nanomaterials in Multimodal Imaging: Design, Functionalization, and Biomedical Applications. Journal of Nanomaterials, 2010:1–15, 2010. [8] Katerina Kluchova, Radek Zboril, Jiri Tucek, Michaela Pecova, Ludmila Zajoncova, Ivo Safarik, Miroslav Mashlan, Ingrid Markova, Dalibor Jancik, Marek Sebela, Helena Bartonkova, Vassiliki Bellesi, Pavel Novak, and Dimitris Petridis. Superparam-
81
agnetic maghemite nanoparticles from solid-state synthesis - their functionalization towards peroral MRI contrast agent and magnetic carrier for trypsin immobilization. Biomaterials, 30(15):2855–63, May 2009. [9] Yves Gossuin, Pierre Gillis, Aline Hocq, Quoc L Vuong, and Alain Roch. Magnetic resonance relaxation properties of superparamagnetic particles. Molecular Imaging, 2009. [10] Sarah Staniland, Bruce Ward, Andrew Harrison, Gerrit van der Laan, and Neil Telling. Rapid magnetosome formation shown by real-time x-ray magnetic circular dichroism. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(49):19524–8, December 2007. [11] Adrian R Muxworthy and Wyn Williams. Critical superparamagnetic/single-domain grain sizes in interacting magnetite particles: implications for magnetosome crystals. Journal of the Royal Society, Interface / the Royal Society, 6(41):1207–12, December 2009. [12] J. Tucek.
Magnetismus nanocastic oxidu zeleza a dvojneho perovskitu typu
Sr2FeRuO6. PhD thesis, Univerzita Palackeho v Olomouci, 2008. [13] T. J. Bastow and A. Trinchi. NMR analysis of ferromagnets: Fe oxides. Solid state nuclear magnetic resonance, 35(1):25–31, February 2009. [14] http://www.tf.uni-kiel.de/matwis/amat/def_en/kap_2/basics/b2_1_6.html. [15] Veronika Sedenková and Jiri Tucek. Spinove vychyleni u nanocastic γ-Fe2O3 a jeho studium pomoci Mossbauerovy spektroskopie ve vnejsim magnetickem poli. Univerzita Palackého v Olomouci, page 71, 2011. [16] http://fr.academic.ru/dic.nsf/frwiki/1576803. [17] S. Chikazumi. Physics of Ferromagnetism. Oxford University Press, Oxford, 2009. [18] Nguyen T. K. Thanh. Magnetic nanoparticles from fabrication to clinical applications. Taylor & Francis Group, 2012.
82
[19] Radovan Herchel, Jiri Tucek, and Zdenek Travnicek.
Stridava susceptibilita a
vysokoteplotni magneticka mereni a jejich vyuziti v chemii a fyzice. Učební text v rámci projektu FRVŠ 1623/2009, 2009. [20] S. Bhagwat, R. Thamankar, and F.O. Schumann. Evidence for superparamagnetism in ultrathin Fe and FexMn1 x films on Cu(100). Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 290-291:216–218, April 2005. [21] M. Mahmoudi, A. Simchi, A. S. Milani, and P. Stroeve. Cell toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Journal of colloid and interface science, 336(2):510–8, August 2009. [22] Michal Babic, Daniel Horak, Miroslava Trchova, Pavla Jendelova, Katerina Glogarova, Petr Lesna, Vit Herynek, Milan Hajek, and Eva Sykova. Poly(L-lysine)modified iron oxide nanoparticles for stem cell labeling. Bioconjugate chemistry, 19(3):740–50, March 2008. [23] Maria Mikhaylova, Do Kyung Kim, Natalia Bobrysheva, Mikhail Osmolowsky, Valentin Semenov, Thomas Tsakalakos, and Mamoun Muhammed. Superparamagnetism of magnetite nanoparticles: dependence on surface modification. Langmuir : the ACS journal of surfaces and colloids, 20(6):2472–7, March 2004. [24] J. Tucek. Uvod do magnetismu, magneticke vlastnosti materialu a magneticke jevy. In Nanosystemy - Workshop, 2010. [25] S. Rudershausen, C. Grüttner, M. Frank, J. Teller, and F. Westphal. Multifunctional superparamagnetic nanoparticles for life science applications. European Cells and Materials, 3:81–83, 2002. [26] Michaela Pecova. Imobilizace trypsinu na magneticke nanocastice a dalsi vyuziti v proteomice. PhD thesis, Univerzita Palackeho v Olomouci, 2008. [27] Jeff W. M. Bulte and Dara L. Kraitchman. Iron oxide MR contrast agents for molecular and cellular imaging. NMR in biomedicine, 17(7):484–99, November 2004.
83
[28] S. M. Moghimi, A. C. Hunter, and J. C. Murray. Long-circulating and targetspecific nanoparticles: theory to practice. Pharmacological reviews, 53(2):283–318, June 2001. [29] Daniel Horak, Michal Babic, Pavla Jendelova, Vít Herynek, Miroslava Trchová, Katarina Likavcanová, Miroslava Kapcalová, Milan Hajek, and Eva Sykova. Effect of different magnetic nanoparticle coatings on the efficiency of stem cell labeling. Journal of Magnetism and Magnetic Materials, 321:1539–1547, 2009. [30] P. Caliceti, O. Schiavon, A. Mocali, and F. M. Verenose.
Evaluation of
monomethoxypolyethyleneglycol derivatized superoxide dismutase in blood and evidence for its binding to blood cells. Farmaco., 44(7-8):711–720, 1989. [31] R. Arshady and M. Monshipouri. Targeted delivery of microparticulate carriers. Microspheres, Microcapsules & Liposomes, 1999. [32] Seppo Santavirta, Yrjö T. Konttinen, Tomoyuki Saito, Mats Grönblad, ESA Partio, Pertti Kemppinen, and Pentti Rokkanen. Immune response to polyglycolic acid implants. The Journal of Bone and Joint Surgery, 72(4):597–600, 1990. [33] I. Safarik and M. Safariková. Magnetic nanoparticles for in vitro biological and medical applications an overview. In Nguyen T. K. Thanh, editor, Magnetic nanoparticles from fabrication to clinical applications, pages 215–236. Taylor & Francis Group, 2012. [34] Stacey M. C. Berman, Piotr Walczak, and Jeff W. M. Bulte. Tracking stem cells using magnetic nanoparticles. Wiley interdisciplinary reviews. Nanomedicine and nanobiotechnology, 3(4):343–55, 2011. [35] P. C. Lauterbu. Image formation by induced local interactions - examples employingnuclear magnetic - resonance. Nature, 242:190 – 191, 1973. [36] M. T. Vlaardingerbroek and J. A. Boer. Magnetic resonance imaging: Therory and practice, 3 rd ed. 2005.
84
[37] Aneta Mala and Zenon Starcuk. Dynamické MR zobrazovani na zaklade kontrastu T1. Masarykova Univerzita v Brne, page 90, 2011. [38] Jiachao Liang. Dynamic contrast enhanced magnetic resonance imaging at high and ultra-high fields. Biomedical Engineering, page 88, 2008. [39] D. D. Stark, R. Weissleder, G. Elizondo, P. F. Hahn, S. Saini, L. E. Todd, J. Wittenberg, and J. T. Ferrucci. Superparamagnetic iron oxide: clinical application as a contrast agent for MR imaging of the liver. Radiology, 168:297–301, 1988. [40] Ralph Weissleder. Liver MR imaging with iron oxides: toward consensus and clinical practice. Radiology, 193:593–595, 1994. [41] M. Vokurka and J. Hugo. Velký lekarsky slovnik. MAXDORF, 2006. [42] Mukesh G. Harisinghani, Jelle Barentsz, Peter F. Hahn, Willem M. Deserno, Shahin Tabatabaei, and Ralph Weissleder.
Noninvasive Detection of Clinically Occult
Lymph-Node Metastases in Prostate Cancer. New Engl. J. Med., 348:2491–2499, 2003. [43] R. Weissleder, G. Elizondo, J. Wittenberg, A. S. Lee, L. Josephson, and T. J. Brady. Ultrasmall superparamagnetic iron oxide: an intravenous contrast agent for assessing lymph nodes with MR imaging. Radiology, 175(2):494–498, 1990. [44] R. Weissleder, J. F. Heautot, B. K. Schaffer, N. Nossiff, M. I. Papisov, J. Bogdanov, A., and T. J. Brady. MR lymphography: study of a high-efficiency lymphotrophic agent. Radiology, 191:225–230, 1994. [45] www.mr-tip.com. [46] Daniel L. J. Thorek, Antony K. Chen, Julie Czupryna, and Andrew Tsourkas. Superparamagnetic iron oxide nanoparticle probes for molecular imaging. Annals of biomedical engineering, 34(1):23–38, January 2006. [47] Lisa Kostura, Dara L. Kraitchman, Alastair M. Mackay, Mark F. Pittenger, and Jeff W. M. Bulte. Feridex labeling of mesenchymal stem cells inhibits chondrogenesis
85
but not adipogenesis or osteogenesis. NMR in biomedicine, 17(7):513–7, November 2004. [48] Renate Hammerstingl, Wolfram Schwarz, and Thomas Vogl. Resovist Summary. Schering AG Germany, 2012. [49] Shingo Matsumoto, Fuminori Hyodo, Sankaran Subramanian, Nallathamby Devasahayam, Jeeva Munasinghe, Emi Hyodo, Chandramouli Gadisetti, John A Cook, James B Mitchell, and Murali C Krishna. Low-field paramagnetic resonance imaging of tumor oxygenation and glycolytic activity in mice. The Journal of Clinical Investigation, 118(5):1965–1973, 2008. [50] Gary S. Feigenbaum, Louis Lemberg, and Joshua M. Hare. Tracking cell fate with noninvasive imaging. Journal of the American College of Cardiology, 54(17):1627–8, October 2009. [51] Dennis E. Vaccaro, Meiheng Yang, James S. Weinberg, Christopher P. Reinhardt, and Ernest V. Groman. Cell tracking using nanoparticles. Journal of cardiovascular translational research, 1(3):217–20, September 2008. [52] N. Sternberg, K. Andreas, H. Bäumler, and R. Georgieva. Blood cells as carriers for magnetically targeted delivery of drugs. In Magnetic nanoparticles from fabrication to clinical applications, pages 387–408. 2012. [53] U. Zimmermann. Cellular drug-carrier systems and their possible targeting. John Wiley & Sons, New York, 1983. [54] O. Necas. Obecna biologie pro lelarske fakulty, 2000. [55] Wendelin J. Stark. Nanoparticles in biological systems. Angewandte Chemie Int. Ed., 50(6):1242–58, February 2011. [56] Weisheng Lin, Yue W. Huang, Xiao D. Zhou, and Yinfa Ma. In vitro toxicity of silica nanoparticles in human lung cancer cells. Toxicology and applied pharmacology, 217(3):252–9, December 2006.
86
[57] Gwyn W. Gould and Jennifer Lippincott Schwartz. New roles for endosomes: from vesicular carriers to multi-purpose platforms. Nature reviews. Molecular cell biology, 10(4):287–92, April 2009. [58] C. Wilhelm and F. Gazeau. Universal cell labelling with anionic magnetic nanoparticles. Biomaterials, 29(22):3161–74, August 2008. [59] http://www.biology_online.org. [60] J. S. Kim, T. J. Yoon, K. N. Yu, M. S. Noh, M. Woo, B. G. Kim, K. H. Lee, B. H. Sohn, S. B. Park, J. K. Lee, and H. Cho M. Cellular uptake of magnetic nanoparticle is mediated through energydependent endocytosis in A549 cells. Journal of Veterinary Science, 7(4):321–326, 2006. [61] Tore G. Iversen, Tore Skotland, and Kirsten Sandvig. Endocytosis and intracellular transport of nanoparticles: Present knowledge and need for future studies. Nano Today, 6(2):176–185, April 2011. [62] A. Aderem and D. M. Underhill. Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual review of immunology, 17(April):593–623, January 1999. [63] Satyajit Mayor and Richard E Pagano. Pathways of clathrin-independent endocytosis. Nature reviews. Molecular cell biology, 8(8):603–12, August 2007. [64] Klaus Unfried, Catrin Albrecht, Lars-Oliver Klotz, Anna Von Mikecz, Susanne Grether-Beck, and Roel P.F. Schins. Cellular responses to nanoparticles: Target structures and mechanisms. Nanotoxicology, 1(1):52–71, January 2007. [65] http://www.rpi.edu/dept/chem-eng/enzymes/Protein-delivery.html. [66] C. Heyn, C. V. Bowen, B. K. Rutt, and P. J. Gareau. Single cell detection with FIESTA: effect of iron loading and distribution. Proc. Intl. Soc. Mag. Reson. Med., 11:805, 2003. [67] J. W. Bulte, T. Douglas, B. Witwer, S. C. Zhang, E. Strable, B. K. Lewis, H. Zywicke, B. Miller, P. van Gelderen, B. M. Moskowitz, I .D. Duncan, and J. A. Frank.
87
Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells. Nature biotechnology, 19(12):1141–7, December 2001. [68] Jin Sook Suh, Jue Yeon Lee, Young Suk Choi, Faquan Yu, Victor Yang, Seung Jin Lee, Chong Pyoung Chung, and Yoon Jeong Park. Efficient labeling of mesenchymal stem cells using cell permeable magnetic nanoparticles. Biochemical and biophysical research communications, 379(3):669–75, February 2009. [69] F. Gazeau and C. Wilhelm. Imaging and manipulating magnetically labelled cells. In Nguyen T. K. Thanh, editor, Magnetic nanoparticles from fabrication to clinical applications, pages 353–363. Taylor & Francis Group, 2012. [70] C. Wilhelm, C. Billotey, J. Roger, J. N. Pons, J. C. Bacri, and F. Gazeau. Intracellular uptake of anionic superparamagnetic nanoparticles as a function of their surface coating. Biomaterials, 24(6):1001–11, March 2003. [71] Runyang Mo, Shuyu Lin, Gongzheng Wang, Yu Wang, and Ed X Wu. Preliminary in vitro study of ultrasound sonoporation cell labeling with superparamagnetic iron oxide particles for MRI cell tracking. Conf. Proc. IEEE Eng. Med. Biol. Soc., pages 367–370, January 2008. [72] Lijun Wang, Zhigang Wang, Tim G. Frank, Stuart I. Brown, Sandy A. Chudek, and Alfred Cuschieri. Rapid and efficient cell labeling with a MRI contrast agent by electroporation in the presence of protamine sulfate. Nanomedicine (London, England), 4(3):305–15, April 2009. [73] T. C. Yeh, W. Zhang, S. T. Ildstad, and C. Ho. Intracellular labeling of T-cells with superparamagnetic contrast agents. Magn. Reson. Med., 30(5):617–25, November 1993. [74] T C Yeh, W Zhang, S T Ildstad, and C Ho. In vivo dynamic MRI tracking of rat T-cells labeled with superparamagnetic iron-oxide particles. Magnetic resonance in medicine : official journal of the Society of Magnetic Resonance in Medicine / Society of Magnetic Resonance in Medicine, 33(2):200–8, February 1995.
88
[75] E. Sykova and P. Jendelova. Migration, fate and in vivo imaging of adult stem cells in the CNS. Cell death and differentiation, 14(7):1336–42, 2007. [76] Ali Syed Arbab, Gene Thomus Yocum, Lindsey Bashaw Wilson, Ashari Parwana, Elaine Kay Jordan, Heather Kalish, and Joseph Alan Frank. Comparison of transfection agents in forming complexes with ferumoxides, cell labeling efficiency, and cellular viability. Molecular imaging, 3(1):24–32, January 2004. [77] Volker Schächinger, Sandra Erbs, Albrecht Elsässer, Werner Haberbosch, Rainer Hambrecht, Hans Hölschermann, Jiangtao Yu, Roberto Corti, Detlef G. Mathey, Christian W. Hamm, Tim Süselbeck, Birgit Assmus, Torsten Tonn, Stefanie Dimmeler, and Andreas M. Zeiher. Intracoronary bone marrow-derived progenitor cells in acute myocardial infarction. The New England journal of medicine, 355(12):1210– 21, September 2006. [78] Erik M. Shapiro, Stanko Skrtic, Kathryn Sharer, Jonathan M. Hill, Cynthia E. Dunbar, and Alan P. Koretsky. MRI detection of single particles for cellular imaging. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 101(30):10901–6, 2004. [79] http://www.medscape.org/viewarticle/574238_2. [80] B. Deuticke, M. Kim, and Chr. Zöllner. The influence of amphotericin B on the permeability of mammalian erythrocytes to nonelectrolytes , anions and cations. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes, 318(3):345–359, 1973. [81] S. Siena, M. Bregni, B. Brando, F. Ravagnani, G. Bonadonna, and A. M. Gianni. Circulation of CD34+ hematopoietic stem cells in the peripheral blood of highdose cyclophosphamide-treated patients: enhancement by intravenous recombinant human granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. Blood, 74(6):1905–14, November 1989. [82] J. R. DeLoach. Encapsulation of exogenous agents in erythrocytes and the circulating survival of carrier erythrocytes. Journal of applied biochemistry, 5(3):149–57, June 1983.
89
[83] Joanna Rejman, Volker Oberle, Inge S. Zuhorn, and Dick Hoekstra. Size-dependent internalization of particles via the pathways of clathrin- and caveolae-mediated endocytosis. The Bochemical journal, 377:159–169, 2004. [84] Jessica Olofsson, Kerstin Nolkrantz, Frida Ryttsén, Bradley a Lambie, Stephen G Weber, and Owe Orwar. Single-cell electroporation. Current Opinion in Biotechnology, 14(1):29–34, February 2003. [85] J. Ho Tai, Paula Foster, Alma Rosales, Biao Feng, Craig Hasilo, Violetta Martinez, Soha Ramadan, Jonatan Snir, C. W. James Melling, Savita Dhanvantari, Brian Rutt, and David J G White. Imaging islets labeled with magnetic nanoparticles at 1.5 Tesla. Diabetes, 55(11):2931–8, November 2006. [86] P. Walczak, D. A. Kedziorek, A. A. Gilad, S. Lin, and J. W. M. Bulte. Instant MR labeling of stem cells using magnetoelectroporation. Magnetic resonance in medicine, 54(4):769–74, October 2005. [87] Dara L. Kraitchman and Jeff W. M. Bulte. Imaging of stem cells using MRI. Basic research in cardiology, 103(2):105–13, March 2008. [88] Dong M. Huang, Jong K. Hsiao, Ying Ch. Chen, Li Y. Chien, Ming Yao, Yin K. Chen, Bor S. Ko, Szu Ch. Hsu, Lin A. Tai, Hui Y. Cheng, Shih W. Wang, Chung S. Yang, and Yao Ch. Chen. The promotion of human mesenchymal stem cell proliferation by superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Biomaterials, 30(22):3645–51, August 2009. [89] Ali S. Arbab, Lindsey A. Bashaw, Bradley R. Miller, Elaine K. Jordan, Bobbi K. Lewis, Heather Kalish, and Joseph A. Frank. Characterization of Biophysical and Metabolic Properties of Cells Labeled with Superparamagnetic Iron Oxide Nanoparticles and Transfection Agent for Cellular MR Imaging 1. Radiology, 229:838–846, 2003. [90] Ali S. Arbab, Lindsey B. Wilson, Parwana Ashari, Elaine K. Jordan, Bobbi K. Lewis, and Joseph A. Frank. A model of lysosomal metabolism of dextran coated super-
90
paramagnetic iron oxide (SPIO) nanoparticles: implications for cellular magnetic resonance imaging. NMR in biomedicine, 18(6):383–9, October 2005. [91] Lizeng Gao, Jie Zhuang, Leng Nie, Jinbin Zhang, Yu Zhang, Ning Gu, Taihong Wang, Jing Feng, Dongling Yang, Sarah Perrett, and Xiyun Yan. Intrinsic peroxidaselike activity of ferromagnetic nanoparticles. Nature nanotechnology, 2(9):577–83, September 2007. [92] Stefaan J. H. Soenen, Uwe Himmelreich, Nele Nuytten, and Marcel De Cuyper. Cytotoxic effects of iron oxide nanoparticles and implications for safety in cell labelling. Biomaterials, 32(1):195–205, January 2011. [93] W. Richard Bowen and Nidal Hilal. Atomic Force Microscopy in Process Engineering , 1st Edition. Elsevier Ltd, 2009. [94] Jeff W. M. Bulte, Dara L. Kraitchman, Alastair M. Mackay, and Mark F. Pittenger. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells is inhibited after magnetic labeling with ferumoxides. Blood, 104(10):3410–3413, November 2004. [95] Ying Ch. Chen, Jong K. Hsiao, Hon M. Liu, I Y. Lai, Ming Yao, Szu Ch. Hsu, Bor S. Ko, Yao C. Chen, Chung S. Yang, and Dong M. Huang. The inhibitory effect of superparamagnetic iron oxide nanoparticle (Ferucarbotran) on osteogenic differentiation and its signaling mechanism in human mesenchymal stem cells. Toxicology and applied pharmacology, 245(2):272–9, June 2010. [96] Dorota A. Kedziorek, Naser Muja, Piotr Walczak, Jesus Ruiz-Cabello, Assaf A. Gilad, Chunfa C. Jie, and Jeff W. M. Bulte. Gene expression profiling reveals early cellular responses to intracellular magnetic labeling with superparamagnetic iron oxide nanoparticles. Magnetic resonance in medicine, 63(4):1031–43, April 2010. [97] You K. Chang, Yu P. Liu, Jennifer H. Ho, Shu Ch. Hsu, and Oscar K. Lee. Aminesurface-modified superparamagnetic iron oxide nanoparticles interfere with differentiation of human mesenchymal stem cells. Journal of orthopaedic research, pages 1–8, February 2012.
91
[98] Lei Wang, Jixian Deng, Jian Wang, Bo Xiang, Tonghua Yang, Marco Gruwel, Tarek Kashour, Boguslaw Tomanek, Randy Summer, Darren Freed, Davinder S. Jassal, Guangping Dai, Miriam Glogowski, Roxanne Deslauriers, Rakesh C. Arora, and Ganghong Tian. Superparamagnetic iron oxide does not affect the viability and function of adipose-derived stem cells, and superparamagnetic iron oxide-enhanced magnetic resonance imaging identifies viable cells. Magnetic Resonance Imaging, 27(1):108–119, 2009. [99] Chung Y. Yang, Jong K. Hsiao, Ming F. Tai, Shin T. Chen, Hui Y. Cheng, Jaw L. Wang, and Hon M. Liu. Direct labeling of hMSC with SPIO: the long-term influence on toxicity, chondrogenic differentiation capacity, and intracellular distribution. Mol. imaging biol., 13(3):443–451, 2011. [100] Gerben M. Buul, Gyula Kotek, Piotr A. Wielopolski, Eric Farrell, P. Koen Bos, Harrie Weinans, Anja U. Grohnert, Holger Jahr, Jan A. N. Verhaar, Gabriel P. Krestin, Gerjo J. V. M. van Osch, and Monique R. Bernsen. Clinically translatable cell tracking and quantification by MRI in cartilage repair using superparamagnetic iron oxides. PLoS ONE, 6(2):e17001, January 2011. [101] Diana N. Tran, Lin C. Ota, John D. Jacobson, William C. Patton, and Philip J. Chan. Influence of nanoparticles on morphological differentiation of mouse embryonic stem cells. Fertility and sterility, 87(4):965–70, April 2007. [102] Min Chen and Anna Von Mikecz. Formation of nucleoplasmic protein aggregates impairs nuclear function in response to SiO2 nanoparticles. Experimental Cell Research, 305(1):51–62, 2005. [103] Hanna L. Karlsson, Pontus Cronholm, Johanna Gustafsson, and Lennart Möller. Copper oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical Research in Toxicology, 21(9):1726– 1732, 2008.
92
[104] Monique R. Bernsen, Amber D. Moelker, Piotr A. Wielopolski, Sandra T. van Tiel, and Gabriel P. Krestin. Labelling of mammalian cells for visualisation by MRI. European radiology, 20(2):255–274, February 2010. [105] Ewa M. Goldys. Fluorescence Applications in Biotechnology and Life Sciences. Number September. John Wiley & Sons, New Jersey, Hoboken, 2009. [106] P. Decherchi, P. Cochard, and P. Gauthier. Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer. Journal of neuroscience methods, 71(2):205–13, February 1997. [107] www.invitrogen.com. [108] Christopher G. Rylander, Digant P. Davé, Taner Akkin, Thomas E. Milner, Kenneth R. Diller, and Ashley J. Welch. Quantitative phase-contrast imaging of cells with phase-sensitive optical coherence microscopy. Optics letters, 29(13):1509–11, 2004. [109] I. Hrazdira and V. Mornstein. Lekarska biofyzika a pristrojova technika. Neptun, 2001. [110] M. Hejtmánek. Úvod do světelné mikroskopie. Olomouc, 2001. [111] B. Alberts, D. Bray, A. Johnson, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts, and P. Walter. Základy buněčné biologie. Espero Publishing, 2005. [112] J. L. Burbano, T. D. Pizzolato, P. R. Morey, and J. D. Berlin. An Application of the Prussian Blue Technique to a Light Microscope Study of Water Movement in Transpiring Leaves of Cotton (Gossypium hirsutum L.). Journal of Experimental Botany, 27(1):134–135, 1976. [113] Gaëtan J. R. Delcroix, Matthieu Jacquart, Laurent Lemaire, Laurence Sindji, Florence Franconi, Jean J. Le Jeune, and Claudia N. Montero-Menei. Mesenchymal and neural stem cells labeled with HEDP-coated SPIO nanoparticles: in vitro characterization and migration potential in rat brain. Brain research, 1255:18–31, February 2009.
93
[114] Ying Jing, Niladri Mal, P. Stephen Williams, Maritza Mayorga, Marc S. Penn, Jeffrey J. Chalmers, and Maciej Zborowski. Quantitative intracellular magnetic nanoparticle uptake measured by live cell magnetophoresis.
FASEB journal,
22(12):4239–47, December 2008. [115] Franck Bertorelle, Claire Wilhelm, Jacky Roger, Florence Gazeau, Christine Ménager, and Valérie Cabuil. Fluorescence-modified superparamagnetic nanoparticles: intracellular uptake and use in cellular imaging. Langmuir, 22(12):5385–91, June 2006. [116] Gang Liu, Zhiyong Wang, Jian Lu, Chunchao Xia, Fabao Gao, Qiyong Gong, Bin Song, Xuna Zhao, Xintao Shuai, Xiaoyuan Chen, Hua Ai, and Zhongwei Gu. Low molecular weight alkyl-polycation wrapped magnetite nanoparticle clusters as MRI probes for stem cell labeling and in vivo imaging. Biomaterials, 32(2):528–37, January 2011. [117] Andrea Tautzenberger, Steffen Lorenz, Ludwika Kreja, Anke Zeller, Anna Musyanovych, Hubert Schrezenmeier, Katharina Landfester, Volker Mailänder, and Anita Ignatius. Effect of functionalised fluorescence-labelled nanoparticles on mesenchymal stem cell differentiation. Biomaterials, 31(8):2064–2071, 2010. [118] Peter J. Goodhew, Humphreys John, and Richard Beandland. Electron microscopy and analysis. Taylor & Francis, 2001. [119] C. T. K. H. S Stadtländer. Scanning Electron Microscopy and Transmission Electron Microscopy of Mollicutes : Challenges and Opportunities. Modern Research and Educational Topics in Microscopy, pages 122–131, 2007. [120] http://www.paru.cas.cz/lem/book/index.html. [121] Chris Heyn, Chris V. Bowen, Brian K. Rutt, and Paula J. Foster. Detection threshold of single SPIO-labeled cells with FIESTA. Magnetic resonance in medicine, 53(2):312–320, February 2005. [122] Brinda Ravikumar, Sovan Sarkar, Janet E. Davies, Marie Futter, Moises GarciaArencibia, Zeyn W. Green-thompson, Maria Jimenez-sanchez, Viktor I. Korolchuk,
94
Maike Lichtenberg, Shouqing Luo, Dunecan C. O. Massey, Fiona M. Menzies, Kevin Moreau, Usha Narayanan, Maurizio Renna, Farah H. Siddiqi, Benjamin R. Underwood, Ashley R. Winslow, and David C. Rubinsztein. Regulation of Mammalian Autophagy in Physiology and Pathophysiology. Physiological Reviews, 90:1383–1435, 2010. [123] Y. Tsujimoto and S. Shimizu. Another way to die: autophagic programmed cell death. Cell death and differentiation, pages 1528–34, November 2005. [124] Klaus D. Sattler. Handbook of Nanophysics : Nanomedicine and Nanorobotics. CRC Press - 887 Pages, 2010. [125] G.J. Hyde, Davies D.S., Cole L., and A. E. Ashford. Retention of fluorescent probes during aldehyde-free anhydrous freeze-substitution. J Microsc., 210:125–130, 2003. [126] Maria Pia Gallo, Roberta Ramella, Giuseppe Alloatti, Claudia Penna, Pasquale Pagliaro, Andrea Marcantoni, Francesca Bonafé, Gianni Losano, and Renzo Levi. Limited plasticity of mesenchymal stem cells cocultured with adult cardiomyocytes. Journal of cellular biochemistry, 100(1):86–99, January 2007. [127] Massimiliano Magro, Giulietta Sinigaglia, Luca Nodari, Jiri Tucek, Katerina Polakova, Zdenek Marusak, Sara Cardillo, Gabriella Salviulo, Umberto Russo, Roberto Stevanato, Radek Zboril, and Fabio Vianello. Charge binding of rhodamine derivative to OH(-) stabilized nanomaghemite: Universal nanocarrier for construction of magnetofluorescent biosensors. Acta biomaterialia, March 2012. [128] Aristides Bakandritsos, George Mattheolabakis, Radek Zboril, Nikolaos Bouropoulos, Jiri Tucek, Dimitrios G Fatouros, and Konstantinos Avgoustakis. Preparation, stability and cytocompatibility of magnetic/PLA-PEG hybrids. Nanoscale, 2(4):564–72, April 2010. [129] http://www.nuncbrand.com/us/page.aspx?ID=226. [130] http://www.solaronix.com/products/tcolayers/tco2215/.
95
[131] Roman Kubinek, Milan Vujtek, and Miroslav Maslan. Mikroskopie skenujici sondou. Olomouc, 2003. [132] OPVK. Studijni material k workshopu. In Letni skola nanotechnologii, Masarykova univerzita Brno, 2011. [133] http://www.eng.yale.edu/nanomechanics/research_methods.html. [134] http://biomach.wz.cz/img_ob_mitoza.jpg. [135] H. D. Summers, P. Rees, M. D. Holton, M. R. Brown, S. C. Chappell, P. J. Smith, and R. J. Errington. Statistical analysis of nanoparticle dosing in a dynamic cellular system. Nature nanotechnology, 6:170–174, 2011. [136] L. Eckertova and L. Frank. Metody analyzy povrchu, elektronova mikroskopie a difrakce. Academia Praha, 1996. [137] M. L. Coleman, E. A. Sahai, M. Yeo, M. Bosh, A. Dewar, and M. F. Olson. Membrane blebbing during apoptosis results from caspase-mediated activation of ROCK I. Nature cell biology, 3:339–245, 2001. [138] OPVK. Prutokova cytometrie - analyza bunecneho cyklu. In AescuLab, Univerzita Palackeho v Olomouci, 2009.
96
Přílohy
Seznam zkratek HSCs: hematopoetické kmenové buňky MSCs: mesenchymální kmenové buňky hMSCs: lidské MSCs rMSCs: potkaní MSCs in vitro: pokusy ve zkumavkách in vivo: pokusy na zvířecích modelech SPIO: superparamagnetické nanočástice oxidů železa VSOP: very small oxide particles USPIO: ultrasmall superparamagnetic iron oxide Resovist: komerční kontrastní látka (karboxydextranem pokryté SPIO) Endorem: komerční kontrastní látka (dextranem pokryté SPIO) HEDP: 1-hydroxyethylidene-1.1-bisphosphonic acid PEG: polyethylen glykol PLA: polylactic acid PVA: polyvinyl alkohol LM: světelný mikroskop FM: fluorescenční mikroskop TEM: transmisní elektronový mikroskop
97
SEM: skenovací elektronový mikroskop FESEM: field emission SEM - SEM s autoemisní tryskou SE: secondary electrons - sekundární elektrony BSE: back scatter electrons - zpětně odražené elektrony YAG: yttrium aluminium garnet - detektor BSE MR: magnetická rezonance MRI: zobrazení magnetickou rezonancí PMI: N-(2,6-diisopropylphenyl)perylen-3,4-dicarboximid DAPI: 4’,6-diamidino-2-phenylindol MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) FCC: plošně centrovaná kubická mřížka
Přehled polymerů
Tabulka 1: Polymery používané jako funkcionalizující slupky SPIO nanočástic [18]
98
Grafy
Obrázek 3: Přehled jednotlivých testů proliferace FeNV - rMSCs
Obrázek 4: Přehled jednotlivých testů proliferace kontrolních rMSCs
99
