Lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciával kapcsolt RAPD markerek jellemzése
Diplomamunka
Készítette: Kuczmog Anett biológus hallgató
Témavezető: Dr. Putnoky Péter PTE TTK Genetikai és Molekuláris Biológiai Tanszék
PÉCS, 2006.
2
BEVEZETÉS ........................................................................................................................................... 3 1. IRODALIMI ÁTTEKINTÉS .................................................................................................................. 4 1. 1. MIKROBIÁLIS KÓROKOZÓK .............................................................................................................. 4 1. 1. 1. A peronoszpóra .................................................................................................................. 4 1. 1. 2. A lisztharmat ....................................................................................................................... 5 1. 1. 3. Lisztharmat és peronoszpóra rezisztens szőlőfajták.......................................................... 6 1. 2. DNS MARKEREK A GENETIKAI TÉRKÉPEZÉSBEN ............................................................................... 7 1. 2. 1. RFLP markerek................................................................................................................... 7 1. 2. 2. RAPD és SCAR markerek.................................................................................................. 8 1. 2. 3. AFLP markerek................................................................................................................... 8 1. 3. A SZŐLŐ GENETIKAI TÉRKÉPE ......................................................................................................... 9 1. 3. 1. Lisztharmat rezisztencia: a Run1 gén azonosítása............................................................ 9 1. 4. PERONOSZPÓRA REZISZTENCIA .................................................................................................... 12 2. ELŐZMÉNYEK.................................................................................................................................. 13 3. CÉLKITŰZÉSEK ............................................................................................................................... 16 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK .......................................................................................................... 17 4. 1. SZŐLŐ DNS IZOLÁLÁSA ............................................................................................................... 17 4. 2. DNS MINŐSÉGÉNEK ELLENŐRZÉSE ............................................................................................... 17 4. 3. PCR REAKCIÓ ............................................................................................................................. 17 4. 4. GÉLELEKTROFORÉZIS .................................................................................................................. 19 4. 5. FRAGMENTIZOLÁLÁS .................................................................................................................... 19 4. 6. KOMPETENS SEJT KÉSZÍTÉSE ....................................................................................................... 19 4. 7. LIGÁLÁSI REAKCIÓ........................................................................................................................ 19 4. 8. TRANSZFORMÁLÁS ....................................................................................................................... 20 4. 9. ESCERICHIA COLI NÖVESZTÉSE..................................................................................................... 20 4. 10. PLAZMID DNS IZOLÁLÁSA........................................................................................................... 20 4. 11. DNS SZEKVENÁLÁS ................................................................................................................... 20 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK ............................................................................................. 21 5. 1. DNS IZOLÁLÁSA .......................................................................................................................... 21 5. 2. CSOPORT SZEGREGÁCIÓS ANALÍZIS RAPD SEGÍTSÉGÉVEL ............................................................ 21 5. 3. EGY PERONOSZPÓRA REZISZTENCIAGÉNNEL KAPCSOLT RAPD MARKER JELLEMZÉSE ..................... 23 5. 4. LISZTHARMAT REZISZTENCIAGÉNNEL KAPCSOLT RAPD MARKEREK JELLEMZÉSE ............................. 24 5. 5. EGY RUN1 GÉNNEL KAPCSOLT MARKER KIMUTATÁSA A 99-1 POPULÁCIÓBAN .................................. 26 5. 6. A DNS-MARKEREK ÉS A RUN1 GÉN ELHELYEZKEDÉSE ................................................................... 27 5. 7. SCAR MARKEREK KIALAKÍTÁSA .................................................................................................... 28 6. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JÖVŐBENI MUNKÁK............................................................................ 32 7. ÖSSZEFOGLALÁS .......................................................................................................................... 33 8. IRODALMI HIVATKOZÁSOK........................................................................................................... 34 KÖSZÖNETNYILYÁNÍTÁS .................................................................................................................. 36
3 BEVEZETÉS A szőlő lisztharmat betegsége által okozott tüneteket senki nem jellemezte jobban, mint kertészkedő írónk, Jókai Mór: „A szőlőszemek piszkos hamuszint vesznek fel, egyes bogyó felreped, s a szőlőmag kiduzzad belőle. Az a hamuszínű por az ezernyi apró gomba, mely gyökerét a bogyó héjába fúrja, s annak nedvét kiszívja. Ha letöröljük, a szőlőszem héja alatta gesztenyeszínű, s olyan kemény is, mint a gesztenye héja. Ha kifejlettebb korában lepi meg a szőlőfürtöt, akkor az megtöpped, olyan lesz, mint a mazsola-szőlő, csakhogy savanyúbb az ecetnél. A lisztharmatos szőlőből bort nem lehet szűrni.” A szőlő mikrobiális kórokozói nagy kárt okozó ellenségei a szőlősgazdáknak, amelyek ellen hosszú idők óta vegyszeres védekezést kell folytatni. A molekuláris biológia fejlődése ennek a területnek is segítséget hozott, a természetes rezisztenciagének és a hozzájuk kapcsolódó DNS-markerek megismerése, a genetikai térképezésben való felhasználása által. E dolgozatban bemutatott munkánkkal mi is a szőlőnemesítők számára szeretnénk molekuláris eszközök révén segítséget nyújtani, a DNS-markerek azonosítása, jellemzése révén.
4 1. IRODALIMI ÁTTEKINTÉS A szőlő ősi kultúrnövényünk, ami napjainkban is igen nagy gazdasági jelentőséggel bír. Számos fajtáját termesztik világszerte, és a belőlük készülő (elsősorban) bortermékek jelentős kereskedelmi szerepe mindenki által ismert. Az egyik világszerte művelt szőlő fajtát, a Vitis vinifera-t, kiváló minősége miatt termesztik, alkalmas bor készítésére és asztali fogyasztásra is, de sajnos minden jelentős kórokozóra érzékeny. 1. 1. Mikrobiális kórokozók A legjelentősebb két mikrobiális kórokozó a lisztharmat (Uncinula necator) és peronoszpóra (Plasmopara viticola), amelyek nagy termésveszteséget is okozhatnak sok fogékony fajtában. Bár a betegségek elleni védekezés többnyire megoldható vegyszerek felhasználásával, mégis messze hatékonyabb megoldás lenne a rezisztens fajták termesztése. Nem mindig megfelelő hatékonyságú a vegyszeres védekezés járványos helyzetekben. A mikrobiális kártevőkkel szemben ellenálló szőlőfajták termesztése nemcsak gazdasági, hanem környezetvédelmi szempontból is fontos lenne, hiszen így jóval kevesebb vegyszer kerülne ki a természetbe. 1. 1. 1. A peronoszpóra A szőlő legkártékonyabb és legelterjedtebb kártevője a peronoszpóra. Amerikából hozták be, feltehetőleg a szőlővessző kötegekben maradt levelekkel. Hazánkban 1880-ben a nyugati országrészben jelent meg először, és az óta is folyamatos a küzdelem ellene. Járványszerűen fellépő pusztító hatása májustól szeptemberig károsítja a szőlő termésének és lombozatának nagy részét. Fellépése és elterjedése nagymértékben függ az időjárástól. Meleg, csapadékos évben lép fel, és akkor is a sík vidéken, leginkább a homokon pusztít. A megtámadott sejtek elveszítik klorofill tartalmunkat, a szőlő elveszíti asszimiláló képességét, a beteg levél olajfoltossá válik, nagy része elszárad, majd néhány napon belül elpusztul. A kórokozó a virágfürtöket is megfertőzi, amelyek gyorsan megbarnulnak és lehullnak. A fejlődő zöld bogyókat és a fejlett bogyókat is megtámadja. A peronoszpóra nagyon hatékonyan terjed aszexuális (ivartalan) szaporodási módon. Hatékony fertőzéséhez a gazdaszervezet érzékenysége szükséges. Morfológiáját és időbeli változásait vizsgálták gazdaszervezet nélküli rendszerben (petri-csészében) és gazdaszervezeten belül úgy, hogy szőlőleveleket fertőztek meg a kórokozóval. A vizsgálatok azt mutatták, hogy a P.viticola terjedésében a gazdaszervezet által kibocsátott vegyületeknek szerepük van. Nagy fertőzőképességét gyors szétterjedése teszi lehetővé, amelyet ivartalan szaporodásával ér el. Ez a folyamat kevesebb, mint 4 nap alatt végbemehet. Párás és meleg időszakban, a sporangiumból kiszabaduló ostoros spórák a leveleket fedő vékony vízrétegben szétrajzanak és ellepik az egészet. Az ostoros spórák egy-egy sztómához érve, elhullatják az ostoraikat és minden spórából csíratömlő fejlődik, amely a szubsztómális üregbe érve, kitágul és infekciós hólyaggá alakul. Ezekből a hólyagokból elsődleges hifák képződnek, micéliumot alkotnak és elterjednek a levél szöveteiben. Kiefer és társai (Kiefer et al., 2002) bizonyították, hogy az ostoros spórák a nyitott sztómán keresztül kibocsátott jelmolekulákat (anyagcsere termékeket) érzékelve jutnak el a behatolás helyére. A korai fertőzési lépéseket
5 (sporangium megjelenése, ostoros spórák és fiatal csíratömlő) fluoreszcin-diacetáttal (FDA) tették láthatóvá a vizsgálatok során (1. ábra).
1. ábra: Ostoros spórák kirajzásának időbeli változása, a levéllemezek fertőzése után, összehasonlítva a gazdaszervezet nélküli rendszerben történt kirajzásokkal (a), A sporangiumokból általában 3-6 ostoros spóra rajzik ki (b), A sporangiumokban 4 vagy 6 mag jelenik meg még a fertőzést megelőző állapotban (c) (Kiefer et al., 2002) 1. 1. 2. A lisztharmat A lisztharmat, korábbi időszakos helyi előfordulása után az utóbbi évtizedben a szőlőn rendszeresen, minden évben jelentkező, nehezen leküzdhető, a peronoszpóra mellett, a szőlő másik legismertebb mikrobiális kórokozója lett. A zöld növény leveleinek, hajtásszárának, zöld bogyóinak bõrszöveti sejtjein élősködik. Nevét a megtámadott levél színén létrejövő lisztszerű, fénytelen, szürkésfehér, kézzel letörölhető, kellemetlen penészszagú bevonatról kapta. A peronoszpórával ellentétben fonalai nem hatolnak a belső szövetek közé, csak a bőrszöveten élősködnek. A levél színén és fonákán is megjelenhet (ellentétben a peronoszpórával, ami csak a fonákon jelenik meg). A kórokozó hatására a levelek bepöndörödnek, erős fertőzés esetén le is hullhatnak, a hajtások fejlődése gátolt, a fertőzött bogyó bõrszövete nem tud növekedni, felhasad úgy, hogy a magok is kilátszanak. A fertőzés általában június közepétől napos, meleg, enyhén párás időben lép fel, és ugusztusig szinte járványszerűen terjed. Fertőzéséhez nedvességet nem igényel (2. ábra). Már korábban tudott tény volt, hogy a kórokozó áttelel. Ez kétféle módon történhet meg: a fertőzött rügyekben micéliummal, illetve a fertőzött növények felületén képződött kleisztothéciumokkal. Az utóbbi áttelelési forma jelenléte egyre erőteljesebb, s mára ez a meghatározó. Ezeknek az ivaros szaporító képleteknek a jelentős részét a hideg tél sem tudja elpusztítani.
6 A penész kolóniák egyszerű szaporodási formákból épülnek fel, és sugárirányban osztódnak 5-9 napig mielőtt elkezdik termelni a konidiospórákat. Ezután a spórák nagyon gyorsan szétterjednek, legkésőbb 8 órán belül. Ez a gyors és összehangolt megjelenés feltehetően azt jelenti, hogy valamilyen molekuláris jelátadást következik be a kolónián belül fertőzéskor (Gadoury et al., 1997).
2. ábra: A lisztharmat fertőzési folyamata. A mikrobiális kórokozó az alvó rügyekben telel át (1). A fertőzött rügyek ágat adnak a fiatal hajtásoknak, amelyeket teljesen befed a kórokozó (2.). Sporuláció következik be a zöld hajtásokon és levelek felületén (3.). A konidiospórák és az aszkospórák megfertőzik a zöld szöveteket (4.). A leveleken, ágakon és termésen lévő kórokozó konidiospórkat termel, amelyeket a szél szállít (5.). fertőzőtt szőlőfürt (a), konidiospórák kialakulása (b), késő nyáron kleisztocithák alakulnak ki a leveleken, ágakon és a terméseken (c), kleisztothécium, aszkospórákat tartalmazó aszkuszok (d), tavasszal kiszabaduló aszkospórák (e). A fejlődő rügyek fertőzöttek lesznek (6.).
1. 1. 3. Lisztharmat és peronoszpóra rezisztens szőlőfajták A rezisztenciára nemesítés – tekintettel a peronoszpóra és a lisztharmat kártételének jelentőségére – elsősorban az ezen betegségekkel szemben ellenálló fajták létrehozását tűzte ki célul. Az elmúlt száz évben a rezisztenciára nemesítéshez az adott kórokozókkal szemben ellenálló észak-amerikai Vitis fajokat használják fel rezisztenciaforrásként. Új lehetőséget jelentett a Muscadinia rotundifolia domináns lisztharmat génjének beépítése a Vitis komplex hibridekbe. Az ilyen módon, interspecifikus keresztezéssel létrejött fajták gyakran hiperszenzitív reakcióval válaszolnak a kórokozó fertőzésére. Így e fajták egyes kórokozókkal szemben vegyszeres kezelés nélkül is megvédhetők. Az interspecifikus keresztezéses nemesítéssel Magyarország nemzetközileg elismert eredményeket ért el. Ilyen rezisztens fajta például a Bianca, a Zalagyöngye, a Viktória gyöngye, a Göcseji zamatos és a Pölöskei muskotály, Medina, Palatina, stb.
7 A nemesítők törekednek arra, hogy az ismételt visszakeresztezésekkel a rezisztens fajták jó borszőlő és csemegeszőlő minősége ne maradjon el a tiszta V. vinifera fajtákétól, s úgy tűnik, egyes fajták esetén sikerült e célt megközelíteni. A természetesen kialakult szőlő eredetű rezisztencia bekeresztezése klasszikus nemesítési módszerekkel idő- és munkaigényes. Ezt a nemesítési munkát segítheti a rezisztenciához kapcsolt DNS markerek megismerése és nyomon követése. A megfelelő rezisztenciagént hordozó növények kiválasztása (a fenotípus megállapítása) ugyanis csak biológiai teszttel lehetséges. Ebben az esetben minden utódot le kell vizsgálni egy keresztezés során, ami esetenként több száz növényt is jelenthet. Ezzel szemben, a rezisztenciához kapcsolt DNS marker jelenlétének gyors kimutatása után már sokkal kevesebb egyedet kell megvizsgálni a munkaigényes és lassabb biológiai tesztben. Ráadásul a rezisztenciához kapcsolt DNS markerek azonosítása után lehetővé válik e gén, gének azonosítása, izolálása, és ezt követően esetleges transzgenikus rezisztens fajták létrehozása. 1. 2. DNS markerek a genetikai térképezésben A kromoszómán a gének a gyöngysorhoz hasonlóan, lineáris sorrendben, lókuszokban helyezkednek el. A genetikai térképezésnek két fő célja van. Egyrészt annak a lineáris sorrendnek a meghatározása, ahogy a gének egymáshoz viszonyítva elhelyezkednek, valamint a gének közötti relatív távolság (géntávolság) megállapítása. A távolság egysége, annak a kifejezése, hogy a keresztezésben szereplő gének között milyen gyakran jön létre rekombináció. Egy egységnyi térképtávolság (centimorgan) 1%-os rekombinációs gyakoriságnak felel meg. A térképezés genetikai markerek segítségével történik. A genetikai markerek különböző tulajdonságokat meghatározó változatok (allélok), amelyek megkülönböztethetők egymástól a klasszikus értelemben vett fenotípus (morfológia, fiziológia) vagy molekuláris szinten, a fehérjék vagy a DNS jellemzésével. Tanksley (Tanksley and Orton, 1983) molekuláris markereknek nevezte el azokat a markereket, amelyek fehérje és/vagy DNS-szinten különböztetik meg az egyes alléleket egymástól. Ezen változatok jelenléte általában nem okoz az egyed szintjén észrevehető fenotípusos változást, a legtöbb DNS marker nem is géneken belüli különbségeket jelez, ezért az ilyen allélek közötti eltérést polimorfizmusnak nevezzük. A DNS-szintű markerek alkalmazását a Southern-blot technika, az ezen alapuló RFLP módszer, majd a polimeráz láncreakció (PCR) kidolgozása tette lehetővé. 1. 2. 1. RFLP markerek Kan és Dozy (Kan and Dozy, 1978), valamint Botstein (Botstein et al., 1980) ismerték fel hogy az úgynevezett hasítási fragmentumhossz polimorfizmusokat (RFLP, Restriction Fragment Length Polymorphism) markerként lehet használni teljes genetikai kapcsoltsági térképek készítésére. Ha a DNS-szekvencia eltérése egy adott szakaszon megváltoztatja egy restrikciós enzim hasítási mintázatát, akkor ezt az érintett szakasz hibridizációs próbaként való alkalmazásával ki lehet mutatni, és rekombinációs térképezésben az allélokat az utódokban követni lehet. Az RFLP markerek véletlenszerűen oszlanak el a genomban és nagyon gyakoriak. Restrikciós endonukleázok segítségével szinte korlátlan mennyiségű polimorfizmust lehet találni. Ez a módszer volt az első olyan
8 molekuláris DNS marker módszer, amelyet fel lehetett használni kromoszómatérképezésre. Az RFPLtechnikát
DNS-ujjlenyomat
elkészítésére
(faj(ta)
azonosítás,
rokonság
megállapítására)
és
monogénes tulajdonságok térképezésére egyaránt alkalmazzák (Hajósné-Novák, 1999). 1. 2. 2. RAPD és SCAR markerek A véletlen amplifikált polimorf DNS (RAPD, Random Amplified Polymorphic DNA), DNSszekvenciák specifikus megsokszorozásán (polimerase chain reaction, PCR) alapuló módszer, amelyet a vizsgált DNS bizonyos szekvenciáival komplementer primerek használata tesz lehetővé. A primerek rendszerint 9-10 bázisból álló egyszálú oligonukleotidok, amelyek a genomi DNS két különböző helyén a komplementer szálakhoz kötődnek. Ha ezek a kötődési helyek megfelelően kis távolságban (100-2000 bp) vannak egymástól, akkor a PCR során meghatározott hosszúságú DNS fragmentum keletkezik. Egy primer általában több diszkrét lókusz megsokszorozását is eredményezi ugyanazon mintában. A reakció során keletkezett DNS szakaszok gélelektroforézis segítségével történő elválasztásával a vizsgált egyedek közötti polimorfizmus kimutatható. E módszer alkalmas különböző genomok hasonlóságának vagy különbözőségének, specifikus fenotípushoz kapcsoltható fragmentumok jelenlétének vagy hiányának kimutatására, populációk genetikai szerkezetének elemzésére, egyedek DNS-ujjlenyomatának elkészítésére. A RAPD módszerrel tehát ismeretlen DNS szakaszokat lehet felszaporítani a genomból egy vagy két önkényesen megválasztott primerrel. A RAPD markerek használata egyszerű és gyors, általában domináns öröklődésűek, a fajok széles skáláján alkalmazható, és nincs szükség arra, hogy a felszaporítani kívánt DNS szakaszokat génbankokból keressük ki. A módszer hátránya, hogy érzékeny a PCR reakció körülményeinek nagyon kis megváltozására, és előfordulhat, hogy az amplifikáció nem a templát DNS-ről, hanem a szennyeződésként véletlenül bevitt DNS-ről történik meg. A RAPD primerek megbízhatóságának javítása érdekében, Paran és Michelmore (Paran and Michelmore, 1992) javasolták
az ismert szekvenciájú amplifikált régió (SCAR, Sequence
Characterized Amplified Region) markerek kifejlesztését. A SCAR markerek a RAPD módszerrel kimutatott és polimorfizmust jelző DNS szakaszok további jellemzéséből származnak. Miután a kérdéses RAPD fragmentumot klónozták és végeinek szekvenciáját meghatározták, a szekvencia ismeretében olyan specifikus primer páros tervezhető, amely segítségével egy adott polimorfizmus nagy biztonsággal vizsgálható. A SCAR primereket speciális DNS régiók sokszorozására használják. Használatuk kedvezőbb, mint a RAPD markereké, mert általában csak egy szakaszt jelölnek, és a PCR
reakció
körülményeinek
változtatására
kevésbé
érzékenyek.
A
SCAR
markereket
géntérképezésre, marker alapú klónozásra, vagy markeren alapuló szelekcióra (MAS, MarkerAssisted Selection), valamint közel rokon fajták azonosítására használják. 1. 2. 3. AFLP markerek Az amplifikált fragmenthossz polimorfizmus (AFLP, Amplified Fragment Lenght Polymorphism) markereket alkalmazó technikán ismeretlen szekvenciájú kromoszómális restrikciós fragmentumok PCR segítségével történő megsokszorozását értjük (Vos et al., 1995). Az amplifikáció előtt a genomiális DNS-t két restrikciós endonukleázzal hasítják, és a DNS-fragmentumok végeire hely
9 specifikus kettős szálú adaptereket ligálnak. A reakció alatt csak azok a restrikciós fragmentumok amplifiklódnak, amelyekben a hasítási hely utáni nukleotidok összeillenek a primer végeken lévő szelektív nukleotidokkal. Az RFPL módszertől annyiban különbözik, hogy a restrikciós fragmentumok detektálása Southern-blot hibridizációval, az AFPL-nél pedig PCR módszer segítségével történik. Az AFLP nagy felbontóképességű technika, genetikai térképezésre, csoport szegregációs analízisre, nemesítési anyagok genetikai különbözőségének vizsgálatára használják. 1. 3. A szőlő genetikai térképe Lodhi és munkatársi a ’Cayuga White’ és ’Aurore’ szőlőfajták keresztezésből létrejött interspecifikus hibrid populáció felhasználásával készítették el a Vitis (2n=38) kapcsoltsági genetikai térképét (Lodhi et al., 1995). A térkép eredetileg 422 RAPD marker felhasználásával készült el, melyek közül 16 RFLP és izoenzim marker volt. A térképen belül a markerek közötti átlagos távolság 6.1 cM volt. A ’Cayuga White’ térképét 214 marker segítségével készítették el, melyek 1996 cM távolságot fednek le, és az ’Aurore’ térképét 225 marker alkotja 1477 cM távolságot lefedve. A ’Cayuga White’ térképe 20 kapcsoltsági csoportból, az ’Aurore’ térképe 22 csoportból épül fel. Az egyes kapcsoltsági csoportok az ’Aurore’ esetében 14-135 cM, a ’Cayuga White’ esetében 14-124 cM nagyságúak. A térkép elkészítésével további kvantitatív tulajdonságok térképezését (QTL), vagy marker alapú gén klónozását (MAS) tették lehetővé. Dalbo és munkatársai a ’Horizon’ (’Seyval’ x ’Schuyler’) és Illionis 547-1 (V.cinerea B9 x V.rupestris B38) szőlőfajták keresztezéséből származó populáció segítségével alkották meg a Vitis genetikai térképét. A térkép 277 RAPD marker segítségével készült el (Dalbó et al., 2000). A ’Horizon’ térképét 153 marker alkotja 1199 cM távolságot lefedve, és az átlagos távolság a markerek között 7.6 cM. Az Illinois 547-1 térképét 179 marker alkotja 1470 cM távolságot fedve, átlagos 8.1 cM markerek közötti távolsággal. Mindkettő térkép 20 kapcsoltsági csoportból épül fel. A térkép szintén felhasználható QTL és MAS vizsgálatok elvégzéséhez. A Vitis (2n=38) teljes genomjának mérete 475 Mb, így 1 cM távolság hozzávetőlegesen 300 kb nagyságú DNS-szakaszt jelent. 1. 3. 1. Lisztharmat rezisztencia: a Run1 gén azonosítása A lisztharmat rezisztencia tulajdonságot a Muscadinia rotundifolia genomból öt keresztezéssel sikerült egy V.vinifera fajtába juttatni (Pauquet et al., 1998). A fenotípus mögött álló feltételezett Run1 (Resistant for Uncinula necator) teljes rezisztenciát biztosított a lisztharmattal szemben, ami azonos módon nyilvánul meg a lombon, bogyón és a vesszőn. Érdekes módon a Run1 gént hordozó egyedek a peronoszpórával szemben is mutattak ellenállást, de nem bizonyított, hogy ez a Run1 gén jelenlétének tulajdonítható. Az első térképezési munkákat csoport szegregációs analízis (BSA, Bulked Segregant Analysis) technikával végezték, amely számos Run1 közeli molekuláris marker meghatározását eredményezte. A munka célja a Run1 génnel kapcsolt molekuláris markerek azonosítása, és egy helyi térkép szerkesztése volt. A szegregációs populációt 1995-ben hozták létre, és a vizsgálatok során marker alapú szelekciós programot (MAS, Marker Assisted Selection program) alkalmaztak. A tesztek elvégezése és a csoportok analízise megerősítette a rezisztencia monogénes
10 öröklődését. A munka során 56 primer kombinációs tesztelését végezték 10 rezisztens és 10 fogékony növényen. A primerek közül 16 kombináció eredményezett 9 polimorf DNS-fragmentumot, és a populáció további 68 egyedét ezekkel tesztelték. Összesen három egyed volt rekombináns, amit sikerült egy vagy kettő markerrel kimutatni. A vizsgálatok eredményeként kiderült, hogy több egyedet kell több markerrel tesztelni, hogy pontosabban meg lehessen szerkeszteni a Run1 régió genetikai térképét. Pauquet és munkatársi később Cabernet Sauvignon x Grenache x Aubun keresztezésből származó populációt használták fel, olyan AFLP markerek kiválogatására, amelyek kapcsoltak a Run1 génnel (Pauquet et al., 2001). Ezek közül 13 AFLP markert választottak ki a térkép elkészítéséhez. A munka során 157 (74 rezisztens és 84 szenzitív) egyedet teszteltek. 17 primerkombináció eredményezett 19 polimorf markert a két csoport között. A markerek közül 13 egyértelműen megjelent mindegyik rezisztens utódban és hiányzott a Cabernet-Sauvignonból. Kettő közülük mindig megjelent a Grenache (Emhb11, Emff1) és Aubun (csak Emhb11) fajtákban. Mivel az AFLP markerek nem specifikusak, kettő ugyanolyan méretű fragmentum a két különböző genotípusban nem jelentheti feltétlenül ugyanazt a szekvenciát. De az Emhb11 markernek megfelelő fragmentumot klónozták mind a VRH3082-1-42 és Grenache fajtába és meghatározták a bázissorrendjét. Csak három nukleotidban volt eltérés a két fragmentum szekvenciája között, ami azt jelentette, hogy ezek megfelelnek ugyanannak a régiónak. Végül a térkép megalkotásához 11 AFLP primer kombinációjából létrehozott 13 polimorf marker tesztelését végezték el az Mtp3294 populáció 157 egyedén. Ezzel elkészítették a Run1 gén környezetének térképét (5. ábra) Donald és munkatársai VRH3082-1-42 x V.vinifera cv Cabernet Sauvignon keresztezésből származó BC5 populáció egyedeivel dolgoztak. Munkájuk során irodalomban közölt rezisztenciagének nukleotid-kötőhelyeik alapján (3. ábra) rezisztenciagén analóg (RGA) markereket fejlesztettek ki (Donald et al, 2002).
3. ábra: A rezisztenciagén nukleotid-kötőhely-leucin gazdag ismétlődésének (NBS-LRR, nucleotid-binding site-leucine rich repeat) sematikus modellje. A konzervatív domének szerint tervezett P-loop, GLPL, kinase-2 és MHD markerek körülbelüli elhelyezkedése.
11
4. ábra: A konszenzus domén szekvenciáknak megfelelően tervezett 22 rezisztencia analóg primer. 22 RGA markert terveztek a régióra és teszteltek hét rezisztens és fogékony egyeden (4. ábra). Eredményül azt kapták, hogy a GLP1-12, MHD98 és MHD145 markerek különbséget mutattak a rezisztens és szenzitív egyedek között. Továbbiakban, hogy könnyebben lehessen a populáció többi egyedét tesztelni RFLP markereket terveztek. A GLP1-12 régiót Southern-blot hibridizációs technikával térképezték, hogy megállapítsák milyen restrikciós helyek találhatók az eredeti szekvencián kívül, amelyeket tudnak esetleg alkalmazni későbbiekben klónozásra. Restrikciós térképezéssel azonosítottak egy 1kb nagyságú HindIII fragmentumot, amely kapcsolódik a GLP1-12 markerrel és egy EcoRI restrikciós hasító helyet foglal magába. Ezután a régió szekvenciájának ismeretében primerpárost terveztek (GLP12-P1/P3), amelyeket mi is alkalmaztunk munkánk során (5. 5. fejezet). A szegregációs analízisek során arra a következtetésre jutottak, hogy az RGA markerekből kialakított GLP1-12 és MHD145 markerek szorosan kapcsolódnak a Run1 génhez, az MHD98 markerrel összesen 4 egyed volt rekombináns, így a markert 2.4 cM távolságra térképezték a géntől (5.ábra).
12
5. ábra: A Run1 gén térképe (Pauquet et al, 2001, Donald et al, 2002).
1. 4. Peronoszpóra rezisztencia Erőteljes élősködő támadása esetében, úgy tűnik, hogy a Run1 gént hordozó genotípusok részleges peronoszpóra rezisztenciát mutatnak. Egyenlőre nem tudható, hogy ez a rezisztencia a Run1 gén indirekt hatásának köszönhető, vagy egy nagyobb introgressz kromoszóma részének. A M. rotundifolia peronoszpóra rezisztenciája, szemben a lisztharmat rezisztenciával, nem monogénikus. Akárcsak a lisztharmat esetében, a peronoszpóra rezisztenciagén kimutatására is alkalmazták a BSA módszerét érzékeny és rezisztens növények populációinál, különböző RAPD anonim és más típusú marker segítségével. A rezisztenciához kötődő markerek kapcsolódási csoportokhoz tartoztak, amiből arra következtettek, hogy a peronoszpóra rezisztencia egyetlen gén ellenőrzése alatt áll. Luo és munkatársai csoport szegregációs analízis, RAPD és SCAR módszerek alkalmazásával próbálták megtalálni a szőlő peronoszpóra rezisztenciagénjét (Luo et al., 2001). 280 Operon primer közül 160 adott polimorf fragmentumot. Egy RADP marker, az OPO06-1500, nagyon erősen kapcsolódott a P.viticola rezisztencia feltételezett fő génjéhez (RPv-1, Resistant of Plasmopara viticola). Mapmarker software analízist használva, kiszámították, hogy az RPv-1 és az OPO06-1500 közötti távolság 1.7 cM. A markert izolálták, klónozták és SCAR markert fejlesztettek belőle (SCO061500).
13 2. ELŐZMÉNYEK A 19. század második felében hozták be Európába Észak-Amerikából a két veszélyes mikrobiális kórokozót. Az Európában termesztett szőlők teljesen védtelenek a betegségekkel szemben. A Vitis és rokon nemzetségek egyes fajai, amelyek kialakulásuk óta együtt éltek a lisztharmattal és peronoszpórával a koevolúció hatásaként rezisztenssé váltak. A 20. században francia nemesítők észak-amerikai vad fajok felhasználásával rezisztens tömegborszőlő fajtákat állítottak elő (frankoamerikai hibridek). Az észak-amerikai szőlőfajok peronoszpóra és lisztharmat rezisztenciája poligénes rendszerben öröklődik, ezért nehéz egy genotípusban kombinálni a magas fokú rezisztenciákat a szintén poligénikusan öröklődő minőséggel. A trópusi származású M. rotundifolia faj monogénesen örökíti a lisztharmat rezisztenciát, peronoszpórával és más kórokozókkal szemben is immunis vagy ellenálló. A kelet-ázsiai Vitis amurensis faj poligénikusan peronoszpóra és agrobaktérium rezisztenciát örökíti. Magyarország jelentős sikereket mondhat magáénak számos értékes szőlőfajta előállításában. A különböző nemesítő műhelyekben a hagyományos módszerek alkalmazásával állítottak elő új fajtákat, fajtajelölteket. Ki kell emelni az 1996-2000 között a Magyar-Amerikai Kutatási Alap által támogatott szőlőnemesítési és genetikai kutatási programot, mely során az észak-amerikai Vitis fajok származékait (franko-amerikai hibridek), a V. amurensis hibrideket használták fel rezisztencia forrásként. 1996-ban magyar-francia fajtacsere keretében került Magyarországra a M. rotundifolia x V. vinifera BC4 hibrid (VRH3082-1-42), amelyet egy 1974-ben indított szőlőnemesítési programban állítottak elő. A M. rotundifolia rokonnemzetségből egy domináns lisztharmat rezisztenciagént tartalmaz. Munkánk során a FVM Pécsi Szőlészeti Borászati Kutatóintézet telephelyén létrehozott 99-1 utódpopuláció egyedeivel dolgoztunk (6. ábra). Az intézet úttörő munkát végez számos komplex hibridek előállításában. A hibrid család keresztezése során szülőként használták fel a M.rotundifolia x V. vinifera BC4 keresztezésből származó VRH3082-1-42 egyedet (Anya), és a Franko-amerikai hibridek x V. amurensis x V. vinifera és Petra (V. amurensis x V. vinifera BC2) keresztezésből származó SK 90-219 egyedet (Apa). Az említett rezisztencia donorokat nagy minőséget adó borszőlő fajtákkal és magvatlan csemegeszőlő fajtákkal keresztezték (1. táblázat, Kozma P., 2003). 1. táblázat: A 99-1 hibrid család genetikai háttere Genetikai háttér
%-os megoszlás
VITIS VINIFERA Malaga Seedling, Cabernet sauvignon, Grenache, Merlot, Aubin, Italia, Traminer, Bouvier, Riesling, Aramon, Cinsaut, Sicilien, Afuz Ali
93,75
100
V. RUPESTRIS, V-BERLANDIERI, V.LABRUSCA, V.LINCENUMI, V.AESTIVALIS, V.CINEREA, V.RIPARIS
3,13
V.AMURENSIS
1,56
MUSCADINIA ROTUNDIFOLIA
1,56
6,25
14
6. ábra: 99-1 populáció eredete Zöld szín jelzi a lisztharmat rezisztens (Run1) egyedeket, míg a piros a peronoszpóra rezisztencia öröklődését mutatja. A sárga egy mind lisztharmatra, mind peronoszpórára gyengébb rezisztenciát mutató fajtát jelez, amelyet szintén szülőként szerepelt a nemesítés során. A családba tartozó (99-1 Kozma jr.,1999) egyedek ellenálló képességét, lisztharmat esetében laboratóriumi és szabadföldi fertőzésekkel tesztelték, a peronoszpóra esetében csak laboratóriumi vizsgálatokat végeztek. (Kozma, 2002; Kozma and Dula, 2003). 2. táblázat: A lisztharmat és a peronoszpóra rezisztencia megoszlása a 99-1 populációban a levéltesztek alapján. Lisztharmat immunis (1), lisztharmat érzékeny (4), peronoszpóra rezisztens (1), peronoszpóra érzékeny (5). P L L1 L2 L3 L4
Összes
Rezisztencia fokozata P1 22 0 6 1 29
P2 36 1 10 12 59 165
P3 39 3 17 18 77
P4 23 3 9 12 47
P5 27 4 36 46 113 160
Total (pcs) 147 11 78 89 325
15 A teszteket elvégezve a lisztharmat ellenállóságát 4 fokozat (1-immunis, 2-, 3-rezisztens, 4érzékeny), a peronoszpóra ellenállóságát 5 fokozat (1-magas rezisztenciát mutató, 2-, 3-rezisztens, 4érzékeny, 5-nagyon érzékeny) szerint értékelték. A vizsgálatok megerősítették azt a vélekedést, hogy a magas fokú lisztharmat rezisztencia kapcsolatban lehet a magas fokú peronoszpóra rezisztenciával. Ezért a két csoport helyett (lisztharmat immunis, lisztharmat érzékeny) négy csoportot választottak ki a különböző fenotípusú kategóriákból (2. táblázat).
16 3. CÉLKITŰZÉSEK Munkánk során a lisztharmat és peronoszpóra rezisztenciát meghatározó génekhez kapcsolt markerek keresését tűztük ki célul, a Magyarországon létrehozott 99-1 hibridcsalád felhasználásával.
1)
Első megközelítésben RAPD kísérletek segítségével kívántuk jellemezni a biológiai tesztekben lisztharmat, illetve peronoszpóra rezisztensnek vagy érzékenynek talált egyedek csoportjait (BSA, Bulk Segregant Analysis), hogy ezen tulajdonságok valamelyikével kapcsolt polimorfizmust találjunk.
2)
További célunk az előzetes tesztekben talált RAPD markerek egyedszintű tesztelésének véghezvitele a teljes 99-1 populáción (325 egyed), a kapcsoltság pontosabb meghatározása érdekében.
3)
Végül a rezisztenciagénnel szoros kapcsoltságot mutató RAPD DNS fragmentumok izolálásával, szekvenciájuk meghatározásával olyan SCAR markerek kifejlesztését terveztük, amelyek a nemesítési munkában a rezisztenciagének valószínű jelenlétének PCR alapú, gyors kimutatását segítik.
17 4. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK 4. 1. Szőlő DNS izolálása A DNS izoláláshoz 1-3g fiatal szőlőlevelet folyékony nitrogénben dörzsöltük szét és 20 ml CEP pufferbe tettük, amihez 100 mg polyvinylpyrrolidont (PVP, Sigma P6755) adtunk (1g levél/100mg PVP). Mindezt jól összeráztuk és 1 órán keresztül 65°C vízfürdőbe indukáltuk, mialatt többször összekevertük. Az egy óra elteltével 20 ml kloroformot (1:1arányban) adtunk hozzá, óvatosan összeráztuk és 30 percig állni hagytuk, közben sűrűn forgattuk. Ezután 10 percig centrifugáltuk (4400 rmp, IEC Centra rotor No 7231). A felülúszót új csőbe mértük és 0,5 térfogatnyi nátrium-klorid oldatot (5M, pH:7.0) és 0,6 térfogatnyi izopropanolt adtunk hozzá. Óvatosan összeráztuk. Következő lépésben 5 percig centrifugáltuk (4400 rmp), majd a felülúszót leöntöttük, alaposan lecsurgattuk és 1ml TE (50:20) oldatban oldottuk fel, amihez 10µl 10 mg/ml DNáz mentes (forralt) RNázt adtunk és 12 óráig szobahőmérsékleten oldódni hagytuk. Ezek után a mintákat három részre osztottuk szét, hogy eppendorf csövekben folytathassuk a munkát. 300µl DNS oldathoz 300µl TES puffert adtunk és 10 perc jégen való inkubálás után 300µl NH4Ac (7,5M, 0°C) oldatot adtunk hozzá. Alapos összekeverés után 10 percig -20°C-ra tettük a csöveket, majd a keletkezett csapadékot ülepítettük (5 perc, 12000 rpm). A felülúszót 500µl-ként új csövekbe óvatosan átpipettáztuk és 0,6 térfogat i-propanollal kicsaptuk a benne lévő DNS-t (20 perc -20°C). Ezután 5 percig centrifugáltuk (12000 rmp) mintákat. A csapadékot 70%-os etilalkohollal mostuk, szárítottuk mintákat és 100µl ioncserélt vízben oldottuk fel (Arnedo-Andres et al., 2002). Oldatok: CEP: 2% CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide), 100 mM Tris, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl, 0,5% β-ME (β-Mercaptoethanol) , TES: TE-ben 10mM Tris (pH:7.5), 1 mM EDTA1% SDS, TE (50:20): 50 mM Tris (pH:7.5), 20 mM EDTA 4. 2. DNS minőségének ellenőrzése A DNS-koncentráció meghatározásához spektrofotométerrel (GeneQuant II) megmértük az oldatok hígításainak optikai denzitását 260 és 280 nm hullámhosszon, és ebből számítottuk ki a koncentrációkat, valamint a fehérje szennyezettség mértékét. Az OD260/OD280 arány mindig 1,6 és 2,0 között volt. A DNS preparátumokból vett mintákat kezelés nélkül, és EcoRI enzimmel emésztve agaróz gélen is elválasztottuk, hogy az RNS, és az enzimreakciót gátló esetleges más szennyezést kimutassuk. 4. 3. PCR reakció A rezisztenciagénekhez kapcsolt markerek keresésének elvégzésére PCR alapú módszereket használtunk fel. A kísérletek során az Operon cég (http://oligos.qiagen.com/stock/rapd_10mer_price.php). dekamer
primersorozataival
azonos
Laboratórium) és végeztük a reakciókat.
primereket
szintetizáltattunk
(MTA
SZBK
Szekvenáló
18 A reakciók általában 24 és 50µl végtérfogatban mentek, ami magába foglalta a 2-5 µl 5-20 µg DNS-t, 6 µl 4X PCR Mix ( 4x Taq buffer, 0.8 mM dNTP, 6mM MgCl2)-t, 1 µl 20 µM dekamer primert, 1µl Taq polimerázt (Fermentas) és a végtérfogat eléréséhez szükséges 3xH2O mennyiséget. Alkalmaztunk még egy PCR mixet, amit közvetlen a reakció összemérése előtt készítettünk el, az F buffert (150 µl 10X Taq Buffer (750 mM Tris-HCl (pH: 8.8), 200 mM (NH4SO4), 0.1 % Tween 20), 144 µl 25mM MgCl2, 3-3 µl 100 mM dNTP, 762 µl 3x H2O) és ebből 20 µl használtunk reakciónkét. A PTC 200 thermocycler gépben a következő programokat alkalmaztuk: RAPD2, OPH2 program esetében 2 perc 95°C, 35 cikluson keresztül 30 másodperc 94°C, 30 másodperc primertől függő annealing hőmérséklet (3. táblázatban feltüntettek), 1 perc 72°C, végül 2 perc 72°C. Speciális programoknál: AN19 program esetében 3 perc 95°C, 4 cikluson keresztül 30 másodperc 95°C, 30 másodperc 58°C, 1 perc 72°C, megint 4 cikluson keresztül 30 másodperc 95°C, 30 másodperc 55°C, 1 perc 72°C, 30 cikluson keresztül pedig 30 másodperc 95°C, 30 másodperc 52°C, 1 perc 72°C. GLP-12 program esetében 2 perc 95°C, 33 cikluson keresztül 30 másodperc 94°C, 30 másodperc 55°C, 1 perc 72°C, és a program végén 5 perc 72°C. 3. táblázat: Az alkalmazott fontosabb primerek és jellemzőik (a dőlt betűsek az általunk tervezett primerek) Primer
Szekvencia
Tm
OPH-19
CTGACCAGCC
36°C
OPN-05
ACTGAACGCC
36°C
OPP-02
TCGGCACGCA
36°C
OPH19-31
CTGACCAGCCCACGCAG
52,9 °C
OPH19-51
CTGACCAGCCTCAATCGATATA
51,2 °C
OPH19-32
TCGTGGATTTAGGGTTTGT
46,9 °C
OPH19-52
TATTGGTTGCGCTTACTTAC
45,3 °C
OPH19-a
GACCAGCCTCAATCGA
43,0 °C
OPH19-y
CTGACCAGCCCACG
41,3 °C
GLP1-12P1
GGAATATTTACTTGGACATCG
55°C
GLP1-12P3
CATTTGAATTGGAGCATACTC
55°C
GLP-sc5
TGCCCACAGAGCAAGTATGA
51,1°C
GLP-sc3
GTTTATATCTTCAACTAGTGCTTAAGTGA
51,9°C
A későbbiekben a meghatározott bázissorrendű régiókra primerpárosokat terveztünk és specifikus reakciókban alkalmaztuk őket. A tervezést a DNASTAR PrimerSelected program segítségével oldottuk meg. Ügyelnünk kellett arra, hogy közel azonos mealting hőmérséklettel rendelkezzenek, ne képezzenek másodlagos szerkezeteket és specifikusan, stabilan kötődjenek (GC:AT aránya biztosítja) a DNS régiókhoz.
19 4. 4. Gélelektroforézis A fragmentumok elválasztására 1% vagy 1.5%-os agaróz gélt használtunk. Az elválasztani kívánt DNS mintához, a végtérfogatnak megfelelően 1/5-nyi 5x STOP (10% ficoll-400, 0.25M EDTA pH: 8.0, 0.2% brómfenolkék) oldatot adtunk. Gélelektroforézist minigél esetén 60 V-on, fragmentizoláláskor 40 V-on, nagy gél esetén 120 V-on végeztük. Kontrollként PstI enzimmel emésztett lambda-DNS-t és 100 bp GeneRuler Ladder DNS kontrollt (Fermentas) alkalmaztunk. Kis fragmentumok elválasztására 1,3 - 1,5%-os gélt, nagy fragmentumok M
esetén 0,7 - 0,8%-os gélt használtunk. Kiértékelést BioDoc-It
fotodokumentációs rendszer
(BioImaging system, www.uvp.com) segítségével végeztük. 4. 5. Fragmentizolálás PCR terméket gélelektroforézis segítségével tisztítottunk. Az izolálni kívánt fragmentum elé a gélbe Whatman DE 81 papírt tettük és 20 perces 60 V feszültség melletti elekroforézis után az izolálandó fragmentum a papírra kerül. Papírt eppendorf csőbe tettük és DNS-t 100µl 1M nátrium-klorid oldattal mostuk le kétszer egymás után. DNS kicsapása 0,1 térfogat 3M nátrium-acetát oldattal (pH:7.0) és 0,6 térfogat izopropanollal történt. 20 perces -20°C-os inkubálás után centrifugáltuk, szárítottuk és 20µl steril desztillált vízben oldtuk fel a csapadékot. 4. 6. Kompetens sejt készítése Kompetens sejtek készítéséhez XL-1 Blue, valamint JM109 E.coli törzset használtunk. 200 ml SOB táptalajban ( 2% Bacto trypton, 0.5% Yeat extract, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, pH 7.0) éjszakán át növesztett baktériumkultúrát 10 percre jégre tettük. A 10 perces centrifugálással (4000 rmp) összegyűjtött sejteket 80 ml hideg TB pufferben (10 mM PIPES, 15 mM CaCl2, 250 mM KCl, pH:6.7) szuszpendáltuk. 10 percig jégen inkubáltuk, majd a centrifugálással összegyűjtöttük a sejteket, és 20 ml hideg TB pufferben szuszpendáltuk.
A szuszpenzióhoz 1.5 ml DMSO-t adtunk, a sejteket
eppendorf csövekbe szétosztva -80°C-os hűtőben fagyasztottuk és tároltuk transzformációig (Inoue et al., 1990). 4. 7. Ligálási reakció A ligálási elegyet, vektor DNS, fragmentum DNS, ligáz puffer (5x koncentráció: 200 mM Tris-HCl, 50mM MgCl2, 50mM dithiotreitol (DTT) 2,5 mM ATP, pH 7,8) és steril víz felhasználásával készítettük. A reakcióhoz T4 DNS ligázt használtunk, és az elegyet legalább 2 óráig szobahőmérsékleten inkubáltuk.
20 4. 8. Transzformálás Egy transzformáláshoz 100µl kompetens sejtet használhatunk fel. A sejteket -80°C - ról jégre tettük. És 15 perc eltelte után hozzáadtuk a transzformációhoz használt DNS-t. 20 percig jégen inkubáltuk, majd 3 perces 37°C-os hősokkot alkalmaztunk. A hősokk után 400µl SOC oldatot (2% Bacto trypton, 0.5% Yeast extract, 10mM NaCl, 2.5 mM KCl, 20mM glükóz, pH 7.0) adtunk a sejtekhez. Egy óra 37°C-os indukáció után a sejteket szelektív táptalajra tettük. PBluescript használata esetén a táptalajba 40µl IPTG (100mM) és 40µl Xgal oldatot (2% dimetil-formamidban) tettünk, és a transzformánsokat kék-fehér screen segítségével detektáltuk. 4. 9. Escerichia coli növesztése Az E. coli törzseket LB (Sambrook et al., 1989) táptalajon 37°C-on növesztettük. A táptalajt készítésekor 1,5 % agarózzal egészítettük ki. A táptalaj a megfelelő antibiotikumokat tartalmazta, tetraciklint (15µg/ml) és ampicilint (200µg/ml), adott végkoncentrációban. 4. 10. Plazmid DNS izolálása A plazmid DNS-t E.coli esetén 3-3 ml LB tápfolyadékban, a megfelelő antibiotikum jelenlétében egész éjszakán átnövesztett sejtekből Ish-Horowicz és Burke szerint alkalikus lízissel preparáltuk (IshHorovicz and Burke, 1981). 1,5 ml kultúrát Eppendorf-csőbe tettük és a sejteket centrifugálással ülepítjük. A sejteket 100µl TEG oldatban (25 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 50 mM glükóz, pH: 8.0 ) szuszpendáljuk fel. A feltárást óvatosan keverés mellett 200µl NS oldat (0,2 N NaCl, 1%SDS) hozzáadásával végeztük. A mintákat 5 percig 0°C-on inkubáltuk, majd erős rázással 160µl hideg Naacetát oldatot (3M, pH:4.8) adtunk hozzájuk. 5 perces 0°C-on történő inkubálás után 5 percig centrifugáltuk, és a felülúszóból 400µl izopropanollal kicsaptuk a plazmid DNS-t. 10-15 perc –20°C-on történő inkubálás után a csapadékot mostuk 70%-os etanollal, centrifugáltuk és szárítottuk, majd 3050µl H2O-Rnase (50-100µg/ml) oldatban feloldottuk. 4. 11. DNS szekvenálás Az izolált klónokat, illetve PCR fragmentumokat az MTA Szegedi Biológia Központ Szekvenáló Laboratóriumába küldtük DNS szekvenciájuk meghatározása céljából.
21 5. EREDMÉNYEK ÉS MEGVITATÁSUK 5. 1. DNS izolálása A rendelkezésre álló szőlőleveleket a pécsi FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet telephelyén gyűjtöttünk be, a két szülő egyedről (apa: Pannonija, anya: Roti BC4) és az utódpopuláció mintegy 140 tagjáról, amelyek lisztharmat és peronoszpóra érzékenységét levéltesztekben és a szabadföldi körülmények között is meghatározták. Ennek eredményét foglalja össze az 1. táblázat (2. fejezet). A fiatal, egészséges levelek DNS-ét először DNAeasy Plant Mini Kit módszer (Quiagen) segítségével izoláltuk, de ezzel a módszerrel viszonylag kis mennyiségű DNS-t sikerült nyerni, ami kevés RAPD analízisre lett volna elegendő. Ezért nagyobb mennyiségű növényi anyagból indultunk ki. A fagyasztással, szétdörzsöléssel és CTAB segítségével történő feltárást, PVP és kloroform segítségével való tisztítási lépések és alkoholos kicsapás követték (4. 1. fejezet). Az izolált DNS-t koncentrációmérés, gélelektroforézis és PCR kísérletek alapján minősítettük. Átlagosan az 1 g-nyi levélből kiindulva 50-100 mg DNS-t sikerült izolálnunk. A RAPD mintázatok összehasonlíthatósága és kiértékelhetősége érdekében minden mintából egyenlő koncentrációjú oldatokat higítottunk, amelyekben a koncentrációt 5 ng/µl-ben határoztuk meg. 5. 2. Csoport szegregációs analízis RAPD segítségével Munkánk során a csoport szegregációs analízis (BSA, Bulk Segregant Analysis) módszerét alkalmaztuk a RADP kísérletekben. A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens illetve szenzitív csoportokból (L1P1 és L4P5 csoportok) 10-10 egyedet választottunk ki. Ezek DNS preparátumából 5 ng/µl koncentrációjú oldatot készítettünk, majd egyenlő térfogatokat mértünk össze, a kialakított csoportoknak megfelelően. A tesztelések során egy harmadik csoportot is alkalmaztunk, amely lisztharmatra rezisztens és peronoszpórára szenzitív egyedeket foglalt magába (L1P5 csoport), annak érdekében, hogy a csoportok közötti különbségeket ezzel tovább jellemezhessük. Ezzel a módszerrel kívántuk kimutatni azokat a RAPD markereket, amelyek a rezisztens vagy szenzitív egyedek többségében előfordulnak, azaz kapcsoltságot mutatnak e tulajdonságok valamelyikével. Először a szülőkön teszteltük a RAPD dekamer primereket, a RADP2 PCR program segítségével (4. 3. fejezet). Az eredményekből arra következtettünk, hogy nagy részük jól működik a mintákon. Sok esetben sikerült eltérő mintázatot kimutatni a két szülő között (7. ábra). A továbbiakban az utód csoportok
tesztelésénél
azokkal
a
primerekkel dolgoztunk,
amelyek
különböző
mintázatot
eredményeztek a szülőknél. Most már a rezisztens és szenzitív csoport között próbáltunk eltérő mintázatot keresni. A várakozásoknak megfelelően a tesztelt primerekkel csak néhány esetben kaptunk különbséget a csoportok között (8. ábra). Munkánk során eddig mintegy 460 szintetizált (dekamer) primer tesztelését végeztük el a RAPD kísérletekben. Ebből 148 mutatott ki polimorfizmust a szülők között, a csoportok között pedig 21. Azaz 21 esetben találtunk valamiféle kapcsoltságot a polimorfizmus és az egyik rezisztenciagén között. A polimorfizmust mutató primerekkel további tesztelést végeztünk a csoportokat alkotó egyedi DNS-mintákon. A 10-10 egyed elemzése alapján 3 primer esetében tűnt a kapcsoltság olyan szorosnak, hogy ezekkel érdemesnek találtuk mind a 140 egyed tesztelését elvégezni.
22 A szülök tesztelését és a csoportok elemzését mind a 460 primerrel elvégeztük és minden olyan reakciót, amelyben a primerek nem működtek, vagy amelyek esetében polimorfizmus volt kimutatható, többször is megismételtünk. Ez azt jelenti, hogy mára közel 4000 RADP reakciót végeztünk el.
7. ábra: A szülők eltérő mintázata RAPD kísérletekben P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. A tesztelt primerek elnevezése a gélkép alján látható.
8. ábra: Csoport szegregációs analízis (BSA) P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), A= L1P1, lisztharmat és peronoszpóra rezisztens csoport, B= L4P5 szenzitív csoport, L= 100 bp DNS ladder kontroll. A tesztelt primerek elnevezése a gélkép alján látható. A tesztelések során kapott eredményekből arra következtettünk, hogy a csoport szegregációs analízis nem mindig megbízható. Sok esetben eltért a csoporttal kapott eredmény az azt követő egyedszintű vizsgálat eredményétől, mert a csoportok között volt eltérés, de ezt az egyedi tesztnél nem lehetett kimutatni. Ebből következően az egyedszintű tesztelést biztosabbnak tartottuk így a primerek tesztelését 3 rezisztens, illetve 3 szenzitív egyedből származó egyedi DNS-minta segítségével folytattuk.
23 5. 3. Egy peronoszpóra rezisztenciagénnel kapcsolt RAPD marker jellemzése Eddig egy primert találtunk, amely különbéget mutatott a csoportos, és az ezt követő egyed szintű teszteléskor is a peronoszpórára szenzitív és rezisztens egyedek között (9. ábra). Az ábrán a nyíllal jelzett fragmentum a kettős rezisztens (L1P1) minták mindegyikében megtalálható. Az L4P5 kettős érzékenységet mutató egyedek közül csak egyben, míg a csak lisztharmat rezisztens (L1P5) egyedek mintáiban egyben sem mutatható ki. Tehát ez a marker egy peronoszpóra rezisztenciával összefüggő gén közelében lehet.
9. ábra: Az OPN-05 primer egyedszintű tesztelése A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyedek, és a csak lisztharmat rezisztens (L1P5) egyedek polimorfizmusa. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. A nyíl a polimorfizmust mutató fragmentumot jelzi, ami egy esetben egy L4P5 egyedben is látható (karika). Az OPN-05 primerrel összesen 39 egyedet vizsgáltunk meg. Eredményeinket a 4. táblázatban foglaltuk össze. Ebből megállapítható, hogy a rekombináns utódok száma nagy, hiszen a 39 vizsgált egyed közül összesen 10 nem szülői kombinációt mutató, rekombináns. 4.táblázat: OPN-05 primer tesztelésének eredménye A zöld mezőben a rekombinánsok száma látható. vizsgált utódok
DNS-markert
DNS-markert
száma
tartalmaz
nem tartalmaz
Rezisztens utód (L1P1)
24
22
2
Szenzitív utód (L1P5, L4P5)
15
8
7
Ezekől az adatokból arra következtettünk, hogy a marker távol helyezkedik el a keresett géntől. Ennek ellenére a vizsgálatot ki kívánjuk terjeszteni az összes utódra, hogy a pontos arányokat meg tudjuk határozni.
24 5. 4. Lisztharmat rezisztenciagénnel kapcsolt RAPD markerek jellemzése Az OPN-05 RAPD marker kimutatásával és tesztelése mellett, két másik primerrel sikerült különbséget találnunk a lisztharmatra rezisztens és szenzitív egyedek között. A 10. ábrán látható, hogy a nyíllal jelezett különbséget adó fragmentum a dupla rezisztens (L1P1) csoport minden egyedében megjelenik, míg a szenzitív (L4P5) egyedek egyikében sem.
10. ábra: OPH19 primer egyedszintű tesztelés A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyedek. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll. A nyíl a polimorfizmust mutató fragmentumot jelzi, ami egy L4P5 egyedben sem látható. A további vizsgálatokból kiderült, hogy az OPH19 primerrel kimutatható polimorfizmus a lisztharmat rezisztenciával mutat szoros kapcsoltságot. A populáció 120 egyedén végeztük el eddig a RAPD kísérletet. A rezisztens utódok esetében 61 mintából csak 1 nem tartalmazta a különbséget adó fragmentumot. A szenzitívek esetében lényegesen nagyobb a rekombinánsok száma (5. táblázat). Az eredmények azonban jól jelzik, hogy az OPH19 primer segítségével kimutatott marker a lisztharmat rezisztenciagén közelében helyezkedhet el. 5.táblázat: Az OPH-19 primer tesztelésének eredménye A sárga mezőben a rekombinánsok száma látható. vizsgált
DNS-markert
DNS-markert
utódok száma
tartalmaz
nem tartalmaz
Rezisztens utód (L1P1, L1P5)
61
60
1
Szenzitív utód (L4P5)
59
16
43
A tesztelése során találtunk még egy primert, amellyel sikerült a lisztharmat rezisztens és szenzitív egyedeket elkülönítenünk. A primer tesztelése tipikus esete volt a csoportos elemzések bizonytalanságának. A BSA analízis során a primer segítségével nem lehetett a csoportok között különbséget mutatni, de az ezt követő egyedszintű teszteléskor igen (11. ábra). Jól látható az ábrán,
25 hogy a nyíllal jelzett különbéget adó fragmentum minden rezisztens (L1P1) egyedben megtalálható, míg a szenzitívekből (L4P5) nem mutatható ki.
11. ábra: Az OPP-02 primer egyedszintű tesztelése A lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyedek polimorfizmusa. P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= Lambda PstI kontroll, M1=L1P1mix, M2=L4P5 mix. A nyíl a polimorfizmust mutató fragmentumot jelzi. A populáció 110 egyedén végeztük el eddig a primer tesztelését, amelyek közül csak 5 volt rekombináns. A rezisztensek esetében 2, a szenzitívek esetében 3 egyed volt a szülői kombinációtól eltérő, így ebben az esetben a két kategóriában található rekombinánsok között nem volt szembetűnő számbeli különbség (6. táblázat). 6. táblázat: Az OPP-02 primer tesztelésének eredménye A sárga mezőben a rekombinánsok száma látható. vizsgált
DNS-markert
DNS-markert
utódok száma
tartalmaz
nem tartalmaz
Rezisztens utód (L1P1, L1P5)
56
54
2
Szenzitív utód (L4P5)
54
3
51
26 5. 5. Egy Run1 génnel kapcsolt marker kimutatása a 99-1 populációban Annak érdekében, hogy megállapítsuk, hogy markereink a M. rotundifolia rokonnemzetségből származó Run1 génhez kapcsoltak, Donald és munkatársai által már megtervezett primer párral teszteltünk néhány rezisztens és szenzitív egyedet (1. 3. 1. fejezet, Donald et al, 2002). A GLP12P1/P3 primerekkel végzett PCR reakció (4. 3. fejezet, GLP12 program) egy 870 bp nagyságú fragmentumot eredményezett mind a rezisztens, mind a szenzitív egyedek esetében. Ezt a terméket EcoRI enzimmel emésztettük, hogy az irodalomban leírt, rezisztenciához kapcsolt EcoRI hely jelenlétét kimutassuk. A várakozásoknak megfelelően a rezisztens mintáknál egy 670 bp és egy 200 bp méretű fragmentumot is kaptunk, míg a szenzitívek esetében csak a 870 bp méretű PCR termék volt jelen. Ezek alapján már el tudtuk különíteni az egyedeket a PCR termékben lévő EcoRI hasítóhely szerint (12. ábra).
12. ábra: A Run1 gén jelenlétének igazolása 2-2 lisztharmat és peronoszpóra rezisztens (L1P1), illetve érzékeny (L4P5) egyed, R= Roti BC4 (Anya), P= Pannonija (Apa), L= 100 bp DNS ladder kontroll A leírtak alapján összesen 104 egyed tesztelését végeztük el a primerpárossal és a vártaknak megfelelően hasonló eredmények születtek. Összesen öt egyedet találtunk, amelyek esetében a PCR fragmentumon található EcoRI hely jelenléte nem volt összefüggésben a rezisztenciagén jelenlétével. Két rezisztens kategóriába tartozó egyednél nem tudtuk kimutatni a marker jelenlétét, és egy olyan szenzitív kategóriába tartozó egyedet találtunk, amelyek a rezisztensekre jellemző markert (EcoRI hely) tartalmazták (7. táblázat). 7. táblázat: A GLP12-P1/P3 primerek tesztelésének eredménye A kék mezőben a rekombinánsok száma látható. vizsgált
DNS-markert
DNS-markert
utódok száma
tartalmaz
nem tartalmaz
Rezisztens utód (L1P1, L1P5)
54
52
2
Szenzitív utód (L4P5)
50
1
49
27 5. 6. A DNS-markerek és a Run1 gén elhelyezkedése Eddig két RAPD markert találtunk, amely erős kapcsoltságot mutatott a lisztharmat rezisztenciával (OPH-19, OPP-02). Ezeken kívül igazoltuk egy irodalomban leírt marker kapcsoltságát is (GLP12). Ha a rekombináns utódokban mindhárom tulajdonság jelenlétét megvizsgáljuk, megállapíthatjuk, hogy az OPH-19 és OPP-02 markerek között is történt rekombináció (8. táblázat). Bárhogy is helyezzük el egymáshoz viszonyítva a két markert, mindenképpen van egy egyed, amelyben kétszeres rekombinációt kell feltételezni. Ha a markerek sorrendje megegyezik a 8. táblázatban feltüntetettel, akkor az L4,OPP-02,(-) egyed a kétszeres rekombináns, ha pedig feltételezzük az OPP-02, L1, OPH19 sorrendet, akkor az L1(-),(-) egyed az. Ennek az eseménynek mindenképpen sokkal ritkábbnak kellene lennie, így az eredmények ellentmondást tartalmaznak. A 8. táblázatban található két olyan L1 (rezisztens) egyed, amelyben egyik allél sem jelenik meg (kékkel jelöltek), és egy L4 (szenzitív) egyed, amelyben mindegyik megtalálható (sárgával jelölt). Ezek esetében elképzelhető, hogy a biológiai rezisztencia teszt eredményei nem helytállóak, ezért esetükben a megfelelő allélok jelenlétének igazolására szükséges megismételni a biológiai és a DNS tesztet is. 8. táblázat: A GLP12-P1/P3, OPH-19 és OPP-02 RAPD allélek előfordulása az utódokban Kék és sárga színnel jelöltek a rekombinánsok Rezisztencia allél
GLP12-P1/P3
OPP-02
OPH-19
Egyedszám
L1
GLP12-P1/P3 +
OPP-02 +
OPH-19 +
44
L1
-
-
-
2
L4
GLP12-P1/P3 +
OPP-02 +
OPH-19 +
1
L4
GLP12-P1/P3 +
OPP-02 +
-
2
L4
-
-
OPH-19 +
11
L4
-
-
-
25
A jelenlegi adatok alapján talán az OPP-02, L1(GLP12), OPH-19 sorrend valószínűbb (13. ábra). Abban az esetben, ha minden RAPD marker a rezisztenciagén egyik oldalán helyezkedne el, olyan közel lennének egymáshoz, hogy feltehetően nem "látnánk" közöttük rekombinációt. Ha viszont a RAPD markerek a rezisztenciagén két oldalán helyezkednek el, akkor nagyobb valószínűséggel jöhetnek létre a 8. táblázatban látható variációk.
13. ábra: A RAPD markerek lehetséges elhelyezkedése
28 5. 7. SCAR markerek kialakítása A lisztharmat rezisztenciához kapcsolt RAPD markerek mindegyike alkalmasnak tűnik a marker segítette szelekció (MAS) módszer alkalmazásához új, rezisztens szőlőfajták nemesítésében. Annak érdekében, hogy a nehézkesebb RAPD eljárásnál könnyebben lehessen a megfelelő marker jelenlétét detektálni, SCAR markerek kifejlesztését határoztuk el. Az OPH-19 primerrel polimorfizmust mutató fragmentum (mintegy 750 bp) izolálását az egyik szülői mintából (Roti BCR4) végeztük el. Először kivágtuk az agaróz gélből a megfelelő fragmentumot tartalmazó darabot, kicsaptuk az izolálandó fragmentumot, majd Taq, illetve Pfu polimerázok segítségével, egy újabb reakcióban megsokszoroztuk, az OPH-19 primert alkalmazva (14. ábra). Az ily módon izolált fragmentumot pBluescrpit vektorba ligáltuk, majd transzformáltuk E.coli sejtekbe. Ezt követően a megfelelő transzformánsokból (fehér telepek) plazmid DNS-t izoláltunk, restrikciós endonukleázok segítségével ellenőriztük, hogy valóban tartalmaznak-e inszertet és meghatároztuk annak bázissorrendjét (4. 7-10. fejezet).
14. ábra: SCAR marker kifejlesztése. Az OPH-19 primerrel felsokszoroztuk a polimorfizmust adó izolált DNS-fragmentumot. A PCR reakcióban használt DNS templátok: P= Pannonija (Apa) összes DNS, R= Roti BC4 (Anya) összes DNS, 1. a 750 bp izolált fragmentumTaq enzimmel való sokszorozása, és 2. a Taq reakció után 4 ciklusban Pfu enzimmel fejeztük be az amplifikálást. L= 100 bp DNS ladder kontroll. Ezután az ismert szekvenciát bioinformatikai eszközökkel elemeztük, különböző adatbázisokkal hasonlítottuk össze a Blast (Altschul et al. 1997) programcsalád segítségével. A szekvencia A és T bázisokban gazdag (15. ábra), nem található hozzá hasonló szekvencia az adatbázisokban.
29
15. ábra: Az izolált fragmentum szekvenciája és a rá tervezett specifikus primerek (OPH-19, OPH-19-31/51, OPH-19-32/52) A bázissorrend ismeretében kettő specifikus primerpárost terveztünk (15. ábra). A OPH19-31 és OPH19-51 külső primereket, amelyek a teljes, 754 bp nagyságú szakasz megsokszorozását eredményezik, és az OPH19-32, OPH19-52 belső primereket, amelyek egy 500 bp nagyságú fragmentumot adnak. A tervezett primereket először az OPH2 program (4. 3. fejezet) segítségével teszteltük. Érdekes módon, minden egyednél megfigyelhető volt az 500 bp nagyságú belső fragmentum, és néhány esetben a szenzitív egyedekben is megjelent a 754 bp nagyságú teljes fragmentum. Ebből arra következtettünk, hogy minimális a szekvencia eltérés a két allél között és a reakció körülményeken illetve a primerek szekvenciáján kell változtatnunk, hogy sikerüljön a SCAR markert létrehozni. Elsőként változtattunk a külső primerpáros szekvenciáján (OPH19-a és OPH19-y) és utána megpróbálkoztunk az ún. touch-down technika alkalmazásával, hogy a PCR reakciót
30 specifikussá tegyük. Ez sikerült is (4. 3. fejezet, AN19 program) azzal a hibával, hogy egy 500 bp nagyságú fragmentum is megjelenik a megsokszorozott DNS-ben (16. ábra). Igaz azonban az, hogy a tervezett külső primerpáros specifikus módon, csak a lisztharmat rezisztens egyedekből sokszorozza fel mindkét fragmentumot, így sikerült a SCAR marker létrehozása.
16. ábra: SCAR markerek tesztelése (P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll, 1=szenzitív egyed, 2= rezisztens egyed, OPH19-31/51= tervezett primer és rövidített változata az OPH19-a/y) Miután a GLP12-P1/P3 primerekkel végzett reakció során kapott 870 bp nagyságú fragmentum EcoRI emésztésével el tudtuk különíteni a rezisztens és szenzitív egyedeket, annak érdekében, hogy könnyebben lehessen a marker jelenlétét detektálni és, hogy marker segítette szelekció (MAS) módszer során alkalmazható legyen, szintén SCAR markerek kifejlesztését határoztuk el. Ezt követően izoláltuk a felsokszorozott 870 bp nagyságú fragmentumot mindkét szülői mintából (4. 5. fejezet), pBluescrpit vektorba ligáltuk és transzformáltuk E.coli sejtekbe (4. 7-9. fejezet). Ezután a megfelelő transzformánsokból (fehér telepek) plazmid DNS-t izoláltunk, restrikciós endonukleázok segítségével
ellenőriztük,
hogy
valóban
tartalmaznak-e
inszertet
és
meghatároztattuk
bázissorrendjüket (4. 10. fejezet). Majd az ismert szekvenciákat bioinformatikai eszközökkel elemeztük. A DNASTAR SeqMan program segítségével összeillesztettük a mintákat és először arra lettünk figyelmesek, hogy a rezisztens és a szenzitív szülő közötti különbséget egy 16 bp nagyságú deléció eredményezi. Valamint az is látható, hogy a szenzitív egyedben az EcoRI endonukláz felismerő helyében báziseltérés van, és ebből adódóan esetükben nincs emésztődés (17. ábra).
17. ábra: A különbséget eredményező deléció (1.seq=Eredeti GLPL régió, 2.seq=szenzitív szülő (Pannonija, Apa), 3.seq=rezisztens szülő (Roti BC4, Anya))
31 Ezután a szekvencia ismeretében primerpárost terveztünk a régióra. Az GLP-sc5 és a GLP-sc3 primereket, amelyek egy 792 bp nagyságú szakasz megsokszorozását eredményezik. A tervezéskor figyelembe vettük a deléciót, ami azt jelenti, hogy a primerpáros egyik tagja erre a szakaszra lett tervezve, így segítségükkel csak a rezisztens egyedekben kell PCR terméket kapnunk. A tervezett primereket először az GLP12 program (4. 3. fejezet) segítségével teszteltük. Érdekes módon, a szenzitív szülőben is megfigyelhető volt a 792 bp nagyságú fragmentum (18. ábra).
18. ábra: SCAR marker tesztelése (Re= rezisztens egyed (L1P1), S=szenzitív egyed (L4P5), P= Pannonija (Apa), R= Roti BC4 (Anya), L= 100 bp DNS ladder kontroll) Ebből arra következtettünk, hogy olyan allél is létezhet, amely nem tartalmazza ugyan az EcoRI helyet, de a deléciót sem, ezért a tervezett primer nem allél-specifikus. Annak érdekében, hogy ezt tisztázzuk további független klónokat kell megvizsgálnunk.
32 6. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JÖVŐBENI MUNKÁK Eddigi munkánk során sikerült egy olyan módszert kidolgoznunk, amely segítségével megfelelő mennyiségű DNS-t tudunk izolálni a szőlő egyedekből a RAPD PCR reakciók végrehajtására. Megállapítottuk, hogy a csoport szegregációs módszer nem megbízható, mert a csoportok közötti polimorfizmus nem minden esetben mutatható ki az egyedszintű tesztelés során. Ezért ezt követően a primerek tesztelését 3 rezisztens, illetve 3 szenzitív egyed és a szülők DNS-mintáinak segítségével folytattuk. Három olyan markert találtunk, amelyek esetében egyedszintű vizsgálattal igazolni lehetett a kapcsoltságot. Mindhárom marker esetében izoláltuk a polimorfizmust mutató fragmentumot és meghatároztuk bázissorrendjüket. Az OPH-19 marker esetében sikerült specifikus SCAR markert kifejlesztenünk. A másik kettő marker esetében még munkálatok folynak. A továbbiakban tökéletesítjük az eddig tervezett SCAR markereinket, megpróbáljuk a hibákat kiküszöbölni és folytatjuk a rezisztenciagénekhez szorosan kapcsolódó több DNS marker sikeres azonosítását és jellemzését, hogy tovább könnyíthessük a klasszikus nemesítők munkáját és hogy bekapcsolódhassunk abba a nemzetközi együttműködésbe, amely a gén, gének izolálását tűzte ki célul.
33 7. ÖSSZEFOGLALÁS A szőlő jelentős mikrobiális kórokozói a lisztharmat és a peronoszpóra, amelyek ellen hosszú idők óta vegyszeres védekezést kell folytatni. A molekuláris biológia fejlődése ennek a területnek is segítséget hozott. A természetes rezisztenciagének a hozzájuk kapcsolódó DNS-markerek megkeresésével térképezhetők és izolálhatók. Munkánkkal a szőlőnemesítők számára szeretnénk segítséget nyújtani, a rezisztenciagénekhez kapcsolt DNS-markerek azonosítása révén. Vizsgálatainkat egy M. rotundifolia x V. vinifera x Franko-amerikai származású hibridcsaládon végeztük. A családot mesterséges és természetes fertőzéssel tesztelték mindkét kórokozóra. Az így jellemzett utódokkal kezdtük el a munkát. A növények leveleiből DNS-t izoláltunk, majd dekamer primerek segítségével RAPD (random amplifikált polimorf DNS) elemzését végeztünk. A szülőkön tesztelve a primereket arra a következtetésre jutottunk, hogy azok nagy része működik, és a legtöbb RAPD kísérlet eltérő mintázatot eredményez. Ezek után csoport szegregációs analízis módszerét alkalmaztuk. Először mindkét betegséggel ellenálló (L1P1), illetve szenzitív (L4P5) csoportokat alakítottunk ki az egyedekből nyert DNS felhasználásával. És ezeken teszteltük a szülők esetében különbségeket eredményező primereket. Eddig mintegy 460 primerrel végeztük el ezt a kísérletet. A csoportok között eltérő mintázatot mutató primerekkel, ahol a polimorfizmus megjelenése ez egyik rezisztenciagénnel való kapcsoltságot jelez, az egyedszintű tesztelést is elvégeztük (140 egyed). Eddig három olyan polimorfizmust találtunk, ahol egyed szintű vizsgálattal igazolni lehetett a kapcsoltságot. Két, lisztharmat rezisztenciához kötődő RAPD markerről megállapítottuk, hogy hozzávetőlegesen 1 centimorgan távolságra lehetnek a rezisztenciagéntől, ezért elhatároztuk, hogy szekvencia szinten jellemzett (SCAR) markert fejlesztünk ki belőlük. Valamint igazoltuk, hogy markereink a Run1 lisztharmat rezisztenciagénnel kapcsoltak. Mindhárom marker esetében már izoláltuk a polimorfizmust mutató DNS-szakaszokat és meghatároztuk bázissorrendjüket. Ennek ismeretében az egyik esetében, olyan specifikus primerpárt tervezhettünk, amelynek segítségével megvalósítható a markerhez kapcsolt szelekció a nemesítési munkában. Folytatjuk a RAPD markerek keresésére irányuló munkánkat, amelynek célja a lisztharmat vagy peronoszpóra rezisztenciagén(ek)hez szorosan kapcsolt több DNS marker azonosítása, jellemzése. Ezzel nemcsak a klasszikus nemesítő munkát könnyítjük meg, hanem segítjük a gének izolálását célzó kísérleteket is.
34 8. IRODALMI HIVATKOZÁSOK Arnedo-Andres, M.S., Gil-Ortega, R., Luis-Arteaga, M., and Hormaza, J.I. (2002) Dvevelpoment of RAPD and SCAR markers linked to the Pvr4 locus for resistance tp PVY in pepper ( Capsicum annuum L.). Theor Appl Genet 105: 1067-1074. Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., and Davis, R.W. (1980) Construction of a genetis linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Amer J Human Genet 32: 314-331. Dalbó, M.A., Ye, G.N., Weeden, N.F., Steinkellner, H., Sefc, K.M., and Reisch, B.I. (2000) A gene contolling sex in grapvines placedon a molcular marker based genetis map. Genom 43: 333-340. Donald, T.M., Pellerone, F., Adam-Blondon, A.-F., Bouquet, A., Thomas, M.R., Dry, I.B. (2002) Identification of resistance gene analogs linked to a powdery mildew resistance locus in grapvine. Theor appl Genet 104: 610-618. Gadoury, D.M., Seem, R.C., and Wilcox, W.F. (1997) Early ontogenic resistance to dowdery moldew in Chardonnary and Riesling grapes. Phytopathology 87: 31. Hajósné-Novák, M. (1999) Genetikai variábilitás a növénynemesítésben. Budapest: Mezőgazda Kiadó. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990) High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96: 23-28. Ish-Horovicz, D., and Burke, J.F. (1981) Rapid and efficient cosmid cloning. Nucl. Acids Res. 9: 29892998. Kan, Y.W., and Dozy, A.M. (1978) Polymorphism of DNA sequence adjacent to human b-globin structural gene:relationship to sickle mutation. PNAS 75: 724-732. Kiefer, B., Riemann, M., Büche, C., Kassemeyer, H.-H., and Nick, P. (2002) The host guides morphogenesis and stomatal tardeting in the grapvine pathogen Plasmopara viticola. Planta 215: 387-393. Kozma, P. (2002) Goals and methods in grape resistance breeding in Hungary. Int J Hort Sci 8: 41-46. Kozma, P., and Dula, B. (2003) Creating of new grape hybrids with complex resistance. In 1th Int. Symp on Grapevine: growing, commerce and research Lissbon, pp. 121. Lodhi, M.A., Daly, M.J., Ye, G.N., Weeden, N.F., and Reisch, B.I. (1995) A molecular marker based linkage of Vitis. Genom 38: 786-794.
35 Luo, S.L., He, P.C., Zhom, P., and Zhung, X.Q. (2001) Identification of molecular genetis markers tightly linked to downy mildew resistant genes is grape. Acta Genet Sin 28: 76-82. Paran, I., and Michelmore, R.W. (1992) Sequence characterized amplified regions (SCARs) as a codominant genetic marker in Lactuca spp. Theor appl Genet 85: 985-993. Pauquet, J., Adam-Blondon, A.-F., Rousseau, S., Peros, J.-P., and Bouquet, A. (1998) Tagging a Muscandia rotundifolia originated powdery mildew resistance gene in Vitis vinifera. In Preceedings of 7th International Symposion on Grapevine Genetics and Breeding Montpellier, France. Pauquet, J., Bouquet, A., This, P., and Adam-Blondon, A.F. (2001) Establishment of a local map of AFLP markers around the powdery mildew resistance gene Run1 is grapvine and assessment of their usefulness for marker assisted selection. Theor Appl Genet 103: 1201-1210. Sambrook, J., Fritsch, E.F., and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual - 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Tanksley, S.D., and Orton, T.J. (1983) Isozymes in plant genetics and breeding. Amsterdam, Oxford, New York: Elsevier. Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Rijans, M., Van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M., and Zabeau, M. (1995) AFLP: a new techique for DNA fingerprinting. Nucleis Acids Res 23: 4407-4414.
36 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet mondok témavezetőmnek, Dr. Putnoky Péternek munkám irányításáért, önzetlen segítségéért, bírálataiért és a problémák megoldásában nyújtott segítségéért. Köszönettel tartozom Dr. Jakab Gábornak és Dr. Hoffmann Gyulának, hogy munkámat értékes megjegyzéseikkel és tanácsaikkal segítették. Külön köszönettel tartozom Dr. Kozma Pálnak, a pécsi FVM Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet igazgatójának a munka során biztosított növényi anyagokért és értékes tanácsaiért. Köszönöm diákkörös társamnak, Takács Attilának és a tanszéken dolgozó laboránsoknak, Miklósvári Zoltánné Maricának és Garai Krisztinának a kísérletek technikai hátterének segítségét és biztosítását.
