I rostliny mají hormony ! ... co a jak s auxinem Eva Zažímalová Ústav experimentální botaniky AV ČR, Praha
Rostliny a tvarová (a vývojová) různorodost
Reakce na okolní prostředí
Reakce na nepříznivé podmínky Živočich: reakce behaviorální
Vnitřní vývojový program geneticky daný
Vnější signály mnoho aspektů okolního prostředí (fyzikální, chemické i biologické) zásadně působí na vývoj rostliny (růst)
(Buchanan et al., 2001)
Reakce na životní podmínky: Živočich:
Rostlina:
behaviorálně
vývojově/růstově
Organogeneze není u rostlin ukončena v embryonálním stadiu
– rostlina NENÍ zelený živočich Nutnost koordinace vývoje – časově, prostorově
Jak?
Signální molekuly !
Fytohormony
auxiny cytokininy gibereliny kyselina abscisová ethylen brasinosteroidy polyaminy kyselina jasmonová kyselina salicylová systemin, atd.
Růstové regulátory rostlin
(fenolické látky) syntetické regulátory
Fytohormony nebo růstové regulátory rostlin
???
"Klasické" rostlinné hormony
Nejvýznamnější typy fytohormonů - přehled
Organogeneze a morfogeneze – auxiny a cytokininy Tvorba kořenů na mediu obsahujícím pouze auxin (IBA), tvorba prýtů při vysokém poměru cytokinin (zeatin): auxin (IBA)
Objev auxinu Fritz Went (1928) koleoptile ovsa
Auxin a jeho úloha v regulaci základních fyziologických procesů u rostlin Regulace buněčného dělení a jeho polarity
Organogeneze (Benková et al., 2003)
(Petrášek et al. 2002)
‘Patterning’
Fylotaxe
(Friml et al., 2002)
(Reinhardt et al., 2003)
Embryogeneze
Tropismy
(Friml et al., 2003)
(Friml et al., 2002)
Dostupnost auxinu v buňkách a v buněčných kompartmentech rostlin
biosyntéza
(de)konjugace
degradace
metabolismus příjem signálu a jeho přenos
import (influx) export (efflux)
intercelulární tok
Transport of auxins at the cellular level: Auxins = weak organic acids
HA pH
IAA
H+
+ A-
pH
IAA-
pH = 5.5:
~ 20%
~ 80%
pH = 7.0:
~0
~100%
Struktury a procesy podílející se na transportu auxinů do buňky a z buňky 20% IAA
80% IAA- + H+
pH 5,5
pH 7,0
IAA-
IAA-
Pasivní difuze „IAA-influx(uptake)carrier“
+
H
„aniontová“ past
„IAA-efflux-carriers“
H+-ATPasa
IAA-
IAA AUX1/LAX
Fyzikálně-chemické vlastnosti auxinové molekuly určují, že:
IAAABCB
PIN
Kapacita přenašečů auxinu z buňky (PINy, ABCB-transportéry, další?) limituje tok auxinu buňkou a tedy i jeho mezibuněčný tok Opakovaná a analogicky asymetrická lokalizace přenašečů auxinu z buňky (PINy) v sousedních buňkách určuje směr toku auxinu mezi buňkami
Přenašeče auxinu do buňky (AUX1/LAX, NRT1.1, další?) pomáhají zvyšovat příjem auxinu do buněk ve specifických buněčných typech a fyziologických situacích
Mutanty v genech pro typické auxinové transportéry IAA Mutant aux1
AUX1/LAX
agravitropní kořeny
IAA(Marchant et al. 1999)
ABCB PIN
Mutant mdr1/pgp19/abcb19 komplexní fenotyp, zakrslé
Mutant pin1 silný fenotyp v květních orgánech
(Palme & Gälweiler 1999, modified)
(Noh et al. 2001)
WT mdr1/pgp19/abcb19
WT
pin1
Standardní auxinové transportéry: predikovaná topologie a umístění na plasmatické membráně (stejné „zvětšení“ !)
Jejich molekulární funkce ? Kvantitativní parametry jejich aktivity?
Petrášek et al., in Transporters and Pumps in Plant Signaling, Springer 2011
Buněčné suspense Experimentální model pro kvantitativní charakterizaci procesů na úrovni buňky
Linie BY-2 (Nicotiana tabacum L., cv. Bright Yellow 2 ; Nagata et al. 1992) Auxin-dependentní (nízká ‘interference’ s tvorbou endogenního auxinu)
Homogenní buněčná populace, vysoce rozpadavá (snadné určení buněčné density a velikosti buněk)
Standardní růstový cyklus, axiální (polární ?) buněčný růst (snadná detekce fenotypových změn)
Snadná transformace a následné sledování fenotypových změn
(Day 3)
Indukovatelná nadexprese AtPIN7 v buňkách BY-2 (linie GVG-PIN7) Den 1, 24 h po indukci nadexprese AtPIN7 dexamethasonem (DEX, 5 uM) (v pTA7002; Aoyama & Chua 1997). BY-2
IAA-
GVG-PIN7 neindukované
PIN
Nepřímá imunofluorescence, anti-PIN7 králičí
polyklonální protilátka. Úsečka = 40 μm. BY-2 + DEX
GVG-PIN7 indukované Semikvantitativní RT-PCR
1h 6h 12 h 48 h 72 h
hours after DEX application
PIN 7
Signál PIN7 je pouze v indukovaných buňkách GVG-PIN7
Petrášek et al., Science 2006
IAA-
Fenotyp buněčné linie GVG-PIN7
PIN
Indukce DEX (5 mM); den 3; Nomarski DIC; úsečky= 40 μm. GVG-PIN7 neindukované Cell number (104 cells per ml)
BY-2
40 30 20
PIN7 induced 10 0 0
1
2
3
4
5
6
7
Time (days)
BY-2 + DEX
GVG-PIN7 indukované Lugol
Nadexprese PIN7 vede k zastavení buněčného dělení, k elongaci a k nadprodukci amyloplastů (» auxinové „hladovění“)
Petrášek et al., Science 2006
Kinetika akumulace 3H-NAA v buňkách GVG-PIN7 24 h po indukci (DEX, 1 mM); 3H-NAA 2 nM; 1-naphthylphthalamová kyselina (NPA) 10 mM; úsečky = SEs, n=4
IAAPIN
4
Accumulation of [3H]-NAA (pmol per million cells)
non-induced + NPA
3
induced + NPA 2
Totéž platí pro kvasinky a HeLa-buňky !
non-induced
1
induced 0 0
5
10
15
20
25
30
Time (min)
Nadexprese PIN7 vede k poklesu akumulace NAA (» nárůst exportu NAA), inhibitor exportu auxinu zvyšuje akumulaci auxinu v buňkách Petrášek et al., Science 2006
IAA-
Fenotyp buněk linie GVG-PIN7, účinek NPA
PIN
Indukce DEX (5 mM); den 3; Nomarski DIC; úsečky = 40 μm. GVG-PIN7 neindukované
Induced cells NPA-treated
non-treated
80
Cell diameter (mm)
GVG-PIN7 indukované + NPA
GVG-PIN7 indukované
60
40
20
0
50
100
150
200
250
Cell length (mm)
Po nadexpresi PIN7 a aplikaci NPA se fenotyp buněk neliší od kontroly
Mravec et al., Development 2008
Nadexprese auxinových transportérů lokalizovaných na plasmatické membráně:
modulace intracelulární hladiny auxinu modulace toku auxinů mezi buňkami změny ve vývoji buněk
Auxinové transportéry: predikovaná topologie a umístění na plasmatické membráně (stejné „zvětšení“ !)
Petrášek et al., in Transporters and Pumps in Plant Signaling, Springer 2011
Nadexprese AtPIN5 v kořenech Arabidopsis a v buňkách BY-2
PIN5 (signál GFP) je na endomembránách (endoplasmatické retikulum a endosomy) !
Mravec et al., Nature 2009
Heterologous overexpression of AtPIN5 in yeast
PIN5 is on PM
PIN5 has a capacity to export auxin from yeast cells
Mravec et al., 2009
Nadexprese AtPIN5 v buňkách BY-2 (tabák) PIN5 na ER může změnit intracelulární distribuci auxinu (… metabolické změny ?)
Nadexprese PIN5 mění metabolický profil IAA v buňkách (žádná volná IAA !)
PIN5 reguluje intracelulární homeostázi auxinu
Buněčné komponenty účastnící se transportu auxinu
Auxinové transportéry: predikovaná topologie a umístění na plasmatické membráně
PILS
Nadexprese AtPILS v buňkách BY-2 (tabák) Také proteiny PILS (PIN-LIKES) jsou na ER PILS2 mění metabolický profil IAA v buňkách - stabilizace oproti PIN5!
Nejen PIN5(6,8), ale také PILS13,5-7 regulují intracelulární homeostázi auxinu
Regulace intracelulární homeostáze auxinu je nečekaně komplexní!
Buněčné komponenty účastnící se transportu auxinu
Dostupnost auxinu v buňkách a v buněčných kompartmentech rostlin
biosyntéza
(de)konjugace
degradace
metabolismus příjem signálu a jeho přenos příjem signálu a
jeho přenos
import (influx) export (efflux)
intracelulární redistruibuce auxinu
intercelulární tok intracelulární tok
Transport auxinu a receptory pro signální dráhy auxinu
ABP1
ABP1
TIR1
TIR1
TIR1-dependentní signální dráha auxinu JÁDRO
Vanneste and Friml, 2009
Regulace genové exprese v odpovědi na auxinový signál: V odpovědi na auxin jsou represory AUX/IAA degradovány. Tím jsou uvolněny transkripční faktory ARF, které aktivují transkripci genů odpovědi na auxin („auxin response genes“). TPL = topless, transkripční korepresor. Arabidopsis thaliana: genová rodina AUX/IAA (29 členů) ARF (22 členů)
celkem 638 možných kombinací
TIR1
Více auxinu
Málo auxinu
Calderon-Villalobos L I et al. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010;2:a005546
TIR1
AUX/IAA Vazba auxinu a Aux/IAA na TIR1
auxin auxin
I6P
TIR1
Calderon-Villalobos L I et al. Cold Spring Harb Perspect Biol 2010;2:a005546
Transport auxinu a receptory pro signální dráhy auxinu
ABP1
ABP1
TIR1
ABP1
ABP1-dependentní signální dráha auxinu ABP1
http://www.rcsb.org/pdb/cgi/explore.cgi?job=graphics&pdbId=1LR5&page
ABP1: není membránový protein (žádná hydrofobní doména) struktura „b-barrel“ (cupin superfamily) C-terminální sekvence KDEL po vazbě auxinu dochází k rychlým změnám na plasmatické membráně
Schéma struktur a procesů, podílejících se na transportu auxinů do buňky a z buňky 20% IAA
80% IAA- + H+ pH 5,5
pH 7,0
IAA-
H
Pasivní difuze „IAA-influx(uptake)carrier“
+ „IAA-efflux-carriers“
BFA
IAA-
PIN IAA-
Auxin
H+-ATPasa
Endocytosa PINů (i dalších proteinů na PM) je inhibována auxiny !
Inhibice endocytosy auxiny Auxiny (po navázání na ABP1) inhibují endocytosu některých proteinů v PM (PM-ATPasa, akvaporiny ... i PINy) … a takto zvyšují jejich množství na PM … ABP1 je součástí endocytotického aparátu
ABP1
PM
… a jejich celkovou aktivitu na PM …
změny pH v buněčné stěně, změny membránového potenciálu ... a zvýšený export auxinů samotných (zpětná vazba !)
ABP1 je receptorem auxinu pro signální dráhu regulující endocytosu některých proteinů na PM
Dostupnost auxinu v buňkách a v buněčných kompartmentech rostlin
biosyntéza
(de)konjugace
degradace
metabolismus
příjem signálu a
jeho přenos
import (influx) export (efflux)
intracelulární redistruibuce auxinu
intercelulární tok intracelulární tok
Model gravitropní reakce kořene
Vanneste and Friml, 2009
Auxin je do kořenové špičky dopravován středním válcem, je distribuován laterálně symetricky z kořenového sloupku a transportován bazipetálně do elongační zóny kořene. Gravitační stimulus: sedimentace statolitů ve sloupku ve směru gravitace a následně relokalizace přenašečů auxinů z buňky (PIN3). Ty pak přenášejí auxin na spodní stranu kořene; odtud je auxin transportován do elongační zóny, kde inhibuje růst buněk. Výsledkem je ohyb kořene dolů ve směru gravitace (pozitivní gravitropismus).
Transport auxinu a receptory pro signální dráhy auxinu
ABP1
ABP1
TIR1
Poděkování Jan PETRÁŠEK Klára HOYEROVÁ Petr DOBREV Milada Čovanová Adriana Jelínková-Černá Petr Klíma Pavel Křeček Martin Kubeš Martina Laňková Jiří Libus Kateřina Malínská Karel Müller Daniela Seifertová Sibu Simon Petr Skůpa Markéta Pařezová Andrea Hourová, Nikola Drážná, Jana Stýblová-Žabová (Jakub Rolčík, Aleš Pěnčík)
PřF UK, Katedra experimentální biologie rostlin a Katedra biochemie FBMI, ČVUT – Petr Hošek, Marcel Jiřina
PřF MU – Jan Hejátko et al. Ústav fyzikální chemie J. Heyrovského AV ČR – M. Hof and Jana Humpolíčková Jiří FRIML and Eva BENKOVÁ et al. (VIB, University Ghent, Belgie)
Angus MURPHY et al. (Purdue Univ., Indiana, USA) Richard NAPIER et al. (Univ. of Warwick, UK) Markus GEISLER et al. (University of Zurich (Fribourg), Switzerland) Cris KUHLEMEIER et al. (Univ. Bern, Switzerland) Christian LUSCHNIG and Jűrgen KLEINE-VEHN (BOKU, Vienna, Austria) Finanční podpora: MŠMT (projekt LC06034) projekty GAČR, EU-INCO Copernicus
