GENOTOXIKUS HATÁSA IN VIVO ÉS IN VITRO. Doktori (PhD) értekezés. Dr. Szendi Katalin

KÖRNYEZETI RÉSZECSKEEXPOZÍCIÓK GENOTOXIKUS HATÁSA IN VIVO ÉS IN VITRO

Doktori (PhD) értekezés

Dr. Szendi Katalin Doktori Iskola vezetője: Prof. Dr. Komoly Sámuel Programvezető: Prof. Dr. Ember István Témavezető: Dr. Varga Csaba

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar Pécs, 2012

TARTALOMJEGYZÉK 1 

Rövidítések jegyzéke _________________________________________________ 4 

2 

Bevezetés __________________________________________________________6  2.1  Általános bevezetés _______________________________________________ 6  2.2  Az 1-nitropirén in vivo mutagenitásvizsgálata, ill. az erre épülő krónikus, azbesztexpozíciós modell ___________________________________________ 7  2.3  Szénnanocsövek potenciális genotoxicitásának és mezoteliómaindukciójának vizsgálata ______________________________________________________11  2.4  Peloidok mutagén aktivitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben __ 15 

3 

Célkitűzések ______________________________________________________17 

4 

Anyag és módszer __________________________________________________ 18  4.1  Általános leírás __________________________________________________ 18  4.1.1  Salmonella Ames mutagenitási vizsgálatok _______________________ 18  4.1.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer _______________________ 18  4.1.1.2 Előinkubációs Ames-teszt ______________________________ 20  4.1.1.3 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben _______________________ 20  4.1.2  Citogenetikai vizsgálatok _____________________________________22  4.1.2.1 Mikronukleusz teszt___________________________________ 22  4.1.2.2 Testvérkromatid-csere (SCE) analízis _____________________ 23  4.1.3  Krónikus, kontaktexpozíciós modell rostszerkezetű anyagokhoz köthető mutagenitás és komutagenitás vizsgálatára _________________ 26  4.1.4  Peloidok ___________________________________________________ 29  4.1.4.1 Hévízi és kolopi gyógyiszapok, fizikai, kémiai, biológiai adatok 29  4.1.4.2 Előkezelés nélküli peloidok _____________________________ 31  4.1.4.3 Peloidkivonatok ______________________________________ 32  4.1.5  Statisztikai módszerek Salmonella Ames-teszt értékeléséhez _________ 34  4.2  Részletező (az egyes módszereknél alkalmazott) leírás ___________________ 36  4.2.1  Kísérleti elrendezés (2.2)______________________________________ 36  4.2.1.1 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben _______________________ 36  4.2.1.2 Krónikus, kontaktexpozíciós modell ______________________ 36  4.2.2  Kísérleti elrendezés (2.3)______________________________________ 37  4.2.2.1 Salmonella Ames mutagenitási vizsgálatok ________________ 37  4.2.2.1.1  Klasszikus, lemezöntéses módszer _______________ 37  4.2.2.1.2  Előinkubációs Ames-teszt ______________________ 37  4.2.2.1.3  Vizeletmutagenitás Ames-tesztben _______________ 38  4.2.2.2 Citogenetikai vizsgálatok ______________________________ 38  4.2.2.3 Krónikus, kontaktexpozíciós modell ______________________ 39 

4.2.3  Kísérleti elrendezés (2.4)______________________________________ 40  5 

Eredmények _______________________________________________________ 41  5.1  Az 1-nitropirén in vivo mutagenitásvizsgálata, ill. az erre épülő krónikus, azbesztexpozíciós modell __________________________________________ 41  5.1.1  Vizeletmutagenitás Ames-tesztben ______________________________ 41  5.1.2  Krónikus, kontaktexpozíciós modell _____________________________ 43  5.2  Szénnanocsövek potenciális genotoxicitásának és mezoteliómaindukciójának vizsgálata ______________________________________________________45  5.2.1  Salmonella Ames mutagenitási vizsgálatok _______________________ 45  5.2.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer _______________________ 45  5.2.1.2 Előinkubációs Ames-teszt ______________________________ 46  5.2.1.3 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben _______________________ 46  5.2.2  Citogenetikai vizsgálatok _____________________________________48  5.2.2.1 Mikronukleusz teszt___________________________________ 48  5.2.2.2 SCE-analízis ________________________________________ 49  5.2.3  Krónikus, kontaktexpozíciós modell _____________________________ 51  5.3  Peloidok mutagén aktivitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben __ 54  5.3.1  Előkezelés nélküli peloidok ___________________________________ 54  5.3.2  Peloidkivonatok _____________________________________________ 56  5.3.2.1 1. sorozat ___________________________________________ 56  5.3.2.2 2. sorozat ___________________________________________ 59 

6 

Megbeszélés és következtetések _______________________________________ 63 

7 

Új eredmények összefoglalása ________________________________________ 75 

8 

Tudományos közlemények és a kongresszusi prezentációk (előadások és poszterek) jegyzéke _________________________________________________ 76 

9 

Köszönetnyilvánítás ________________________________________________ 86 

10  Irodalomjegyzék ___________________________________________________ 87 

1 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ALT:

analitikai tisztaságú

AR:

analytical reagent

B(a)P:

benz(a)pirén

CAS:

Chemical Abstracts Service

CNT:

carbon nanotube

DE:

dekonjugációs enzimek

DMSO:

dimetil szulfoxid

F-344:

Fischer-344 patkánytörzs

FBS:

fetal bovine serum

f/p:

percenkénti fordulatszám

IARC:

International Agency for Research on Cancer

LD:

letális dózis

LLL:

left lateral lobe = lobus hepatis sinister lateralis

M1:

1. metafázis

M2:

2. metafázis

M3:

3. metafázis

MGM:

minimal glucose medium

MN:

mikronukleusz

MWCNT: multi-walled carbon nanotube NOAEL: no observed adverse effect level NP:

nitropirén

OGYFI:

Országos Gyógyhelyi és Gyógyfürdőügyi Főigazgatóság

OTH:

Országos Tisztifőorvosi Hivatal

PBS:

phosphate-buffered saline (foszfát puffer)

ROS:

reactive oxygen species (reaktív oxigénfajták)

RPMI:

Roswell Park Memorial Institute

S9 mix:

patkánymájból preparált metabolizáló enzimek, 9000 x g szupernatáns frakció

SCE:

sister chromatid exchange (testvérkromatid-csere)

SD:

standard deviation (standard deviáció)

SPSS:

Statistical Package for the Social Sciences

SSC:

saline-sodium citrate (NaCl + Na-citrát)

SWCNT: single-walled carbon nanotube UICC:

Union Internationale Centre le Cancer

VB só:

Vogel-Bonner só

2 BEVEZETÉS 2.1 ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS A részecske ill. rosttoxikológia a tudomány régóta kutatott területei közé tartozik. Már a 16. század közepén több tudós észlelte a finomszemcsés anyagok betegségeket okozó hatását. Az ipari forradalom következtében a populáció nagy része exponálódott a gyárak által kibocsátott szennyezőanyagokkal. Mindemellett abban az időben az ipari toxikológia még gyerekcipőben járt. A 20. században az azbeszt és a szilícium toxikológiája került előtérbe, melyet a nanotechnológiai iparnak köszönhetően a 21. században új anyagcsoportok, a nanorészecskék követtek [1]. A környezetünket szennyező részecskék (rostos és nem rostos) expozíciójával számos helyen találkozhatunk: pl. a gyártás, ipari termékek használata, a bányászat, illetve az emberi tevékenységet követő, véletlenszerű expozíciók során is, melynek hatására különböző betegségcsoportokkal kell szembesülnünk, mint az asztma, krónikus obstruktív tüdőbetegségek, kardiovaszkuláris megbetegedések, vagy akár fibrózis illetve a különböző ráktípusok. Napjainkban is számos részecsketípus képezi a kutatások alapját. A század egyik új kihívása a szilárd halmazállapotú, finomszemcsés anyagok (mint pl. elemi szálak, nanotechnológiai termékek) széles spektrumának feltérképezése. Dolgozatomban rostos (rostszerkezetű por: hossz-átmérő arány: ≥ 3:1 [2]) és nem rostos (szemcsés szerkezetű por: hossz-átmérő arány: < 3:1 [2]; talajtani szempontból vett részecskék, szemcseméret megközelítőleg: < 200 µm) részecskék specifikus genotoxicitását vizsgáltam. A kísérletek 3 anyagcsoporton történtek. Az ismerten karcinogén (IARC 1) azbesztrostokat, a méretükben, alakjukban az azbesztrostokhoz

nagyon

hasonló,

de

eltérő

biológiai

aktivitást

mutató

szénnanocsöveket, és mind a balneoterápiában, mind a wellness területén előszeretettel alkalmazott gyógyiszapokat vizsgáltuk. A genotoxikológiai tesztelés és a rákkockázatbecslés szempontjából a rostos és nem rostos részecskék a „klasszikus toxikus” anyagokhoz (gáz vagy folyadék fázisú kémiai karcinogének) képest egy speciális csoportot képeznek. A rostos és nem rostos részecskék fizikai-kémiai viselkedése különbözik a már „hagyományos” kémiai karcinogénekétől [3]. A vegyi anyagok számos expozíciós útvonalon juthatnak a szervezetbe, ahol közvetlenül vagy indirekt módon – a metabolizáció során – 6

kölcsönhatásba léphetnek a DNS-sel. Bár a többnyire inhalációval a szervezetbe jutó részecskék metabolizációs folyamatokon nem mennek keresztül, azonban a rostsejtkölcsönhatás vizsgálata során figyelembe kell venni az internalizációt és fagocitózist, továbbá a részecskék transzcitózissal történő sejtekbe bejutását, melyek meghatározó szerepet játszanak a citotoxicitásban, a fibrogén hatásokban és a genotoxicitásban is. A rostos és nem rostos részecskék felületi tulajdonságaiknál fogva indirekt úton, gyulladásos

folyamatokon

keresztül

(ROS:

reaktív

oxigénfajták)

okozhatnak

genotoxicitást és következményes tumorképződést. Míg a vegyi anyagok a klasszikus toxikokinetika szabályait követik (eloszlás, biotranszformáció, elimináció), addig a részecskék teljesen más módon fejthetik ki hatásukat (jellemző kinetika: pl. a lerakódás, clearance, elhúzódó elimináció). Nem lehet eléggé hangsúlyozni legjelentősebb közös tulajdonságukat, melyet a felszínükhöz kötött szerves anyagok potenciális jelenléte képezi. A rostos szerkezetű anyagok a nagy fajlagos felületük miatt számos lehetséges mutagént képesek megkötni, de a nem rostos részecske típusú anyagok is hordozhatnak policiklusos aromás szénhidrogéneket és egyéb mutagén komponenseket [4].

2.2 AZ 1-NITROPIRÉN IN VIVO MUTAGENITÁSVIZSGÁLATA, ILL. AZ ERRE ÉPÜLŐ KRÓNIKUS, AZBESZTEXPOZÍCIÓS MODELL Az 1-nitropirén (1-NP) (1. ábra) elsősorban közlekedési eredetű, valamint fosszilis tüzelőanyagok tökéletlen égéskor keletkező, továbbá a dohányfüstben előforduló, nitrocsoporttal rendelkező policiklusos aromás szénhidrogén [5]. Egy másik lényeges légszennyező anyag az azbeszt, melynek rostjai felületükön megköthetik és akkumulálhatják pl. az 1-NP molekulákat is. Az

azbeszt

természetes

előfordulású

rostos,

hidratált

szilikátásványok

összefoglaló neve. Nagy szakítószilárdságú, hőnek és a legtöbb vegyi anyagnak ellenáll. Keletkezés és kristályszerkezet alapján két osztályba sorolhatók: szerpentinek és amfibolok. A magyar 12/2006. (III. 23.) EüM rendelet szerint azbesztnek 6 különböző szilikátfajta minősül (2. ábra).

7

1. ábra Az 1-nitropirén (1-NP) szerkezete

AZBESZT

SZERPENTIN OSZTÁLY

AMFIBOL OSZTÁLY

krokidolit (kék azbeszt)

krizotil (fehér azbeszt)

amozit tremolit antofillit aktinolit

2. ábra Az azbesztek osztályozása és típusai Két legelterjedtebb típusa a krokidolit (kék azbeszt, amfibol-csoport) és a krizotil (fehér azbeszt, szerpentinek) (3. ábra). 8

3. ábra Krokidolit (27 000x-es nagyítás) és krizotil (50 000x-es nagyítás) rostok jellegzetes transzmissziós elektronmikroszkópos felvétele [6] Az amfibolazbesztek (pl. krokidolit) rostjai egyenesek, tűszerűek, szövetük érdesebb, merevebb, a rostok savállóak. A szerpentinazbeszt (pl. krizotil) rostjai hajlékonyak és görbültek, lágy szövetet alkotnak, lúgrezisztensek. Széleskörű elterjedésüket e fenti tulajdonságok tették lehetővé. A termékekből ill. anyagokból a különböző kötöttségi állapotú azbesztszálak felszabadulhatnak, és a környezetből a mikroszkópikus méretű szálak a különböző expozíciós utakon a szervezetbe jutva deponálódhatnak, kumulálódhatnak, és általában néhány évtizedes latenciaidőt követően megbetegedéseket okozhatnak (azbesztózis, bronchiális karcinóma, pleurális vagy peritoneális mezotelióma) [7]. A legnagyobb egészségügyi kockázatot a kék azbeszt jelenti, melynek alkalmazása 1992-től tiltott Magyarországon [8]. Az azbesztet, kedvező tulajdonságai miatt, (hajlékonyság, ellenálló képesség) széles körben használták. Habár 2005. január 1-től a 41/2000. (XII. 20.) EüM-KöM együttes rendelet értelmében Magyarországon tilos minden azbesztet tartalmazó termék forgalmazása és felhasználása, a belélegezhető rostok továbbra is jelen vannak az emberi környezetben, mely több emittáló forrás működésének következménye. Ilyen az 9

azbesztbányászat (egyes országokban) és feldolgozóipar, vagy a rostok felszabadulása azbesztcement anyagú tetőfedő palákból, építő- ill. szigetelőanyagokból, nyomó- és lefolyócsövekből vagy tűzálló burkolatokból. További forrás lehet, különösen a posztkommunista országokban és a harmadik világban, a közlekedés és szállítás, a korszerűtlen azbeszt fékbetétekkel felszerelt veterán buszok és tehergépkocsik irreálisan hosszú használata. Alkalmanként az azbesztmentesítő programok és az épületbontások szintén hozzájárulnak a sokáig immobilis rostok környezetbe jutásához [7, 9, 10]. További lehetőség az ivóvíz szennyezése azbesztrostokkal, melyek az azbesztcementből készült vízvezetékek falából szabadulhatnak fel. Ezek a rostok különböző, az ivóvízben előforduló szerves anyagokat köthetnek meg – pl. klórozási melléktermékek – melyek közt jól ismert mutagének és karcinogének is találhatók [11, 12]. Több korábbi vizsgálat is jelezte, hogy a benz[a]pirén és más policiklusos aromás vegyületek mind vizes, mind apoláros közegből hatékonyan kötődnek az azbesztrostok viszonylag nagy felszínéhez [13, 14, 15, 16]. Humán toxikológiai, foglalkozás-egészségügyi és munkahigiénés szempontból a belégzést tekintik a fő expozíciós útnak. Azonban nem munkahelyi, hanem elsősorban közlekedési eredetű, vagy más, nem ellenőrzött tevékenység (lakásfelújítás, otthoni munkaruházat mosás stb.) során keletkező rostokhoz kötött molekulák gyakran kerülnek a gasztrointesztinális rendszerbe. A tüdőbe kerülő rostok egy részét felköhöghetjük, miközben a rostkötegek kisebb átmérőjű kötegekké, vagy elemi rostokká esnek szét. A laboratóriumok közötti eredmények összehasonlíthatósága miatt a vizsgálatokban egységesített, respirábilis rostokat használnak [17], míg a környezeti és munkahelyi expozíció során főként inkább nagyobb méretű, nem respirábilis rostszerkezetű porokat inhalálunk, melyek később lenyelésre kerülnek. Így a teljes populáció vonatkozásában az orális expozíció jelentősnek

tekinthető [11,

12].

Elektronmikroszkópos vizsgálatok szerint a

gasztrointesztinális traktusba került rostok átjuthatnak a bélfalon [18, 19]. A policiklusos aromás vegyületek metabolitjai a széklettel és a vizelettel választódnak ki. Előzetes kísérletünkben a korábbi tanulmányokban [20, 21] a génexpressziók szintjén hatékonynak bizonyult egyszeri 1-NP dózissal po. (per os) és ip. (intraperitoneálisan) kezelt állatok vizeletének mutagenitását vizsgáltuk. Mind a hatás mechanizmusának megismerése, mind a kockázatbecslés lehetőségét tekintve lényeges a komutagenitás (vagyis két anyag együttes hatása), vagy egyéb lehetséges kémiai ill. fizikai interakciók tanulmányozása. Ez pedig lehetetlen az orális expozícióval bejutó

10

azbesztrosthoz kötött 1-NP, és/vagy metabolitjai – mint potenciális mutagének – toxikokinetikájának megismerése nélkül. Állatkísérletekben a lenyelt azbesztrostok felhalmozódását több szervben is kimutatták, főként a csepleszben, de a vesében, májban, lépben, agyban, tüdőben ill. a vérben és vizeletben is megfigyelhető volt a szálak jelenléte [22, 23]. Emberi boncolási adatok is alátámasztják a cseplesz rendkívül magas akkumulációs hajlamát, mely minden bizonnyal összefüggésben áll a hashártya daganatainak előfordulásával [24]. A rostok okozta oxidatív károsodást kimutatták különböző kombinált in vivo/in vitro genotoxicitási tesztekben (üstökös elektroforézis, bakteriális mutagenitási teszt, citogenetikai vizsgálatok) [14, 15, 25]. Azonban az azbesztexpozíció végpontjának, a mezoteliómának, vizsgálata in vitro rendszerekben nehézségekbe ütközik. A humán peritoneum mezotélsejt-kultúrái nagyon rövid proliferatív élettartammal rendelkeznek, öregedésük során egyre több reaktív oxigéngyököt képeznek, mely a DNS növekvő oxidatív károsodásához vezet. Éppen ezért hosszú időtartamú kísérletekben hasonló jellegű hatások vizsgálatára nem alkalmasak [26]. Ebből kifolyólag egy egyszerű sebészi eljárásból álló specifikus in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellt fejlesztettünk ki rostos szerkezetű anyagok számára [27]. A kísérlet célja az azbesztrostok és a mezotélsejtek közötti hosszútávú, direkt kontaktus vizsgálata volt. Az állatokat nagy tisztaságú amfibollal (krokidolit) és szerpentinnel (rodéziai krizotil) exponáltuk. A környezeti expozíció modellezésére 1-nitropirénnel (1-NP) előkezelt rostokat használtunk, mely az IARC szerinti 2B csoportba tartozó, lehetséges humán karcinogén, és genotoxikus anyag [5, 28].

2.3 SZÉNNANOCSÖVEK POTENCIÁLIS GENOTOXICITÁSÁNAK ÉS MEZOTELIÓMAINDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA Az elmúlt évtized folyamán egyre nagyobb érdeklődés mutatkozik egy forradalmian új anyagcsoport, a nanotechnológiai termékek iránt. Az egyik leggyorsabban fejlődő irány a szénnanocsövek (CNT) felhasználása. A szénnanocsövek a szén allotróp módosulatainak új tagjai, melyek a fullerénekhez és a grafithoz hasonlatosak, legismertebb formáik az egyfalú- (SWCNT) és többfalú szénnanocsövek

11

(MWCNT) (4. ábra). Az egyelen atomvastagságú grafitréteg neve grafén, mely feltekerve, két fél fullerénsapkával alkotják az egyfalú szénnanocsöveket.

4. ábra A szén allotróp módosulatai [29] Méreteiket tekintve, míg átmérőjük a nanométer tört része is lehet, addig hosszuk elérheti a több tíz mikrométert (hossz-átmérő arány ≥ 3:1). Egyedülálló elektromos, mechanikai és termikus tulajdonságai miatt a szénnanocsövek igen fontossá válnak az elektronika, az űrkutatás és a számítógépipar újabb területein [29, 30]. Ma még csak évente néhány száz tonnát gyártanak belőlük, de termelésük volumene exponenciálisan növekszik [31], ugyanakkor a környezetre és az emberek egészségére gyakorolt hatásukról rendelkezésre álló információk nem kielégítőek [32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43]. Nincs megfelelő mennyiségű adat (főként orális expozíció esetében) sem az általános toxicitásról (pl. közepes halálos dózis, LD50-érték; nem észlelt ártalmas hatás szintje, no observed adverse effect level, NOAEL), sem specifikus toxikológiai tulajdonságaikról (pl. genotoxicitás és karcinogenitás) [39, 44]. A nanorészecskék különösen fontos környezeti és munkahigiénés veszélyeit két tényező jelentheti. Egyrészt már maga a mérettartomány is kockázati tényezőnek tekinthető, másrészt nagy adszorpciós felülettel rendelkeznek, melyre különböző toxikus anyagok kötődhetnek, íly módon bekerülhetnek az emberi szervezetbe. A 12

nanorészecskék a három legismertebb expozíciós úton juthatnak be az emberi szervezetbe: inhalációval, bőrön keresztül és a gasztrointesztinális rendszeren át. Tulajdonságaikban nagyon hasonlítanak egyes, bizonyított környezeti és toxikológiai kockázatot jelentő ásványok elemi rostjaihoz, elsősorban az azbeszthez [7]. A fullerének erősen lipofilek, ebből következően sejtmembránban dúsulnak, redox-aktívak, a keletkező reaktív oxigéngyökök lipid- és protein peroxidációt okozhatnak [36]. SWCNT esetében ismert annak oxidatív stresszt, apoptózist, egyéb citotoxikus választ és pulmonális toxicitás okozó hatása [32, 34, 37, 38]. Egerekben a szénnanocsövek (0,5 mg/állat) szuszpenziójának intratracheális instillációval történő tüdőbe juttatása granulómákat okozott [32], míg patkányok tüdejében az immunsejtek az 1 vagy 5 mg/ttkg dózisban bejuttatott SWCNT összecsapzódások körül gyülekeztek. A tüdő SWCNT expozíciója után nem-dózisfüggő, súlyos multifokális granulómák alakultak ki, amelyek bizonyítékul szolgálnak az idegentest-típusú reakcióra. A garnulómák makrofágszerű multinukleális óriássejteket tartalmaztak [38]. A tüdő szénnanocső-expozíciója és az érrendszer oxidatív státusza közötti összefüggést is vizsgálták. A szénnanocsövek intrafaringeális instillációja (10 és 40 μg/egér) az érrendszerben oxidatív válaszokat hozott létre, mely szerepet játszhat az aterogenezisben. Az SWCNT ismételt expozíciója (20 μg/egér minden második héten egy alkalommal, 8 héten át) stimulálta az ateroszklerózis progresszióját. Az in vivo és in vitro elvégzett kísérletek azt bizonyítják, hogy a szénnanocsövek tényleges direkt és indirekt oxidatív hatással rendelkeznek, amely feltehetőleg prediszponáló tényezőként jelenik meg az aterogenezisben [34, 45, 46]. Shvedova az SWCNT citotoxikus és genotoxikus hatásait vizsgálta humán keratinocita és bronhiális epiteliális sejteken, in vitro. Az SWCNT ultrastrukturális és morfológiai elváltozásokat, a sejt integritásának elvesztését, apoptózist és oxidatív stresszt okozott. A kapott adatok az sugallják, hogy az SWCNT expozíció dermális és pulmonális toxicitást okozhat, az oxidatív stressz pedig az egyik legfontosabb sejtkárosító mechanizmus [37]. Ahol felmerül az oxidatív stressz létrejöttének lehetősége, ott a genotoxicitás lehetőségét sem hagyhatjuk figyelmen kívül [47]. Poland és mtsai kimutatták, hogy in vivo, az MWCNT-k – intraperitoneális beadást követően (50 µg/egér) – az azbesztre jellemző gyulladásos választ és granulomatózus elváltozások létrejöttét indukálják [48]. Más, hosszabb távú, in vivo

13

kísérletek az MWCNT-k egyszeri intraszkrotális (1 mg/ttkg) vagy intraperitoneális (3 mg/egér) dózisait követően mezotelióma kialakulását mutatták [49, 50]. Tehát a fenti kutatások az MWCNT-k potenciális karcinogén hatását bizonyítják, azonban a mechanizmus alapjai nem ismeretesek [51]. A nanotechnológia számos ígérete ellenére a velejáró kockázati tényezőket is figyelembe kell venni. Számos epidemiológiai bizonyíték gyűlt már össze az emberi egészség és a különböző típusú – munkahelyi, beltéri, kültéri – részecskeexpozíciókat illetően. Ilyen pl. az azbeszttel és egyéb rostokkal történő munkahelyi expozíciók és a többlet daganatos halálozás (tüdőrák, mezotelióma) valamint az egyéb légzőszervi megbetegedések közötti bizonyított összefüggés. A nanorészecskékkel kapcsolatban még nincsenek ilyen vizsgálati eredmények, azok megszületéséhez nagyságrendileg legalább egy évtized szükséges. Feltétlenül fontos tehát az expozíció mérését megoldani,

valamint

az

alapvető

toxikológiai

történéseket

megérteni

annak

eldöntéséhez, hogy szükségesek-e epidemiológiai vizsgálatok. Ma még az exponáltak száma alacsony és a veszély bizonytalan, azonban az exponáltak száma előreláthatóan emelkedni fog és a veszélyek analizálásával sem várhatunk [52]. Fontos lépés a nanotermékek környezeti és egészségügyi hatásainak nyomon követése, hogy kontrollálni tudjuk az előrehaladott technika és az ezzel járó károsító tényezők egyensúlyát. Kutatómunkánkkal e sürgető problémának megoldására törekszünk. Kutatásunk célja, hogy adatokat gyűjtsünk a szénnanocsövek lehetséges specifikus toxikus hatásairól. Ehhez egyrészt klasszikus genotoxicitási vizsgálatokat alkalmaztunk, melyekben a kémiai tisztaságú egy- és többfalú szénnanocsövek in vitro és in vivo genotoxicitási tesztelését végeztük. Másrészt rostszerkezetű anyagok vizsgálatára kifejlesztett in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellünkben [27] a potenciális mezoteliómaindukáló hatást kutattuk. A modell in vivo vizsgálja a minta és a mezotélsejtek közötti krónikusan fennálló direkt kontaktust. Alkalmazását a szénnanocsövek azbeszthez hasonló rostos szerkezete és mérettartománya indokolta. A kísérletek alatt további kihívást, technikai problémát jelentett a szénnanocsövek pontos dozírozásának megoldása, mivel azok az oldószerben nem alkottak stabil, homogén szuszpenziót, ezzel megakadályozva a megfelelő mérési eljárást.

14

2.4 PELOIDOK

MUTAGÉN

AKTIVITÁSÁNAK

VIZSGÁLATA

BAKTERIÁLIS MUTAGENITÁSI TESZTBEN A balneoterápia és balneoprevenció nagy népszerűségnek örvendő ága az iszapkezelés. A gyógyiszapok (peloidok, pelos: sár, görög szó) a természetben előforduló, ásványi és növényi eredetű anyagok, melyek finom szemcsézettségük, vízkötő és hőtároló képességük folytán alkalmasak forró göngyölések készítésére vagy hosszú ideig melegen maradó fürdők előállítására. Az iszapokat elsősorban gyógyvizekkel keverve, iszappakolás, iszapfürdő stb. formájában szokták felhasználni [53]. Az iszapkezelés indikációi igen sokoldalúak. Legelterjedtebben a reumás mozgásszervi betegségek kezelésében használják [54, 55]. Számos európai országban a balneoterápia a klinikai medicina része. Bár a gyógyvizeket, gyógyiszapokat terápiás vagy prevenciós célból régóta alkalmazzák,

lehetséges

mellékhatásaik

ismeretlenek.

Kevés

információ

áll

rendelkezésünkre gyógyító hatásuk bizonyítására is. A peloidterápia hatásosságának megítélése elsősorban klinikai megfigyelésekre és tapasztalatokra épül, azonban az irodalomban fellelhető vizsgálatok nagy része szinte teljes egészében leíró jellegű, valamint módszertani hiányosságokkal küzd [56]. A peloidok humán szervezetre gyakorolt hatásai összetettek, fizikai, fizikokémiai és kémiai sajátságokból eredeztethetők. Mindezidáig legtöbbet a peloidok termofizikai hatásait vizsgálták. Sok kutató a peloidok terápiás hatásosságát majdnem kizárólag termofizikai sajátosságainak tulajdonítja. Azonban jól ismert, hogy a gyógyiszapok kialakulásában a magas hőmérsékletnek és a nagy nyomásnak kulcsfontosságú szerepe van, amely nemcsak a terápiás szempontból kedvező komponensek, hanem az esetlegesen toxikus, egészségre potenciálisan káros alkotórészek kialakulásához is vezethet. Gyógyvizekben az utóbbi 10-20 évben számos szerves molekulát találtak gázkromatográfia, nagynyomású folyadékkromatográfia, valamint az ezekhez kapcsolt tömegspektrometria segítségével. Gyógyiszapokban való jelenlétükről viszont kevés adat áll rendelkezésünkre, sem interakcióikat, sem pedig pontos biológiai aktivitásukat nem ismerjük. Előfordulhatnak köztük genotoxikus és egyéb toxikus anyagok is [57]. Az egészségügyről szóló 1997. évi CLIV. törvény 247. §-a (2) bekezdésének x) pontja alapján az Országos Tisztifőorvosi Hivatal (OTH) engedélyezi a természetes 15

gyógyiszap megnevezést. „Természetes gyógyiszap az a természetes iszap, amelynek összetétele

ismert,

az

emberi

egészségre

ártalmas

anyagot

nem

tartalmaz,

kitermelésének körülményei a közegészségügyi előírásoknak megfelelnek, és eredeti összetételének minden megváltoztatása nélkül az adott felhasználási formában tudományosan elismert gyógyhatással rendelkezik” [58]. Az engedélyeztetés során csatolni kell  többek között  az iszapvizsgálat mikrobiológiai és teljes körű kémiai vizsgálatát, valamint a gyógyhatás elbírálásához szükséges, emberen végzett orvostudományi kutatások eredményeit, melyek igazolják, hogy az iszap az emberi szervezet életműködésének javítására, vagy valamely betegség gyógyítására alkalmas [59, 60]. Magyarországon – az ÁNTSZ 2012-es minősítése alapján – mindössze négy helyen lelhető fel gyógyhatású iszap: Makón, Tiszasülynél („Kolopi iszap”), Hajdúszoboszlón, és Alsópáhokon („Georgikon”) [61]. A 2007-es jelentés alapján még a Hévízi tó iszapja is ide tartozott [62]. A 4.1.4.1 fejezetben táblázatokba fogalt adatok az Országos Gyógyhelyi és Gyógyfürdőügyi Főigazgatóság archívumából származnak. Azonban az ott fellelhető, avagy az interneten elérhető adatok minősége és mennyisége nem elégíti ki a fenti rendeletben leírtakat. Hiányos mennyiségű információ áll rendelkezésre pl. a gyógyiszapok mikrobiológiai tulajdonságairól, a szerves komponensekről (a teljes körű kémiai vizsgálatról) vagy az orvosi vizsgálatokról. Az ÁNTSZ 2012-es minősítése alapján Magyarországon az országos törzskönyvi nyilvántartásba bekerült egy 5. iszap is, az ún. Neydharting gyógyiszap (Ausztria) [63]. A hivatalos magyar nyelvű honlapon [64] széles körű analitikai vizsgálatok és orvosbalneológiai szakvélemény is található. Munkánkban hazai gyógyiszapok (Hévíz, Kolop) lehetséges toxikus és genotoxikus hatásait vizsgáltuk [65], amely kísérletsorozat hozzájárul a balneológia és balneoterápia bizonyítékokon alapuló szintre emeléséhez. Célunk, hogy adatokat gyűjtsünk a terápiás és preventív célra használt iszapok egészségi kockázatainak becsléséhez, és új kísérleti módszert fejlesszünk az előkezelés nélküli peloidminták lehetséges genotoxikus hatásának vizsgálatához.

16

3 CÉLKITŰZÉSEK Az alábbi célkitűzéseket fogalmaztuk meg: AZ 1-NITROPIRÉN IN VIVO MUTAGENITÁSVIZSGÁLATA, ILL. AZ ERRE ÉPÜLŐ KRÓNIKUS, AZBESZTEXPOZÍCIÓS MODELL

o Hatásmechanizmus, potenciálisan mutagén metabolitok kiválasztási kinetikájának megismerése és kockázatbecslés o Új állatkísérletes modell kifejlesztése annak eldöntésére, hogy az azbesztrostok és a mezotélsejtek között krónikusan fennálló, direkt kontaktus okoz-e mezoteliómát o Környezeti

expozíció

modellezése

1-NP-vel

előkezelt

azbesztrostokkal,

komutagenitás és egyéb lehetséges kémiai ill. fizikai interakciók tanulmányozása SZÉNNANOCSÖVEK

POTENCIÁLIS

GENOTOXICITÁSÁNAK

ÉS

MEZOTELIÓMAINDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA

o Elsődleges adatok megszerzése a szénnanocsövek potenciális toxikus és genotoxikus hatásairól, vagy azok kizárása o Szénnanocsövek potenciális mezoteliómaindukáló hatásának kimutatása, ill. környezeti expozíció modellezése 1-NP-vel előkezelt szénnanocsövekkel rostos anyagok számára kifejlesztett in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellünkben PELOIDOK

MUTAGÉN AKTIVITÁSÁNAK VIZSGÁLATA BAKTERIÁLIS MUTAGENITÁSI

TESZTBEN

o Hazai gyógyiszapok (Hévíz, Kolop) lehetséges toxikus és genotoxikus hatásainak vizsgálata, adatgyűjtés, kockázatbecslés o Új kísérleti módszerek kifejlesztése az előkezelés nélküli peloid minták lehetséges komplex genotoxikus hatásainak vizsgálatához

17

4 ANYAG ÉS MÓDSZER 4.1 ÁLTALÁNOS LEÍRÁS 4.1.1 SALMONELLA AMES MUTAGENITÁSI VIZSGÁLATOK 4.1.1.1 KLASSZIKUS, LEMEZÖNTÉSES MÓDSZER Munkánkban számos minta vizsgálatát végeztük Salmonella Ames-teszttel [66]. Az egyik leggyakrabban alkalmazott bakteriális pontmutációk reverziójára épülő rendszert világszerte alkalmazzák új kémiai anyagok és gyógyszerek mutagén potenciáljának első vonalbeli meghatározására. Ezen kívül számos vegyi anyag elfogadtatásához, nyilvántartásba vételéhez is használják. Genetikailag módosított, hisztidin szintézisben gátolt mutáns Salmonella typhimurium TA törzseit használtuk, mellyel kémiai anyagok, fizikai hatások, komplex környezeti és biológiai minták mutagenitását lehet vizsgálni. (Ha a minta mutagén, a minimális hisztidin tartalmú táptalajon a reverz mutációt szenvedett baktériumok ún. „revertáns” telepeket hoznak létre 48 óra alatt, a telepszámok pedig a mutagenitás erősségével növekszenek.)1 A konvencionális Ames-teszt [66] során kétféle Salmonella typhimurium törzset használtunk a bakteriális pontmutációk vizsgálatára, melyek ampicillin rezisztenciáért felelős plazmidot is tartalmaznak: a frame-shift mutációk kimutatására TA98-as és a bázispárszubsztitúcióra érzékeny TA100-as törzset. A baktériumtörzseket B.N. Ames (University of California, Berkley) biztosította. A kísérlet során táplevesben (Oxoid nutrient broth) (25 g/dm3) történő szaporítás után 100 µl baktériumtenyészetet (108 baktérium), a tesztanyagot, 0,4 ml pH 7,4 foszfátpuffert és 2 ml topagart rétegzünk minimál-glükózagar táptalajra, 3-3 párhuzamos lemezt öntünk. A topagar összetétele: 10 rész lágy agar (5 g NaCl, 6 g agar,

1

Minden egyes Salmonella typhimurium törzs különböző típusú mutációt hordoz a hisztidin operonban.

A DNS károsodást okozó mutagének számára ezek a mutációk különböző mechanizmusokon keresztül ún. érzékenyített régióként („hot spot”) működnek. Ezen kívül a törzseket egyéb mutációk is jellemzik, melyek elősegítik a mutagének detektálását (pl. rfa mutáció hatására nő a baktériumsejtfal permeabilitása; uvrB-deléció következtében a DNS excíziós reparációs rendszert kódoló gén sérül, így számos mutagén iránti szenzitivitás megnő; az R-faktor plazmid jelenlétekor a gyengén detektálható mutagének is kimutathatók).

18

1000 ml desztillált víz és 1 rész hisztidin-biotin oldat (0,5/0,5 mM). A minimálagar összetétele: 15 g agar, 20 ml 50X Vogel-Bonner médium E, 50 ml 40%-os glükóz és 930 ml desztillált víz. A Vogel-Bonner médium E (50X) összetétele: 10 g MgSO4 · 7H2O, 100 g citromsavas monohidrát, 500 g K2HPO4, 175 g NaHNH4PO4 · 4H2O és 670 ml 45 °C-os desztillált víz. A lemezeket 48 óráig 37 °C-on inkubáljuk, majd manuális módszerrel leolvassuk. Sok vegyület csak enzimatikus aktiválás után válik mutagénné, ezért az in vitro Ames-tesztben el kell végezni a vizsgált anyag metabolikus aktivációját is. Ehhez patkánymájból preparált, aktiváló enzimeket tartalmazó, homogenizált májmikroszóma – S9 – frakciót (9000 x g szupernatáns frakció) alkalmazunk, mely tartalmazza a máj citoszolhoz vagy membránhoz kötött enzimjeit. Így a tesztet metabolikus aktivációval (Aroclor 1254-el indukált Sprague-Dawley patkányok májából preparált metabolizáló enzimekkel2) (4%-os töménységben) és anélkül is elvégezzük. (50 ml S9 mix összetétele: 2 ml (4%) patkány máj S9 frakció, 1 ml MgCl2-KCl só, 0,25 ml 1 M glükóz-6-foszfát, 2 ml 0,1 M NADP, 25 ml 0,2 M foszfát puffer, pH 7,4, 19,75 ml steril desztillált víz.) Felhasználás előtt az S9 mix aktivitását B(a)P-nel (Sigma-Aldrich) (1 µg/lemez), mint indirekt mutagénnel teszteltük. A vizsgálatoknál negatív- (ill. a megfelelő oldószeres és/vagy S9 mixet tartalmazó kontrollokat) és pozitív kontrollokat is beállítunk. A baktériumtörzsek mutagének iránti érzékenységét minden alkalommal a megfelelő diagnosztikus mutagénekkel ellenőrizzük (TA98: 4-nitro-o-feniléndiamin [200%, DMSO-ban oldva], TA100: nátriumazid [10%]). A törzsek ampicillin rezisztenciáját is ellenőrizzük. (Az ampicillines lemez összetétele (1 dm3-re): 15 g agar, 910 ml desztillált víz, 20 ml 50X VB só, 50 ml 40% glükóz, 10 ml steril hisztidin · HCl · H2O (2 g per 400 ml H2O), 6 ml steril 0,5 mM biotin, 3,15 ml steril ampicillin oldat (8 mg/ml 0,02 N NaOH).) A kezelt minták revertáns telepszámait a kontroll csoport revertáns telepszámaival hasonlítottuk össze a normalitásvizsgálat függvényében Student-féle kétmintás t-próba vagy Mann-Whitney próba segítségével, ahol a kezelt csoportban a revertáns telepszámok kontrollhoz viszonyított statisztikailag szignifikáns pozitív irányú eltérését tekintettük a mutagén hatás jelenlétének. A statisztikai szignifikancia kritériuma: p<0,05. 2

Az állatkísérletek a Munkahelyi Állatkísérleti Bizottság működési szabályzatával összhangban történtek.

A hatósági engedély nyilvántartási száma: BA02/2000-23/2001 ill. BA02/2000-24/2006.

19

4.1.1.2 ELŐINKUBÁCIÓS AMES-TESZT Ismét a fentiekben említett Salmonella typhimurium törzseket használtuk: a frame-shift mutációk kimutatására alkalmas TA98-as és a bázispárszubsztitúcióra érzékeny TA100-as törzset. Mivel számos mutagén anyag, főként a környezeti minták, a konvencionális Salmonella Ames-tesztben nehezen detektálhatók, a standard eljárás egy változatát, az érzékenyebb előinkubációs Ames-tesztet is alkalmazzuk [66]. Az előinkubációs Ames-teszt során a tesztanyagok és a S. typhimurium baktériumok együtt magasabb koncentrációban inkubálódnak, mielőtt a minimál-glükózagar lemezekre kerülnének, szemben a hagyományos eljárással. A baktériumtenyészetből 100 µl-t, 0,4 ml pH 7,4 foszfátpuffert (vagy 0,5 ml S9 mixet) és a vizsgálandó mintát Eppendorf csövekbe pipettázzuk. Az előinkubáció során a mintákat 37 °C-on 30-120 percig inkubáljuk. Ezután hozzáadjuk a 2 ml topagarhoz és rárétegezzük a minimálagar lemezre. 37 °C-on, 48 óráig inkubáljuk. Minden esetben három párhuzamos lemezt készítünk. Az Ames-teszt megfelelő pozitív és negatív kontrolljait alkalmazzuk (4.1.1.1 fejezet). 4.1.1.3 VIZELETMUTAGENITÁS AMES-TESZTBEN Kezelt állatok vizeletmintái potenciális mutagén hatásainak vizsgálatára a konvencionális lemezinkorporációs Salmonella Ames-tesztet alkalmaztuk [66]. Beltenyésztett (PTE-ÁOK, nem akkreditált, konvencionális, C-szintű állatház) hím/nőstény F-344, 3 hónapos, kb. 100 g tömegű patkányokat hatosával a vizsgálat paramétereinek megfelelő számú csoportba rendeztük (lásd Részletező leírás). Az állatokat egyenként vizeletgyűjtésre alkalmas metabolikus ketrecekben helyeztük el. A kezelendő állatcsoportok – előzetes 24 órás éhezés után – a tesztanyag adott dózisait gyomorszondán (po.) át és/vagy intraperitoneálisan (ip.) kapták2. A kontroll csoportot po. és/vagy ip. a megfelelő oldószerrel kezeltük. Az állatok tápot a metabolikus ketrecben való tartózkodás alatt nem, csapvizet azonban ad libitum fogyaszthattak. Az egyes állatok vizeletmintáit hűtés mellett (+ 4 °C), elkülönítve, steril vizeletgyűjtő pohárban gyűjtöttük az első (/és a második) 24 óra során, majd csoportonként és mintavételi idő szerint egyesítettük az oszlopkromatográfiás technikához szükséges nagyobb

térfogat

eléréséhez.

Meghatároztuk

az

egyes

vizeletcsoportok 20

kreatininkoncentrációját, majd a hűtött és szűrt mintákat makroretikuláris műgyantával töltött oszlopokon töményítettük (Sigma Amberlite XAD-4 és XAD-7, 1:1 v/v, SigmaAldrich Kft., Budapest) [28, 67]. A preparálás eredményeként 10x-es töménységű, dimetil-szulfoxidos

eluátumokat

kaptunk

1

mmol/l

kreatininkoncentrációhoz

standardizálva. A megfelelő vizeletkoncentrátumokból 100 µl-t adtunk a TA98-as és 100-as törzsekhez. Három párhuzamos lemezzel dolgoztunk. A tesztet elvégeztük a ßglükuronidázt (250 U/lemez) és szulfatázt (100 U/lemez) tartalmazó standard dekonjugációs enzimek jelenlétében (+DE), mely a genotoxicitást esetleg elfedő kötésből felszabadítja a metabolitokat, ill. annak hiányában (-DE) is.

21

4.1.2 CITOGENETIKAI VIZSGÁLATOK 4.1.2.1 MIKRONUKLEUSZ TESZT3

5. ábra Binukleált sejt mikronukleusszal, mikroszkópos felvétel (nagyítás: 400x) Az in vitro mikronukleusz (MN) tesztet citokalazin-B módszerrel binukleált (kétmagvú) sejteken, humán limfocita sejttenyészetben végezzük [68]. Vénapunkcióval steril heparinos vérvételi csövekbe (BD Vacutainer) vett teljes vér 0,7 ml-éhez a 9 ml tápfolyadék (RPMI 1640, összetétele: 500 ml RPMI-hez 125 µl penicillin, 25 mg streptomycin, 75 ml FBS) bemérésekor a rendszerhez hozzáadjuk a vizsgálandó anyagot és 200 µl fitohemagglutinint (növényi lektin), mely a sejtciklus G0 fázisába került limfocitákat blasztos transzformációra, azaz osztódásra serkenti, ezáltal a limfociták visszatérnek a sejtciklusba. Ezután 37 °C-on, nedves kamrában, 5% CO2-termosztátban inkubáljuk. A fitohemagglutinin stimulációt követő 44. órában a limfocitatenyészethez 3

Mutáció során beszélhetünk pontmutációról, mely csupán egyetlen bázist érint, vagy több bázis

inszerciójáról, deléciójáról, mint ahogyan nagyobb méretű deléciókról, kromoszómatörésekről illetve teljes kromoszómák elvesztéséről vagy többletéről is. A mikronukleusz teszt is annak a tesztrendszernek a része, mely az új kémiai anyagok, fizikai tényezők genotoxikus hatásának tesztelésére hivatott. Olyan kémiai anyagok mutagén hatásának kimutatására alkalmas, melyek interfázisban lévő sejtek citoplazmájában megjelenő kromoszóma fragmentumok képződését okozzák. Ezek a DNS fragmentumok számfeletti kromoszómából vagy kromoszómális törtvégekből (acentrikus fragmentumok) származó, sejtmagként festődő ún. mikronukleuszok, melyek átmérője a mag átmérőjének kb. 1/5-1/20-ada, az osztódás során egyik utódsejtmagba sem képesek integrálódni, a sejtmag mellett elkülönülten helyezkednek el (5. ábra). Kromoszómatörést okozó (klasztogén) vagy extra kromoszómát eredményező (aneugén) hatásra gyakoriságuk megsokszorozódik. A mutagén hatás vizsgálatához limfocitákat, epiteliális sejteket használhatnak.

22

100 µl citokalazin-B-t adunk, mely a teljes magosztódás után blokkolja a sejtosztódást. A 72. órában az interfázisba került sejtek nagy része kétmagvú. A centrifugálás és a felülúszó eltávolítása után 0,56% KCl-dal 10 percig szobahőmérsékleten (20-25 °C) hipotonizálunk, majd metanol:ecetsav 3:1 arányú keverékét cseppenként adagolva, 4-5 alkalommal fixálást végzünk. Minden alkalom után centrifugálunk, és a felülúszót eltávolítjuk. 80 µl sejtszuszpenziót tárgylemezre cseppentünk, majd száradás után 3%os Giemsa-val 15 percig festjük. Megszámláljuk a citokinézisben blokkolt kétmagvú sejteket. 1000 leszámolt sejtből adjuk meg a mikronukleuszok előfordulási arányát (MN/1000 sejt, függetlenül a sejtekben található mikronukleuszok számától). Pozitív kontrollként bleomycint használunk, negatív kontrollként a mintával nem-exponált illetve

az

adott

oldószerrel

kezelt

kultúrát.

A

statisztikai

vizsgálatokat

normalitásvizsgálat után Student-féle páros t-próbával végeztük. A statisztikai szignifikancia kritériuma p<0,05 volt. 4.1.2.2 TESTVÉRKROMATID-CSERE (SCE) ANALÍZIS4 Teljesen eltérő genetikai végpont vizsgálható a szintén a citogenetikai módszerek közé tartozó, testvérkromatidok kicserélődésével (SCE) járó jelenséggel. SCE-analízist bróm-dezoxiuridin (BrdU) + fluoreszcencia + Giemsa módszerrel végzünk, 72 órás humán limfocita sejttenyészetben [69]. SCE kimutatása csak osztódó sejtekben lehetséges. Vénapunkcióval steril heparinos vérvételi csövekbe (BD Vacutainer) vett teljes vér 0,7 ml-éhez 9 ml tápfolyadék (RPMI 1640, összetétele: 500 ml RPMI-hez 125 µl penicillin, 25 mg streptomycin, 75 ml FBS) és 100 µl BrdU bemérésekor a rendszerhez hozzáadjuk a vizsgálandó anyagot és 200 µl fitohemagglutinint (növényi lektin). Ezután 37 °C-on, nedves kamrában, 5% CO2-termosztátban inkubáljuk. A fitohemagglutinin-stimulációt követő 70. órában a limfocitatenyészethez 20 µl kolhicint adunk, mely a mitózist metafázisban leállítja (M2 fázis). 4

A perifériás limfociták in vitro tenyésztése során nukleozid-analóg (bróm-dezoxiuridin) beépülését

lehetővé téve, a szemikonzervatív replikáció következtében a második metafázisban (M2 fázis) a testvérkromatidok differenciális festődését érhetjük el. Genotoxikus hatásra megnő a testvérkromatidok homológ szakaszai közötti kicserélődés gyakorisága (6. ábra). A módszer igen érzékeny a hatásukat az Sfázisban kifejtő anyagokra. Ismert, hogy a DNS-léziók csaknem mindegyike vezethet SCE keletkezéséhez.

23

6. ábra M2 fázis, testvérkromatidok differenciális festődése; SCE-k, mikroszkópos felvétel (nagyítás: 1000x) A 72. órában centrifugálással kezdünk, a felülúszó eltávolítása után 0,56% KCl-dal 40 percig szobahőmérsékleten (20-25 °C) hipotonizálunk, majd metanol:ecetsav 3:1 arányú keverékét cseppenként adagolva, 4-5 alkalommal fixálást végzünk. Minden alkalom után centrifugálunk, és a felülúszót eltávolítjuk. 80 µl sejtszuszpenziót tárgylemezre cseppentünk, majd száradás után a kromoszóma-preparátumokon az SCE-ket módosított fluoreszcens+Giemsa eljárással [70] tesszük láthatóvá. A lemezeket PBS-sel (8,76 g NaCl, 0,095 g KH2PO4, 0,748 g K2HPO4, bidesztvízzel 1 l-re kiegészítve) 5 percig kezeljük, 1 ml Hoechst 33258 (0,5 mg/ml) + 99 ml PBS-sel 10 percig festjük, majd PBS-ben történő öblítés után fedőlemezzel fedjük. Kvarclámpával 60 perces UVbesugárzást (13 cm távolságból) követően a fedőlemezt eltávolítjuk és a lemezeket 90 percig 60 °C-os tömény sóoldat (2x SSC: 0,3 M NaCl + 0,03 M Na-citrát) hatásának tesszük ki, majd 3%-os Giemsával (foszfát pufferben) 10 percig festjük. Egy tárgylemezen 25 teljes kromoszómaszámú (2n=46), M2 fázisban lévő sejtet értékeltünk. Ezen kívül számláltuk az M1 és M3 fázisú sejtek előfordulási arányát is. Mindkét csoportban

1000x-es

nagyítással,

fénymikroszkóposan

vizsgáltuk

a

szétterült

kromoszómák testvérkromatidjai között történt terminális (=1 SCE) és intersticiális (=2 SCE) cseréket. Ezek gyakoriságát SCE/sejt egységben számoltuk, majd átlagoltuk. Pozitív kontrollként etilmetán-szulfonátot használtunk, negatív kontrollként a mintával nem-exponált illetve az adott oldószerrel kezelt kultúrát. A statisztikai vizsgálatokat 24

normalitásvizsgálat után Student-féle páros t-próbával végeztük. A statisztikai szignifikancia kritériuma p<0,05 volt.

25

4.1.3 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL ROSTSZERKEZETŰ ANYAGOKHOZ KÖTHETŐ MUTAGENITÁS ÉS KOMUTAGENITÁS VIZSGÁLATÁRA

Egy specifikus in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellt fejlesztettünk ki rostos szerkezetű anyagok (pl. azbeszt, szén nanocső) számára [27]. A modell lényege, hogy a rostos szerkezetű anyagok és a mezotélsejtek közötti krónikusan fennálló, direkt kontaktust vizsgáljuk potenciális mezoteliómaindukáló hatás kutatása érdekében. A kísérlet kisszámú állatot igénylő egyszerű sebészi eljárásból áll. Az állatokat a vizsgálandó, előkezelés nélküli rostmintával is exponáltuk, illetve a környezeti expozíció modellezésére 1-nitropirénnel (1-NP) (Sigma-Aldrich) előkezelt rostokat használtunk, mely az IARC szerinti 2B csoportba tartozó, lehetséges humán karcinogén, és genotoxikus anyag [5, 28]. Az előkezelés során 10 mg rostmintát 1-NP telített vizes oldatával 24 órán keresztül szobahőmérsékleten (20-25 °C) 300 percenkénti fordulatszámmal (f/p) rázattunk. A rázatott mintákat nagy sebességgel addig centrifugáltuk (6000 f/p), míg a rostok teljesen kiülepedtek. A felülúszót leszívtuk, és a nedves rostot kiszáradásig 37 °C-os termosztátba helyeztük. Beltenyésztett (PTE-ÁOK, nem akkreditált, konvencionális, C-szintű állatház) hím/nőstény, 1 éves, kb. 400 g tömegű Wistar/Fischer 344 patkányokat hatosával öt csoportba (előkezelés nélküli és előkezelt 2-féle rosttípus, negatív kontroll) rendeztünk. Az expozícióhoz az ún. Kertai-féle zsebet („Kertai’s fold”; lig. hepatogastricum) készítettük elő, mely a kiscseplesz egy ligamentuma, amely a nagy májlebeny (LLL: left lateral lobe = lobus hepatis sinister lateralis) homorú felszínéhez csatlakozik. Éternarkózist követően az állatot hátára fektetve rögzítettük. A mellkas alatt, középen, hosszanti bemetszéssel megnyitottuk a hasüreget. A hasfalra gyakorolt enyhe nyomással előtűnt a nagy májlebeny és annak belső oldalán preparáltuk a Kertai-féle zsebet. A vizsgált előkezelés nélküli ill. 1-NP-vel előkezelt rostminták 10 mg-jait (10 mg/állat; 25 mg/ttkg) kemény zselatin kapszulába helyeztük, és a peritoneum kettőzetéből álló zsebbe ültettük (7, 8. ábra). Két rétegben zártuk a hasüreget. Az állatokat konvencionális állatházi körülmények között tartottuk, csapvizet és félszintetikus táplálékot (CRLT/N rágcsálótáp; Szindbád Kft. keverőüzem, Gödöllő) kaptak ad libitum. Negatív kontrollként a kozmetikai- és gyógyszeriparban ismert inert cinkoxidport (PTE Egyetemi Gyógyszertár, Pécs) használtuk, melynek nincs 26

mezoteliómaindukáló hatása. 12 hónap elteltével a túlélő állatokat leöltük2 és boncoltuk, és a májból ill. az elváltozásra gyanús szervekből (peritoneum, cseplesz) rutin hisztopatológiai módszerek szerinti vizsgálatot végeztünk.

7. ábra Kertai-féle zseb preparálása a nagy májlebeny belső felszínén. Az eszköz hegye a képen a Kertai-féle zsebben helyezkedik el

27

8. ábra Azbesztet tartalmazó keményzselatin-kapszula elhelyezése a Kertai-féle zsebben

28

4.1.4 PELOIDOK 4.1.4.1 HÉVÍZI ÉS KOLOPI GYÓGYISZAPOK, FIZIKAI, KÉMIAI, BIOLÓGIAI ADATOK Hévízi5 [71, 72, 73] és kolopi6 gyógyiszapokat vizsgáltunk in toto, illetve klasszikus talajkémiai eljárással [74]. A peloidminták fizikai, kémiai [75, 76, 77] és biológiai adatait az I-IV. táblázat tartalmazza.

I. táblázat: A peloid minták publikált fizikai és kémiai adatai Komponensek Hévíz

Vízoldható szervetlen frakció

Vízoldható szerves frakció Kjeldahl nitrogén Hamu Huminsav (össz) Kolop

Komponensek aránya (m/m%) 14,44 0,903 3800 mg/kg 23,9 50,3

Szervetlen frakció Szerves frakció

5

93,04 1,53

A hévízi tó Európa legnagyobb felületű, meleg vizű gyógytava, az első világháború óta Magyarország

egyik legnépszerűbb gyógyhelye. A hévízi iszap a kevert peloidok csoportjába tartozik, mert jelentős mennyiségben (20-25%) tartalmaz szerves anyagot (tőzeg) a szervetlen komponensek mellett. Az iszapot eredetileg a tó medréből termelték ki, melynek alját 6-8 m vastagságban tőzeg béleli, és ezen a rétegen tör felszínre a vulkanikus eredetű szervetlen iszap, mely keveredve a tőzeggel létrehozza a hévízi iszapot. Ma már természetvédelmi okokból a kezelésre használt anyagot a tó elvezető csatornájából gyűjtik a kezelésre használt anyagot. Származási hely: Hévízgyógyfürdő és Szent András Reumakórház (minősítés száma: 34/Gyf/1972., nyilvántartási szám: VIII/3 [2007]) 6

A kolopi iszapot Tiszasüly település mellett a Tisza egykori medréből termelik ki. Ez a peloid minimális

szerves anyag tartalma miatt a szervetlen iszapok közé tartozik. Mintánkat a Harkányi Gyógyfürdő Rt.-től kaptuk, ahol a kiszárított iszapot saját gyógyvizükkel keverve alkalmazzák. Származási hely: Harkányi Gyógyfürdő (minősítés száma: OTH-GYÓGYF 187-2/2011, nyilvántartási szám: VIII/2)

29

II. táblázat: A hévízi peloid minta kémiai komponensei és szemcsenagysága Szervetlen (anorganikus) komponensek a hévízi iszapban használatra kész állapotban Vízoldható

Sósavban oldható

(m/m%)

(m/m%)

Sósavban nem oldható (m/m%)

SiO2

0,002

SiO2

0,94

SiO2

5,46

CaO

0,21

CaO

20,25

CaO

0,04

MgO

0,03

MgO

1,29

MgO

0,01

Na2O

0,03

Na2O

0,004

Na2O

0,04

SO3

0,27

SO3

0,93

TiO2

0,04

CO2

0,18

CO2

14,5

Fe2O3

0,06

TiO2

0,002

Al2O3

0,17

Fe2O3

0,49

K2O

0,06

Al2O3

0,78

K2O

0,09

Szemcsenagyság és %-os megoszlása >1 mm

1,1%

1-0,63 mm

2,4%

0,63-0,32 mm

3,9%

0,32-0,20 mm

5,5%

<0,20 mm

87,1%

Szerves anyag Szárazanyagban

Használatra készen

(m/m%)

(m/m%)

Extraktbitumen

0,42

0,25

Vízoldható organikus anyagok

0,36

0,22

Könnyen hidrolizálható fehérje

0,64

0,38

Nehezen hidrolizálható fehérje

0,74

0,44

Hemicellulóz

2,25

1,35

Cellulóz

0,62

0,37

Huminsavak

7,82

4,68

Humuszkísérő anyagok

1,37

0,82

Humin + Lignin

11,84

7,08

Nem hidrolizálható nitrogén

0,4

0,24

Hexánkivonat

0,34

0,2

30

III. táblázat: A kolopi peloid minta kémiai komponensei és szemcsenagysága

Szárazanyag tartalom (m/m%) használatra kész állapotban

Szemcsenagyság és %-os megoszlása

SiO2

58,88

CaO

2,66

>0,02 mm

13,8%

MnO2

0,03

MgO

2,2

0,02-0,002 mm

18,1%

Al2O3

17

CaCO3

2,3

<0,002 mm

60%

Fe2O3

7,8

SO3

1,24

veszteség

8,1%

IV. táblázat: Iszapminták biológiai komponensei hévízi (telep/g)

kolopi (telep/g)

Össztelepszám 37 °C-on

2794

372

Clostridium

800

0

Enterococcus

0

0

Coliform

0

0

4.1.4.2 ELŐKEZELÉS NÉLKÜLI PELOIDOK A sensu stricto előkezelés nélküli peloidok genotoxikológiai vizsgálatára az érzékenyebb előinkubációs Ames-tesztet alkalmaztuk [66] (4.1.1.2 fejezet). A hévízi és kolopi peloidokat használatra szánt állapotukban tároltuk, a kísérlet előtt szárítószekrényben (Heraeus T 5042) 105 °C-on tömegállandóságig szárítottuk, majd autoklávban sterileztük (120 °C, 20 perc, 105 Pa). (A sterilezés eredményessége ellenőrzött.) A steril peloidokat a S. typhimurium baktériumtörzsekkel 30-60-120 percig inkubáltuk 37 °C-on. A peloidok három dózisával dolgoztunk: 20-40-80 mg/108 baktérium. Az előinkubációs periódus végén a mintákat 800/perc fordulaton 8 percig centrifugáltuk, majd a 108 baktériumot tartalmazó felülúszót a topagarhoz adtuk. Három párhuzamos lemezt készítettünk. Az Ames-teszt megfelelő pozitív és negatív kontrolljait alkalmaztuk (4.1.1.1 fejezet). 31

4.1.4.3 PELOIDKIVONATOK Az in toto vizsgálatok negatív eredményei után kivonatokat is készítettünk. A gyógyiszapok kivonatainak vizsgálatára a konvencionális Salmonella Ames-tesztben TA98 és TA100-as törzseket használtunk (4.1.1.1 fejezet). A tesztet metabolikus aktivációval (Aroclor 1254-el indukált Sprague-Dawley patkányok májából preparált metabolizáló enzimekkel [S9 mix]) és anélkül is elvégeztük (S9+/-) [66]. A

peloidokat

szárítószekrényben

(Heraeus

T

5042)

105 °C-on

tömegállandóságig szárítottuk. A négyféle peloidkivonat elkészítéséhez rendre desztillált vizet, 0,1N-os sósavat, metanolt (AR: analytical reagent, Sigma-Aldrich), illetve toluolt (ALT: analitikai tisztaságú, Interkémia Zrt., Budapest) használtunk. A 20 grammnyi iszapmintákat 1 órán keresztül 100 ml oldószerrel rázattuk, majd leszűrtük (pórusátmérő: 0,45 µm) [74]. Az extraktumokat három dózisban teszteltük: 100, 66, 33 μl/lemez (108 baktérium). Negatív kontrollnak a megfelelő oldószereket használtuk. Az Ames-teszt megfelelő pozitív kontrolljait alkalmaztuk (4.1.1.1 fejezet). Három párhuzamos lemezt készítettünk. A kísérletet három hónap elteltével megismételtük. Az iszapmintákat hermetikusan lezárt tartályokban, szobahőmérsékleten (20-25 °C) tároltuk.

32

33

Krónikus, kontaktexpozíciós modell

in vivo

SCE

MN

Vizeletmutagenitás Ames-tesztben

Citogenetikai vizsgálatok

Előinkubációs Ames-teszt

Standard Salmonella Ames-teszt

Alkalmazott módszerek

kombinált in vitro/in vivo

in vitro

Vizsgálati típusok

krokidolit, krizotil, +/- 1-NP MWCNT, SWCNT, +/- 1-NP

MWCNT, SWCNT

1-NP

MWCNT, SWCNT

peloidok

MWCNT

peloidkivonatok

MWCNT, SWCNT

Anyagcsoportok

V. táblázat: A dolgozatban ismertetett vizsgálatok összefoglaló táblázata

patkány n=6 állat/csoport

patkány n=6 állat/csoport vizeletminta S. typhimurium TA98, TA100

humán limfociták

S. typhimurium TA98, TA100

Sejtkultúrák, biológiai rendszerek

12 hónap

24 h

24 h, 48 h

72 h

1 h előinkub. + 48 h 30-60-120 perc előinkub. + 48 h 72 h

48 h

48 h

Kísérlet tartama

25 mg/ttkg

po. 50 mg/ttkg

100, 50, 25 µl/lemez cc. 0,01 mg/µl MWCNT cc. 0,002 mg/µl SWCNT 100, 66, 33 μl/lemez 5, 10 mg/lemez 20, 40, 80 mg/lemez 10 mg/szövettenyésztő cső cc. 1 mg/ml po., ip. 30 µmol/ttkg

Kezelési mód

4.1.5 STATISZTIKAI MÓDSZEREK SALMONELLA AMES-TESZT ÉRTÉKELÉSÉHEZ

Az Ames-teszt eredményeinek értékelése során több statisztikai és nem statisztikai módszert is figyelembe vettünk, mivel egyetlen egy, kizárólagosan jól működő rendszer nincsen. A Salmonella Ames-teszt segítségével végzett mutagenitási vizsgálatok értékelésében számos statisztikai lehetőséget használnak az egyes kutatók is [78]. Az eltérő statisztikai elemzések alkalmazásának oka a mind pontosabb információnyerés igénye. A klasszikus értékelési módszer – a kontroll átlagához viszonyított kétszeres telepszám módszere, a „kétszeres” szabály – nem sugall szilárd tudományos megalapozottságot, hiszen matematikai értelmezésben több csoport számtani átlagának összevetéséről van szó. A középértékek összehasonlítására számos statisztikai módszer áll rendelkezésre, melyek biológiai rendszerek értékelésében is jól használhatók más mérési területeken, így jogos az igény e módszerek felhasználására az Ames-teszt esetében is. Egy 1995-96-ban végzett felmérés [78] eredményeként az említett két év során publikált kutatások 40%-ban alkalmazták a kétszeres szabályt, 3%-ában a t-próbát, 9%ában ANOVA módszert, a legkisebb négyzetek módszerét (alapszintű lineáris regressziós modell) a kutatások 11%-ában, 20%-ában egyéb lineáris regressziós modellt és 17%-ában egyéb, nem besorolható módszereket használtak. A választott elemzések sokfélesége a statisztikai módszerek matematikai előfeltételeinek megléte mellett arra enged következtetni, hogy az egyes mutagenitási vizsgálatok során kapott revertáns telepszámok matematikai eloszlásai eltérnek, nem mutatnak egyezőséget a különböző kutatások során. Ennek hátterében a biológiai rendszerek sokszínűsége is állhat, így joggal vetődik fel, hogy a kapott eredmények értékelésében nem jelenthető ki csakis egyetlen módszer megalapozottsága. A statisztikai módszerekkel történő összehasonlítások során az egyes módszerek matematikai hátterének megléte esetén jó eséllyel kapunk megbízható eredményt a módszerek alkalmazási feltételeinek szigorú követésével. A számos statisztikai számítási módszer erősségeit egyesítve több számítógépen futtatható alkalmazás készült (AMESFIT, SALM stb.) ezzel is egyszerűsítve a kutatók munkáját. A tapasztalat azonban azt mutatja, hogy még e programok sem tekinthetők minden szempontból, minden vizsgálat esetén teljesen megbízható módszernek. 34

Az a tény azonban igazolható, hogy számos esetben a kétszeres szabály [79] alkalmazásával (mely egyes Salmonella törzsek esetében az alacsony spontán mutációs ráta miatt háromszoros szabályra módosul) nem mutatható ki a mutagén hatás olyan esetekben, ahol a statisztikai szoftverek illetve más elemzési módszerek szignifikáns különbséget jeleznek. Több kutató elengedhetetlennek tartja a dózis-hatás összefüggés igazolását is a mutagenitási vizsgálatok alkalmazásával [80, 81, 82]. Ez részben megvalósítható a kétszeres szabály alkalmazásával is, ugyanakkor szerencsésebb választás lehet a lineáris regressziós modellek vagy egyéb statisztikai próbák alkalmazása. Az Ames-teszt esetében alkalmazott párhuzamos kísérleti elrendezések gyakran alacsony száma nehezíti az értékelés pontosságát és megbízhatóságát. A három párhuzamos lemezzel végzett tesztek esetében a biológiai rendszer sajátosságából adódóan egyes törzseknél az elemszámok szórása olyan nagymértékű lehet, hogy a statisztikai elemzés eredményeként nem mutatható ki szignifikáns összefüggés olyan esetben sem, ahol a kísérleti elrendezés és hipotéziseink alapján azt várnánk. A megválasztott – legtöbbször 5%-os – szignifikancia határ is tartalmazza a hibás értelmezés, a nullhipotézis téves elvetésének valószínűségét éppen az esetek 5%ában. A körülmények figyelembe vételével – például egy várt dózis-hatás összefüggés csak részleges megléte, vagy a mutagenitás dózistól független jelentkezése illetve nem a hatáserősségnek megfelelően csak egyes dózisok esetében történő megléte – a teszt értékelhetőségének egyéb feltételeinek betartása mellett (pl. háttérhomogenitás vizsgálata, pozitív és negatív kontrollok megléte) az álpozitív vagy éppen az álnegatív eredmény kiszűrését teszi lehetővé. Felvetődik persze annak a lehetősége is, hogy az adott elemszámok és eloszlások mellett más statisztikai próba alkalmazása megfelelőbb eredménnyel járhat, ugyanakkor a statisztikai kritériumoknak megfelelő, a megfelelő paraméterekkel rendelkező minták esetében lényegi eltérés nem várható más statisztikai próba alkalmazásától sem.

35

4.2 RÉSZLETEZŐ (AZ EGYES MÓDSZEREKNÉL ALKALMAZOTT) LEÍRÁS

4.2.1 KÍSÉRLETI ELRENDEZÉS (2.2) 4.2.1.1 VIZELETMUTAGENITÁS AMES-TESZTBEN Beltenyésztett nőstény, 3 hónapos, kb. 100 g tömegű F-344 patkányokat hatosával négy csoportba rendeztünk (po. és ip. 1-NP, po. és ip. oldószeres kontroll). Az állatokat egyenként helyeztük el vizeletgyűjtésre alkalmas metabolikus ketrecekben. Az egyik kezelendő csoport egyszeri 30 µmol/ttkg 1-NP-t (CAS No. 5522-43-0, SigmaAldrich, tisztaság: 99%) kapott kukoricacsíra-olajban (corn-oil, Sigma-Aldrich), gyomorszondán keresztül (po.), míg a másik kezelt csoport ugyanezt a dózist intraperitoneálisan (ip.) kapta. A két kontroll csoportot csak az oldószerrel kezeltük po. illetve ip. A vizeletmintákat hűtés mellett, elkülönítve gyűjtöttük az első és a második 24 óra során külön-külön. A továbbiakban a 4.1.1.3 fejezetben leírtak szerint jártunk el. A konvencionális lemezinkorporációs Ames-tesztet alkalmaztuk a vizeletminták mutagenitásának vizsgálatára [66] (4.1.1.1 fejezet). A vizelet-koncentrátumokból 100 μl-t adagoltuk a Salmonella TA98 ill. 100-as törzset tartalmazó két-két lemezhez [67]. 4.2.1.2 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL Az UICC azbesztmintákat (krokidolit és rodéziai krizotil) Rendall és Timbrell (SPI Supplies, Glamorgan, UK) biztosította [17]. Kémiai tisztaságú és 1-NP-vel (Sigma-Aldrich)

előkezelt

mintákat

használtunk.

Az

azbesztrostokkal

történt

kutatásaink során korábbi HPLC eredmények igazolják a felülethez kötött anyagok jelenlétét [25]. Beltenyésztett hím, 1 éves, kb. 400 g tömegű Wistar patkányokat rendeztük hatosával öt csoportba (továbbiakban lásd 4.1.3 fejezet).

36

4.2.2 KÍSÉRLETI ELRENDEZÉS (2.3) Az egyfalú- (SWCNT) és a többfalú szénnanocső (MWCNT) minták az MTA Központi Kémiai Kutatóintézetéből származnak (Gyártó: Shenzhen Nanotech. Port Co., Ltd. Kína). Az SWCNT átmérője <2 nm, hossza 5-15 µm, tisztasága: 90 vol%; az MWCNT hossza 1-2 µm, átmérője, 10-30 nm, tisztasági foka: 95-98 vol%. 4.2.2.1 SALMONELLA AMES MUTAGENITÁSI VIZSGÁLATOK 4.2.2.1.1 Klasszikus, lemezöntéses módszer Mutagén hatásra vonatkozó kísérleteink egy részében a klasszikus, lemezöntéses eljárást alkalmaztuk [66] (4.1.1.1 fejezet). A topagarba különböző koncentrációjú szénnanocsöveket mértünk, majd MGM táptalajra öntve 37°C-on 48 óráig inkubáltuk. Törzsoldatunkban 1 ml toluolban diszpergáltunk 10 mg MWCNT-t. Ebből háromféle koncentrációt mértünk be, 100 µl, 50 µl és 25 µl-t. Mindegyik esetben 3-3 párhuzamost használtunk. Ugyanezt tettük az SWCNT-vel is azzal a különbséggel, hogy a törzsoldatban, ebben az esetben 5 ml toluolban sikerült felvenni 10 mg SWCNT-t. A toluolra is készítettünk egy 9 táptalajból álló hígítási sort az előbb említett koncentrációknak megfelelően azzal a céllal, hogy összevessük a toluol önmagában adott mutagenitási értékeit a toluolban oldott szénnanocsövek eredményeivel. 4.2.2.1.2 Előinkubációs Ames-teszt A standard eljárás egy változatát, az érzékenyebb előinkubációs Ames-tesztet alkalmaztuk [66] (4.1.1.2 fejezet) a szükségesnek vélt változtatásokkal. A toluolt kihagytuk a további kísérletekből. Eppendorf csövekbe mértük az MWCNT-t (5 mg illetve 10 mg mennyiségben) a baktériumtenyészetet és a puffert, azután 1 órán keresztül inkubáltuk. Az így kapott elegyünket hozzáadtuk a topagarhoz, majd a minimál-glükózagar lemezekre öntöttük. 37 °C-on 48 óráig inkubáltuk. Minden esetben három párhuzamos lemezt készítettünk.

37

4.2.2.1.3 Vizeletmutagenitás Ames-tesztben A

szénnanocsöveket

félfolyékony

Carbopol-gélben,

mágneses

keverő

segítségével diszpergáltuk [83]. Beltenyésztett hím, kb. 100 g tömegű Fischer-344 patkányokat hatosával három csoportba rendeztünk. Az állatokat egyenként helyeztük el vizeletgyűjtésre alkalmas metabolikus ketrecekben. Gyomorszondán át két csoportot SWCNT és MWCNT 50 mg/ttkg egyszeri dózisával kezeltük. A harmadik, kontroll csoport csak carbopol-gélt kapott. A vizeletmintákat hűtés mellett (4 °C), elkülönítve gyűjtöttük az első 24 óra során. A további lépések a 4.1.1.3 fejezetben. 4.2.2.2 CITOGENETIKAI VIZSGÁLATOK 40 ml félfolyékony Carbopol-gélben diszpergáltunk 400-400 mg-ot mindkét típusú szénnanocsőből (MWCNT, SWCNT). A szénnanocsövek gélben való egyenletes eloszlatásához mágneses keverőt alkalmaztunk. Mikroszkópos homogenitásvizsgálatot végeztünk. A vérmintákat három egészséges donorból vettük lítium–heparint tartalmazó, steril, zárt vérvételi rendszerbe (BD Vacutainer). Mindegyik esetben 3 kontroll és 3 exponált mintát elemeztünk. A kísérletekben – az előkísérleteknél szokásos módon – a praktikusan (kitapadás, homogenitás, átlátszóság, kiülepedés) bemérhető legnagyobb dózist alkalmaztuk, mivel LD50 érték stb. nem álltak rendelkezésre. Az in vitro mikronukleusz (MN) tesztben (4.1.2.1 fejezet) a vizsgált sejtkultúrákhoz a tápfolyadék bemérésekor 10 mg MWCNT-t illetve SWCNT-t 1 ml gélben diszpergálva adtunk (a végkoncentráció: 1 mg/ml). A testvérkromatid-csere (SCE) tesztben (4.1.2.2 fejezet) ismételten 10-10 mg MWCNT-t, ill. SWCNT-t adtunk hozzá a vizsgált sejtkultúrákhoz (végkoncentráció: 1 mg/ml).

38

4.2.2.3 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL 10 mg előkezelés nélküli ill. 1-NP-vel előkezelt SW- és MWCNT-vel exponáltuk saját tenyésztésű F-344 nőstény patkányok hattagú csoportjait (előkezelés nélküli SW- és MWCNT, előkezelt SW- és MWCNT, ZnO-os kontroll) (4.1.3 fejezet).

39

4.2.3 KÍSÉRLETI ELRENDEZÉS (2.4) Megegyezik a 4.1.4.2 és 4.1.4.3 fejezetekben leírtakkal.

40

5 EREDMÉNYEK 5.1 AZ 1-NITROPIRÉN IN VIVO MUTAGENITÁSVIZSGÁLATA, ILL. AZ ERRE ÉPÜLŐ KRÓNIKUS, AZBESZTEXPOZÍCIÓS MODELL

5.1.1 VIZELETMUTAGENITÁS AMES-TESZTBEN Szignifikanciavizsgálat történt a kezelt (po. és ip. 1-NP) és a kontroll (po. és ip. kukoricaolaj) csoport mintái, valamint a kezelt csoportok enzimes (+DE) és enzim nélküli (-DE) mintái között. Statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitást a TA98as törzsben az ip. és a po. kezelt csoport első 24 órában begyűjtött vizeletmintáiban tudtunk kimutatni. Azonban, míg az ip. csoportban az enzimatikus bontás (dekonjugáció) nem befolyásolta az eredményt, addig a po. kezelt csoportnál csak a dekonjugáló enzimek jelenlétében jelentkezett szignifikáns mutagenitás (p=0,031). A TA100-as törzsben viszont csak az ip. kezelés okozott erősen szignifikáns (p=0,002; 0,010) mutagén hatást az első 24 órás vizeletmintáknál. Ez a mutagenitás mind az enzimek jelenlétében, mind hiányában jelentkezett (+DE vs. -DE), de a dekonjugáció szignifikánsan tovább fokozta a megjelenő mutagenitás erősségét (p=0,003). Viszont sem a 48 órás ip. minta, sem a 24- és 48 órás po. minták nem mutattak pozitivitást a TA100-as törzsben (VI. és VII. táblázat).

41

VI. táblázat: 1-NP-vel intraperitoneálisan vagy per os kezelt F-344 patkányok vizeletmintáinak mutagenitási vizsgálatai Salmonella Ames-tesztben TA98-as

Vizeletgyűjtés (h)

Kezelési mód

törzsben

Csoportok

0-24 24-48

po.

24-48

ip.

0-24

1-NP

TA98

p

TA98

p

p

(-DE),

(kontroll vs.

(+DE),

(kontroll

-DE vs.

revertáns

kezelt)

revertáns

vs. kezelt)

+DE)

0,024 *

0,080

0,383

0,321

0,031 *

0,443

0,195

0,115

telepszám

telepszám

(átlag ±SD)

(átlag ±SD)

155,9±29,9

Kontroll

18,9±7,1

1-NP

25,6±10,1

Kontroll

0,024 *

17,9±3,9 0,295

15±3,5

1-NP

41,6±8,0

Kontroll

72,5±14,6

1-NP

63,9±11,6

Kontroll

99,6±23,4

219,4±38,4

79,2±56,0 35±7,0

0,120

35,9±2,7 16,3±4,2

0,194

618,0±291,3 154,0±178

*szignifikáns különbség (p<0,05)

VII. táblázat: 1-NP-vel intraperitoneálisan vagy per os kezelt F-344 patkányok vizeletmintáinak mutagenitási vizsgálatai Salmonella Ames-tesztben TA100-as

Vizeletgyűjtés (h) 24-48

po.

0-24

24-48

ip.

0-24

Kezelési mód

törzsben

Csoportok

TA100

p

TA100

p

p

(-DE),

(kontroll vs.

(+DE),

(kontroll

-DE vs.

revertáns

kezelt)

revertáns

vs. kezelt)

+DE)

0,010 *

0,003 *

0,335

0,212

0,829

0,055

0,071

0,245

telepszám

telepszám

(átlag ±SD)

(átlag ±SD)

1-NP

808,5±27,2

Kontroll

325,3±4,1

1-NP

471,6±91,6

Kontroll

362,5±53,0

1-NP

359,5±13,4

Kontroll

317,5±49,2

1-NP

377,0±61,2

Kontroll

310,5±57,3

0,002 *

1168,5±2,7 677,0±74,9

0,282

1011,2±418 640,5±59,4

0,364

269,4±28,0 236,3±108,6

0,397

302,8±20,4 492,5±72,8

*szignifikáns különbség (p<0,05)

42

5.1.2 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL A kémiai tisztaságú és 1-NP-vel előkezelt azbesztmintákkal exponált állatcsoportok boncolása során makroszkóposan kékesszürke azbesztfelhalmozódás látható a hasüregben: a Kertai-féle zsebben és a környező szervek felszínén, az omentumon és a peritoneumon. A különböző azbesztmintákkal exponált állatcsoportok valamennyi tagjának májából készített szövetminták hisztológiai vizsgálata csupán megtartott szerkezetű májállományt, idegentest típusú granulomatózus reakciót és többmagvú óriássejteket mutatott ki (9, 10. ábra). Az exponált ill. a ZnO-dal kezelt negatív kontroll csoportban mezoteliómára utaló jeleket sem makroszkóposan, sem mikroszkópos vizsgálattal nem detektáltunk. A ZnO-dal kezelt kontroll csoport májszövetében idegentest típusú granulomatózus reakciót nem észleltünk. A kísérlet vége előtt elhullott vagy moribund patkányokat felboncoltuk. (Az elhullás: egy kontroll és egy a kezeletlen krizotil csoportból.) A hasűri szervek az eltávolítást követően patológiai vizsgálatra kerültek (PTE-ÁOK Pathologiai Intézet), mezoteliómára utaló szövettani elváltozásokat nem észleltünk.

9. ábra Idegentest típusú granulomatózus reakció (fehér nyilak) a patkány májszövetében, mikroszkópos felvétel (nagyítás: 200x)

43

10. ábra A májszövet heges állományában, kikapcsolt kondenzor mellett jól láthatóak az azbesztrostok (fekete nyíl), és idegentest típusú, többmagvú óriássejtek (sárga háromszög). A fekete szemcsék formalinpigmentnek felelnek meg (fehér nyíl). Fáziskontraszt-mikroszkópos felvétel (nagyítás: 400x)

44

5.2 SZÉNNANOCSÖVEK POTENCIÁLIS GENOTOXICITÁSÁNAK ÉS MEZOTELIÓMAINDUKCIÓJÁNAK VIZSGÁLATA

5.2.1 SALMONELLA AMES MUTAGENITÁSI VIZSGÁLATOK 5.2.1.1 KLASSZIKUS, LEMEZÖNTÉSES MÓDSZER Az alkalmazott bakteriális mutagenitási tesztben (Ames-teszt) első megoldandó problémáink közt szerepelt a szénnanocsövek homogén diszpergálása. Kísérleteinkhez diszpergáló közegként a toluolt használtuk. A rendszerből a szénnanocsövek gyakran kitapadtak az eszközökhöz és edényekhez, pontos adagolásuk így lehetetlenné vált. Másrészt a toluol megzavarta a biológiai rendszert, a vártnál nagyobb mutagenitási értékeket produkált, ezért a nanocsövekkel együtt történő használatra alkalmatlannak bizonyult. Gyakorlatilag a toluol hatását mértük, függetlenül attól, hogy mennyi és milyen típusú szénnanocső volt még jelen a rendszerben. Példaként közöljük a TA98-as törzzsel kapott eredményeinket (11. ábra). A diagramon fel nem tüntetett koncentrációk esetében a háttérhomogenitás hiánya miatt a telepszámok értékelhetetlenek voltak.

40 Átlagos telepszám

35 30 28,33

25

26,00

26,00

20 15

22,00 15,33

10 5 0 Neg. kontroll

A/25

A/50

B/25

Toluol/25

11. ábra Klasszikus, lemezöntéses Ames-teszt eredményei (átlagos telepszám +SD) Salmonella typhimurium TA98-as törzsön, kétféle szénnanocső (A: MWCNT; B: SWCNT), kétféle dózis: 25 ill. 50 µl/lemez

45

5.2.1.2 ELŐINKUBÁCIÓS AMES-TESZT Szignifikáns eltérést a toluol elhagyásával az előinkubációs tesztben sem tapasztaltunk Az előinkubáció általában előhívja a lemezöntéses technikával nem detektálható enyhe mutagén hatásokat. Esetünkben azonban a módszer nem juttatott plusz információhoz, kivéve, hogy toluol elhagyásával sem tapasztaltunk mutagenitást. Példának a TA100-as törzs eredményeit mutatjuk be a többfalú csövek esetében (12. ábra).

200 180 176,00

Átlagos telepszám

160 140

164,33 139,33

120 100 80 60 40 20 0 Neg. kontroll

5mg MWCNT

10mg MWCNT

12. ábra Az előinkubációs Ames-teszt eredményei (átlagos telepszám +SD) MWCNT-vel Salmonella typhimurium TA100-as törzsön, kétféle dózis: 5 ill. 10 mg/lemez

5.2.1.3 VIZELETMUTAGENITÁS AMES-TESZTBEN Statisztikailag szignifikáns mutagenitást (p<0,05) nem észleltünk sem a TA98as, sem a 100-as törzs esetén. A nanocsövek típusától az eredmények függetlenek voltak, és a vizeletminták enzimatikus dekonjugálása sem befolyásolta azokat (13, 14. ábra).

46

A bakteriális mutagenitási vizsgálatok tehát negatív eredménnyel zárultak, azaz sem bázispárszubsztitúciós, sem pedig kereteltolódásos mutációkat nem sikerült kimutatnunk a Salmonella rendszerben.

13. ábra SW- és MWCNT-vel kezelt és kontroll (po. carbopol-gélt kapott) csoportok vizeletmintáinak standardizált mutagenitása (átlagos telepszám +SD) TA98-as Salmonella törzsben

47

14. ábra SW- és MWCNT-vel kezelt és kontroll (po. carbopol-gélt kapott) csoportok vizeletmintáinak standardizált mutagenitása (átlagos telepszám +SD) TA100-as Salmonella törzsben

5.2.2 CITOGENETIKAI VIZSGÁLATOK 5.2.2.1 MIKRONUKLEUSZ TESZT A mikronukleusz (MN) tesztben MWCNT-kezeléssel kapott eredményeinket a 15. ábra szemlélteti. A binukleált sejtek gyakoriságát a kezelés nem befolyásolta, mely annyit jelent, hogy a tesztanyagnak nem volt a citogenetikai értékelést befolyásoló toxikus hatása a tenyészetekre, (mivel a sejtkultúrákban a vizsgált anyag potenciális citotoxikus hatása is kimutatható). Ilyen esetben a toxikus anyag megakadályozza, hogy a mitogén által osztódásra serkentett sejtek a sejtciklus G0 fázisából G1 fázisba kerüljenek [84]. Az adatokból páros t-próbával statisztikailag szignifikáns különbséget (p<0,05) nem találtunk a kezelt és a negatív kontroll (carbopol-géles) eredmények összehasonlítása során. Mivel a mikronukleuszok számfeletti kromoszómából vagy kromoszómális törtvégekből származhatnak, eredményeink alapján klasztogén és aneugén hatás sem igazolható a vizsgált magas MWCNT-koncentrációnál. Az azonos dózisú SWCNT-kezelés azonban határozott mitózisgátlást jelzett, amely a kétmagvú sejtszám nagyfokú csökkenése miatt lehetetlenné tette a számlálást.

48

15. ábra A párosított negatív kontroll és MWCNT-exponált minták átlagai között nincs statisztikailag szignifikáns (p<0,05) eltérés

5.2.2.2 SCE-ANALÍZIS Az SCE-analízist megelőzően először az osztódási kinetikát hasonlítottuk össze a negatív kontroll (carbopol-géles) és a kezelt tenyészetekben, a BrdU-beépülés alapján (16. ábra). Az MWCNT esetében szignifikáns eltérést nem találtunk, az SCE-analízis elvégezhető volt. Azonban az SWCNT-vel kezelt esetekben az osztódási kinetika teljes M1 irányú eltolódását tapasztaltuk, mely az értékelést nem tette lehetővé. Eredményeinket a 17. ábra szemlélteti: az adatok alapján páros t-próbával igazolható SCE-gyakoriság emelkedését nem tapasztaltunk.

49

≥ 16. ábra M1:M2:≥M3 fázisú sejtek megoszlása a negatív kontroll és az MWCNT-vel kezelt tenyészetekben a BrdU-beépülés alapján (átlag +SD) (M1: 1. metafázis, M2: 2. metafázis, M3: 3. metafázis)

17. ábra Kontroll és kezelt minták SCE átlagai +SD (MWCNT)

50

5.2.3 KRÓNIKUS, KONTAKTEXPOZÍCIÓS MODELL Mezoteliómára utaló elváltozásokat sem makroszkóposan, sem mikroszkóposan, a kezelt és a kontroll csoportban sem észleltünk. A patkányokat – abban az esetben, ha betegnek látszottak vagy elhullottak, ill. a 12 hónap elteltével a túlélőket – felboncoltuk. (A beültetést követő 23. napon egy MWCNT+NP, a 6. hónapban egy MWCNT, a 10. hónapban egy SWCNT+NP implantált patkány hullott el. Egy MWCNT+NP beültetett patkányt pedig moribund státusza miatt a 10. hónapban leöltünk.) A szervek az eltávolítást követően patológiai vizgálatra kerültek (PTE-ÁOK Pathologiai Intézet). Az elhullások okaként természtes halál került megállapításra. A 12. hónapban történt boncolások során minden esetben makroszkóposan a beültetés

helye

körüli

szervekre

(nagycseplesz,

peritoneum,

vékonybél

serosa)

szétszóródott szénkonglomerátumokat (18. ábra) és a máj peritoneum borítéka alatti nagy mennyiségű széndepozitumokat észleltünk. Egyéb makroszkópos eltérést, mint pl. hasűri folyadékgyülem (ascites), nekrózis, nem detektáltunk. A talált elváltozások (pl. ciszták, lipóma)

hisztológiai

granulomatózus

vizsgálata

reakciót,

megtörtént.

többmagvú

A

májmetszeten

óriássejteket,

idegentest

szénszemcséket

típusú

bekebelező

makrofágokat láttunk, melyeket kötőszövetes sövények határoltak el az ép szövettől. Mindkét szénnanocső kezelés hasonló elváltozásokat eredményezett (19. ábra). A ZnO-dal kezelt kontroll csoport májállománya ép volt.

51

18. ábra Szénkonglomerátumok a patkány peritoneumán (fehér nyíl)

52

19. ábra A kép felső részén megtartott szerkezetű májállományt lehet megfigyelni, míg az alsó részen a szénpor (hosszú nyíl) indukálta idegentest-típusú granulomatózus reakció (epitheloid sejtek, óriássejtek [rövid nyíl]) látható (mikroszkópos felvétel, nagyítás: 400x)

53

5.3 PELOIDOK

MUTAGÉN

AKTIVITÁSÁNAK

VIZSGÁLATA

BAKTERIÁLIS MUTAGENITÁSI TESZTBEN

5.3.1 ELŐKEZELÉS NÉLKÜLI PELOIDOK Statisztikailag szignifikáns mutagenitást nem észleltünk sem a hévízi, sem a kolopi peloid mintáknál (20.a-d ábra).

20.a ábra Frame-shift mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a hévízi peloid mintában TA98as törzsben

54

20.b ábra Bázispárszubsztitúciós mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a hévízi peloid mintában TA100-as törzsben

20.c ábra Frame-shift mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a kolopi peloid mintában TA98as törzsben

55

20.d ábra Bázispárszubsztitúciós mutagenitás (átlagos telepszám +SD) a kolopi peloid mintában TA100-as törzsben

5.3.2 PELOIDKIVONATOK 5.3.2.1 1. SOROZAT A hévízi iszap főleg szervetlen oldószeres oldatai: sósavas kivonat TA98-as törzsben (21.a ábra), illetve vizes és sósavas kivonatok TA100-as törzsben (21.b ábra) metabolikus aktiváció után statisztikailag szignifikáns mutagenitást mutattak.

56

0,041

0,034

21.a ábra Hévízi kivonatok a kereteltolásos mutációra érzékeny törzsnél * statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás

0,009

0,027

0,019 0,035

0,018

21.b ábra Hévízi kivonatok a bázispárszubsztitúcióra érzékeny törzsnél * statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás A hévízi iszap főleg szerves oldószeres kivonatai közül: a toluolos extraktum TA98-as törzsben, metabolikus aktiváció után (21.a ábra), illetve a metanolos extraktum 57

TA100-as törzsben, metabolikus aktivációval és anélkül is (21.b ábra) mutagénnek bizonyult (p<0,05). A kolopi iszap vizes és sósavas kivonatai esetében a TA98-as törzsnél nem észleltünk eltérést (21.c ábra). Azonban ezek a kivonatok a TA100-as törzsnél szignifikáns mutagenitást mutattak metabolikus aktiváció után (21.d ábra).

21.c ábra Kolopi kivonatok a kereteltolásos mutációra érzékeny törzsnél

58

0,017

0,025

0,004 0,003

0,021 0,014

21.d ábra Kolopi kivonatok a bázispárszubsztitúcióra érzékeny törzsnél * statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás A kolopi iszap metanolos és toluolos oldatai enzimatikus aktiváció után mutagénnek bizonyultak a TA100-as törzs esetében (21.d ábra). A TA98-as törzs alkalmazásakor a szerves anyagokat tartalmazó kivonatokban nem tapasztaltunk eltérést (21.c ábra).

5.3.2.2 2. SOROZAT A hévízi peloid kivonatai közül TA98-as törzsnél a sósavas oldat metabolikus aktiváció nélkül (S9-) szignifikáns mutagenitást mutatott (p<0,05) (22.a ábra). A TA100-as törzsnél szignifikáns eltérést nem tapasztaltunk (22.b ábra).

59

0,008 0,027

22.a ábra Frame-shift mutagenitás a hévízi peloid mintánál * statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás

22.b ábra Bázispárszubsztitúciós mutagenitás a hévízi peloid mintánál A kolopi iszap esetén a TA98-as törzsnél, metabolikus aktiváció nélkül (S9-) a vizes és metabolikus aktiváció után (S9+) a metanolos kivonat, míg a TA100-as

60

törzsnél, metabolikus aktiváció után (S9+) a sósavas kivonat mutatott statisztikailag szignifikáns különbséget a megfelelő oldószeres kontrollhoz képest (22.c,d ábra). A második kísérletsorozatban a toluolos kivonatok minden koncentrációban toxikusnak minősültek, melynek lehetséges oka a mikrobiális aktivitás.

0,031

0,002

22.c ábra Frame-shift mutagenitás a kolopi peloid mintánál * statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás

61

0,026

22.d ábra Bázispárszubsztitúciós mutagenitás a kolopi peloid mintánál * statisztikailag szignifikáns (p<0,05) mutagenitás

62

6 MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK Szilárd (rostos és nem rostos) részecskék expozíciójával számos helyen találkozhatunk

melynek

hatására

különböző

krónikus,

nem

fertőző

betegségcsoportokkal kell szembesülnünk, mint az asztma, krónikus obstruktív tüdőbetegségek, kardiovaszkuláris megbetegedések, vagy akár fibrózis illetve a különböző ráktípusok. Napjainkban is számos részecsketípus képezi a kutatások alapját. A század új kihívása a szilárd halmazállapotú, finomszemcsés anyagok (mint pl. elemi szálak, nanotechnológiai termékek) széles spektrumának feltérképezése. Dolgozatomban 3 teljesen eltérő szilárd részecske specifikus genotoxicitását vizsgáltam növekvő mérettartományban. A nanométeres nagyságrendű, méretükben, alakjukban az azbesztrostokhoz nagyon hasonló, de eltérő biológiai aktivitást mutató szénnanocsöveket,

az

elektronmikroszkópos

mérettartományban

lévő, ismerten

karcinogén azbesztrostokat, és a 200 µm-nél kisebb szemcseméretű gyógyiszapokat. A genotoxikológiai tesztelés és a rákkockázatbecslés szempontjából a rostos és nem rostos részecskék a „klasszikus toxikus” anyagokhoz képest egy speciális csoportot képeznek, fizikai-kémiai

tulajdonságaik

különböznek

a

már

„hagyományos”

kémiai

karcinogénekétől. A legnagyobb hansúlyt legjelentősebb közös tulajdonságukra kell fektetni, a felszínükhöz kötött szerves anyagok potenciális jelenlétére! A rostos szerkezetű anyagok nagy fajlagos felületük miatt számos lehetséges mutagént képesek megkötni, de a nem rostos részecske típusú anyagok is hordozhatnak policiklusos aromás szénhidrogéneket és egyéb mutagén komponenseket. Amennyiben környezeti mintákat vizsgálunk, abban az esetben a megfigyelt következmény

a

felszínen

hordozott

anyagokkal

állhat

kapcsolatban.

Az

azbesztrostokkal történt kutatásaink során korábbi HPLC eredmények [15, 25] igazolják a felülethez kötött anyagok jelenlétét, mellyel párhuzamosan alakultak a genotoxicitási vizsgálatok eredményei is. E tapasztalatokat a szénnanocsövek kutatása során is felhasználtuk. A gyógyiszapok felszínéhez kötődő kémiai anyagok kivonatainak frakcionálását követő eredményeink is ezt az elméletet támasztják alá. Vizsgálatainkat a karcinogén 1-nitropirén in vivo mutagenitási vizsgálatával kezdtük, mellyel egy potenciális azbesztexpozíció modelljét készítettük el.

63

Az 1-NP genotoxikus aktivitását már számos módszerrel bizonyították [5, 85]. A TA98 és 100-as Salmonella-törzsek nem igényeltek metabolikus aktiválást a mutagenitás kimutatásához [86], míg nitroreduktáz-deficiens sejteket felhasználva in vitro mutagenitási tesztekben csak metabolikus aktiválás után lehetett pozitivitást kimutatni [87]. Ez utóbbi tény a nitro-csoport fontosságára hívja fel a figyelmet. Élő állatok

kezelésekor

eltérő

viselkedést

tapasztalhatunk

különböző

expozíciós

körülmények között. Az in vivo vizsgálatok szerint pl. a bélflóra játszik jelentős szerepet az 1-NP 1-aminopirénné történő átalakításában, melynek már nincs mutagén hatása [85]. A patkánymáj aerob viszonyok között kimutatható mértékben gyűrűoxidációs termékeket is termel, továbbá DNS-adduktumok megjelenését is előidézi [85]. Az ip. kezelt patkányok vizelete szintén mutagénnek bizonyult Salmonellában [88]. In vivo citogenetikai vizsgálattal pedig genommutációt (aneuploidiát) egyszeri 30 mmol/ttkg dózissal ip. kezelt CBA/Ca egerekből sikerült leírni [89]. Az állatkísérletek során összegyűlt bizonyítékok alapján az 1-NP IARC szerinti 2B csoportba tartozó, lehetséges humán karcinogénnek tekinthető [5]. A tüdőtumoron kívül egyéb malignus elváltozásokat is okoz, pl. emlő-, gyomor-bélrendszeri tumorokat vagy leukémiát [5, 85, 90]. Mind a rövid-, mind a hosszútávú állatkísérletek bizonyos gének (Ha-ras, c-myc, p53) expressziójának megemelkedését is jelezték a legkülönbözőbb szövetekben [20, 21, 91]. A jelen kísérletek során, ugyanazzal a kezelési protokollal, amelyet korábban citogenetikai és génexpressziós vizsgálatokban is alkalmaztak [20, 21, 91], a kiválasztott vizelet mutagenitását igazoltuk. A TA100-as törzs használatával, mely bázispárszubsztitúcióra érzékeny, a mutagenitás csak az első 24 órában jelentkezett az ip. kezelést követően. Az 1-NP mutagén metabolit(ok) mindenképpen konjugált formában is jelen volt(ak) ebben a vizeletmintában, hiszen a dekonjugáció a mutagenitás újabb szignifikáns növekedésével járt. A po. kezelés kizárólag a TA98 által kimutatható frame-shift mutagén(ek) megjelenéséhez vezetett a vizeletben, mely(ek)et dekonjugáció mellett tudtunk kimutatni az első 24 órában. A második 24 órában a vizeletminták már nem mutattak mutagén hatást, vagyis a mutagén 1-NP metabolitok 24 óra alatt kiürültek. Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a biotranszformáció jellegét nagymértékben befolyásolja az expozíció módja. A po. kezelés a kockázatbecslés szempontjából fontos, mivel ez a környezeti 1-NP-expozíció lehetséges formáját modellezi. A szituáció nagyban hasonlít tehát a karcinogén azbesztrostok esetéhez, mely 64

esetben a rostokhoz kötött molekulák bekerülhetnek a gasztrointesztinális rendszerbe [11]. Minthogy a „kereskedelmi méretű” belégzett azbesztrostok jelentős része végül lenyelésre kerül és a rostok felületén policiklusos aromás molekulák nagy számban lehetnek jelen, mindkét anyagcsoport kockázatbecslésekor figyelembe kell venni a lehetséges

interakciókat.

A

vizelet

mutagenitási

mintázatának

előzetes

meghatározásával egy használható modellt dolgoztunk ki. Az állatmodell alkalmazható a genotoxikus kölcsönhatások vizsgálatára (a) rosthoz kötött nitroarén orális expozíciója esetén; (b) akut, 24 órás kísérletben. Minthogy az átlagpopuláció főleg orálisan, a gasztrointesztinális traktuson keresztül exponálódik a különböző típusú részecskékhez kötött nitroarénekkel, az itt ismertetett, orális kezelési mód hatékonyabbá teheti a kockázatbecslés folyamatát az ilyen jellegű karcinogén légszennyezők esetében. Az 1-nitropirén in vivo mutagenitási vizsgálatában kapott eredményeket felhasználtuk

az

újonnan

kifejlesztett

in

vivo

krónikus,

kontaktexpozíciós

modellünkhöz, melyben előkezelés nélküli, illetve a környezeti expozíció modellezésére 1-nitropirénnel előkezelt azbesztrostokat használtunk. Az amfibolok által szállított aktív vasionok folyamatosan képződő reaktív oxigénfajtákat hoznak létre, amelyek kapcsolatban állnak a rosttoxicitással és hatással vannak a DNS-re és a fehérjékre [92]. A ferroionok helyettesíthetik a magnéziumot a krizotil rostokon. Az azbeszt karcinogén hatásának alapját a DNS-károsodások, a célsejtek proliferációjának és differenciálódásának változásai képezhetik. Több mezoteliómában is kromoszómatöréseket és tumorszupresszor gének elvesztését mutatták ki. Azbeszt expozíció hatására számos jelátviteli út (NK-κB, PKC és MAPKERK 1/2) aktiválódik [93, 94, 95]. Humán mezotél sejttenyészeteket az azbesztrostok nem transzformáltak, melynek lehetséges magyarázata citotoxikus hatásukban keresendő. Az in vivo transzformációt a mezotélsejtek krokidolit expozíciót követő TNF-α kibocsátása magyarázhatja. A TNF-alfa mediálja az NK-kappaB aktivitást, csökkentve a rostok citotoxicitását, és elősegíti a károsodott mezotélsejtek proliferációját [93]. Korábbi kísérletekben Varga és mtsai patkányokban arénszármazékkal előkezelt 50 mg/ttkg krokidolit és antofillit rostok citogenetikus aktivitását mutatták ki, a csontvelősejtek testvérkromatid-kicserélődés gyakoriságának szignifikáns növekedését állapították meg. A tesztben a kémiai tisztaságú rostok nem bizonyultak genotoxikusnak [14, 25]. Orális 65

expozíció során patkányok csepleszből és vékonybélből izolált mezotélsejtjeinek nagymértékű DNS-száltörései mutatkoztak. Ezt a hatást a rostok előkezelése szignifikánsan emelte [16]. Jelen in vivo vizsgálatunkban azonban még az azbesztrostok mezotélsejtekre közvetlenül ható, krónikusan fennálló expozíciója sem indukált peritoneális mezoteliómát. Mivel független tanulmányokban [14, 16, 25] az előkezelt rostok (krokidolit, antofillit + benz[a]pirén) kogenotoxicitást mutattak, saját in vivo kísérleteinkben nem erre az eredményre számítottunk. Ez a megfigyelés arra enged következtetni, hogy a mezotelióma kialakulásának mechanizmusa független lehet a rostok és a mezotélsejtek fizikai kontaktusától. Ezt követően különböző módszerekkel a nanométeres tartományba eső, az azbesztrostokhoz igen hasonlatos, újnak mondható anyagcsoport, a szénnanocsövek potenciális genotoxicitását és mezoteliómaindukcióját vizsgáluk az azbesztrostok kutatása során megszerzett ismeretanyag felhasználásával és összevetésével. A rostszerű anyagok biológiai hatását három fontos tényező befolyásolja: hosszuk, átmérőjük és perzisztenciájuk. A rendelkezésre álló irodalmi adatok szerint a nanorészecskék néhány fajtájának fokozottabb gyulladáskeltő hatása van, mint az azonos anyagból álló nagyobb mérettartományba sorolható részecskéknek. Általánosan elfogadott, hogy az oxidatív stressz vezet gyulladáshoz, mely gyakran együtt jár a genotoxicitással. A nagy felület, a rajta megkötött fémek és szerves anyagok mind szerepet játszhatnak ezekben a folyamatokban [32]. Előkísérleteink során a vizsgált nanocsövek esetében pontmutációt előidéző hatást bakteriális rendszerben nem észleltünk. Az irodalomban található adatok alapján SWCNT- és MWCNT-k vizsgálatát Ames-tesztben mindezidáig csak néhányan végeztek, mutagén hatást egyik esetben sem mutattak ki [96, 97, 98]. Vizsgálataink során klasztogén, aneugén illetve SCE-gyakoriságot befolyásoló hatás emberi sejtek tenyészetében nem volt kimutatható. Az SWCNT típusú csövek sejttoxikusnak bizonyultak a tenyészetekben, legalábbis végpontként a mitózisgátlást vizsgálva. Annak ellenére, hogy a szénnanocsövek Ames-tesztben nem mutattak mutagenitást, a citogenetikai vizsgálatok közül a mikronukleusz tesztben, illetve az üstökös elektroforézis vizsgálattal is többen pozitív eredményt kaptak. (Ez főként a strukturális defektussal rendelkező, vagy fémmel szennyezett szénnanocsövekre igaz.) [96, 99, 100, 101, 102]. Ugyanakkor – főként a nagy tisztaságú nanocsövek tesztelésekor – ezeknek 66

ellentmondó eredmények is születtek kromoszóma aberrációs-, mikronukleusz tesztben és üstökös elektroforézis vizsgálatban [96, 98, 103]. Az eltérések és ellentmondások magyarázatául szolgálhat az eltérő módszertan illetve az különböző tulajdonságú és tisztaságú szénnanocsövek alkalmazása. Az irodalomban egyelőre nincsenek teljes mértékben egyező módszertanú és ezáltal összehasonlítható vizsgálatok. Éppen ezért nagy szükség lenne egy olyan egységes vizsgálati modellre, mint amilyet már az azbeszt esetén kidolgoztak (UICC standard azbesztek) [17]. A kombinált in vivo/in vitro vizeletmutagenitási tesztünkben a patkányok csoportjait p.o. SWCNT és MWCNT 50 mg/ttkg egyszeri dózisával kezeltük. Ez a dózis tízszerese volt az irodalomban fellelhető intratracheális instillációval adagolt legnagyobb mennyiségnek. A jelenlegi legmagasabb orális dózis (Swiss) egerekben >1000 mg/ttkg [104]. Mint ahogyan korábbi vizsgálatunkban, az in vitro Ames-tesztben is [47], ez utóbbi esetben is negatív eredményeket kaptunk. A szénnanocsövek által okozott genotoxikus hatás lehet elsődleges, ha közvetlenül

hat

a

DNS-re,

illetve

másodlagos,

mely

pl.

gyulladás

vagy

szabadgyökképződés során jöhet létre. A szénnanocsövek által okozott citotoxicitás egyik legfontosabb mechanizmusának az oxidatív stressz tekinthető. Számos kísérletben vizsgálták a CNT-k direkt mutagén képességét, azonban jelenleg az eredmények nem meggyőzőek [42]. Bár in vitro előkísérleteinkben MWCNT okozta citogenetikus hatást (klasztogén, aneugén, SCE-indukáló hatás) nem detektáltunk, SWCNT azonos dózisainál specifikus citotoxikus hatást és mitotikus gátlást figyeltünk meg. Mivel az előkísérletben dózisfüggést nem vizsgáltunk, csupán annyit állíthatunk, hogy a rendszerbe vitt dózis citotoxikus hatást eredményezett, mely gátolta a genotoxicitásvizsgálatot. Oxidatív stressz vagy szabadgyökképző hatások kimutatására az itt alkalmazott tesztek feltehetőleg nem elég érzékenyek. Éppen ezért nagyobb felbontású citogenetikai és egyéb vizsgálatok (mint pl. célszövetek in vivo sejtszintű DNS-mikrogélelektroforézise (Comet assay) [16], vagy a Salmonella typhimurium mást törzseivel való tesztelés) több információt nyújthatnak. A széles skálán mozgó méretbeli eltérések, a nagy felület:tömeg arány és a jelentős mértékű adszorpciós kapacitás a szénnanocsövek értékelésében döntő fontosságú. Ebből kifolyólag a vegytiszta nanocsövek vizsgálata nem feltétlenül elégséges ahhoz, hogy a kockázatbecsléshez a valósághoz közelebbi, megfelelő adatokat kapjunk. Így nem szabad elhanyagolni azokat a problémákat sem, amelyekkel 67

az azbesztrostok kockázatbecslése során már szembesültünk: a méret:fajlagos felület megoszlása és a rostok által megkötött anyagok szoros összefüggést mutathatnak a kialakuló végső egészségügyi hatásokkal. Egy speciális tumorféleség, a mezotelióma kialakulását in vivo karcinogenitási vizsgálatunkban sem kémiai tisztaságú, sem NP-nel előkezelt csövek esetében nem észleltük. Módszerünkkel a zselatinkapszula felszívódása után a mezotélsejtek közvetlen közelébe juttattuk a csöveket, miként más esetben az azbesztrostokat vagy a cinkoxidot. (A szénnanocsöveket fölöslegben kell adni. A bevitt anyagmennyiséget csak a kapszula térfogata korlátozza.) Tehát ha fizikai karaktere és a közvetlen kontaktus következtében az anyag mezoteliómát lenne képes indukálni, akkor ezt észleltük volna. (Az ásványi rostok – bronchus-karcinómától független – pleurális és peritoneális mezoteliómaindukáló hatása jól ismert.) A szénnanocsövek potenciális egészségkárosító hatása ma is vitatott [44, 105, 106]. Az irodalomban megtalálható karcinogenitási vizsgálatokat illetve ezek saját kísérleteinkre vonatkozó összefüggéseit a következőkben ismertetjük. Poland és munkatársai [48] egerek hasüregébe ip. injekcióval szénnanocsöveket juttattak. Rövid távú, 7 napig tartó kísérletben megfigyeléseik során arra a következtetésre jutottak, hogy a gyulladásos proteinek, a sikertelen („frustrated”) fagocitózis következtében termelődő, fagolizoszómából származó toxikus anyagok és granulómák jelenléte bizonyíték mezotelióma típusú daganat kialakulására. Ez a feltételezés azonban bizonytalan alapokon áll. A granulómaképződést úgy értelmezni, mint a mezotelióma kialakulásának korai biomarkerét, koncepciójában helytelen. Hiszen számos xenobiotikum és idegen test képes granulomatózus elváltozásokat indukálni későbbi mezotelióma kifejlődése nélkül is, amely egyébiránt egy igen ritka és specifikus tumorféleség. Tekintetbe véve a kísérletet végzők megfigyeléseit elmondhatjuk, hogy a rendkívül rövid távú granulóma indukció nem egyértelműen támasztja alá a szénnanocsövek mezoteliómát okozó hatását vagy az azbesztszerű patogenitást. A p53 génkiütött („knock-out”) egerekben MWCNT-vel okozott mezotelióma [50] szintén kevés bizonyítékul szolgál, mivel az azbeszt által okozott daganatkeltés kulcslépése a szupresszorgén inaktivációja [11], illetve ebben a kísérletben így eleve nagyobb a rák kialakulásának veszélye is. Saját munkánkban az előzőeket figyelembe véve azonban genetikailag intakt (genetikailag nem módosított) állatokat használtunk; az SW- és MWCNT-k magasabb dózisait alkalmaztuk (10 mg/állat = 25 mg/ttkg); mind kémia tisztaságú, mind pedig 1-NP-vel előkezelt CNT-kel 68

dolgoztunk; a nanocsövek olyan mérettartományait választottuk, melynek karcinogén potenciálja inkább valószínűsíthető; ezen kívül hosszútávú megfigyelési időszak (12 hónap) és a mezotélsejtekkel való jól definiált, direkt és folyamatos kontaktus jellemezte a kísérleteket. Azonban még e szigorú körülmények között sem észleltük mezotelióma kialakulását, csupán idegentest típusú granulomatózus reakciót, epiteloidés többmagvú óriássejteket detektáltunk. Eredményeink

Sakamoto

és

munkatársai

megfigyeléseivel

sincsenek

összhangban [49]. A szerzők egyszeri intraszkrotális 1 mg/ttkg dózisú MWCNT injekció beadását követően extrém magas (85,7%) mezotelióma előfordulást detektáltak az 52 hetes vizsgálati periódus alatt. Azonban a krokidolit azbeszt, mely a mezotelióma legpotensebb előidézője, azonos körülmények között vizsgálva egyáltalán nem okozott mezoteliómát. Muller és munkatársai (2009) MWCNT-vel végzett korábbi vizsgálataik során [99, 107] tüdőben gyulladásos, granulomatózus, fibrotikus elváltozásokat detektáltak; illetve ugyanaz az MWCNT epiteliális sejtekben in vitro és in vivo is mutációt okozott. Azt tapasztalták, hogy a strukturális defektusokat tartalmazó szénnanocsövek jelenlétéhez kapcsolódik az észlelt gyulladásos válasz és genotoxicitási aktivitás is. A gyulladás, a mutáció és a rák közötti már ismert, szoros kapcsolat hatására ezt követő tanulmányukban [108] patkányok hasüregébe juttatták a strukturális defektusokkal rendelkező szénnanocsöveket, hogy megvizsgálják azok karcinogén potenciálját. 24 hónap elteltével sem észleltek mezoteliómaindukciót. Azonban a pozitív kontrollként használt krokidolit esetében az állatok 34,6%-nál alakult ki mezotelióma. Egyre több adat érhető el a szénnanocsövek potenciális káros hatásainak vizsgálatáról. Egymás után jelennek meg különböző tanulmányok, összefoglaló közlemények a nanotermékek tulajdonságait taglalva [39, 44, 109, 110, 111, 112]. A változatos paraméterek miatt azonban nem egyszerű az információk megfelelő interpretálása. Esetünkben a karcinogenitást tekintve az eredmények helytelen értelmezése nem kevés veszélyt is hordozhat magában, főként a kockázatbecslés jelenlegi, korainak mondható stádiumában. A csekély számú rendelkezésre álló, azonban talán félreértelmezett eredmények [48] alapján a szénnanocsövek környezeti és népegészségügyi kockázatait nem lehet megfelelő módon felbecsülni. In vivo tanulmányunkban még a szénnanocsövek mezotélsejtekre ható, hosszútávú, direkt expozíciója sem indukált peritoneális mezoteliómát. Ebből kifolyólag eredményeink nem jeleznek számottevő kockázatot, főként az azbesztrostokhoz képest. Azonban a 69

szénnanocsövek daganatot okozó hatását nem zárhatjuk ki. Az eddigi kutatások között emberre vonatkozó, élettanilag releváns expozíciós utat értékelő, karcinogén hatásokat vizsgáló tanulmány egyelőre még nem elérhető. A pontosabb expozíció és kockázatbecslés érdekében még több adatra van szükség. A még nagyobb mérettartományba tartozó peloidoknál is – környezeti mintákról lévén szó – a felületükhöz potenciálisan kötődő kémiai anyagok jelenlétéből, illetve a lehetséges kogenotoxikus hatásból indultunk ki. Kísérleti módszereink fejlesztésének célja az volt, hogy peloidmintákat előkezelés nélkül (in toto) tudjuk vizsgálni, hogy ebben a formában okoznak-e mutációt a baktériumtörzsekben. Annak ellenére, hogy a Salmonella Ames-teszt érzékenyebb formáját, az előinkubációs Ames-tesztet alkalmaztuk, a peloidminták egy dózisa esetében sem kaptunk statisztikailag szignifikáns eredményt. Ennek oka lehet, hogy a módszer korlátozza a rendszerbe vihető mintamennyiséget. A probléma kiküszöbölésére a gyógyiszapok szerves és szervetlen kivonatait készítettük el. A két egymást követő kísérletsorozatban klasszikus talajkémiai eljárással frakcionáltuk a kivonatokat. Mind a szerves, mind a szervetlen kivonatok számos frakciója mutatott statisztikailag szignifikáns mutagenitást metabolikus aktivációval és anélkül is. Mindkét peloidkivonatos kísérletben több statisztikailag szignifikáns eltérést tapasztaltunk metabolikus aktiváció (S9+) alkalmazása mellett (14), mint anélkül (4). Tehát az indirekt mutagének jelenléte mindkét iszapmintában jelentős. Szervetlen oldószerek (desztillált víz, sósav) használata esetén kétszer több (12) statisztikailag szignifikáns eredményt kaptunk, mint a szerves oldószereknél (metanol, toluol) (6), mindkét kísérletben és peloidmintánál. (A szervetlen oldószerek ugyanis hidrofil szerves anyagokat is oldhatnak.) A Hévízi tóból származó gyógyiszap szerves anyag tartalma jelentős (20%) [73], emiatt magasabb mutagén aktivitást vártunk. A kolopi gyógyiszap a szervetlen iszapok csoportjába tartozik, rendkívül kevés szerves anyagot tartalmaz [76]. Azonban mindkét gyógyiszap esetén azonos számban fordultak elő mutagén frakciók. A TA100-as törzsnél metabolikus aktiváció után (S9+) több statisztikailag szignifikáns mutagenitást figyelhettünk meg mindkét peloidnál. Így feltételezzük, hogy

70

a

peloidminták

főként

bázispárszubsztitúciót

okozó

indirekt

mutagéneket

tartalmazhatnak. Magyarországon – ahogyan már fentebb említettük – a hévízi gyógyiszap szervesanyag-tartalma jelentős (20%), azonban országunkban a szerves iszapok jelenléte többnyire nem jellemző. Ezáltal egy speciális probléma is felmerült, mivel Veniale és munkatársai [113] szerint a nagy szervesanyag-tartalmú iszapokban magas mikrobiológiai aktivitás várható. (Bár a hévízi iszap baktériumflórája enyhén antibiotikumtermelő, és emiatt patogén baktériumok előfordulása csekély [114], amint az iszapot kemelik eredeti környezetéből, benne a kórokozók el tudnak szaporodni.) Intézetünkben a tömegállandóságig szárított iszapokból tárolás és autoklávozás előtt mikrobiológiai vizsgálatokat végeztünk (4.1.4.1 fejezet, IV. táblázat). Gyógyiszapokra vonatkozó határértékek nincsenek rendeletben rögzítve. Az

iszapkivonatos

vizsgálataink

ismételt

eredményeiben

fluktuációt

tapasztaltunk: első esetben több mutagén frakciót kaptunk, mint másodszorra, és a második kísérletsorozatban a mutagén mintázat szinte teljes mértékben különbözött az előzőtől, csupán minimális átfedés volt megfigyelhető. Az iszapban élő, biológiaimetabolikus aktivitással rendelkező mikroorganizmusok magyarázhatják a fenti eredményeket [113]. Az iszapokban előfordulhatnak potenciálisan veszélyt jelentő kémiai anyagok is (As, Hg, Cd, Pb, Se stb.), valamint az esetenként jelen lévő radioaktivitás is további kérdéseket vethet fel [113]. Intézetünkben tájékozódási jelleggel radioaktivitási méréseket végeztünk. Egyik mintán sem volt jellemző az α-sugárzás megemelkedett szintje. A mérésekből alacsony radonaktivitásra következtethetünk. További kísérleteinkben [77, 115, 116, 117] elvégeztük a gyógyiszapok öxotoxikológiai és ökogenotoxikológiai vizsgálatait is, melyek szintén a peloidok potenciálisan káros hatásaira hívják fel a figyelmet. Az ökotoxikológiai minősítést trágyagiliszta (Eisenia-teszt) [118, 119, 120] ill. fehér mustár gyökérnövekedési teszttel [74, 121, 122] (in toto) végezve a peloidok akut toxikus hatást nem mutattak, azonban eltérések mindkét esetben mutatkoztak, így feltételezhető, hogy a gyökér képződésére és fejlődésére

a

mintákban

jelenlévő

komponenesek

negatív

hatással

bírnak.

Ökogenotoxikológiai vizsgálatunkban pedig egér és patkány limfociták üstököselektroforézise mellett trágyagiliszta-sejteket (Eisenia) is vizsgáltunk. A férgekből cölomasejteket preparáltunk és ezeken is vizsgáltuk a genotoxikus hatást. Eisenia cölomasejteken igazoltuk a hévízi iszap feltételezett DNS-károsító hatását. 71

Mindazonáltal a gyógyvizek, ásványvizek adott esetben a gyógyiszapok kevésbé koncentrált változatainak is tekinthetők. A kezelések során gyakran a gyógyiszapokat gyógyvízzel keverve alkalmazzák. A fürdőkúrák alkalmával a gyógyvizek illékony szerves komponensei is hatással lehetnek a gyógyhatás kiteljesedésében. Így az inhaláció is egy lehetséges expozíciós út. Ebből kifolyólag – a gyógyvizek szervesanyag-koncentrátumainak vizsgálata mellett – további kísérleti elgondolásaink között szerepel a különféle gyógyvizek illékony szerves komponenseinek vizsgálata is exikátorban kivitelezve, bakteriális mutagenitási teszttel. Statisztikailag szignifikáns eredményeink ugyan nem mutatnak dózis-hatás összefüggést, azonban ennek oka az alkalmazott statisztikai módszerekben keresendő (4.1.5 fejezet). Az elemzések során a kérdés a mérsékelten mutagén hatással rendelkező anyagok esetében merül fel. Más szerzők [66, 78] tanulmányai alapján is kijelenthető, hogy a módszer jól azonosít egyértelmű mutagén hatással rendelkező anyagokat, éppen ezért kiemelkedően fontos a mutagenitási vizsgálatok sorában. A kérdéses, nehezen értelmezhető esetekben a kutató előtt több lehetőség is nyílik: a statisztikai módszerek első és másodfajú hibalehetőségeinek csökkentésére nagyobb elemszámú kísérleti elrendezéssel megismételt kísérletek, vagy más mutagenitási vizsgálatok alkalmazása az Ames-teszt eredményeinek pontosítására, megerősítésére. Azonban a talajkivonatok készítésének módszertana nem enged további hígítást, vagy koncentrálást, ezáltal többszörös koncentrálási sor kialakítását. Az alkalmazott eljárás volt az egyetlen lehetőségünk annak érdekében, hogy a rendszerből ne veszítsünk szerves anyagot. Következtetéseink szerint a két vizsgált peloidminta genotoxicitása előkezelés nélkül,

in

toto,

Ames-tesztben

nem

mérhető

a

korlátozottan

bevihető

koncentrációmennyiség miatt. Veniale és munkatársai szerint [113] az iszapokban élő mikroorganizmusok érési folyamatokat indukálnak, melyek befolyásolhatják az iszapok szerves anyagainak biológiai-metabolikus aktivitását. (Eredeti peloid mintáinkat az ismételt kísérlet előtt 3 hónapig

tároltuk

szobahőmérsékleten

(20-25 °C).)

Következésképpen

további

vizsgálatok szükségesek a mikrobiológiai aktivitás mutagenezisben betöltött szerepének megfigyelésére. Ehhez a jövőben széleskörű radioaktivitási méréseket is tervezünk a gyógyiszapokban potenciálisan jelenlévő radioaktív elemek biológiai rendszerben észlelhető mutagén hatásának kimutatása érdekében.

72

Az említett körülmények tekintetében a kapott mutagén frakciók további kémiai analízise, a komponensek elkülönítése és a toxikus összetevők azonosítása szükséges. A dolgozatban vizsgált rostos és nem rostos részecske típusú anyagok egyike sem mutatott fizikai tulajdonságaikból eredő hatásokat, a kapott eredmények csak kémiai hatásokon alapultak. A kísérletek humán relevanciáját a következőkben foglalom össze: A kiváló fizikai tulajdonságai miatt igen széles körben elterjedt, és a mai napig a környezetünkben megtalálható, IARC szerinti 1. csoportba tartozó, humán karcinogén azbesztrostok emberi szervezetben történő expozíciójának modellezése kapcsán hozzájárultunk a hatásmechanizmus jobb megismeréséhez. Eredményeink alapján arra a következtetésre jutottunk, hogy a mezotelióma kialakulásának mechanizmusa független lehet a rostok és a mezotélsejtek fizikai kontaktusától. A szénnanocsövek humán szervezetre gyakorolt potenciális egészségkárosító hatása ma is vitatott. A számos átfogó tanulmányban megjelenő változatos paraméterek nehezítik az eredmények megfelelő értelmezését. Hiányoznak a humán, élettanilag releváns expozíciós utat értékelő, karcinogén hatásokat vizsgáló epidemiológiai tanulmányok is. Ezek alapján a szénnanocsövek környezeti és népegészségügyi kockázatait nem lehet megfelelő módon felbecsülni. In vivo tanulmányunkban kapott eredményeink cáfolják azt a feltételezést, hogy a szénnanocsövek mezoteliómát váltanának ki, a továbbiakban a humán kockázatbecslés más vonalaira szükséges összpontosítanunk. A peloidkivonatok esetében számos frakcióban statisztikailag szignifikáns mutagenitás figyelhető meg, tehát megfontolandó annak lehetősége, hogy a gyógyiszapok tartalmazhatnak az egészségre potenciálisan káros anyagokat. A kockázatbecslés szempontjából, mivel bakteriális rendszerben dolgoztunk, az így kapott eredmények humán viszonyokra közvetlenül nem extrapolálhatók. Ezen kívül peloidkivonatos kísérleteinkben a gyógyiszapok szerves és szervetlen komponenseit magasabb koncentrációban alkalmaztuk, mint amennyivel az emberi szervezet érintkezhet egyszeri iszapkezelés alkalmával. A metabolikus aktivációval kapott eredményeink potenciális, indirekt kockázatot jelentenek, mivel az emberi bőr metabolizmusban betöltött szerepe elhanyagolható a májenzimekkel szemben, azonban a felszívódó indirekt mutagének már könnyen elérhetik a metabolizáló szerveket. Ismereteink korlátozottak a hámszövet metabolikus aktivitását illetően [123, 124]. 73

Napjainkban

a

széleskörű

népszerűségnek

örvendő,

gyógyiszapokból

készült

kozmetikai, illetve a gyógyászatban is alkalmazott termékek otthoni felhasználása újabb problémák felmerüléséhez vezet. A háztartásokban használatba kerülő eredeti peloid készítmények – amelyek feltehetően nagyszámú mikroorganizmust tartalmaznak – a kezelést megelőzően, vízzel keverve lehetőséget biztosítanak a mikrobiológiai érési folyamatokhoz [113]. E körülmények fontos szerepet játszhatnak a toxicitásban. A gyógyiszapok otthoni használatát megelőző minőségi, aktuális toxicitást felmérő vizsgálatok, gyorstesztek alkalmazása alapvető fontosságú a nem kívánatos toxikus mellékhatások elkerülése érdekében.

74

7 ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA A rostos és nem rostos szerkezetű részecskék specifikus genotoxicitása témájában elvégzett kísérletek az alábbi új megállapításokra vezettek: o Igazoltuk az 1-NP-vel különböző módon kezelt állatok vizeletének mutagenitását o Po. ill. ip. kezelést követően szignifikáns vizeletmutagenitás csak az első 24 órában jelentkezik, vagyis a mutagén metabolitok 24 óra alatt kiürülnek o Használható modellt dolgoztunk ki az orális expozíciós úton ható szilárd fázison megkötött kémiai anyagok kockázatbecsléséhez o Kifejlesztettünk egy in vivo krónikus, kontaktexpozíciós modellt szilárd fázisú anyagok vizsgálatára, és bizonyítottuk, hogy a kezeletlen ill. 1-NP-vel kezelt azbesztrostok mezotélsejtekre közvetlenül ható krónikus expozíciója nem indukált peritoneális mezoteliómát

o A szénnanocsövek többféle altípusát vizsgálva nem találtunk mutagén és egyéb genotoxikus, csak citotoxikus és mitózisgátló hatást (SWCNT-nél) o A mezotélsejtekre közvetlenül ható kezelt és kezeletlen szénnanocsövek hosszútávú expozíciója során mezotelióma kialakulását nem észleltük, azonban idegentest típusú granulomatózus reakciót, epiteloid- és többmagvú óriássejteket detektáltunk

o A hévízi és a kolopi iszapminta Ames-tesztben in toto nem okoz bakteriális pontmutációt o Csak bizonyos kémiai frakciók tekinthetők mutagéneknek, a mutagenitás időben változó o Az iszapminta-frakciók szignifikáns mutagenitásának jellemző mintázata az indirektés bázispárszubsztitúció típusú mutagenezis

75

8 TUDOMÁNYOS

KÖZLEMÉNYEK

ÉS

A

KONGRESSZUSI

PREZENTÁCIÓK (ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK) JEGYZÉKE

PHD TÉZIS ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ EREDETI KÖZLEMÉNYEK Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs. Mutagenic activity of peloids in the Salmonella Ames test. Appl. Clay Sci. 2012; 55:70-74. (IF2011: 2,474) Szendi K, Gerencsér G. Balneoprevenció: Gyógyiszapok genotoxikológiai vizsgálata üstökös-elektroforézissel. Magyar Epid. 2011; 8(4):207-212. Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs. A balneoterápia lehetséges kockázatai: peloidok mutagén aktivitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben. Magyar Epid. 2011; 8(2):109-121. Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs. Gyógyiszapok ökogenotoxikológiai vizsgálata. Magyar Epid. 2011; 8(2):123-127. Gerencsér G, Murányi E, Szendi K, Varga Cs. Ecotoxicological studies on Hungarian peloids (medicinal muds). Appl. Clay Sci. 2010; 50:47-50. (IF: 2,303) Varga Cs, Szendi K. Carbon nanotubes induce granulomas but not mesotheliomas. In Vivo 2010; 24:153-156. (IF: 1,159) Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs. Gyógyiszapokból készült kivonatok mutagenitásának vizsgálata Salmonella Ames-tesztben. Balneológia Gyógyf. Gyógyid. 2009; 28(1):72-78. Szendi K, Varga Cs. Lack of genotoxicity of carbon nanotubes in a pilot study. Anticancer Res. 2008; 28:349-352. (IF: 1,390) Varga Cs, Szendi K. Mesothelioma and environmental exposure. A newly developed animal model for fiber exposure. Ann. NY. Acad. Sci. 2008; 1138:73-76. (IF: 2,303) 76

Szendi K, Varga Cs. Előkísérletek a szén nanocsövek potenciális genotoxicitásának és mesothelioma-indukciójának vizsgálatára. Egészségtud. 2006; 50:73-82. Szendi K, Varga Cs. Nanotechnológia: Egy új kihívás a környezethigiéne számára. Szén nanocsövek. Magyar Epid. 2006; 3:59-66. Varga Cs, Szendi K. A karcinogén 1-nitropirén in vivo mutagenitása, egy potenciális azbesztexpozíció modellje. Magyar Onkol. 2006; 50:337-340. Varga Cs, Szendi K, Ember I. An in vivo model for testing genotoxicity of environmental fibre-associated nitroarenes. In Vivo 2006; 20:539-542. (IF: 1,273)

EGYÉB KÖZLEMÉNYEK Gerencsér G, Szendi K, Kovács A, Ember I. Biodízel gyártása során keletkező melléktermékekkel kezelt talajok ökotoxikológiai vizsgálata. Magyar Epid. 2012; 9(3):209-214. Szendi K, Gerencsér G, Kovács A, Ember I. Talajjavító és szelektív növényvédőszer komponensek genotoxikológiai és ökotoxikológiai vizsgálata. Magyar Epid. 2012; 9(3):215-224. Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs. Biodízel gyártása során keletkező glicerines mellékfázis vizsgálata szubkrónikus toxicitási tesztben. Magyar Epid. 2011; 8(1):27-31. Szendi K, Gerencsér G, Kovács A, Varga Cs. Biodízel előállításakor képződött glicerin fázis melléktermék vizsgálata in vivo genotoxikológiai tesztekben. Magyar Epid. 2011; 8(1):21-26.

77

KÖNYVFEJEZET Ember I, Fehér K, Murányi E, Németh K, Prantner I, Stefler D, Szendi K, Tibold A. Biomarkerek. In: Ember István (eds.) Népegészségügyi Orvostan. Budapest-Pécs: Dialóg Campus; 2007. pp.195-203.

PHD

TÉZISHEZ

KAPCSOLÓDÓ

KONGRESSZUSI

PREZENTÁCIÓK

(ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK) UV-sugárzás elleni védelem termálvizekkel? Varga Cs, László M, Gerencsér G, Szendi K [ea] Magyar Balneológiai Egyesület Nagygyűlése, Hajdúszoboszló, 2012. nov. 23-25. Hazai termál- és gyógyvízminták illékony- és szervesanyag-kivonatainak vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [ea] Magyar Epidemiológiai Társaság VI. Kongresszusa, Pécs, 2011. nov. 25-26. Hazai termál- és gyógyvízminták illékony- és szervesanyag-kivonatainak vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület Nagygyűlése, Harkány, 2011. nov. 18-20. Gyógyiszapok frakcionálása toxicitási és hatástani vizsgálatokhoz Szabó I, Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület Nagygyűlése, Harkány, 2011. nov. 18-20. Natív és extrahált gyógyiszapok genotoxicitásának vizsgálata bakteriális mutagenitási tesztben Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület Jubileumi Nagygyűlése, Gyula, 2010. nov. 19-21. Gyógyiszapok genotoxikológiai vizsgálata 78

Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület Jubileumi Nagygyűlése, Gyula, 2010. nov. 19-21. Further methodological development of genotoxicity studies comparing contaminated environmental samples (soil, peloid etc.) using bacterial mutagenicity test Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs [ea] The 63° General Assembly and International Scientific Congress of the World Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy (FEMTEC), Tunisia, 2010. nov. 1-2. New experimental methods for studying different soils and medical muds Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs [poszter] The 63° General Assembly and International Scientific Congress of the World Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy (FEMTEC), Tunisia, 2010. nov. 1-2. Methodological development of genotoxicity studies comparing peloids and contaminated soil samples using Ames test Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs [poszter] 37th World Congress of the International Society of Medical Hydrology and Climatology, Paris, 2010. jún. 23-26. New experimental methods for studying potential toxicity of peloids Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [poszter] 37th World Congress of the International Society of Medical Hydrology and Climatology, Paris, 2010. jún. 23-26. Gyógyiszapokból és szennyezett talajmintából készült kivonatok mutagenitásának összehasonlító vizsgálata Salmonella Ames tesztben, módszertani fejlesztés Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVIII. Nemzetközi Kongresszusa, Orosháza-Gyopárosfürdő, 2010. máj. 13-15. Új vizsgálati módszerek a gyógyiszapok tanulmányozásához Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVIII. Nemzetközi Kongresszusa, Orosháza-Gyopárosfürdő, 2010. máj. 13-15. 79

Gyógyiszapok mutagenitásának vizsgálata Ames teszt és üstökös elektroforézis alkalmazásával Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület 2009. Évi Nagygyűlése, Hévíz, 2009. nov. 20-22. Új vizsgálati módszerek a gyógyiszapok tanulmányozásához Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület 2009. Évi Nagygyűlése, Hévíz, 2009. nov. 20-22. Genotoxicity studies on Hungarian peloids using Ames test and comet assay Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs [ea] Scientific Congress of The World Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy (FEMTEC), Yokohama, Japan, 2009. nov. 8-12. New experimental methods for studying medical muds samples Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [poszter] Scientific Congress of The World Federation of Hydrotherapy and Climatotherapy (FEMTEC), Yokohama, Japan, 2009. nov. 8-12. Magyarországi gyógyiszapok értékelése ökotoxikológiai tesztekkel Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [ea] 8. Magyar Ökológus Kongresszus, Szeged, 2009. aug. 27-29. Gyógyiszapok mikrobiológiai vizsgálata Gerencsér G, Murányi E, Szendi K, Varga Cs [poszter] Magyar Epidemiológiai Társaság IV. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2008. nov. 28-29. Gyógyiszapokból készült kivonatok mutagenitásának vizsgálata Salmonella Ames tesztben Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] Fiatal Higiénikusok Fóruma, Az MHT Ifjúsági Tagozatának IV. Fóruma, Győr, 2008. máj. 29-31.

80

A gyógyiszapok lehetséges egészségi kockázatai Murányi E, Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] Fiatal Higiénikusok Fóruma, Az MHT Ifjúsági Tagozatának IV. Fóruma, Győr, 2008. máj. 29-31. A karcinogén 1-nitropirén in vivo mutagenitása, egy potenciális azbesztexpozíció modellje Szendi K, Varga Cs [poszter] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVI. Nagygyűlése, Pécs, 2008. ápr. 17-19. A gyógyiszapok lehetséges egészségi kockázatai Murányi E, Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVI. Nagygyűlése, Pécs, 2008. ápr. 17-19. Gyógyiszapokból készült kivonatok mutagenitásának vizsgálata Salmonella Ames tesztben Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] Magyar Balneológiai Egyesület 2007. évi Nagygyűlése, Esztergom, 2007. nov. 16-18. Gyógyiszapokból készült kivonatok mutagenitásának vizsgálata Salmonella Ames tesztben Murányi E, Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] A Pécsi Tudományegyetem Orvostudományi és Egészségtudományi Koordinációs Központjának, Orvostudományi és Egészségtudományi Szakosztályának Rendkívüli Jubileumi Tudományos Ülése, Pécs, 2007. jún. 9. Environmental exposure and mesothelioma Varga Cs, Szendi K, Ember I [poszter] International Oncology Congress, Al Ain, Egyesült Arab Emirátusok, 2007. febr. 17-22. Relevance of the in vitro and in vivo studies in genotoxicological research on fibres 81

Szendi K, Varga Cs [poszter] Nanobiológia mini-szimpózium, MTA PAB Székház, Pécs, 2006. nov. 10. In vitro és in vivo vizsgálatok jelentősége a rostok genotoxikológiai értékelésében Szendi K, Varga Cs [poszter] Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság III. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2006. nov. 3-4. Genotoxicity studies on fibres and nanotubes Varga Cs, Szendi K [ea] Bregenz Summer School on Endocrinology, Bregenz, Austria, 2006. júl. 30-aug. 3. Relevance of the in vitro and in vivo studies in genotoxicological research on fibres Varga Cs, Szendi K [poszter] Congress Linz 2006, Alternatives to Animal Experimentation (ALTEX), 2006. jún. 2-4. A nanotechnológia környezet-egészségügyi kockázatai: Szén nanocsövek potenciális genotoxicitásának és mesothelioma-indukciójának vizsgálata Szendi K, Varga Cs [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XV. Nagygyűlése, Siófok, 2006. ápr. 2628. Összehasonlító környezet-genotoxikológiai vizsgálatok rostszerű anyagokkal Varga Cs, Szendi K, Varjas T [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XV. Nagygyűlése, Siófok, 2006. ápr. 2628. Nanotechnológia: új kihívások a környezethigiéne számára. Szén nanocsövek Szendi K, Varga Cs [ea] Magyar Molekuláris és Prediktív Epidemiológiai Társaság II. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2005. ápr. 1-2.

82

PHD

TÉZISHEZ

NEM

KAPCSOLÓDÓ

KONGRESSZUSI

PREZENTÁCIÓK

(ELŐADÁSOK ÉS POSZTEREK) Talajjavító és szelektív növényvédőszerek genotoxikológiai és ökotoxikológiai vizsgálata Gerencsér G, Szendi K, Kovács A, Ember I [ea] Magyar Epidemiológiai Társaság VI. Kongresszusa, Pécs, 2011. nov. 25-26. Combined genotoxicity studies on biodiesel related technical glycerol Szendi K, Gerencsér G, Kovács A, Varga Cs [poszter] The 4th Conference of PhD Students and the First Conference of Postdoctoral Researchers in Medicine and Pharmacy, Targu Mures, Romania, 2011. júl. 6-8. (Acta Medica Marisiensis, Vol 57, Suppl 3, 2011, ISSN 2068-3324) Combined genotoxicity studies on technical glycerol from biodiesel Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [ea] International Conference of Preventive Medicine and Public Health, Pécs, Hungary, 2010. nov. 19-20. Biodízel gyártása során keletkező glicerines fázis vizsgálata szubkrónikus toxicitási tesztben Gerencsér G, Szendi K, Varga Cs [ea] International Conference of Preventive Medicine and Public Health, Pécs, Hungary, 2010. nov. 19-20. Marketing communication in Public Health – Promotion of health conscious behaviour Berényi K, Szendi K, Budán F [ea] International Conference of Preventive Medicine and Public Health, Pécs, Hungary, 2010. nov. 19-20. Orvoslátogatók a közvélemény kereszttüzében Berényi K, Szabó I, Szendi K, Budán F

83

[ea] Fiatal Higiénikusok Fóruma, Az MHT Ifjúsági Tagozatának VI. Fóruma, Debrecen, 2010. máj. 27-29. Orvoslátogatók a közvélemény kereszttüzében Berényi K, Szabó I, Szendi K, Budán F [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVIII. Nemzetközi Kongresszusa, Orosháza-Gyopárosfürdő, 2010. máj. 13-15. Epidemiológiai módszerek balneológiai vizsgálatokban Horváth-Sarródi A, Murányi E, Szendi K, Gerencsér G, Varga Cs [ea] Magyar Balneológiai Egyesület 2009. Évi Nagygyűlése, Hévíz, 2009. nov. 20-22. Biomarker vizsgálatok ionizáló sugárzás- és citosztatikumexpozícióban – esettanulmány Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVII. Nagygyűlése, Marosvásárhely, 2009. ápr. 17-19. Magyarországi gyógyiszapok értékelése ökotoxikológiai tesztekkel Gerencsér G, Szendi K, Murányi E, Varga Cs [ea] Népegészségügyi Tudományos Társaság XVII. Nagygyűlése, Marosvásárhely, 2009. ápr. 17-19. Biodízel előállításakor képződött glicerin fázis melléktermékek vizsgálata in vitro bakteriális mutagenitási tesztben Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] Magyar Epidemiológiai Társaság IV. Nemzetközi Kongresszusa, Pécs, 2008. nov. 28-29. Biomarker studies in ionizing radiation and cytostatic exposure Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] International Conference and Central and Eastern European Chapter Meeting of International Society for Environmental Epidemiology, Čeladná, Czech Republic, 2007. nov. 26-29.

84

Biomarker vizsgálatok ionizáló sugárzás és citosztatikus expozícióban Szendi K, Murányi E, Gerencsér G, Varga Cs [poszter] A Pécsi Tudományegyetem Orvostudományi és Egészségtudományi Koordinációs Központjának, Orvostudományi és Egészségtudományi Szakosztályának Rendkívüli Jubileumi Tudományos Ülése, Pécs, 2007. jún. 9.

85

9 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretnék köszönetet mondani programvezetőmnek, Prof. Dr. Ember Istvánnak a lehetőségért, tanításért, támogatásért. Szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Dr. Varga Csaba egyetemi docensnek, aki már medikus korom óta ötleteivel, tanácsaival és támogatásával segítséget nyújtott minden munkámmal kapcsolatban. A vizsgálatok során nyújtott segítséget Harth Csabánénak, Pest Károlynénak, Dr. Murányi Editnek és Gerencsér Gellértnek köszönöm. Továbbá köszönöm a segítséget minden egyes munkatársamnak, akik a munkánk elvégzésében segítségünkre voltak. Köszönettel tartozom Prof. Kertai Pálnak (DE) önzetlen szakmai segítségéért, Prof. B.A. Amesnek (Univ. California) a Salmonella törzsekért, H. Kármán Franciskának (MTA-KKKI) a szénnanocsőmintákért, Semjén Dávidnak (PTE) a szövettani értékelésért, valamint Nardai Ilonának (Harkányi Gyógyfürdő) és Bergmann Annamáriának (Hévíz gyógyfürdő és Szent András Reumakórház) a peloidmintákért. Végül, de nem utolsó sorban köszönöm a családomnak a támogatást, mellyel a munka során végig mellettem álltak.

86

10 IRODALOMJEGYZÉK 1

Donaldson K, Borm P. Particle and Fibre Toxicology, a new journal to meet a real need. Part Fibre Toxicol. 2004; 1:1.

2

25/2000. (IX. 30.) EüM-SzCsM együttes rendelet a munkahelyek kémiai biztonságáról

3

Schins RP. Mechanisms of genotoxicity of particles and fibers. Inhal Toxicol. 2002; 14(1):57-78.

4

Varga

C.

Solid-phase

Environmental

Genotoxicity:

In

Vivo

Veritas!

WebmedCentral, Toxicology 2011; 2(8):WMC002134. 5

IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Humans. Vol 46: Diesel and Gasoline Engine Exhausts and Some Nitroarenes, IARC, Lyon, 1989, pp. 1-458.

6

Varga C. Azbesztrostok az ivóvízben: elektronmikroszkópos vizsgálatok. Hidrológiai Közlöny 1990; 70(2):108-113.

7

IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risk to Chemicals on Man. Vol 14: Asbestos, IARC, Lyon, 1977, pp. 1-106.

8

Kovács B, Mátyás L, Simon G. Azbeszt – a felméréstől a mentesítésig. Levegő Munkacsoport,

Környezetvédelmi

és

Vízügyi

Minisztérium.

http://www.orszagoszoldhatosag.gov.hu/letoltes.php?filename=Azbeszt_2.pdf 9

Varga C, Kiss I, Ember I. The lack of environmental justice in Central and Eastern Europe. Environ Health Persp 2002; 110A:662-663.

10

Varga

C.

A

genotoxikológiai

kockázatbecslés

nehézségei:

környezeti

azbesztexpozíció. Magyar Epidemiol 2005; 2:147-150. 11

Varga C. Can one access genotoxic and carcinogenic risk of asbestos without mentioning ingested fibres? Mutat Res 2005; 572:173-174.

12

Varga C. Asbestos fibres in drinking water: are they carcinogenic or not? Medical Hypotheses 2000; 55(3):225-226.

13

Szyba K, Lange A. Presentation of benzo(a)pyrene to microsomal enzymes by asbestos fibres in the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test. Environ. Health Perspect. 1983; 51:337-341.

14

Varga C, Horváth G, Timbrell V. In vivo studies on genotoxicity and cogenotoxicity of ingested UICC anthophyllite asbestos. Cancer Lett. 1996; 105:181-185. 87

15

Varga C, Horváth G, Pocsai Zs, Timbrell V. On the mechanism of cogenotoxic action between ingested amphibole asbestos fibres and benzo[a]pyrene: I. Urinary and serum mutagenicity studies with rats. Cancer Lett. 1998; 128:165-169.

16

Varga C, Horváth G, Timbrell V. On the mechanism of cogenotoxic action between ingested amphibole asbestos fibres and benzo[a]pyrene: II. Tissue specificity studies using comet assay. Cancer Lett. 1999; 139:173-176.

17

Timbrell V, Rendall REG. Preparation of UICC standard reference samples of asbestos. Powder Technol. 1972; 5:279-287.

18

Truhaut R, Chouroulinkov I. Effect of long-term ingestion of asbestos fibres in rats. IARC Sci Publ. 1989; 90:127-133.

19

Chouroulinkov I. Experimental studies on ingested fibres. IARC Sci Publ. 1989; 90:112-126.

20

Ember I, Pusztai Z, Gyöngyi Z, Kiss I. 1-Nitropyrene induces elevated expression of oncogenes and tumor suppressor genes 24 hours after treatment in CBA/Ca mice. Anticancer Res. 2000; 20:1563-1566.

21

Gyöngyi Z, Nádasi E, Varga C, Kiss I, Ember I. “Long-term” effects of 1nitropyrene on oncogene and tumor suppressor gene expression. Anticancer Res. 2001; 21:3937-3940.

22

Milette JR, Boone RL, Rosenthal MT, McCabe LJ. The need to control asbestos fibres in potable water supply systems. Sci. Total Environ. 1981; 18:91-102.

23

Kaczenski JH, Hallenbeck WH. Migration of ingested asbestos. Environ. Res. 1984; 35:531-551.

24

Pontefract RD, Cunningham HM. Penetration of asbestos through the digestive tract of rats. Nature 1973; 243:352-353.

25

Varga C, Pocsai Z, Horváth G, Timbrell V. Studies on genotoxicity of orally administered crocidolite asbestos in rats: implications for ingested asbestos induced carcinogenesis. Anticancer Res. 1996; 16:811-814.

26

Varga C, Szendi K. Relevance of the in vitro and in vivo studies in genotoxicological research on fibres. ALTEX 2006; 23:133.

27

Varga C, Szendi K. Mesothelioma and Environmental Exposure. A Newly Developed Animal Model for Fibre Exposure. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2008; 1138:73-76.

88

28

Varga C, Szendi K, Ember I. An in vivo modell for testing genotoxicity of environmental fibre-associated nitroarenes. In Vivo 2006; 20:539-542.

29

Tapasztó L. Speciális anyagok és technológiák a XXI. században. Műszaki Fizikai és

Anyagtudományi

Kutatóintézet,

Magyar

Tudományos

Akadémia.

(http://www.nanotechnology.hu/magyarul/Specmattech.html, 2012. 30

Szendi K, Varga C. Nanotechnológia: Egy új kihívás a környezethigiéné számára. Szén nanocsövek. Magyar Epidemiológia 2006; 3:59-66.

31

Foley M. The international nanotechnology business directory. How do carbon nanotubes

work:

Carbon

Nanotube

101.

Available

at

http://www.nanovip.com/node/2077, 2006. 32

Lam CW, James JT, McCluskey R. Pulmonary toxicity of single-wall carbon nanotubes in mice 7 and 90 days after intratracheal instillation. Toxicol. Sci. 2004; 77:126-134.

33

Dhawan A, Taurozzi JS, Pandey AK, Shan W, Miller SM, Hashsham SA. Stable colloidal dispersions of C60 fullerenes in water: Evidence for genotoxicity. Environ. Sci. Technol. 2006; 40:7394-7401.

34

Li Z, Salmen L, Hulderman T, Kisin E, Shvedova A, Luster M, Simeonova P. Pulmonary carbon nanotube exposure and oxidative status in the vascular system. Free Radic. Biol. Med. 2004; 37(1):S142.

35

Niwa Y, Iwai N. Genotoxicity in cell lines induced by chronic exposure to watersoluble fullerenes using micronucleus test. Env. Health Prev. Med. 2006; 11:292297.

36

Oberdorster E. Manufactured nanomaterials (fullerenes, C60) induce oxidative stress in the brain of juvenile largemouth bass. Environ. Health Perspect. 2004; 112(10):1058-1062.

37

Shvedova AA, Kisin E, Keshava N, Murray AR, Gorelik O, Arepalli S, Gandelsman VZ, Castranova V. Cytotoxic and genotoxic effects of single-wall carbon nanotube exposure on human keratinocytes and bronchial epithelial cells. (Abstract). In: 227th American Chemical Society National Meeting: 27 March-1 April 2004, Anaheim, CA. Washington, DC, American Chemical Society, IEC 20, 2004.

38

Warheit DB, Laurence BR, Reed KL. Comparative pulmonary toxicity assessment of single-wall carbon nanotubes in rats. Toxicol. Sci. 2004; 77:117-125. 89

39

Aschberger K, Johnston HJ, Stone V, Aitken RJ, Hankin SM, Peters SAK, Tran CL, Christensen FM. Review of carbon nanotubes toxicity and exposure  Appraisal of human health risk assessment based on open literature. Critical Reviews in Toxicology 2010; 40(9):759-790.

40

Sathya TN, Vardhini NV, Balakrishnamurthy P. Revolution of ‘nano’ in in-vitro genetic toxicology. Journal of Cell and Tissue Research 2010; 10(3):2389-2396.

41

Ng CT, Li JJ, Bay B-H, Yung LYL. Current Studies into the Genotoxic Effects of Nanomaterials. Journal of Nucleic Acids 2010; Article ID 947859, 12 pages.

42

Stella GM. Carbon nanotubes and pleural damage: Perspectives of nanosafety in the light of asbestos experience. Biointerphases 2011; 6(2) (17 pages).

43

Doak SH, Manshian B, Jenkins GJ, Singh N. In vitro genotoxicity testing strategy for nanomaterials and the adaptation of current OECD guidelines. Mutat. Res. 2012; 745(1-2):104-111.

44

van der Zande M, Junker R, Walboomers XF, Jansen JA. Carbon Nanotubes in Animal Models: A Systematic Review on Toxic Potential. Tissue Eng. Part B Rev. 2011; 17(1):57-69.

45

Li Z, Hulderman T, Salmen R, Chapman R, Leonard SS, Young S-H, Shvedova A, Luster MI, Simeonova PP. Cardiovascular Effects of Pulmonary Exposure to Single-Wall Carbon Nanotubes. Environ Health Perspect. 2007; 115(3):377-382.

46

Xu YY, Yang J, Shen T, Zhou F, Xia Y, Fu JY, Meng J, Zhang J, Zheng YF, Yang J, Xu LH, Zhu XQ. Intravenous Administration of Multi-walled Carbon Nanotubes Affects the Formation of Atherosclerosis in Sprague-Dawley Rats. J Occup Health. 2012 Aug 23. [Epub ahead of print]

47

Szendi

K,

Varga

genotoxicitásának

C. és

Előkísérletek

a

szén

nanocsövek

mesothelioma-indukciójának

potenciális vizsgálatára.

Egészségtudomány 2006; 50:73-82. 48

Poland CA, Duffin R, Kinloch I, Maynard A, Wallace WAH, Seaton A, Stone V, Brown S, MacNee W, Donaldson K. Carbon nanotubes’ introduced into the abdominal cavity of mice show asbestos-like pathogenicity in a pilot study. Nat. Nanotech. 2008; 3:423-428.

49

Sakamoto Y, Nakae D, Fukumori N, Tayama K, Maekawa A, Imai K, Hirose A, Nishimura T, Ohashi N, Ogata A. Induction of mesothelioma by a single

90

intrascrotal administration of multi-walled carbon nanotube in intact male Fischer 344 rats. J. Toxicol. Sci. 2009; 34:65-76. 50

Takagi A, Hirose A, Nishimura T, Fukumori N, Ogata A, Ohashi N, Kitajima S, Kanno J. Induction of mesothelioma in p53+/- mouse by intraperitoneal application of multi-wall carbon nanotube. J. Toxicol. Sci. 2008; 33:105-116.

51

Singh N, Manshian B, Jenkins GJS, Griffiths SM, Williams PM, Maffeis TGG, Wright CJ, Doak SH. Nanogenotoxicology: the DNA-damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials 2009; 30:3891-3914.

52

HM Government. Characterising the potential risks posed by engineered nanoparticles. A first UK Government research report. 2005, pp. 1-55.

53

Gyarmati J. Iszapkezelések és iszapkutatások. Balneológia, Rehabilitáció, Gyógyfürdőügy 1988; 8:14-26.

54

Bender T, Balint PV, Balint GP. A brief history of spa therapy. Ann. Rheum. Dis. 2002; 61:949-950.

55

Bender T, Karagülle Z, Bálint GP, Gutenbrunner C, Bálint PV, Sukenik S. Hydrotherapy, balneotherapy, and spa treatment in pain management. Rheumatol. Int. 2005; 25(3):220-224.

56

Verhagen AP, de Vet HC, de Bie RA, Kessels AG, Boers M, Knipschild PG. Taking baths: the efficacy of balneotherapy in patients with arthritis. A systematic review. J. Rheumatol. 1997; 24:1964-1971.

57

Varga C. Balneoprevention: new approaches. Int. J. Biometeorol. 2010; 56(1):195-197.

58

74/1999. (XII. 25.) EüM rendelet a természetes gyógytényezőkről 3. számú melléklet

59

https://www.antsz.hu/felso_menu/ugyfeleknek/hatosagi_ugyintezes/engedelyek/ gyogyhely_gyogytenyezo_gyogyviz_asvanyviz/termeszetes.html?query=gy%C3 %B3gyiszap

60

74/1999. (XII. 25.) EüM rendelet a természetes gyógytényezőkről

61

https://www.antsz.hu/data/ cms33335/gyogyiszap.pdf

62

http://naturastart.shp.hu/hpc/web.php?a=naturastart&o=BHis2eyVUK

63

https://www.antsz.hu/data/cms33335/gyogyiszap.pdf

64

http://www.gyogyiszap-neydharting.hu/

91

65

Szendi K, Gerencsér G, Murányi E, Varga Cs. Mutagenic activity of peloids in the Salmonella Ames test. Appl. Clay Sci. 2012; 55:70-74.

66

Maron DM, Ames BN. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat. Res. 1983; 113:173-215.

67

Varga C, Pocsai Z, Kertai P. Urinary and serum mutagenicity studies with rats bearing experimental tumours. Mutagenesis 1995; 10(1):43-45.

68

Vine MF. Micronuclei. In: Biological markers in epidemiology. Hulka BS, Wilcosky TC, Griffith JD (eds.). New York, Oxford University Press, 1990; pp. 125-146.

69

Varga C. Genotoxicologic evaluation of ozonated/chlorinated drinking water: Cytogenetic effects of XAD-fractions on cultured human cells. Environ Toxicol Chem. 1991; 10:1029-1035.

70

Pap M, Varga C. Sister-chromatid exchanges in peripheral lymphocytes of workers occupationally exposed to xylenes. Mutat. Res. 1987; 187:223-225.

71

http://www.spaheviz.hu/

72

http://www.heviz.net/heviz-2

73

http://www.heviz-info.hu/tofurdo.html

74

Lassu L. Környezetvédelmi vizsgálatok. Nemzeti Szakképzési Intézet, Budapest, 1998.

75

Wellness Centrum. Hévízgyógyfürdő [http://www.wellnesscentrum.hu/heviz.php] Letöltve: 2010. szeptember.

76

Ansa

Import-Export

Bt.

Kolopi

gyógyiszap

kompressz

[http://www.halinaansa.hu/termeszetes-es-osi-gyogymodok/kolopi-gyogyiszapkompressz.html] Letöltve: 2012. június 77

Gerencsér G, Murányi E, Szendi K, Varga Cs. Ecotoxicological studies on Hungarian peloids (medicinal muds). Applied Clay Science 2010; 50:47-50.

78

Kim BS, Margolin BH. Statistical methods for the Ames Salmonella assay: a review. Mutat. Res. 1999; 436:113-122.

79

Cariello NF, Piegorsch W. The Ames test: The two-fold rule revisited. Mutat. Res. 1996; 369:23-32.

80

Margolin BH, Kaplan N, Zeiger E. Statistical analysis of the Ames Salmonella/microsome test. Proc. Natl. Acad. Sci. 1981; 78:3779-3783.

92

81

Bernstein L, Kaldor J, McCaan J, Pike MC. An empirical approach to the statistical analysis of mutagenesis data from the Salmonella test. Mutat. Res. 1982; 97:267-281.

82

Krewski D, Leroux BG, Bleuer SR, Broekhaven LH. Modelling the Ames Salmonella/microsome assay. Biometrics 1993; 49:499-510.

83

Hosmani AH, Thorat YS, Kasture PV. Carbopol and its pharmaceutical significance: A review. Pharmaceutical Reviews 2006; 4(1) DOAJ.

84

Dean BJ, Danford N. Assays for the Detection of Chemically induced Chromosome Damage in Cultured Mammalian Cells. In: Mutagenicity Testing: a Practical Approach. Venitt S and Parry JM (eds.) Oxford, IRL Press Limited, 1984, pp. 187-232.

85

Chan PC. NPT Toxicity Report Series No. 34: NTP Technical Report on Toxicity Study of 1-Nitropyrene. Research Triangle Park, 1996, pp. 1-62.

86

Mermelstein R, Kiriazides DK, Butler M, McCoy EC, Rosenkranz HS. The extraordinary mutagenicity of nitropyrenes in bacteria. Mutat. Res. 1981; 89:187196.

87

Heflich RH, Thornton-Manning JR, Kinouchi T, Beland FA. Mutagenicity of oxidized microsomal metabolites of 1-nitropyrene in Chinese hamster ovary cells. Mutagenesis 1990; 5:151-157.

88

Ball LM, Rafter JJ, Gustafsson JA, Gustafsson BE, Kohan MJ, Lewtas J. Formation of mutagenic urinary metabolites from 1-nitropyrene in germ-free and conventional rats: role of the gut flora. Carcinogenesis 1991; 12:1-5.

89

Pusztai Z, Selypes A, Ember I. Short-term effects of 1-nitropyrene on chromosomes and on oncogene/tumor suppressor gene expression in vivo. Anticancer Res. 1998; 18:4489-4492.

90

Imaida K, Lee MS, Land SJ, Wang CY, King CM. Carcinogenicity of nitropyrenes in the newborn female rat. Carcinogenesis 1995; 16:3127-3030.

91

Ember I, Kiss I, Gyöngyi Z, Varga C. Comparison of early onco/suppressor gene expressions in peripheral leukocytes and potential target organs of rats exposed to the carcinogen 1-nitropyrene. Eur. J. Cancer Prev. 2000; 9:439-442.

92

Shulka A, Gulumian M, Hei TK, Kamp D, Rahman Q, Mossman BT. Multiple roles of oxidants in the pathogenesis of asbestos-induced diseases. Free Rad. Biol. Med. 2003; 34:1117-1129. 93

93

Mossman BT, Borm PJ, Castranova V, Costa DL, Donaldson K, Kleeberger SL. Mechanisms of action of inhaled fibers, particles and nanoparticles in lung and cardiovascular diseases. Particle Fiber Toxicol. 2007; 4:4.

94

Nádasi E, Ember I, Arany I. Extracellular signal-regulated kinase as biomarker in the molecular epidemiology of human carcinogenesis. I. Molecular mechanisms. Hung. Epidemiol. 2005; 2:297-304.

95

Nádasi E, Ember I, Arany I. Extracellular signal-regulated kinase as biomarker in the molecular epidemiology of human carcinogenesis. II. Clinical implications. Hung. Epidemiol. 2006; 3:53-58.

96

Kisin ER, Murray AR, Keane MJ, Shi XC, Schwegler-Berry D, Gorelik O, Arepalli S, Castranova V, Wallace WE, Kagan VE, Shvedova AA. Single-walled carbon nanotubes: geno- and cytotoxic effects in lung fibroblast V79 cells. J. Toxicol. Environ. Health 2007; 70(24):2071-2079.

97

Di Sotto A, Chiaretti M, Carru GA, Bellucci S, Mazzanti G. Multi-walled carbon nanotubes: lack of mutagenic activity in the bacterial reverse mutation assay. Toxicol. Lett. 2009; 184:192-197.

98

Wirnitzer U, Herbold B, Voetz M, Ragot J. Studies on the in vitro genotoxicity of baytubes, agglomerates of engineered multi-walled carbon-nanotubes (MWCNT). Toxicol. Lett. 2009; 186:160-165.

99

Muller J, Decordier I, Hoet PH, Lombaert N, Thomassen L, Huaux F, Lison D, Kirsch-Volders M. Clastogenic and aneugenic effects of multi-wall carbon nanotubes in epithelial cells. Carcinogenesis 2008; 29:427-433.

100 Cveticanin J, Joksic G, Leskovac A, Petrovic S, Sobot AV, Neskovic O. Using carbon nanotubes to induce micronuclei and double strand breaks of the DNA in human cells. Nanotechnology 2010; 21:015102. 101 Migliore L, Saracino D, Bonelli A, Colognato R, D’Errico MR, Magrini A, Bergamaschi A, Bergamaschi E. Carbon nanotubes induce oxidative DNA damage in RAW 264.7 cells. Environ. Mol. Mutagen. 2010; 51:294-303. 102 Lindberg HK, Falck GC, Suhonen S, Vippola M, Vanhala E, Catalán J, Norppa H. Genotoxicity of nanomaterials: DNA damage and micronuclei induced by carbon nanotubes and graphite nanofibres in human bronchial epithelial cells in vitro. Toxicol. Lett. 2009; 186:166-173.

94

103 Zeni O, Palumbo R, Bernini R, Zeni L, Sarti M, Scarfi MR. Cytotoxicity investigation on cultured human blood cells treated with single-wall carbon nanotubes. Sensors 2008; 8:488-499. 104 Kolosnjaj-Tabi J, Hartman KB, Boudjemaa S, Ananta JS, Morgant G, Szwarc H, Wilson LJ, Moussa F. In vivo behaviour of large doses of ultrashort and fulllength

single-walled

carbon

nanotubes

after

oral

and

intraperitoneal

administration to Swiss mice. ACS Nano 2010; 4:1481-1492. 105 Schipper ML, Nakayama-Ratchford N, Davis CR, Karn NWS, Chu P, Liu Z, Sun X, Dai H, Gambhir SS. A pilot toxicology study of single-walled carbon nanotubes in a small sample of mice. Nat. Nanotech. 2008; 3:216-221. 106 Zhao Y, Xing G, Chai Z. Nanotoxicology: Are carbon nanotubes safe? Nat. Nanotech. 2008; 3:191-192. 107 Muller J, Huaux F, Fonseca A, Nagy JB, Moreau N, Delos M, Raymundo-Piñero E, Béguin F, Kirsch-Volders M, Fenoglio I, Fubini B, Lison D. Structural Defects Play a Major Role in the Acute Lung Toxicity of Multiwall Carbon Nanotubes: Toxicological Aspects. Chem. Res. Toxicol. 2008; 21:1698-1705. 108 Muller J, Delos M, Panin N, Rabolli V, Huaux F, Lison D. Absence of carcinogenic response to multiwall carbon nanotubes in a 2-year bioassay in the peritoneal cavity of the rat. Toxicol. Sci. 2009; 110:442-448. 109 Boczkowski J, Hoet P. What's new in nanotoxicology? Implications for public health from a brief review of the 2008 literature. Nanotoxicology 2010; 4(1):1-14. 110 Gernand J, Casman E. A meta-analysis of carbon nanotube pulmonary toxicity studies – How physical dimensions and impurities affect the toxicity of carbon nanotubes. This document is a currently unpublished chapter of the doctoral dissertation of J.M. Gernand. It has been submitted for publication to a peer reviewed

journal

and

is

currently

under

review.

http://www.andrew.cmu.edu/user/jgernand/carbon_nanotube_tox.pdf

Letöltve:

2013. február. 111 Lam CW, James JT, McCluskey R, Arepalli S, Hunter RL. A review of carbon nanotube toxicity and assessment of potential occupational and environmental health risks. Crit Rev Toxicol. 2006; 36(3):189-217. 112 Donaldson K, Murphy FA, Duffin R, Poland CA. Asbestos, carbon nanotubes and the pleural mesothelium: a review of the hypothesis regarding the role of long 95

fibre retention in the parietal pleura, inflammation and mesothelioma. Part Fibre Toxicol. 2010; 7:5. doi: 10.1186/1743-8977-7-5. 113 Veniale F, Bettero A, Jobstraibizer PG, Setti M. Thermal muds: Perspectives of innovations. Appl. Clay Sci. 2007; 36:141-147. 114 http://terapia-heviz.hu/hevizi-to/hevizi-iszap 115 Gerencsér G, Szendi K, Varga C. Gyógyiszapok ökogenotoxikológiai vizsgálata. Magyar Epidemiológia 2011; 8(2):123-127. 116 Szendi K, Gerencsér G. Gyógyiszapok genotoxikológiai vizsgálata üstököselektroforézissel. Magyar Epidemiológia 2011; 8(4):207-212. 117 Varga C. Vízhigiéne – víztoxikológia: Aktuális hazai kérdések és kutatási irányok. Acta Biol. Debr. Oecol. Hung. 2012; 29:9-120. 118 Fischer E. Effects of atrazine and paraquat-containing herbicides on Eisenia fetida (Annelida, Oligochaeta). Zool. Anz. 1989; 223:291-300. 119 Fischer E, Molnár L. Growth and reproduction of Eisenia fetida (Oligochaeta, Lumbricidae) in semi-natural soil containing various metal chlorides. Soil Biol. Biochem. 1997; 29:667-670. 120 OECD Guideline 207, 2003. Earthworm, Acute Toxicity Test. 121 Gruiz K, Horváth B, Molnár M. Környezettoxikológia. Budapest: Műegyetem Kiadó; 2001. 122 OECD Guideline 208 for the Testing of Chemicals, 2003. Seedling Emergence and Seedling Growth Test. 123 Matis EI, Reshetova GG, Novikova SV. Experimental validation of the administration into the body of the lipids from therapeutic muds by means of vibration. Vopr. Kurortol. Fizioter. Lech. Fiz. Kult. 1996; 4:22-24. 124 Tateo F, Ravaglioli A, Andreoli C, Bonina F, Coiro V, Degetto S, et al. The invitro percutaneous migration of chemical elements from a thermal mud for healing use. Appl. Clay Sci. 2009; 44:83-94.

96