KAR,AKTERISASI ENZIM KATEPSIN DARI IKAN PATIN (Ponsosius sp) f,lrcmmod Zokiyul Fikri, lmo Wiioyonti, Noni Nur'qenoh, Sofrino Dyoh Hordiningtyos, Elizobeth Juleni Topotubun Deportemen Teknologi Hosil Peroiron, Fokultos Perikonon don Ilmu Kelouton,
IPB
Abstrsk
I':im
kotepsin merupokon enzim penting yong berperon dolom proses pelunokon
on selomo proses kemunduron mutu. Aktivitos enzim ini songot berpengoruh
; I ':::o proses kemunduron mutu ikon . Oleh koreno itu, perhr diketohui korokteristik enziri"i i ::-':clom proses kemunduron mutu sehinggo dopot mengombil longkoh yong tepot :: :* :erongonon don pengolohon ikon. Tuiuon penelition iri odoloh mengekstrok enzim : ::: - :ori ikon potin don menentukon korokter enzim kot,rpsin yong berosql dori ikon : )e'elition ini dilokukon duo tohop yoitu ekstroksi en;,im kosor don pengendopon :- . : - c.nmonium sulfot. Hosil penelition ekstrok kosor (c'ude ekstrok) enzim kotepsin -:'-- -((:rn oktivitos spesifik 0,457 U/^g, enzim tersebut dopot diendopkon dengon ::
-
i<
n
-
-'
I --c(on ommonium sulfot 6070. Pengendopon dengon renggunokon ommonium sulfot
= -:-:-:: iion oktivitss spesifik 0,23 koli. Enzim kotepsin memprnyoi suhu optimum 50 "C don - :''*-T 6, konsentrosi substrot optimum 670 dengon niloi crktivitos 0,8167 U/ml. Berot enzim kotepsin kosor hosil SDS-PAGE 12,97-55,49 kDA don berot molekul enzim : ;-go mempunyoi oktivitos proteolitlk podo onolisis zym,rgrom odoloh 28,88 kDo.
-: ,T H U
: 3'
:-
: enzim, kotepsin, korokteristik, ikon potin
LUAN
n
merupokon ienis ikon konsumsi oir towor osli lndonesio yong tersebor di .viloyoh Sumoters don Kolimonton. Doging ikon potin memiliki kondungon kolori
':'e n yong cukup tinggi, roso dogingnyo khos, eno<, lezot don gurih sehinggo :' :leh mosyorokot. lkon potin diniloi lebih omon untuk kesehoton koreno kodor
'.'/a
rendoh dibondingkon dengon doging hewon 'ernok. Seloin itu ikon potin
:eberopo kelebihon loin, yoitu ukuron per indiv dunyo besor don di olom
;-: r
biso mencopoi 120 cm (Susonto don Amri, 2OO2).
"':1urut doto stotistik perikonon budidoyo tohun 2O('1, produksi ikon potin (dori .: kolom, kerombo don ioring opung, serto sowoh) odoloh sebesor I l.l I8 ton.
:
oton menyongkut mutu don :-:'pongon. Hol ini disebobkon koreno ikon polin secerti holnyo sifot ikon podo - . : ' oitu cepot mengolomi kemunduron mutu ikon. re.urunon mutu ikon teriodi segero seteloh ikon dito rgkop otou moti. Kecepoton
,-:'mutu dipengoruhi oleh bonyok foktor, ontoro loin ienis kelomin, ienis ikon, ukuron .:-o si lingkungon, perlokuon fisik, iumloh iosod renik, dor oktivitos enzim (Ridwonsyoh I
Prosiding Pertemuon llmioh don Semincr Nosionol MPHPI 20'i
I
2l
2oo2)' soloh sotu ienis enzim yong berperon penting dorom proses kemunduron mufu ikon odoloh enzim-enzim penguroi protein (enzim proteoritik) yong menguroikon protein meniodi pepton' polipeptido' don osom-osom omino (Kreuzer r 965) Hidrorisis protein oreh suotu proteose seperti kotepsin colpoin don kologenose dopot menyebobkon timburnyo
okumurosi metobolit' perubohon citoroso, don pelunokon tekstur, terbentuknyo komponen vorotire serto peningkoton iumloh bokteri yong okhirnyo menimbulkon kebusukon. Proteqse odoloh enzim yong mompu menghidrolisis ikoton peptide podo protein. Enzim ini untuk melokukon oktivitosnyo membutuhkon oir sehinggo dikerompokkon dorom kelos hidrolose (Roo ef o/' I998)' secoro umum proteose dopot dibogi dorom duo gorongon, yoitu proteinose don peptidose' Berdosorkon sifot kimio don sisi okt;fnyo dikenor empot gorongon profeose yoitu serin, sistein, osportot don metollo endopeptidqse (otto don schirmeisfer proteose merupokon kelompok besor enzim, termosuk korepsin jilll;.t'ttein risosomor don
Kofepsin ditemukon
di lisosom serot doging don di sel fogosit. Lisosom merupokon introseluler orgonel yong bonyok mengondung enzim hidrolitik don berperon dorom pencernoon dolom sel' Kotepsin odoloh osom proteose terretok di risosom. Mereko mungkin terbeboskon ke keduo sitoplosmo don ruong introseruror sebogoi konsekuensi dori gongguon lisosomol yong teriodi seteloh kemotion sel okibot penurunon pH (Duston r 9g3 diocu
dolom
Cherer 2OO7).
Beberopo tipe kotepsin teloh diidentifikosi dengon osom omino yong berbedo di sisi oktifnyo' Kotepsin B don Kotepsin L keduonyo merupokon sistein proteinose yong kemungkinon poling penting dolom kemunduron tekstur doging (Aoki er cr. 2ooo; Kolodzieisko don sikorski 1996)' Aktivitosnyo berbedo-bedo tiop froksi doging don spesies ikon' Aktivitos opfimum diloporkon podo suhu 4o-so oc don oktivitosnyo menurun dengon penurunon suhu' Kotepsin secoro umum bekerio podo pH 3-4 don beberopo kotepsin mempunyoi oktivitos tinggi podo iugo pH 6-6,5 (Aoki ef ot. 2ooo; Korodzieisko don sikorski 1996). Aktivitos kotepsin songot berpengoruh terhodop tekstur doging ikon koreno kotepsin dopot menurunkon fleksibilitos (kekenyolon) sehinggo doging ikon meniodi t,dok elostic don ioringon doging ikon melunok (lembek)' Pelunokon doging ini merupokon soroh sotu sumber mosoloh podo industri surimi koreno kotepsin dopot menurunkon kemompuon pembentukon gel podo proses pembuoton surimi dori doging ikon okibot degrodosi protein myofibrir yong dopot mengurongi elosfisitos don kekuoton gel surimi. Jenis kotepsin B, D, L don H teloh diketohui memiliki efek ge/ soffenrng podo proses pembenrukon ger surimi (Hoord 2ooo).
I
Prosiding pertemuon llmioh don Seminor
N.*r, *rrfllO,
ZZ
fir*egr dori penelition ini odoloh untuk mengetohui korokterisosi don purifikosi enzim kofepsin
r
*on
:TO'I}E
Eil
Potin dengon presipitosi ommonium sulfot.
PENELITIAN
don Alot Bohon yong digunokon terdiri dori bohon utqmo berupo ikon potin dolom keodoon
bohon-bohon untuk ekstroksi kosor (buffer Tris HCI 0,1
M pH 2,4),
presipitosi
rsrm,urium sulfot teknis), uii oktivitos kotepsin (hemoglobin, buffer tris HCI 0,1 M pH 7,4,
- ::rodes, TCA Soh,folin, HCI I N), uii kodor protein (pereoks Brodford, bovine serum * - Alot yong digunokon ontoro loin incubotor, sentrifuse suhu Jingin, spektrofotometer, *:'i', kertos soring whotmon no.'l , tobung reoksi, don erlenmeyer ' r, irr .':r,si Kotepsin Kqsor i<stroksi dilokukon dengon presipitosi sompel untuk merrperoleh ekstrok kosor n:: - cengon coro ikon dimotikon, kemudion doging ikon dibedoh dengon cepot don
.: ---,6 menghilongkon dorqh. Tohopon ekstroksi kotepsin kosor ;eloniutnyo ". :' :, 2002). :,'erisosi
berdosorkon
Suhu
. c.okterisosi suhu dilokukon dengon melokukon voriosi st,hu inkubosi podo soot suhu 20, 30, 40,50, 60 dan 70 oC. Podo woktu
.- :- oktivitos kotepsin dengon .- r-, hemoglobin sebogoi substrotnyo dibuot dengon : - .:'epsin kosor di ukur berdosorkon (Dinu ef ol.2OO2)-
konsenlrosi 2oh pH 2. Aktivitos
: ,'erisosi pH
crokteriscsi pH dilokukon dengon menggunokon substro" hemoglobin 2o/o yong ::do berbogoi voriosi pH yoitu 4, 5, 6, don 7. Seloin i'u, buffer Tris HCI yong .:
:.-" : - -:.3n iugo diotur podo voriosi pH yong somo yoitu 4, 5, 6, don 7. Aktivitos :-: -
: :*'erisosi Konsenirqsi <
enzim
Subslrqt
crqkterisosi konsentrosi substrot dilokukon dengon menguboh konsentrosi substrot
-*:: rcln dengon berbogoi voriosi konsentrosi yoilvz 3o/o,4oh, !;oh don 60/o (b/vl pH 2. :: enzim kotepsin kosor di ukur berdosorkon (Dinu et ol.2OO2)' i"+: : tosi Enzim Kotepsin Kosor semi murni diperoleh dengon mengendopkon esktrok kosor kotepsin ommonium sulfot dengon tingkot keienuhon 5Oo , 600/0, 7ooh, don 807o.
-,-.I,-ckon * -:- --^ sulfot ditombohkon sedikit
I
demi sedikit ke dolom supernoton don seloniutnyo
Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor No,ionol MPHPI 20
11
23
disentrifuse
podo '12000xg selomo 30 menit. Pelet yong diperoleh dqri hosil sentrifuse
dilorutkon dolom buffer Tris HCI 0,1 M pH7,4.
Aktivitos Kotepsin Aktivitos proteolitik dori kotepsin diuii menggunokon hemoglobin sebogoi substroinyo dengon konsentrosi 2o/o pH 2. Aktivitos kotepsin diukur menurut metode Dinu et o/. (2002). Penetuon Konsenlrqsi Protein Konsentrosi protein ditentukon dengon menggunokon metode Brodford dengon bovin serum olbumin (BSA) sebogoi stondor (Brodford 1976).
Penenluon Berot Molekul dengon SDS-PAGE don Zimogrom Penentuon berot molekul dilokukon dengon metode SDS-PAGE dengon komposisi gel
penohon (stocking gel) sebesor 4o/o don gel pemisoh (gel okrilomid) sebesor 8o%. Anolisis SDS don zimogrom dilokukqn berdosorkon (Loemmli I970).
HASIL DAN PEMBAHASAN
Ekstroksi Enzim Kolepsin Ekstroksi enzim kotepsin kosor
dori doging ikon potin dilokukon dengon mengombil
bogion doging ikon yong sudoh memosuki tohop posf-rigor. Berdosorkon hosil penelition
Fentiono (2009), podo f ose
ini oktivitqs kotepsin berodo podo
oktivitos tertinggi
dibondingkon podo fose-fose sebelumnyo, sehinggo dihoropkon rendemen kotepsin yong dihosilkon tinggi. Seloniutnyo doging ikon dilorutkon dolom qkuodes dengon perbondingon
l:'l
don
dihomogenisosi. Menurut Correno (2000), kotepsin bonyok ditemukon podo lisosom don sel
pogosit.
Proses homogenisosi
ini bertuiuon untuk mengeluorkon enzim kotepsin dori bogion
lisosom don mitokondrio.
Hosil pemecohon sel dengon proses homogenrsosi dipisohkon dengon sentrifugosi
metode diferensiol sebonyok tigo koli. Penelition yong dilokukon Dinu
el o/.
(2OO2l
menyebutkon bohwo podo sentrifugosi tingkot pertomo dilokukon sentrifugosi podo kecepoton 600x g selomo l0 menit. Sentrifugosi tingkot keduo dilokukon podo kecepoton '10000x g selomo '10 menit. Sentrifugosi tohop ketigo dilokukon podo kecepoton 4000x g selomo
I0
menit.
Sentrifugosi metode differensiosi diowoli dengon sentrifugosi tingkot pertomo, dimono
supernoton yong dihosilkon diombil untuk kemudion dilokukon sentrifugosi keduo podo kecepoton tinggi untuk memisohkon portikel yong berukuron sedong. Pelet yong dihosilkon
podo sentrifugosi keduo dilorutkon dengon buffer Tris-HCl 0,1 M pH7,4 dengon iumloh yong somo dengon okuodes yong digunokon untuk proses homogenisosi.
I
T
Prosiding Pertemuon llmioh Jon Seminor Nosionol MPHPI 201
1
24
: r -:u'nyo disentrif ugosi kemboli untuk memperoleh supe rnoion yong merupokon :::' dqri kotepsin. Buffer Tris-HCl pH7,4 yong digunokon ;ebogoi pelorut berfungsi -;ungi enzim dori seiumloh besor osom yong dileposkon dori vokuolo podo soot :e . rlol ini seloros dengon pendopot Whittoker (1994} /ong menyotokon bohwo =-:'n- seboiknyo menggunokon buffer untuk mengontrol pH dekot dengon 7,5 don
:'
0,1-0,5.
."ros ekstrok kosor enzim kotepsin ditentukon dengon rrenggunokon hemoglobin
-ssirctnyo dengon konsentrosi 2o/o pH 2. Hosil penguiion menuniukon ekstrqk kosor '=csin memiiki oktivitos spesifik sebesor O,45706 lJ/ry1 dengon kodor protein .. -
2202 mgf ml. Niloi oktivitos enzim kotepsin dipengort hi oleh ienis ikon, kondisi
":-c'ongon gonod, umur, don temperotur lingkungon. Aktivitos spesifik
*
ekstrok
kctepsin dori ikon bondeng (Chonos chqnos Forskol) mencopoi 0,8598
U/-g
-:'l , 9,4 Ufmg podo ikon mockerel don 4,5 U/^g prdo milkfish (Jiong ef o/. - ' : J/^g podo ikon mos (Liu ef o/. 2008). Beordrrll don Johnston (1985) ':- cchwo oktivitos enzim kotepsin podo ikon soithe (Po//:chius virens L.) meningkot : !? on'ro kondisi lopor. Podo ikon solmon lOncorhyncl'us kefo L.) menuniukkon :':'eolitik cothepsin L tinggi selomo migrosi pemiiohon
- :,
(Yomoshito
el o/.
.l990).
A
--:-: n. pi/chordus) (Gomez-Guillen don Botiso 1997).
::
Enzim Kosqr
i':-'c\, (qsqr yqng diperoleh
seloniutnyo di presipitosi menggunokon qmmonium sulfot
'-l{c- keienuhon 5Oo/o,6Oo/n,7Ooh, don 807o dengon tuiu:n untuk memisohkon don ,:- e-:im kotepsin dori protein-protein loin yong terdopot :odo ekstrok kosor enzim 3r
lihon tingkot ke[enuhon ommonium sulfot podo rento rg 5O%-8Ao didosorkon
: - : : c :t
Bisswonger (2004) yong menyotokon bohwc
tiop presipitosi
protein
-ck'eristik podo konsentrosi reogen yqng berbedo. Pres pitosi dengon omrnonium
-:
se
cng konsentrosi 20-1A0o dionggop cukup untuk pre;ipitosi protein. Berbogoi
-sr yong dopot digunokon podo proses presipitosi diorforonyo ommonium sulfot,
:::e" polietilen glikol (PEG), otou loruton orgonik seperti oseton otou olkohol I ?a diocu dolom Kumor ef o/. 2003). Nomun pe nilihon ommonium sulf ot , :- p,:rdo pendopot Jovois (.l999) yong menyotokon bohwo ommonium sulfot : : ::pct don muroh. -"'."ic; enzim kotepsin ikon potin yong teloh mengolorri pengendopon dengon -- :;rf ot dopot dilihot podo Gombor l.
I
Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 201 I
25
ti .!-,
L
v
4
li
ry
;
l! lr
,
).,
€sen 4*16 66$+ *ft*6
ti'
lqoc***ntra*[ arftsatgm
Gombor
'l Aktivitos enzim kotepsin
fi{.+{f
1*#.i+
*t
setelqh pengendopon dengon berbogoi konsentrosi
ommonium sulfot.
Aktivitos enzim podo pelet lebih besor dibondingkon dengon oktivitos enzim podo
supernoton. Aktivitos optimum enzim kotepsin podo pelet diperoleh dengon pengendopon ommonium sulfot podo tingkot keienuhon 600/o dengon niloi 0,21 62 unitfml don oktivitos enzim menurun toiom dengon semokin tingginyo tingkot keienuhon qmmonium sulfot. Aktivitqs
enzim
kotepsin podo supernoton cenderung mengolomi p.nrrunon dengon semokin
sulfot. Presipitosi menggunokon gqrom odoloh coro pengendopon protein berdqsorkon kemompuon ion gorom dolom mempengoruhi meningkotnyo tingkot keienuhon ommonium
kelorufon protein. lon gorom dori gorom ommonium sulfot, yoitu ion NHr+ don SO+2-. Pqdo konsentrosi rendoh, ion-ion gorom tersebut okon mengelilingi protein
don
mencegoh
bersotunyo molekul-molekul ini, sehinggo protein lorut. Peristiwo ini disebut solfing in. Pqdo konsentrosi yong finggi,
teriodi peningkoton muoton listrik disekitor protein yong okon
menorik moteri oir dori koloid protein. Interoksi hidrofobik diontoro sesomo molekul protein
podo suoson yong tinggi qkon menurunkqn keloruton protein (Suhortono 1989). Koroklerislik Suhu Ekstrok Kosor Enzim Kotepsin Suhu merupokon soloh sotu
foktor yong mempengoruhi oktivitos enzim. Pengoruh
suhu
terhodop oktivitos enzim kotepsin kosor disoiikon podo Gombar 2. Aktivitos enzim meningkot dengon odonyo peningkoton suhu dori 40 oC meniodi 50 oC, nomun peningkoton suhu
sompoi 60
'C
menyebobkon oktivitos enzim menurun. Suhu optimum ekstrok kosor enzim
kotepsin odqloh podo suhu 50 "C dengon niloi oktivitos 0,0749 U/ml.
Podq perubohon suhu, kecepoton reoksi yong dikotolisis oleh enzim
mulo-mulo
meningkot koreno odonyo peningkoton suhu. Energi kinetik okon meningkot podo kompleks enzim don substrot yong bereoksi. Nomun, peningkoton energi kinetik oleh peningkotqn suhu mempunyqi botos yong optimum. Jiko botos tersebut terlewoti, moko energi tersebut dopot memutuskon ikoton hidrogen don hidrofobik yong lemoh yong mempertohonkon struktur
sekunder-tersiernyo. Podo suhu ini, denoturosi yong disertoi dengon penurunon oktivitos
I
L_
Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI
20l
I
26
-togtoi kotolis okon teriodi suhu optimol enzim bergontung podo lomonyo F kodor yong dipokoi untuk menentukonnyo. Semokin lomo suotu enzim Fh podo suhu dimono strukturnyo sedikit lobil, moko semokin besor kemungkinon Fh-Hpur mengolomr denoturosi.
?, = *.+3 €
;
c
* ;LT = i\ J
i
{
t
i,:
Snilat
Gombor 2 Pengoruh suhu terhodop oktivitos enzim kotepsin kosor.
L=-=--=-
$crot pgo merupokon sqloh sotu foktor yong mempengoruhi loiu reoksi enzim. ] dd dengon kosentrosi enzim yong lebih sedikit dibondingkon subsrrot, penembohon I*, Fa frr rreningkotkon loiu reoksi. Peningkoton loiu reoksi ini teriodi secoro lineor. jiko rtcrot don enzim seimbong, loiu reoksi okon relotif konston. pengoruh kosentrosi ]Jfr':*roaop oktivitos spesifik enzim dopot dilihot podo Gombor 3. Kosenrrosi substrot lerhodop qktivitos spesifik enzim yong dihosilkqn. Jiko kosenrrosi substrot lFF.5 noko oktivitos spesifik enzim okon sompoi podo tifik tetentu. Kosentrosi substrot l*616 merupokon kosentrosi substrot yong poling tinggi oktivitos spesifik enzim kotepsin FJoi sebesor 0,81 67 (U/ml) tetopi tidok biso dikorokon bohwo 60% merupokon lF optimol untuk enzim kotepsin koreno dengon dinoikkon kosentrosi substrotnyo ]ffi lr.OX lernr.rngkinon okon menemuksn iumloh kosentrosi optimol untuk enzim ini. =
0.90 0.80
o.zo € f,
-.5 0.60
o.so
E
o.+o
$
o.:o
E
<
o.zo 0.10 0.00
K3%
K4%
K50/o
K6%
Konsentrasi substrat
l:-c:r
3 Pengoruh kosentrosi substrot terhodop oktivitos spesifik kotepsin.
I
----rE
Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nos onol MpHpl
20l 1 27
Semokin bonyok molekul substrot yong tersedio, semokin sering molekul-molekul tersebut memosuki sisi qktif molekul enzim. Akon tetopi, terdopot keterbotoson dolom memqcu kecepoton reoksi dengon corq menombohkon lebih bonyok logi substrqt ke suotu qkon meniodi kosentrqsi enzim yong tetop. Pqdo suotu titik tertentu, kosentrosi substrot itu cukup tinggi sehinggo semuo sisi oktif podo semuo molekul sudoh ditempoti oleh susbtrot. Segoro seteloh produk meninggolkon sisi oktif, molekul substrot yong loin okon mosuk. Pqdq kosentrosi substrot seperti ini, enzim
ifu dikotokon mengolomi keienuhon don loiu
reoksi
ditentukon oleh kecepoton sisi oktif menguboh substrot meniodi produk. Ketiko suotu enzim teloh ienuh, sotu-sotunyq corq untuk meningkotkon produktivitos oioloh menombohkon lebih
bonyok logi enzim (Compbell 2OO2l. Pengoruh pH Semuq reoksi enzim dipengoruhi oleh pH medium tempot reoksi
feriodi. Setiop enzim
memiliki pH optimum yong khos, yoitu pH yong menyebobkon oktivitos moksimol. Profil oktivitos pH enzim menggomborkon pH podo soot pemberi don penerimo proton yqng penring podo sisi kotolitik enzim berodo podo tingkot ionisosi yong diinginkon. Nomun podo
pH tertentu (ekstrim) dopot menyebobkqn enzim terdenoturosi yong menyebobkon
enzim
kehilongon oktivitos biologisnyo (Lehninger I 993).
Niloi pH songot berpengoruh terhodop oktivitos spesifik enzim kotepsin. Niloi pH yong memberikon oktivitos spesifik terboik, ditompilkon oleh pH 6 yoitu 0,6660 U/ml. Jiko pH kurong qtou lebih dori 6, menyebobkon teriodinyo penurunqn oktivitos spesifik dori enzim korepsin (Gombor
4). Aktivitos spesifik kotepsin yong lebih tinggi podo pH 6 iugo ditemukon
podo ikon nilo (Sherekor el ol. 1988) don doging ikon mos (Horo ef ol. 1988).
a s.ffis E
H
n.arym
E E a,
m"4+*$
E s&m il
E *.uwo pH
Gombor 4 Pengoruh pH terhodop ok.ivitos spesifik kotepsin.
Bobot Molekul Kotepsin Penentuon bobot molekul dilokukon dengon nrenggunokon teknik SDS-PAGE (Sodium dedocyl Su/phofes-Poliocrylomido gel E/ekfroforesis). Pcdo metode ini
terdopot duo mocom gel
yoitu gel pemisoh (resolving) don gel penohon (sfocking gel) yong mengondung SDS, Prosiding Pertemuqn llmioh dqn Seminor Nosionol MPHPI 201 I
APS
:--cnium perisulfot), okrilomido don -:
TEMED serto sompel
yorg okon ditentukqn berot
.<.J nyo yoitu ekstrok kosor enzin, kotepsin.
i.osil onoliso berot molekul dengon SDS-PAGE dopot dilihot podo Gombor
5.
Morker
:-: cigunokon podo onoliso ini berosol dori pormocio. Morker pqrmocio menggunokon ':-:sr LMW (Low Moleculorweight). Podo morker pormocio terlilot odo 6 bond/pito yong :'rr.)e
dituniukkon podo Tobel 2, sedongkon podo ekstrok kqsor terdopot 5 pito.
4i
97 kDo
66 kDo 45 kDo 30 kDq 20,1 kDq 14,4
kDq* Morker
-:-::r
Enzim kosor
5, Hosil onolisis SDS-PAGE ekstrok kosor enzim kotepsin ik:n potin. M = Mqrker, E= ekstrok kosor
Tqbel -r'1w
I
Jenis stondor, berot molekul don niloi Rf stondor pormocio
(14400-97000)
llrcsphorylose b ADqnin Ovolbumin ffionic onhydrose Trypsin inhibitor r-Loclolbumin
BM
97000 66000 45000 30000 20100 14400
Log BM
4,986772 4,819544 4,653213 4,477121 4,3031 96 4,158362
Jqrok
migrosi
(cm)
Bond (cm)
Rf
5
112
O,24
5
119
0,38
5
2,3
O,46
5
2rg
5
3r3
5
4,4
0,56 0,66 0,88
3erot molekul ekstrok kosor ditentukon berdosorkon personroon regresi lineor ontoro
: ij con logoritmo berot molekul podo stondor (Gombor 6), Persomoon regresi linier :: :- ! = -1,372x + 5,293 dimono y = log berot molekul norker (kDo), sedongkon = -:tr ltos relotif protein (cm). Ekstrok kosor enzim kotepsin memiliki berot molekul sebesor - ' - . )a,21,51 kDo, 29,50 kDo,43,10 kDo, don 55,49 kDo (Tot,el 1).
I
-
-=-
Prosiding Periemuon llmioh don Seminor Nrrsionol MPHPI 201
1
29
6
E
5
:
{
o
3
!o .I
g 5
Y='1,3718xt 5'X9$9
2 tb
ro
&r
I
TD
0
* fr.$$43
0 0
s.l 0,! t,3 0,4 s"5 0.$ s-? t8 s,$ I Rf
Gombor 6. Kurvo stondor SDS-)AGE Tobel 2 Perhitungon berot molekul ekstrok kosor e nzim kotepsin ikon potin Poniong
Poniong Bond (cm
,l
5
2
2
5
2.4
3
5
3
4
5
3.5
Bqnd
0.4 0.48 0.6 0.7
-1.372 -1.372 -1.372 -1.372
5,293 5,293 5,293 5,293
Log BM
BM
BM Kd
4,7442 4,63444 4,4698 4,3326
55488,12
55,49
43096,3 43,10 29498,5 29,5O 21 ,51 2 t 508
Untuk melihot qktivitos enzim dilokukon uii zimogr
protein dengon coro inkubosi. Hosil onoliso zimogrom dopot dilihot podo gombor
7.
Podo
ekstrok kosor terdopot bond bening yong menunfukon :donyo oktivitos enzim kotepsin. Morker yong digunokqn berupo pormocio dengon kurvt regresi y = -1,160x + 5,266 (Gombor 8). Berot molekul dori bond bening tersebut Jihitung berdosorkon persomoon regresi dori stondor don diperoleh niloi sebesor 28,28 kDo (Tobel 2). Penelition yong dilokukon Krouse ef ol. (2010) mennuniukkon bqhwo kotecsin D yong berqsol dori doging ikon osfrich memiliki bobot molekul 29,1 kDo. Penelition loir yong dilokukon oleh Jiong ef ol.
(1997) mengenoi kotepsin D ikon tongkol don ikon bondetg, menuniukkon bahwo kotepsi podo ikon tongkol terestimosi sebesor 5l kDo don podo ikrn bondeng sebesor 54 kDo.
I
Prosiding Pertemuon llmioh don l,eminor Nosionol MPHPI 2OI
I
30
D
97 kDa
66 kDo
45 kDo 30 kDq
8,88 kDo
20.1 kDo
14,4kDo
re€. Morker
Hasil pengendapan ammonium sulfat
Gombor 6 Zimogrom enzim kotepsin ikon potin.
ur l
5l
g 41 o
I
./=
E E
3
(,
.o 2 o) o
l 0.+-
-1.1607x + 5.2661 R2 = 0.9461
1
I I
0.20 0.40 0.60 0.80 'r.00
0.,00
1.20
Rf
Gombor 7 Kvrvo regresi lineor Zimogrom stondur pormocio.
Tobel 3 Perhitungon berot molekul enzim yong men"punyoi oktivitos
lo
i':-":,( (
nd kosor
Poniong Migrosi
Poniong
(cm)
(cm)
4.7
3.3
Bond
Rf
0.702128
q -'r.r
b
6
5,266
[ogBM
Brvr rlJlr
4,451532 28283,42
28,28
"i -pulon -os l penelition ekstrok kqsor (crude eksfrok) enzim kotepsin menuniukkon oktivitos :; :. ),a57 U/^g, enzim tersebut dopot diendopkon dengrn menggunokon ommonium ':' :lr :: Enzim kotepsin mempunyoi suhu optimum 50 'C dor pH optimum 6, konsentrosi : ":- opi,mvm 60/o dengon niloi oktivitos 0,8167 U/ml. Berot nolekul enzim kotepsin kosor ilS-PAGE 12,97-55,49 kDA don berot rnolekul enzim yong didugo mempunyoi oktivitos
I
Prosiding Pertemuon llmioh don Semino. Nosionol MPHPI 201
1 3l
proteolitik podo onolisis zymogrom odoloh 28,88 kDo. )engendopon dengon menggunokon ommonium sulfot menghosiikon oktivitqs spesifik 0,23 koli
DAFTAR PUSTAKA
Anonim. 2007. Stofistik Ke/oufon don Perikonon Tohun 2006. Pusot Doto Stotistik don lnformosi. Deportemen Kelouton dqn Perikonsn. Bodon Pusot Stotistik Republik lndonesio
Aoki T. Yomoshito T. Ueno R.2OOO. Dislribution of cofhe psins in red ond white muscles omong fish species. J. Agric. Food Chem . 43 t 327 -330 Beordoll
,l985. Lysosomol
enzyme oc'ivities in muscle following storvotion ond refeeding in the soithe Pol/ochius Virens l.E r. J.Cell Bio/.39''l 12-117.
C.
Bisswonger
Johnston
H. 2004.
lA.
Procticol Enzymology. Germony: \Viley-VCH'
,|976. A Ropid ond sensitive method for rluontificotion of microgrom quontities Brodford MM. of protein utilizing the principle of protein dye binding. Ano/ Biochem72r234-254. Cheret R, Lodrot CD, Anton M de Lombollerie, Bogni ' YY.2OO7. Colpoin ond cothepsin octivities in posf morlem fish ond meot muscles. f cod Chemislry'l0l: I474-1479 Dynnor N. 20l l. Pemurnicn don korokterisosi enzim Iotepsin dori ikon bondeng (Chonos chonos Forskoll). [Skripsi]. Fokultos Perikonqn don llmu Kelouton. lnstitut Pertonion Bogor. Dinu D, Dumitru lF, Neichfor MT. 2OO2.lsoloiion ond c[ orocierizotion of two chotepsin f rom muscle of corrqsius ourotus gibelio. Roum. Biolec'tol. Lelf.7(3),753-758.
Fentiono N. 2009. Peronon Enzim Proteose Jeroon lk< n Bondeng (Chonos chonos) dolom proses kemunduron mutu. [skripsi]. Bogor: De portemen Teknologi Hosil Peroiron, Fokultos Perikoncrn don llmu Kelouton, lnstitut Pe rtonion Bogor.
Gc mez-Guille'n MC, Botiso l. 1997. Seosonol chonge s ond preliminory chorocterizoton of cothepsin D-like octivity in sordine (Sordinr: pi/chordus) muscie' int. J. Food Sci. Technol., 32 255-264. Hoord NF. 2OOO. Seofood enzymes: the role of odoptc tion ond onother introspesific foctor. Dolcm: Hqord NF, Simpson BK, editor. Seofooc Enzymes : lJtilizqtion ond Influence on Posfhorvest Seofc,od Quo/itiy. New York: Morcei Dekker. lnc. hlm 531-547
Jiong ST, Her YH, Lee JJ, AND Wong JH. 1993. Iomporison of the cothepsin D f rom Mockerel (Scomber ousfro/osicus) ond Milkfish (Chonos chonos) muscle. Bioscience, Biolechnology, Biochemislry 57 (4): 57 1 -577. .|999. Method ond Profoc:/s. New Jersey: Hurnono Press lnc.
Jovois JC.
Krouse
lmmunocylochemico/
Shonisoni C, Tshidino, Tomohiso O, Yosuhoru, /oughon, Bensh S, Muromoto K, Ryno JN.2010. Iurificotion qnd portiol chorocterizot on of ostrich skeletol muscle cothepsin D ond its octivity during meot moturotion. J. Me:lScience.87(3): 196-201.
l,
,1965. The Technology of Fish tJtitizofion. Englond Kreuzer R. Ludgote House I l0 Fleet Street London ECa. Ku.nor A, lgor Y, Goloev, Bo M. Dekker lnc.
2003.
:
Fishing News (Books) Ltd,
/so/ofion ond t'urificolion Protein New York: Morcel
Loemmli UK. 1970. Cleovoge of structurol protein riuring the sssembly bocteriopho ge 14. Nofure 227(10): 680-685'
I
t_
of the heot
Prosiding Pertemuon llmioh con Seminor Nosionol MPHPI
2011
32
of
lil H, Yin L, Zhong N, Li S, Mo C. 2008.
lsolotion of cothepsin B from the muscle of silver corp (Hypophtholmichlhys molilrixl ond comporison of cothepsins B ond L octions on surimi gel softening. Food Chemistry I I 0: 3l 0-31 8.
Ono HH, Schirmeister T. '1997. Sislem Profeoses ond their inhibifors. Chem. Rev
g7(l\
"133-172
Edwonsyoh. 2OO2. Pengoruh Konsenfrosi Hidrogen Peroksrdo don lomo perendomon lerhodop Mutu lkan Kembung yong di Pindong. USU Librory : Universitos Sumotrs Utoro.
loo MB, Tqnksole ASM, Ghotgote MS, Deshponde W. I998. Moleculor ond Biotechnologicol Aspecls of Microbiol Proteoses. Microb. Mol. Biol. Revw. 62: 1092-2171
lrorto,
H don Amri, K. 2OO2. Budi Doyo lkqn Potin. Penebor Swodoyo. Jokorto. 90 hol.
lftortono MT. 1989. Enzim don bioteknologi. Bogor : Pusot Antor Universitos. Ulftoker JR. 1994. Principles of Enzymology for lhe Food Science. Second Edition. New York: Morcel Dekker, lnc.
lqro*rito M, Konogoyo muscle
of
S. 1990. Porticipotion of cothepsin L into extensive softening of the chum solmon cought during spowning migrotion. Nippon Surson Gokkoishi,
5621271-1277.
I
Prosiding Pertemuon llmioh don Seminor Nosionol MPHPI 20I
I
33i
