Forenzní a analytická toxikologie Daniel Jun a Kamil Kuča 17.4.2007
Literatura • Forenzní a klinická toxikologie, laboratorní toxikologická vyšetření – Marie Balíková, Galén, 2004 • Farmakologie a toxikologie – H. Lüllmann a kolektiv, Grada Publishing, 2002 • Laboratorní diagnostika, T. Zima, Galén, 2003
Úvod I. • základem forenzní toxikologie = toxikologie, aplikovaná pro právní účely • identifikace a kvantifikace toxické noxy a metabolitů, účelem vysvětlit příčiny poškození nebo popř. úmrtí • materiál je zkoumán z živých osob (zejména návykové látky) nebo post mortem
Úvod II. • návykové látky ve vztahu k dopravě, pracovnímu procesu apod. • výrazné soudní či administrativní dopady na jedince • požadavek na vědeckou a právní obhajitelnost, nezpochybnitelnost • -> správná volba vzorků, dostatečné množství (možnost opakované analýzy)
Úvod III. • řádné značení a protokolace vzorků, nezaměnitelnost • správné uchovávání, konzervace • zamezení nežádoucí kontaminace (nádoby pro odběr, při zpracování apod.) • minimalizace rozkladu vzorku (ztráty) • důležité u plynných vzorků
Úvod IV. • v klinické i forenzní toxikologii se uplatňují postupy STA (systematické analytické toxikologie) • řeší vyhledávání jedu a jeho metabolitů, z dílčích kroků analýzy vyplývají následné postupy • podmínkou přesná znalost osudu nox, jejich metabolitů a toxických projevů
Farmakokinetika, metabolizmus I. • absorpce z místa aplikace • distribuce v organizmu • metabolizmus, eliminace • různé způsoby podání, dle toho se liší vstřebané množství, nástup účinku a průběh hladiny látky a jejich metabolitů v těle v čase (intravenózní vs. orální podání)
Farmakokinetika, metabolizmus II. • Absorpce – dle způsobu podání – rozsah a rychlost absorpce – nejvýznamnější GIT, látky se vstřebávají dle stupně ionizace – pasivní difůze neionizované formy do krevních kapilár GIT – velmi ionizované látky (paraquat) se vstřebávají podél celého traktu
Farmakokinetika, metabolizmus III. – žaludek (pH cca 2) -> horní část tenkého střeva (pH 5-7) -> dolní část tenkého střeva (pH 7-8) ->tlusté střevo (pH 7-8) – možnost podat absorbens – biologická dostupnost – rozdíl oproti i. v. podání (%) – enterohepatální recirkulace (látky s molek. hmotností > než cca 500) – vstřebány přímo nebo jako metabolity
Farmakokinetika, metabolizmus IV. • Distribuce – distribuční objem Vd = a/c • a – množství noxy vztažené na plazmat. koncentraci • c – plazmatická konc. po dosažení distribuční rovnováhy
– ethanol, kofein – 35 l, delta 9-THC – 630 litrů – možnost odhadu podané dávky
Farmakokinetika, metabolizmus V. • Eliminace – hlavně játra a ledviny (plíce, žluč, stolice, pot, mateřské mléko apod.) – clearance – objem plazmy, očistěné od noxy za časovou jednotku, aditivní hodnota – závisí na zdrav. stavu orgánů – čím větší je Vd, tím je při dané hodnotě clearance eliminace pomalejší (např. delta 9-THC) – eliminační poločas – doba, za kterou klesne plazmatická konc. na 50 %
Farmakokinetika, metabolizmus VI. • játra – first-pass effect – presystémová eliminace, týká se GIT, působení metabolických systémů • ledviny – reabsorpce neionizovaných molekul (tubuly, kanálky), filtruje se podíl nevázaný na bílkoviny (glomeruly), závisí na pH krve
Farmakokinetika, metabolizmus VII. • možnost ovlivnit rychlost eliminace změnou pH moče • Akumulace nox – plazma, tkáně – akumulace dána počtem dávek, intervalem a rychlostní eliminační konstantou
Biotransformace • působení organizmu na cizorodé látky • změna chem. struktury • zejména lipofilní noxy podléhají rozsáhlé metabolizaci • nejde vždy o detoxikaci látky (methanol -> formaldehyd, kyselina mravenčí; parathion >paraoxon apod.)
Biotransformační reakce I. • reakce fáze I – nesyntetické – zejména oxidační (hydroxylace, O a N – dealkylace, tvorba S oxidů a N oxidů), méně redukční a hydrolytické
• reakce fáze II – syntetické – konjugační reakce s kys. glukuronovou, sírovou, glycinem, cysteinem, methylace a acetylace – maskování funkčních skupin z původní struktury nebo I. fáze (sulfhydrylové, aminové, hydroxylové, karboxylové) konjug. s endogenními substráty – obvyklé snížení toxicity
Otrava, toxické hladiny nox, jejich interakce I. • otrava – chorobný stav organizmu, vyvolaný noxou • intenzita tox. příznaků závisí na látce, dávce, způsobu podání, frekvenci a stavu organizmu • běžné látky mohou být toxické při nesprávném podání • MKN-10 schválená v Ženevě hodnotí otravy spíše než dle jedu pro statistické účely (sebevražda, drog. závislost, neúmyslná aplikace látky apod.)
Otrava, toxické hladiny nox, jejich interakce II. • jedna látka může být tedy zařazena pod více kódů • po určení příčiny otravy požadavky na zhodnocení jejího stupně • obtížné, někdy malé rozdíly mezi terapeutickou a toxickou hladinou, individuální rozdíly, nutná aproximace • u intoxikací, na rozdíl od klinických studií díky nejasným anamnestickým údajům bývá obtížné uvádět krevní hladiny nox bez důkladné analýzy každé otravy
Otrava, toxické hladiny nox, jejich interakce III. • problém korelovat krev. hladinu s účinkem – – – – – – – – –
neznámý dávkovací režim analytické nedokonalosti interakce více látek netypické reakce (alergie apod.) akumulace díky narušení org. snížení či zastavení vylučování u fatalit redistribuce látek různé, např. genetické dispozice problematika někt. látek je složitější (např. u delta 9-THC je opožděný nástup euforického účinku oproti vrcholu plazm.hladiny)
Obecné přístupy k terapii I. • informace o jedech podá Toxikologické informační středisko Všeobecné fakultní nemocnice v Praze 2 (stálá informační služba, aktualizované údaje) • Snížení absorpce jedu – laváž žaludku, zvracení, podání nespecifického antidota (aktivní uhlí) a zvýšení jeho pasáže(laxativa) – specifická antidota – kyseliny a zásady apod.
Obecné přístupy k terapii II. • Zrychlení eliminace jedu – forsírovaná diuréza – zvýš. eliminace jed, podají se diuretika (furosemid, roztok manitolu), doplňují se minerály infuzí – kyselého pH moče se dosáhne podáním chloridu amonného, zásaditého (alkalického) podáním laktátu nebo citrátu sodného
• Hemoeliminační metody – hemodialýza (difůze, ultrafiltrace), hemoperfůze (adsorpce) – účinné hlavně je-li jed v krvi a ne kumulován v tkáních – u závažných otrav, možné komplikace
Obecné přístupy k terapii III. • Symptomatická podpůrná léčba – kontrola tzv.vitálních funkcí (oběh, dýchání, teplota, neurologické funkce)
• Detoxikace absorbovaných jedů podáním antidot – těžké kovy – vazba na –SH skupiny (např. kys. dimerkaptosulfonová, DMPS při otravě arzénem) – donátor –SH skupin N-acetylcystein u otrav paracetamolem – antagonisté (naloxon – opiáty; benzodiazepiny – flumazenil; organofosfáty – atropin, reaktivátory)
Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno I. • informace o vystavení organizmu noxe se získají chemicko-toxikologickým vyšetřením • volba správného biolog. vzorku • využití anamnestických údajů (typ látky, cesta vstupu, frekvence kontaktu s jedovat. látkou apod.) • podpora či vyvrácení diagnózy otravy, umožní lékaři zvolit vhodnou terapii • kvantifikace látky v krvi pomáhá stanovit závažnost otravy
Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno II. • při kontrolních vyšetřeních možnost omezit se na např. moč nebo krev • post mortem – neomezené možnosti odběru, obvykle femorální a srdeční krev, moč, vzorky jater a ledvin, plicní tkáň, mozková tk., vlasy apod. – odběry dle typu otravy a dostupnosti jednotlivých vzorků
Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno III. • analýza mekonia (novorozenecká smolka, tvoří se od 12 týdne těhotenství) – průkaz závislosti matky • analýza vlasů – možnost sledování historie u abúzu drog, chronické intoxikace apod. • u tzv. „Human Performance Toxicology“ (sledování způsobilosti osob k určité činnosti) mají význam i alternativní biol. materiály (sliny – nelze provést nežádoucí manipulace se vzorkem)
Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno VIII. • detekční okno – čas od intoxikace, po který lze sledovat dostupnými analyt. technikami výskyt sledované látky a jejich metabolitů – hodiny – sliny, pot, krev – dny – moč, stolice – týdny až měsíce – vlasy, nehty, novorozenecká smolka
Laboratorní diagnostika otrav, limity detekce, časové detekční okno IX. • forenzní důkaz vyžaduje jasnou identifikaci látky, nestačí skupina (např. opiáty, amfetaminy apod.) • analytické techniky musí umět rozlišit spolehlivě jednotlivé látky nebo jejich metabolity a zároveň umožnit i jejich kvantifikaci • často stopová množství nox • faktor stability vzorků • přítomnost látky v různých biol. vzorcích umožní často sestavit anamnézu intoxikace
Vývojové trendy v analytické toxikologii I. • aplikovaná věda, kombinace znalostí z farmakologie, chemie a fyziologie • • • • • •
1950 – TLC 1960 – GC 1970 – GC, HPLC, imunometody 1980 – GC-MS, SPE, SPME 1990 – LC-MS, GC-MS-MS apod. 2000 – GC-MS-MS, LC-MS-MS atd., on site technologie
Vývojové trendy v analytické toxikologii II. • současné analytické metody mají detekční limity až pg/ml – ng/ml • pro co nejcitlivější detekci je zapotřebí vzorek moče, kde jsou látky zakoncentrovány • výsledky analýz mohou upřesnit volbu dalších biol. vzorků k analýze • potřeba dostatečného množství vzorku pro opakování analýz
Vývojové trendy v analytické toxikologii III. • • • • •
v současné době rozvoj imunochemických metod možnost pracovat s mikrolitry vzorku jednoduché analýzy v terénu, rychlé výsledky použití zejména pro screening uplatnění při rozhodování dalšího postupu v analýze • neustálé zlepšování citlivosti a selektivity protilátek
Vývojové trendy v analytické toxikologii IV. • imunochromatografie • analýza by měla zohlednit vždy účel zjištění nox • význam anamnestických údajů • počáteční analýza neznámé škodliviny by měla začít screeningem skupin látek, na který pak navazují specifické konfirmační analýzy
Vývojové trendy v analytické toxikologii V. • • • •
nutnost sledovat nové trendy v literatuře přibývají nové látky ze skupiny léčiv problematika „design drugs“ potřeba neustálého vývoje analytických metod, variability • potřeba zkušených odborníků
Současné toxikologické analytické metody I. • Chemické testy – – – –
jednoduché testy orientační např. těžké kovy (Reinschův test) tečkovací reakce – na destičce, umožní zjištění funkčních skupin (Dragendorffovo činidlo na látky obsahující dusík apod.) – vyžaduje zručného a zkušeného odborníka – vodítko pro další postupy
Současné toxikologické analytické metody II. • Spektrofotometrie – UV/VIS – jedna z prvních metod v analytické toxikologii – dnes význam jako nedestruktivní detekční metoda v tandemovém spojení s HPLC – vhodná pro kontrolu čistoty látek a jejich roztoků (standardy apod.) – u specif. metod – stanovení karboxyhemoglobinu v krvi, kyanidů
Současné toxikologické analytické metody III. • Imunochemické metody – – – –
komerční kity standardizovány a validovány výrobcem analýzy slin, krve a moče principem jsou protilátky z různých zdrojů, které s větší či menší selektivitou vážou noxu na principu „zámku a klíče“ – selektivní (např. pro methamfetamin) nebo skupinové (amfetaminy)
Současné toxikologické analytické metody IV. • Imunochem. metody – pokračování – v toxikol. záchytu se záměrně užívají širokospektré protilátky – záchytové metody pracují na principu kompetice o omezené množství protilátky mezi analytem (drogou) ve vzorku a značeným analytem v reagentu – analyt je detekován dle své schopnosti vytěsnit nebo blokovat fixní množství značeného analytu z vazby na protilátku – značení realizováno enzymem, fluorescenční látkou nebo radioaktivním izotopem
Současné toxikologické analytické metody V. • měří se množ. vázané protilátky na značený analyt nebo zbytkové množství volného znač. analytu ve vztahu ke konc. měř. analytu ve vzorku • dle principů se dělí na – – – – –
EIA RIA ELISA CEDIA FPIA, KIMS a ostatní
Současné toxikologické analytické metody VI. • TLC – – – – –
stacionární fáze na desce různé stacionární fáze (sorbenty) extrakce vzorku, opakované nanášení vyvíjení v soustavě v uzavřené komoře detekce UV zářením nebo chemicky postřikem desky vhodnou detekční soustavou – možnost užití denzitometrie nebo jen vizuální detekce – vhodná pro vzorky, kde je vyšší koncentrace látek
Současné toxikologické analytické metody VII. • HPLC (vysoceúčinná kapalinová chromatografie) – TLC v kolonovém uspořádání – různé druhy sorbentů, rozdílná zrnitost (velmi častý oktadecylsilan) – normální či reverzní fáze – isokratická nebo gradientová eluce mobilní fází – detekce UV/VIS spektrofotometrem nebo fluorescenčním detektorem (vyšší citlivost) – v poslední době systémy HPLC-MS a HPLC-MS-MS
Současné toxikologické analytické metody VIII. • Plynová chromatografie (GC) – stacionární fáze adsorbent nebo kapalina chem. vázaná na vnitř. stěnu kapilární kolony – nejběž. kapalnou fází jsou polydimethylsilikony modifikované polárními skupinami přítomnými v postranním řetězci – mobilní fáze plynná – inertní plyn (dusík, helium, vodík) – izotermální režim nebo teplotní program – různé druhy detektorů – tepelně vodivostní (TCD), plameno-ionizační (FID)
Současné toxikologické analytické metody IX. • GC - pokračování – nitrogen-phosphorus detector (NPD) – MS detektory - hmotnostní detektory, poskytnou po ionizaci látky spektra
Validace • selektivita • citlivost • otázka úpravy vzorků - stabilita
