For Use With the High Pure System

COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With the High Pure System IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 High Pure System Viral Nucleic Acid Kit

HCV HPS V2

48 teszt 48 teszt

P/N: 04861817 190 P/N: 03502295 001

FELHASZNÁLÁS MÓDJA A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System (HPS) egy in vitro nukleinsav-amplifikációs vizsgálat a hepatitis C vírus (HCV) RNS 1–6 genotípusainak mennyiségi meghatározására humán szérumban vagy plazmában. A vizsgálat a manuális minta előkészítésre High Pure System Viral Nucleic Acid Kit-et, az automatizált amplifikálásra és detektálásra COBAS® TaqMan® 48 Analizátort használ. A vizsgálat a szérum vagy plazma HCV RNS-szintek változásának mérése által a klinikai megjelenéssel és egyéb laboratóriumi markerekkel együtt az antivirális kezelést követő virológiai válasz megállapításában nyújthat segítséget. Újabb adatok szerint a szérum/plazma HCV RNS-szintek korai változásai előre jelezhetik az interferonkezelésre adott hosszútávú választ1. A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 nem való vér vagy vérkészítmények HCVfertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HCV-fertőzés jelenlétének megerősítésére. A VIZSGÁLAT ÖSSZEGZÉSE ÉS MAGYARÁZATA A hepatitis C vírus a poszttranszfúziós non-A, non-B hepatitis esetek 90–95%-áért felelőssé tehető elsőrendű kóroki ágens2-4. A HCV egyszálú, pozitív RNS-t tartalmazó vírus, amelynek genomja mintegy 3000 aminosavat kódoló megközelítően 10 000 nukleotidot tartalmaz. Mint vérrel terjedő vírus, a HCV vérrel és vérkészítményekkel átvihető. A vér HCV-szűrővizsgálatainak széles körű elfogadása jelentősen csökkentette a transzfúzióval kapcsolatos hepatitis kockázatát. A HCVfertőzés gyakorisága az intravénás kábítószer-használattal kapcsolatosan a legnagyobb, és kisebb mértékben egyéb percutan expozíciókkal kapcsolatosan4. Immunszerológiai felmérések alapján a HCV-fertőzés globális elterjedtsége Európában 1,0%, Afrikában 5,3%5. A HCV-fertőzött betegekben az anti-HCV antitestek megjelenése ezekre az ellenanyagokra specifikus immunszerológiai vizsgálatok kifejlesztéséhez vezetett. Ugyanakkor bár az anti-HCV antitestek jelenléte jelzi a korábbi HCV-fertőzést, jelen fertőzés markereként nem használható. Ráadásul a direkt kimutatás vírustenyésztéses módszerekkel szintén nem lehetséges. Az alanin-aminotranszferáz-szintek (ALT) mérése a HCV-fertőzés helyettes indikátorának tekinthető, de az nem a virémia közvetlen mérése. Az ALT-emelkedés mértéke nem korrelál közvetlenül a HCV-fertőzés szintjével. Tény, hogy ALT-emelkedést számos májgyulladás, egyebek között, de nem kizárólagosan, vírusos hepatitis okozhat. Ezzel szemben a HCV RNS polimeráz-láncreakcióval [Polymerase Chain Reaction (PCR)] történő nukleinsav-amplifikációs kimutatása és mennyiségi meghatározása lehetővé teszi az aktív virémia mérését6-8. PCR használatával lehetővé válik a HCV-virémia kimutatása az immunológiai szerokonverziót megelőzően9-10, továbbá az interferonterápiában részesülő antitest-pozitív krónikus HCV-fertőzött betegek vírusmennyiség-változásainak kimutatása1. AZ ELJÁRÁS ALAPELVEI A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 három fő lépésből épül fel: (1) manuális minta-előkészítés a HCV RNS extrahálására; (2) a target RNS automatizált reverz transzkripciója, azaz komplementer DNS (cDNS) szintézise; (3) target cDNS PCR-amplifikálás specifikus komplementer primerek segítségével, és a hasított kettős fluoreszcens festékkel jelölt oligonukleotid próbák szimultán kimutatása, amely lehetővé teszi a HCV target amplifikált termék (amplikon) mennyiségi meghatározását.

1

A master mix reagens a HCV RNS-re és a HCV mennyiségi standard RNS-re egyaránt specifikus primer párokat és próbákat tartalmaz. Az amplifikált DNS kimutatása targetspecifikus és mennyiségi standard-specifikus kettős-jelölt oligonukleotid próbák segítségével történik, amelyek lehetővé teszik a HCV amplikon és a HCV mennyiségi standard amplikon független azonosítását. A HCV RNS mennyiségi meghatározása során HCV mennyiségi standardot kell használni. A HCV mennyiségi standard egy nem fertőző Armored RNA konstrukció, amely a HCV RNS targethez és egy a HCV mennyiségi standard amplikon és a HCV-targetamplikon megkülönböztetését lehetővé tevő egyedi próbához kötődő régióval identikus primer kötő helyekkel bíró HCV-szekvenciákat tartalmaz. A HCV mennyiségi standard minden egyes mintához és kontrollhoz ismert kópiaszámban hozzáadásra kerül, majd a HCV targettel együtt a minta előkészítési, reverz transzkripciós, PCR-amplifikációs és kimutatási lépéseken keresztül megy. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor a vizsgálati mintákban levő HCV RNS-titert a HCV-szignálnak a HCV mennyiségi standard szignállal való összehasonlításával számolja ki minden egyes minta és kontroll esetén. A HCV mennyiségi standard kompenzálja a gátló hatásokat, és az előkészítési és amplifikációs folyamatok szabályozásával lehetővé teszi a HCV RNS pontos mennyiségi meghatározását valamennyi mintában. A targetszekvencia kiválasztása A target RNS-szekvencia kiválasztása a különböző HCV-genotípusok között a genomban maximálisan konzervált régiók azonosításán múlik11,12. Az ismert HCV-genotípusok között a HCVgenom 5'-nem átírt szakasza a legnagyobb fokban konzervált RNS-szekvencia13. A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 a HCV-genom nagyfokban konzervált 5'-nem átírt szakaszán lévő szekvenciáknak megfelelő reverz transzkripciós és PCR-amplifikációs primereket használ. Minta előkészítése A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 EDTA-s plazma- és szérummintákat dolgoz fel, és HCV RNS-t izolál egy üvegszálakhoz való nukleinsav kötődésen alapuló generikus manuális mintaelőkészítés révén. A HCV-víruspartikulumokat magas hőmérsékleten való inkubálás során roncsolják egy proteáz és egy olyan chaotrop roncsoló/kötő puffer segítségével, amely szabaddá teszi a nukleinsavakat, és megvédi a szabaddá tett HCV RNS-t a plazmában és a szérumban lévő RNázoktól. A HCV mennyiségi standard RNS molekulák ismert száma kerül a roncsolóreagenssel együtt hozzáadásra valamennyi mintához. Ezt követően izopropanol lesz a roncsoló keverékhez adva, majd egy üvegszálas szűrőbetétes oszlopon az egész lecentrifugálásra kerül. A centrifugálás során a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS az üvegszálas szűrő felületéhez kötődik. A nem kötődött anyagok, mint sók, fehérjék és egyéb sejt eredetű szennyezések a centrifugálás révén eltávolításra kerülnek. Az adszorbeált nukleinsavak vizes oldattal kerülnek mosásra és eluálásra. Az egyszer használatos eszközök 12 minta, illetve ismétlés párhuzamos feldolgozását teszik lehetővé. A HCV RNS-t és HCV mennyiségi standard RNS-t tartalmazó feldolgozott minták az amplifikálási/detektálási keverékhez kerülnek hozzáadásra. A HCV target RNS és a HCV mennyiségi standard RNS amplifikálását és detektálását azután a COBAS® TaqMan® 48 Analizátor végzi el a teszt készletben biztosított amplifikálási és kimutatási reagensek segítségével. Reverz transzkripció és PCR-amplifikálás Reverz transzkripció A reverz transzkripciót, a PCR-amplifikálási és a kimutatási reakciókat a hőstabil rekombináns enzim, Thermus species Z05 DNS-polimeráz (Z05) segítségével végzik. Mangán (Mn2+) jelenlétében, valamint megfelelő pufferviszonyok között a Z05 mind reverz transzkriptáz-, mind DNS-polimerázaktivitást mutat14,15. Ez lehetővé teszi a reverz transzkripció, a PCR-amplifikálás és a kimutatás megtörténését ugyanazon reakcióelegyben. A feldolgozott mintákat amplifikációs csövekben (K-csövek) lévő amplifikáló keverékhez adják, ahol tehát mind a reverz transzkripció, mind a PCR-amplifikálás megtörténik. A reakcióelegyet fel kell hevíteni, hogy lehetővé váljon egy downstream primernek a HCV target RNS-hez és a HCV mennyiségi standard RNS-hez való specifikus kapcsolódása. Mn2+ és dezoxinukleozidtrifoszfátok (dNTPs), azaz dezoxiadenozin-, dezoxiguanozin-, dezoxicitidin- és dezoxiuridintrifoszfátok feleslegének jelenlétében a Z05 polimeráz a kapcsolódott primerhez a target RNS-sel komplementer DNS szálat (cDNS) szintetizál. 2

Targetamplifikáció A HCV target RNS és a HCV mennyiségi standard RNS reverz transzkripcióját követően a reakcióelegyet az RNS:cDNS hibrid denaturálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett fel kell hevíteni. Ahogy az elegy kihűl az upstream primerek specifikusan kötődnek a cDNSszálhoz, a Z05 pedig a primerre egy második DNS-szálat szintetizál. Ezzel a PCR első ciklusa véget ért, a HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS targetrégiójának egy kettős szálú DNS-másolatát létrehozva. A kettős szálú DNS szeparálása és a primer targetszekvenciák szabaddá tétele végett a reakcióelegyet újra fel kell melegíteni. Az elegy kihűlésével a primerek a target DNS-hez kapcsolódnak. A Z05 Mn2+ és feleslegben lévő dNTPs jelenlétében a primerekre a targettemplátoknak megfelelően egy kettős szálú DNS molekulát szintetizál, amelyet amplikonnak hívnak. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor automatikusan a folyamatot adott számú cikluson keresztül ismétli, hogy az amplikon DNS-mennyisége ciklusonként megduplázódjon. A szükséges számú ciklus a COBAS® TaqMan® 48 Analizátorba előre be van programozva. Az amplifikálás a HCV-genomnak csak a primerek közötti régiójában zajlik; a teljes HCV-genom nem amplifikálódik. Szelektív amplifikálás A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 a target-nukleinsav szelektív amplifikálását a mintából az AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim és dezoxiuridin-trifoszfát (dUTP) használatával éri el. Az AmpErase enzim felismeri és katalizálja az olyan DNS-szálak megsemmisítését, amelyek dezoxiuridint tartalmaznak16, a dezoxitimidint tartalmazókét viszont nem. A dezoxiuridin a természetes DNS-ben nincs jelen, ugyanakkor az amplikonban mindig megtalálható, miután a master mix reagens a dNTP-ok egyikeként dezoxiuridin-trifoszfátot használ; tehát csak az amplikon tartalmaz dezoxiuridint. A dezoxiuridinnak köszönhetően a szennyező amplikont az AmpErase enzim még a target RNS amplifikálását megelőzően lebontja. Továbbá bármilyen nem specifikus terméket, amely a master mix kezdeti mangán okozta aktiválódása után képződik, az AmpErase enzim lebont, javítva ezáltal a specificitást és az érzékenységet. A master mix reagensben lévő AmpErase enzim katalizálja a dezoxiuridint tartalmazó DNS hasítását a dezoxiuridin-csoportoknál úgy, hogy a dezoxiribóz lánc felnyílását okozza a C1 helyen. Az első hevítési lépésben az amplikon DNS-lánc eltörik a dezoxiuridin helyén, tehát a DNS nem lesz amplifikálható. Az AmpErase enzim 55 °C felett, azaz a hevítési lépések során inaktív, azaz nem bontja le az amplifikálás során képződött targetamplikont. A PCR-termékek kimutatása COBAS® TaqMan® vizsgálat során A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 valós idejű17,18 PCR-technológiát alkalmaz. A kettős-jelölt fluoreszcens próbák használata biztosítja a PCR-termék halmozódásának valós idejű detektálását az amplifikálási folyamat során felszabaduló fluoreszcens jelzőfestékek emissziós intenzitásának monitorozása révén. A HCV-re és a HCV mennyiségi standardra specifikus oligonukleotidokból álló próbák egy jelző (reporter) és egy blokkoló (quencher) festékkel jelöltek. A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 során a HCV és HCV mennyiségi standard próbák különböző fluoreszcens jelző festékkel vannak jelölve. Amikor a kettős fluoreszcens festékkel jelölt próbák érintetlenek, a jelzőfesték fluoreszcenciája Föster típusú energiatranszfer-effektus révén gátolt a blokkoló festék közelsége miatt. PCR során a próba hibridizál egy targetszekvenciával, és az 5'→3' nukleáz aktivitású hőstabil Z05 DNS polimeráz hasítja. Ha egyszer a jelző és blokkoló festékek felszabadulnak és különválnak, megszűnik a blokkolás, és a jelzőfesték fluoreszcens aktivitása megnő. A HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS amplifikációja egymástól függetlenül, különböző hullámhosszokon van mérve. Ez a folyamat adott számú cikluson keresztül ismétlődik, minden egyes ciklusban jelentősen növekedve az adott jelzőfestékek emissziós intenzitása, ezáltal lehetővé téve a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS független azonosítását. A szignálok intenzitása a PCR kezdetekor jelenlévő kiindulási anyag mennyiségével mutat összefüggést. A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 mennyiségi meghatározás alapjai A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 pontos kvantitatív eredményeket nyújt egy nagyon széles dinamikus tartományon, mivel az amplikon monitorozása az amplifikáció exponenciális fázisa során történik. Minél magasabb a minta HCV-titere, annál korábban emelkedik a HCV próba jelző festékének fluoreszcenciája az alap fluoreszcenciaszint fölé (lásd 1. ábra). Mivel a HCV mennyiségi standard (QS) RNS mennyisége állandó valamennyi mintában, a HCV QS próba 3

jelzőfestékének fluoreszcenciája valamennyi minta esetén ugyanazon ciklus során kell megjelenjen (lásd 2. ábra). Azokban az esetekben, ahol a QS amplifikálását és kimutatását gátlás vagy rossz mintavisszanyerés befolyásolja, a fluoreszcencia később jelenik meg, ezáltal lehetővé válik a HCV target RNS számított titerének megfelelő módosítása. A specifikus fluoreszcens szignál megjelenését kritikus küszöbértéknek nevezik. A kritikus küszöbérték definíció szerint az a tört alakú ciklus szám, amelynél a jelző festék fluoreszcenciája meghalad egy előre meghatározott küszöbértéket (a kijelölt fluoreszcencia szintet), és megkezdődik ezen szignál exponenciális növekedési fázisa (lásd 3. ábra). Egy magasabb kritikus küszöbérték a kiindulási HCV target RNS egy alacsonyabb titerét jelzi. Egy 2-szeres titeremelkedés a target HCV RNS kritikus küszöbértékének 1-gyel való csökkenésével korrelál, míg egy 10-szeres titeremelkedés a kritikus küszöbérték 3,3-del való csökkenésével korrelál. Az 1. ábra egy vírus hígítási sor target növekedési görbéit ábrázolja az 5-log10 tartományon. Ahogy a víruskoncentráció nő, a növekedési görbék korábbi ciklusokra tolódnak. Emiatt a legbaloldalibb növekedési görbe a legmagasabb vírustiterszinthez tartozik, a legjobboldalibb növekedési görbe pedig a legalacsonyabb vírustiterszinthez tartozik. 1. ábra

Normalizált fluoreszcencia

45,00 40,00 35,00 30,00 25,00 20,00 15,00

Legmagasabb titer

10,00 5,00

Legalacsonyabb titer

0,00 0

10

20

30

40

50

60

Ciklusszám

A 2. ábra egy vírus hígítási sorból származó minták mennyiségi standard növekedési görbéit mutatja az 5-log10 tartományon. A mintákhoz adott mennyiségi standard mennyisége állandó minden egyes reakcióban. A mennyiségi standard kritikus küszöbértéke a vírustitertől függetlenül hasonló. 2. ábra 12,00

Normalizált fluoreszcencia

Legalacsonyabb titer 10,00

8,00

A HCV titertől függetlenül hasonló HCV QS kritikus küszöbértékek

6,00

4,00

Legmagasabb titer

2,00

0,00 0

10

20

30

40

50

60

Ciklusszám

A 3. ábra egy példát mutat be arra, hogyan történik az egyes növekedési görbék az összes ciklusban mért fluoreszcens értékeinek a normalizálása. A tört alakú ciklusszámot (kritikus küszöb) úgy határozzák meg, hogy hol keresztezi a fluoreszcens szignál a kijelölt fluoreszcenciaszintet.

4

3. ábra Normalizált fluoreszcencia

2,80 2,60 2,40 2,20 2,00

Rögzített fluoreszcenciaszint

1,80

Ct-érték = 17,4

1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 8

10

12

14

16

18

20

22

Ciklusszám

A HCV RNS MENNYISÉGI MEGHATÁROZÁSA A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 a HCV vírus RNS-t mennyiségileg meghatározza egy második targetszekvencia (HCV mennyiségi standard) felhasználásával, amely minden egyes mintához ismert koncentrációban hozzá van adva. A HCV mennyiségi standard egy nem fertőző olyan HCVszekvenciadarabokat tartalmazó Armored RNA konstrukció, amelyek a HCV-targetszekvencia kötő régióival identikus primer kötő régiókat tartalmaznak. A HCV mennyiségi standard ugyancsak egy ugyanolyan hosszúságú és bázisösszetételű amplifikációs terméket szintetizál, mint a HCV target RNS. A HCV mennyiségi standard amplikon kimutatási próbakötő régióját úgy módosították, hogy a HCV mennyiségi standard amplikon különbözzön a HCV-targetamplikontól. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátorban a PCR annealing fázisa során, a mintákat szűrt fénnyel világítják meg és gerjesztik, és minden egyes minta szűrt emissziójú fluoreszcens adatait gyűjtik. A készülék ingadozásai miatt azután minden egyes minta leolvasási értékét korrigálják. Ezeket a fluoreszcens leolvasási adatokat küldi el a készülék az AMPLILINK szoftverhez, és tárolja egy adatbázisban. Előellenőrzések történnek annak meghatározására, hogy a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS adatok érvényes sorokat mutatnak-e, és az előre beállított határokon kívül fekvő adatok jelzőket kapnak. Valamennyi előellenőrzés befejezése után a készülék a fluoreszcens leolvasásokat feldolgozza, és kritikus küszöbértékeket hoz létre a HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS számára. A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 mellé biztosított tételspecifikus kalibrációs állandókat használja a készülék a minták és kontrollok titerértékeinek kiszámításához a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS kritikus küszöbértékek alapján. A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 standardizálása HCV RNS NAT vizsgálatokra szolgáló második WHO Nemzetközi standarddal (NIBSC 96/798)19 történt, és a titereredmények nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben vannak kifejezve. REAGENSEK High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001)

48 teszt

LYS (roncsoló/kötő puffer) trisz 52% guanidin HCl < 1% karbamid 20% Triton X-100 Xn 52% (w/w) guanidin HCl

2 x 25 ml

+

Ártalmas

CAR (RNS, liofilizált)

2 x 2 mg

5

PK (proteináz K, liofilizált) 99% proteináz K, liofilizált Xn 99% proteináz K, liofilizált

2 x 100 mg

+

Ártalmas

IRB (gátlóanyag-eltávolító puffer) trisz 65% guanidin HCl Xn 65% (w/w) guanidin HCl

1 x 33 ml

+

Ártalmas WASH (mosópuffer) trisz NaCl (adjon hozzá 50 ml etanolt és 30 ml ioncserélt vizet) ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System Viral Nucleic Acid állvány készlet) roncsoló állvány szűrőcsőállvány rögzített hulladék állvánnyal eluáló állvány állványfedél fogók WR (High Pure System Viral Nucleic Acid hulladék állvány)

+

COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 HCV HPS V2 (P/N: 04861817 190) Minta-előkészítő és kontroll reagensek HCV QS (COBAS® TaqMan® HCV mennyiségi standard) nátrium-foszfát puffer EDTA < 0,005% poli rA RNS (szintetikus) < 0,001% Armored RNA konstrukció, amely egy inzertet tartalmaz HCV primer kötő szekvenciákkal és egy egyedi próbához kötődő régióval (nem-fertőző RNS MS2 bakteriofágban) amarántvörös festék 0,1% Proclin® 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet).

6

1 x 20 ml

1 x 30 ml 4 darab

8 darab 48 teszt

2 x 1,0 ml

2 x 1,0 ml

+

HCV H(+)C, v2.0 [HCV magas (+) kontroll, 2.0-s verzió] < 0,001% HCV szekvenciákat tartalmazó Armored RNA konstrukció (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCRtechnikával nem kimutatható 0,1% Proclin® 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet).

2 x 1,0 ml

+

HCV L(+)C, v2.0 [HCV alacsony (+) kontroll, 2.0-s verzió] < 0,001% HCV szekvenciákat tartalmazó Armored RNA konstrukció (nem fertőző RNS MS2 bakteriofágban) Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCRtechnikával nem kimutatható 0,1% Proclin® 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). CTM (–) C [COBAS® TaqMan® negatív kontroll (humán plazma)] Negatív humán plazma, tesztekkel nem reaktív HCV antitestre, HIV-1/2 antitestre, HIV p24 antigénre és HBsAg-re; HIV-1 RNS, HCV RNS és HBV DNS PCRtechnikával nem kimutatható 0,1% Proclin® 300 konzerváló Xi A proclin az 5-klór-2-metil-2H-izotiazol-3-on és a 2-metil2H-izotiazol-3-on (3:1) arányú keveréke

4 x 1,0 ml

+

Irritatív R43: Bőrrel érintkezve túlérzékenységet okozhat (szenzibilizáló hatású lehet). Amplifikációs és kimutatási reagensek HCV MMX (COBAS® TaqMan® HCV master mix) tricin puffer kálium-hidroxid kálium-acetát < 20% dimetil-szulfoxid glicerin < 0,001% dATP, dCTP, dGTP, dUTP < 0,001% upstream és downstream primerek a HCV 5'-nem átírt régióhoz < 0,001% fluoreszcens-jelzett oligonukleotid próba specifikus HCV-re és a HCV mennyiségi standardra < 0,05% Z05 DNS-polimeráz (mikrobiális) < 0,1% AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzim (mikrobiális) 0,09% nátrium-azid 7

2 x 24 teszt 2 x 1,4 ml

CTM Mn2+ (COBAS® TaqMan® mangánoldat) < 1,2% mangán-acetát jégecet 0,09% nátrium-azid

2 x 24 teszt 2 x 1,0 ml

FIGYELMEZTETÉSEK ÉS ÓVINTÉZKEDÉSEK A. IN VITRO DIAGNOSZTIKAI CÉLRA. B. Ez a teszt nem való vér és vérkészítmények HCV-fertőzöttségének szűrésére, vagy diagnosztikus vizsgálatként HCV-fertőzés jelenlétének megerősítésére. C. A kalibrációs együtthatók értékei tételspecifikusak, valamint specifikusak a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System vizsgálatra. Ezek az értékek esetleg nem érvényesek más minta-előkészítési módszerek alkalmazása esetén. D. Csak humán EDTA-s plazmamintákhoz és humán szérumhoz alkalmazható. E. Ne pipettázzon szájjal. F. Ne egyen, igyon vagy dohányozzon a laboratórium területén. Viseljen egyszer használatos védőkesztyűt, védőruhát és szemvédőt a minták és a készlet reagensei kezelése közben. A minták és a tesztreagensek kezelését követően gondosan mosson kezet. G. A reagensflakonokból való anyagkivétel során kerülje el a reagensek mikrobiális és ribonukleáz-szennyezését. H. Steril, egyszer használatos pipetták és RNáz-mentes pipettahegyek használata javasolt. I. Ne öntsön össze különböző tételekből, vagy azonos tételből, de különböző flakonokból származó reagenseket. J. Ne keverje a különböző készletekből származó reagenseket. K. A fel nem használt reagensek, hulladék és minták kezelésének összhangban kell lennie a megfelelő országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásokkal. L. Ne használja a készletet a lejárati idő után. M. Az anyagok biztonsági adatlapjai (MSDS) igény esetén hozzáférhetők a helyi Rocheirodában. N. A mintákat és kontrollokat fertőzőként kell kezelni a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories20 és az CLSI Dokumentum M29-A321 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. Megjegyzés: A kereskedelemben kapható háztartási fehérítő rendszerint 5,25%-ban tartalmaz nátrium-hipokloritot. 1:10 arányban hígított háztartási fehérítő megfelel 0,5% nátrium-hipoklorit oldatnak. O. FIGYELMEZTETÉS: A CTM (–) C, HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 emberi vérből származó humán plazmát tartalmaz. A forrás anyag tesztekkel vizsgálva nem bizonyult reaktívnak Hepatitis B felületi antigénre (HBsAg), HIV-1/2 és HCV antitestekre, valamint HIV p24 antigénre. A negatív humán plazma PCR-technikával történő vizsgálata során HIV-1 RNS, HCV RNS vagy HBV DNS nem volt kimutatható. Egyetlen vizsgálati módszer sem nyújthat teljes garanciát arra, hogy a humán vérkészítményekben nincs jelen fertőző anyag. Emiatt minden humán eredetű anyagot potenciálisan fertőzőnek kell tekinteni. A CTM (–) C; HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 fertőzőként kezelendő a Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories20 és a CLSI Dokumentum M29-A321 előírásoknak megfelelő biztonságos laboratóriumi eljárásokat alkalmazva. Gondosan tisztítson meg, és ioncserélt vagy desztillált vízzel frissen készített 0,5% nátrium-hipoklorit oldattal fertőtlenítsen minden munkaterületet. P. A HCV MMX and CTM Mn2+ nátrium-azidot tartalmaz. A nátrium-azid ólom- és rézcsövekkel erősen robbanékony fém-azidokat képezve reakcióba léphet. Amikor nátrium-azid tartalmú oldatokat önt ki a laboratóriumi mosogatóba, az azidlerakódás megakadályozására nagy mennyiségű vízzel öblítse ki a lefolyót. 8

Q.

Viseljen szemvédőt, védőruhát és egyszer használatos védőkesztyűt bármely reagens kezelése közben. Ezen anyagok bőrrel, szemmel és nyálkahártyákkal való érintkezése kerülendő. Ha mégis előfordul érintkezés, azonnal mossa le nagy mennyiségű vízzel. Ellenkező esetben égő érzés előfordulhat. Ezen reagensek kiömlése esetén szárazra törlés előtt vízzel hígítsa.

TÁROLÁSI ÉS KEZELÉSI KÖVETELMÉNYEK Minta-előkészítő reagensek A. Tárolja a High Pure System Viral Nucleic Acid reagenseket 15–25 °C-on a megérkezést követően. B. Tárolja az eluáló puffert (ELB) és a roncsoló/kötő puffert (LYS) 15–25 °C-on. Felbontást követően tartsa az ELB és LYS puffereket 15–25 °C-on. A felnyitott ELB és LYS puffereket 28 napon belül vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, fel kell használni. C. Miután a hordozó RNS-hez és a proteináz K-hoz hozzáadta az eluáló puffert (ELB), a fel nem használt feloldott hordozó RNS-t (CAR) és a fel nem használt feloldott proteináz K-t (PK) tárolja -15 °C és -25 °C között. Feloldást követően a hordozó RNS-t és a proteináz K-t 28 napon belül vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, fel kell használni. D. Miután etanolt adott a gátlóanyag-eltávolító pufferhez, illetve etanolt és vizet adott a mosópufferhez, tárolja a gátlóanyag-eltávolító puffert (IRB) és a mosópuffert (WASH) 15–25 °C-on. Ezek a munkaoldatok 28 napig vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik, stabilak. E. A roncsoló/kötő munkaoldatot [roncsoló/kötő puffer plusz hordozó RNS, proteináz K és HCV QS] elkészítést követően azonnal fel kell használni. A maradékot ki kell dobni. Amplifikációs és kimutatási reagensek A. B.

C.

D. E.

A reagenseket és kontrollokat tilos lefagyasztani. A HCV MMX; CTM (–) C; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS és CTM Mn2+ 2–8 °C-on tárolandók. Felbontás nélkül ezek a reagensek a jelölt lejárati dátumig stabilak. Egy 12 mintát tartalmazó tételhez való mennyiség eltávolítása miatt felnyitott alábbi oldatok maradéka 2–8 °C-on tárolandó: HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS és CTM Mn2+. Felbontást követően a HCV MMX; HCV L(+)C, v2.0; HCV H(+)C, v2.0; HCV QS és CTM Mn2+ 2–8 °C-on 28 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik. Felbontást követően a fel nem használt CTM (–) C kontrollt ki kell dobni. A master mix munkareagenst CTM Mn2+-t HCV MMX-hez hozzáadva készül) 2–8 °C-on sötétben kell tárolni. Az előkészített mintákat és kontrollokat a master mix munkareagenshez annak elkészítésétől számított 1 órán belül hozzá kell adni. A feldolgozott minták és kontrollok 20–30 °C-on legfeljebb 3 óráig, 2–8 °C-on legfeljebb 24 óráig, illetve -20 °C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig stabilak. Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak a master mix munkareagenshez adásától számított 2 órán belül meg kell kezdeni.

A KÉSZLET TARTALMA Minta-előkészítő reagensek A.

High Pure System Viral Nucleic Acid Kit (P/N: 03502295 001) LYS (roncsoló/kötő puffer) CAR (hordozó RNS) PK (proteináz K) IRB (gátlóanyag-eltávolító puffer) WASH (mosópuffer)

9

ELB (eluáló puffer) RS (High Pure System Viral Nucleic Acid állvány készlet) WR (High Pure System Viral Nucleic Acid hulladék állvány) Amplifikációs és kimutatási reagensek B. COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 (P/N: 04861817 190)

HCV HPS V2

HCV QS (COBAS® TaqMan® HCV mennyiségi standard) HCV H(+)C, v2.0 [HCV magas (+) kontroll, v2.0] HCV L(+)C, v2.0 [HCV alacsony (+) kontroll, v2.0] CTM (–) C [COBAS® TaqMan® negatív kontroll (humán plazma)] HCV MMX (COBAS® TaqMan® HCV master mix) CTM Mn2+ (COBAS® TaqMan® mangánoldat) SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK Műszerezettség és szoftver • COBAS® TaqMan® 48 Analizátor • AMPLILINK szoftver • Az AMPLILINK szoftverhez készült adatállomás • COBAS® TaqMan® 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.1.0-s verziójú sorozatával való használathoz vagy COBAS® TaqMan® 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyvével való használathoz. • AMPLILINK szoftver 3.1-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve COBAS® AmpliPrep készülék, COBAS® TaqMan® készülék és COBAS® TaqMan® 48 készülék használatához vagy AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozat Alkalmazási kézikönyve COBAS® AmpliPrep készülék, COBAS® TaqMan® készülék, COBAS® TaqMan® 48 készülék és COBAS® AMPLICOR® készülék használatához. • K-cső kupakrögzítő Egyszer használatos anyagok • K-cső-doboz 12 x 96 Centrifuga követelmények • •

Sigma 4–15 °C asztali centrifuga vagy ezzel ekvivalens mikro-titer lemezcentrifuga, amely képes 4600 x g centrifugális erő biztosítására Sigma centrifuga kilendülő fejes rotor P/N: 11118 (tartalmaz 2 kosarat P/N: 13218 (és 2 lemeztartót P/N: 17978) vagy ennek megfelelő.

EGYÉB SZÜKSÉGES, DE NEM BIZTOSÍTOTT ANYAGOK • Izopropanol (> 99%) – az ACS feltételeknek megfelelő vagy jobb • Etanol (96–100%) – az ACS feltételeknek megfelelő vagy jobb • Ioncserélt víz • Állítható pipetták*: (250 µl és 1000 µl) aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos RNázmentes hegyek • Pipetta segédeszköz: Drummond (P/N: 4-000-100) vagy ennek megfelelő 10

• • • •

Vízfürdő 50 °C (± 2 °C)-os Szárazfűtőblokk 70 °C (± 2 °C)-os Steril eldobható szerológiai pipetták: 5, 10 és 25 ml Steril polipropilén kúpos csövek; 15 ml és 50 ml: Corning (P/N: 430052 és P/N: 430290) vagy ennek megfelelő • Steril 2,0 ml mikrocentrifuga csövek: Sarstedt (P/N: 72.693.005) vagy ennek megfelelő • Vortex keverő • Cső állványok • Egyszer használatos kesztyűk, púdermentes • Kalibrált hőmérők vízfürdőhöz és száraz fűtőblokkhoz * A pipetták pontossága a névleges térfogat 3%-án belül legyen. Aeroszolbarrieres vagy pozitív kiszorításos RNáz-mentes pipettahegyeket kell használni ott, ahol alapvető megelőzni a minta és az amplikon keresztszennyeződését.

A MINTA LEVÉTELE, TRANSZPORTJA ÉS TÁROLÁSA Megjegyzés: Valamennyi mintát fertőzések átvitelére alkalmasként kell kezelni. A.

A minta levétele

A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 kizárólag szérum- vagy plazmamintákhoz való használatra alkalmas. A BD SST szérumvételező csövekbe vagy EDTA (levendulakék kupak) véralvadásgátlót tartalmazó steril csövekbe kell levenni. A vért ne hagyja 2–25 °C-on 6 óránál tovább. A gyártó utasításait követve a szérumot vagy a plazmát a levételtől számított 6 órán belül szeparálja el a teljes vérből. Vigye át a szérumot vagy a plazmát egy steril polipropilén csőben. A 4. és 5. ábra ilyen minta levételi vizsgálatokból származó adatokat mutat. A vizsgálatokat a COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, version 2.0 (v2.0) segítségével végezték.

Átlagos HCV RNS eredmények – Log10 HCV RNS (IU/ml)

4. ábra HCV stabilitása teljes vérben; SST csövek (szérum) < 1 óra 2–8C 6 óra 2–8C 24 óra 2–8C 48 óra 2–8C 72 óra 2–8C < 1 óra 20–25C 6 óra 20–25C 24 óra 20–25C 48 óra 20–25C 72 óra 20–25C Mintaszám

11

Átlagos HCV RNS eredmények – Log10 HCV RNS (IU/ml)

5. ábra HCV stabilitása teljes vérben; EDTA-s csövek (EDTA-s plazma) < 1 óra 2–8C 6 óra 2–8C 24 óra 2–8C 48 óra 2–8C 72 óra 2–8C < 1 óra 20–25C 6 óra 20–25C 24 óra 20–25C 48 óra 20–25C 72 óra 20–25C

Mintaszám

B. A minta transzportja A teljes vér, szérum vagy plazma transzportja meg kell feleljen a kóroki ágensek transzportjára vonatkozó országos, szövetségi, állami és helyi szabályozásoknak22. A teljes vér 2–25 °C-on transzportálandó, és a levételtől számított 6 órán belül fel kell dolgozni. A plazma, illetve szérum 2–8 °C-on vagy -20 – -80 °C-ra fagyasztva transzportálandó. C. A minta tárolása A szérum és az EDTA-s plazma 2–8 °C között 3 napig, vagy fagyasztva -70 °C alatt tárolható. A minták tárolása 800–900 µl részletekben 2,0 ml-es polipropilén csavarókupakos csövekben javasolt (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). A 6. és 7. ábra ilyen minta tárolási vizsgálatokból származó adatokat mutat. A vizsgálatokat a COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 segítségével végezték.

Átlagos HCV RNS eredmények – Log10 HCV RNS (IU/ml)

6. ábra HCV stabilitása szérumban < 1 óra 2–8C 72 óra 2–8C 120 óra 2–8C 168 óra 2–8C 240 óra 2–8C < 1 óra 20–25C 72 óra 20–25C 120 óra 20–25C 168 óra 20–25C 240 óra 20–25C Mintaszám

12

Átlagos HCV RNS eredmények – Log10 HCV RNS (IU/ml)

7. ábra HCV stabilitása EDTA-s plazmában < 1 óra 2–8C 72 óra 2–8C 120 óra 2–8C 168 óra 2–8C 240 óra 2–8C < 1 óra 20–25C 72 óra 20–25C 120 óra 20–25C 168 óra 20–25C 240 óra 20–25C Mintaszám

A szérum- és plazmaminták legfeljebb három alkalommal olvaszthatók és fagyaszthatók HCV RNS-veszteség nélkül. Az 1. táblázat ilyen fagyasztás-olvasztás vizsgálatok adatait mutatja, a vizsgálatokat a COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 segítségével végezték. 1. táblázat Log10 különbségek HCV koncentrációban a 0. ciklustól szérum és EDTA-s plazma esetén 5 fagyasztás és olvasztás ciklus során Mátrix

Stabilitás minta #

1 2 Szérum 3 4 5 Szérum átlag 11 12 EDTA-s 13 plazma 14 15 EDTA-s plazma átlag

Fagyasztás/olvasztás ciklus 0. ciklus 1. ciklus 2. ciklus 3. ciklus 4. ciklus 5. ciklus 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

-0,052 0,293 -0,270 0,071 0,342 0,077 -0,006 -0,329 -0,056 0,186 -0,120 -0,065

0,238 0,228 -0,023 -0,516 -0,031 -0,021 0,043 -0,375 -0,248 -0,066 -0,111 -0,151

0,179 -0,206 -0,430 -0,295 -0,344 -0,239 -0,143 -0,234 -0,371 -0,034 -0,055 -0,167

-0,670 -0,338 0,008 -0,564 -0,436 -0,400 -0,159 -0,642 -0,395 -0,241 0,250 -0,237

-0,277 0,175 -0,229 -0,670 -0,277 -0,246 -0,140 -0,265 -0,142 -0,084 -0,217 -0,170

HASZNÁLATI UTASÍTÁS Megjegyzés: A részletes üzemeltetési utasításokért, az eredmények kinyomtatásáért és a jelzők, megjegyzések és hibaüzenetek értelmezéséért forduljon a következő kézikönyvekhez: (1) a COBAS® TaqMan® 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.1.0-s verziójú sorozatával való használathoz és az AMPLILINK szoftver 3.1 verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyve a COBAS® AmpliPrep készülék, COBAS® TaqMan® készülék és COBAS® TaqMan® 48 készülék használatához vagy (2) a COBAS® TaqMan® 48 készülék Felhasználói kézikönyve az AMPLILINK szoftver 3.1.0-s verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyvével való használathoz és az AMPLILINK szoftver 3.2-es verziójú sorozatának Alkalmazási kézikönyve a COBAS® AmpliPrep készülék, COBAS® TaqMan® készülék, COBAS® TaqMan® 48 készülék és COBAS® AMPLICOR® készülék használatához.

13

Megjegyzés: Valamennyi amplifikációs és kimutatási reagensnek használat előtt szobahőmérsékleten kell állnia; legalább 30 perccel használat előtt vegye ki azokat a 2–8 °C-on történő tárolásból. Megjegyzés: A szérum és plazma mintákat 15–30 percig hagyni kell, hogy felhasználás előtt felvegyék a szobahőmérsékletet. Megjegyzés: Használjon aeroszolbarrieres pipettákat vagy pozitív kiszorításos hegyeket, ahol indokolt. A szennyeződés elkerülésének érdekében rendkívüli gondossággal járjon el. Futtatási mennyiség: Valamennyi készlet elegendő reagenst tartalmaz négy darab 12 mintás futtatáshoz, amelyek kivitelezhetőek külön-külön vagy párhuzamosan. Valamennyi legfeljebb 24 mintát és kontrollt tartalmazó futtatásnak a CTM (–) C, HCV L(+)C, v2.0 kontrollokat és a HCV H(+)C, v2.0 kontrollt tartalmaznia kell (lásd „Minőség-ellenőrzés”). Az amplifikációs és kimutatási reagensek 24 tesztre elegendő kétszer használatos palackokban vannak. A reagensek leghatékonyabb felhasználása céljából a mintákat és a kontrollokat a 12 többszörösének megfelelő tételekben kell feldolgozni. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés: Fagyasztott szérum vagy plazma minták használatakor tegye a mintákat szobahőmérsékletre, amíg azok teljesen fel nem olvadnak, majd felhasználás előtt vortexelje őket 5–10 másodpercig. Megjegyzés: Felhasználás előtt hagyja a reagenseket, hogy elérjék a szobahőmérsékletet. A tisztítási reakciók megkezdése előtt fűtse fel a fűtőblokko(ka)t 70 °C (± 2 °C)-ra, és a vízfürdőt 50 °C (± 2 °C)-ra. A. Reagens előkészítése Megjegyzés: A roncsoló/kötő munkaoldatot csak azután készítse el, mikor valamennyi mintát és kontrollt 15–30 percig állni hagyta, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet. 1. Készítse el a gátlóanyag-eltávolító puffert 20 ml 96–100% etanolnak a gátlóanyag-eltávolító pufferhez (IRB) való pipettázásával. A cső 5–10-szeri fordítgatásával keverje össze az oldatokat. Ez elegendő feloldott gátlóanyag-eltávolító puffer 48 teszthez. 2.

Készítse el a mosópuffert 50 ml 96–100%-os etanolnak és 30 ml ioncserélt víznek a mosópufferhez (WASH) való pipettázásával. A cső 5–10-szeri fordítgatásával keverje össze az oldatokat. Ez elegendő feloldott mosópuffer 48 teszthez.

3.

Melegítse elő az eluáló puffert (ELB) 70 °C (± 2 °C)-on egy 2,0 ml-es csavarókupakos centrifugacsőben. Több csövet is használhat. A mintánkénti eluáló térfogat 75 µl. Melegítse elő a vizsgálatok számának az alábbi táblázatban felsorolt megfelelő térfogatot.

Reagens Eluáló puffer (ml) 4.

12 2,0

Ismétlések száma 24 4,0

Pipettázza a vizsgálatok számának az alábbi táblázatban felsorolt megfelelő térfogatú izopropanolt egy tiszta steril csőbe.

Reagens Izopropanol (ml)

12 5,0

Ismétlések száma 24 10,0

5.

Pipettázzon 0,5 ml eluáló puffert (ELB) a hordozó RNS-hez (CAR). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi hordozó RNS fel nem oldódik. A feloldott hordozó RNS 24 teszthez elegendő. A feloldott hordozó RNS fel nem használt térfogata -15 és -25 °C között legfeljebb 28 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik.

6.

Pipettázzon 5,0 ml eluáló puffert (ELB) a proteináz K-hoz (PK). Helyezze vissza a lezárót; fordítsa meg a csövet, majd vortexelje addig, amíg valamennyi proteináz K fel nem oldódik. 14

A feloldott proteináz K 24 teszthez elegendő. A feloldott proteináz K fel nem használt térfogata -15 és -25 °C között legfeljebb 28 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. 7.

Készítse el a roncsoló/kötő munkaoldatot az alábbiak szerint úgy, hogy a feldolgozandó minták és kontrollok számának megfelelően a következő táblázatban felsorolt térfogatokat pipettázza:

Reagensek Roncsoló/kötő puffer (ml) Hordozó RNS (µl) HCV QS (µl) Proteináz K (ml)

12 7,0 140 56 1,4

Ismétlések száma 24 14,0 280 112 2,8

Megjegyzés: A HCV QS térfogata meghatározott a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 vizsgálatra. Megjegyzés: Fagyasztott feloldott hordozó RNS vagy proteináz K használata esetén olvassza fel szobahőmérsékleten, és többször fordítgassa meg használat előtt. • Mérje a roncsoló/kötő puffer jelzett térfogatát egy tiszta steril 50 ml-es csőbe. • Adja a feloldott hordozó RNS jelzett térfogatát a roncsoló/kötő puffert tartalmazó csőhöz. • Vortexelje a HCV QS-t 3–5 másodpercig, és adja a HCV QS jelzett térfogatát a roncsoló/kötő puffert és feloldott hordozó RNS-t tartalmazó csőhöz. • Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10–15-szöri fordítgatással keverje össze. Vortexelni TILOS – a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. • Adja a feloldott proteináz K jelzett térfogatát a roncsoló/kötő puffert tartalmazó csőhöz. • Csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10–15-szöri fordítgatással keverje össze. Vortexelni TILOS – a vortexelés buborékképződést okoz az oldatban. A proteináz K-nak a roncsoló/kötő pufferhez való hozzáadását és elkeverését követően azonnal kezdje meg a roncsoló/kötő munkaoldat adagolását. A fel nem használt roncsoló/kötő puffer (LYS) 15–25 °C-on legfeljebb 28 napig tárolható, vagy a lejárati dátumig, amelyik előbb következik. A fel nem használt roncsoló/kötő munkaoldatot ki kell dobni. B. Minta és kontroll előkészítése Megjegyzés: Aeroszol-rezisztens hegyekkel ellátott állítható pipetták használata javasolt ehhez a művelethez. Megjegyzés: A 19. és 22. lépésekhez megfelelő méretű steril kombi-hegyekkel ellátott ismétlő pipetta használható. Mindamellett különös gondot kell fordítani a reagensek kiloccsanásának és a keresztszennyeződésnek az elkerülésére. 1. Pipettázzon 625 µl roncsoló/kötő munkaoldatot a roncsoló állvány minden egyes üregébe (I, átlátszó). Nyomja vissza a fedeleket fedő állásba. 2.

Egy alkalommal egy üreget felnyitva pipettázzon 500 µl mintát vagy kontrollt a megfelelő üregbe. Minden egyes minta vagy kontroll bemérését követően nyomja le a fedelet addig, amíg a patentes mechanizmus nem biztosítja az üreg szoros záródását.

3.

Valamennyi minta és kontroll bemérését követően mintegy 10 másodpercig történő vortexeléssel keverje meg a feltöltött roncsoló állványt. Vizuálisan ellenőrizze, hogy valamennyi üreg vortexelésre került, és jól meg lett keverve.

4.

Inkubálja a roncsoló állványt 50 °C (± 2 °C)-on 10 percig egy előfűtött vízfürdőben. Úsztassa a roncsoló állványt egy megközelítőleg 5–7 cm vízzel töltött vízfürdőben. A vízfürdőből való eltávolítását követően szárítsa meg a roncsoló állványt.

5.

Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10–20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet.

15

6.

Egy alkalommal egy üreget felnyitva pipettázzon 250 µl izopropanolt minden egyes üregbe. Minden egyes bemérést követően nyomja le a fedelet addig, amíg a patentes mechanizmus nem biztosítja az üreg szoros záródását.

Megjegyzés: Az izopropanol térfogata meghatározott a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 vizsgálatra. 7. Keverje össze a mintákat az állvány háromszori fordítgatásával, majd vortexelje az állványt mintegy 10 másodpercig. Vizuálisan ellenőrizze, hogy valamennyi üreg vortexelésre került, és jól meg lett keverve. 8.

Centrifugálja a roncsoló állványt a mikro-titer lemezcentrifugában 10–20 másodpercig 4600 x g-re beállított. A centrifuga esetleg nem éri el a beállított sebességet.

9.

Egy alkalommal egy üreget felnyitva vigyen át 750 µl minta vagy kontroll elegyet a rögzített hulladék állvánnyal (fehér) ellátott szűrőcsőállvány (II, sárga) megfelelő üregeibe. Az egyes minta vagy kontroll elegy bemérését követően nyomja le a fedelet addig, amíg a patentes mechanizmus nem biztosítja az üreg szoros záródását.

10.

Valamennyi minta és kontroll bemérését követően centrifugálja a szűrőcsőállványszerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában.

11.

Egy alkalommal egy üreget felnyitva vigye át a maradék minta vagy kontroll elegyet a szűrőcsőállvány megfelelő üregeibe. Minden egyes minta vagy kontroll elegy bemérését követően szorosan zárja le az üreg fedelét. Dobja ki megfelelő módon a roncsoló állványt.

12.

Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában.

13.

A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra.

14.

Nyissa fel a szűrőcsőállvány valamennyi fedelét a fogók segítségével, és pipettázzon be 400 µl gátlóanyag-eltávolító puffert (IRB) minden egyes üreg oldala mentén. Ne érintse meg az üregek oldalát. Miután hozzáadta a gátlóanyag-eltávolító puffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket.

15.

Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában.

16.

Nyissa fel valamennyi fedelet a fogók segítségével, és pipettázzon be 700 µl mosópuffert (WASH) minden egyes üreg oldala mentén. Ne érintse meg az üregek oldalát. Miután hozzáadta a mosópuffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket.

17.

Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 2 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában.

18.

A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Dobja ki a hulladék állványt. Cserélje ki egy új hulladék állvánnyal, és pattintsa a szűrőcsőállványt a hulladék állványra.

19.

Nyissa fel valamennyi fedelet a fogók segítségével, és pipettázzon be 700 µl mosópuffert minden egyes üreg oldala mentén. Ne érintse meg az üregek oldalát. Miután hozzáadta a mosópuffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket.

20.

Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában.

21.

A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt a hulladék állványról. Helyezze a szűrőcsőállványt az eluáló állványra (IIIA, kék), és pattintsa a szűrőcsőállványt az eluáló állványra. Dobja ki megfelelő módon a hulladék állványt.

22.

Nyissa fel valamennyi fedelet a fogók segítségével, és pipettázzon 75 µl előmelegített eluáló puffert (ELB) minden egyes szűrő közepére anélkül, hogy a szűrőhöz érne.

Megjegyzés: Ne az üreg oldala mentén adagolja az eluáló puffert. Miután hozzáadta az eluáló puffert valamennyi üreghez, szorosan zárja le a fedeleket. Inkubálja az eluáló állványt szobahőmérsékleten az eluáló puffernek az utolsó üreghez való hozzáadását követően legalább 3 percig. 23.

Centrifugálja a szűrőcsőállvány-szerelvényt 3 percig 4600 x g-n a mikro-titer lemezcentrifugában.

24.

A szűrőcsőállvány felső oldalán lévő mindkét patentkapocs lenyomása révén távolítsa el a szűrőcsőállványt az eluáló állványról. Dobja ki megfelelő módon a szűrőcsőállványt.

16

25.

Helyezze az állvány fedelet (IIIB, kék) az eluáló állványra (IIIA, kék). Nyomja le határozottan, és pattintsa a kapcsokat az eluáló állványra. Zárja le valamennyi fedelet.

26.

A feldolgozott minták és kontrollok közvetlenül PCR-re kerülnek felhasználásra. A feldolgozott minták és kontrollok 50 µl-ét használja amplifikálásra. A minta és kontroll előkészítést követő 3 órán belül adja a feldolgozott mintákat és kontrollokat a master mix munkaoldathoz. Ha a feldolgozott minták és kontrollok nem kerülhetnek felhasználásra az előkészítésüktől számított 3 órán belül, akkor tárolhatja a feldolgozott mintákat és kontrollokat 2–8 °C-on legfeljebb 24 óra hosszat a lefedett eluáló állványban vagy -20 °C-ra fagyasztva legfeljebb 1 hétig steril 2,0 ml-es csavarókupakos csövekben (pl. Sarstedt P/N: 72.694.006). A minták és kontrollok master mix munkaoldathoz adását követő 2 órán belül amplifikálja a mintákat és kontrollokat.

Reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás Megjegyzés: A K-hordozókat és a K-hordozó tartót 70%-os izopropanol oldattal nedvesített, szálmentes ruhával kell megtörölni. C. Reagens előkészítése Megjegyzés: A COBAS® TaqMan® HCV master mix (HCV MMX), a „Master Mix munkareagens” (MMX munkareagens) és az MMX munkareagens plusz feldolgozott minták és kontrollok fényérzékenyek. Ezek a reagensek fénytől védve tartandók. Megjegyzés: A COBAS® TaqMan® HCV master mix (HCV MMX) és a COBAS® TaqMan® mangánoldat (CTM Mn2+) oldatokat legalább 30 percig hagyni kell, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet a master mix munkareagens elkészítése előtt. Megjegyzés: Az MMX munkareagenst a minta és kontroll előkészítés befejeztével készítse el. Megjegyzés: A master mix munkareagenst az elkészítést követő 1 órán belül fel kell használni. Megjegyzés: Ha egyszer a feldolgozott mintákat és kontrollokat az MMX munkareagenshez mérte, akkor az amplifikálást 2 órán belül meg kell kezdeni. 1.

Hagyjon egy fiola HCV MMX és egy fiola CTM Mn2+ oldatokat legalább 30 percig, hogy felvegyék a szobahőmérsékletet.

2.

Helyezzen egy K-hordozót a K-hordozó-tartóba.

3.

Helyezzen új K-csöveket a K-hordozóba anélkül, hogy a K-csövek oldalához érne.

Megjegyzés: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 4. A K-cső kupakrögzítő segítségével távolítsa el a K-csövek kupakját. Helyezze a kupakokat a K-cső tárolóhelyén a tartóba. 5.

Készítse el az MMX munkareagenst a következők szerint: 24 teszt esetén mérjen 170 µl CTM Mn2+ oldatot egy fiola HCV MMX reagenshez. Csavarja rá a kupakot az üvegre, majd 10-szeri fordítgatással keverje jól össze. Az MMX munkareagenst ne vortexelje. Az MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 1 órán belül fel kell használni. 12 teszt esetén vegyen ki 669 µl HCV MMX reagenst és tegye egy 2 ml-es csőbe. Mérjen 81 µl CTM Mn2+ oldatot a HCV MMX reagenst tartalmazó 2 ml-es csőbe, csavarja rá a kupakot a csőre, majd 10-szeri fordítgatással keverje jól össze. Az MMX munkareagens fénytől védve tartandó, és 1 órán belül fel kell használni. A HCV MMX és CTM Mn2+ oldatok maradéka az eredeti fiolákban 2–8 °C-on tárolható. Felbontást követően a HCV MMX és CTM Mn2+ 2–8 °C-on 28 napig vagy a lejárati dátumig stabil, amelyik előbb következik.

Megjegyzés: A CTM Mn2+ térfogata meghatározott a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 vizsgálatra. 6. Pipettázzon 50 µl MMX munkareagenst mindegyik K-csőbe. 17

Megjegyzés: Fagyasztva tárolt minták és kontrollok használatakor az amplifikálást megelőzően olvassza fel a mintákat szobahőmérsékleten, majd keverje meg őket jól mielőtt a 7. lépéssel folytatná. 7. Mérjen aeroszolbarrierrel vagy pozitív kiszorításos heggyel ellátott mikropipettával minden egyes mintából és kontrollból 50 µl-t a megfelelő, MMX munkareagenst tartalmazó K-csőbe. Minden mintát és kontrollt mikropipetta segítségével háromszori fel-le pipettázással óvatosan keverjen össze anélkül, hogy buborékokat csinálna. 8.

Ismételje meg a 7. lépést minden egyes feldolgozott mintára és feldolgozott kontrollra, amíg az összeset át nem vitte a K-csövekbe. Használjon új hegyet minden egyes mintához és kontrollhoz. Szemmel ellenőrizze, hogy nincsenek-e buborékok, és szükség esetén távolítsa el azokat. A K-cső kupakrögzítő segítségével tegye fel a K-csövek kupakját. Szemmel ellenőrizze, hogy valóban a megfelelő térfogatok lettek összemérve.

9.

Az amplifikálást a mintáknak és kontrolloknak az MMX munkareagenst tartalmazó K-csövekbe való bemérésétől számított 2 órán belül meg kell kezdeni.

D. 1.

A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor betöltése és működtetése Kapcsolja be a számítógépes munkaállomást, majd jelentkezzen be a Windows XP-be a megfelelő felhasználónévvel és jelszóval.

2.

Kapcsolja be a COBAS® TaqMan® 48 Analizátort. Ellenőrizze, hogy a készülék inicializálódik-e és használatra kész-e. Ha az előző futtatás(ok)ból K-hordozók maradtak bármelyik PCR-készülékben, távolítsa el azokat a K-hordozó transzporter segítségével.

3.

Indítsa el az AMPLILINK szoftvert a számítógépen. A megfelelő felhasználóazonosítóval és jelszóval jelentkezzen be.

4.

A vizsgálandó minták számára K-hordozó megrendelések létrehozásához kattintson az Orders ikonra. Válassza ki a Sample fület, majd kattintson az New gombra és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be minden mintának a rendelésszámát. Válassza a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 vizsgálatdefinícióját. Ismételje meg ezt mindegyik minta esetén. Kattintson a Save gombra.

Megjegyzés: Ha 24 csőnél kevesebb mintát futtat, akkor ahhoz, hogy a PCR-készülékben a K-hordozó ki legyen egyensúlyozva, az 1, 2, 5, 20, 23 és 24 pozíciókban csőnek kell lennie. 5. A minőség-ellenőrzési adatok beviteléhez kattintson az Orders ablakban a Quality Control fülre. Kattintson a New gombra, és a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével vigye be a készlet mellé biztosított COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 kontroll értékkártyáról a vonatkozó adatokat. Adja meg a megfelelő mezőkbe a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 tételszámát, lejárati dátumát, az alacsony (+) és magas (+) kontroll tartományokat, valamint a tétel specifikus kalibrációs együtthatókat. Kattintson az „OK” gombra. 6.

Az Orders ablakban a K-Carrier fülre kattintva rendeljen a futtatáshoz egy K-hordozó számot. A K-Carrier ablakban kattintson a New gombra. A „K-Carrier ID” jobb oldalán lévő cellába a billentyűzet vagy vonalkód-leolvasó segítségével adja meg a K-hordozón lévő vonalkódból a K-hordozó számot. Ne feledje, hogy az ugyanezen K-hordozó azonosítóhoz rendelt korábbi futtatás eredményeit el kell fogadni. Válassza ki a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 vizsgálatdefinícióját az ablak alsó részén lévő vizsgálati panelből.

7.

A Worklist listában jelölje ki a Típus (T) oszlop első sorát. Jelölje ki ezt a mezőt, majd a megjelenő legördülő-listából válassza ki a kívánt kontrolltípust. Majd a következő sorhoz kattintson kétszer a mintaazonosító mezőre. A LookUp Control ablak megjelenik valamennyi lehetséges kontrollt feltüntetve. Amikor a kontrollt kiválasztja, a megfelelő kalibrációs és kontroll értékek megjelennek a jobb alsó információs mezőben. Ismételje meg ezt a folyamatot valamennyi szükséges kontroll esetén.

8.

Ha mintákat akar megadni a Worklist listára, kattintson kétszer az első pozícióra (sorra) a minta bevitelhez. Meg fog jelenni a hozzárendelt minta megrendeléseket tartalmazó Lookup Sample ablak. Egynél több rendelésszám kijelölését a Shift + Arrow gombokkal végezheti el. Ellenőrizze, hogy minden megrendeléshez a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 vizsgálatdefiníciója van-e hozzárendelve.

9.

A K-hordozó megrendelés kijelölés mentéséhez kattintson a Save gombra. 18

E. 1.

Reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás Válassza ki a Sytem fül Systems ikonját; a PCR-készülék kinyitásához kattintson az Open gombra. Ha a PCR-készülék teteje teljesen kinyílott, és a Systems ablakban a „Ready to Load” felirat látható, emelje meg és nyissa ki a PCR-készülék fedelét. A K-hordozó transzporter segítségével vigye át a kupakkal lezárt master mix munkareagenst és mintákat, illetve kontrollokat tartalmazó betöltött K-hordozót a PCR-készülékbe. Csukja le a készülék fedelét.

2.

Ellenőrizze, hogy a HCVHP2 vizsgálatdefiníciós fájl be van töltve a futtatáshoz. A PCRkészülék tetejének zárásához és a futtatás elindításához kattintson a Start gombra a Systems ablakban a TC ikon alatt.

3.

A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor a reverz transzkripciót, amplifikálást és kimutatást automatikusan végzi.

EREDMÉNYEK Az eredmények kiszámítása A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor automatikusan meghatározza a minta vagy a kontroll HCV RNS titerét. A HCV RNS NAT vizsgálatokra vonatkozó második WHO Nemzetközi standardnak (NIBSC 96/798)19 megfelelően a HCV RNS titer nemzetközi egység [International Unit (IU)]/ml-ben van kifejezve. A COBAS® TaqMan® 48 Analizátor: • • •

Meghatározza a HCV RNS és a HCV mennyiségi standard RNS ciklus küszöbértékét. Meghatározza a HCV RNS-titert a HCV RNS és HCV mennyiségi standard RNS küszöbértékek, valamint a tételspecifikus kalibrációs együtthatók alapján. Meghatározza, hogy a számított HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 IU/ml titerek a megadott tartományba esnek-e.

Futtatás validálása Ellenőrizze az AMPLILINK eredmény ablakban vagy a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes. A futtatás akkor érvényes, ha a COBAS® TaqMan® HCV kontrollok egyike sem kap jelzőt. A futtatás nem érvényes, ha a COBAS® TaqMan® HCV kontrollok az alábbi jelzők bármelyikét kapják: Negatív kontroll: Jelző _N_NC_INVALID

Eredmény Invalid

Magyarázat Érvénytelen eredmény vagy „érvényes” eredmény, amely nem volt negatív a HCV targetre

Eredmény < 2.50E+01 IU/mL Target Not Detected Számszerű titer, X.XXE+XX IU/mL > 3.91E+08 IU/mL Invalid

Magyarázat Kontroll a tartomány alatt Kontroll a tartomány alatt Kontroll a tartományon kívül Kontroll a tartomány felett Érvénytelen eredmény

HCV alacsony pozitív kontroll: Jelző _L_LPCINVALID

19

HCV magas pozitív kontroll: Jelző _H_HPCINVALID

Eredmény < 2.50E+01 IU/mL Target Not Detected Számszerű titer, X.XXE+XX IU/mL > 3.91E+08 IU/mL Invalid

Magyarázat Kontroll a tartomány alatt Kontroll a tartomány alatt Kontroll a tartományon kívül Kontroll a tartomány felett Érvénytelen eredmény

Ha a futtatás érvénytelen (invalid), ismételje meg a teljes futtatást (minta- és kontroll-előkészítés, reverz transzkripció, amplifikálás és kimutatás). Az eredmények értékelése: Érvényes futtatás esetén ellenőrizzen minden egyes mintát, hogy kapott-e jelzőt vagy megjegyzést az eredménylapon. Értékelje az eredményeket az alábbiak szerint: Egy érvényes futtatás mind érvényes, mind érvénytelen mintaeredményeket is tartalmazhat, attól függően, hogy a jelzők és/vagy megjegyzések az egyes mintákra vonatkoznak-e. A mintaeredmények az alábbiak szerint értékelendők: Titer eredmény Target Not Detected

< 2.50E+01 IU/mL

≥ 2.50E+01 IU/mL és ≤ 3.91E+08 IU/mL > 3.91E+08 IU/mL

Magyarázat A HCV kritikus küszöbérték meghaladja a vizsgálat korlátait, vagy nincs HCV küszöbérték. Adja ki az eredményt, mint „Nincs kimutatható HCV RNS”. A számított IU/ml a vizsgálat kimutatási határa alatt van. Adja ki az eredményeket, mint „HCV RNS kimutatható, kevesebb, mint 25 HCV RNS IU/ml”. A 25 IU/ml és 3,91E+08 IU/ml közötti számított eredmények belül esnek a vizsgálat lineáris tartományán. A számított IU/ml a vizsgálat lineáris tartománya felett van. Adja ki az eredményeket, mint „nagyobb, mint 3,91E+08 HCV RNS IU/ml”. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményeire van szükség, az eredeti mintát HCV-negatív humán plazmával vagy szérummal való hígítást követően (az eredeti minta és az ismételt vizsgálat mátrixától függően). Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral.

Megjegyzés: A vizsgálat tartomány tartománya feletti minták ugyancsak adhatnak „QS_INVALID” jelzővel ellátott érvénytelen eredményt. Amennyiben ilyen minták mennyiségi eredményeire van szükség, az eredeti mintát HCV-negatív humán plazmával vagy szérummal való hígítást követően (az eredeti minta és az ismételt vizsgálat mátrixának megfelelően). Szorozza meg a mért eredményt a hígítási faktorral. MINŐSÉG-ELLENŐRZÉS Valamennyi 24 mintából és kontrollból álló futtatásnak egy COBAS® TaqMan® negatív kontrollt, egy COBAS® TaqMan® HCV alacsony (+) kontrollt, 2.0-s verzió és egy COBAS® TaqMan® HCV magas (+) kontrollt, 2.0-s verzió kell tartalmaznia. Mint minden új laboratóriumi eljárás esetében, a vizsgálatot végző használjon további házon belüli kontrollokat minden alkalommal, amíg az eljárás kivitelezését nagyfokú megbízhatósággal nem képes elvégezni. Nincsenek követelmények a pozitív kontrolloknak a K-hordozóban való elhelyezését illetően. Ellenőrizze a kinyomtatott eredménylapon a jelzőket és megjegyzéseket, hogy meggyőződjön arról, hogy a futtatás érvényes.

20

Negatív kontroll A CTM (–) C kontrollnak „Target Not Detected” eredményt kell adnia, azaz a HCV RNS kritikus küszöbérték meghaladta a vizsgálat korlátait, vagy nincs HCV RNS küszöbérték, ugyanakkor a HCV mennyiségi standard RNS érvényes küszöbértékkel rendelkezik. Ha a CTM (–) C kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha a CTM (–) C kontroll következetesen nem érvényes, vegye fel a kapcsolatot a Roche helyi szervizével. Pozitív kontrollok A HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 kontrollokhoz tartozó kijelölt tartományok a készlettel adott COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 kontroll értékkártyán vannak feltüntetve. Ezek a tartományok bevitelre kerülnek az AMPLILINK szoftver adatállomásába. A HCV L(+)C, v2.0 és HCV H(+)C, v2.0 kontrollok HCV RNS IU/ml értékeinek a készlettel adott COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 kontroll értékkártyán feltüntetett tartományba kell esnie. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll nem felel meg ennek a feltételnek, a teljes futtatás érvénytelen. A teljes eljárást (minta és kontroll előkészítése, amplifikálás és kimutatás) meg kell ismételni. Ha egyik vagy mindkettő pozitív kontroll számított HCV RNS titere rendszeresen kívül esik a kijelölt tartományon, kérjen technikai segítséget a helyi Roche-irodától. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS ÓVINTÉZKEDÉSEK Mint minden vizsgálati eljárásnál, a helyes laboratóriumi technika alapvető a vizsgálat megfelelő kivitelezéséhez. A vizsgálat magas érzékenysége miatt rendkívüli gondossággal kell ügyelni a reagensek, illetve az amplifikálási elegyek tisztaságának megőrzésére. Minden reagens tisztaságát szorosan figyelemmel kell kísérni. Dobjon ki bármilyen gyanús reagenst. ELJÁRÁSSAL KAPCSOLATOS KORLÁTOZÁSOK 1.

A kalibrációs együtthatók értékei tételspecifikusak, valamint specifikusak a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System vizsgálatra. Ezek az értékek esetleg nem érvényesek más minta-előkészítési módszerek alkalmazása esetén.

2.

A vizsgálatot humán szérum vagy EDTA véralvadásgátlóval gyűjtött humán plazma használatára validálták. Más típusú minták vizsgálata téves, álnegatív vagy álpozitív eredménnyel járhat.

3.

Ritkán bár, de előfordulhat, hogy a vizsgálat primerei és/vagy próbái által lefedett virális genom nagyfokban konzervált régióiban lévő mutációk következtében a vírusmennyiség kevesebbnek adódik, vagy a vírus kimutatása sikertelen lesz.

4.

A HCV RNS mennyiségi kimutatása a mintában jelen lévő víruspartikulumok jelenlététől függ, ezért befolyásolhatják a mintalevételi módszerek, betegfaktorok (pl. kor, tünetek megléte) és/vagy a fertőzés stádiuma.

5.

A megbízható eredmény a megfelelő mintalevételen, -transzporton, -tároláson és -feldolgozáson múlik.

6.

A COBAS® TaqMan® HCV master mixben jelen lévő AmpErase enzim csökkenti az amplikonszennyezés kockázatát. Ugyanakkor a HCV-pozitív kontrollokból vagy klinikai mintákból származó szennyeződés csak helyes laboratóriumi gyakorlattal és ezen Használati utasításban meghatározott eljárások gondos betartásával kerülhető el.

7.

A terméket csak a PCR-technikák terén képzett személy használhatja.

8.

Ez a termék csak COBAS® TaqMan® 48 Analizátorral használható.

9.

A technológiák különbözősége miatt javasolt, hogy az egyik technológiáról a másikra való áttéréskor a felhasználók végezzenek korrelációs laboratóriumi vizsgálatokat, hogy a technológiák közötti különbség számszerűsíthető legyen.

21

ZAVARÁST OKOZÓ ANYAGOK Az albumin (max. 7000 mg/dl), össz bilirubin (max. 24,1 mg/dl), hemoglobin (max. 540 mg/dl), trigliceridek (max. 1432 mg/dl) emelkedett szintjei, valamint a szisztémás lupus erythematosusban (max. 780 IU/ml anti-dsDNS antitest) és rheumatoid arthritisben (max. 660 IU/ml RF) szenvedő betegekből származó klinikai minták EDTA-s plazmában és szérumban nem bizonyultak zavaró hatásúnak a vizsgálat HCV RNS mennyiségi meghatározása során. A következő gyógyszerkomponensek nem zavarják a vizsgálat HCV RNS mennyiségi meghatározását a megfelelő Cmax érték (plazma csúcskoncentráció) 3-szorosa mellett EDTA-s plazmában ls szérumban. Nukleotid HIV-reverz transzkriptáz inhibitor Tenofovir disoproxil fumarát HIV-fúzió inhibítor Enfuvirtid Non-nukleozid HIV-reverz transzkriptáz inhibitorok Nevirapin Efavirenz

Nukleozid reverz transzkriptáz és DNS polimeráz inhibitorok Lamivudin Zidovudin Zalcitabin

HIV-proteáz inhibitorok

Stavudin Ribavirin Abacavir-szulfát Didanosin Immunmodulátorok

Saquinavir Amprenavir Lopinavir/Ritonavir

PEG interferon alfa-2a Interferon alfa-2b Interferon alfa-2b

Paroxetin HCl Fluoxetin HCl Sertralin HCl

Indinavir-szulfát Ritonavir Nelfinavir-mezilát

Antidepresszánsok

NEM KLINIKAI ÉRTÉKELÉS A. Kimutatási határ A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System kimutatási határát a HCV másodlagos standard (Lot GTR015) és egy HCV 4 genotípusú klinikai minta HCV-negatív humán EDTA-s plazmával és HCV-negatív humán szérummal vett hígítási sorainak analízise révén határozták meg. A HCV másodlagos standardot (Lot GTR015) HCV 1a genotípusú klinikai minta segítségével készítették, amelyet a NIBSC-től származó HCV RNS NAT vizsgálatokra vonatkozó második WHO Nemzetközi standardnak (NIBSC 96/798)19 megfelelően kalibráltak. A HCV 4 genotípus koncentrációját a mintában COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 segítségével határozták meg. Három egyedi COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 és High Pure System Viral Nucleic Acid Kit tételkombináció mindegyike esetén legalább 8 független hígítási sort vizsgáltak mindegyik mátrixszal. Koncentrációnként legalább 48 ismétlést vizsgáltak mindegyik készlet tételkombinációval, összesen legalább 148 ismétlést koncentrációnként mindegyik mátrixszal (EDTA-s plazma és szérum). Ezen vizsgálatnak a 2. és 3. táblázatban feltüntetett eredményei azt mutatják, hogy Probit analízissel végzett meghatározás szerint az a HCV 1 genotípus RNS koncentráció, amelyet a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 képes 95%-os pozitivitási aránnyal kimutatni 9,3 IU/ml (95% CI 6,1 – 24,2) EDTA-s plazmában és 8,8 IU/ml (95% CI 7,5 – 11,1) szérumban. A három egyedi tétel kombinációra vonatkozó egyenkénti adatokat a 2. és 3. táblázat mutatja.

22

2. táblázat A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System kimutatási határa HCV 1 genotípus esetén EDTA-s plazmában G10020 COBAS® TaqMan® Kit tétel High Pure Kit tétel 17310600 34 IU/ml 100% 23 IU/ml 100% 17 IU/ml 100% 11 IU/ml 88,2% 5,6 IU/ml 92,2% 2,8 IU/ml 74,0% 95% pozitivitási arány 10,0 IU/ml Probit analízissel 95% konfidenciaintervallum (CI) (5,0–2107,0)

G11233

G11225

12317800 100% 100% 100% 94,0% 86,3% 76,5% 9,0 IU/ml

17390400 100% 100% 100% 94,1% 88,2% 71,0% 8,8 IU/ml

(6,7–14,6)

(6,6–14,0)

A 3 tétel kombinált adatai 100,0% 100,0% 100,0% 92,1% 88,9% 74,8% 9,3 IU/ml (6,1–24,2)

3. táblázat A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System kimutatási határa HCV 1 genotípus esetén szérumban G10020 COBAS® TaqMan® Kit tétel High Pure Kit tétel 17310600 34 IU/ml 100% 23 IU/ml 100% 17 IU/ml 98,0% 11 IU/ml 94,1% 5,6 IU/ml 82,4% 2,8 IU/ml 62,7% 95% pozitivitási arány 10,8 IU/ml Probit analízissel 95% konfidenciaintervallum (CI) (8,3–16,3)

G11233

G11225

12317800 100% 100% 100% 100% 92,2% 68,6% 6,0 IU/ml

17390400 100% 97,9% 97,9% 97,9% 89,6% 79,2% 9,0 IU/ml

(4,8–9,6)

(6,3–16,0)

A 3 tétel kombinált adatai 100,0% 99,3% 98,7% 97,3% 88,0% 70,0% 8,8 IU/ml (7,5–11,1)

A HCV 4 genotípusra vonatkozó a 4. táblázatban feltüntetett eredmények azt mutatják, hogy Probit analízissel végzett meghatározás szerint az a HCV 4 genotípus RNS koncentráció, amelyet a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 képes 95%-os pozitivitási aránnyal kimutatni 16,1 IU/ml (95% CI 12,2 – 25,1) EDTA-s plazmában és 25,4 IU/ml (95% CI 21,5 – 31,2) szérumban.

23

4. táblázat A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System kimutatási határa HCV 4 genotípus esetén EDTA-s plazmában és szérumban Minta mátrix Koncentráció 30 IU/ml 20 IU/ml 15 IU/ml 10 IU/ml 5 IU/ml 2,5 IU/ml 95% pozitivitási arány Probit analízissel 95% konfidenciaintervallum (CI)

EDTA-s plazma A 3 tétel kombinált adatai 100,0% 95,3% 96,7% 86,2% 60,0% 41,2% 16,1 IU/ml (12,2–25,1)

Szérum A 3 tétel kombinált adatai 96,6% 90,6% 88,7% 79,7% 47,3% 29,5% 25,4 IU/ml (21,5–31,2)

B. Pontosság A tétel szerinti, eszköz szerinti, vizsgáló szerinti, futtatások közötti, egy futtatáson belüli és a teljes pontosságot egy 1 genotípusú klinikai mintából származó HCV panelek segítségével értékelték mind EDTA-s plazmában, mind szérumban. Az 5. és 6. táblázat mutatja a varianciaanalízis egyes komponenseire vonatkozó CV%-ot és a teljes CV%-ot HCV 1 genotípus esetén. 5. táblázat A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 pontossága HCV 1 genotípus esetén EDTA-s plazmában Variancia komponens Tétel szerint Készülék szerint Vizsgáló szerint Futtatások közötti Egy futtatáson belüli Teljes %CV n

4,44E+06 4,8% 0,0% 18,4% 18,6% 18,8% 32,6% 48

HCV 1 genotípus koncentráció (IU/ml) 4,44E+05 4,44E+04 4,44E+03 4,44E+02 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 17,7% 20,7% 17,6% 32,5% 48

18,7% 17,1% 20,0% 32,3% 48

24

16,8% 12,7% 24,4% 32,2% 48

14,8% 23,0% 17,2% 32,3% 48

4,44E+01 15,4% 1,3% 12,7% 9,8% 28,0% 35,8% 48

6. táblázat A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 pontossága HCV 1 genotípus esetén szérumban Variancia komponens

1,17E+06 Tétel szerint 2,7% Készülék szerint 0,0% Vizsgáló szerint 12,0% Futtatások 16,5% közötti Egy futtatáson 15,2% belüli Teljes %CV 25,6% n 72

HCV 1 genotípus koncentráció (IU/ml) 1,31E+05 1,31E+04 1,31E+03 1,31E+02 6,56E+01 0,0% 12,3% 13,9% 11,1% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 0,0% 12,8% 0,0% 0,0% 6,6% 0,0% 17,5% 16,2% 16,5% 16,9% 32,9%

3,28E+01 10,4% 0,0% 9,7% 31,2%

13,9%

18,9%

12,9%

24,3%

36,5%

46,1%

25,8% 72

27,7% 72

25,1% 72

32,3% 72

49,1% 72

57,5% 72

Egy 4 genotípusú klinikai mintából származó HCV panelek segítségével HCV 4 genotípusra vonatkozó pontossági vizsgálatokat ugyancsak végeztek mind EDTA-s plazmában, mind szérumban 5,87E+01 IU/ml és 1,17E+04 IU/ml közötti HCV-titerekkel. A HCV 4 genotípusra a teljes %CV 33,3% és 35,1% közöttinek bizonyult. C. Lineáris tartomány A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 és High Pure System Viral Nucleic Acid készletek három egyedi tétel kombinációjának segítségével két 15 tagú armored HCV RNS tartalmú linearitás panelt vizsgáltak EDTA-s plazmában és szérumban. A panelek 15 tagja 7,83E+00 HCV RNS IU/ml – 7,83E+08 HCV RNS IU/ml tartományt fedett le a forrásanyagra nézve, amelynek titerét a NIBSC-től származó HCV RNS NAT vizsgálatokra vonatkozó második WHO Nemzetközi standardnak (NIBSC 96/798)19 megfelelően kalibrált HCV 1a genotípusú klinikai minta segítségével készített HCV másodlagos standarddal (Lot GTR015) való összehasonlítás révén határozták meg. Szintenként tizenkét ismétlést vizsgáltak a három tételkombináció mindegyike esetén, tehát szintenként összesen 36 ismétlést. A CLSI EP6-A irányelvet követve ± 0,2 log10 elfogadási feltétel mellett a linearitás a 2,35E+01 HCV RNS IU/ml – 3,91E+08 HCV RNS IU/ml tartományon állt fenn. Ahogy azt a 8. és 9. ábrák mutatják, az armored HCV RNS paneleket használva a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System eredmények a névértékekhez 0,3 log10-on belül pontosak voltak a 2,5E+01 HCV RNS IU/ml – 3,91E+08 HCV RNS IU/ml tartományon EDTA-s plazmában és szérumban. 8. ábra Lineáris tartomány a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System vizsgálatra EDTA-s plazmában Átlagos log megfigyelt titer (IU/ml)

10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0

y = 0,9945x - 0,0404

2,0

2

R = 0,9979

1,0 0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

Log névleges titer (IU/ml)

25

7,0

8,0

9,0

10,0

Átlagos log megfigyelt titer (IU/ml)

9. ábra Lineáris tartomány a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System vizsgálatra szérumban

D.

10,0 9,0 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0

y = 1,0001x - 0,0579

2,0

2

R = 0,9969

1,0 0,0 0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

9,0

10,0

Log névleges titer (IU/ml)

Genotípus-inkluzivitás

Mennyiségi meghatározás – Klinikai minták A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System (HCVHPSV2) és a COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 (CAHCM) segítségével hatvan 1, 2a, 2, 3, 4, 5 és 6 genotípusokat reprezentáló HCV-pozitív klinikai mintát vizsgáltak különböző mátrixokban (EDTA-s plazma és szérum) három-három párhuzamos mintaként. További HCV-genotípus mintákat készítettek úgy, hogy a fenti hatvan mintából huszonnégyet HCV-negatív EDTA-s plazmában, valamint a fenti hatvan mintából huszonkettőt HCV-negatív szérumban hígítottak tovább. Ahogy azt az alábbi 7. táblázat mutatja a HCVHPSV2 és a CAHCM log titerek közti átlagos differencia valamennyi vizsgált klinikai minta esetén az egyes genotípusokra ≤ 0,23 log volt. 7. táblázat HCVHPSV2 és CAHCM log titerek közti átlagos differencia az egyes HCV-genotípusokra HCV-genotípus 1 2a 2 3 4 5 6 Összes HCV genotípus

HCVHPSV2 - CAHCM -0,12 -0,21 -0,04 0,23 -0,07 -0,03 -0,15

n 25 7 14 22 16 9 13

-0,03

106

Mennyiségi meghatározás – NIBSC panel A NIBSC-től származó HCV-genotípus panelt (kód 02/202) a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System segítségével értékelték. Ahogy azt a 8. táblázat mutatja, mind a 6 HCV-genotípusú minta a NIBSC panelben olyan értékeket adott, amelyek a névértékhez 0,25 log-on belül voltak.

26

8. táblázat A megfigyelt és a várt log titerek közti különbség NIBSC panel esetén HCV 1–6 genotípusokra Log IU/ml Megfigyelt

HCVgenotípus

Várt

1 2 3 4 5

3,00 3,00 3,00 3,00 3,00

2,76 3,15 3,01 2,78 3,00

Megfigyelt – Várt -0,24 0,15 0,01 -0,22 0,00

6

3,00

3,15

0,15

HCV-genotípuskimutatás Valamennyi HCV-genotípus kimutatását a HCV másodlagos standardból (Lot 0002, 1a genotípus) és a rendelkezésre álló ismert HCV 2a, 2b, 3, 4, 5 és 6 genotípusokat reprezentáló klinikai mintákból származó sorozathígítások analízisével határozták meg HCV-negatív EDTA-s plazmában és szérumban. A HCV 2a, 2b, 3, 4, 5 és 6 genotípus sorozathígításokban a forrásanyag koncentrációját COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 segítségével határozták meg. A két különböző COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 készlet tételek mindegyike esetén legalább 3 független hígítási sort vizsgáltak mindegyik mátrixszal és genotípussal. Koncentrációnként legalább 12 ismétlést vizsgáltak egy-egy COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 készlet tétel segítségével, koncentrációnként tehát összesen 24 ismétlést. A 9. táblázatban feltüntetett eredmények jelzik, hogy a HCV 1–6 genotípusokat EDTA-s plazmában és szérumban mindössze 6,3 IU/ml – 19,4 IU/ml szinteknél kimutatták. 9. táblázat HCV 1–6 genotípusok kimutatása EDTA-s plazmában és szérumban HCVgenotípus 1 2a 2b 3 4 5 6

95% PROBIT kimutatás (IU/ml) EDTA-s plazma

Szérum

16,7 11,8 9,6 6,3 14,9 14,3 7,0

11,3 19,4 11,0 11,1 13,5 13,4 10,7

A megfigyelt legalacsonyabb szint legalább 95%-os Pozitivitási aránnyal EDTA-s plazma Szérum 20 20 20 10 20 10 10

20 20 10 10 20 20 10

E. Klinikai specificitás A COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System (HCVHPSV2) klinikai specificitását 50 HCV-szeronegatív EDTA-s plazma és 50 HCV-szeronegatív szérumminta analízise révén határozták meg 2 különböző COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 készlet tétel segítségével. Mind a 200 vizsgálati eredmény negatív volt HCV RNS-re. Ezen eredmények alapján a HCVHPSV2 klinikai specificitása 100%.

27

F. Analitikai specificitás Az analitikai specificitást mikroorganizmusoknak HCV-negatív humán EDTA-s plazmához és szérumhoz való hozzáadásával értékelték. A Flaviviridae család tizenkét nem-HCV tagját és huszonkét további mikroorganizmust vizsgáltak lehetséges keresztreaktivitás irányában a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System segítségével. A vizsgált nem-HCV RNS vagy DNS mikroorganizmusok egyike sem volt pozitív HCV RNS-re. A vizsgált mikroorganizmusok listáját a 10. táblázat mutatja. 10. táblázat Analitikai specificitás minták Analitikai specificitás miatt vizsgált mikroorganizmusok EDTA-s plazmában és szérumban West Nile vírus

Hepatitis G vírus

Hepatitis B vírus A és B genotípusok

St. Louis Encephalitis vírus

Staphylococcus aureus és epidermis

Humán papilloma vírus 11, 18, 6B

Dengue vírus 1, 2, 3, 4 típusok

Epstein-Barr vírus

Varicella Zoster

Sárgalázvírus

Propionibacterium acnes

Candida albicans

Zika vírus

Adenovírus humán 3-as típus

HTLV I/ II

Banzi vírus

Cytomegalovírus Davis és cytomegalovírus Towne

Influenza B

Ilheus vírus

Herpes Simplex vírus 1 típus, MacIntyre; 2 típus, G

Mycobacterium avium

Murray Valley Encephalitis vírus

Hepatitis A vírus

HIV

28

Teljesítőképesség összehasonlítása a COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 és a COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV Test vizsgálatokkal Negyvenhét HCV-pozitív EDTA-s plazma klinikai mintát és negyvenhét HCV-pozitív szérum klinikai mintát vizsgáltak önállóan a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System (HCVHPSV2) és a COBAS® AMPLICOR® HCV MONITOR Test, v2.0 (CAHCM) segítségével. Ötven HCV-pozitív EDTA-s plazma klinikai mintát és ötven HCV-pozitív szérum klinikai mintát vizsgáltak önállóan a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System (HCVHPSV2) és a COBAS® AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV Test (CAPCTM) segítségével. Valamennyi minta HCVHPSV2, CAHCM és CAPCTM vizsgálatokkal kapott HCV RNS log titer eredményeit genotípus szerint csoportosítva a 10. és 11. ábra tünteti fel: CAHCM és HCVHPSV2, valamint CAPCTM és HCVHPSV2, rendre. G.

10. ábra Korreláció a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System ® ® (HCVHPSV2) és a COBAS AMPLICOR HCV MONITOR Test, v2.0 (CAHCM) vizsgálatok között

HCVHPSV2 log titer (HCV IU/ml)

8,0 y = 0,9911 x - 0,0515 2 R = 0,9666

7,0 6,0

Gt 1, n=32

5,0

Gt 2, n=18 Gt 3, n=11

4,0

Gt 4, n=7 Gt 5, n=6

3,0

Gt 6, n=10 Gt unk, n=10

2,0 1,0 1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

7,0

8,0

CAHCM log titer (HCV IU/ml)

11. ábra Korreláció a COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 For Use With The High Pure System ® (HCVHPSV2) és a COBAS AmpliPrep/COBAS® TaqMan® HCV Test (CAPCTM) vizsgálatok között

HCVHPSV2 log titer (HCV IU/ml)

8,0 y = 0,9881 x - 0,0254 2 R = 0,9565

7,0 6,0

Gt 1, n=32

5,0

Gt 2, n=20 Gt 3, n=11

4,0

Gt 4, n=11 Gt 5, n=6

3,0

Gt 6, n=10 Gt unk, n=10

2,0 1,0 1,0

2,0

3,0

4,0

5,0

6,0

CAPCTM log titer (HCV IU/ml)

29

7,0

8,0

HIVATKOZÁSOK 1.

Orito, E., Mizokami, M., Suzuki, K. et al. 1995. Loss of serum HCV RNA at week 4 of interferon-a therapy is associated with more favorable long-term response in patients with chronic Hepatitis C. Journal of Medical Virology 46:109-115.

2.

Choo, Q.-L., Kuo, G., Weiner, A. J., Overby, L. R., Bradley, D. W. and Houghton, M. 1989. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis viral genome. Science 244:359-362.

3.

Alter, H. 1991. Descartes before the horse: I clone, therefore I am: The Hepatitis C virus in current perspective. Annals of Internal Medicine 115:644-649.

4.

Lauer, G.M. and Walker, B.D. 2001. Hepatitis C Virus Infection. New England Journal of Medicine 345:41-52.

5.

World Health Organization, Weekly Epidemiological Record, 1999. 74:421-428.

6.

Kessler, H.H., Santner, B.I., Umlauft, F. et al. 1996. Quantitation and genotyping of Hepatitis C virus RNA in sera of hemodialysis and AIDS patients. Clinical Diagnostic Virology 5:73-78.

7.

Orito, E., Mizokami, M., Nakano, T. et al. 1994. Serum hepatitis C virus RNA level as a predictor of subsequent response to interferon-a therapy in Japanese patients with chronic Hepatitis C. Journal of Medical Virology 44:410-414.

8.

Reichard, O., Yun, Z.B., Sonnerborg, A. et al. 1993. Hepatitis C viral titers in serum prior to, during, and after oral treatment with ribavirin for chronic Hepatitis C. Journal of Medical Virology 41:99-102.

9.

Puoti, M., Zonaro, A., Ravagil, A. et al. 1992. Hepatitis C virus RNA and antibody response in the clinical course of acute Hepatitis C virus infection. Hepatology 16:877-881.

10.

Young, K., Resnick, R., and Myers, T. 1993. Detection of Hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcriptase-polymerase chain reaction assay. Journal of Clinical Microbiology 31:882-886.

11.

Stuyver, L., Rossau, R., Wyseur, A. et al. 1993. Typing of hepatitis C virus isolates and characterization of new subtypes using a line probe assay. Journal of General Virology 74:1093-1102.

12.

Machida, A., Ohnuma, H., Tsuda, F. et al. 1992. Two distinct subtypes of hepatitis C virus defined by antibodies directed to the putative core protein. Hepatology 16:886-891.

13.

Bukh, J., Purcell, R. H., and Miller, R.H. 1992. Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis C virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA 89:4942-4946.

14.

Meng Q, Wong C, Rangachari A, Tamatsukuri S, Sasaki M, Fiss E, Cheng L, Ramankutty T, Clarke D, Yawata H, Sakakura Y, Hirose T, Impraim C. 2001. Automated multiplex assay system for simultaneous detection of hepatitis B virus DNA, hepatitis C virus RNA, and human immunodeficiency virus type 1 RNA. J Clin Microbiol 8:2937-45.

15.

Smith, E.S., Li, A.K., Wang, A.M., Gelfand, D.H., Myers, T.M. 2003. Amplification of RNA: High-Temperature Reverse Transcription and DNA Amplification with a MagnesiumActivated Thermostable DNA Polymerase. In PCR Primer: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Dieffenbach C.W. and Dveksler G.S., Eds. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, pp. 211-219.

16.

Longo, M.C., Berninger, M.S. and Hartley, J.L. 1990. Use of uracil DNA glycosylase to control carry-over contamination in polymerase chain reactions. Gene 93:125-128.

17.

Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P.S., and Griffith, R. 1992. Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences. Bio/Technology 10:413-417.

18.

Heid, C.A., Stevens, J., Livak, J.K., and Williams, P.M. 1996. Real time quantitative PCR. Genome Research 6:986-994.

19.

Saldanha, J., Heath, A., Aberham, C., Albrech, J., Gentili, G., Gessner, M. and Pisani, G. 2005. World Health Organization collaborative study to establish a replacement WHO international standard for hepatitis C virus RNA nucleic acid amplification technology assays. Vox Sanguinis 88:202-204.

30

20.

Richmond, J.Y. and McKinney, R.W. eds. 1999. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. HHS Publication Number (CDC) 93-8395.

21.

Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Protection of Laboratory Workers From Occupationally Acquired Infections; Approved Guideline-Third Edition. CLSI Document M29-A3 Wayne, PA:CLSI, 2005.

22.

International Air Transport Association. Dangerous Goods Regulations, 41st Edition. 2000. 704 pp.

31

High Pure System Viral Nucleic Acid Kit gyártva: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ 08876 USA A Roche csoport tagja

" Distributed by

COBAS® TaqMan® HCV Test, v2.0 gyártója: Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, NJ, 08876 USA A Roche csoport tagja

Roche Diagnostics Indianapolis, IN 46256 USA (For Technical Assistance call the Roche Response Center toll-free: 1-800 526 1247)

Roche Diagnostics H7V 4A2 Laval, Quebec (For Technical Assistance call: Pour toute assistance technique, appeler le: 1-877 273 3433)

Roche Diagnostics (Schweiz) AG CH-6343 Rotkreuz

Roche Diagnostics F-38240 Meylan

Roche Diagnostics GmbH D-68298 Mannheim, Germany

Distributore in Italia: Roche Diagnostics SpA Piazza Durante 11 I-20131 Milano

Roche Diagnostics S.L. E-08006 Barcelona

Distribuidor em Portugal: Roche Farmacêutica Química, Lda P-2700 Amadora

Roche Diagnóstica Brasil Ltda. CNPJ n° 30.280.358/0001-86 Av. Engenheiro Billings, 1729 05321-010-São Paulo-SP Serviço de atendimento ao consumidor: 0800.77 20295

A ROCHE, az AMPLICOR, az AMPERASE, az AMPLILINK, az AMPLIPREP, a COBAS, a TAQMAN és a HIGH PURE a Roche védjegye. A ROCHE RESPONSE CENTER a Roche szolgáltatási védjegye. Az Armored RNA® egy szabadalommal védett technológia, Ambion, Inc. és Cenetron Diagnostics, LLC. #5,677,124, #5,919,625, és #5,939,262 U.S. szabadalmak, valamint más folyamatban lévő szabadalmak. Az Armored RNA® az Ambion és a Cenetron bejegyzett védjegye. A Proclin® a Rohm and Haas Company védjegye. A BD SST a Becton Dickinson and Co. védjegye. A Microsoft és a Windows XP a Microsoft Corporation védjegye, illetve az Egyesült Államokban és/vagy más országokban bejegyzett védjegye. Copyright 2007, Roche Molecular Systems, Inc. Minden jog fenntartva 9/2007

(04873505001-03ENGL) 04873505044-03

Doc Rev. 3.0

32