DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS CSEH ANDRÁS ATTILA

DOKTORI (Ph.D.) ÉRTEKEZÉS

CSEH ANDRÁS ATTILA

PANNON EGYETEM GEORGIKON KAR KESZTHELY

2010

2

A PARLAGFŰ GYOMBIOLÓGIAI VALAMINT EGÉSZSÉGÜGYI SZEMPONTBÓL LEGLÉNYEGESEBB TULAJDONSÁGAINAK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATA

NÖVÉNYTERMESZTÉSI ÉS KERTÉSZETI TUDOMÁNYOK DOKTORI ISKOLA iskolavezető: Dr. Gáborjányi Richárd egyetemi tanár, az MTA doktora

témavezető: Dr. Taller János tudományos főmunkatárs

DOKTORI ÉRTEKEZÉS

Cseh András Attila Ph.D. hallgató

Keszthely 2010

3

A PARLAGFŰ GYOMBIOLÓGIAI VALAMINT EGÉSZSÉGÜGYI SZEMPONTBÓL LEGLÉNYEGESEBB TULAJDONSÁGAINAK MOLEKULÁRIS GENETIKAI VIZSGÁLATA Írta: Cseh András Attila Készült a Pannon Egyetem Növénytermesztési és Kertészeti Tudományok Doktori Iskolája keretében Témavezető: Dr. Taller János Elfogadásra javaslom (igen / nem) ………………………………….. (aláírás) A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el, Keszthely, 2010. …………………………………... a Szigorlati Bizottság elnöke Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem …………..………………………. (aláírás) Bíráló neve: …........................ …................ igen /nem …………...………………………. (aláírás) A jelölt az értekezés nyilvános vitáján ….............% - ot ért el Keszthely, ………...…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke A doktori (PhD) oklevél minősítése…................................. …………………………………… Az EDT elnöke

4

Kivonat A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) invazív gyom Európában és hatalmas egészségügyi és gazdasági károkat okoz. Magyarországon az elsőszámú gyomnövény és a pollene a legveszélyesebb allergének közé tartozik. A fentiek miatt célul tűztük ki, hogy a parlagfű származásának és terjedésének nyomonkövetésére anyai öröklésű markereket fejlesszünk, valamint a triazinokkal és az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia gyors DNS szintű kimutatását és az amb a I géncsalád pontosabb megismerését. A különböző parlagfű populációk genetikai összehasonlításához a kloroplasztisz és mitokondrium nem kódoló régióit PCR-RFLP módszerrel vizsgáltuk. Az anyai öröklésű markerek alapján, az általunk vizsgált magyarországi parlagfüvek genetikai értelemben a kanadaiakhoz álltak közelebb, az USA-ból származók pedig távolabbi csoportot alkottak. Az atrazin rezisztens és szenzitív parlagfüvek psbA génjét szekvenáltuk. Bizonyítottuk, hogy a gén egyetlen pontmutációja felelős a rezisztencia kialakulásáért, hasonlóan más gyomnövényekhez. Restrikciós enzimeket és bi-PASA primereket használva kimutattuk, hogy a rezisztens parlagfüvekben a psbA gén szenzitív változata is megtalálható. Magyarországi parlagfüvekből és a ’Nova’ napraforgó fajtából az ALS-gátló herbicidek célgénjének A és B régióját szekvenáltuk és elemeztük. Ha Magyarországon is megjelenne a rezisztens biotípus, akkor eredményeink felhasználásával a rezisztencia DNS szinten is igazolható. A parlagfű pollen allergén fehérjéjét kódoló amb a I gén első felét amplifikáltuk szekvencia

specifikus

primerekkel

magyarországi

parlagfüvekből.

Szekvencia

specifikus primerekkel nem sikerült felszaporítanunk a teljes gént, így közvetve bizonyítottuk a gén változékonyságát és azt, hogy a parlagfű genomban több helyen kódolt az Amb a I fehérje.

5

ABSTRACT

Common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) is an invasive weed in Europe, causing important economic and public health damage. Ragweed is the most widespread weed in Hungary and is recognized as the most dangerous pollen allergen. For these reasons, the aims of the present study were to reveal the origin and sperad of ragweed by developping maternally inherited markers and to detect the resistance against triazine and ALS–inhibitor herbicides at the DNA level and to expand knowledge involving the amb a I gene family. In order to compare different ragweed populations non coding regions of the chloroplast (cp) and mitochondrial (mt) DNA of common ragweed were analysed by PCR-RFLP. It was demonstrated that the analysed ragweed plants, collected from Hungarian populations, may have originated from Canada, rather than the United States. The psbA chloroplast gene of atrazine-resistant and susceptible A. artemisiifolia plants were sequenced. It was demonstrated that the atrazine resistance of ragweed is caused by a single point mutation in the gene, similarly to other weeds. Restriction enzyme analysis and bi-PASA primers detected both the atrazine-resistant and susceptible types of the psbA gene in atrazine-resistant plants. Regions A and B of the ALS gene (the target gene of ALS-inhibitor herbicides) of Hungarian ragweed plants and that of the sunflower cultivar ‘Nova’ were also sequenced in the present study. Our results make it possible to confirm the ALS resistance in the case that the resistant biotype appears in Hungary. Sequence-specific primers were used to amplify the Amb a I gene, which encodes the major allergen of the ragweed pollen with the objective to define polymorphic gene variants in the Hungarian populations. Sequence specific primers did not amplified the complete gene, so the polymorphism of the gene was prouved indirectly and also that the Amb I protein is encoded by multiple loci.

6

ABSTRACT

L ADN chloroplastique et mitochondrial de l’ambroisie á feuilles d'armoise (Ambrosia artemisiifolia L.), faisant partie des especes envahissantes et posant d'importants problemes a la santé humain, avait etait analysé par PCR-RFLP. La detection des variable regions de l’ADN chloroplastique et mitochondrial aide a charactériser les relations genetiques entre differents populations. Ces analyses ont confirmé que les plantes d’ ambroisie de la population hongroise sont plus proches de la poplulation de Canada plutot que des Etats Units. Un gene chloroplastique (psbA ) a été amplifié et sequencé ce qui a révélé que l’ atrazine tolérance de l’ambroisie est la conséquence d’ une point-mutation dans ce gene. Restriction enzymes et PASA primaires paires ont demonstré que les plants resistants a l’atrazine contient les deux formes (resitant et sensitives) de la psbA gene. L’ ALS gene (le target gene des ALS-inhibitor herbicides) de l’ambroisie hongroise et de tournesol NOVA ont été analyses dans le présent travail. La region A et B de l’ALS gene étaient sequencés pour les comparer avec les populations americains. Sequence-specifiques primaires etaient utilisés pour analyser l’Amb a I gene, qui est responsable pour le majeur allergen de l’ambroisie pour obtenir les gene-variétés dans la population hongroise.

7

Rövidítések Jegyzéke

ALS:

Acetolaktát-szintetáz

bp:

bázispár

cDNS:

complementary DNS

cpDNS:

kloroplasztisz DNS

EDTA:

Ethylen-diamine tetra-acetic acid

IPTG:

isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside

knt:

kilonukleotid

mtDNS:

mitokondrium DNS

nt:

nukleotid

PASA:

PCR Amplification of Specific Alleles

PCR:

Polymerase Chain Reaction

RAPD:

Random Amplified Polymorphic DNA

RFLP:

Restriction Fragment Length Polymorphism

SSR:

Simple Sequence Repeat

SNP:

Single Nucleotide Polymorphism

X-Gal:

5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside

8

Tartalomjegyzék 1. BEVEZETÉS ÉS CÉLKITŰZÉSEK............................................................11 1.1. Célkitűzések.........................................................................................................14 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS............................................................................15 2.1. A gyom fogalma..................................................................................................15 2.2. A parlagfű (Ambrosia altemisiifolia L.) általános jellemzése.......................15 2.2.1. Morfológia és taxonómia...................................................................................15 2.2.2. Származása és elterjedése..................................................................................17 2.2.3. Szaporodásbiológiája.........................................................................................19 2.2.4. A parlagfű kórokozói..........................................................................................21 2.5.5. A parlagfű ellen alkalmazott védekezési eljárások............................................22 2.3. A kloroplasztisz és mitokondrium genom sajátosságai..................................23 2.3.1. A kloroplasztisz-genom......................................................................................24 2.3.2. A mitokondriális genom.....................................................................................25 2.4. Molekuláris genetikai vizsgálati módszerek és molekuláris markerek........25 2.4.1. Restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (RFLP)........................................25 2.4.2. Polimeráz láncreakció (PCR).............................................................................26 2.4.3. Szekvencia specifikus primerek (SCAR).............................................................26 2.4.4. PCR-RFLP..........................................................................................................26 2.4.5. PASA (PCR amplification of specific alleles).....................................................26 2.4.6. Bi-PASA (bidirectional-PASA)...........................................................................27 2.5. A Genetikai távolság értékelése........................................................................27 2.6. A triazin-rezisztencia..........................................................................................28 2.6.1. Az 1,3,5-triazinok rövid jellemzése.....................................................................28 2.6.2. A triazin-rezisztencia mechanizmusa és öröklődése...........................................29 2.6.3. A parlagfű atrazin-rezisztens biotípusának elterjedése Magyarországon.........31 2.7. Az acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia.................................................................................................................32 2.7.1. Az ALS-gátló herbicidek rövid jellemzése..........................................................32 2.7.2. Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia mechanizmusa és öröklődése a gyomnövényekben.........................................................................................................32 2.8. A parlagfű pollenallergia és az Amb a I géncsalád.......................................34 3. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK......................................................................35 3.1. Növényanyag.......................................................................................................35 3.1.1. A filogenetikai összehasonlításra használt egyedek...........................................35 3.1.2. A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatához felhasznált növények ......................................................................................................................................35 3.1.3. Acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidek célgénjének szekvenálásánál vizsgált növények...............................................................................36 3.1.4. Az Amb a I géncsalád vizsgálatánál tesztelt növények.......................................36 3.2. Molekuláris vizsgálatok.....................................................................................36 3.2.1. DNS izolálás.......................................................................................................36 3.2.2. DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR).........................................37 3.2.2.1. A kloroplasztisz és mitokondrium genom vizsgálata.......................................38 3.2.2.2. A psbA gén felszaporítása restrikciós emésztéshez és szekvenáláshoz...........40 3.2.2.3. A psbA gén allél specifikus felszaporítása Bi-PASA (bidirectional-PCR amplification of specific alleles) primerekkel..............................................................41 9

3.2.2.4. Az ALS-A és ALS-B fragmentum amplifikálása..............................................41 3.2.2.5. Az Amb a I géncsalád vizsgálata specifikus primerekkel................................41 3.2.3. Restikciós enzimek használata...........................................................................43 3.2.3.1. A kloroplasztisz és mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP vizsgálata..............43 3.2.3.2. A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek...................43 3.2.4. DNS elválasztás gélelektoforézissel és értékelés................................................43 3.2.5. DNS fragmentumok tisztítása gélből..................................................................44 3.2.6. Klónozás és szekvenálás.....................................................................................44 3.2.7. A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése..............................................45 4. EREDMÉNYEK...................................................................................................47 4.1. A parlagfű populációgenetikai viszgálata PCR-RFLP módszerrel fejlesztett anyai öröklésű markerek segítségével .............................................................47 4.2. Herbicid célgének és rezisztenciát okozó mutációk jellemzése a parlagfűben.................................................................................................................52 4.2.1. Az atrazin-rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata...................................52 4.2.1.1. A psbA gén rezisztens és fogékony alléljának kimutatása...............................55 4.2.2. Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata........60 4.3. A parlagfű pollen fő allergénjét kódoló Amb a I géncsalád vizsgálata szekvencia specifikus primerekkel...........................................................................65 5. KÖVETKEZTETÉSEK ÉS JAVASLATOK.............................................68 5.1. Parlagfű populációk genetikai összehasonlítása............................................68 5.2. A parlagfű triazin-rezisztenciájának molekuláris genetikai háttere............70 5.3. A parlagfű ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztenciája.......................71 5.4. Az Amb a I géncsalád molekuláris genetikai vizsgálata szekvencia specifikus primerekkel...............................................................................................73 6. ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................75 7. Irodalomjegyzék...................................................................................................77 8. Új tudományos eredmények.............................................................................87 9. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..........................................................................90 10. Az értekezés témakörében megjelent publikációk, előadások...........91 11. Mellékletek............................................................................................................95

10

1.

Bevezetés és célkitűzések

Az ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) hatalmas humán egészségügyi és gazdasági károkat okoz Magyarországon. Ennek a problémának a nagyságát jelzi, hogy 2004 óta kormányzati szintre emelkedett a parlagfű elleni küzdelem. Megalakult a "Parlagfűmentes Magyarországért" Tárcaközi Bizottság, melynek célja a parlagfű elleni harc irányítása, koordinációja. A bizottság állásfoglalása szerint a parlagfű borítottság és ezzel együtt a parlagfű pollenkoncentrációjának a csökkentését csak az egész társadalom szervezett erőfeszítéseivel, anyagi, szellemi erőforrásainak, egyéni kezdeményezéseinek mozgósításával és hatékony felhasználásával lehet elérni. Az utóbbi néhány évtizedben a parlagfű szó szerint meghódította a Kárpát-medencét, és úgy tűnik inváziójának egyik égtáj irányában sem sikerül gátat vetni. E gyors terjedés legkellemetlenebb mellékhatása a pollen által kiváltott allergia, amitől már minden negyedik-ötödik honfitársunk szenved (Makra és mtsai 2004). Emellett, a parlagfű irtására vonatkozó szigorú rendelkezések ellenére, az A. artemisiifolia az utóbbi években a legelterjedtebb gyomnövényünkké vált. Növényvédelmi szempontból meghatározó kérdés a mezőgazdasági termelésben a gyomirtás. Az éves növényvédőszer felhasználás nagy részét a herbicidek teszik ki. A gyomszabályozást többek között a gyomflóra dinamikus változása és herbicidrezisztens változatok megjelenése nehezíti. Jól ismert jelenség az új fajok megjelenése, egyes gyomfajok előretörése, ökológiai illetve termesztéstechnológiai változás vagy emberi beavatkozás hatására egy adott ökoszisztémában. Ezt figyelhettük meg a parlagfű Európába, és közelebbről a Kárpát-medencébe való behurcolása esetében is, amit jól alátámasztanak az országos gyomfelvételezések adatai. Az A. artemisiifolia 1947–53 között a borítottságot tekintve 0,39 százalékkal még csak a 21. volt, de az 1996–1997. évi felvételezésen 4,7 százalékkal a fontossági sorrendben már az első helyen végzett. A legújabb 2007-2008. évi Országos Szántóföldi Gyomfelvételezés szerint 5,3 %-ra nőtt a borítása. A parlagfű európai megtelepedése, hogy egy vagy több centrumból indult ki, illetve terjedésének pontos útvonala sem ismert. Az invázió nyomonkövetése érdekes lehetne gyombiológiai és növényvédelmi szempontból egyaránt. Ezeknek a nehéz kérdéseknek a megválaszolásához nyújthatnak segítséget az egyes régiókra, biotípusokra jellemző molekuláris markerek. A parlagfű kizárólag magokkal szaporodik, ezért célravezető az

11

anyai öröklésű kloroplasztisz és mitokondrium specifikus markereket használni a terjedés nyomonkövetésére, a megbízhatóság és a nukleáris genomnál egyszerűbb vizsgálhatóság miatt. Az energia-központként funkcionáló mitokondrium és a fotoszintézis helye, a kloroplasztisz

kulcsfontosságú

sejtszervecskéi

a

növénynek.

Fontosságukat

nyomatékosítja, és sejten belüli részleges „autonómiájukat” mutatja, hogy mindkét organellum rendelkezik önálló DNS-sel, és a génjeikben bekövetkező változás a teljes növényre kihat, amire jó példa a citoplazmás hímsterilitás, vagy a triazin-rezisztencia. 1992-ben Somogy megyében találták az első triazin-rezisztens parlagfüvet, és alig kilenc év elteltével, 2001-ben már Békés megyében is megtalálható volt a rezisztens biotípus. A felvételezést végző szakemberek szerint ma már Magyarországon mindenhol előfordul a triazin-rezisztens változat. Elgondolkodtató, hogy noha a triazinrezisztencia a kloroplasztisz genomban kódolt mutáció következménye, és így anyai öröklésű - tehát pollennel nem terjed - mégis a parlagfű esetében néhány év elég volt, hogy százkilométeres távolságokra megjelenjen a triazinszármazékoknak ellenálló biotípus. Vajon mezőgazdasági munkagépekkel, járművekkel, ha akaratlanul is, de terjesztjük a rezisztens magokat, vagy pedig az ugyanazzal a szerrel történő kezelés kiváltotta szelekciós nyomással, folyamatosan indukáljuk a rezisztenciát? Valószínűleg mindkét lehetőség igaz, és annyi a közös bennük, hogy bizonyos fokú gondatlanság eredményei. A közeljövő nagy feladata, az ALS-gátló herbicidekre rezisztens parlagfű biotípus magyarországi megjelenésének a megakadályozása, ill. felkészülés a rezisztens parlagfű terjedésére, gyors monitoring rendszer kidolgozása és erre alapozott pontos gyomirtási tanácsadások készítése. Az Amerikai Egyesült Államokban 1998-ban jelent meg a rezisztens biotípus. A kutatások során feltárták a rezisztencia genetikai okát, ami az ALS génben meghatározott helyeken bekövetkező öt pontmutáció bármelyike lehet. Mivel egy sejtmagi gén mutációja felelős a rezisztenciáért, ezért a mutáns genotípus a pollennel is terjedhet, így sokkal gyorsabb és nagyobb területeket érintő invázióra kell számítani, mint a triazin rezisztencia esetében. A jelenlegi helyzetet tekintve félő, hogy az ország nagy részét kitevő mezőgazdasági művelés alatt álló területeken - mezőgazdaságunk általános állapota miatt - a parlagfű továbbra is megfelelő feltételeket fog találni magának. Ugyanakkor meg kell jegyeznünk, hogy a parlagfű terjedésének okai nemcsak mezőgazdaságunk kedvezőtlen viszonyaiban keresendők, hanem kedvező biológiai tulajdonságai és a természetes 12

ellenségeinek hiánya is segítette. Noha jelenleg Európa legfertőzöttebb területének mondható

Magyarország,

további

terjedése

várható

az

egész

kontinensen.

Lengyelországban, pl. már Varsó magasságában is megtalálták, és fertőzött Bulgária ill. Románia nagy része is. Franciaország középső és a földközi-tengeri részén, és Olaszországban is elterjedt. Az utóbbi években regisztrálták nagyarányú terjedését Ausztriában és Svájcban is. Géncentrumában, Észak Amerikában is a fertőzés erősödését tapasztalják. Környezetvédelmi szempontból nemcsak a gyomirtó szerek jelentenek problémát a parlagfű elleni védekezésben. A nem szakszerűen végzett kaszálás következtében a talajhoz közel eső rügyekből erős oldalhajtás képződés indul meg, melyek hatalmas mennyiségű pollent és magot produkálnak. Ugyanakkor a rendszeres kaszálásnak országos szinten hatalmas az üzemanyagigénye, ami jelentős légszennyező. Megoldás lehetne a fiatal növények gyökerestül történő kézi kitépése, de erre a fertőzött terület méretei miatt egyszerűen nincs, és nem is lesz kapacitás. A védekezés hatékonyságának növeléséhez és az új eljárások kidolgozásához szükség van új, más szemléletű kutatásokra. Az elmúlt pár évtizedben szemtanúi lehettünk a molekuláris genetikai vizsgálati módszerek látványos fejlődésének. Ugyanakkor jelentősége ellenére, nemcsak hazai szinten, de világviszonylatban is kevés szakirodalom található a parlagfű molekuláris genetikai vizsgálatáról. Genton és munkatársai (2005) mikroszatellit markerekkel hasonlítottak össze észak-amerikai és franciaországi parlagfű populációkat. A franciaországi populációkban nagyobb genetikai változatosságot találtak mint az amerikaiakban, mely eredményből arra következtetnek, hogy több forrásból történthetett a parlagfű inváziója. Amerikában Patzoldt és mtsai (2001) és Tranel és mtsai (2004) vizsgálták az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia molekuláris genetikai okait az A. artemisiifolia, Xanthium strumarium, Amaranthus hybridus és az Amaranthus tuberculatus gyomfajokban. Ez a kevés eredmény meglehetősen érthetetlen, hiszen orvos-biológiai vonatkozású kutatások tömege jelzi a pollenallergia okozta probléma súlyosságát, de az allergiát kiváltó növény molekuláris genetikai természetének megismerésével mégsem foglalkoznak mélyebben. A parlagfűpollen allergén fehérjéjét, már immunológusok azonosították, ezt az összetett fehérjét az amb a I géncsalád kódolja. A génnek több cDNS szekvencia váláltozata ismert. Alapkutatás szintű vizsgálatok szükségesek a gén szerkezetének jobb 13

megismeréséhez és hasznos információt jelenthetne a magyarországi génváltozatok meghatározása is.

1.1 Célkitűzések A fentiek miatt, a jelen kutatási program célja a parlagfűről molekuláris genetikai információk gyűjtése, melyek felhasználhatóak további kutatásokhoz ill. közvetlenül alkalmazhatóak

gyombiológiai

vizsgálatokhoz,

így

populáció-genetikai

összehasonlításokhoz, a triazinokkal és az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia gyors DNS szintű meghatározásához és az amb a I géncsalád pontosabb megismeréséhez.

14

2. Irodalmi áttekintés

2.1 A gyom fogalma A világ mezőgazdaságilag művelt területén átlagban 0-25%-nyi termésveszteséget okoznak a kártevő rovarok, 10-15%-nyit a gyomok és mintegy 10-15%-ra tehető az élősködő gombák, vírusok stb. okozta kár. A gyom fogalmát, már többen is meghatározták: Ujvárosi (1957) szerint gyomnak tekinthető minden olyan növény, amelyet nem vetettünk, hasznot nem hoz, és jelenléte káros leginkább azzal, hogy a vetett növény elől elfoglalja a helyet, vagy felhasználja a talaj tápanyag- és vízkészletét. Hunyadi (1988) megfogalmazása szerint gyomnak nevezzük bármelyik fejlődési stádiumban lévő olyan növényt vagy növényi részt (rizóma, tarack, hagyma, hagymagumó, stb.), amely ott fordul elő, ahol nem kívánatos. A parlagfű ezeknek a meghatározásoknak a kereteit is feszegeti, mert nem csak jelenlétével káros és nem csak a kultúrnövényektől vesz el helyet és tápanyagot, ahol előfordul ott biztosan nem kívánatos, hanem közvetlenül az emberre veszélyes allergén pollent is termel.

2.2 A parlagfű (Ambrosia altemisiifolia L.) általános jellemzése 2.2.1 Morfológia és taxonómia Az A. artemisiifolia ürömlevelű parlagfű a fészkesek (Asteraceae) családjába, a csöves virágúak (Asteroideae) alcsaládjába a parlagfű (Ambrosia) nemzetségbe tartozó egyéves T4-es életformájú gyom.

A

fajon belül három változatot különítettek el, ezek közül

Magyarországon

szinte

csak

az

A.

artemisiifolia var. elatior (L.) Descourtils változat fordul elő (Szigetvári és Benkő 2004). A csíranövény kelésekor a sziklevelek széles tojásdadok, lekerekített csúcsúak, rövid nyelűek (1. ábra). Az első lomblevelek keresztben átellenesek és szárnyasan hasogatottak, a későbbi lomblevelek pedig szórt állásúak, rövid nyelűek, kontúrjuk tojásdad, szárnyaltak, szeldeltek. A legfelső szárlevelek esetenként tagolatlanok. A levelek színe sötétzöld, vastagon, tompán szőrözött, fonákuk sötétszürke, sűrűn szőrözött (Béres és mtsai 2005).

15

A kifejlett növény közepes vagy nagy termetű, felálló, dúsan, terpedten elágazó, tompán négyélű szárú növény, rányomott és elálló szőrökkel borítva. Levelei rövid nyelűek egy-kétszeresen, szárnyasan szeldeltek. A szeletek tojásdadok, pelyhesek. Az ágak végén füzérekben helyezkednek el a sárga porzós virágok, míg a termős virágok lentebb, a füzérek alján, illetve a felső lomblevelek hónaljában ülnek. A termős fészek egyvirágú, a termőt szőrös hatfogú burok zárja körül, amely a terméssel együtt hullik le (Béres és mtsai. 2005). Termését jellemezve elmondható, hogy az egymagú fészek külső héja a fészek vackából és a murva pikkelyekből fejlődött ki, kehely alakú, a peremén 5-7 bütyökkel a pikkelyek csúcsaival (1. ábra). A kehelyre csúcsos fedő borul. Az egymagvú fészek sárgásbarna vagy szürkésbarna, érdes, fénytelen, törékeny. Ha ez a héj széttörik, szabaddá válik a kaszat, amely citrom alakú csúcsa szélesen gömbölyű, rajta rövid bibecsonk található. Ez fedi a tojás alakú faggyúszerű magot (Németh 2000).

1. ábra: Az ürömlevelű parlagfű szaporítóképletei: a – egymagvú fészek, b – kaszat. Ambrisia artemisiifolia csíranövény (c). (Abonyi Zsuzsanna rajzai)

16

2.2.2

Származása és elterjedése

Az A. artemisiifolia Észak-Amerika déli területeiről származó egyéves növény. Az Egyesült Államokból, ahol 1838-ban fedezték fel, mint gyomnövényt (Wagner és Beals 1958),

többször

is

behurcolták

Európába

heremag,

gabona

és

burgonya

szállítmányokkal. Németországban már az 1800-as évek közepe táján regisztrálták, azonban klimatikus okokból, a termése nem tudott beérni, és így nem honosodott meg (Hegi 1960). A tényleges megtelepedés és a felszaporodása az első világháború környékén indult meg Fiume és Trieszt kikötői felől fertőzött gabonaszállítmányokkal. A gyors terjedés a második világháború után kezdődött el. Az európai inváziójának két központja volt: a kisebbik Délnyugat-Franciaországban, Lyon körzetében, a nagyobbik Délnyugat-Magyarország és Horvátország határos részein (Szigetvári és Benkő 2004). A parlagfű 1923-ban már megtalálható volt Somogy megyében (Lengyel 1923), majd 1924-ben Zala és Veszprém megyékben is (Moesz 1926). Később a Duna-Tisza közén Szegedtől kiindulva terjedt északra (Tímár 1955). Ma már az ország teljes területén megtalálható (2. ábra).

2. ábra: A parlagfű hazai elterjedése megjelenésétől a hetvenes évek végéig (Béres 1981). A sötétebb színek a nagyobb borítottságot szemléltetik.

Az országos gyomfelvételezések adatai szerint az A artemisiifolia 1947 – 53 között a borítottságot tekintve 0,39 %-kal még csak a 21. volt, de az 1996–1997. évi 17

felvételezésen 4,7 %-kal a fontossági sorrendben már az első helyen végzett (Novák és mtsai 2009). A parlagfű mezőgazdasági művelés alatt álló területeken, szántóföldeken, szőlőkben, gyümölcsösökben gyakori, de előfordul legelőkön, árokparton, útszéleken, erdők szélén és különösen parlagon hagyott területeken terjed gyorsan. Gyakorlatilag mindenhol megtalálható, még a városokban is (3. ábra).

3. ábra: A parlagfű fertőzöttség mértéke és a borítási %-a Magyarországon (Parlagfű kézikönyv, 2007). Kiss és Béres (2006) szerint az ürömlevelű parlagfű tömeges felszaporodásának okai a következők lehetnek: közrejátszanak biológiai jellemzői, mint a nagyfokú alkalmazkodó képessége, a hidegtűrő képességének növekedése, jó kompetíciós képessége, talajjal szembeni igénytelensége, jó szárazságtűrése, gyors regenerálódó képessége, rezisztens biotípusának kialakulása, allelopatikus hatású anyagok képzése. Meghatározó szerepe azonban a helytelen emberi tevékenységeknek van, melyek a múltban is elősegítették elszaporodását (Kiss és Béres 2006). Ezek a hibák a következők lehettek: gyomos táblaszegélyek

növekedése, gondozatlanul hagyott területek

gyarapodása, kezdeti védekezések elmulasztása, gyommaggal fertőzött vetőmag használata, a bérmunkák során a művelő-, betakarító- és szállítóeszközökkel széthurcolás, a szakismeret hiánya, a gyomirtási technológiák helytelen megválasztása és jelentős költsége, a gabonatarlók ápolási munkáinak elhagyása, késői elvégzése és

18

rossz minőségű talajmunkák végzése (Tóth és mtsai 2001, Tóth és mtsai 2004, Szentey és mtsai 2004).

2.2.3

Szaporodásbiológiája

A parlagfű hímnős növény, a porzós virágzatok a hajtások csúcsain, míg a termős fészkek a felső lomblevelek hónaljában a porzós virágzatok alatt helyezkednek el. A porzós virágzatban 10-100 halványsárga virág van (Basset és Crompton 1975). A pollen viszonylag nagy 10-25 mikron átmérőjű. A termős fészkek rendszerint egyvirágúak, ülők, és murvapikkellyel borítottak. A szaporítóképlet háromféle módon fordulhat elő: egymagvú fészek, kaszat és mint csupasz mag (Schermann 1966), de a leggyakoribb a fészek. A dús olajtartalmú mag faggyúszerű, tojásalakú. Ezer kaszat súlya 2,0-2,3 gramm (Béres 1981). Az A. artemisiifolia csak magvakkal szaporodik. A növények kb. 95%-a monoikus, egylaki növény. Előfordulnak azonban olyan egyedek is, amelyek kizárólag termős virágokat hoznak, illetve olyanok, amelyeken vagy a termős vagy a porzós virágok vannak túlsúlyban (Gebben 1965). Hegi (1960) szerint sűrű állomány esetén csaknem kizárólag porzós, míg ritkább térállásban, jó talajon inkább termős virágokat hoz. A termős virágok nyílását a porzósak mintegy 7-10 nappal megelőzik. Elsősorban szélporozta növény, a pollenje akár több száz kilométerre is eljut (Bíró 2003). Egy gramm parlagfű pollenben 30-35 millió virágporszem van, és egyetlen növény képes akár nyolcmilliárd virágporszemet is termelni (Juhász és Juhász 2002). A virágzás legintenzívebb szakasza augusztusra esik, azonban július második felétől szeptember végéig virágzik (4. ábra).

19

4. ábra: A parlagfű életciklusa (Béres 1981). Az idegenmegporzás mellett önmegporzással is életképes magokat hoz létre. A kisebb növények átlagos magszáma néhány száz, míg a közepeseké 3000 (Béres és Hunyadi 1980), de a nagyobb növények magprodukciója a 62000-t is eléri (Dickerson és Sweet 1971). A növény zöldtömege és magprodukciója között arányosan növekvő, szoros összefüggés figyelhető meg (Dickerson 1968). A csírázási idő szintén befolyásolja a maghozamot. Külföldi adatok szerint a május közepéig kikelt növények átlagosan 32000 magot hoztak, míg a július elején kikeltek csak 3.100 darabot (Basset és Crompton 1975). A frissen érett magvak ősszel nyugalomban vannak. A nyugalmi állapot 8 hetes 4°C-on történő stratifikációval megszüntethető (Willemsen és Rice 1972). A magvak csírázását a változó hőmérséklet és a primer dormancia megszűnése után a fény is segíti (Maguire és Overland 1959, Béres és Hunyadi 1980). A magvak csírázását a gibberellines kezelés jelentősen nem fokozza (Kosikova, 1960). Toole és Brown (1946) szerint a talajban tárolt magvak 39 évig megőrizték csírázóképességüket. Béres és mtsai (2005)

arra az eredményre jutottak, hogy a magnyugalmat a

termésekben lévő vízzel ki nem mosható endogén gátló anyagok felhalmozódása okozza, melyek 6-12 hetes sztratifikáció után válnak inaktívvá. Az A. artemisiifolia termések nyugalma tehát Crocker (1916) klasszikus felosztása alapján „endogén anyagcsere akadályok” típusba sorolható.

20

2.2.4

A parlagfű kórokozói

Magyarországon eddig tíz növénykórokozó gomba jelenlétét mutatták ki az ürömlevelű parlagfüvön (Entyloma polysporum, Albugo tragopogonis, Plasmopara halstedii, Verticillium dahliae, Botrytis cinerea, Rhizoctonia solani, Macrophomina phaseolina, Septoria epambrosiae, Sclerotinia sclerotiorum, Phyllachora ambrosiae) (Kiss és mtsai 2003). Ezek közül csupán a Ph. ambrosiae és a P. halstedii okozott egyegy évben komolyabb károkat a hazai parlagfű állományban. Az 1999-es évben az ország egész területén a Ph. ambrosiae okozott járványt (Bohár és mtsai 2000, Vajna és mtsai 2000). Ebben az évben egy hónappal megrövidült a parlagfű pollenszórási időszaka (Kiss és mtsai 2001). A járvány nem ismétlődött meg, de sikerült meghatározni a Ph. ambrosiae rDNS ITS-régió nukleotid sorrendjét és fajspecifikus primereket tervezni, így lehetővé vált a kórokozó kimutatása (Varga és Kiss 2003). A Plasmopara halstedii 2001 őszén okozott járványos megbetegedést az ürömlevelű parlagfüvön (Vajna 2002). Ebben az időszakban a sokéves átlag egytizedére csökkent a levegő parlagfűpollen koncentrációja (Kiss és mtsai 2003). Kiss és mtsai (2003) szerint 6 amerikai gombafaj tűnik perspektivikusnak a biológiai védekezésre: a Puccinia xanthii, P. canaliculata, P. conoclinii, Entyloma polysporum, E. compositarum és Protomyces gravidus fajok. Ezeket a gombafajokat eddig még csak Észak-Amerikában írták le a parlagfüvön, tehát ezek a parlagfűre specializálódott rozsdagombák nem követték gazdanövényüket Európába (Kiss és mtsai 2003). P. xanthii gombafajt csak amerikai herbáriumi gyűjteményekben sikerült kimutatni a parlagfüvön, gyűjtőutakon nem találták meg, így csak az elméleti lehetősége adott a gombafaj biológiai védekezésben való használatának (Kiss 2007). A parlagfű fertőzés mérsékléséhez a biológiai védekezés is hozzájárulhatna, bár önmagában valószínűleg nem jelentene teljes megoldást (Béres és mtsai 2005). Biológiai gyomirtásra a vírusok nem használthatók, mert polifág kórokozók, de a gyomnövények vírusrezervoár szerepe nagy jelentőségű. A parlagfű növényvirológiai szempontból történő alaposabb megismerése azért is fontos, mivel igen nagy számban megtalálható az egész ország területén. Schmelzer és Wolf (1977) szerint az ürömlevelű parlagfűn előforduló vírusok a következők: dohány mozaik vírus (Tobacco mosaic), dohány gyűrűsfoltosság vírus (Tobacco ringspot), dohány csíkosság vírus (Tobacco streak) és uborka mozaik vírus (Cucumber mosaic). Ilyen irányú kutatásokat végeztek a Pannon Egyetem Georgikon Karán, Keszthelyen Takács és mtsai (2001). A parlagfű 21

vírus-ellenállóságát vizsgálták a burgonya Y-vírus (Potato Y virus) N törzsével (PVYN) és NTN (PVYNTN) törzsével, a Chenopodium mozaik vírussal (Sowbane mosaic virus), a dohány mozaik vírus OB törzsével (Tobacco mosaic virus), az uborka mozaik vírus U/246 törzsével (Cucumber mosaic virus) és legutóbb a cukkíni sárga mozaikvírussal (Zucchini yellow mosaic virus) szemben. A kísérlet során a mesterségesen inokulált növényekben a vírusok jelenlétét a fertőzést követő ötödik héten DAS-ELISA szerológiai módszerrel és visszaizolálással ellenőrizték. Megállapították, hogy az általuk vizsgált vírustörzsekkel szemben a parlagfű rezisztens, azaz a fertőzést követően a vírusokra jellemző lokális és szisztemikus tünetek nem mutatkoztak (Takács és mtsai 2001, Takács és mtsai 2002). Kazinczi (2004) vizsgálatában a szabadföldről gyűjtött tünetmentes minták 8 %-ából az uborka mozaik vírust (Cucumber mosaic virus) sikerült szerológiai úton és bioteszttel is kimutatni.

2.2.5

A parlagfű ellen alkalmazott védekezési eljárások

Béres és mtsai (2005) szerint a védekezés integrált és célirányos kell, hogy legyen. A kémiai védekezés során a szükségtelen herbiciddel történő kezelés gazdaságtalan és káros. A herbicides kezelésnek komoly gyakorlati korlátai vannak, ugyanis használatuk elsősorban mezőgazdasági művelés alatt álló területekre - és a szer hatóanyagától, típusától függően - ott is csak bizonyos kultúrákra korlátozódik. A herbicidek rendszeres egyoldalú használata következtében rezisztens gyompopulációk alakulhatnak ki, mint ahogy Magyarországon is megjelent a triazin-rezisztens parlagfű biotípus. Az ürömlevelű parlagfű a legnagyobb gyomirtási problémát a kapás kultúrákban okozza, de szinte minden kultúrában eredményesen irtható a megfelelő herbicid alkalmazásával (Béres és mtsai 2005). Béres és mtsai (2005) szerint a mechanikai védekezés leghatékonyabb módját a növény gyökerestül történő eltávolítása jelentené, de ez csak kis területen, esetleg városokban lehet hatékony. A kapálás is jól alkalmazható kisebb bolygatott területeken. A kaszálással történő védekezés legnagyobb problémája, hogy a kaszálásra a parlagfű nem pusztul ki, hanem rövid idő alatt a talajjal párhuzamosan futó új hajtásokat fejleszt. A kaszálás időpontjának helyes megválasztásával nagyban nő a hatékonysága. Egyszeri kaszálás esetén a leghatásosabb közvetlenül a virágzás előtt kaszálni, de a porzós virágok újrafejlődésének a megakadályozásához további 1-2 kaszálásra lehet még szükség (Béres és mtsai 2005). Az ürömlevelű parlagfű a bolygatott talajú, növényekkel 22

nem leárnyékolt területeken érzi jól magát, ezért fűfélék telepítése vagy mulcs réteggel történő talajtakarás is jó lehetőséget jelent a parlagfű elleni védekezésre (Béres és mtsai 2005). A mezőgazdasági művelés során a gabonatarlók és tarlóhántásban részesített területek kiváló lehetőséget kínálnak a mechanikai védekezésre. A tarlóhántás időbeni elvégzésével megakadályozzuk, hogy magot érleljen, majd a terület többszöri művelésével sok gyommag csírázását serkentjük és ezzel jelentősen csökken a talajok magkészlete (Béres és mtsai 2005). Biológiai védekezés: A behurcolt gyomokkal szemben a biológiai védekezés leghatékonyabb módja az őshazájukból származó természetes ellenségeik körültekintő alkalmazása (Kiss és mtsai 2003). Goeden és mtsai (1974) szerint az ürömlevelű parlagfüvön táplálkozó rovarok közül a Tarachidia candefacta és a Zygogramma suturalis (parlagfű levélbogár) fajok a legígéretesebbek. A parlagfű levélbogarat több országba betelepítették (Horvátország, Kína, volt Szovjetunió), ahol károsítást nem okozott a kultúrnövényekben, viszont a parlagfűben sem tett komoly kárt (Reznik és mtsai 1994, Igrc és mtsai 1995). Japán szabadföldi kísérletekben az Ophraella communa faj a parlagfüvet jelentősen károsította (Yamazaki és mtsai 2000). A biológiai védekezésben kulcsszerepet játszhatnának a parlagfűre specializálódott gombák, azonban még nem adtak hírt egyik gombafaj kitűnő agrotechnikai alkalmazhatóságáról sem.

2.3 A kloroplasztisz és mitokondrium genom sajátosságai A növényi genom különlegessége, hogy a mitokondriumok mellett a színtestekben is található DNS-állomány (Mátyás 2002). A három genom mérete és öröklődése is eltér egymástól. Az organellum-DNS felhasználása széles körű a rokon fajok közötti és fajon belüli genetikai távolságok elemzésére, a megbízhatóság, a nukleáris DNS-hez képest egyszerűbb vizsgálhatóság és a génáramlásban betöltött különleges szerepe miatt (Clegg és mtsai 1984, Pillay és Hilu 1990, Hultquist és mtsai 1997, Perez de la Rosa és mtsai 1995, Cipriani és mtsai 1998, Parducci és Szmidt 1999). A kloroplasztisz és mitokondrium DNS vizsgálata jobban rávilágíthat az evolúciós kapcsolatokra, mivel ezek mutációs rátája jóval kisebb, mint a nukleáris DNS-nek (Wolfe és mtsai 1987). Az organellum-DNS vizsgálatok hatékonyságát növeli, ha a vizsgálni kívánt növényfaj 23

maggal szaporodik és szélbeporzású. A pollen migrációs távolsága igen nagy lehet, ugyanakkor a mag terjedőképessége korlátozott. A sejtmag DNS-ében kódolt allélok hatékony génáramlásával szemben tehát az anyai öröklésmenet helyi genotípusok fennmaradását teszi lehetővé. Ezért különböző területek populációinak genotípizálására az organellum-DNS markerek is jól alkalmazhatóak (Mátyás 2002). Markerként való alkalmazásukhoz ki kell emelni, hogy az organellumgenom haploid, ritkán rekombinálódik, azaz a változások zöme csak mutációk révén alakulhat ki és csak az egyik szülő által örökíthető át (Mátyás 2002). A DNS-t tartalmazó sejtorganellumok, a kloroplasztisz és a mitokondrium az endoszimbionta elmélet szerint az eukarióta baktériumszerű

sejtekből

alakultak

ki,

szervezetek

amelyek

a

mai

„fogságába” került fotoszintetizáló

lila

baktériumokkal és Cyanobacteriumokkal, állnak rokonságban (Gray 1989). A kloroplasztisz-DNS (cpDNS) és a mitokondriális DNS (mtDNS) kétszikűekben, kizárólagosan anyai öröklődést mutat, a pollenből hiányzik, így csak a petesejt citoplazmájával kerül át az utódba (Heifetz 2000, Bock és Hagemann 2000). 2.3.1

A kloroplasztisz-genom

A kloroplasztiszok genomja kettősszálú, gyűrű alakú DNS-molekula. A legfontosabb termesztett növények így a búza: Yasunari és mtsai 2000, rizs: Hiratsuka és mtsai 1989, kukorica: Maier és mtsai 1995 és sok más faj (lúdfű: Shusei és mtsai 1999) teljes kloroplasztisz

DNS

szekvenciáját

meghatározták,

ezért

pontos

ismeretekkel

rendelkezünk a gének számáról és sorrendjéről, amelyek távoli fajokban is megegyeznek. A teljes színtestgenom 130-160 ezer nukleotid, amely mindig tartalmazza a riboszomális géneket, amelyek a kloroplasztisz felépítéséhez szükségesek, de ezek a színtestecske működéséhez a fotoszintézishez nem elegendőek, ebben a nukleáris gének is közreműködnek (Velich 2001). A kloroplasztisz genomra jellemző a tömör szerveződés, intronok csak rövid szakaszokban fordulnak elő és az ismétlődő szekvenciák előfordulása sem jellemző, egyetlen ilyen szekvencia ismert, amely a legtöbb növényben 20-25 knt (kilonukleotid) (Velich 2001). A színtestekben 10-100 DNS molekula lehet és minden növényi sejt tartalmazhat 10-100 kloroplasztiszt, tehát ezerszeres kópiaszámú is lehet a színtestgenom (Velich 2001).

24

2.3.2

A mitokondriális genom

A mitokondriumok DNS-állománya a kloroplasztiszokénál lényegesen nagyobb, 300-2500 knt közé esik (Mátyás 2002). A magasabb rendű növények mitokondriális genomjára az a jellemző, hogy a gének intronokkal lehetnek megszakítva, a kódoló szekvenciák között nagyobb nem átíródó szakaszok találhatók és nagy az ismétlődő szekvenciák aránya is. A genom több algenomikus gyűrűből áll, melyek az ismétlődő szekvenciáknál fűződnek le és a gyűrűk dinamikus egyensúlyban vannak (Velich 2001). A növényi mitokondrium általában mindössze 40-50 gént tartalmaz, amelyek jórészt a glikolízis és az elektrontranszport fehérjéit kódolják (Mátyás 2002). Nagyon kevés szervezetben ismert a mitokondrium-DNS-ének teljes nukleotidsorrendje, a genom mérete és a gyűrűfajták állandó változása miatt.

2.4

Molekuláris genetikai vizsgálati módszerek és molekuláris markerek

A molekuláris genetika robbanásszerű fejlődése számtalan új DNS vizsgálati módszer és új molekuláris marker típus kifejlesztését eredményezte. A DNS markerek alkalmazását a „Southern blot” hibridizáció és az ezen alapuló RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) módszer, majd a polimeráz láncreakció (Polymerase Chain Reaction) kifejlesztése tette lehetővé. 2.4.1

Restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (RFLP)

Az első DNS marker, melyet Botstein és mtsai 1980-ban írtak le az RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) volt. Ennek a felfedezésnek az alapját a restrikciós enzimek működésének megismerése teremtette meg. A leggyakoribb restrikciós endonukleázok 4 illetve 6 bp nagyságú DNS szekvenciákat „ismernek fel”, majd elvágják a kétszálú DNS molekulát. A különböző genomok eltérő pozíciókban tartalmaznak restrikciós emésztési helyeket, ezért különböző méretű fragmentumokra darabolódnak fel az emésztés során. A növényi genom nagy mérete miatt, a restrikciós enzimek olyan sok darabra vágják a DNS-t, hogy pontos elválasztásuk nem lehetséges, ezért a gélelektroforézis után jelölt próbákkal Southern-hibridizációt (Southern 1975) végeznek a genomok megkülönböztetéséhez. Az így kapott fragmentumok kodomináns markerként viselkednek, tehát a heterozigóták is kimutathatók a segítségükkel. A módszer hátránya, hogy nagy mennyiségű DNS-t igényel és a jelölt próbák alkalmazása miatt hosszadalmas és költséges eljárás (Heszky és mtsai 2005).

25

2.4.2

Polimeráz láncreakció (PCR)

A polimeráz láncreakciót (Polymerase Chain Reaction) először 1985-ben Saiki és mtsai írták le a β-globin gén amplifikálására. A reakcióval a sejtekben végbemenő DNS replikációt utánozzuk. A PCR ciklusokból áll, amelyekben a primerek kapcsolódási helyétől kiinduló DNS szintézis történik. A ciklusok ismétlésével a primerek közötti DNS szakasz exponenciálisan amplifikálódik, mert a polimeráz enzim az újonnan készített DNS szálakat is templátként használja. Az így kapott DNS mennyiség már egyszerű agaróz gélelektroforézissel kimutatható, míg a templátként használt DNS kis mennyisége miatt nem látszik (Kiss 1999). A napjainkban is használt hőstabil Taq polimeráz enzimet Saiki és mtsai 1988-ban izolálták a Thermus aquaticus baktériumból, ezzel lehetővé vált a specifikus PCR egyetlen reakcióelegyben, a hőmérséklet gyors és pontos változtatásával. 2.4.3

Szekvencia specifikus primerek (SCAR)

Marker fragmentumok, gének manapság akár teljes genomok szekvenálásával pontos szekvencia adatokhoz juthatunk. Ezután ezekre a szekvenciákra specifikus, 18-26 bp nagyságú primereket tervezhetünk, ezek az ún. Sequence Characterized Amplified Regions (SCAR) primerek. Ezekkel a primerekkel jól reprodukálható termékeket várhatunk, melyek egyúttal kodomináns markerek is lehetnek (Heszky és mtsai 2005). 2.4.4

PCR-RFLP

Specifikus primerek alkalmazása során gyakran azonos méretű, de eltérő szekvenciájú termékeket kapunk. Ezeknek a termékeknek a markerként való alkalmazásához és SNP-k detektálásához az egyik lehetséges módszer a PCR termékek restrikciós enzimekkel történő emésztése. Ha a termékekben voltak nukleotid eltérések és a megfelelő restrikciós endonukleázzal dolgoztunk, akkor különböző méretű restrikciós fragmentumokat fogunk látni a gélelektroforézis után. Ezzel a módszerrel kodomináns CAPS (Cleaved Amplified Polymorphic Sequences) markereket kaphatunk (Heszky és mtsai 2005). 2.4.5

PASA (PCR amplification of specific alleles)

Az SNP-k (Single Nucleotide Polymorphism), a csupán egyetlen nukleotidban eltérő allélok kimutatásának gyors PCR alapú módszere a PASA (allél-specifikus PCR). A módszer elve az, hogy a szekvencia ismeretében a mutáció helyére két primert 26

tervezünk, melyek végein találhatóak a polimorf nukleotidokkal komplementer bázisok. A harmadik primert az SNP-től megfelelő távolságba (100-500 bp) az ellentétes szálra tervezzük. A PCR reakció allél specifikusságát növeli, ha az SNP-hez készített primerek 3’ végétől 5 nukleotid távolságra egy nukleotid cserét (mismatch) is beiktatunk (Gaudet és mtsai 2007). A primerek tervezésekor fontos figyelembe venni, hogy mind a három primer kapcsolódási hőmérsékletének azonosnak kell lennie. Ezzel a módszerrel két PCR reakció szükséges a heterozigóták és a homozigóták elkülönítéséhez. 2.4.6 A

Bi-PASA (bidirectional-PASA)

bi-PASA

(kétirányú

allél-specifikus

amplifikáció)

a

PASA

módszer

továbbfejlesztett változata, amellyel egyetlen PCR reakcióban alkalmazott két primerpárral, allél specifikus termékeket kapunk. Tehát a hetero és homozigóták jól elkülöníthetőek az alapján, hogy egy vagy két allél specifikus (különböző méretű) termék szaporodik fel a PCR reakcióban (Liu és mtsai 1997). A primerek tervezésénél nagy hangsúlyt kell fektetni az azonos kapcsolódási hőmérsékletekre, a megfelelő méretkülönbségre a két allél-specifikus termék között és a primer-dimerek kialakulásának lehetőségével is számolni kell.

2.5

A Genetikai távolság értékelése

Ha két vagy több populáció genetikai elkülönülését szeretnénk értékelni, akkor a genetikai azonosság mértékét kell kiszámolnunk. Egy vagy több génhelyre vonatkoztatva, a genetikai azonosság (I = identitás) az X és Y jelű populációk között:

I xy =

∑ (x ⋅ y ) ∑ x ⋅∑ y i

i

2

i

2

, ahol

i

xi és yi az allélok gyakoriságai a két populációban. I értéke 0 és 1 között változhat. Ha értéke 1, a két populáció azonos. A genetikai azonosság tulajdonképpen annak az átlagos valószínűségét fejezi ki, hogy a két populációban véletlenszerűen kiválasztott allél azonos lesz-e (Mátyás 2002). Nei (1975) a genetikai azonosságot felhasználva a két populáció genetikai távolságát (genetic distance ) az allélgyakoriságban mutatkozó eltéréssel jellemzi: D = - lnI

( I = identitás)

27

A genetikai távolság a két populációban mért allélgyakoriságok különbségéből is számítható: d=

1 ∑ ( xi − y i ) 2

A két populáció azonossága esetén D ill. d értéke 0. Nei és Li (1979) a genetikai távolság (GD) meghatározására, ha RFLP vizsgálat eredményeiből szeretnénk meghatározni, a következő összefüggést javasolja:

, ahol Nxy a két egyed azonos fragmentumainak a száma, Nx az első minta fragmentumainak a száma, Ny a második minta fragmentumainak az összege. Két vagy több populáció egyedei között, ezzel az összefüggéssel kiszámíthatóak a genetikai távolságok. Az eredményeket egy genetikai távolság mátrixba rendezhetjük. Populáció genetikai elemző programok segítségével a genetikai távolság mátrix egyszerűbben meghatározható, és az eredmények jobb és érthetőbb szemléltetése érdekében dendogrammot is szerkeszthetünk klaszteranalízissel. A klaszteranalízis jól ismert módszer a genetikai eredmények kiértékelésének gyakorlatában. Ilyen módszer az UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean), vagy a WPGMA (weighted pair group method with averaging) is. Ezek a módszerek a klaszterek közötti különbségek számítási módjában térnek el egymástól. A leggyakrabban alkalmazott UPGMA csoportátlag módszer, egy hierarchikus osztályozó algoritmus, melyben két csoport távolságát a tagjaik közötti összes távolságérték mértani átlaga fejezi ki (Sokal és Michener 1958). A mértani közép alapján súlyozás nélkül számoló UPGMA módszerrel lehet az egyes csoportok közötti különbségeket a leginkább kimutatni (Sneath és Sokal 1973).

2.6 A triazin-rezisztencia 2.6.1

Az 1,3,5-triazinok rövid jellemzése

Az 1,3,5-triazinok a fotoszintézist gátló herbicidek csoportjába tartoznak. A xylémben transzlokálódnak. Pre- és posztemergensen is alkalmazzuk egyéves kétszikű és néhány egyszikű gyom ellen, talajherbicidként. A triazinokat környezetvédelmi

28

megfontolásokból 2007 végéig lehetett használni Magyarországon kivéve a terbutilazin hatóanyagot. A hatáskifejtésükhöz bemosó csapadékra van szükség. A klóraminotrazinok rendkívül perzisztensek, és vízoldékonyságuk a legrosszabb. Felhasználási területük széles: leggyakrabban a kukoricában, de szántóföldi kultúrákban (gabona, burgonya, cukorrépa), négy évesnél idősebb szőlőben, almástermésűeknél, kertészeti kultúrákban és erdészetekben használjuk. Az 1,3,5-triazinok csoportjába tartozik a terbutilazin, a terbumetoncianazin, a terbutrin, az aziprotrin, a prometrin, a dipropetrin és a legismertebb, a II-klór-4-etil-amino-6-izopropilamino-1,3,5-triazin, azaz az atrazin (Kádár 2001).

2.6.2

A triazin-rezisztencia mechanizmusa és öröklődése

A triazinok hatásukat a fotoszintézis gátlásával fejtik ki. Ezt úgy érik el, hogy a II. fotószisztéma területén az elektrontranszportot szétkapcsolják a primer (Q) és a szekunder (plasztokinon) elektron akceptor között. Pontosabban a kloroplasztiszban hozzákötődnek a D1 thylakoid membrán fehérjéhez, ezzel helyéről elmozdítják a plasztokinont, így gátolják a fotoszintetikus elektrontranszportot (Berzsenyi 2000) (5. ábra).

5. ábra: A triazinok fotoszintézis gátlása (Kádár 2001).

29

A triazin herbicidekkel szembeni rezisztenciának három fő formája ismert. Az első a gyökérzet elhelyezkedésén alapuló szelektivitás, amely számos kultúrnövény ellenálló képességének alapja. Ebben az esetben a növények gyökérzete mélyebben helyezkedik el, mint a herbicid bemosódási zónája (Warwick 1976). A második a triazin herbicidek biokémiai alapokon nyugvó hatástalanítása. A detoxifikálás három formáját ismerjük: I.

hidroxi atrazin képzés

II.

oldallánchasítás (dealkiláció)

III.

glutation-konjugáció (Jensen és Bandeen 1979).

A harmadik rezisztenciát okozó változás a D1 thylakoid membrán fehérje szerkezetében következhet be. Mivel e 32 kDa méretű fehérjéhez ezután már nem tud kötődni az atrazin, és így tovább működhet a fotoszintézis. A D1 fehérjét a psbA gén kódolja a kloropasztisz genomban (Steinback és mtsai 1981), tehát extra kromoszomális öröklődésű. A psbA gént először Spinacea oleraceaból illetve Nicotiana debneyből izolálták és szekvenálták (Zurawsky és mtsai 1982). Azóta különböző fotoszintetikus szervezetekből klónozták, és a szekvenálás eredményei a gén nagyfokú konzerváltságát mutatják (Holt és mtsai 1993). Egyetlen primerpárral a psbA konzervált régiója kimutatható volt a kultúrnövények közül búzában, kukoricában, repcében, lucernában. A növények egy részénél a triazin rezisztencia a psbA gén 264-es kódonján bekövetkezett egyetlen pontmutáció eredménye (Botterman és Leemans 1988, Rios és mtsai 2003). Ez a nukleotid csere adenin helyett guanint eredményez, ami a fentiek szerint változtatja meg a D1 fehérje tulajdonságait. Mivel hasonló molekuláris változásokat figyeltek meg a repcében (Reith és Strauss 1987), az árpában (Rios és mtsai, 2003) és a gyomnövények közül az Amaranthus fajokban (Hirschberg és McIntosh 1983), a Solanum nigrum-ban (Goloubinoff és Edelman 1984) és a Poa annua-ban (Barros és Dyer 1988), ebből e tulajdonság konzervált változékonyságára lehet következtetni. Erre Botterman és Leemans (1988), majd Holt (1993) is felhívta a figyelmet. Cheung (1993) egy primerpárt fejlesztett ki, amellyel repcében, a Chenopodium spp.-ben és az Amaranthus spp.-ben egyetlen PCR reakcióval ki tudták mutatni a psbA gén régióját, ahol a mutáció bekövetkezett. Ugyanezzel a primerpárral több növény fajban, még egyszikűekben is, mint az árpa (Rios és mtsai 2003) ugyanazt a fragmentumot kapták. Ez a primerpár egy 277 bp méretű PCR terméket ad mind a triazin rezisztens, mind a triazin fogékony növényekben. E fragmentumon belül a pontmutáció szekvenálás nélkül is kimutatható. A psbA gén atrazin rezisztens biotípusa elkülöníthető a fogékonytól, mivel a BstXI-es 30

restrikciós endonukleáz a mutáció helyén vágja ezt a szekvenciát (Thomzik és Hain 1988). A MaeI restrikciós enzim felismerési szekvenciája szintén itt található, de csak a fogékony biotípust vágja (Cheung és mtsai 1993). A teljes psbA gén amplifikálása egy másik primerpárral (trnH+trnK) lehetséges, melyet Demesure és mtsai (1995) fejlesztettek ki. Ezt a primerpárt szintén univerzálisnak tartják, mivel különféle növényeken végzett vizsgálatok során egyetlen 1.800 bp méretű, a psbA gént tartalmazó fragmentumot szaporított fel. Ez a fragmentum tartalmazza az egész gént és a gén promóter és 5’UTR (5’ untranslated region) régióját is. A psbA gén fényre indukálódik, és a legintenzívebben átíródó növényi gén (Kim és mtsai 1993, Mayfield és mtsai 1995). A promóter a génkifejeződés szabályozásában a transzkripció szintjén vesz részt, az 5’UTR pedig a transzláció folyamatában játszik szerepet. A psbA gén promótere egy jól ismert promóter, amely tartalmazza a ”-10” (TATAAT) és a “-35” (TTGACA) konzervált elemeket (Igloi és Kössel 1992, Hayashi és mtsai 2003). Az 5’UTR a promóter és a gén kódoló régiója között helyezkedik el, és szabályozza, hogy fény hatására a psbA gén mRNS-éről a D1 fehérje transzlációja induljon

el

(Staub

és

Maliga

1993).

Így

meghatározó

szerepe

van

a

poszttranszkripcionális génszabályozásban (Shen és mtsai 2001). Frey és mtsai (1999) a psbA gént vizsgálták a közönséges aggófűben (Senecio vulgaris). Eredményeik arra utaltak, hogy e növény kloroplasztisz genomja polimorf, de ez a polimorfizmus nem csak egyedszintű, hanem az egyes növények levelei között is találhatók eltérések. Ezt a jelenséget, amikor egy növényben illetve egy sejtben több kloroplasztisz vagy mitokondrium genotípus található meg, heteroplazmásságnak nevezzük. 2.6.3

A parlagfű atrazin-rezisztens biotípusának elterjedése Magyarországon

A rezisztens gyombiotípusok megjelenését és elterjedését az ország egész területére kiterjedő monitoring vizsgálatokkal a Komárom-Esztergom Megyei és a Somogy Megyei Növény- és Talajvédelmi Szolgálat követi nyomon. A rezisztens biotípust először az 1992-ben gyűjtött Somogy megyei magmintákból mutatták ki. Az 1999-2001 között Somogy megyei minták 50 százaléka atrazin rezisztensnek bizonyult. 2000-re a rezisztens változat már megjelent Vas és Tolna, valamint az Alföldön is Békés megyében. Baranya és Zala megyéket 2001-ben érte el, és az országosan vizsgált összes csíraképes magminta 36 százaléka bizonyult rezisztensnek. Ezeknek az adatoknak az ismeretében megállapítható, hogy a parlagfű atrazin-rezisztens biotípusa hasonlóan – 31

bár sokkal rövidebb idő alatt – terjedt el, mint korábban a hazánk délnyugati részéből kiinduló szenzitív típus (Hartmann és mtsai 2003).

2.7

Az acetolaktát–szintetáz (ALS) működést gátló herbicidekkel szembeni

rezisztencia 2.7.1

Az ALS-gátló herbicidek rövid jellemzése

Az ALS (acetolaktát-szintetáz) enzim, amely azonos az AHAS-sal (hidroxi-ecetsavszintetáz) az elágazó szénláncú aminosavak (leucin, izoleucin, valin) szintézisében játszik szerepet, öt herbicidcsoport hatáshelye (Scarabela és mtsai 2004). Ez az öt herbicidcsoport, imidazolinonok,

melyekhez

számtalan

triazolpirimidin

hatóanyag

szulfonanilidek,

tartozik

a

szulfonil-ureák,

pirimidiniltio-benzoátok

és

szulfonilaminokarbonil-triazolinonok. Ezekbe a csoportokba tartozó hatóanyagok megjelenésével, kezdve a legelsővel a klórszulfuronnal forradalmi változás kezdődött a herbicidek felhasználásában az addig alkalmazott kg/ha-os dózisokat a g/ha váltotta fel. Mára az ALS-gátlók a legszélesebb körben használt herbicidek lettek a világon (Tranel és Wright 2002). A kultúrnövények toleranciája az ALS-gátló herbicidekkel szemben a gyors metabolikus lebontásából ered. A termesztett növények, mint a búza, kukorica, árpa, rizs és a szója más-más helyen hatástalanítják, bontják meg a hatóanyag szerkezetét (Kádár 2001). Az ALS-gátlók a xylémben és a floémben egyaránt transzlokálódó szisztemikus mikroherbicidek, melyek a gyökéren és a levélen keresztül is képesek elpusztítani az érzékeny növényeket. Felhasználási területük széles, pre- és posztemergensen is alkalmazhatóak egy- és kétszikű gyomok ellen. A herbicid felvétele gyors, a pusztulás azonban hosszú, általában 7-17 nap (Kádár 2001).

2.7.2

Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia mechanizmusa és öröklődése a

gyomnövényekben Jelenleg a világon az ALS gátló herbicidekkel szemben 95 rezisztens gyomfaj ismert. Az ALS gátló herbicidekkel szemben rezisztens parlagfüveket először 1998-ban, az USA-ban

találtak,

Magyarországon

még

nem

ismert

ez

a

biotípus

(www.weedscience.org). Az ALS gén két reprezentatív szakasza az A és a B régió. Ez a két szakasz kódolja az ALS fehérjének azon részét, ahol a herbicidek kapcsolódnak az

32

enzimhez, így megakadályozák annak működését (Tranel és Wright 2002). Az ALS fehérje funkcióját a kloroplasztiszban fejti ki, az első enzim az elágazó szénláncú aminosav bioszintézisben (Tranel és Wright 2002). Az ALS gén a nukleáris genomban kódolt és a Mendeli öröklésmenetet követi, így az ALS gén alléljai a pollennel és a maggal is terjednek (Tranel és Wright 2002). Az ALS-A és ALS-B régiókban, ha bekövetkezik a Sathasivan és mtsai (1990) által Arabidopsis thaliana-ban meghatározott öt pontmutáció valamelyike, akkor kialakul a rezisztencia (Gutteri és mtsai 1996, Wright és mtsai 1998). A rezisztenciát okozó aminosav cserék a különböző gyomnövényekben az ALS-A régióban a következők voltak: Ala122/Thr122, Pro197/Ser197, Ala205/Val205 az ALS-B régióban: Trp574/Leu574, Ser653/Thr653 (McNaughtona és mtsai 2005). Patzoldt és mtsai (2001) négy fogékony és két rezisztens parlagfüvet hasonlítottak össze az ALS-A és ALS-B szekvencia alapján. Arra a következtetésre jutottak, hogy a rezisztenciát ebben a populációban a Trp574-es aminosav (triptofán) leucinra cserélődése okozza. Azt is bizonyították, hogy az általuk vizsgált mintákban a 653-as aminosav, amely a legtöbb növényben szerin - a parlagfűben alaninra változott, de ez az aminosav csere nem váltott ki rezisztenciát. Zheng és mtsai (2005) szerint a parlagfű ALS rezisztenciájának meghatározó oka a Trp574/Leu574 aminosav csere, valamint a rezisztencia mértékét befolyásolja, hogy a mutáció heterozigóta vagy homozigóta formában van-e jelen az adott növényben. Keresztrezisztenciát is kimutattak, szulfonilureákkal, imidazolinokkal és a triazol-pirimidinekkel szemben (Taylor és mtsai 2002, Tranel és mtsai 2004, Zheng és mtsai 2005). Tranel és mtsai (2004) az USA három államában - Illinois, Minnesota és Ohio vizsgálták az ALS-A szekvencia változatosságát 24 db parlagfűben (Ambrosia artemisiifolia), 24 db bojtorján szerbtövisben (Xanthium strumarium) és 10-10 db disznóparéjban

(Amaranthus

hybridus,

Amaranthus

tuberculatus).

A

legtöbb

polimorfizmust a parlagfűben találták, a 24 egyedben 48 db SNP-t (Single Nucleotide Polymorphism) detektáltak. A két Amaranthus faj húsz egyedében összesen 7 polimorf nukleotid volt, a szerbtövisben nem fedeztek fel eltérést az egyedek között.

2.8 A parlagfű pollenallergia és az Amb a I géncsalád Az allergia fogalmát a 20. század első évtizedében Clement von Pirquet vezette be a tuberkulózissal kapcsolatban. A fogalmat ma szélesebb körben használják: betegségek és állapotok sorát jelöli, amelyeknél egy adott szervezet másképpen reagál a külső 33

antigénekkel (legtöbbször fehérjékkel) szemben egy ismételt találkozásnál, mint ahogyan azt más emberi szervezetek teszik és ezen reakció során kóros és ártó tünetek jelentkeznek (Cserháti 2006). A XX. század második felében rohamosan növekedett világszerte az allergiás és asztmás betegek száma elsősorban a technikai civilizáció közepes vagy magasabb szintjén álló országokban, és e betegségek kezelése egyre növekvő költségeket jelent (Cserháti 2006). Magyarországon 2005-ben a légúti allergiák kezelésére 17 milliárd forintot fordítottak (Nékám és Páldy 2008). Világszerte az allergiás megbetegedések egyik leggyakoribb kiváltói a pollenek. Az általánosan elfogadott szakmai vélemény szerint a pollinózisok legalább 50%-ában a parlagfű oki vagy társtényező (Kazinczi és mtsai 2009). Ennek az a magyarázata, hogy a parlagfűpollen erős allergén és egy átlagos növény nyolcmilliárd virágporszem termelésére képes 2-3 hónap alatt (Béres és mtsai 2005). Juhász és Juhász (2002) megállapítása szerint Magyarországon az ürömlevelű parlagfű virágpora a szezonális pollenkoncentráció 60-71 %-át teszi ki. Pollenje erős allergén, mert nagyon aktív, és hatékony antigént tartalmaz, amely a pollenből az orrnyálkahártyán keresztül másodpercek alatt diffundál, így a tünetek szinte azonnal jelentkeznek (Béres és mtsai 2005). Ez az antigén egy fehérje, amit az Amb a I géncsalád kódol (Rafnar és mtsai 1991). Az Amb a I fehérje a pollen fehérjetartalmának a 6%-át teszi ki, de az allergiás reakciók kb. 90 %-áért az Amb a I specifikus antitestek a felelősek (Lockey és Ledford 2008). Amb a 2-től egészen Amb a 9-ig izoláltak már kisebb molekulasúlyú allergén fehérjéket, de ezek jelentősége is jóval kisebb az allergia kialakulásában (Lockey és Ledford 2008). Az Amb a I fehérje 38 kDa nagyságú, lánc formájú és savas jellegű (Rafnar és mtsai 1991). Az Amb a I génnek eddig négy változatát azonosították cDNS szinten. Rafnar és mtsai (1991) parlagfű pollenből izolált mRNS-eket írták át cDNS-é és elemezték az Amb a I.1, Amb a I.2 és Amb a I.3 génváltozatokat nukleinsav és aminosav szinten. Griffitha és mtsai (1991) az Amb a I gén kódoló régiójának negyedik változatát (Amb a I.4) is leírták. A parlagfű genetikai változékonyságából arra lehet következtetni, hogy a génnek még több változata létezhet.

34

3. Anyagok és módszerek

3.1 Növényanyag 3.1.1 A filogenetikai összehasonlításra használt egyedek A vizsgálatokhoz Kelet-Magyarországról Hódmezővásárhely közeléből származó egymástól több km-re lévő parlagfüvekről gyűjtött magokat és Nyugat-Magyarországról Keszthely térségéből gyűjtött parlagfű magokat használtunk. Kanadában Montreal környékén és az USA-ban Madison közelében gyűjtött magokat szintén bevontunk a vizsgálatokba, de itt a növények csak 300-400 m-re voltak egymástól. Az amerikai és kanadai növények magjait Dr. Kiss Levente (MTA Növényvédelmi Kutatóintézet) bocsátotta a rendelkezésünkre. A begyűjtött magokat tenyészedényben csíráztattuk és a fiatal növényekről szedtünk leveleket a DNS izoláláshoz. Mindegyik populációból négy növényt választottunk ki a genetikai vizsgálatokhoz, amelyek magjai különböző anyanövényekről származtak. A vizsgálatoknál referenciaként használtunk két napraforgó fajtát is, mivel ez a növény is a fészkesek családjába tartozik. Az ’Iregi Szürke’ szabadelvirágzású fajtát és a ’Nova’ hibridet is tenyészedényben neveltük és fiatal levelekről szedtünk mintákat a DNS izolálásához. 3.1.2

A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatához felhasznált növények

A triazin rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálatánál 36 fogékony és 12 rezisztens növényt használtunk. A növények magjait Hoffmanné Pathy Zsuzsannától (Somogy Megyei Mezőgazdasági Szakigazgatási Hivatal Növény- és Talajvédelmi Igazgatóság) kaptuk. A rezisztencia kimutatása növényházi körülmények között 10 cm átmérőjű

műanyag

tenyészedényekben,

3 ismétlésben

történt.

A kísérletben

tenyészedényenként legalább 10 értékelhető növény volt, melyek ugyanarról az anyanövényről származtak. A kezelést az atrazin 2,0 kg/ha-os dózisával közvetlenül a vetés után, preemergensen végeztük. A rezisztensnek tűnő mintákat minden esetben ugyanezzel a dózissal posztemergens kezelésben is részesítettük. A növényeket hőmérsékleti igényüknek megfelelően és természetes megvilágítás mellett, szükség szerint öntözve neveltük. Az értékelés a pusztulás meghatározásával, a keléstől számított 10. napon történt. A DNS izolálása a kezeletlen kontroll egyedei közül véletlenszerűen kiválasztott növény, fiatal leveleiből történt, a rezisztencia teszt eredményének ismeretében.

35

3.1 Acetolaktát–szintetáz

(ALS)

működést

gátló

herbicidek

célgénjének

szekvenálásánál vizsgált növények Az ALS-A fragmentum szekvenciáját hét véletlenszerűen begyűjtött parlagfűben és egy napraforgóban (Nova hibrid) határoztuk meg. A parlagfüvek közül négy származott Keszthelyről, kettő Hódmezővásárhelyről és egy Montreálból (Kanada). Az ALS-B fragmentumot három keszthelyi, egy hódmezővásárhelyi parlagfűből és egy napraforgóból (Nova hibrid) szekvenáltuk.

3.1.4 Az Amb a I géncsalád vizsgálatánál tesztelt növények Az Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 cDNS-ekre tervezett primerek: RW32, RW38, RW45 (Rafnar és mtsai 1991) tesztelését öt parlagfű DNS-én végeztük. Melyek közül három keszthelyi és kettő hódmezővásárhelyi gyűjtésből származott. Az általunk tervezett Amb a I specifikus primereket szintén ezen az öt egyeden teszteltük, majd a vizsgálatokat kiterjesztettük további hét növényre melyek magjai közül egyet Keszthelyen, kettőt Hődmezővásárhelyen és 2-2 Montreal és Madison közelében gyűjtöttünk.

3.2 Molekuláris vizsgálatok 3.2.1

DNS izolálás

A DNS-t minden növényből Walbot és Warren (1988) eljárását követve izoláltuk, de kisebb módosításokat hajtottunk végre. Felhasznált anyagok: -

Lízis oldat:

15 % szacharóz 50 mM Tris HCl (pH 8.0) 50 mM EDTA (pH 8.0) 500 mM NaCl

-

20T – 10E puffer: 20 mM Tris HCl (pH 8.0) 10 mM EDTA (pH 8.0)

-

TE puffer: 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 1.5 mM EDTA (pH 8.0)

-

7,5 M ammónium-acetát

-

20 % SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)

-

Izopropanol

36

-

CIA: kloroform/izoamil-alkohol: 24 : 1 arányban

-

3 M nátrium-acetát

-

96 %-os és 70 %-os etanol

A növények fiatal leveleit (100 mg) folyékony nitrogén jelenlétében porrá zúztuk, majd 1,5 ml lízis oldatot adtunk a mintákhoz. Egy centrifugálást követően eltávolítottuk a folyadékot és 300 μl 20T-10E pufferrel finoman rázva föloldottuk a csapadékot. A mintákhoz 20 μl 20 %-os SDS-t adtunk, és vortexelés után 15 percig 70 °C-on inkubáltuk. Az oldathoz 150 μl 7,5 M-os ammónium-acetátot kevertünk, és 30 percre darált jégbe állítottuk a mintákat. Centrifugálás (10 perc, 4 C˚, 15000 rpm) után a felső tiszta réteget, körülbelül 450 μl-t átpipettáztunk egy másik steril csőbe, majd azonos mennyiségű izopropanolt adtunk hozzá, és 15 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk. Újabb centrifugálás (5 perc, 4 C˚, 8000 rpm) után a folyadékot leöntöttük, és 500 μl TE pufferben a csapadékot feloldottuk. A CIA kezelést követően, 40 μl 3 M-os nátriumacetátot valamint 1 ml etanolt adtunk a mintákhoz, majd ismét centrifugáltunk. Végül egy 70% etanolos tisztítás után kiszárítottuk a mintákat és 200 μl TE pufferben feloldottuk. 3.2.2

DNS amplifikálása polimeráz láncreakcióval (PCR)

A PCR reakciót minden esetben Robocycler (Stratagene, USA) készülékben hajtottuk végre. A reakciót mintánként 20µl reakció eleggyel indítottuk, amely a következő komponenseket tartalmazta: - 25 ng templát DNS, - 100 μM dNTP (dATP, dTTP, dCTP, dGTP), - 10x PCR puffer [(1 x 10mM TrisHCl (pH 8.8), 1,5 mM MgCl2, 50mM KCl és 0,1% Triton X-100)], - 0,2 μM a primerpár mindkét tagjából (Metabion, Germany), - 0,5 unit DynaZyme DNS polymeráz enzim (Finnzymes Oy, Finland). A PCR profilt az alkalmazott primerek kapcsolódási hőmérsékletének és a felszaporítani kívánt termékek méretének megfelelően választottuk meg.

37

3.2.2.1 A kloroplasztisz és mitokondrium genom vizsgálata A kloroplasztisz és a mitokondrium genom vizsgálatánál Al-Janabi és mtsai (1994), Demesure és mtsai (1995), Dumolin-Lapegue és mtsai (1996), Hiratsuka és mtsai (1989), Petit és mtsai (1998) és Wu és mtsai (1998) által kifejlesztett univerzális primer párokat teszteltük. Az alkalmazott 12 db kloroplasztisz és a 12 db mitokondrium genom specifikus primer pár jelölését, szekvenciáját és az alkalmazott kapcsolódási hőmérsékleteket az 1. táblázatban közöljük. A PCR profil a következő volt: 1 ciklus 94˚C 3 perc, majd ezt követte 35 cikluson át 94˚C 30 másodperc, X ˚C 1 perc, 72˚C 2 perc, a végső lánchosszabítás 72˚C 5 perc.

38

1. táblázat: A kloroplasztisz és a mitokondrium nem kódoló régióinak felszaporításához alkalmazott primerek szekvenciái és kapcsolódási hőmérsékletei

Kloroplasztisz

Primer szekvenciák

primer párok psbC2-trnS1 Demesure et.al. (1995) trnS2-trnfM Demesure et.al. (1995) trnS4-trnT3 Demesure et.al. (1995) trnF-trnV Dumolin-L. et al. (1996) trnK f-trnK r Demesure et.al. (1995) trnQ-trnR Dumolin-L. et al. (1996) rpoC1-rpoC2 Petit et al. 1998 trnD-trnT1 Demesure et.al. (1995) trnT2-psbC2 Dumolin-L. et al. (1996) psaA-trnS4 Demesure et.al. (1995) trnV-rbcL Dumolin-L. et al. (1996) rbcL1-rbcL2 Hiratsuka et al. (1989)

Kapcsolódási Hőmérséklet (oC)

psbC2 trnS1 trnS2 trnfM trnS4 trnT3 trnF trnV trnK f trnK r trnQ trnR rpoC1 rpoC2 trnD trnT1 trnT2 psbC2 psaA trnS4 trnV rbcL rbcL1 rbcL2

5'-GGTCGTGACCAAGAAACCAC-3' 5'-GGTTCGAATCCCTCTCTCTC-3' 5'-GAGAGAGAGGGATTCGAACC-3' 5'-CATAACCTTGAGGTCACGGG-3' 5'-CGAGGGTTCGAATCCCTCTC-3' 5'-AGAGCATCGCATTTGTAATG-3' 5'-CTCGTGTCACCAGTTCAAAT-3' 5'-CCGAGAAGGTCTACGGTTCG-3' 5'-GGGTTGCCCGGGACTCGAAC-3' 5'-CAACGGTAGAGTACTCGGCTTTTA-3' 5'-GGGACGGAAGGATTCGAACC-3' 5'-ATTGCGTCCAATAGGATTTGAA-3' 5'-TAGACATCGGTACTCCAGTGC-3' 5'-AAGCGGAATTTGTGCTTGTG-3 5'-ACCAATTGAACTACAATCCC-3' 5'-CTACCACTGAGTTAAAAGGG-3 5'-GCCCTTTTAACTCAGTGGTA-3' 5'-GAGCTTGAGAAGCTTCTGGT-3' 5'-ACTTCTGGTTCCGGCGAACGAA-3' 5'-AACCACTCGGCCATCTCTCCTA-3' 5'-CGAACCGTAGACCTTCTCGG-3' 5'-GCTTTAGTCTCTGTTTGTGG-3' 5'-ATGTCACCACAAACAGAAACTAAAGC-3' 5'-CTTCACAAGCAGCAGCTAGTTCAGGA-3’

57 62 57,5 57,5 53,5 57,5 55 54,5 55 58 57,5 55

39

Mitokondrium

Kapcsolódási Hőmérséklet (oC)

Primer szekvenciák

primer párok 18S-5S

18S

5'-GTGTTGCTGAGACATGCGCC-3'

Al-Janabi et al. (1994)

5S nad5a f nad5 r nad5d f nad5d r nad1B nad1C nad4exon1 nad4exon2a atp6 f atp6 r cob f cob r cox1 f cox1 r nad3 f nad3 r rps14 f rps14 r nad4exon2b nad4exon4 rps14 cob

5'-ATATGGCGCAAGACGATTCC-3' 5'-GAAATGTTTGATGCTTCTTGGG-3' 5'-ACCAACATTGGCATAAAAAAGT-3' 5'-ATAAGTCAACTTCAAAGTGGA-3' 5'-CATTGCAAAGGCATAATGAT-3' 5'-GCATTACGATCTGCAGCTCA-3' 5'-GGAGCTCGATTAGTTTCTGC-3' 5'-CAGTGGGTTGGTCTGGTATG-3' 5'-TCATATGGGCTACTGAGGAG-3' 5'-GGAGGIGGAAAITCAGTICCAA-3' 5'-TAGCATCATTCAAGTAAATACA-3' 5'-AGTTATTGGTGGGGGTTCGG-3' 5'-CCCCAAAAGCTCATCTGACCCC-3' 5'-GGTGCCATTGCGGAGTGATGG-3' 5'-TGGAAGTTCTTCAAAAGTATG-3' 5'-GAAATGTTTGATGCTTCTTGGG-3' 5'-TTCATAGAGAAATCCAATCGT-3' 5'-ATACGAGATCACAAACGTAGA-3' 5'-CCAAGACGATTTITTTATGCC-3' 5'-TGTTTCCCGAAGCGACACTT-3' 5'-AACCAGTCCATGACTTAACA-3' 5'-CACGGGTCGCCCTCGTTCCG-3' 5'-GTGTGGAGGATATAGGTTGT-3'

nad5a f-nad5 r Wu et al. (1998) nad5d f-nad5d r Wu et al. (1998) nad1B-nad1C Demesure et.al. (1995) nad4exon1-nad4exon2a Demesure et.al. (1995) atp6 f-atp6 r Wu et al. (1998) cob f-cob r Wu et al. (1998) cox1 f-cox1 r Wu et al. (1998) nad3 f-nad3 r Wu et al. (1998) rps14 f-rps14 r Wu et al. (1998) nad4exon2b-nad4exon4 Demesure et.al. (1995) rps14-cob Demesure et.al. (1995)

58 60 60 57,5 57,5 55 64 60 58 55 55 57,5

3.2.2.2 A psbA gén felszaporítása restrikciós emésztéshez és szekvenáláshoz A psbA gént tartalmazó 1800 bp nagyságú fragmentum amplifikációját a trnH: 5’ACGGGAATTGAACCCGCGCA-3’ és a trnK: 5’-CCGACTAGTTCCGGGTTCGA3’ (Demesure és mtsai 1995) primerekkel végeztük. A PCR reakció profil a következő volt: 94oC 3 perc; 30 ciklus: 94oC 45 másodperc , 55oC 1 perc, 72oC 2 perc, és a végső extenzió 72oC-on 10 perc volt. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a 5’ATGAGGGTTACAGATTTGGTC-3’

(f277)

forward

és

a

5’-

AGATTAGCACGGTTGATGATA-3’ (r277) (Cheung és mtsai 1993) reverz primerek segítségével szaporítottuk fel. A PCR reakcióhoz a következő programot alkalmaztuk: 94oC 2 perc; 30 ciklus: 94oC 5 másodperc, 50oC 10 másodperc, 72oC 30 másodperc, végül 72oC 5 percig.

40

A psbA gén szekvenálásához a trnK+r277 és a f277+trnH primerpárokkal is felszaporítottuk a gén két felét. A PCR profil megegyezett a trnK+ trnH primerpárnál alkalmazottal.

3.2.2.3

A psbA gén allél specifikus felszaporítása Bi-PASA (bidirectional-PCR

amplification of specific alleles) primerekkel A psbA gén 278 bp méretű mutációt tartalmazó darabját és a fogékony egyedekre jellemző 208 bp ill. a rezisztensekben felszaporodó 109 bp nagyságú fragmentumokat a PsbaF

(5’-ATGAAGGTTACAGATTCGGTC-3’),

AAGGTTAGCACGGTTAATGATA-3’), ATTGATCTTCCAATATACTA-3’) GAATGAGAGTTGTTGAAACC-3’)

PsbaR

(5’-

BPMMF és

(5’-

BPMMR

primereket

egy

reakcióban

(5’használva

amplifikáltuk. A vastaggal szedett nukleotidok a specifikusság növelése érdekében alkalmazott nukleotod cseréket (MisMatch) jelölik. A PCR reakció az alábbiak szerint történt: 94oC 2 perc; 45 ciklus: 94oC 15 másodperc, 53oC 15 másodperc, 72oC 30 másodperc, végül 72oC 3 percig.

3.2.2.4

Az ALS-A és ALS-B fragmentum amplifikálása

Az ALS-A régió felszaporítása a forward 5’-AGCTCTGGAACGTGAAGGC-3’ és reverz 5’-CGTGTTACCTCAAGAGTTAGC-3’ (Patzoldt és mtsai 2001) primereket használva a következő PCR profillal történt: 94oC 3 perc; 35 ciklus: 94oC 30 másodperc, 57oC 1 perc, 72oC 1 perc, végül 72oC 5 perc. Az

ALS-B

régióra

specifikus

ATGAACGTTCAAGAGTTAGC-3',

primerek R:

a

következők

voltak:

F:

5'-

5'-CCTTCGGTGATCACATCCTTGAA-3'

(Patzoldt és mtsai 2001). A PCR reakció profilja megegyezett az ALS-A régióéval az 53 o

C-os kapcsolódási hőmérséklet kivételével.

3.2.2.5 Az Amb a I géncsalád vizsgálata specifikus primerekkel Első lépésként Rafnar és mtsai (1991) által publikált primereket teszteltük le, melyek a következők voltak: RW38, RW45, RW32.1, RW32.2, RW32.3 (2. táblázat). A PCR reakciót az alábbi profil szerint állítottuk be: 94oC 3 perc; 5 ciklus: 94oC 30 másodperc, 65oC 1,5 perc, 72oC 4 perc, 30 ciklus: 94oC 30 másodperc, 55oC 1,5 perc, 72oC 4 perc végül 72oC 5 perc.

41

2. táblázat: Az Amb a I gén elejére (RW38), közepére (RW45) és végére (RW32.1, RW32.2, RW32.3) tervezett primerek (Rafnar és mtsai 1991). Primer Nevek RW38 RW45 RW32.1 RW32.2 RW32.3

Primer Szekvenciák 5’-TCTTGTATTTTACCTTAG-3’ 5’-ACCATCGTTGGACTTAA-3’ 5’-TCATTATAAGTGCTTAGT-3’ 5’-ATTATAAAAAGCTTAGG -3’ 5’-ATAGCAAAAGCTTAGGAG-3’

Primer Lokalizáció (nukleotidokban) 27-43 540-557 1211-1223 1211-1223 1211-1223

A három génváltozat elkülönítésére irányuló vizsgálatokat a PrimerSelect (DNAStar Inc., Madison, USA) (3.táblázat) és Primer3 (Rozen és mtsai 2000) (4. táblázat) programokkal tervezett specifikus primerekkel végeztük. A primerek megtervezéséhez használt szekvenciákat az 1. mellékletben közöljük. 3. táblázat: A PrimerSelect programmal tervezett primerek, melyek az Amb a I gén három variánsának első felén lokalizáltak. Primer Nevek Amba 1-2E Amba 1K Amba 1-2E Amba 2K Amba 3E Amba 3K

Primer Szekvenciák 5’-ATGGGGATCAAACACTG-3’ 5’-GGCCTCCTGGATTCACTT-3’ 5’-ATGGGGATCAAACACTG-3’ 5’-TGCCTCCTGGACAAACTT-3’ 5’-ATGGGGATCAAACAATG-3’ 5’-TGCCTCCTGGAAGCACTT-3’

Primer Kapcsolódási Lokalizáció Hőmér. oC (nt-okban) (X) 2-18 52 516-533 2-18 52 516-533 2-18 53 516-533

42

4. táblázat: A primer3 programmal az Amb a I.1, Amb a I.2 és Amb a I.3 génekből specifikus termékek amplifikációjára tervezett primerek. Primer Nevek

Primer Szekvenciák

Amba 1P530 Amba 1P1172 Amba 1P298 Amba 1P968 Amba 1-2P224 Amba 1-2P891 Amba 3P232 Amba 3P899

5’- GGCCTGATTAAGTCCAACGA-3’ 5’-GGCATGAGAGTACACCAGCA-3’ 5’-TCCAAAAGAAGGCACACTCC-3’ 5’-CATTTTTCTTGCTGCGTTCA-3’ 5’-AGGTTTTGCAAAGGGAACCT-3’ 5’-ACGTTCCCCATCTGTCGTAG-3’ 5’-AGGTTTTGCAAAGGGAACCT-3’ 5’-ACGTTCCCCATCTGTCGTAG-3’

Primer Kapcsolódási Lokalizáció Hőmér. oC (nt-okban) (X) 530-550 55 1152-1172 298-318 55 948-968 224-244 55 871-891 232-252 55 879-899

A PCR során a programok által meghatározott primer kapcsolódási hőmérsékleteket (X) alkalmaztuk. A profil a következő volt: 94oC 3 perc; 35 ciklus: 94oC 30 másodperc, XoC 1 perc, 72oC 2 perc a végső extenzió 72 oC 5 perc.

3.2.3 Restikciós enzimek használata 3.2.3.1 A kloroplasztisz és mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP vizsgálata A restrikciós emésztésekhez 10 µl PCR terméket használtunk fel. Az enzimekből 10 unitot kevertünk a mintákhoz és 4 órára vízfürdőbe helyeztük őket. A Taq I restrikciós enzimnél 65oC-os, a BstU I-nél 60 oC-os az Aci I, Dde I, EcoR I, Hae III, Hha I, Mse I és az Rsa I-es restrikciós endonukleáznál 37 oC-os hőmérsékletet alkalmaztunk a gyártó (New England Biolabs, US) leírása szerint.

3.2.3.2 A psbA gén rezisztenciát okozó pontmutációjánál vágó enzimek A PCR termékekből 10 µl-t használtunk az emésztésekhez. A BstXI-es endonukleázból 8 unitot adtunk a mintákhoz, a MaeI-esből 3 unitot. Az emésztéseket 4 órán át 50oC-on ill. 45 oC-on végeztük.

3.2.4 DNS elválasztás gélelektroforézissel és értékelés A különböző méretű DNS fragmentumok elválasztására horizontális agaróz gélelektroforézist alkalmaztunk. A PCR és a restrikciós termékeket 1,5%-os agaróz (Promega, USA) gélen, a heteroplazmásság vizsgálatakor 2,5%-os Metaphor (Cambrex, USA) gélen 0,5xTBE pufferben választottuk szét (220V 1,5 óra). A géleket 20 percig 43

ethidium-bromidot tartalmazó TE pufferben (85µl/1000ml) festettük. A kapott mintázatot, a Syngene GeneGenius géldokumentációs rendszerével detektáltuk és értékeltük. A fragmentumok méretét 50 bp-os és 100 bp-os súlymarkerhez (Fermentas, Litvánia) viszonyítottuk.

3.2.5 DNS fragmentumok tisztítása gélből Az izolálni kívánt fragmentumokat a transilluminátorra helyezett gélből steril szikével kimetszettük, majd a NovaGene SpinPrep Gel DNA Kit (Novagene, USA) segítségével tisztítottuk a gyártó útmutatása szerint.

3.2.6 Klónozás és szekvenálás A klónozáshoz a pGEM-T Easy Vector System-et (Promega, USA) használtuk a gyártó

leírása

szerint.

Első

lépésként

steril,

IPTG

(isopropyl-beta-D-

thiogalactopyranoside) és X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside) tartalmú ampicillines LB táptalajt és SOC tápoldatot készítettünk. Egy liter LB táptalaj a következőket tartalmazta: -

10 g Bacto-tryptone

-

5 g Bacto-yeast kivonat

-

5 g NaCl

-

0.1 g Ampicillin

-

0.119 g IPTG

-

0.08 g X-Gal

100 ml SOC tápoldatot az alábbi alkotóelemekből állítottunk össze: -

2 g Bacto-tryptone

-

0.5 g Bacto-yeast kivonat

-

1 ml 1M NaCl

-

0,25 ml 1M KCl

-

1 ml 2M Mg2+

-

1 ml 2M Glükóz

Ezt követte a gélből izolált fragmentumok ligálása a plazmidba. A ligálási reakcióelegy a következőket tartalmazta:

44

-

5 µl 2X Rapid Ligation puffer

-

1 µl pGEM-T Easy Vector

-

2 µl Gélből izolált PCR termék

-

1 µl T4 DNS Ligáz

-

1 µl Steril IEW

A ligálási reakcióelegyet egy éjszakán át 4oC-on tartottuk a maximális számú transzformáns létrehozásához. A JM109-es kompetens sejtek transzformálása és a transzformánsok kiválogatása a következő módon történt. A ligálási reakcióelegyből 2 µl-t egy steril 1,5 ml-es eppendorf csőbe mértünk és a jégen felolvasztott JM109-es kompetens sejteket tartalmazó szuszpenzióból 50 µl-t adtunk a mintákhoz. Húsz percig jégen tartottuk a csöveket, majd pontosan 47 másodpeces 42oC-os hősokkot alkalmaztunk. Ezután 2 percre ismét jégre helyeztük a mintákat. A transzformált sejteket is tartalmazó szuszpenzióhoz 950 µl SOC tápoldatot kevertünk, majd másfél órán át 37oC-on 150 rpm-el rázattuk a csöveket. Lamináris bokszban az egyes mintákból 100-100 µl-t kentünk szét két petricsészébe, amelyek az ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajt tartalmazták. A petricsészéket egy éjszakán át 37 oC-on inkubáltuk. Másnap a fehér színű telepeket kolónia PCR-el ellenőriztük és egyben átoltottuk egy új ampicillin, IPTG és X-Gal tartalmú LB táptalajra. A kolónia PCR a klónozó helyre specifikus primerekkel

történt

T7:

5'-TAATACGACTCACTATAGGG-3',

SP6:

5'-

ATTTAGGTGACACTATAG-3' 50oC-os primer kapcsolódási hőmérsékleten. A megfelelő méretű inzertet tartalmazó telepekből egyet belemostunk egy 2ml-es eppendorf csőbe, amely 1,5 ml SOC tápoldatot tartalmazott. A csöveket 37oC-on egy éjszakán át rázattuk. Az így keletkezett sejtkultúrából a plazmidokat az EZ-10 Spin column plasmid DNA Kit-el (Biotechnology Department Bio Basic Inc., Canada) izoláltuk a gyártó leírása szerint. Az izolált plazmid DNS oldatot ismét leellenőriztük a T7 és SP6 primerekkel. A megfelelő inzertet tartalmazó mintákat szekvenáltattuk. A szekvenálás a 3100 Genetic Analyzerrel (Applied Biosystems, USA) történt, melyet a Biomi Kft. végzett el. 3.2.7

A filogenetikai és a szekvencia adatok értékelése

A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-ének PCR-RFLP viszgálatánál kapott restrikciós fragmentumok jelenlétét 1-esel a hiányát 0-ával jelöltük. Az így kapott binomiális mátrixot a Treecon 1.3b softver (Van de Peer és De Wachter 1994) 45

segítségével elemeztük. Kiszámoltuk a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrixot, majd ez alapján UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) dendogrammot készítettünk. A restrikciós fragmentumokból kapott adatmátrixon nem végeztük el a bootstrap analízist, mert a restrikciós fragmentumok egymástól nem függetlenek, mivel egyetlen nukleotid csere egy fragmentum elvesztését vagy két új fragmentum keletkezését eredményezheti, így a bootstrap analízis téves eredményre vezetne (Felsenstein 2007). A szekvenálásból kapott ABI fájlok szekvencia adatait a SeqMan (DNAStar Inc., Madison, USA) program segítségével illesztettük egymáshoz és határoztuk meg a pontmutációkat ill. a kódoló szekvenciák által meghatározott aminosavsorrendet. A nukleotid és aminosav szintű homológia kereséseket a BLAST program (Altschul és mtsai 1990) segítségével a http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-e.html internetes oldalon végeztük el.

46

4. Eredmények 4.1 A parlagfű populációgenetikai viszgálata PCR-RFLP módszerrel fejlesztett anyai öröklésű markerek segítségével Az univerzális primer párok tesztelése során a felszaporított Cp és Mt nem kódoló régiók mérete 250 és 3000 bp között volt (5. táblázat). A cpDNS vizsgálatánál 12 univerzális primerpárt teszteltünk le ebből 4 primerpárral kaptunk az összes mintánál egyetlen terméket. Ezeket a kloroplasztisz fragmentumokat bevontuk az RFLP vizsgálatokba és 9 restrikciós enzimmel emésztettük. A mtDNS összehasonlításánál 12 primerpárral kísérleteztünk, ebből 7-tel kaptunk terméket, de a cobf - cobr és a rps14f rps14r primerpárokkal felszaporítható mtDNS fragmentumok mérete csupán 250-300 bp volt. Ezeken a kisebb termékeken nem végeztük el a 8 enzimmel a restrikciós emésztéseket, mert csak kevés vágási helyre számíthattunk. 5. táblázat: A felszaporított kloroplasztisz és mitokondrium régiók mérete bázispárban. Cp primer párok psbC2-trnS1 trnS2-trnfM trnS4-trnT3 trnF-trnV trnK f-trnK r trnQ-trnR rpoC1-rpoC2 trnD-trnT1 rbcL1 –rbcL2 psaA –trnS4 TrnV -rbcL tmT2 –psbC2

Termékek db 1 1 1 1 több több több több több több több nincs

Méret bp 1600 1200 1500 3000

Mt primer párok 18S-5S nad5a f-nad5 r nad5d f-nad5d r nad1B-nad1C nad4exon1-nad4exon2a cob f-cob r rps14 f-rps14 r atp6 f-atp6 r cox1 f-cox1 r nad3 f-nad3 r

nad4exon2b-nad4exon3 rps14-cob

Termékek db 1 1 1 1 1 1 1 nincs nincs nincs nincs nincs

Méret bp 1000 1000 1000 950 2000 300 250

A PCR-RFLP során a psbC2-trnS1, trnS2-trnfM, trnS4-trnT3 és trnF-trnV primerpárokkal felszaporított Cp régiók hossza összesen 7.300 bp volt. A vizsgált Mt régiók mérete összesen 5.950 bp, melyeket a 18S-5S, nad5af-nad5r, nad5df-nad5dr, nad1B-nad1C és nad4exon1-nad4exon2a primerekkel amplifikáltunk. A restrikciós enzimekkel végzett kezelések után, a mintákat agaróz gélen választottuk el és digitálisan dokumentáltuk a gélfotókat (6. ábra).

47

Cp: trnS2+trnfM, emésztve MseI-el

Mt: Nad5d F+R, emésztve RsaI-el

6. ábra: PCR-RFLP vizsgálatok agaróz elektroforetogrammjai. Minták: Emésztett fragmentum: 0, K-Magyarország (Hódmezővásárhely): 1, 2, 13, 14; NyMagyarország (Keszthely): 3, 4, 15, 16; USA: 5, 6, 7, 8; Kanada: 9, 10, 11, 12; Napraforgó: 17, 18; 100 bp-os DNS marker: M. Az emésztések utáni különböző méretű termékek számát a kloroplasztisz és mitokondrium régiók emésztése során a parlagfűben a napraforgóban és a két növényben együtt vizsgálva a 6/a és 6/b táblázatok foglalják össze.

48

6/a táblázat: A kloroplsztisz régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok száma a különböző enzimekkel. Restrikciós Fajok enzimek Taq I Hha I Dde I Hae III

EcoR I

BstU I Aci I Rsa I Mse I

A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ

Cp primerpárok psbC2trnS1 2 2 2 0 (0) 2 (2) 2 (0) 7 7 7 3 3 3 0 0 0 0 0 0 13 (1) 12 (0) 13 (12) 5 5 5 4 4 4

trnS2trnfM 4 (2) 2 (0) 4 (2) 0 0 0 0 0 0 6 (0) 9 (3) 10 (7) 0 0 0 2 2 2 3 3 3 5 5 5 5 (1) 4 (1) 6 (3)

trnS4trnT3 6 (6) 3 (3) 9 (0) 4 (4) 1 (1) 5 (0) 9 (9) 7 (7) 16 (0) 6 (6) 3 (3) 9 (0) 4 (2) 7 (3) 7 (2) 4 4 4 2 2 2 2 2 2 10 (1) 9 (0) 10 (9)

trnF-trnV 10 8 12 2 2 2 6 8 10 6 7 9 8 5 9 0 0 0 13 13 14 5 7 9 6 7 8

(2) (2) (8)

(2) (4) (4) (2) (3) (4) (4) (0) (5)

(2) (3) (9) (2) (4) (3) (2) (3) (3)

Az A. A. jelöli a parlagfüvet a H. A. a napraforgót és a ∑ az összes fragmentumot a két növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok számát mutatja.

49

6/b táblázat: A mitokondrium régiók restrikciós emésztés után kapott fragmentumok száma a különböző enzimekkel. Restrikciós enzimek

Fajok

Taq I

A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ A. A. H. A. Σ

Hha I Dde I Hae III

EcoR I

BstU I Aci I Rsa I Mse I

18S-5S 8 6 8 3 3 3 7 6 7 7 7 7 2 2 2 4 4 4 3 3 3 2 2 2 0 0 0

(2) (0) (6)

(1) (0) (6)

nad5a fnad5 r 7 4 7 5 5 5 6 7 7 5 5 5 2 2 2 5 4 5 10 6 10 5 3 5 -

(3) (0) (4)

(0) (1) (6)

(1) (0) (4) (4) (0) (6) (2) (0) (3) -

Mt primerpárok nad5d f- nad1Bnad5d r nad1C 0 0 0 5 5 5 2 2 2 0 0 0 0 0 0 2 2 2 2 2 2 4 5 5 -

(0) (1) (4) -

5 5 5 4 6 6 3 2 3 6 7 7 0 0 0 4 4 4 5 8 9 3 5 5 -

(0) (2) (4) (1) (0) (2) (0) (1) (6)

(0) (5) (4) (0) (2) (3) -

nad4exon1nad4exon2a 7 5 7 6 5 6 4 4 4 4 5 6 8 5 8 5 4 5 4 4 4 6 5 6 -

(2) (0) (5) (1) (0) (5)

(1) (2) (3) (2) (0) (6) (1) (0) (4)

(1) (0) (5) -

Az A. A. jelöli a parlagfüvet a H. A. a napraforgót és a ∑ az összes fragmentumot a két növényben. A zárójeles számok az adott fajra jellemző specifikus fragmentumok számát jelentik, a ∑ utáni zárójeles szám mindkét növényfajban előforduló fragmentumok számát mutatja. A napraforgó és a parlagfű cpDNS-ét összehasonlítva 36 emésztésből 17-szer, ami 47%-nak felel meg a mtDNS emésztésénél 41-ből 19-szer, ami 46%-ot jelent, eltérő számú és/vagy méretű restrikciós fragmentumokat kaptunk. A konzerváltabb Cp genomnál a restrikciós fragmentumok száma összesen 213 volt a két fajban. A parlagfüvekben 134 különböző emésztési terméket találtunk ebből 15 (11,2%) bizonyult

50

polimorfnak. A napraforgókkal összehasonlítva, további 79 polimorf fragmentum keletkezett. A jobban rekombinálódó mitokondriális DNS-ben 224 különböző emésztési terméket tudtunk összeszámolni. A parlagfűben az emésztések során 173 termék keletkezett, és ezek közül 32 (18,5%) bizonyult polimorfnak. Még további 15 polimorf fragmentumot találtunk a napraforgó mintákat is vizsgálva. A genetikai távolságmátrix alapján szerkesztett dendogram (7. ábra) jól szemlélteti, hogy a két napraforgó teljesen elkülönült a parlagfüvektől. A parlagfű populációk két csoportra váltak szét az USA-ból származó egyedek egymással szoros kapcsolatot mutattak, de a többi egyedtől elkülönültek.

7. ábra: UPGMA dendogram, a Nei-féle (Nei és Li 1979) genetikai távolságmátrix alapján a Treecon 1.3b programmal (Van de Peer és De Wachter 1994) szerkesztve.

51

A hármas és négyes számú Hódmezővásárhely környéki parlagfű két kanadai mintához állt a legközelebb. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak.

4. 2 Herbicid célgének és rezisztenciát okozó mutációk jellemzése a parlagfűben 4.2.1 Az atrazin-rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata A psbA gént szenzitív és atrazin rezisztens parlagfüvekből is izoláltuk a trnH+trnK primerekkel. A PCR reakciók során a gént is tartalmazó 1800 bp méretű terméket kaptunk. A szekvenálás megkönnyítése érdekében ezt a fragmentumot két részletben is felszaporítottuk a trnK+r277 és a trnH+f277 primereket használva. A szekvenálást ezen a két fragmentumon és a mutáció helyét tartalmazó belső fragmentumon - amit a f277+r277 primer párral amplifikáltunk - is elvégeztük. A három szenzitív és a három rezisztens parlagfű psbA génjének nukleotid-sorrendje nem különbözött egymástól, csupán egyetlen bázispár eltérést találtunk a rezisztens egyedekben, a 790-es pozícióban (7. ábra). Ez a pontmutáció a szakirodalomban közölt más növényekhez hasonlóan a parlagfűben is egy adenin/guanin csere, ami szerin/glicin aminosav váltást okoz a D1 fehérjében az atrazin kötődési helyén.

52

8. ábra: A psbA gén szekvenciája az atrazin rezisztens parlagfűben. A szekvencia elején a start (ATG) a végén a stop (TAA) kódon aláhúzva. A rezisztenciáért felelős nukleotid “G”, aminek a pozíciójában a szenzitív típusban adenin található, bekeretezve látható. A CTAG nukleotidok alatti csillagok jelölik a második MaeI vágási helyet. A szürkével kiemelt szekvenciák a belső 277 bp méretű fragmentum primerjei, az aláhúzással az univerzális primerektől való eltérést jelöltük. A Cheung és mtsai (1993) által tervezett primer párral a várt 277 bp méretű, a pontmutációt tartalmazó belső régiót sikerült felszaporítanunk, annak ellenére, hogy mindkét primerben két nukleotid eltérés van a parlagfű szekvenciához viszonyítva (8. ábra). A parlagfű szekvenciának megfelelő primereket szintetizáltattunk, azonban ezekkel is ugyanazt az eredményt kaptuk, mint a Cheung féle primerekkel. A D1 fehérje aminosav-sorrendje nagyon konzervált a magasabb rendű növények között. Ennek ellenére a genetikai kód degenerációja miatt, a mutációk hatására lehet nukleotid szinten különbségeket kimutatni a psbA génben. A homológiakeresés eredményét a 7. táblázat tartalmazza. Látható, hogy az 1062 bp nagyságú génben a több tízes nagyságrendű nukleotid eltérések nem vagy csak néhány aminosav megváltozását okozzák. Ennek magyarázata a genetikai kód „lötyögése” és a D1 fehérje fontos szerepe a fotoszintézisben, amit csak a megfelelő fehérje-szerkezettel tud ellátni.

53

7. táblázat: A parlagfű psbA génjének az összehasonlítása több növényfaj psbA génjével.

Ls So Nt Ms At Bn Gm Hv Os

psbA ORF Nukleotidok 10 46 41 60 52 48 74 77 90

Aminosavak 0 0 0 4 1 2 2 6 4

Promóter Nukleotidok 9 11 13 22 27 27 27 27 29

5’UTR Nukleotidok 1 22 20 14 13 24 20 26 22

A számok az eltérő nukleotidokat és aminosavakat jelzik az A. artemisiifolia L. szekvenciájától. ORF: open reading frame; 5’UTR: 5’-untranslated region. Ls: Lactuca sativa, So: Spinacea oleracea, Nt: Nicotiana tabacum, Ms: Medicago sativa, At: Arabidopsis thaliana, Bn: Brassica napus, Gm: Glycine maxima, Hv: Hordeum vulgare, Os: Oryza sativa. Az Ambrosia artemisiifolia promótere is tartalmazza a ”-10” és a “-35” konzervált elemeket, valamint ezek között megtalálható a prokariótákra jellemző TGn motívum és az eukariótákra jellemző TATA box (9a ábra). A promóter központi részén kívüli regió kevésbé konzervált.

54

9. ábra: A parlagfű psbA génjének promóter (a) és 5’UTR (b) szekvenciájának az összehasonlítása más növényfajokéval. Szürkével az azonos nukleotidokat jelöltük. A “10” és a “-35” konzervált elemeket a promóterben és a riboszóma kötődési helyeket az 5’UTR-ben aláhúzással jelöltük. A növényfajok jelölése azonos az 7. táblázattal. A psbA gén 5’UTR-e a parlagfűben 75 nukleotid hosszú. A szekvenciában számos eltérés felfedezhető a többi magasabb rendű növényhez képest is (9b ábra). A homológia körülbelül 70%-os, de a saláta (Lactuca sativa) 5’UTR szekvenciája mindössze egyetlen nukleotidban különbözik. A három riboszóma-kötődési helyben nem tér el az Ambrosia artemisiifolia 5’UTR-e sem a többi vizsgált növényétől.

4.2.1.1 A psbA gén rezisztens és fogékony alléljának kimutatása A heteroplazmásság vizsgálatánál a BstXI és a MaeI restrikciós enzimeket alkalmaztuk. A psbA gén belső 277 bp méretű fragmentumát a rezisztens egyedekben a BstXI enzim a pontmutációnál elvágja, és egy 87 bp és egy 190 bp méretű terméket eredményez (10. ábra).

55

10. ábra: A psbA gén belső 277 bp nagyságú fragmentuma, a BstXI enzimmel történt emésztés után. Az első 6 minta rezisztens egyedből származik, a többi 18 minta szenzitívből. M: 50 bp-os súlymarker. A fogékony egyedekben nem vág a BstXI enzim. A szekvencia adatok azt mutatták, hogy a MaeI-es enzimnek két vágási helye van a fogékony egyedekben. Az első független a rezisztenciától, míg a második a rezisztenciát okozó mutáció helyén található. Ezért ezzel az enzimmel a szenzitív típusban három darab restrikciós fragmentumot (154 bp, 88 bp, 35 bp) kapunk, a rezisztens egyedekben pedig csak kettőt (154 bp, 123 bp) ( 11. ábra).

11. ábra: A 277 bp méretű fragmentum sematikus emésztési képe a szenzitív és a rezisztens genotípusban a MaeI és a BstXI enzimekkel. A számok a restrikciós fragmentumok méretét jelölik bázispárban. Az emésztések elvégzése után (12. ábra) azt tapasztaltuk, hogy a rezisztens egyedeknél a BstXI-es emésztés után mindig marad emésztetlen 277 bp méretű termék. Ez a jelenség független volt a restrikciós enzim koncentrációjától. 56

12. ábra: Hat szenzitív és hat rezisztens növény restrikciós emésztési képe BstXI-es (A szenzitív egyedekben nincs vágási hely, a rezisztensekben egy 190 bp és egy 87 bp nagyságú termék látható.) és MaeI-es enzimekkel (A szenzitívekben 154 bp, 88bp és 35 bp a rezisztensekben 154 és 123bp méretű termék látható) . A kép jobb szélén 50 bp-os marker (M) látható. Az emésztés után megmaradt 277 bp méretű terméket kivágtuk és visszatisztítottuk a gélből. Ezt a DNS-t használva templátként megismételtük a PCR reakciót a f277+r277 primerekkel. A kapott terméket a MaeI-es enzimmel emésztve érdekes módon megkaptuk a szenzitív és a rezisztens szekvenciákra jellemző méretű restrikciós fragmentumokat és egy 189 bp méretű fragmentumot is (13. ábra).

57

13. ábra: A heteroplazmásság kimutatása hat atrazin rezisztens mintán. A BstXI enzimes emésztés után az emésztetlen 277 bp méretű terméket kivágtuk a gélből és visszatisztítottuk a DNS-t, a PCR után MaeI-el emésztettük a termékeket. Egyszerre látható az atrazin rezisztens típusra jellemző fragmentum (123 bp) és a szenzitív növényekre jellemző fragmentumok (154 bp, 88 bp és 35 bp). A kép bal szélén egy emésztés előtti 277-es fragmentum, a jobb szélén az 50 bp-os marker látható. Ebből az eredményből arra következtetünk, hogy a psbA gén triazin rezisztenciát okozó változata heteroplazmásan van jelen az általunk vizsgált rezisztens egyedekben, azaz egy növényben a psbA génre nézve többféle kloroplasztisz genotípus található. A 189 bp (154 bp + 35 bp) méretű termék megjelenése az első MaeI vágási hely hiányának köszönhető, mely kloroplasztisz genotípus nyomokban (heteroplazmásan) fordul elő a vizsgált rezisztens parlagfű mintákban. A fogékony egyedekben is megpróbáltuk kimutatni a psbA gén rezisztens változatát, de ezek a próbálkozásaink nem hoztak egyértelmű eredményt, valószínűleg a nagyon kis kópiaszám miatt (az adatokat nem közöltük). A rezisztenciát okozó pontmutációt tartalmazó régióra bi-PASA primereket terveztünk

(14.

megtervezésekor

ábra). mindkét

A

BPMMF primerben

és

BPMMR

egy-egy

primerek

nukleotid

szekvenciájának

cserét

(MisMatch)

alkalmaztunk, a reakció specifikusságának növelése érdekében. Ezekkel a primerekkel egy PCR reakcióban lehetséges a fogékony és a rezisztens genotípusra jellemző fragmentum felszaporítása. Kimutatható, ha egy mintában jelen van a rezisztens és a szenzitív genotípus is.

58

5’ATGAAGGTTACAGATTCGGTCAAGAAGAAGAAACTTATAATATCGTAGCCGCTCATGGTT ATTTTGGCCGATTGATCTTCCAATATGCTA/GGTTTCAACAACTCTCGTTCTTTACATTTCTTC CTAGCTGCTTGGCCTGTAGTAGGTATCTGGTTCACTGCTTTAGGTATCAGTACTATGGCTTTC AACCTAAATGGTTTCAATTTCAACCAATCAGTAGTTGATAGTCAAGGCCGTGTTATTAACAC TTGGGCTGATATCATTAACCGTGCTAACCTT3’

PsbaF: 5’-ATGAAGGTTACAGATTCGGTC-3’ - sötétszürke PsbaR 5’-AAGGTTAGCACGGTTAATGATA-3’- sötétszürke BPMMF: 5’-ATTGATCTTCCAATATACTA-3’- szürke BPMMR: 5’-GAATGAGAGTTGTTGAAACC-3’- szürke 14. ábra: A bi-PASA primerek tervezéséhez felhasznált parlagfű psbA gén szekvencia részlet és a megtervezett primerek szekvenciái. Vastagbetűvel a rezisztenciáért felelős nukleotidot és a primerekben alkalmazott MisMatch-et (nukleotid cserét) jelöltük. A PCR-es kísérletet elvégeztük 6 rezisztens és 6 szenzitív egyeden és az elektroforézis után azt az eredményt kaptuk, hogy a rezisztens egyedek tartalmazzák a szenzitív genotípust is (15. ábra). A rezisztens és szenzitív egyedekben is megjelent a 278 bp nagyságú termék, amely a PsbaF és PsbaR primerekkel szaporodott fel. A rezisztens genotípusra jellemző 109 bp nagyságú fragmentum, amely szintézisének a PsbaF és BPMMR primerek az indító szekvenciái, csak a rezisztens egyedekben amplifikálódott. A szenzitív kloroplasztisz genotípusokban a PsbaR és BPMMF primerektől kiindulva 208 bp nagyságú termék szaporodik fel, melyet a rezisztens és a szenzitív fenotípusú egyedekben is ki tudtunk mutatni. A bi-PASA PCR eredményei azt mutatják, hogy a triazin rezisztens parlagfüvekben a psbA gén rezisztens és szenzitív változata is megtalálható.

59

15. ábra: A bi-PASA primerekkel

elvégzett PCR reakció

termékeinek az

elektroforetogrammja. Az első hat minta rezisztens, ezekben amplifikálódott a várt 278 bp-os régió és a rezisztens genotípusra specifikus 109 bp-os termék és a szenzitív genotípusra jellemző 208 bp-os fragmentum is. A második hat minta szenzitív fenotípusú és csak a 278 bp-os régió és a fogékony genotípusra specifikus 208 bp mértű termék szaporodott fel. 4.2.2

Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai vizsgálata

Az ALS gén vizsgálatához az ALS-A régiót felszaporítottuk a Patzoldt és mtsai (2001) által közölt primerekkel és közvetlenül szekvenáltuk. Ez a régió tartalmaz az öt toleranciáért felelős mutáció közül hármat (Ala122/Thr, Pro197/Ser, Ala205/ Val). Az általunk vizsgált hat magyarországi, és egy kanadai parlagfű, valamint viszonyítási alapként használt egy napraforgó minta ALS-A szekvenciáját a 16. ábrán közöljük.

60

16. ábra: Az ALS-A regió 264 nukleotid méretű szakasza, amely tartalmaz három ALSgátló rezisztenciáért felelős pontmutációt. Az aminosav szekvenciában a három rezisztenciát okozó mutációt fekete színnel jelöltük (Ala122/Thr, Pro197/Ser, Ala205/Val). A hódmezővásárhelyi 2. sz. minta aminosav sorrendjében a detektált mutációt beszürkítettük (Ile192/Asp192). A nukleotid szintű polimorfizmusokat beszürkítettük. A polimorf nukleotidok jelentése a konszenzus szekvenciában: W=A/T, Y=C/T.

61

Egyik minta sem tartalmazta a rezisztenciáért felelős mutációkat, de a hódmezővásárhelyi 2-es parlagfűben a 224-es nukleotidnál egy timin/adenin csere következett be, ami izoleucin/aszparaginsav aminosav cserét eredményez. Tranel és mtsai (2004) 24 amerikai parlagfű egyed ALS-A szekvenciáját közölték, ahol 24 mintán összesen 32 nukleotid polimorfizmust detektáltak. Ezekkel az adatokkal hasonlítottuk össze az általunk vizsgált hat magyarországi és egy kanadai parlagfű minta, valamint egy napraforgó szekvenciáját (8. táblázat). 8. táblázat: Polimorfizmusok az ALS-A régió 264 nukleotidja alapján. Faj

Gyűjtési hely

Növények

Polimorf

Polimorf

Napraforgó

-

száma 1

nukleotidok 5

nukleotid/növény 5

(Nova) Parlagfű

Illinois

8

18

2,25

(Tranel és mtsai 2004) Minnesota

8

34

4,25

(Tranel és mtsai 2004) Ohio

8

32

4

(Tranel és mtsai 2004) USA

24

36

1,5

(Tranel és mtsai 2004) Kanada, Montreál Hódmezővásárhely Keszthely Magyarország

1 2 4 6

4 12 15 19

4 6 3,75 3,17

A magyarországi mintákban 19 különböző pontmutációt mutattunk ki a 264 bp méretű régióban. A két hódmezővásárhelyi mintában összesen öt egyedi polimorfizmust találtunk, míg a többi hazai mintában található nukleotid cserék az amerikai mintákban is előfordultak. Az ALS-B régiókat PCR-el felszaporítottuk, majd klónoztuk és a teljes régió szekvenciáját meghatároztuk a napraforgó és a négy parlagfű mintában. A szekvenálás eredménye 17. ábrán látható. Ebben a régióban két ALS-gátlókra rezisztenciát okozó mutáció lehetséges (Trp574/Leu, Ser653/Thr), melyek közül egyik sem volt megtalálható az ALS-B szekvenciákban. A Ser653/Ala aminosav cserét minden vizsgált egyedben kimutattuk, melyet Patzoldt és mtsai (2001) is felfedeztek amerikai parlagfüvekben, de ez nem okozott rezisztenciát az ALS-gátló herbicidekkel szemben.

62

17. ábra: Az ALS-B regió 365 nukleotidja, amely tartalmazza a két ALS-gátló rezisztenciáért felelős pontmutációt. Az aminosav szekvenciában a két rezisztenciáért felelős mutációt fekete színnel jelöltük (Trp574/Leu574, Ser653/Thr653). A keszthelyi 2. sz. minta aminosav sorrendjében a detektált két mutációt beszürkítettük ( Ala624/Val624, Ile640/Val640). A nukleotid polimorfizmusokat beszürkítettük. A polimorf nukleotidok jelentése a konszenzus szekvenciában: R=A/G, Y=C/T. A régió felszaporításához alkalmazott primereket sötétszürke szín jelöli.

63

A keszthelyi 2-es számú mintában a 245-ödik és a 292-edik nukleotidnál bekövetkezett pontmutációk aminosav cserét is eredményeztek. Így az aminosav sorrendben alanin/valin és izoleucin/valin váltás következett be (16. ábra). Az ALS-A és ALS-B régióban az egy parlagfűre eső polimorf nukleotidok száma nagyságrendileg azonos volt. A napraforgó ALS-B szekvenciában 21 nukleotid eltérés volt a parlagfű szekvenciákhoz képest (8. és 9. táblázat), ez négyszer annyi, mint az ALS-A régió esetében. 9. táblázat: Polimorfizmusok az ALS-B régió 365 nukleotidja alapján. Faj Napraforgó Nova Parlagfű

Gyűjtési hely

Növények

Polimorf

Polimorf

-

száma 1

nukleotidok 21

nukleotid/növény 21

5 11 12

5 3,66 3

Hódmezővásárhely 1 Keszthely 3 Magyarország 4

4.3 A parlagfűpollen fő allergénjét kódoló Amb a I géncsalád vizsgálata

szekvencia specifikus primerekkel A Rafnar és mtsai (1991) meghatározták az Amb a I gén cDNS szekvenciáját és három génváltozatot írtak le. Ezt a gént ill. változatait kívántuk kimutatni magyarországi parlagfüvekben. A vizsgálatokat Rafnar és mtsai (1991) által a gén elejére, közepére és végére tervezett specifikus primerekkel kezdtük el. A gén első felét valószínűleg sikerült amplifikálnunk 5 magyarországi parlagfűből az RW38 és RW45 primerekkel (18. ábra), de a kódoló cDNS szekvenciától eltérően nem 530 bp méretű terméket kaptunk, hanem egy 630 bp-osat. Nagy valószínűséggel 100 bp méretű intron található a gén első felében, vagy más genomi régióból történt az amplifikáció. A gén egészének felszaporítása nem sikerült az RW38 és RW32.1, RW32.2 és RW32.3 primer-kombinációkkal sem.

64

18. ábra: Az Amb a I gén cDNS szekvenciájának első felére tervezett primerekkel (RW38+RW45: Rafnar és mtsai 1991) felszaporított termék elektroforetogrammja. Az Amb a I gén három változatára specifikus primerek (Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K,

Amba3E+Amba3K),

amiket a PrimerSelect programmal

terveztünk a gén ugyanazon részét amplifikálják, mint az RW38+RW45 primerpár. A cDNS szekvencia alapján várt fragmentum 532 bp méretű volt. A PCR reakciók elvégzése után azt tapasztaltuk, hogy mind a három primer kombináció számos nem specifikus termék mellett felszaporított egy kb. 630 bp méretű főterméket is, hasonlóan az

RW38+RW45

primerpárhoz

(19.

ábra).

Az

Amba1-2E+Amba2K

és

Amba3E+Amba3K primer párokkal kapott termékek 20-30 bp-ral nagyobbak voltak a 630 bp-nál. A Primer3 programmal tervezett specifikus primerek tesztelésénél sem kaptunk egyértelmű eredményeket. Az Amba1P530+Amba1P1172 primer párral, mely a cDNS szekvencia alapján az 1-es génváltozat végéről amplifikálna egy 643 bp méretű terméket, 50 bp-tól 1200 bp-ig változatos méretű PCR termékeket kaptunk. A Amba1P298+Amba 1P968 primer párral egy 900 bp méretű főtermék mellett számos kisebb fragmentum is amplifikálódott (19. ábra). Ez a primer pár a gén Amb a I.1-es változatának

a

közepéről,

egy

671

bp

nagyságú

specifikus

fragmentum

felszaporításához lett tervezve. Az Amba1-2P224+Amba1-2P891 primer pár, amelyet az Amb a I gén egyes és kettes változatának középső régiójából egy 668 bp méretű

65

termék felszaporítására terveztünk, nem amplifikált specifikus terméket a vizsgált mintákban (19. ábra). Az Amba3P232+Amba3P899 primerpárt a gén harmadik változatának középső 668 bp méretű régiójának amplifikálására terveztük. A PCR reakciókban specifikus terméket nem szaporított fel.

19. ábra: Az Amb a I gén három változatára specifikus a gén első felére tervezett primerekkel (Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K, Amba3E+Amba 3K) és a génváltozatokra

specifikus

primerekkel

(Amba1P298+Amba1P968,

Amba1-

2P224+Amba1-2P891) végzett PCR reakciók amplifikációs mintázata.

66

5.

Következtetések és javaslatok

5.1 Parlagfű populációk genetikai összehasonlítása A kutatómunka kezdetekor célul tűztük ki, hogy a parlagfűről minél több molekuláris genetikai információt gyűjtsünk, melyek felhasználhatóak további kutatásokhoz, populációgenetikai összehasonlításokhoz, a magyarországi parlagfű származásának megállapításához és a terjedésének követéséhez az európai kontinensen. Hasonló tárgyú kutatást végezték Franciaországban Genton és munkatársai (2005), mikroszatellit markereket fejlesztettek, majd ezekkel hasonlítottak össze észak-amerikai és franciaországi parlagfű populációkat. A franciaországi populációkban nagyobb genetikai változékonyságot találtak, mint az amerikai minták között. Ebből az eredményből arra következtetnek, hogy több forrásból történthetett a parlagfű inváziója. A parlagfű nukleáris genomjának diverzitás vizsgálatával a szerző már foglalkozott (Cseh 2004). Az egy parcelláról származó 24 egyed RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) vizsgálata során a polimorf fragmentumok aránya meghaladta a 70%-ot, ami kiugróan magasnak mondható. Ez a rendkívül nagyfokú heterozigótaság valószínűleg az alapja az ürömlevelű parlagfűre, mint fajra jellemző életképességnek. Nagyon meglepő ez a nagyfokú diverzitás, annak ellenére, hogy a parlagfű magjai a talajban évtizedekig megőrzik csíraképességüket, ezért elképzelhető, hogy különböző generációk tucatjai élnek egyidejűleg egymás mellett, és kereszteződnek egymással, a gének legváltozatosabb kombinációit hozva így létre. Ugyanakkor nem zárható ki, hogy a DNS szintű változékonyság mobilis genetikai elemek, transzpozonok aktivitásának, vagy más molekuláris genetikai esemény, például túlzott rekombináz aktivitás eredménye is egyben. A parlagfű pollenje akár több száz kilométerre is képes eljutni, és amennyiben e nagy távolságra eljutó pollen megőrzi termékenyítőképességét, úgy nem beszélhetünk térbeli izoláltságról, és a sejtmagi gének gyakorlatilag szabadon terjedhetnek az ország szinte bármely növényéről a másikra. A kitűzött céljaink eléréséhez az organellum genomok vizsgálatát találtuk megfelelőnek, mivel ezek anyai öröklésűek, tehát a pollennel nem terjednek és PCRRFLP módszerrel egyszerűbben és megbízhatóbban jellemezhetőek, mint a nukleáris genom. A markerek fejlesztését Al-Janabi és mtsai (1994), Demesure és mtsai (1995), Dumolin-Lapegue és mtsai (1996), Hiratsuka és mtsai (1989), Petit és mtsai (1998) és Wu és mtsai (1998) által publikált primerek tesztelésével kezdtük el, mert ezek a kloroplasztisz és a mitokondrium genomjából nem kódoló régiókat szaporítanak fel

67

PCR reakció segítségével. Ezekben a nem kódoló régiókban sokkal több polimorfizmus várható, ezért jóval informatívabbak filogenetikai szempontból. A parlagfű cpDNS-ében a vizsgált 12 univerzálisnak mondott primerpár közül 4 terméke bizonyult alkalmasnak az RFLP vizsgálatokra, a mtDNS esetében 12 primerpárból 5 volt jól használható. Ezeket a termékeket emésztettük a Taq I, BstU I, Aci I, Dde I, EcoR I, Hae III, Hha I, Mse I és az Rsa I-es restrikciós endonukleázokkal. Az RFLP eredményeként cpDNS fragmentumokból összesen 213 restrikciós terméket kaptunk, ezekből 134 volt parlagfű és 79 napraforgó specifikus. A 134 parlagfű fragmentumból

11,7%

bizonyult

polimorfnak,

ezek

szolgálhatnak

genetikai

információval a gyűjtés helyéről. A mtDNS szekvenciák emésztésével 224 restrikciós fragmentum keletkezett, ebből 15 csak a napraforgó mintákban fordult elő. A 173 parlagfű specifikus termék közül 18,5% volt polimorf. A genetikai távolságmátrix alapján szerkesztett dendogram (6. ábra) kiértékelésénél azt tapasztaltuk, hogy a referenciaként használt napraforgók egy távoli csoportot alkottak, tehát a módszer helyes eredményre vezetett. Az USA-ból származó négy parlagfű egymással szoros kapcsolatot mutatott, de a többi egyedtől elkülönültek. A hármas és négyes számú Hódmezővásárhely környéki parlagfű két kanadai mintához állt a legközelebb. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak. Ezek alapján azt feltételezzük, hogy Magyarországra Kanadából is érkeztek parlagfűmagok. Nagyon valószínű azonban az is, hogy az amerikai kontinensről több forrásból történt a fertőzés. A magyarországi parlagfű populáció származásának pontosabb felméréséhez szükségesnek látjuk, hogy több populációt is megvizsgáljunk Észak-Amerikából és Európából. Anyagi okok azonban, nem tették lehetővé ezt a nagyobb szabású kutatást. A populációgenetikai vizsgálatokban a rokon fajok közötti és fajon belüli genetikai távolságok elemzésére az organellum-genom felhasználása széleskörű. A parlagfű organellum-DNS jellemzéséhez egy viszonylag egyszerű és költség hatékony módszert, a PCR-RFLP-t adaptáltuk. Meghatároztuk azokat a nem kódoló kloroplasztisz és mitokondrium régiókat, amelyek megbízhatóan amplifikálhatóak. Bizonyítottuk, hogy ezekben a szekvenciákban restrikciós enzimekkel polimorf nukleotidokat lehet kimutatni. Ezek az SNP-k utalhatnak az adott növény származására, mivel ezek a markerek anyai öröklést mutatnak és a pollennel nem terjednek. A módszer további előnye, hogy jól ismételhető és több labor eredményei is összevethetőek. A parlagfű populáció genetikai vizsgálatához, szükség lenne egy nemzetközi összefogásban 68

elvégzett kutatásra, amely vizsgálná Amerika és Európa fertőzött területeit, így kirajzolódhatna az ürömlevelű parlagfű származásának és terjedésének genetikai térképe.

5.2 A parlagfű triazin-rezisztenciájának molekuláris genetikai háttere Mivel a gyomnövények közül az Amaranthus fajok (Hirschberg és McIntosh 1983), a Solanum nigrum (Goloubinoff és Edelmann 1984) és a Poa annua (Barros és Dyer 1988), triazin rezisztenciája is a psbA gén 264-es kódonján bekövetkezett egyetlen pontmutáció eredménye és Bottermann és Leemans (1988), majd Holt (1993) is felhívta a figyelmet e tulajdonság konzervált változékonyságára, ezért arra következtettünk, hogy a parlagfűben is ennek a génnek a mutációja okozhatja a triazin-rezisztenciát. A gén vizsgálatát az atrazin rezisztencia tesztek után 12 rezisztens és 36 fogékony fenotípusú parlagfüvön kezdtük el. A psbA gén szekvenálása során bebizonyosodott, hogy a parlagfűben csak egyetlen pontmutáció felelős a rezisztencia kialakulásáért a többi gyomnövényhez hasonlóan. A rezisztens és szenzitív génváltozatokat hordozó egyedek elkülönítésére a szekvenálásnál gyorsabb és egyszerűbb módszert is alkalmaztunk. A mutációra specifikus restrikciós enzimek segítségével megállapítható az egyed rezisztenciája. A BstX I-es enzim csak a rezisztens biotípusra jellemző génváltozatot vágja ketté, a Mae Ies enzim pedig csak a szenzitív allél változatot tudja hasítani. A restrikciós enzimek segítségével arra is tudtunk következtetni, hogy a rezisztens egyedekben a psbA gén heteroplazmásan van jelen. A még gyorsabb és nagy mintaszámban elvégezhető rezisztencia teszt kifejlesztése érdekében, a mutációra specifikus bi-PASA primereket terveztünk. A PCR reakciók egyértelműen mutatták a rezisztens és a szenzitív allélok jelenlétét. A bi-PASA kísérletek is alátámasztották a restrikciós emésztések eredményeit. A rezisztens egyedekben a szenzitív genotípusra jellemző fragmentum is amplifikálódott. Ezzel a módszerrel a rezisztencia megállapítása maximum két napot vesz igénybe és a vizsgálat bármely növényi részből elvégezhető. A psbA gén szekvenciája nagyon konzervatívnak mondható a növények között, így az álltalunk kifejlesztett bi-PASA primerek a gyomnövények nagy részében változtatás nélkül használhatóak lennének a rezisztencia teszt elvégzésére. Az így kapott gyors és pontos eredmények a gyomirtási tanácsadásnál is felhasználhatóak , akár parcella szinten is kimutatható a rezisztens gyomok jelenléte.

69

5.3 A parlagfű ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztenciája Irodalmi adatokból tudjuk, hogy az USA-ban már kialakultak ALS-gátló herbicidekkel szemben rezisztens parlagfű biotípusok. Nagy a valószínűsége, hogy a Magyarországon is termesztett ALS inhibitorokkal szemben rezisztens napraforgó fajták termesztése során vagy az egyoldalú szerhasználat miatt, hazánkban is kialakul a rezisztens biotípus. Az ALS-gátlókkal szembeni rezisztencia molekuláris genetikai hátterét ismerjük, az ALS génben következhet be öt olyan pontmutáció, amelyek a rezisztencia kialakulásához vezető aminosav cserével járnak. A különböző növényekben a rezisztenciát okozó aminosav cserék az ALS-A régióban a következők voltak: Ala122/Thr122, Pro197/Ser197, Ala205/Val205 az ALS-B régióban: Trp574/Leu574, Ser653/Thr653 (McNaughtona és mtsai 2005). Patzoldt és mtsai (2001) négy fogékony és két rezisztens parlagfüvet hasonlítottak össze az ALS-A és ALS-B szekvencia alapján. Arra a következtetésre jutottak, hogy a rezisztenciát ebben a populációban a Trp574-es aminosav (triptofán) leucinra cserélődése okozza. Zheng és mtsai (2005) szerint is a parlagfű ALS rezisztenciájának meghatározó oka a Trp574/Leu574 aminosav csere és a rezisztencia mértékét az is befolyásolja, hogy a mutáció heterozigóta vagy homozigóta formában van jelen az adott növényben. A rezisztenciát kiváltó mutáció kimutatásához szükséges az ALS-A és ALS-B régió szekvenciájának ismerete. A parlagfűben az ALS-A régió szekvenciáját Tranel és mtsai 2004-ben közölték, azonban az ALS-B régió teljes szekvenciáját a parlagfűben még nem publikálták. Célunk volt a magyarországi parlagfű minták ALS-A és ALS-B régióinak szekvenálása. A kísérletekbe referenciaként szintén bevontunk egy napraforgó fajtát és az ALS-A szekvenciát sikerült meghatároznunk egy kanadai mintából is. Tranel és mtsai (2004) az ALS-A szekvencia változékonyságát vizsgálták az USA három államában 24 db parlagfűben, 24 db bojtorján szerbtövisben és 10-10 db Amaranthus fajban (Amaranthus hybridus, Amaranthus tuberculatus). A legtöbb polimorfizmust a parlagfűben találták, a 24 egyedben 48 db SNP-t detektáltak. A két Amaranthus faj húsz egyedében összesen 7 polimorf nukleotid volt, a szerbtövisben nem fedeztek fel eltérést az egyedek között. Ez az eredmény is rámutat a parlagfű óriási genetikai változékonyságára, amelynek pontos okait még nem ismerjük. A hat magyarországi parlagfűben 19 különböző pontmutációt mutattunk ki a 264 bp nagyságú ALS-A szekvenciában. A két hódmezővásárhelyi mintában összesen öt egyedi polimorfizmust találtunk, míg a többi hazai mintában található nukleotid cserék az 70

amerikai mintákban is előfordultak. Az egyetlen aminosav cserét okozó mutáció a 2-es számú hódmezővásárhelyi parlagfűben alakult ki, ami a 192. aminosavat érintette. A napraforgó mintában 5 olyan SNP volt, amit a parlagfüvekben nem tudtunk kimutatni. Az ALS-B régiót négy Magyarországi parlagfűből és egy napraforgóból klónoztuk, majd szekvenáltuk. A parlagfű ALS-B régióját Amerikában már vizsgálták, azonban a teljes régió szekvenciáját ebben a dolgozatban közöljük először. Ebben a régióban két ALS-gátlókra rezisztenciát okozó mutáció lehetséges (Trp574/Leu, Ser653/Thr), melyek közül egyik sem volt megtalálható az ALS-B szekvenciákban. A Ser653/Ala aminosav cserét minden vizsgált egyedben kimutattuk, melyet Patzoldt és mtsai (2001) is felfedeztek amerikai parlagfüvekben, de ez nem okozott rezisztenciát a vizsgálataik szerint. A keszthelyi 2-es számú mintában a 245-ödik és a 292-edik nukleotidnál bekövetkezett pontmutációk az aminosav sorrend megváltozását is eredményezték. Az egy növényre eső polimorf nukleotidok száma az ALS-A és ALS-B régiókban közel azonos volt, tehát a mutációk valószínűsége nem tér el a két szekvenciában. A napraforgó esetében azt tapasztaltuk, hogy az ALS-B régió nagyobb eltérést mutat a parlagfű szekvenciáktól. Négyszer több polimorf nukleotid volt az ALS-B, mint az ALSA régióban. A szekvencia adatok ismeretében, már lehetséges az öt kulcsfontosságú mutációra bi-PASA primereket tervezni és így lerövidíteni a rezisztencia megállapításának idejét. Ezt a következő lépést az is megvalósíthatóvá teszi, hogy a szekvencia adatokból kiderült a rezisztenciáért felelős mutációk környékén konzervatív nukleotid sorrendű szakaszok találhatók. Ezekre a szekvenciákra nagy biztonsággal tervezhetőek az allél specifikus primerek. A módszerből fakadó további előny lenne, hogy egyetlen vizsgálattal megállapítható az, hogy a rezisztenciáért felelős mutáció heterozigóta vagy homozigóta formában van-e jelen. Ez befolyásolja a rezisztenca mértékét, így például egy rezisztens heterozigóta populációban még szerkombinációban érdemes lenne kijuttatni az ALS-gátló herbicideket, de egy homozigóta populációnál már teljesen felesleges és káros. A genetikai információkra alapozott gyomirtási tanácsadás a jövőben új, ígéretes iránya lehet a növényvédelemnek. A dolgozatban közölt eredmények és vizsgálati módszerek lehetővé teszik, a Magyarország területén megjelenő, ALS-gátló herbicidekkel szemben rezisztens parlagfű biotípus, gyors azonosítását és a rezisztencia genetikai okainak feltárását. Ez az időben történő detektálás jelentősen hozzájárulhat az ALS inhibitorokkal szemben rezisztens biotípus terjedésének a csökkentéséhez. 71

5.4 Az Amb a I géncsalád molekuláris genetikai vizsgálata szekvencia specifikus primerekkel A parlagfű pollenallergia jelentős humán egészségügyi és ezzel gazdasági károkat okoz Magyarországon és a világban. Az allergia kialakulásáért 90%-ban az Amb a I fehérje felelős (Lockey és Ledford 2008). Ezt a 38 kDa nagyságú fehérjét az Amb a I géncsalád kódolja és eddig a génnek négy változatát írták le cDNS szinten. A gén pontosabb megismeréséhez és a gén magyarországi változatainak feltérképezéséhez végeztünk vizsgálatokat szekvenci specifikus primerekkel. Rafnar és mtsai (1991) által a gén kódoló szekvenciájára tervezett primerekkel (RW38, RW45) valószínűleg sikerült a gén első felének a felszaporítása a magyarországi mintákból. A primerek által közrefogott régió mérete a cDNS szekvenciában 530 bp, de kísérleteinkben 630 bp méretű termék keletkezett. Azt feltételezzük, hogy ebben a régióbn egy 100 bp méretű intron lehet, a genomi DNS szekvenciában. A feltevésünk igazolására szükségesnek látjuk ennek a 630 bp méretű terméknek a szekvenálását, erre azonban a dolgozat elkészültéig nem volt módunk. A teljes Amb a I gén amplifikálása nem

sikerült

a

genomi

DNS-ből

az

RW38+RW32.1,

RW38+RW32.2

és

RW38+RW32.3 primer-kombinációkkal sem. Ennek okát abban látjuk, amire Rafnar és mtsai (1991) is felhívták a figyelmet a Southern-blot analízis eredményeiből következtetve, hogy az Amb a I géncsalád valószínűleg több helyen szétszórva van kódolva a parlagfű genomban. A magyarországi génváltozatok feltérképezéséhez megpróbáltunk az Amb a I gén első felének három változatára specifikus primereket tervezni a PrimerSelect programmal. Az Amba1-2E+Amba1K, Amba1-2E+Amba2K és Amba3E+Amba 3K primer párok valószínűleg a gén első felét amplifikálják, hasonlóan az RW38+RW45 primerekhez. A tervezett primerek nem bizonyultak specifikusnak az Amb a I.1, Amb a I.2 és Amb a I.3 génváltozatokra és több termék is keletkezett a várt 630 bp méretű mellett. A parlagfű genetikai változékonysága itt is megnehezítette a munkánkat. A keletkezett termékek klónozása és szekvenálása adhatna csak pontos választ a kísérletekben kapott eredményekre. A Primer3 programmal tervezett specifikus primerek tesztelésénél sem kaptunk egyértelmű eredményeket. Az Amba1P530+Amba1P1172 primer pár az Amb a I.1 gén második felének cDNS szekvenciájára specifikus. A vizsgált parlagfű mintákban RAPD jellegű mintázatot kaptunk ezzel a primer kombinációval. Ugyanezt az eredményt

72

mutatták az Amb a I.1 génváltozat közepére tervezett Amba1P298+Amba 1P968 primerek

is.

Az

Amba1-2P224+Amba1-2P891

és

Amba3P232+Amba3P899

primerpárok, amiket az Amb a I.2 és Amb a I.3 génváltozatok közepének a felszaporításához terveztünk nem amplifikáltak specifikus terméket. Az új generációs szekvenálási eljárásokkal a parlagfű teljes genomja pár hét alatt megismerhető lenne. A teljes parlagfű DNS szekvencia ismeretében az egészségügyi (Amb a I, Amb 2 - Amb 9) és gyomirtási szempontból fontos gének egyszerűen izolálhatóak lennének. Új herbicid rezisztens biotípusok megjelenésekor, más fajokból ismert herbicid rezisztencia gén szekvenciák alapján, a gén parlagfű homológja gyorsan azonosítható lenne és a DNS szintű rezisztencia tesztek kidolgozása is megvalósulhatna.

73

7. Összefoglalás A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) a legveszélyesebb allergén és legelterjedtebb gyomnövényünk. Az utóbbi években kifejlesztett molekuláris genetikai módszerek lehetővé teszik, hogy olyan parlagfű-specifikus ismereteket szerezzünk, melyek a védekezés új eljárásainak kifejlesztését teszik lehetővé. A rengeteg, orvos-biológiai vonatkozású kutatás mellett, az allergiát kiváltó növény molekuláris genetikai megismerésére nemcsak hazai, de világviszonylatban sem fordítanak kellő hangsúlyt. Ilyen értelemben a jelen munka úttörő jellegű. Egy átfogóbb kutatási program részeként a célunk volt, hogy a parlagfűről minél több molekuláris genetikai információt gyűjtsünk, amelyek felhasználhatóak gyombiológiai vizsgálatokhoz, így parlagfű populációk filogenetikai összehasonlításához, a triazinokkal és az ALS-gátló herbicidekkel szembeni rezisztencia gyors DNS szintű meghatározásához és az Amb a I géncsalád pontosabb megismeréséhez. A parlagfű amerikai, kanadai, Kelet- és Nyugat-magyarországi populációinak molekuláris genetikai vizsgálata során anyai öröklésű markereket fejlesztettünk PCRRFLP módszerrel. A kloroplasztisz és a mitokondrium DNS-éből nem kódoló régiókat szaporítottunk fel univerzális primerekkel és ezeket a szekvenciákat restrikciós enzimekkel emésztettük. Az így kapott markerek utalhatnak az adott növény származására, mivel ezek a markerek anyai öröklést mutatnak és a pollennel nem terjednek. A genetikai távolságmátrix alapján az USA-ból származó négy parlagfű egymással szoros genetikai kapcsolatot mutatott, de a többi egyedtől különálló csoportot alkottak. Genetikai értelemben két kanadai és két Hódmezővásárhely környéki parlagfű is közel állt egymáshoz. A többi minta viszonylag kis genetikai távolságra volt egymástól, de a gyűjtési helyük szerint párokat alkottak. Ezek alapján azt feltételezzük, hogy Magyarországra Kanadából is érkeztek parlagfűmagok. Nagyon valószínű azonban az is, hogy az amerikai kontinensről több forrásból történt a fertőzés. Két fontos herbicidcsoport; a triazinok és az ALS-gátlók célgénjét jellemeztük a parlagfűben. Bizonyítottuk, hogy az atrazin rezisztencia oka a parlagfűben - más gyomnövényekhez hasonlóan - a psbA gén egyetlen pontmutációja. A rezisztens és szenzitív génváltozatokat BstX I-es és Mae I-es restrikciós enzimekkel el tudtuk különíteni és kimutattuk, hogy a rezisztens növényekben a psbA gén heteroplazmásan van jelen. Gyors és nagy mintaszámban végezhető rezisztencia teszt kifejlesztése

74

érdekében a mutációra specifikus bi-PASA primereket terveztünk. A PCR reakciók egyértelműen mutatták a rezisztens és a szenzitív allélok jelenlétét. Az ALS gén A és B régióját szekvenáltuk magyarországi parlagfüvekből és a Nova napraforgó fajtából. Meghatároztuk a nukleotid és aminosav szintű polimorfizmusokat a parlagfüvek között és a napraforgó és parlagfű minták között is. Megállapítottuk, hogy a szekvenciákban nem találhatóak meg azok a nukleotid polimorfizmusok (SNP), amelyek

a

rezisztenciát

okozó

aminosav

cseréket

okozták

a

különböző

gyomnövényekben. Ezeknek a szekvenciáknak az ismeretében az ALS-gátlókra rezisztens parlagfű biotípus magyarországi megjelenése előtt, lehetőségünk van az öt kulcsfontosságú pontmutációra bi-PASA primereket tervezni és így lerövidíteni a rezisztencia megállapításának az idejét. A parlagfű pollenallergia legfőbb kiváltója az Amb a I fehérje, ezt a fehérjét az Amb a I gén kódolja. A gén kódoló cDNS szekvenciáját, már meghatározták és eddig négy változatát írták le (Rafnar és mtsai 1991,Griffitha és mtsai 1991). Az Amb a I gén magyarországi génváltozatait kívántuk meghatározni. A magyarországi mintákból a gén első felének felszaporítása valószínűleg sikerült a cDNS szekvencia specifikus primerekkel. A génváltozatokra specifikus primerekkel nem kaptunk egyértelmű eredményeket. Ez magyarázható a géncsalád nagy genetikai változékonyságával és azzal, hogy a parlagfű genomban több helyen és több részletben lehet kódolva az Amb a I fehérje.

75

7.

Irodalomjegyzék

Al-Janabi S.M., McClelland M., Petersen C., Sobral B.W.S. (1994) Phylogenetic analysis of organellar DNA sequences in the Andropogoneae: Saccharinea. Theor. Appl. Genet. 88: 933-944. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E.W., Lipman D. J. (1990) "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215: 403-410. Barros M. és Dyer T. (1988) Atrazine rezistance in the grass Poa annua is due to a single base change in the chloroplast gene for the D1 protein of photosystem II. Theor. Appl.Genet. 75: 610-616. Basset I. J. és Crompton C. W. (1971) The biology of Canadian weeds. Ambrosia artemisiifolia L. and A. psilostachya. DC. Can. J. Plant Sci. 55: 463-476. Berzsenyi Z. (2000) Rezisztencia a különböző herbicid csoportokkal szemben. In: Hunyadi K., Béres I., Kazinczi G. Gyomnövények, gyomirtás, gyombiológia Mezőgazda Kiadó, Budapest Béres I. (1981) A parlagfű (Ambrosia artemisiaefolia L.) hazai elterjedése, biológiája és a védekezés lehetőségei. Kandidátusi értekezés, Keszthely Béres I. és Hunyadi K. 1980. A parlagfű biológiája. Növényvédelem 16: 109-116. Béres I., Novák R., Hoffmanné Pathy Zs., Kazinczi G. (2005) Az ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiaefolia L.) elterjedése, morfológiája, biológiája, jelentősége éa a védekezés lehetőségei. Gyomnövények, Gyomirtás VI.1: 1-47 Bíró E. (2003) A fővárosi parlagfűprogram bemutatása. 48. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest, 128. Bohár Gy., Vajna L., Kiss L. (2001) Egy Phyllachora faj okozta járvány a parlagfüvön Magyarországon. Agrofórum. 11: 24-26. Bock R. és Hagemann R. (2000) Extracellular inheritance: plastid genomics: manipulation of plastid genomes and biotechnology apparatus. Prog. Bot. 6: 76–90. Botterman J. és Leemans J. (1988) Engineering of herbicide resistance in plants. Biotech Gen Eng Rev 6: 321-340. Botstein D., White R. L., Skolnick M., Davis R. W. (1980) Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphisms. Am. J. Hum. Genet. 32: 314–331 Cheung W., Cote J., Benoit D., Landry B. (1993) A rapid assay for chloroplast-encoded triazine resistance in higher plants. Plant. Mol. Biol. Rep. 11: 142-155

76

Clegg M.T., Rawson J. R. Y., K. Thomas (1984) [Pennisetum americum] Chloroplast DNA variation in pearl millet and related species. Genetics 106: 449–461. Cipriani G., R. Testolin, R. Gardner. 1998. Restriction-size variation of PCR-amplified chloroplastDNA regions and its implication for the evolution and taxonomy of Actinidia. Theor. Appl. Genet. 96: 389–396. Crocker W. (1916) Mechanism of dormancy in seeds. Amer. J. Bot., 3: 99-103. Cseh A. (2004) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) molekuláris genetikai vizsgálata. Diplomadolgozat, Keszthely Cserháti E. (2006) Gyermekkori allergiás (atópiás) megbetegedések. Hippocrates VIII. 1: 28-35. Demesure B. N., Sodzi R. J., Petit R. (1995) A set of universal primers for amplification of polymorphic non-coding regions of mitochondrial and chloroplast DNA in plants. Molecular Ecology 4: 129-131. Dickerson C. T. (1968) Studies on the germination, growth, development and controll of common ragweed (Ambrosia altemisiifolia L.) Univ. Microfilms Inc. Ann. Arbor. Mich. 162. Dickerson C. T. és Sweet R. D. (1971) Common ragweed ecotyp Weed Sci. 19: 64-66. Dumolin-Lapegue S., Bodenes C., Petit R. J. (1996) Detection of rare polymorphisms in mitochondrial DNA of oaks with PCRRFLP combined with SSCP analysis. For. Genet. 3: 227-230. Felsenstein J. (2007) PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.6. Manual Distributed by the author. Department of Genome Sciences, University of Washington, Seattle Frey J.E., Müller-Schärer H., Frey B., Frei D. (1999) Complex relation between triazine-susceptible phenotype and genotype in the weed Senecio vulgaris may be caused by chloroplast DNA polymorphism. Theor. Appl. Genet. 99: 578-586. Gaudet M., Fara A-G., Sabatti M., Kuzminsky E., Mugnozza G. M. (2007) Singlereaction for SNP Genotyping on Agarose Gel by Allele-specific PCR in Black Poplar (Populus nigra L.) Plant Mol. Biol. Rep. 25: 1–9. Gebben A. I. (1965) The ecology of common ragweed (Ambrosia altemisiifolia L.) in Southeastern Michigan, Univ. Microfilms Inc. 234. Genton B. J., Shykoff J . A., Giraud T. (2005): High genetic diversity in French invasive populations of common ragweed, Ambrosia artemisiifolia, as a result of multiple sources of introduction. Molecular Ecology 14: 4275-4285. 77

Goeden R. D., Kovalev O. V., Ricker D. W. (1974) Arthropods exported from California to the U.S.S.R. for ragweed control. Weed Sci. 22: 156-158. Goloubinoff P. és Edelman M. (1984) Chloroplast-encoded atrazine resistance in Solanum nigrum: psbA loci from susceptible and resistant biozypes are isogenic except for a single codon change. Nucleic Acids Res. 12: 9489-9496. Gray M. W. (1989) The evolutionary origins of organelles. Trends Genet 5: 294–299. Griffitha I. J., Pollocka

J., Klapperb D. G., Rogersa B. L., Naulta A.K. (1991)

Sequence Polymorphism of Amb a I and Amb a II, the Major Allergens in Ambrosia artemisiifolia (Short Ragweed). Int. Arch. Allergy. Immunol. 96: 296-304. Gutteri M. J., Eberlein C. V., Mallory-Smith C. A., Thill D. C. (1996) Molecular genetics of target-site resistance to acetolactate synthase inhibiting herbicides. Molecular Genetics and Evolution of Pesticide Resistance, Washington, 10-16. Hartmann F., Hoffmanné P. Zs., Tóth Csantavéri Sz. (2003) A parlagfű (Ambrosis artemisiifolia L.) atrazinrezisztens biotípusának országos elterjedése. Növényvédelem 39: 313-318. Hayashi K., Shiina T., Ishii N., Iwai K., Ishizaki Y., Morikawa K., Toyoshima Y. (2003) A role of the –35 element in the initiation of transcription at psbA promoter in tobacco plastids. Plant Cell Physiol. 44(3): 334-341. Hegi G. (1960) Illustrierte Flora von Mittel-Europa. 6., Lehmanns Verlag, München. 496-498. Heifetz P. (2000) Genetic engineering of chloroplast. Biochemie 82: 655–666. Hiratsuka J., Shimada H., Whittier R., Ishibashi T., Sakamoto M., Mori M., Kondo C., Honji Y., Sun C-R., Meng B-Y., Li Y-Q., Kanno A., Nishizawa Y., Hirai A., Shinozaki K., Sugiura M. (1989) The complete sequence of the rice (Oryza sativa) chloroplast genome: Intermolecular recombination between distinct tRNA genes accounts for a major plastid DNA inversion during the evolution of the cereals. Molecular and General Genetics 217: 185-194. Holt J. S., Powels S.B., Holtum A. M. (1993) Mechanisms and agronomic aspects of herbicide resistance. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 44: 203-229. Heszky L., Fésüs L., Hornok L. (2005) Mezőgazdasági biotechnológia. Agroinform, Budapest Hultquist S. J., Vogel K. P., Lee D. J., Arumuganathan K., Kaepwithin S. (1997) DNA content and chloroplast DNA polymorphisms among switchgrasses from remnant midwestern prairies. Crop Sci. 37: 595–598. 78

Hunyadi K. (1988) Szántóföldi gyomnövények és biológiájuk. Mezőgazdasági Kiadó, Budapest. Igloi G. L. és Kössel H. (1992) The transcriptional apparatus of chloroplasts. Crit Rev Plant Sci 10: 525-558. Igrc J., Deloach C. J., Zlof V. (1995) Release and establishment of Zygogramma saturalis F. (Coleoptera: Chrysomelidae) in Croatia for control of common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.). Biological control 5: 203-208. Juhász M. és Juhász I. E. (2002) A hazai gyomnövények aeropollinológiai jelentősége. Környezeti ártalmak és a Légzőrendszer XII., Hévíz 149-160. Jensen K. I. N. és Bandeen J. D. (1979) Triazine resistance in annual weeds. CibaGeigy Agrochem. Monogr. 55–57. Kazinczi G. (2004) Vírusok alternatív gazdái: gyomnövények. Akadémiai doktori értekezés, Keszthely. Kazinczi G., Béres I., Novák R., Karamán J. (2009) Újra fókuszban az ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) Növényvédelem 8: 389-403. Kádár A. (2001) Vegyszeres gyomirtás és termékszabályozás. Factum Bt. Kiadó, Budapest Kim J. M., Christopher D. A., Mullet J. E. (1993) Direct evidence for selective modulation of psbA, rpoA, rblC and 16S RNA stability during barley chloroplast development. Plant Mol. Biol. 22: 447-463. Kiss E. 1999. Növényi Molekuláris Genetika I. Egyetemi Jegyzet, Gödöllő 88-92. Kiss L. (2007) Is Puccinia xanthii a suitable biological control agent of Ambrosia artemisiifolia? Biocontrol Science and Technology 17: 535-539. Kiss L. és Béres I. (2006) Anthropogenic factors behind the recent population expansion of common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) in Eastern Europe: is there a correlation with political transitions?, Journal of Biogeography, 33, 12: 21542157. Kiss L., Vajna L., Bohár GY. (2001) A parlagfű rejtélyes betegsége. Élet és tudomány 32: 1012-1014. Kiss L., Vajna L., Bohár GY. (2003) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) elleni biológiai védekezés lehetőségei. Növényvédelem 39: 319-331. Kosikova P. G. (1960) Germination of seeds of several species of several of several species of weeds and ruderal plants after treatment with solutions of gibberellic acid of various concentrations. Doklady Akad. Nauk. SSSR. Bot. Sci. Sect., Amer. Inst. 79

Biol. Sci. 13: 45-47. Lengyel G. (1923) Az Ambrosia artemisiifolia előfordulása Magyarországon. Botanikai Közlemények 21: 100. Liu Q., Thorland E. C., Heit J. A., Sommer S. S.

(1997) Overlapping PCR for

Bidirectional PCR Amplification of Specific Alleles: A Rapid One-Tube Method for Simultaneously Differentiating Homozygotes and Heterozygotes Genome Research 7: 389-398. Lockey R. F., Ledford D. K. (2008) Allergens and allergen immunotherapy, fourth edition (Clinical Allergy And Immunology) Book: 131-132. Maguire J. D. és Overland A. (1959) Laboratory germination of seed of weedy and native plants. Washington, Agr. Exp. Sta. Circ. 319: 15. Maier R. M., Neckermann K., Igloi G. L., Kössel H. (1995) Complete Sequence of the Maize Chloroplast Genome: Gene Content, Hotspots of Divergence and Fine Tuning of Genetic Information by Transcript Editing Journal of Molecular Biology 251: 614628. Makra L., Juhász M., Borsos E., Béczi R. (2004) Meteorological variables connected with airborne ragweed pollen in Southern Hungary. Int J Biometeorol 49: 37–47. Mayfield S. P., Yohn C. B., Cohen A., Danon A. (1995) Regulation of chloroplast gene expression. Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 46: 147-166. Mátyás Cs., (2002) Erdészeti-természetvédelmi genetika Mezőgazda Kiadó, Budapest McNaughtona K. E., Letartea J., Leea E. A., Tardifb F. J. (2005) Mutations in ALS confer herbicide resistance in redroot pigweed (Amaranthus retroflexus) and Powell amaranth (Amaranthus powellii). Weed Science 53(1): 17-22. Moesz G. (1926) Néhány érdekesebb növény újabb előfordulása. Botanikai Közlemények. 23: 184-186. Nei M. (1975) Molecular Population Genetics and Evolution. North-Holland, Amsterdam. Nei M. és Li W. H. (1979) Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proceedings of the National Acadademy of Science USA 76: 5269-5273. Nékám K. és Páldy A. (2008) Burden of ragweed allergy in Hungary. First Internat. Ragweed Conf. Budapest 2008, 25.

80

Németh I. (2000). A szántóföldi, kertészeti, erdészeti és élősködő gyomfajok jellemzése. In: Gyomnövények, gyomirtás, gyombiológia (szerk. Hunyadi K., Béres I., Kazinczi G.), Mezőgazda Kiadó 2000, 102-104. Novák R., Dancza I., Szentey L., Karamán J. (2009) Magyarország szántóföldjeinek gyomnövényzete.

Ötödik

Országos

Szántóföldi

Gyomfelvételezés.

Témadokumentáció, Budapest Parducci, L., and A.E. Szmidt. (1999) PCR-RFLP analysis of cpDNA in the genus Abies. Theor. Appl. Genet. 98: 802–808. Patzoldt W. L., Tranel P. J., Alexander A. L., Schmitzer P. R. (2001) A common ragweed population resistant to cloransulam-methyl Weed Science 49: 485-490. Perez de la Rosa, J., S.A. Harris, A. Farjon. (1995) Noncoding chloroplast DNA variation in Mexican pines. Theor. Appl. Genet. 91: 1101–1106. Petit R.J., Demesure B., Dumolin S. (1998) cpDNA and mtDNA primers in plants. In Molecular tools for screening biodiversity. Edited by A. Karp, P.G Isaac, and D.S. Ingram. Chapman and Hall, London. 256–261. Pillay M. és Hilu K.W. (1990) Chloroplast DNA variation in diploid and polyploid species of Bromus (Poaceae) subgenera Festucaria and Ceratochloa. Theor. Appl. Genet. 80: 326–332. Rafnar T., Griffiths I. J., Kuos M-c., Bonds J. F., Rogers B. L., Klapper D. G. (1991) Cloning of Amb a I (Antigen E), the major allergen family of short ragweed pollen. The Journal of Biological Chemistry 2: 1229-1236. Reith M. és Straus N. (1987) Nucleotide sequence of the chloroplast gene resposible for triazine resistance in Canola. Theor. Appl. Gen. 73: 357-363. Reznik S. Y., Belokobylskiy S. A., Lobanov A. L. (1994) Weed and herbivorous insect population densities at the broad spatial scale – Ambrosia artemisiifolia L. and Zygogramma saturalis F. (Col., Chrysomelidae). Journal of Applied Entomology 118: 1-9. Rios D. R., Saione H., Robredo C., Acevedo A., Colombo N., Prina R. A. (2003) Isolation and molecular characterization of atrazine tolerant barley mutants. Theor. Appl. Genet. 106: 696-702. Rozen S. és Skaletsky J. H. (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, 365-386.

81

Sathasivan K., Haughn G. W., Murai N. (1990) Nucleotide sequence of a mutant acetolactate synthetase gene from an imidazolinone – resistant Arabidopsis thaliana var. Nucleic Acids Res. 18: 2188. Scarabela L., Carrarob N., Sattina M., Varotto S. (2004) Molecular basis and genetic characterisation of evolved resistance to ALS-inhibitors in Papaver rhoeas. Plant Science 166(3): 703-709. Schermann Sz. (1966) Magismeret I. Akadémia Kiadó, Budapest 453-454. Schmelzer K. és Wolf I. (1977) Wirtspflanzen und ihre Viren, Virosen und Mykoplasmosen.

In:

Klinkowski,

M.

Pflanzliche

Virologie,

Registerband,

Verzeicnisse und Übersichten zu den Virosen in Europa. Akademie Verlag, Berlin 53189. Shen Y., Danon A., Christopher D. (2001) RNA binding-proteins interact specifically with the Arabidopsis chloroplast psbA mRNA 5’ untranslated region in a redoxdependent manner. Plant Cell. Physiol. 42(10): 1071-1078. Shusei S., Nakamura Y., Kaneko T., Asamizu E., Tabata S. (1999) Complete Structure of the Chloroplast Genome of Arabidopsis thaliana. DNA Research 6(5): 283-290. Staub J. M. és Maliga P. (1993) Accumulation of D1 polypeptid in tobacco plastids is regulated via the unstranlated region of the psbA mRNA. EMBO J 12: 601-606. Steinback K., McIntos L., Bogorad L.,Arntzen C. (1981) Identification of the triazine receptor as a chloroplast gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 7463-7467. Sneath P. H. A. és Sokal R. R. (1973) Numerical Taxonomy. WH Freeman, San Francisco Sokal R. R. és Michener C. D. (1958) A statistical method for evaluating systematic relationship. University of Kansas, Scientific Bulletin 38: 1409-1438. Szentey L., Tóth Á., Dancza I. (2004) Közös érdekünk, a parlagfűmentes Magyarország, Növény- és Talajvédelmi Központi Szolgálat 3-27. Szigetvári Cs. és Benkő Zs. R. (2004): Ürömlevelű parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.). In: Mihály B. és Botta-Dukát Z. Biológiai inváziók Magyarországon Özönnövények. Természetbúvár Alapítvány Kiadó, Budapest 337-370. Takács A., Bicsák B., Horváth J., Kazinczi G. (2002) A parlagfű vírusellenállóságának vizsgálata. 12.Növényvédelmi Fórum, Keszthely 46. Takács A., Horváth J., Kazinczi Gabriella, Pribék D. (2001) A parlagfű vírusellenállóságának vizsgálata. 47. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest 113. 82

Tímár L. (1955) Egy veszedelmes gyomkártevő előőrsei Szegeden. Délmagyarország, Szeged 18: 4. Thomzik J. E. és Hain R. (1988) Transfer and segregation of triazin-tolerant chloroplasts in Brassica napus L. Theor. Appl. Genet. 76: 165-171. Toole E. H. és Brown E. (1946) Final results of the Durvel buried seed experiment. J. Agric. Res. 72: 201-210. Tóth Á., Benécsné B. G., Béres I. (2001) Az allelopátia szerepe az Ambrosia artemisiifolia és a Cirsium arvense tömeges felszaporodásában Magyarországon. Gyomnövények, gyomirtás. 2: 21-29. Tóth Á., Hoffmanné P. Zs., Szentey L. (2004) A parlagfű (Ambrosia elatior) helyzet 2003-ban, Magyarországon. A levegő pollenszám csökkentésének nehézségei Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest, Öszefoglalók 69. Tranel P. J., Weilu J., Patzoldt W. L., Wright T. R. (2004) Intraspecific variability of the acetolactate synthase gene. Weed Science 52: 236-241. Tranel P. J. és Wright T. R. (2002) Resistance of weeds to ALS-inhibiting herbicides: what have we learned? Weed Science 50: 700–712. Taylor J. B., Loux M. M. Harrison S. K, Regnier E. (2002) Response of ALS-resistant common ragweed (Ambrosia artemisiifolia) and giant ragweed (Ambrosia trifida) to ALS-inhibiting and alternative herbicides.Weed Technology 16: 815–825. Ujvárosi M. (1957) Gyomnövények, gyomirtás Mezőgazdasági Kiadó, Budapest Vajna L. (2002) Downy mildew epidemic on common ragweed in Hungary caused by Plasmopara halstedii. Plant Pathology 51: 809. Vajna L., Bohár Gy., Kiss L. (2000) First report of Phyllachora ambrosiae in Europe causing epidemics on common ragweed. Plant Disease 84: 489. Varga K. és Kiss L. (2003) A parlagfű járványos megbetegedését okozó Phyllachora ambrosiae molekuláris azonosítása. 49. Növényvédelmi Tudományos Napok, Budapest 153. Van de Peer Y. és De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment Comput. Applic. Biosci. 10: 569-570. Velich I. (2001) Növénygenetika, Mezőgazda kiadó, Budapest Wagner W. H. és Beals T. F. (1958): Perennial ragweeds (Ambrosia) in Michigan, with the description of a new intermediate taxon. Rhodora 60: 178-204.

83

Walbot V. és Warren C. (1988) Regulation of Mu element copy number in maize lines with an active or inactive Mutator transposable element system. Mol. Gen. Genet. 211(1): 27-34. Warwick D. D. (1976) Plant variability in triazine resistance. Residue Rev., Springer Verlag, New York 65: 56-63. Willemsen R. W. és Rice E. L. (1972) Mechanism of seed dormancy in Ambrosia altemisiifolia American Journal of Botany 59: 248-257. Wolfe K.H., Li W. H., Sharp P. M. (1987) Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochondrial, chloroplast, and nuclear DNAs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 9054–9058. Wright T. R., Bascomb N. F., Sturner S. F., Penner D. (1998) Biochemical mechanism and molecular basis for ALS-inhibiting herbicide resistance in sugarbeet (Beta vulgaris) somatic cell selections. Weed Science 46: 13–23. Wu J., Krutovskii K. V., Strauss S. H. (1998) Abundant mitochondrial genome diversity, population differentiation and convergent evolution in pines. Genetics 150: 1605–1614 Yamazaki K., Imai C., Natuhara Y. (2000) Rapid population growth and food-plant exploitation pattern in an exotic leaf beetle, Ophraella communa LeSage (Coleoptera: Chrysomelidae), in western Japan. Applied Entomology and Zoology 35: 215-223. Yasunari O., Isono K., Kojima T., Endo A., Hanaoka M., Shiina T., Terachi T., Utsugi S., Murata M., Mori N., Takumi S., Ikeo K., Gojobori T., Murai R., Murai K., Matsuoka Y., Ohnishi Y., Tajiri H., Tsunewaki K. (2000) Chinese Spring Wheat (Triticum aestivum L.) Chloroplast Genome: Complete Sequence and Contig Clones Plant Molecular Biology Reporter 18: 243-253. Zheng D., Patzoldt W. L., Tranel P. J. (2005) Association of the W574L ALS substitution with resistance to cloransulam and imazamox in common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) Weed Science 53(4): 424-430. Zurawski G., Bohnert H. J., Whitfeld P. R., Bottomley W. (1982) Nucleotide sequence of the gene for the Mr. 32000 thylakoid membrane protein from Spinacea oleracea and Nicotiana debneyi predicts a totally conserved primary translation product of Mr 38950. Proc. Natl. Acad. Sic. USA 79: 7699-7703.

84

8.

Új tudományos eredmények

I. Meghatároztunk négy kloroplasztisz és öt mitokondrium nem kódoló DNS régiót, amelyek az univerzálisnak mondott primerekkel a parlagfűben is csak egyetlen PCR terméket amplifikálnak így alkalmazhatóak PCR-RFLP módszerrel végzett populáció genetikai vizsgálatokban. II. A megbízhatóan amplifikálható kloropasztisz és mitokondrium szekvenciákat kilenc restrikciós enzimmel emésztettük, így anyai öröklésű markereket fejlesztettünk. A markerek segítségével az Egyesült Államokból, Kanadából és Magyarországról származó parlagfűvek között meghatároztuk a genetikai távolságot. III. Szekvenáltuk a parlagfű psbA kloroplasztisz génjét az atrazin rezisztens és szenzitív egyedekből és bizonyítottuk, hogy a rezisztenciát a gén 790. bázispárjánál bekövetkezö pontmutáció (adenin/guanin) okozza. IV. Restrikciós emésztésekkel bizonyítottuk, hogy a psbA gén rezisztens és szenzitív változata is megtalálható a rezisztens parlagfüvekben, tehát a két kloroplasztisz genotípus heteroplazmásan van jelen. V. Bi-PASA allél specifikus primereket terveztünk a psbA gén rezisztens és szenzitív változatára, így az atrazin rezisztencia tesztek egyetlen PCR reakcióval elvégezhetőek. VI. Magyarországi parlagfüvekben és a Nova napraforgó hibridben szekvenáltuk és elemeztük az ALS-gátló herbicidek célgénjének A és B régióját. A parlagfű teljes ALS-B régió szekvenciáját ez a dolgozat közli először.

85

VII. A parlagfű pollen allergén fehérjéjét kódoló amb a I gén első felét valószínűleg amplifikáltuk szekvencia specifikus primerekkel magyarországi parlagfüvekből. Szekvencia specifikus primerekkel nem sikerült kimutatnunk a teljes gént, így közvetve bizonyítottuk a gén változékonyságát és azt, hogy a parlagfű genomban több helyen kódolt az Amb a I fehérje.

86

8. 1 New scientific results I. Four chloroplast and mitochondrial noncoding DNA regions were defined using universal primers which gave only one product in common ragweed, so they can be used for PCR-RFLP analysis. II. The reliably amplified chloroplast and mitochondrial sequences were digested using nine restriction enzymes, thus markers with maternal inheritence were developped. The markers were used to define the genetic distances between American, Canadian and Hungarian ragweeds. III. The ragweed chloroplast gene psbA was sequenced, both from atrazine resistant and sensitive individuals, and prouved that the resistence was caused by a point mutation at the 790th basepair (adenine/guanine). IV. The heteroplasmy (the presence of the resistant and sensitive forms of the gene in the resistant individuals) of the psbA gene was demonstrated. V. Bi-PASA allele-specific primers were designed to the resistant and sensitive forms of the psbA gene, which makes it possible to accomplish resistance tests by a single PCR reaction. VI. The A and B regions of the target gene of ALS inhibitor herbicides were sequenced and analysed in hungarian ragweeds and in the maize hybrid Nova. The complete sequence of the B region is described for the first time in the present work. VII.

The amb a I gene encoding the major allergen protein of the ragweed pollen was likely to be amplified using sequence specific primers from hungarian ragweeds. Sequence specific primers were unable to detect the complete amb a I gene, which suggested high gene variability and the presence of multiple copies of the gene in the ragweed genome.

87

9.

Köszönetnyilvánítás Köszönetemet szeretném kifejezni témavezetőmnek, Dr. Taller Jánosnak a szakmai

segítségéért, tanácsaiért, és munkám irányításáért. Köszönöm a Pannon Egyetem, Növénytudományi és Biotechnológai Tanszék Biotechnológia Laboratóriumban dolgozó kollégáimnak biztatásukat és segítségüket. Végül de nem utolsó sorban hálás vagyok Családomnak támogatásukért, amely nélkül ez a munka nem jöhetett volna létre.

88

10. Az értekezés témakörében megjelent publikációk, előadások Idegen nyelvű cikkek: Cseh A., Cernák I. and Taller J. (2009) Molecular characterization of atrazine resistance in common ragweed (Ambrosia artemisiifolia L.) Journal of Applied Genetics 50(4), 321–327. Impact factor 2008: 1.351 Cseh A. and Taller J. (2008) Genetic diversity of ragweed Ambrosia artemisiifolia L. a comparison of the maternally inherited cpDNA and mtDNA. Journal of Plant Diseases and Protection, Special Issue XXI, 389-394. Impact Factor 2008: 0.566

Idegen nyelvű előadások: Cseh A. and Taller J. (2007) Genetic diversity of ragweed Ambrosia artemisiifolia L. a comparison of the maternally inherited cpDNA and mtDNA. XIV. European Weed Research Society Symposium, Hamar, Norway 173. Cseh A., Cernak I. and Taller J., (2006) Molecular genetic analysis of the most dangerous invasive weed of Middle- Europe, Ambrosia artemisiifolia L. International Symposium Intractable Weeds and Plant Invaders, Ponta Delgada, Portugal 19.

Magyar nyelvű cikkek: Cseh András és Taller János (2008) Herbicid célgének molekuláris genetikai vizsgálata az ürömlevelű parlagfűben (Ambrosia artemisiifolia L.) Magyar Gyomkutatás és Technológia 9(2): 57-69. Cseh András és Taller János (2008) A parlagfű (Ambrosia artemisiifolia L.) genetikai diverzitásának vizsgálata az anyai öröklésű kloroplaszt és mitokondrium DNS-ének elemzésével. Magyar Gyomkutatás és Technológia 9(1): 56-57.

89

Magyar nyelvű előadások: Cseh A. és Taller J. (2008) Molekuláris genetikai vizsgálatok a parlagfűben. A Magyar Gyomkutató Társaság és a Pécsi Akadémiai Bizottság Növényorvosi Munkabizottsága konferenciája, Keszhely Taller J. és Cseh A. (2006) Hogyan járulhat hozzá a molekuláris genetika a parlagfű elleni védekezéshez? A Magyar Gyomkutató Társaság és a Pécsi Akadémiai Bizottság Növényorvosi Munkabizottsága konferenciája "A hazai gyomnövénykutatás legújabb eredményei", Keszthely

Más témákban megjelent publikációk, előadások Idegen nyelvű cikkek: Cseh A., Kruppa K., Molnár I. (2009) Incorporation of a winter barley chromosome segment into cultivated wheat and its characterization with GISH, FISH and SSR markers. Cereal Research Communications 37, 321-324. Csöndes I., Kadlicskó S., Cseh A. (2007) Susceptibility of different pepper varieties to Macrophomina phaseolina in field trials. Cereal Research Communications 35, 333-336. Impact Factor 2007: 1.190 Cseh A., Taller J., Podmaniczky P., Kocsis L. (2006) Comparative analysis of the most wide spread grapevine stock lines in the world, the Teleki lines, with microsatellite markers. Cereal Research Communications 34, 773-776. Impakt Faktor 2006: 1.030

90

Idegen nyelvű előadások: Molnár-Láng M., Szakács É., Molnár I., Kruppa K., Sepsi A., Cseh A., Dulai S., Aranyi N., Hoffmann B. (2009) Molecular cytogenetic identification, physical mapping and phenotyping of wheat-barley introgression lines. 8th International Symposium in the Series, Recent advances in plant biotechnology, Szeged, Hungary Cseh A., Kruppa K., Molnár I. (2009) Incorporation of a winter barley chromosome segment into cultivated wheat and its Characterization with GISH, FISH and SSR markers. VIII. Alps-Adria Scientific Workshop Neum, Bosnia-Herzegovina Csöndes I., Kadlicskó S., Cseh A. (2007) Susceptibility of different pepper varieties to Macrophomina phaseolina in field trials.VI. Alps-Adria Scientific Workshop, Obervellach, Austria Podmaniczky P., Győrffyné J. G., Cseh A., Taller J., Kocsis L. (2006) Genetic differences among roottstokcks derived from the Teleki’s seedlings. 9 International Conference on Grape Genetics and Breeding, Udine, Italy Cseh A., Taller J., Podmaniczky P., Kocsis L.(2006) Comparative analysis of the most wide spread grapevine stock lines in the world, the Teleki lines, with microsatellite markers. V. Alps-Adria Scientific Workshop, Opatija, Croatia

Magyar nyelvű cikkek: Kocsis L., Podmaniczky P., Cseh A., Miroslav B., Miroslav P., Cernak I., Győrffyné J. G., Taller J. (2009) Rokonsági viszonyok a Teleki magoncokból származó alanyok között. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 252-256. Kruppa K., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Árpa kromoszómák azonosítása új búza × árpa hibridek utódvonalaiban in situ hibridizáció és ssr-markerek segítségével. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 277-281.

91

Molnár I., Cseh A. Lángné Molnár M. (2009) Búza-Aegilops biuncialis 3M-4B centrikus fúzió és 3M(4B) szubsztitúciós vonal előállítása és molekuláris citogenetikai jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest, 337-341.

Magyar nyelvű előadások: Kocsis L., Podmaniczky P., Cseh A., Miroslav B., Miroslav P., Cernak I., Győrffyné J. G., Taller J. (2009) Rokonsági viszonyok a Teleki magoncokból származó alanyok között. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest Kruppa K., Cseh A., Lángné Molnár M. (2009) Árpa kromoszómák azonosítása új búza × árpa hibridek utódvonalaiban in situ hibridizáció és SSR-markerek segítségével. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest

Molnár I., Cseh A. Lángné Molnár M. (2009) Búza-Aegilops biuncialis 3M-4B centrikus fúzió és 3M(4B) szubsztitúciós vonal előállítása és molekuláris citogenetikai jellemzése. Hagyomány és haladás a növénynemesítésben. XV. Növénynemesítési Tudományos Napok, Budapest Cseh A., Csöndes I., Varga Zs., Taller J. és Fischl G. (2008) Genetikai vizsgálatok a Keszthely térségi fehér fagyöngy (Viscum album L.) és a Botryosphaerostroma visci populációiban. XIV. Növényvédelmi Tudományos Napok 2008, Budapest Cseh A, Varga Zs, Taller J, Cernák I, Fischl G (2006) Előzetes eredmények keszthely térségi fehér fagyöngy (Viscum album L.) populációk genetikai vizsgálatairól. XVI. Keszthelyi Növényvédelmi Fórum, Keszthely

92

11. Mellékletek 1. melléklet: Az Amb a I. gén három változatának cDNS szekvenciái (Rafnar és mtsai 1991). Amb a I.1 (1-1202 bp) 1 aatggggatc aaacactgtt gttacatctt gtattttacc ttagcccttg tcactttgct 61 gcaacctgtt cgttctgccg aagatctcca ggaaatctta ccagttaacg aaacaaggag 121 gctgacaaca agtggagcat acaacattat agacgggtgc tggaggggca aagccgattg 181 ggcggaaaac cgaaaagcgt tagccgattg tgcccaaggt tttgggaagg gaacagtggg 241 cggaaaagat ggtgatatat acacggtcac cagtgagcta gatgatgatg ttgcaaatcc 301 aaaagaaggc acactccggt ttggtgccgc ccaaaacagg cccttgtgga tcatttttga 361 aagagatatg gtgattcgtt tggataaaga gatggtggta aacagtgaca agaccatcga 421 tggccgaggg gcgaaagttg aaatcattaa cgctggtttc acccttaatg gtgtcaagaa 481 tgtaatcatt cataacataa atatgcatga tgttaaagtg aatccaggag gcctgattaa 541 gtccaacgat ggtccagcag ctccaagagc tggtagtgat ggtgatgcta taagtatttc 601 tggtagttca caaatatgga tcgaccattg ttcgctcagt aagtctgttg atgggctggt 661 agatgccaag ctcggcacca cacgcttaac cgtttccaac agcttattca cccaacacca 721 gttttactat tattcggggc tggtgacgaa aatattgaag atagaggcat gctagcaacg 781 gtcgctttca acacgttcac tgataacgtt gaccaaagaa tgcctagatg tcgacatggg 841 tttttccaag tcgttaacaa caactatgat aaatggggat cgtatgccat cggtggtagc 901 gcgtccccaa ccatactcag ccaagggaac agattctgcg cccccgatga acgcagcaag 961 aaaaatgtcc taggaaggca tggtgaagcc gccgcagagt cgatgaagtg gaactggaga 1021 acgaataaag acgtgcttga aaatggtgct atttttgttg catccggggt cgatccagtg 1081 ctaacccctg agcaaagcgc agggatgatt ccagccgaac caggagagtc cgctctaagc 1141 ctcactagta gtgctggtgt actctcatgc caacccggag caccttgcta agcacgccaa 1201 tt

93

Amb a I.2 (1-1332 bp) 1 caatggggat caaacactgt tgttacatct tgtattttac cttagccctt gtcactttgc 61 tgcaacctgt tcgttctgca gaagatgttg aagaattctt accttcagct aacgaaacaa 121 ggaggagcct gaaagcatgt gaagcacaca acattataga caagtgctgg aggtgcaaag 181 ccgattgggc gaataaccga caagcgttag ccgattgtgc ccaaggtttt gcaaagggaa 241 cctacggtgg aaaacatggt gatgtctaca cggtcaccag tgataaagat gatgatgttg 301 caaatccaaa agaaggcaca ctccggtttg ctgctgccca aaacaggccc ttgtggatca 361 tttttaaaag aaatatggtg attcatttga atcaagagct tgtcgtaaac agcgacaaga 421 ccatcgatgg ccgaggggtg aaagttaaca tcgttaacgc cggtctcacc ctcatgaatg 481 tcaagaatat aatcattcat aacataaata tccatgatat taaagtttgt ccaggaggca 541 tgattaagtc caacgatggt ccaccaattt taagacaaca aagtgatggt gatgctataa 601 atgttgctgg tagttcacaa atatggatcg accattgctc gctcagtaag gcttccgatg 661 ggctgctcga tatcaccctc ggcagctcac acgtgaccgt ttccaactgc aaattcaccc 721 aacaccaatt tgtattattg ctcggggctg atgacaccca ttatcaagat aaaggcatgc 781 tagcaacggt agcattcaac atgttcaccg atcacgttga ccaaagaatg cctagatgta 841 gatttgggtt tttccaagtc gttaacaaca actacgacag atggggaacg tacgccatcg 901 gtggtagctc ggccccaact atactcagcc aagggaacag attcttcgcc cccgatgata 961 tcatcaagaa aaatgtctta gcgaggactg gtactggcaa cgcagagtcg atgtcgtgga 1021 actggagaac agatagagac ttgcttgaaa atggtgctat ttttctccca tccgggtctg 1081 atccagtgct aacccctgag caaaaagcag ggatgattcc agctgaacca ggagaagccg 1141 ttctaagact cactagtagt gctggtgtac tctcatgcca tcaaggagca ccttgctaag 1201 cacctggcca attcctaagc tttttataat aatcataaat acttatttta ttttattttt 1261 gatattttat atgaaaccat tacgttcaag tactctatta acatgtttta aattcataag 1321 agtttattga t Amb a I.3 (1-1333 bp) 1 caacaatcat acaatgggga tcaaacaatg ttgttacatc ttgtatttta ccttagcact 61 tgtcgctttg ctgcaacctg ttcgttctgc cgaaggggtc ggggaaatct taccttcagt 121 taacgaaacg aggagcctgc aagcatgtga agcactcaac attatagaca agtgctggag 181 gggcaaagcc gattgggaga acaaccgaca agcgttagcc gactgtgccc aaggttttgc 241 aaagggaacc tacggcggaa aatggggtga tgtctacacg gtcaccagca atctagatga 301 tgatgttgca aatccaaaag aaggcacact ccggtttgct gccgcccaaa acaggccctt 361 gtggatcatt tttaaaaatg atatggtgat taatttgaat caagagcttg tcgtaaacag 421 cgacaagacc atcgatggcc gaggagtgaa agttgaaatc attaacggag gtctcaccct 481 catgaatgtc aagaatataa tcattcataa cataaatatc catgatgtta aagtgcttcc 541 aggaggcatg attaagtcca acgatggtcc accaatttta agacaagcaa gtgatgggga 601 tactataaat gttgctggta gttcccaaat atggatagac cattgctcac tcagcaagtc 661 tttcgatggg ctggtcgatg tcaccctcgg tagcacacac gtgaccattt ccaactgcaa 721 attcacccaa cagtcaaaag caatattgtt gggggcagat gacacccatg ttcaagataa 781 aggaatgcta gcaacggtcg ctttcaacat gttcaccgat aacgttgacc aaagaatgcc 841 tagatgtcga tttgggtttt tccaagttgt taacaacaac tacgacagat ggggaacgta 901 cgccataggt ggtagctcgg ccccaactat actctgccaa gggaacagat tcttggcccc 961 tgatgatcag atcaagaaaa atgtcctagc gaggactggt acaggcgctg ctgagtcgat 1021 ggcgtggaac tggagatctg ataaagactt gcttgaaaat ggtgctattt ttgttacatc 1081 tgggtctgat ccagtgctaa cccctgttca aagcgcaggg atgattccag ctgaaccagg 1141 agaagccgct ataaaactca ctagtagtgc tggtgtattc tcatgccgtc ctggagcacc 1201 ttgctaagca ccctgccaat tctcctaagc ttttgcaatg atcaaaaata cttttttatt 1261 ttatttttaa tattttatat gtactggaaa tgaaccatta ccttctagta ctctataaca 1321 tgttttgcat tta 94