doc. Ing. Richard Hrabal, CSc. NMR laboratoř, Vysoká škola chemicko-technologická v Praze, číslo dveří 42 telefon 220 443 805, e-mail
[email protected])
15. říjen 2015 základy NMR spektroskopie přístrojové vybavení návštěva laboratoře
22. říjen 2015 technologie využití NMR spektroskopie pro řešení prostorové struktury proteinů praktické příklady
Hlavní protagonisté Felix Bloch Kurt Wüthrich
Oleg Jardetsky
Edward M. Purcell Richard Ernst
Kurt Wüthrich
Nobel Price Winner in Chemistry 2002
G. Wagner, K. Wüthrich. 1982. Sequential resonance assignments in protein 1H nuclear magnetic resonance spectra. Basic pancreatic trypsin inhibitor. J. Mol. Biol. 155, 347-366.
Co lze pomocí NMR spektroskopie studovat na biomolekulách? • identifikace substrátu (kovalentní struktura) • prostorové uspořádání (vyšší typ struktury, sekundární, terciární…..) • dynamické vlastnosti (celé molekuly nebo jen vybrané části)
• schopnosti vzájemné interakce, event. interakce s jinými substráty • struktura komplexů, dynamika a rovnováha • vynikající metoda pro návrh nových typů léčiv (SAR)
Úvodní poznámky • NMR spektroskopie využívá magnetických vlastností jader atomů. • Absorpční (emisní) spektroskopie, podobně jako IČ nebo UV. Detekuje absorbci radiofrekvenčního záření jádry atomů v molekule. • Aktivní jsou pouze jádra se spinovým kvantovým číslem (I) 0. Tato jádra mohou absorbovat RF záření. • Sudé hmotové číslo & sudé atomové číslo I = 0 (12C, 16O) • Sudé hmotové číslo & liché atomové číslo I = celočíselný (14N, 2H, 10B) • Liché hmotové číslo I = polovinový (1H, 13C, 15N, 31P) • Spinové stavy jádra jsou kvantovány.
m = I, (I - 1), (I - 2), … , -I m je magnetické kvantové číslo.
• Pro 1H, 13C, 15N, 19F, 31P (nejběžnější měřená jádra) platí: I = 1/2 m = 1/2, -1/2 • To znamená, že tato jádra mohou zaujmout pouze dva stavy (energetické hladiny). • Další důležitou vlastností částic s nábojem je tzv. magnetický moment (m), který může být vyjádřen
m = g I h / 2p • Je to vektorová veličina, která má velikost a směr (nukleární magnet) • h je Planckova konstanta • g je gyromagnetický poměr (konstanta), která je závislá na povaze jádra. • Různá jádra mají různý magnetický moment.
Vliv externího magnetického pole Bo (jádra I = 1/2) • V základním stavu nejsou jaderné spiny uspořádané a neexistuje mezi nimi žádný energetický rozdíl. Jsou tzv. degenerované:
Bo= 0
• Vlivem silného externího magnetického pole dojde však k jejich uspořádání buď v souhlasném nebo opačném směru s ohledem na směr magnetického pole:
Bo
• Vždy existuje malý přebytek jader uspořádaných souhlasně se směrem externího magnetického pole než nesouhlasném.
Energie a populace spinových stavů • Vlivem externího magnetického pole dojde k vytvoření dvou hladin, mezi kterými je rozdíl v energii. Tyto hladiny jsou obsazeny souhlasně a nesouhlasně orientovanými jadernými spiny: b DE = h n
Bo > 0 a
Bo = 0
• Rozdíl v populaci jednotlivých stavů je dán rozdílem v jejich energiích a řídí se Boltzmanovým rozdělením:
Na / Nb = e
DE / kT
• DE pro 1H při 400 MHz (Bo = 9.5 T) je 3.8 x 10-5 Kcal / mol
Na / Nb = 1.000064 • Rozdíl v populacích je velmi malý ve srovnání s ostatními spektroskopickými metodami.
Zvyšující se rozdíl v populacích obou spinových stavů a a b pro jádro 1H v závislosti na externím magnetickém poli. Je-li stav b obsazen 106 spinů, stav a obsahuje106+přebytek. 21,14 T 900 MHz b 9,40 T 400 MHz Bo = 0
2,35 T 100 MHz Bo 16 spinů
a
64 spinů
135 spinů
Energie a citlivost • Energie (jednoho spinu) je přímo úměrná magnetickému momentu jádra a velikosti externího magnetického pole: E = - m . Bo E(up) = g h Bo / 4p --- E(down) = - g h Bo / 4p
DE = g h Bo / 2p •Energetický rozdíl mezi oběma stavy určuje intenzitu signálu, tj. citlivost měřeného jádra), •Větší magnety (vyšší Bo) způsobují vyšší citlivost NMR přístrojů. • Jádra s větší gyromagnetickou konstantou g absorbují více energie a jsou tudíž citlivější. Výsledná citlivost je úměrná m a Na - Nb, a magnetickému toku v RF cívce, což opět závisí na g, konkrétně g3.
g13C = 6,728 rad / G g1H = 26,753 rad / G
je ~ 64x citlivější než 13C jen z důvodu konstanty g
1H
• Přidáme-li k tomu nižší přirozené zastoupení 13C, citlivost tohoto jádra se sníží dokonce o faktor 6400 vzhledem k 1H.
Energie a frekvence • Energie je též přímo úměrná frekvenci elektromagnetického záření…
DE = h n
n = g Bo / 2p
DE = g h Bo / 2p
• Pro jádro 1H je tato frekvence při využití komerčně dostupných magnetů (2,35 – 23,49 T) v rozsahu 100-1000 MHz.
g-rays
10-10
x-rays
10-8
UV VIS
IR
m-wave radio (NMR)
10-6 10-4 10-2 wavelength (cm)
100
102
Precesní pohyb jader • Každé jádro má tzv. moment hybnosti I, který je vlastností všech (nejen magneticky aktivních jader). Jádro si lze potom představit rotující kolem vlastní z osy.
l
• Má-li jádro nenulový magnetický moment (I 0) dostaneme rotující atomový magnet. Interakcí s externím polem Bo vzniká kroutící moment. Bez ohledu na původní orientaci vektoru m, tento má vždy snahu orientovat se podle externího pole Bo. m
Bo
Bo nebo... m
m
Precesní pohyb jader (pokračování) • Precesní pohyb je výslednicí interakce síly, která se snaží přimět vektor m k souhlasné nebo nesouhlasné orientaci s vektorem Bo, a síly udržující jej v rotaci: wo
m Bo
• Vektor magnetického momentu vykonává precesní pohyb okolo osy z (směru externího magnetického pole). Frekvence tohoto pohybu se nazývá Larmorova frekvence a značí se w:
wo = 2pn
wo = - g Bo (radiany)
• Tento jev lze přirovnat k pohybu osy otáčejícího se setrvačníku pod vlivem gravitace. • Frekvence tohoto precesního pohybu je přímo úměrná rozdílu energií dvou spinových stavů, což lze odvodit na základě kvantové mechaniky.
Makroskopická magnetizace • Nyní je možné zavést pojem makroskopická magnetizace Mo, který je přímo úměrný rozdílu populací (Na - Nb), kdy byly příspěvky jednotlivých vektorů m zprůměrovány: z
z
Mo
x y
x
y
Bo
Bo
• Každý vektor m může být rozložen na složku v ose z a v rovině <xy>. Distribuce komponent v rovině <xy> je náhodná, takže se zprůměrují a navzájem vyruší. Velikost makroskopické magnetizace je potom dána rozdílem populací spinových stavů a a b (Na – Nb). • Mezi m and Mo je podstatný rozdíl. Zatímco m je kvantován (může se vyskytovat ve dvou stavech a a b ), Mo odráží stav celé populace spinů a představuje kontinuum.
NMR excitace • Nyní potřebujeme, aby systém absorboval energii. Zdrojem je oscilující elektromagnetické záření s frekvencí wo generované střídavým proudem : B1 = C * cos (wot) z
Mo Bo
B1
z
b Mo
x
x
B1 y
y
i
i
Vysílač (y) • Je-li frekvence RF pole B1 a precesního pohybu magnetizace Mo stejná, je dosaženo tzv. rezonanční podmínky a systém absorbuje energii. • Vzájemnou interakcí RF pole B1 a magnetizace Mo dojde k jejímu překlopení kolem tohoto pole B1 o úhel b, který odpovídá velikosti dodané energie a době jejího působení.
Návrat magnetizace Mo zpět do rovnováhy (detekce signálu) • Při absenci excitujícího magnetického pole B1 se Mxy bude snažit přejít zpět na Mo (do výchozího rovnovážného stavu) obnovením původní distribuce populací Na / Nb. Tento jev se nazývá relaxace. z
z
Mxy
Mo
rovnováha...
x
x
wo y
y
• Oscilace vektoru Mxy vytváří fluktující magnetické pole, které generuje elektrický proud v přijímací cívce: z Mxy x
wo y
Přijímací cívka (-x)
NMR signál
Průběh signálu v přijímací cívce (-x): x
y
x
x
y
y
I = C * cos (wot) I
t
y
x
x
x
y
y
Laboratorní a rotující soustava souřadnic • Systém koordinát doposud používaný se nazývá laboratorní soustava souřadná. Jedná se o fixní systém, ve kterém jaderné spiny rotují rychlostí wo, což znesnadňuje jakoukoliv další analýzu. • Řešením je souřadná soustava, která sama rotuje rychlostí wo, tzv. rotující soustava souřadná. Z fyzikálního pohledu odstraníme takto vliv frekvence generované externím magnetickým polem Bo. z
Mxy wo Bo
z
x
y
Laboratorní soustava
Mxy
x
y
Rotující soustava
• V rotujícím systému souřadnic se vektor Mxy nepohybuje za podmínky, že jsme v rezonanci (w pole B1 je přesně frekvence jádra wo). Jsme-li mimo rezonanci, pohyb vektoru je stále pomalý ve srovnání s rychlostí rotace wo.
Free Induction Decay (FID) • Nyní analyzujme signál, který se objeví v přijímací cívce po sklopení vektoru makroskopické magnetizace do roviny <xy> (p / 2 puls). • Po aplikaci RF pulsu se vzorek postupně dostane do rovnováhy, t.j. obnoví se původní obsazení energetických hladin a vektor makroskopické magnetizace se dostane zpět do osy z, okolo níž vykonává precesní pohyb. Mxy w = wo
wo
čas
t
Mxy w
w - wo <> 0
čas t • V rotující soustavě souřadnic w - wo. Relaxace Mo v rovině <xy> je exponenciální. V příjímací cívce detekujeme zanikající cosinový signál.
FID (pokračování) • V reálném vzorku je mnoho spinových systémů, jejichž frekvence jsou odlišné od frekvence B1 (carrier frequency). Protože jsme efektivně excitovali všechny tyto spiny, dostaneme kombinaci signálů a různé frekvenci Free Induction Decay (FID):
I = f(t)
• Po zpracování Fourierovou transformací dostaneme:
I = f(n)
Základní NMR parametry • • • • •
H H
Chemický posun Interakční konstanta Intenzita signálu Počet signálů ve spektru Relaxační vlastnosti jádra (NOE)
H
N
8.5
8.0
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
Chemický posun • Jestliže má každý druh jádra svoji charakteristickou frekvenci, proč je NMR spektroskopie tak užitečná? • Vlivem tzv. chemického okolí dochází ke změnám magnetického pole, které působí na každé jádro stejného typu. Hovoříme o tzv. efektivním magnetickém poli Beff, které je tvořeno hlavním magnetickým polem Bo a lokálním magnetickým polem Bloc. Beff = Bo - Bloc --- Beff = Bo( 1 - s ) s je tzv. konstanta magnetického stínění.
OH
CH2
CH3
vyšší pole
nižší pole frekvence wo
velikost stínění s
NMR škála (d, ppm) • Každý signál ve spektru je charakterizován svou pozicí vyjádřenou ve frekvenčních jednotkách. Problémem je však skutečnost, že Bloc je mnohem menší než Bo (rozsah tisíce Hz oproti milionům Hz) a také závislost na velikosti Bo. • Proto používáme relativní stupnici (odstranění velké frekvence generované externím magnetickým polem) a vztahujeme posun každého signálu k signálu referenčnímu (standardu).
d=
w - wref wref
x 106
ppm (parts per million)
• Potom je pozice signálu stejná pracujeme-li se 100 MHz (2.35 T) nebo 900 MHz CH3 (21,14 T) magnetem. H 3C
Si
CH3
CH3
• Př. Tetramethylsilan (TMS) je standardem jak pro 1H, tak pro 13C spektroskopii. Je dobře rozpustný, inertní a poskytuje vždy jeden signál.
Příklady rozsahů chemických posunů v ppm • 1H ~ 15 ppm:
Alkoholy, Ha
Aromatické H Amidy
Kyseliny Aldehydy
Olefiny
Alifatické H ppm
15 13C
10
7
5
2
0 TMS
~ 220 ppm:
C=O v ketonech
Aromatika, konjugované alkeny Olefiny
Alifatické CH3 CH2, CH ppm
210
150
C=O v kyselinách, aldehydech, esterech
100
80
50
Uhlíky v sousedství alkoholů, ketonů
0 TMS
Indukční efekt. • Izolovaný atom 1H má kulově symetrický orbital 1s.
H (1s) • Nyní přidáme -CH3, čímž získáme methan. Elektronový oblak 1H (kteréhokoliv ze 4 ekvivalentních atomů) se deformuje vlivem elektronegativnějšího atomu uhlíku (přitahuje elektrony 1s).
H (1s)
C (sp3)
• Tímto způsobem se sníží elektronová hustota okolo jader 1H, dojde k jejich odstínění a posunu k vyšším hodnotám magnetického pole (ppm). Nahradíme-li jeden z vodíků halogenem, pozorujeme, že čím je příslušný halogen elektronegativnější, tím dochází k většímu odstínění ostatních jader 1H. s (HF) < s (HCl) < s (HBr) < s (HI) Jinými slovy, s rostoucí elektronegativitou připojeného atomu (skupiny atomů), klesá stínící konstanta s.
Mezomerní efekt • NH2 v anilinu vykazuje +M efekt dojde k většímu stínění aromatických protonů, než v případě benzenu (7.24 ppm). NH2 skupina dodává elektrony do aromatického systému a ten jich obsahuje více než benzen. N H
H
6.55
H
H
7.08
H
6.70 • Z rezonančních struktur je vidět větší elektronová hustota v polohách ortho a para. Protony v těchto polohách jsou tedy více stíněny a tedy posunuty k nižším hodnotám ppm. H
H
H
H
H
N
N
H N
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Mezomerní efekt (…) • Na druhé straně, nitrobenzen vykazuje výrazný -M efekt. Všechny aromatické protony jsou více odstíněny a tím pádem posunuty k vyšším hodnotám ppm než O O benzen. N H
H
8.15
H
H
7.55
H
7.70 • Opět polohy ortho a para mají tento efekt výraznější.
O
O
O
N
O
O
N
O N
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
Anizotropní efekt • Jakákoliv chemická vazba je anizotropní, protože je orientována v prostoru. • Významný jev zejména u násobných vazeb a aromatických kruhů ( π-elektrony) • Jestliže takovouto vazbu (vazebné elektrony) vložíme do externího magnetického pole, bude indukovat lokální magnetické pole, které bude také anizotropní. • Magnetické pole působící na jádra v okolí takovéto vazby bude též anizotropní. Lokální magnetické pole bude buď zvyšovat nebo naopak snižovat efektivní magnetické pole. Bude-li tento efekt kladný nebo záporný záleží na pozici příslušného jádra vůči takovéto vazbě.
Bo
C
C
„Ring current“ efekt • Anizotropní efekt aromatického jádra je vytvářen systémem konjugovaných dvojných vazeb. • Siločáry indukovaného magnetického pole jsou kolmé k rovině aromatického kruhu. Bring
Bo • Vodíky v rovině kruhu jsou odstíněny (posun k vyšším hodnotám ppm), zatímco vodíky nad nebo pod rovinou kruhu jsou stíněné (nižší hodnoty ppm).
+
+ -
„Ring current“ efekt (…) • Toto je důvod, proč je chemický posun aromatických protonů v rozmezí 6 až 9 ppm: H
7.27
H
7.79 H
• Extrémním příkladem tohoto efektu je [18]anulen: H
H
H
H
H
H H
-2.99
H H
H H
+9.28
H H
H
H
H H
H
7.41
Spin-spinové interakce Bloc
Přímá spin-spinová interakce
Bloc
1Hj
1Hk
Bo
Nepřímá spin-spinová interakce
13C
J H jk 2pI j J jk I k
((
J jk 0 25Hz
)(
)
DD H jk b jk 3 I j e jk I k e jk I j I k
)
b jk (0,2nm) 15012 Hz
Přímá spin-spinová interakce v pevných látkách
b jk (15012 Hz ) J jk (0 25Hz ) projeví se v běžném spektru ztráta rozlišení
rotace pod magickým úhlem (54,7), 12 000 Hz
Bo rotace pod magickým úhlem (54,7), 870 Hz statické spektrum
Obrázek z: Brinkman A., Dipolar Recoupling in Magic-Angle-Spinning NMR, disertace, Stockholmská univerzita 2001
Přímá spin-spinová interakce v kapalinách kapaliny z důvodu izotropního pohybu molekul zprůměrování interakce = 0 Hjk
Hjk
rIS < 5-6 Ǻ
Hjk
Hjk
Hjk
Hjk Hjk
Hjk
Hjk
H
H
Hjk
Spin – spinová interakce se neprojeví přímo ve spektrech, nicméně její efekt lze měřit v podobě tzv. křížové relaxace, což se využívá v experimentech, které využívají tzv. nukleární Overhauserův efekt (NOESY, ROESY)
Nepřímá spin-spinová interakce • Energetické hladiny jednotlivých jader jsou též ovlivňovány spinovými stavy jader v okolí. Toto je nazýváno nepřímou spin-spinou interakcí. Nepřímá interakce je to proto, že je zprostředkována vazebnými elektrony (na rozdíl od přímé dipóldipólové interakce jaderných spinů):
1H
1H
Bo
C
E = JAB * IA * IB • Magnetický moment jádra polarizuje vazebné elektrony, resp. jejich magnetické momenty a tato polarizace je přenášena na další jádra.
Nepřímá spin-spinová interakce Interakční konstanta (intenzita a počet čar) O H 3C O
CH2 CH3
4.0
4.10
3.5
3.0
2.5
4.00
2.0
1.30
1.5
1.0
1.20
• Každý atom 1H ve skupině CH2 „vidí“ 4 možné stavy atomů 1H v sousední skupině CH3. • Naproti tomu každý atom 1H skupiny CH3 „vidí“ 3 možné stavy protonů CH2 skupiny. • 2 protony skupiny CH2 a 3 protony skupiny CH3 jsou navzájem ekvivalentní.
0.5
Nepřímá spin-spinová interakce Interakční konstanta (intenzita a počet čar) aa ab ba bb CH3
aaa aab aba baa abb bab bba bbb CH2
• Je-li jádro A v interakci s n jádry (spin ½), která jsou identická je počet čar v multipletu A roven n + 1 . • Signál CH2 skupiny se objeví jako kvartet (4 čáry), zatímco CH3 skupina jako triplet (3 čáry). • Je-li jádro A v interakci s n jádry, která mají spin I platí pro počet čar multipletu A:
m=2nI+1 • Vzdálenost jednotlivých čar v multipletu je rovna velikosti interakční konstanty v Hz. Je stejná v obou multipletech jak CH2, tak CH3 skupiny (7 Hz).
Interakční konstanta (pokračování) Interakční konstanta (intenzita a počet čar) • Z předchozího diagramu lze též odvodit intenzity jednotlivých čar multipletu. Protože existuje stejná pravděpodobnost, že se systém nalézá v jakémkoliv stavu (stavy v řádcích jsou energeticky degenerované), poměr intenzit je 1:2:1 pro CH3 a 1:3:3:1 pro CH2 skupinu. • Obecně lze intenzitu čar získat z koeficientů binomického rozvoje:
1 : n / 1 : n ( n - 1 ) / 2 : n ( n - 1 ) ( n - 2 ) / 6 : ...
• Pro rychlou orientaci slouží tzv. Pascalův trojúhelník. 1 1 1 1 2 1 1 3 3 1 1 4 6 4 1
Kapitoly z praktické NMR spektroskopie
SPECTROSPIN 500 DRX 500 Avance
Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou měřící sondou, tzv. kryosondou Temperature 17K Temperature 4K
25 Bar
Computer
Historické NMR spektrometry První komerčně dostupný CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 30 MHz (1952), Varian Inc. CW-NMR spektrometr s rezonanční frekvencí 40 MHz (1961), ÚPT Brno
600 MHz NMR spektrometr na VŠCHT Praha
Řez supravodivým magnetem
Průřez supravodivým magnetem Pohled shora
Kapalný dusík (-196oC)
Měřící sonda Měřený vzorek
Solenoid Evakuovaný plášť Kapalné helium (-269oC)
y
x z
Zhasnutí magnetu „quench“
Nárůst velikosti magnetického pole NMR spektrometrů 1300
Pracovní frekvence [MHz]
1200 1100 1000 900 800 700 600 500 400 300 200 100 0 1950
1960
1970
1980
1990
2000
Rok uvedení na trh
2010
2020
900 MHz magnet firmy Bruker
900 MHz magnet firmy Oxford Instruments
900 MHz 1H NMR spektrum lysozymu
První 1 GHz NMR spektrometr Centre de RMN à Très Hauts Champs Lyon, France
Citlivost a rozlišení se počítají 40 MHz
1000 MHz
1 GHz NMR spectrum of 2 mM ubiquitin Saunders M., Wishnia A. and Kirkwood J.G: J.Am.Chem.Soc.79, 3289 (1957). Bruker official website: http://www.bruker-biospin.com/av1000-apps.html
RIKEN Research Institute Yokohama, Japan
Schéma moderního NMR spektrometru s chlazenou měřící sondou Temperature 17K Temperature 4K
25 Bar
Computer
Kryosonda Chlazená plynným He na teplotu 17 K, předzesilovače na cca 40 K
Kyvety pro kapalinovou NMR spektroskopii.
Srovnání citlivosti 500 MHz sondy TBI a 600 MHz kryosondy CTCI při měření 1H 620:1
6600:1
1) 500 versus 600 MHz 2) využití kryotechnologie
7000 6000
3) 12 let vývoje technologie NMR spektroskopie
5000 4000 3000 2000 1000 0 500 TBI
600 TCI (cryo)
Sensitivity between CryoProbe (CP) TCI and Room Temperature (RT) TXI probe
Sensitivity enhancement: 1.8-fold
Stabilizace magnetického pole v čase C6H12 (bez locku)
• Vlivem driftu Bo dochází k postupné změně polohy měřeného signálu. • Řešením je systém nazývaný „field lock“.
•Jedná se o jakýsi separátní NMR spektrometr, který pracuje nejčastěji se signálem deuteria a podle velikosti změny Bo a tedy polohy signálu 2H koriguje hlavní pole Bo.
Homogenizace magnetického pole v prostoru • Nehomogenita Bo vzniká vlivem nedokonalé konstrukce magnetu, okolních feromagnetických předmětů, nehomogenity vzorku… • Odstraňuje se malými změnami Bo pomocí tzv. korekčních cívek. Tento proces se nazývá shimování.
• Korekční cívky jsou umístěny okolo hlavní cívky v různých směrech a lze jimi definovaně modifikovat hlavní pole.
Ukázky: a) špatně naladěný („nashimovaný“) magnet
b) dobře naladěný („nashimovaný“) magnet
