DNS KLÓNOZÁS
DNS KLÓNOZÁS: Egy DNS molekula megsokszorozása In vitro-PCR In vivo-különféle gazdasejtekben
POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ (PCR)
PCR A POLIMERÁZ LÁNC REAKCIÓ DNS MOLEKULÁK MEGSOKSZOROZÁSÁRA (AMPLIFIKÁLÁSÁRA) HASZNÁLT, NAGYON ÉRZÉKENY MÓDSZER
1985-BEN TALÁLTA FEL KARY MULLIS, 1993-BAN NOBEL DÍJAT KAPOTT
PCR AZ AMPLIFIKÁLT DNS AKÁR 40 KB HOSSZÚ IS LEHET. A CÉLSZEKVENCIA KÉT VÉGÉRŐL KB. 20 BP SZEKVENCIA ISMERETE SZÜKSÉGES. AZ EMBER ÉS SOK EGYÉB ÉLŐLÉNY GENOMSZEKVENCIÁJÁNAK ISMERETÉBEN GYAKORLATILAG BÁRMELY KÍVÁNT DNS SZEKVENCIA AMPLIFIKÁLHATÓ.
Taq POLIMERÁZ
A PCR-hoz egy hőforrásokban élő baktérium, a thermus
aquaticus DNS polimerázát használták először. Manapság már számos rekombináns enzim közül választhatunk.
Taq POLIMERÁZ A Thermus aquaticus polimeráz
Nem semmisül meg 95 fokon. Működése 72 fokon ideális.
PCR a Taq POLIMERÁZ FELFEDEZÉSE ELŐTT ÉS UTÁN…
Az alkalmazott nem hőstabil DNS-polimerázt minden ciklus során pótolni kellett…
A PCR REAKCIÓ ÖSSZETEVŐI DEOXIRIBONUKLEOTID TRIFOSZFÁTOK (dNTP-k), a DNS építőkövei TEMPLÁT DNS, az amplifikálandó DNS szekvenciát tartalmazó minta PRIMEREK, 20-50 bp hosszúságú oligonukleotidák, a célszekvencia két végével komplementerek HŐSTABIL DNS POLIMERÁZ PUFFER VÍZ
PCR A PRC EGY CIKLUSA (HÁROM ALAPVETŐ LÉPÉSE) 20-40SZER ISMÉTLŐDIK EGY REAKCIÓ SORÁN. A PCR KÉSZÜLÉK A REAKCIÓCSÖVEKET RENDKÍVÜL GYORSAN TUDJA LEHŰTENI, ÉS FELMELEGÍTENI.
EGY PCR CIKLUS LÉPÉSEI DENATURÁCIÓ ~94°C : A DNS egyesszálúvá válik. PRIMER KAPCSOLÓDÁS/ANNEALING ~54°C : Az egyesszálú primerek és templát DNS között bázispárosodás zajlik. EXTENZIÓ ~72°C : A Taq polimeráz a templáttal komplementer bázisokat épít be a primerek 3’ végétől kiindulva. A DNS szintézis, mint mindig, most is 5’-3’ irányba halad.
EGY PCR CIKLUS LÉPÉSEI
DENATURÁCIÓ
PRIMER KAPCSOLÓDÁS
EXTENZIÓ
A DNS MENNYISÉGE EXPONENCIÁLISAN NŐ A PCR SORÁN
A DNS MENNYISÉGE EXPONENCIÁLISAN NŐ A PCR SORÁN A DNS SZÁLAK SZÁMA MINDEN CIKLUS SORÁN MEGKETTŐZŐDIK
AZ ELSŐ NÉHÁNY CIKLUS UTÁN MÁR A KÉT PRIMER KÖZÖTTI RÉSZ AMPLIFIKÁLÓDIK (lsd. következő kép)
A PCR EREDMÉNYEKÉPPEN A PRIMEREK KÖZTI DNS SZAKASZ NAGY MENNYISÉGBEN KELETKEZIK.
Xn = X0 . 2n
(n: ciklusok száma)
AZ ELSŐ CIKLUSOK ÁTTEKINTÉSE Amplifikálandó DNS szakasz
1. ciklus 72O
2. ciklus
3. ciklus
72O
72O
PCR REAKCIÓ ELLENŐRZÉSE GÉLELEKTROFORÉZISSEL
Marker DNS
PCR fragmentumok
PCR ÉS KONTAMINÁCIÓ
Mivel a PCR nagyon érzékeny módszer, A KONTAMINÁCIÓ VESZÉLYE NAGY
Leírták, hogy pipettázás során pár vérsejt még ha cserélnek is tip-et a pipetta végéhez tapadhat és átkerülhet egyik mintából a másikba, komoly bonyodalmakat okozva.
A PCR ALKALMAZÁSAI
FERTŐZÉSEK DIAGNÓZISA Tervezzünk olyan primereket, melyek csak a kórokozó DNSével komplementerek, míg az emberi DNS-el nem Vegyünk megfelelő mintát a betegből, mely valószínűleg tartalmazza a kórokozót (pl. köpet) Végezzük Végezzük el a PCR reakciót Futtassuk meg a PCR terméket gélelektroforézissel Ha a várt hosszúságú fragment képződik, a beteg fertőzött A diagnózis néhány óra alatt megvan, szemben a gyakran napokig/hetekig tartó baktérium tenyésztéssel.
BAKTÉRIUM FERTŐZÉSEK DIAGNÓZISA Sok patogén baktérium és vírus detektálásához szükséges primer pár már megvásárolható.
Neisseria gonorrhea (tripper) Chlamydia trachomatis (Chlamydia Chlamydia) Mycobacterium tuberculosis (TBC) Treponema pallidum (Szifilisz) Mycobacterium leprae (lepra)
VÍRUS FERTŐZÉSEK DIAGNÓZISA
HIV HPV CMV EBV herpes viruses rota virus Calici virus
A PCR ALKALMAZÁSAI
ÖRÖKLÖTT BETEGSÉGEK DIAGNÓZISA Bármely gén mutációját ki tudjuk mutatni, ha PCR-amplifikáljuk majd megszekvenáljuk. CISZTÁS FIBRÓZIS-CFTR MELLRÁK-BRCA RETIONOBLASZTÓMA-Rb P53
A PCR ALKALMAZÁSAI
PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS Az embrióból a kövekező módokon nyerhetünk DNS-t veleszületett betegségek PCR alapú diagnózisához: PREIMPLANTÁCIÓS GENETIKAI DIAGNÓZISSAL CHORION VILLUS MINTAVÉTELLEL AMNIOCENTÉZISSEL
A PCR ALKALMAZÁSAI
PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS IN VITRO FERTILIZÁCIÓ, PREIMPLANTÁCIÓS GENETIKAI DIAGNÓZISSAL Ismert recesszív letális mutációt hordozó párok gyermekének betegsége kiküszöbölhető, ha IVF után 4-8 sejtes embrióból egy sejtet eltávolítanak, felPCR-ezik a mutáns gént, majd megszekvenálják. Ha homozigóta az embrió a mutációra, nem ültetik vissza a méhbe.
A PCR ALKALMAZÁSAI
PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS
CHORION VILLUS MINTAVÉTEL
A PCR ALKALMAZÁSAI
PRÉNATÁLIS DIAGNÓZIS AMNIOCENTÉZIS A magzatvíz a fejlődő embrió elhalt bőrsejtjeit is tartalmazza. Kis mennyiségű magzatvíz kiszívásával bármely betegség PCR alapú diagnózisához elégséges mennyiségű sejtet nyerhetünk.
A PCR ALKALMAZÁSAI
IGAZSÁGÜGYI ORVOSTAN
A PCR ALKALMAZÁSAI
IGAZSÁGÜGYI ORVOSTAN BÁRMELY SZEMÉLY AZONOSÍHATÓ PCR-EN ALAPULÓ
VNTR MÓDSZERREL. EGY HAJSZÁL, VÉR/ONDÓ CSEPP, PÁR HÁMSEJT AZ ÁLDOZAT KÖRME ALATT ELÉGSÉGES TEMPLÁT MENNYISÉGET BIZTOSÍT VNTR ANALÍZISHEZ.
STR/S SHORT TANDEM REPEATS 2-7 BÁZIS ISMÉTLŐDÉSE 7-40 SZER
AZ ISMÉTLŐDÉSEK SZÁMA KÜLÖNBÖZŐ LEHET: VNTR (VARIABLE NUMBER OF TANDEM REPEAT)
10 (vagy több) STR ALAPJÁN BÁRMELY EMBER BEAZONOSÍTHATÓ
AZ FBI STR LOKUSZAI
VNTR
Homológ kromoszómák
TANDEM ISMÉTLŐDÉSEK (REPEATS)
gélelektroforézis
PCR PRIMEREK
VNTR ”C” gyanúsított
gélelektroforézis
”B” gyanúsított
Ismétlődések száma
”A” gyanúsított
DNS a tetthelyről
REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIA/ DNS KLÓNOZÁS
tetszőleges DNS fragmentumok illeszthetőek össze génsebészeti módszerekkel
REKOMBINÁNS DNS TECHNOLÓGIA/ DNS KLÓNOZÁS Emésszük mindkét DNS molekulát ugyanazzal a restrikciós enzimmel
RAGADÓS VÉGEK
DNS LIGÁZ
REKOMBINÁNS DNS
tetszőleges DNS fragmentumok illeszthetőek össze génsebészeti módszerekkel
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ORVOSI ALKALMAZÁSA TÍPUS
REKOMBINÁNS FEHÉRJE
FUNKCIÓ
BETEGSÉG
VÉRALVADÁSGÁTLÓK
Szöveti plazminogén aktivátor (TPA)
trombusok oldása
szívinfarktus
VÉRALVADÁSI FAKTOROK
Faktor VIII
véralvadás elősegítése
hemofília
KOLÓNIA STIMULÁLÓ FAKTOROK
Granulocita kolónia stimuláló faktor (G-CSF)
fehérvérsejt képződés stimulálása
immundeficienciák, fertőzések, kemoterápia után
ERITROPOETIN
Eritropoetin
vörösvérsejtszám növelése
anémia veseelégtelenségben, dopping
NÖVEKEDÉSI FAKTOROK
Inzulin-szerű növekedési faktor 1 (IGF-1)
sejtosztódás és növekedés stimulálás, sejthalál gátlás
Laron törpeség ALS, diabetes dopping
NÖVEKEDÉSI HORMON
Növekedési Hormon
anabolikus hatás a sejtekre
törpeség dopping
INZULIN
Inzulin
glükóz felvétel a sejtekbe
diabetes
INTERFERONOK
Interferon-béta-1a Interferon béta-1b
vírus replikáció gátlása,
hepatitisz C, egyes tumorok
INTERLEUKINOK
Interleukin 1-35
különböző fehérvérsejtek stimulálása
sebek, HIV, immundeficienciák, tumorok
MONOKLONÁLIS ANTITESTEK
MONOKLONÁLIS ANTITESTEK
specifikus fehérje kötés
diagnosztika, tumorok
VAKCINÁK
hepatitis B envelope fehérje
immunrendszer stimulálása
virális és bakteriális fertőzések megelőzése
A RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
DNS-t hasító enzimek
A RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK
Védelem a fágok ellen
A RESTRIKCIÓS-MODIFIKÁCIÓS RENDSZER RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZ
+
MODIFIKÁCIÓS METILÁZ
FÁG DNS
NUKLEÁZ
BAKTERIÁLIS GENOM
NUKLEÁZ
FELISMERÉSI /RESTRIKCIÓS HELY: 4-8 bp palindróm szekvencia.
A RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZOK a restrikciós endonukleáz-DNS interakció nem specifikus helyen
a restrikciós endonukleáz-DNS interakció specifikus restrikciós helyen
A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK
RESTRIKCIÓS ENDONUKLEÁZ
A RESTRIKCIÓS ENDONUKÁZOK TOMPA VÉG
RAGADÓS VÉG
AGARÓZ GÉL ELEKTROPHORÉZIS Marker DNS
DNS molekulák elválasztása méretük alapján
DNS KLÓNOZÁS Klónozáshoz szükséges: - Inszert: a megsokszorozni kívánt DNS darab (megfelelő restrikciós enzimekkel hasítva) - Vektor DNS (megfelelő restrikciós enzimekkel hasítva)
-DNS ligáz enzim -Gazdasejt
DNS KLÓNOZÁS RESTRIKCIÓS EMÉSZTÉS LIGÁLÁS TRANSZFORMÁLÁS
REKOMBINÁNS PLAZMID IZOLÁLÁS
DNS KLÓNOZÁS
Bakteriális promóter Polilinker több (P) és operátor (O) restrikciós felismerési hellyel Antibiotikum rezisztencia gén
Replikációs origó
klónozó vektor
Riboszóma kötőhely
Replikációs origó
Transzkripciós terminációs szekvencia
Antibiotikum rezisztencia gén
expressziós vektor
DNS KLÓNOZÁS-LIGÁLÁS DNS LIGÁZ
DNS KLÓNOZÁS rekombináns plazmid gén emésztés
ligálás
transzformáció
lacZ
R1 Ha génünket és a plazmidot két különböző restrikciós enzimmel vágjuk, génünket irányítottan illeszthetjük a plazmidba (expressziós vektornál fontos), és az üres plazmid visszazáródását is elkerülhetjük, mivel két különböző ragadós vég nem ligálódik.
X: Lac Z mutáció a bakteriális kromoszómán
Fehér kolónia kiválasztása
Szélesztés
növesztés
1. antibiotikum és X-gal
Rekombináns plazmid izolálás
Fehér kolónia: nincs X-gal lebontás, rekombináns plazmid
Plazmidok LacZ-vel
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA
Rekombináns fehérjéket nagy mennyiségben tudunk előállítani baktériumok segítségével. A fehérjét kódoló gént indukálható bakteriális promótert tartalmazó expressziós vektorba kell klónozni.
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA
A rekombináns fehérjéket nagy mennyiségben izoláljuk a baktériumokból, pl. AFFINITÁS KROMATOGRÁFIÁval.
REKOMBINÁNS FEHÉRJÉK ELŐÁLLÍTÁSA E. COLI
ÉLESZTŐ/ROVAR SEJTEK
EMLŐS SEJTEK
Nem minden fehérje állítható elő baktériumokban, mert az eukarióta fehérjék gyakran olyan poszttranszlációs módosításokon mennek keresztül, melyeket a baktériumok nem képesek elvégezni. Ilyenkor eukarióta sejtekben kell expresszáltatni a kérdéses fehérjét.
