CRONQ.) PARAQUAT-REZISZTENCIÁJÁBAN

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM, TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR NÖVÉNYÉLETTANI ÉS MOLEKULÁRIS NÖVÉNYBIOLÓGIAI TANSZÉK, BIOLÓGIAI DOKTORI ISKOLA

A POLIAMIN TRANSZPORTEREK SZEREPE A BETYÁRKÓRÓ (CONYZA CANADENSIS /L./ CRONQ.) PARAQUAT-REZISZTENCIÁJÁBAN

DOKTORI ÉRTEKEZÉS JÓRI BALÁZS KÁROLY

DOKTORI PROGRAM: KÍSÉRLETES NÖVÉNYBIOLÓGIA A BIOLÓGIA DOKTORI ISKOLA VEZETŐJE: DR. ERDEI ANNA, CMHAS, EGYETEMI TANÁR

PROGRAMVEZETŐ: DR. SZIGETI ZOLTÁN, DSC, EGYETEMI TANÁR

TÉMAVEZETŐ: DR. LÁSZTITY DEMETER, CSC, EGYETEMI DOCENS

2010

TARTALOM Bevezetés.................................................................................................................................... 2 Irodalmi áttekintés .................................................................................................................... 4 Célkitűzések............................................................................................................................. 27 Anyag és módszer .................................................................................................................... 28 A növények nevelése.......................................................................................................................................................... 28 A növények kezelése .......................................................................................................................................................... 28 Funkcionális aktivitás mérése ............................................................................................................................................ 28 Dezoxi-ribonukleinsav kinyerése ...................................................................................................................................... 29 Ribonukleinsav kinyerése .................................................................................................................................................. 29 Reverz transzkripció, cDNS készítése................................................................................................................................ 30 Differential-display-RT-PCR ............................................................................................................................................. 30 A fragmentek elválasztása és visszaizolálása ..................................................................................................................... 30 A fragmentek klónozása és szekvenálása ........................................................................................................................... 31 Primertervezés .................................................................................................................................................................... 31 PCR reakció ........................................................................................................................................................................ 32 Szemikvantitatív RT-PCR reakció ..................................................................................................................................... 32 In silico elemzések .............................................................................................................................................................. 33

Eredmények ............................................................................................................................. 34 DDRT-PCR ......................................................................................................................................................................... 34 CAT-homológ ..................................................................................................................................................................... 36 Poliamin transzporterek in silico vizsgálata ...................................................................................................................... 37 Direkt szekvenálás .............................................................................................................................................................. 42 Transzporter-inhibitor (KNO3) alkalmazása ..................................................................................................................... 45 A teljes ferritin szekvencia meghatározása és elemzése.................................................................................................... 47 A génexpresszió változások megerősítése szemikvantitatív RT-PCR technikával .......................................................... 52

Eredmények megvitatása ........................................................................................................ 53 Függelék ................................................................................................................................... 60 1.számú függelék: Adatbázis azonosítók listája ................................................................................................................. 60 2. számú függelék: Transzmembrán domének és putreszcinkötőhelyek in silico előrejelzése ....................................... 61 3.számú függelék: Ferritin szekvencia ............................................................................................................................... 67

Irodalomjegyzék ...................................................................................................................... 68 Rövidítések jegyzéke ............................................................................................................... 74 Összefoglalás ............................................................................................................................ 76 Summary .................................................................................................................................. 78 Köszönetnyilvánítás ................................................................................................................ 80 Az értekezéshez kapcsolódó közlemények jegyzéke ............................................................ 81 Referált tudományos folyóiratokban megjelent cikkek: ................................................................................................... 81 További tudományos folyóiratokban megjelent cikkek: ................................................................................................... 81 Referált tudományos folyóiratokban megjelent konferencia kivonatok: ......................................................................... 81 Összefoglalók konferencia kiadványokban: ...................................................................................................................... 81 További kapcsolódó publikációk ........................................................................................................................................ 81

| Bevezetés

1

BEVEZETÉS Az elmúlt évszázadok során a mezőgazdaság és a szolgálatában álló tudományok megkísérelték a lehető legjobban hasznosítani a biológiai rendszereket, hogy így az ipari méreteket öltött növénytermesztés kielégíthesse az egyre növekvő fogyasztási igényeket. A hagyományos növénynemesítési eljárásokat egyre inkább a genomok ismeretét felhasználó molekuláris módszerek váltják fel, emellett kiemelt szerep jut a haszonnövények életterét beszűkítő, hozamukat csökkentő herbivorok, paraziták és gyomnövények elleni vegyszeres küzdelemnek. A gyomnövények ellen a világon legszélesebb körben alkalmazott herbicidek egyike a paraquat. Bár a bipiridil típusú vegyületet laboratóriumi redoxreakciók indikátoraként a XIX. század vége óta használják (metil-viologén néven), posztemergens, nem szelektív, kontakt gyomirtó hatását csak 1955-ben szabadalmaztatták. A levélherbicidet kezdetben haloid sók formájában, 1962 óta szerkombinációkban hozták forgalomba (Paraquat Information Center www.paraquat.com ). Kiterjedten használták szőlőültetvények, gyümölcsösök totális gyomtalanítására, de ipari növények érését elősegítő defoliáns szerként is. Népszerűségét széles spektrumú és gyors hatásának köszönhette és a kezelés eredményessége csupán korlátozott mértékben függ időjárási tényezőktől: a permetezés után pár órányi napfényes időszakot követel meg. Használatakor utólagos környezeti károkkal nem kellett számolni, mert a herbicid a talajszemcsékhez rendkívül gyorsan és irreverzibilis módon kötődik, biológiailag inaktiválódik. Lebomlása akár több évig eltarthat (Ross és Krieger, 1980), a talajvízbe csak igen kis mértékben mosódik (Rial-Otero et al, 2006). A szer intenzív használata következtében a hetvenes évektől a mezőgazdaság számára problémát jelentettek az egyre gyakrabban megjelenő, paraquattal szemben toleráns és rezisztens gyomfajok. Az első rezisztens fajok leírását követő harmincöt év alatt mára közel harminc növényfajban alakult ki az ellenálló képesség a herbiciddel szemben, (Ryan, 1970, HRAC, www.hracglobal.com ) melyek közül kimagasló mértékű rezisztenciát tapasztaltak a betyárkóró (Conyza canadensis /L./ Cronq.) magyarországi populációjában.

| Bevezetés

2

A rezisztencia-mechanizmus leírására több elképzelést is leírtak, mindezidáig azonban egyiket sem sikerült bizonyítani. (Norman et al, 1993, Szigeti 2000). Munkám során – melynek célja a paraquat-rezisztencia mechanizmusának megértése volt – a klasszikus növényélettani módszerek mellett modern, molekuláris biológiai és in silico, számítógépes elemzéseket is alkalmaztam annak érdekében, hogy a komplexebb megközelítés lehetővé tegye a folyamatok jobb megértését. A rezisztenciamechanizmus leírása nem csupán elméleti szempontból fontos. A folyamat feltárása stratégiai jelentőségű lehet az eddig ismert herbicidek újszerű megközelítésből eredő, hatékonyabb használatát illetően, valamint humán vonatkozásban is fontos tanulságokkal szolgálhat.

| Bevezetés

3

IRODALMI ÁTTEKINTÉS A paraquat (Pq, 1,1’-dimetil-4,4’-bipiridil) a bipiridil típusú herbicidek családjába tartozik. Természetes körülmények között stabil, fehér kristályos anyag, melynek olvadáspontja 300°C-nál van (1. táblázat). Vízben jól oldódik, szerves oldószerekben gyakorlatilag oldhatatlan. Rendkívül stabil vegyület, bomlása során – melyet vizes oldatban az UV sugárzás katalizál – 4-karboxil-1-metil piridinium-klorid keletkezik (Ross és Krieger, 1980, Paraquat Information Center www.paraquat.com). Általános név: További nevek: Kémiai név: Összegképlet: Molekulasúly: Fotostabiliás: Vízoldékonyság: Gőznyomás: Partíciós koefficiens: Abszorpciós koefficiens: Töltéseloszlás:

Paraquat Metil-viologén 1,1’-dimethyl-4,4’-bipyridylium ion C12H14N22+ 257 g/mol UV fény hatására, vizes oldatában lebomlik 620 g/l (20 °C) 10-9 mm Hg 4,4683 1 000 000 (becsült érték)

Szerkezeti képlet:

1. táblázat A paraquat fizikai-kémiai tulajdonságai (Paraquat Information Center, Weed Science Society, 1994 és Wauchope et al, 1992 alapján)

| Irodalmi áttekintés

4

P700*

Pq2+

Pq°+

e-

NADPH

e-

NADP+ P700

1. ábra A paraquat a PSI redukáló oldalán fejti ki hatását az elektronok eltérítése által. (Dodge 1971, Fujii et al, 1991 alapján)

Herbicidként alkalmazva hatásának kifejtéséhez fény és oxigén jelenléte szükséges. Fitotoxikus képessége alacsony redoxpotenciál értékén alapul, melynek következtében a fotoszintézis I. fotokémiai rendszerének (PSI) redukáló oldalán az elektrontranszport lánc FeSx komponensénél bekapcsolódva az elektronokat fiziológiás útjukról eltereli (1. ábra), majd azokat felvéve paraquat kation gyökké alakul (Dodge 1971, Fujii et al, 1991). Elektronok hiányában nemcsak kevesebb NADPH termelődik, hanem a képződött paraquat kation gyökök reakcióképességük folytán a kloroplasztiszban a molekuláris oxigénnel

kölcsönhatva

szuperoxid

anion

gyököket

generálnak,

míg

maguk

regenerálódnak, visszaalakulnak paraquat kationná (Bowyer és Camilleri, 1985). A szuperoxid

anion

gyökök

–

hasonlóan

egyéb

stresszhatások

során

lejátszódó

folyamatokhoz – savas közegben protonálódhatnak és hidrogén-peroxidot képezhetnek (Babbs et al, 1989). A képződött hidrogén-peroxid molekulák további szuperoxid anion gyökök mellett, a Haber-Weiss reakcióban hidroxil gyököket is létrehoznak. A folyamatot szabad Fe3+ és Cu2+ ionok katalizálják, melyek Fe2+ és Cu+ ionokká redukáldóva a Fenton-reakció során további reaktív gyököket hoznak létre. A paraquat kation redukált formája közvetlen is reakcióba léphet a Fe3+ ionnal a Winterbourn-reakcióban (Vile et al, 1987) ( 2. ábra ). | Irodalmi áttekintés

5

PQ INDUKÁLTA SZUPEROXID GYÖK KÉPZÉS

Pq2+ + e- Pq +* O2 + Pq +*O2-* + Pq2+

WINTERBOURN-REAKCIÓ

Pq *+ + H2O2 Pq2+ + OH- + HO*

Pq *+ + Fe3+ Pq2+ + Fe2+ H+ + Fe2+ + H2O2 HO* + Fe3+ + H2O

FENTON-REAKCIÓ O2-* + Fe3+ O2 + Fe2+ 2 O2-* + 2 H+ H2O2 + O2 H+ + Fe2+ + H2O2 HO* + Fe3+ + H2O

2. ábra A paraquat hatásmechanizmusa

Mint látható, egyetlen paraquat molekula is rendkívüli mértékű szabadgyök-képző hatással bír. A nettó termékként jelentkező aktív oxigénformák (OH* és O 2-*) károsítják a fotoszintetikus pigmenteket (Pölös et al, 1987), peroxidálják a lipideket, dezorganizálják a lipidtartalmú membránokat (Hiyama et al, 1993, Váradi et al, 2000), ezáltal növelik a membránok permeabilitását, csökken a turgornyomás, a növény pedig végül elszárad (Harvey és Fraser, 1980). Hasonlóan egyéb oxidatív stresszhatásokhoz, a reaktív oxigénformákat a szuperoxid-diszmutáz, a kataláz, a Haliwell-Asada út és a xantofillciklus próbálja eliminálni a rendszerből. A paraquat a növény felszínére kerülve gyorsan, fél-másfél órán belül penetrálódik a növénybe. A tünetek a környezeti tényezőktől függően egy napon belül már jelentkezhetnek. Autokatalitikus jellegéből adódóan a paraquat rendkívül hatékony (Babbs et al, 1989). Mivel a paraquat a folyamathoz szükséges elektronokat a fotoszintetikus elektrontranszportlánctól veszi el, ezért a hatás nagymértékben függ a fényintenzitástól: erős napfényben korlátozott a hatóanyag transzlokációja, ilyenkor gyors a hatáskifejtés, a kontakthatás erősebb. Az alacsonyabb fényintenzitás vagy alacsonyabb hőmérséklet elősegíti a herbicid szétterjedését a növényben (Hunyadi és Almádi, 1981, Halász et al, 2002). | Irodalmi áttekintés

6

Faj latin neve Amaranthus lividus Arctotheca calendula Bidens pilosa Ceratopteris richardii Conyza bonariensis

Conyza canadensis

Conyza sumatrensis

Crassocephalum crepidiodes Cuphea carthagenenis Eleusine indica Epilobium adenocaulon Erigeron philadelphicus Hordeum glaucum Hordeum leporinum Ischaemum rugosum Landoltia punctata Lepidium virginicum Lolium perenne Lolium rigidum Mitracarpus hirtus Monochoria korsakowii Parthenium hysterophorus Poa annua Rehmannia glutinosa Solanum americanum Solanum nigrum Vulpia bromoides Youngia japonica

Származási hely Malajzia Ausztrália (Victoria) Kenya Egyesült Államok Egyiptom Japán Dél-Afrikai Köztársaság Japán Magyarország Kanada (Ontario) Egyesült Államok (Mississippi) Belgium Egyesült Államok (Delaware) Japán Taiwan Malajzia Sri Lanka Malajzia Fiji-szk. Malajzia Egyesült Államok (Florida) Belgium Egyesült Királyság Japán Ausztrália (Victoria) Ausztrália (Dél-Ausztrália) Ausztrália (Victoria) Ausztrália (Dél-Ausztrália) Malajzia Egyesült Államok (Florida) Kanada (Ontario) Egyesült Királyság Dél-Afrikai Köztársaság Ausztrália Ausztrália (Queensland) Japán Kenya Egyesült Királyság Belgium Kína Dél-Korea Egyesült Államok (Florida) Malajzia Ausztrália (Victoria) Japán

Év 1990 1986 1991 n.a. 1989 1989 2003 1980 n.a. 1993 1994 1998 2003 1980 1980 1990 1998 1990 1984 1990 1996 1982 1989 1989 1984 1990 1988 2001 1989 2001 1993 n.a. 2002 n.a. 2007 1994 n.a. 1981 n.a. n.a. n.a. 1985 1990 1990 1980

Rezisztencia faktor n.a. 60 n.a. 10-40 150 n.a. n.a. 100 450 n.a. n.a. n.a. n.a. 400 n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. n.a. 10 >5 250 250 n.a. 100 n.a. n.a. n.a. n.a. 6-10 n.a. 14 n.a. n.a. n.a. 3-4 n.a. n.a. n.a. 12 n.a. 5-6 110

2. táblázat Paraquat-rezisztens növényfajok. Rezisztenciafaktor: cPqIC50R/cPqIC50S (Szigeti, 2000 és Heap, I. The International Survey of Herbicide Resistant Weeds. Online. Internet. August 11, 2008. http://www.weedscience.com nyomán).


7

Hasonlóan egyéb, ismétlődően, hosszabb időszakon keresztül alkalmazott herbicidhez a paraquattal szembeni tolerancia és rezisztencia is rövid időn belül kifejlődött számos fajnál. Egyaránt találunk köztük pro- és eukariótát, egysejtűt illetve szövetes élőlényt, növényt, gombát, sőt állatot is (Szigeti 2000, Fujii et al, 2004, Vermeulen et al 2005). A rezisztens növényfajok mind rendszertanilag mind földrajzi elhelyezkedés szerint széles spektrumot ölelnek fel. A fajok között egy- és kétszikűek egyaránt találhatóak, mind az öt földrészen. A területek közül kiemelkedik Ausztrália, az Egyesült Államok és az ázsiai térség – érdekes módon pont azok a területek, ahol a bipiridil-származékokat máig alkalmazzák (2. táblázat). A 2. táblázatban felsorolt, rezisztens növények között kimagasló, élettani állapotától függően akár 450-es reziszenciafaktorral is bír a betyárkóró, rendszertani nevén Conyza canadensis (L.) Cronq. paraquat rezisztens biotípusa (Vaughn KC, 2003). Az Észak-Amerikából származó, Európában a XVII. század közepén megtelepedett növény – melyet régebbi rendszertani nevén Erigeron canadensis-ként is ismerhetünk – az

Asteraceae családba tartozik (Cronquist A, 1976) (3. táblázat). Taxon:

Besorolás:

Regnum:

Plantae

Subregnum:

Tracheobionta

Superdivisio:

Spermatophyta

Divisio:

Magnoliophyta

Classus

:

Magnoliopsida

Subclassus:

Asteridae

Ordo:

Asterales

Familia:

Asteraceae

Genus:

Conyza Less.

Species:

Conyza canadensis (L.) Cronq.

3. táblázat A Conyza canadensis taxonómiája (USDA PLANTS adatbázis alapján)

Hazánkban széles körben elterjedt, leginkább a mérsékelten száraz, tápanyagban gazdag, többnyire csak gyengén humuszos, agyagos vagy vályogos talajokat kedveli, a melegebb fekvésű helyeken, parlagon hagyott szántóföldeken, erdőirtások, utak, vasúti töltések mentén, gyomtársulásokban jelenik meg, olykor tömegesen. Az olykor másfél méteres magasságot is elérő egynyári, adventív gyomnövény orsógyökerű fészkesvirágzatú (3. ábra). Felálló, hengeres szára van, mely felső részén erősen ágas, alsó részén sűrűn | Irodalmi áttekintés

8

leveles, szőrös vagy érdes. A tűlevelek szálas lándzsásak vagy hosszúkás lándzsásak, a külsők csúcsukon 3 tompa fogúak. A szárlevelek szálas lándzsásak, hegyesek, ép szélűek vagy fűrészesek, berzedt szőrűek, az alsók nyélbe keskenyedők, a felsők ülők (Horánszky és Járainé, 1990).

3. ábra A Conyza canadensis virágzata és habitusa (fotó: Les Binns és John Hardy, flickr.com)

A Conyza fajokkal szembeni paraquatkezelés hatékonyságának csökkenését a hetvenes évek második felében figyelték meg, de a paraquat-rezisztenciával, okaival foglalkozó publikációkat csupán a nyolcvanas évek közepén kezdték közölni. (Harvey és Harper, 1982). A rezisztens fajok megjelenése óta a paraquattal szembeni ellenálló képesség magyarázatára számos elmélet született, melyet azonban kísérletesen nem, vagy csak részben sikerült igazolni. Az egyik legelső hipotézis szerint a paraquat hatáshelye, a PSI akceptor oldala körüli redoxpotenciál viszonyok megváltozása tehető felelőssé a rezisztenciáért (Cheung et al, 1988). Elektron spin rezonancia spektroszkópia vizsgálatokkal igazolták, hogy a FeSx vas-kén protein a Conyza pennsylvanica és más fajok paraquat rezisztens biotípusában változatlan formában találhatók meg (Norman et al, 1993). Az aktív hely hasonló módon változatlannak bizonyult Lolium perenne-ben | Irodalmi áttekintés

9

(Harvey et al, 1980), Hordeum glaucum-ban (Powles és Cornic, 1987) valamint a Conyza

canadensis-szel közeli rokon Conyza bonariensis-ben (Fuerst et al, 1985). A szenzitív és rezisztens Conyza biotípus között sincs a hatóhely tekintetében különbség: a paraquat az elektronokat a fiziológiás útjukról mindkét esetben eltéríti (Lehoczki 1993, Norman et al, 1993). Nem találtak bizonyítékot arra sem, hogy a Conyza képes metabolizálni a paraquatot. Metabolizálódást csak talajlakó baktériumokban (Bacillus subtilis) és egyes gombafajokban (Lipomyces starkeyi) igazoltak (Funderburk és Bozarth, 1967, Carr et al, 1985). Magasabb rendű növények között egyedül a Rehmannia glutinosa-ban sikerült kimutatni indirekt módon a paraquat metabolizmusát, ami vélhetően egy fenilpropanoid glikozid származéknak köszönhető, mely a paraquatot kémiai kötés vagy módosítás során inaktiválja (Chun et al 1997, Chun et al 2002). Mivel a paraquat hatásmechanizmusa a szuperoxid-aniongyök képzésen és az általa okozott oxidatív stresszen alapszik, egy jól működő antioxidáns védőenzimrendszer bizonyos mértékű paraquat toleranciát eredményezhet. A sorbakapcsolt enzimeket magába foglaló rendszer fiziológiás körülmények között a kloroplasztiszban keletkező aktív oxigénformák eliminálásában játszik szerepet. Az enzimrendszer tagjai között a szuperoxid-diszmutáz (SOD) a szuperoxid anion gyökből hidrogén-peroxidot és oxigénmolekulát képez. A szintén reaktív hidrogén-peroxidot az aszkorbát-glutation ciklus eliminálja a kloroplasztiszban. Oxidatív stressz esetén a ciklusban résztvevő aszkorbát-peroxidáz, a dehidroaszkorbát-reduktáz és a glutation-reduktáz enzimek aktivitása megnő. Megfigyelték, hogy a paraquattal és szaliciláttal – mely a szisztemikusan szerzett reziszenciát indukálja – egyszerre kezelt dohánylevelek esetén a paraquat hatása sokkal kisebb mértékű. (Silverman et al 2005) Fokozottabb paraquat toleranciát tapasztalhatunk a hosszabb életidejű fajok illetve fajon belüli biotípusok esetén. Az Arabidopsis thaliana gigantea (gi-3) mutánsa, mely egyike a legkésőbbi virágzású, leghosszabb életidejű mutáns vonalaknak, egyaránt toleránsnak bizonyult csekély mennyiségű paraquat- és hidrogén-peroxidos kezelésre. (Kurepa et al 1998) Az ilyen hosszú életidejű növény- illetve állatfajok általános jellemzője a rendkívül jól működő oxidatív stressztolerancia mechanizmus (Vermeulen et al, 2005). Ezzel együtt a ciklus enzimeinek fokozott aktivitását mutató növényfajok legfeljebb 10-es


10

értékű rezisztencia faktorral bírnak (Schaaltiel és Gressel, 1986, Norman et al 1993); ezt inkább paraquat toleranciának, mintsem igazi rezisztenciának lehet mondani. Nagyfokú rezisztencia nem magyarázható a megnövekedett aktivitású védőenzimrendszer működésének eredményeként. Problémát jelent az energetikai rendszer kimerülése; a paraquat gyök autokatalitikus folyamatok során, molekuláris oxigénnel reagálva könnyen visszaalakul paraquat kationná, hogy újabb szuperoxid gyököket generáljon. Mivel a kloroplasztiszban a NADPH készlet limitált, éppen a paraquat elektroneltérítő hatása miatt feltételezhető, hogy a szuperoxid generátor paraquat kation valamilyen módon inaktív állapotba kell, hogy kerüljön. A védőenzim-elméletet cáfolják azon kísérleteink is, melyek során bizonyítottuk, hogy a paraquat rezisztens Conyza biotípus a szenzitívhez hasonló módon reagál egyéb, szuperoxid generáló ágensekre. Menadion hatására mind a szenzitív, mind a rezisztens biotípus egyedei elpusztultak: egyező mértékben aktív antioxidáns enzimrendszerük nem képes kivédeni a paraquattól molekuláris szerkezetében különböző, de hatásában szintén szuperoxid-gyök generátor menadion által okozott stresszt (Jóri et al, 2007). Az oxidatív stresszhez kapcsolódóan átmeneti megoldást jelent a reaktív gyököket (O2*-, OH*) generáló egyéb folyamatok lassítása. Ha a paraquat által generált szuperoxid gyök csökkent mennyiségben fér hozzá szabad Fe3+ ionokhoz, kevesebb redukált állapotú Fe2+ keletkezik a Fenton-reakció során, mely kevesebb OH* gyököt képez a H2O2-ból. A leginkább a lipidmembránokat roncsoló reaktív hidroxil gyök termelődése szempontjából fontos tehát a szabad Fe3+ szint intracelluláris szabályozottsága, szuperoxid-gyök képződése során a vasionok eliminálása. (Halliwell, 1993). Ferritin génnel transzformált, ferritint túlexpresszáló dohánynövények paraquat-toleranciát mutattak (Deák et al, 1999) Egy másik, szintén korai hipotézis szerint a rezisztenciát a paraquat akadályozott felvétele okozza. Az elképzelés szerint a paraquat már a sejtfalban kötődik, a lignifikálódott részeken adszorbeálódik, illetve az epikutikuláris viaszrétegen keresztül nehezen penetrálódik (Vaughn et al, 1989). A publikált eredmények mindezt cáfolták. A

Conyza canadensis-szel azonos genusba tartozó Conyza bonariensis fajban bizonyították, hogy az ellenálló képességet nem okozhatja a herbicid csökkent mértékű kutikuláris penetrációja (Fuerst et al, 1985). A kísérletekben a C14-gyel jelölt paraquat bejutott a sejtbe és hatáshelyére, a kloroplasztisztba. Az elektronakceptorként szolgáló paraquat kezelés


11

hatására az izolált kloroplasztiszokban az elektrontranszport serkentése hasonló mértékű volt. A korlátozott felvétel elméletét cáfolják az általunk Conyza-n végzett sejtfrakcionálási kísérletek is (Jóri et al, 2007). Azt is leírták, hogy a paraquat mind a szenzitív, mind a rezisztens Conyza biotípusban bejut a sejtbe (Lehoczki 1988). A paraquat tehát nem kötődik meg a sejtfalban, hanem azon és a plazmalemmán keresztül bejut a sejtbe, - sőt, a rezisztens biotípusban egy hónap után is kimutatható a citoszólt és a vakuólumokat tartalmazó frakcióban (Jóri et al, 2007). Mivel a paraquat metabolizálódását nem mutatták ki eddig Conyza-ban, hatáshelye sem módosult, valamint egyetlen működő védőenzimrendszer sem volt képes önmagában magas fokú rezisztenciát okozni, ezért a rezisztenciáért más mechanizmus felelős. Valószínűsíthető, hogy a sejtekbe jutott paraquat a hatáshelyéről eltávolítódik és inaktív kompartmentben különítődik el. Conyza bonariensis esetén autoradiográfiás követési módszerrel vizsgálaták a 14 C-gyel jelölt paraquat leveleken belüli lokalizálódását (Fuerst et al, 1985). Megfigyelték, hogy míg a szenzitív egyed levelein belül a paraquat elhelyezkedése egyenletes, addig a rezisztens típusban elsősorban a vaszkularizált szövetekben, a levélnyél alsóbb régióiban volt megtalálható, azaz az apoplaszton keresztüli haladása gátlódott, és amint a vaszkularizált szövetekből átjutott a fotoszintetikus mezofillum sejtjeibe, a paraquat vakuolumba kompartmentalizálódott.

Conyza canadensis esetén a fotoszintetikus apparátus működését vizsgálták szenzitív és rezisztens biotípusokban. A rezisztens növényekben a PSII optimális kvantumhatékonyságát tükröző, így a növények funkcionális aktivitását jellemző változó és maximális fluoreszcencia (Fv/Fm) hányados értéke a kezelést követően a szenzitívhez hasonló módon csökkent. Azonban a rezisztens biotípusban az átmeneti gátlást követően helyreállást figyeltek meg. A paraquat tehát eljutott a hatás helyéig, de az átmeneti gáltás után a funkció helyreáll (Lehoczki és Szigeti, 1988, Lehoczki et al, 1992). Hasonlót figyeltek meg Hordeum glaucum esetében. A penetráció kinetikája megegyezett a szenzitív és rezisztens biotípusokban, de a bejutást követően a rezisztens biotípusban a paraquat vakuólumokba szállítva került inaktív állapotba (Lasat et al 1997). A paraquat transzportjában központi kérdés a membránokon történő átjutás, mivel a kétértékű, pozitív nettó töltésű molekula nem képes átdiffundálni a hidrofób foszfolipid rétegeken, mely transzporter fehérjék segítségével valósulhat meg. | Irodalmi áttekintés

12

Toxikus ágensek eliminációjáért felelős egyetlen gén által kódolt multidrogrezisztenciát (MDR) okozó rendszert az élővilág bármely csoportjában találunk. A multidrog-rezisztenciáért felelős transzport-fehérjéket két nagy osztályba sorolhatjuk: az ABC-transzporterek és a másodlagos multidrog-transzporterek (4. ábra) (Putman et al, 2000).

4. ábra Multidrog transzporterek két fő osztálya. (A) ABC-típusú MDR fehérje, mely a szubsztát kijuttatásához szükséges energiát az ATP hidrolíziséből nyeri. (B) Másodlagos multidrogtranszporter a strukturálisan különböző drogokat H+ vagy Na+ ion ellenében juttatja az extracelluláris térbe. (Putman et al, 2000 alapján)

Az ABC-transzporterek a legismertebb multidrog-rezisztenciát okozó rendszerek, melyek ATP-kötő kazetta doménnel rendelkeznek, és többek között tumoros megbetegedések kemoterápiás válaszában okoznak multidrog-rezisztenciát (Doige és Ames, 1993, Gros et al 1986). Gyakorlatilag minden pro- és eukarióta szervezetben, többféle anyag transzportjában vesznek részt. Szállíthatnak ionokat, szénhidrátokat, lipideket, xenobiotikumokat, antibiotikumokat, pigmenteket, de még akár hosszabb polipeptideket is (Gottesmann és Pastan, 1993). Korábbi vizsgálataink során kiderült: a | Irodalmi áttekintés

13

Conyza rezisztenciájáért vélhetőleg nem ABC jellegű, multidrog-rezisztencia fehérje felel. A paraquattal együtt alkalmazott, az ABC-transzportereket speciálisan gátló vanadátilletve verapamil-kezelés nem befolyásolta jelentősen a helyreállási folyamatot a rezisztens biotípus esetén. (Halász et al 2002). A másodlagos multidrog transzporterek az ABC-transzporterek mellett külön osztályt képeznek a multidrog-rezisztenciát okozó fehérjék közt. Ezek leginkább a prokarióták körében kutatottak, de eukariótákban is ismeretek homológjaik. Jellemző rájuk, hogy a protongradienst (proton motive force, PMF) használva képesek a toxikus anyagokat transzportálni (Putman et al, 2000). Méretük és hasonlóságok alapján felállított beosztást a másodlagos multidrog transzport-fehérjék esetében az 5. ábra mutatja be.

Prokarióta MDR-transzporterek ABC tpt

Másodlagos MDR transzporterek

RND

MATE

MFS

12-TMS MFS PqrA

Ochrob actrum anthrop i

PqrA

Strepto myces coelicol or

PqrA

Proteus vulgaris

SMR

14-TMS MFS Qac A

Staphyl ococcu s aureus

Qac A

mvrA E.coli

Salmon ella typhim urium

mvrC / EmrE E.coli

5. ábra Az MDR transzporterek rendszere prokariótákban. RND, (resistance-nodulation-cell division), rezisztencia- noduláció- sejtosztódás- fehérjék családja. MATE, (multidrug and toxic compound extrusion), multidrog - és toxikus ágenseket kilökő fehérjék családja. MFS, (major facilitator superfamily) a legfőbb facilitátor fehérjék családja. SMR, (small multidrug resistance), kisméretű multidrog-rezisztencia fehérjék családja. ABC: ATP-binding cassette transzporter, MDR: multidrug-rezisztencia, TMS: transzmembrán szegmens. A paraquat transzportjára képes, prokariótákból izolált fehérjék narancssárga színnel kiemelve (Putman et al, 2000 alapján)


14

Paraquat transzportjára kizárólag az MFS és SMR családba tartozó fehérjék között írtak le példákat. Az MFS család tagjai megtalálhatók pro- és eukariótákban egyaránt, diés oligoszacharidok, Krebs-ciklus intermedierek, foszfát-észterek és antibiotikumok szimanti- vagy uniportjáért felelnek, 12 vagy 14 transzmembrán régióval (TMS) rendelkeznek. Az MFS fehérjecsalád 14-TMS klaszterjába tartozik a Staphylococcus aureus mono- és divalens kationok transzportjáért felelős QacA gén terméke. Ezzel mutat nagyfokú hasonlóságot a Salmonella typhimurium faj plazmidon elhelyezkedő rezisztenciagénje, mely paraquattal szemben okoz rezisztenciát (Hongo et al 1994). Az MFS fehérjecsalád 12-TMS klaszterjába sorolják az Ochrobactrum anthropi paraquat rezisztens JW2 vonalából izolált rezisztenciagénjét, a PqrA-t. A 410 aminosavból álló,

42

kilodaltonos

polipeptid

12

transzmembrán

szegmensre

tagolódik,

membránintegráns fehérjét alkot. A gént Escherichia coli-ba transzformálva a gazdasejtek ellenállóvá váltak paraquattal szemben. (Won et al, 2001). A pqrA gént ezen kívül nemcsak E. coli-ban, hanem dohány növényben is sikerült expresszáltatni. A transzgénikus dohánynövény, melyben a pqrA gén meglétét és expresszióját immunoblot analízissel is igazolták, paraquatra nézve rezisztenssé vált, viszont egyéb aktív oxigénforma generáló ágensekre – mint a H2O2 vagy a menadion – továbbra is érzékeny maradt (Jo et al, 2004). Az SMR családba tartozik az egyik leghatékonyabb prokarióta paraquat-transzport rendszer. Az E. coli K12-es mutáns törzsében a metil-viologén bejutását gátló, rezisztens törzsekre jellemző 12 kilodalton tömegű, membránintegráns protein mvrC – újabb nevén EmrE – mellett találjuk a szuperoxid-gyök redukáló képességet okozó mvrA gént (Morimyo, 1988, Morimyo et al, 1992). Az EmrE, melyet régebben mini-TEXAN-ok közé, ma már az SMR családba csoportosítanak, kisméretű, 110 aminosavból álló fehérje. A fehérje szubsztrátkötésében kulcsfontosságú szerepet játszik a Glu-14 aminosav, mely tulajdonság a többi SMR fehérjére is jellemző. A génjét tartalmazó plazmid kópiaszámának emelésével fokozódó paraquat-rezisztenciát figyeltek meg. Az EmrE monomerjei – melyek önmagukban csak monovalens ionokat transzportálnak – fiziológiás körülmények közt dimerekké állnak össze, így képesek divalens vegyüleket mozgatni (Schuldiner 2007a,b). Az antiporter méretében és töltéseloszlásában is igen hasonló a H+-ATPáz kisméretű membránkötött „c” alegységéhez (Yerushalmi et al, 1995, Rotem és Schuldiner, 2004).


15

A paraquatot nem csak MDR fehérjék képesek a sejtet illetve partikulumait határoló membránokon átjuttatni. Az MDR-rendszerek mellett egyéb, membránintegráns transzporterek

is

szubsztrátspecifitású

alkalmasak

toxikus

transzporterek,

ágensek

melyek

transzportjára.

alapvető

funkciója

Ezek a

olyan,

tág

mesterségesen

szintetizált molekulához – esetünkben a paraquathoz – hasonló szerkezetű, töltéseloszlású természetes molekulák membránokon keresztül történő juttatása (Rotem and Schuldiner, 2004).

6. ábra Az egymáshoz töltéseloszlásában hasonló paraquat (a, kék) és a putreszcin (b, piros) molekulamodellezése (Erős D, 2006 személyes közlés)

A bipiridil paraquathoz bivalens karakterében és töltéseloszlásában hasonló molekulák a poliaminok, elsősorban a putreszcin (6. ábra). A szabad állapotukban pozitív töltésű poliaminok a növényi sejtek szinte minden részében megtalálhatóak, így a citoszólban, mitokondriumban, kloroplasztiszban, vakuólumban vagy akár a sejtfalhoz kötve. A sejtek külső poliamin-felvételére alkalmas transzporterekkel rendelkeznek, poliamin-tartalmukat a bioszintézisen és lebontáson kívül a különböző poliamintranszport folyamatok is szabályozzák (Igarashi és Kashiwagi 1999). A poliaminok kapcsolata a paraquat-rezisztenciával régóta ismert. Az állatvilágban, az emlősök közt a paraquat epitheliális sejtekbe jutása részben poliamin-felvételi rendszereken keresztül történik meg (Smith, 1982). Humán rendszerben kimutatták, hogy a poliaminok – leginkább a putreszcin – kompetícióban állnak a paraquattal a felvételi mechanizmus során. (Chen et al, 1992, Toursarkissian et al, 1994). Állati szervezetekben is többszörösen bizonyított, hogy a paraquat felvétele a poliamint transzportáló rendszereken keresztül is történhet (Rose et al 1976, Gaudreault et al, 1984, Wyatt et al 1988, Seiler és Dezeure 1990), sőt putreszcinnel kompetitíven gátolható (Brooke-Taylor et al, 1983).


16

Ehhez hasonló rendszer a növényvilágban sem ismeretlen, Hart és munkatársai eredményei alapján világossá vált, hogy a paraquat felvétele és a poliaminok transzportja között összefüggés áll fenn (Hart et al, 1992.) Munkatársaival kukorica gyökérsejtekben vizsgálták a paraquat és a poliaminok (putreszcin, kadaverin, spermin) felvételét. A paraquat és a putreszcin influx koncentrációfüggő kinetikája hasonlónak bizonyult: egy, a sejtfal- és membránkötődésből adódó lineáris és egy, a plazmalemmán keresztül irányuló influxot jellemző telítési komponensre volt bontható. A telítési komponenst tovább vizsgálva, a kinetikai analízis során különböző paraquat – és poliamin – koncentrációval bíró kísérleti összeállításokban azt tapasztalták, hogy a diamin putreszcin kompetitív módon gátolta a paraquatfelvétel telítési komponensét. Hasonló hatást tapasztaltak az ugyancsak diamin kadaverin esetén is, melynek felvétele mind paraquattal, mind putreszcinnel kompetitív módon gátolhatónak bizonyult. Ezzel ellentétben, a nagyobb méretű, tetravalens poliamin, a spermin nem-kompetitíven gátolta a putreszcin és paraquat influxot. A paraquat és putreszcin influx telítési jellegéből arra következtettek, hogy a folyamat fehérje-közvetített. Tehát a paraquat valamely, alapvetően a putreszcin transzportjára alkalmas karrier-rendszeren át jut be a kukoricagyökér sejtjeibe (Hart et al, 1992.). További kísérleteik során a paraquat intracelluláris transzportját illetve effluxát vizsgálva etiolált csíranövényekben kinetikai kísérleteikkel bizonyították, hogy a paraquat lassan a citoplazmából a vakuólumba szekvesztrálódik, illetve részben a gyökerek felől a hajtások irányába transzlokálódik (diTomaso et al, 1993). Hart és munkacsoportja már ekkor felvetette, hogy a Conyza bonariensis és a Hordeum glaucum megnövekedett rezisztenciájáért is hasonló, vakuoláris kompartmentációs mechanizmus felel (Hart et al, 1992, diTomaso et al, 1993). A paraquat nem közvetlenül energizált transzporterekkel jut be a sejtbe, ezt az ép növényi mintákban mérhető negatív transzmembrán potenciál teszi lehetővé. Így a rezisztenciát végső soron okozhatja a paraquat hatékony kiválasztásának, csökkent felvételének vagy szekvesztrációjának eredője (Preston et al, 1992), mely – a szubsztrátok hasonló töltéseloszlása okán – akár a poliamin transzporterek megváltozott aktivitása miatt is lehetséges. Ezért fontosnak tartottuk azon poliamin transzporterek szerepét tisztázni, melyek más vegyületek transzportjára is alkalmasak. A prokarióta E. coli-ban a poliamin anyagcserét

vizsgálva

kiderült,

hogy

a különböző

típusú

poliaminok

hasonló

transzportrendszereken át veszi fel, így többféle poliamin felvételére alkalmas rendszerek | Irodalmi áttekintés

17

léteznek. E.coli-ban eddig négy poliamin felvételi rendszert azonosítottak: a neutrális pHn működő, ABC transzporter spermidint preferáló és putreszcin-specifikus felvételi rendszerek mellett a savas pH-n aktív PotE a putreszcin exkrécióban és putreszcin-ornitin antiporter folyamatban, míg a hasonlóan alacsony pH-jú környezetben működő CadB a kadaverin kiválasztásban és kadaverin-lizin antiportban vesz részt (Igarashi és Kashiwagi, 1999, Uemura et al, 2007) (7. ábra).

E.coli poliamin transzporter gének 12-TMS APC PUT-

PUT-specifikus

SPD-specifikus

exkréció

PUT/OR N anti-

CAD/LIZ

PotE

csatorna képző2

PotC

csatorna képző1

PotB

ATPáz

PotA

szubszrád-kötő

PotD

csatorna-képző2

PotI

csatorna képző1

PotH

ATPáz

PotG

szubszrád-kötő

porter

PotF

CAD-

exkréció

antiporter

CadB

ABC-tpt

7. ábra: Poliamin transzport rendszereket kódoló gének hierarchiája E.coli-ban. ABC: ATP binding cassette protein transzporter, TMS: transzmembrán szegmens, APC: aminosav-poliaminorganokation transzporter, LIZ: lizin, ORN: ornitin, PUT: putreszcin, SPD: spermidin, CAD: cadaverin. Igarashi és Kashiwagi, 1999 alapján.

A PotE 46 kDa tömegű membránintegráns fehérje, melynek N és C terminálisa is a citoplazma felé mutat. A PotE magas fokú specifitást mutat putreszcinre nézve. Szerepe a putreszcin felvételében és a sejtből történő kijuttatásában van, utóbbira putreszcin-ornitin antiporter aktivitás teszi képessé (Kashiwagi et al, 1997, Tomitori et al, 2001). Az aktív centumként megjelölt Glu77, Glu207 és Glu433 aminosavak a transzportaktivitás miatt | Irodalmi áttekintés

18

fontosak: a fenti pozíciókban sérült mutáns törzseknél a putreszcin felvétele és az exkréciója is csökkent. Mind a három pozíció a hidrofil régiókban található, a citoplazma felőli oldalon, ezért elképzelhető, hogy a putreszcin kötőhely kialakításában vesznek részt. Az E.coli PotE-hez hasonló funkciót betöltő fehérjét találtak Haemophilus

influenzae-ben is, ahol a transzportaktivitás szempontjából fontos glutaminsavak az E.colihoz hasonlóan, a 77-es, 207-es és 433-as pozícióval ekvivalens pozícióban található meg. Többféle poliamin felvételére alkalmas rendszert és PotE homológot nemcsak pro- hanem eukarióták között is találunk. A Leishmania nevű protozoából izolált, APC aminosavpoliamin-organokation transzporter szupercsaládba tartozó, sejtfelszínen lokalizált, vélhetőleg proton szimporter LmPOT1 viszonylag nagy affinitással bír putreszcinre és spermidinre, egyéb aminosavak transzportjára azonban nem képes (Hasne és Ulmann, 2005). A poliamin transzportrendszereket és működésüket leginkább az élesztőkben tárták fel. Ezen poliamintranszporterek alacsony szubsztrátspecifitásukból eredően putreszcin és spermidin transzport mellett aminosavak felvételére is képesek.

8. ábra Poliamintranszporter rendszerek az élesztőben (Uemura et al, 2007 alapján). VAC: vakuólum, pGOL: Post-Golgi partikulum, PUT: putreszcin, SPD: spermidin, SPM: spermin

Az élesztőben négy, membránlokalizált, poliamin exkrécióért felelős fehérjét (TPO1-TPO4) azonosítottak, ezen kívül a vakuólumon elhelyezkedő UGA4-et, mint gamma-aminovajsav transzportert. A plazmamembránon lokalizált GAP1 változatos | Irodalmi áttekintés

19

szubsztrátspecificitást mutat: a putreszcin és spermidin mellett aminosavak felvételére képes. (Uemura et al, 2007) Az AGP2, mely a plazmalemmában és a tonoplasztban is megtalálható a spermidin felvétel mellett aminosav-permeázként is működik. (Aouida et al, 2005). Az aminosav-poliamin organokation transzporterek közé tartozó SAM3 alapvető szubsztrátjai az S-adenozil-metionin, a glutaminsav és a lizin, de poliaminokat is szállít; a putreszcin és spermidinfelvétel nagy része is ezen a transzporteren át zajlik. Az elsődlegesen ureatranszporterként leírt, PTK2 által szabályozott DUR3 is széles spektrummal rendelkező rendszer, mely poliaminokat is képes a citoplazmába juttatni az extracelluláris térből (8. ábra, 4. táblázat) (Uemura et al, 2007).

TPO1 TPO2 TPO3 TPO4 TPO5 UGA4 GAP1 AGP2

DUR3 SAM3

Szubsztrát PUT, SPD, SPM SPM SPM PUT, SPD, SPM PUT, SPD PUT, GABA PUT, SPD, aminosavak SPD, SPD szubsztituensek, carnitin, aminosavak urea, SPD, SPM, PUT PUT, SPD, Glu, Lys, SAM

Lokalizáltság plazmamembrán. vakuólum plazmamembrán. vakuólum plazmamembrán. vakuólum plazmamembrán. vakuólum Golgi, poszt-Golgi vakuólum plazmamembrán plazmamembrán, vakuólum

plazmamembrán plazmamembrán

Típus 12-TMS H+/drog antiporter 12-TMS H+/drog antiporter 12-TMS H+/drog antiporter 12-TMS H+/drog antiporter APC1, L-típusú APC1 -típusú APC YAT-típusú APC

16-TMS putreszcin és urea transzporter S-adenozilmetionin transzporter putreszcin és spremidin transzporter

4. táblázat Poliamin transzporter rendszerek az élesztőben (Igarashi és Kashiwagi 1999, Tomitori et al, 2001, Uemura et al, 2005, 2007, Tachiharaet al 2005, Aouida et al, 2005 alapján)

Az élesztőknél a poliaminok transzporjáért felelős fehérjék döntő hányadát a TPO (transporter for polyamine) családba tartozó gének kódolják. A TPO-fehérjék elsősorban az élesztő sejtmembránján helyezkednek el, de bizonyos körülmények között a vakuoláris membránokban is megjelennek. Az egymással homológ TPO gének (TPO2, TPO3, TPO4) különböző poliamin molekulákra specifikusak. Míg a TPO1 és TPO4 putreszcint, spermidint és spermint egyaránt képes volt felismerni, a TPO2 és TPO3 a sperminre szelektív (Uemura et al, 2005). Ez tükröződik szerkezetükben is: a TPO4 inkább a TPO1-gyel, a TPO3 inkább a TPO2-vel mutat hasonlóságot (9. ábra). Ezen gének túlexpresszálása esetén csökkent


20

poliamintoxicitást figyeltek meg, valamint kimutatták a poliaminok vakuólumban történő akkumulációját.

9. ábra A Saccharomyces poliamin-transzporter peptid primer szerkezeteinek CLUSTALW (Thompson et al, 1997) analízise. Forrásszekvenciák: TPO1, TPO2, TPO3, TPO4. Méret és az aminosav töltése alapján a fekete részek teljes, a szürke részek részleges aminosav egyezést jelölnek. A gének alatti sorban a konszenzus szekvenciát tünteti fel a program. Uemura et al, 2005 alapján

A TPO1 génje a XII. kromoszómán helyezkedik el, nagy mértékben hasonlít a prokarióta PotE-hez. (Igarashi és Kashiwagi, 1999). A szubsztrátkötésért felelősnek jelzett három glutaminsav (Glu207, Glu324, Glu574) hasonló helyzetben található, mint az E.coli PotE fehérjében (Kashiwagi et al, 1997). A gén által kódolt fehérje 586 aminosav hosszú, 12 putatív transzmembrán szegmenssel rendelkezik (Goffeau et al, 1996), így a már említett, Ochrobactrum anthropi PqrA paraquatrezisztencia génjét is magába foglaló MFS multidrog-transzporterek családjához hasonlít (Goffeau et al, 1997). Természetes | Irodalmi áttekintés

21

állapotában a plazmamembránban helyezkedik el, és a poliaminok exkréciójában játszik szerepet, alapvetően alacsony aktivitással. Túlexpresszálása esetén viszont a TPO1 fehérje megjelent a vakuoláris membránokban is. Lúgos kémhatású környezetben a TPO1 a poliaminok felvételét, savas környezetben pedig kiválasztását katalizálja (Uemura et al, 2005). A poliamin transzportot a vakuoláris membránon a PTK1, a plazmamembránon pedig a PTK2 protein kinázok szabályozzák (Kakinuma et al, 1995, Nozaki et al 1996, Kaouass et al 1997), melyek valószínűleg a transzporter citoszól felé néző hosszabb, mintegy 180 aminosavnyi, szerinben és treoninban gazdag régiójaihoz képesek kapcsolódni. Ezen kívül rendelkezik még egy (Arg-Arg-Xaa-Thr) szekvenciával, melyet a kalcineurin, egy Ca2+/kalmodulin-függő protein-foszfatáz ismer fel (Hashimoto és Soderling, 1989). Rendkívül lényeges hangsúlyozni a TPO poliamin-transzporterek kapcsán a TPO gének expressziója és a paraquattolerancia közötti korrelációt. Kísérletesen bizonyították, hogy a TPO1 poliamin-transzporter szubsztrátjaként ismeri fel a paraquatot (Tomitori et al, 1999, Uemura et al, 2005). A gént élesztősejtekben fokozott mértékben expresszálva, az a kísérletben poliamin analógként használt paraquattal szemben toleránsabbak, míg a TPO1 génre nézve knock-out változatokban paraquatra érzékenyebbé váltak, így feltételezhető, hogy az élesztőben a PotE homológ TPO1 poliamin transzporter fehérje felelős a paraquat transzlokációjáért is (Tomitori et al, 1999, 2001). Protozoák

és

egysejtű

eukarióták

mellett

az

emlősállatok

poliamin

transzportereinek részletes működési mechanizmusát is sikerült az utóbbi időben tisztázni nem-invazív, fluoreszcens próbákkal jelölt poliamin-analógok alkalmazásával (Soulet et al, 2004). Az eddigi elméletek a receptor-közvetített endocitózist emelték ki, mint legfőbb poliamin-felvételi rendszert. Ezzel szemben poliamin-analógokkal kimutatták, hogy sokkal jelentősebb, sőt egyes esetekben kizárólagos a transzporterek és intracelluláris vezikulumok közreműködésével végbemenő kétlépcsős transzport-út (10. ábra). A

kísérletek

azonban

nemcsak

a

poliaminok

transzportmechanizmusáról

szolgáltattak kulcsfontosságú információt. Ismeretes, hogy a paraquat epiteliális sejtekbe jutása részben poliamin-felvételi rendszereken keresztül történik meg (Smith, 1982). Így ezen, korábbi paraquat-poliamin kompetícióról szóló beszámolók mellett ismét beigazolódott, hogy a poliamin-transzporterek szubsztrát preferenciája – rendszertani


22

kategóriáktól függetlenül is – nem korlátozódik a poliaminokra, hanem a hasonló töltéseloszlású és méretű molekulákra is kiterjed.

10. ábra Poliamin transzport emlős sejtekben (Soulet et al alapján). A, A kétlépcsős transzport út során a poliamin a sejt membránjában lokalizált transzportereken keresztül jut a citoszólba. A citoszólból már létező, acidotrófan festődő intracelluláris vezikulumokba szekvesztrálódik egy második, vezikuláris transzporter közreműködésével. B, receptor-mediált endocitózis során a poliamin először a plazmamembránban lokalizált receptorhoz kötődik, majd miután a receptorpoliamin komplex endoszómához kapcsolódik, egylépéses endocitózis során jön létre a poliaminszekvesztrációs vezikula, a PVS.

A növényi poliamintranszport kevésbé tanulmányozott, de magasabb rendű növényeknél megfigyelték, hogy a felvételi szint nagyon gyors, a telítést egy-két percen belül eléri, és kétfázisú rendszer jegyeit mutatja a putreszcin két telítődő komponensére nézve (Bagni és Torrigiani, 1992). A vakuólumokban a tonoplaszton keresztül közvetett, míg a mitokondriumokban membránpotenciáltól függő, a mátrix felé irányuló aktív transzport mechanizmusokat mutattak ki (Pistocchi et al, 1990). Egyes rendszerekben különálló transzporterekkel történik meg a membránon való átjutás (Persson et al, 1996, Seiler et al, 1996) de valószínűsíthető, hogy – mint ahogyan ez az élesztő esetén bizonyított – az aminosavak és a poliaminok képesek megosztozni ugyanazokon a felvételi rendszereken, így többféle poliamin felvételére alkalmas rendszerek (multiple poliamin transporter) is léteznek (Tiburcio et al, 1997). Korán felismert ténynek számít, hogy az aminosavakat transzportáló rendszerek sem | Irodalmi áttekintés

23

rendelkeznek magas specificitással az egyes aminosavakra nézve, hanem az aminosavak savas vagy bázikus karaktere szerint válogatnak, sőt poliaminokat is képesek transzportálni. (Kinraide, 1981; Wyse és Komor, 1984; Bush, 1993). Az Arabidopsis genomanalízise során kiderült, hogy majdnem 60 olyan gén létezik, melyek vélhetőleg szerepet játszanak az aminosav és poliamin transzportban. Két nagy csoportba oszthatóak: az aminosav transzporterek (amino acid transporter family, ATF) és az aminosav poliamin kolin (amino acid polyamine choline transporter family, APC) típusú transzporterek családjára. (Wipf et al, 2002) Mint a legtöbb növény esetén, az elsőként leírt Arabidopsis aminosav transzportereinek többsége – az Arabidopsis-ban 46 fehérje – is az ATF szupercsaládba tartozik általában széles spektrumban semleges és kationos jellegű aminosavakat transzportálnak (11. ábra). Élesztőből származó, hét ATF típusú aminosavtranszporter közül négyet vakuoláris transzporterként is leírtak. (Wipf et al, 2002)

A. thaliana aminosav- és poliamin transzporterek APC (14 db)

AtLAT-5

AtLAT-4

AtLAT-3

AtLAT-1

CAT9

CAT8

12 TM

CAT7

CAT6

CAT5

CAT4

CAT3

CAT2

14 TM

CAT1

AtAUX

AtANT

AtLHT

AtProT

AtAAP

9-11 TM, H+ kapcsolt szimporterek

AtLAT-2

ATF (46 db)

11. ábra Arabidopsis thaliana aminosav és poliamin transzporterek (tpt) Wipf et al, 2002 alapján. AtAAP: aminosav-permeázok, AtProT: prolin tpt, AtLHT: lizin-hisztidin tpt, AtANT: aromás és neutrális aminosav tpt, AtAUX: auxin tpt, CAT: kationos aminosav tpt. TM: transzmembrán, ATF: Aminosav transzporter szupercsalád, APC: Aminosav-poliamin-kolin szupercsalád. | Irodalmi áttekintés

24

Az APC transzporterek, melyek lényegesen kisebb irodalommal bírnak, mint az ATF transzporterek, csak funkcionálisan hasonlóak az ATF transzporterekhez, struktúrájukban eltérnek azoktól. Az a tény, hogy az APC fehérjék pro- és eukariótákban egyaránt előfordulnak, arra enged következtetni, hogy evolúciósan korán megjelent gének termékeiről van szó. Legtöbbjük jellemzően 12-14 TM doménnel bír, heterodimert képez, melyet plazmamembránhoz rögzítő alegység egészít ki. Protonfüggetlen, obligát, a membrán mindkét oldala felé aktív aminosav transzporterek. (Verrey et al, 2004) A teljes Arabidopsis genomban 14 APC-típusú fehérjét kódoló gént határoztak meg, a fehérjék közül 9 transzporter 14 TM doménnel, 5 pedig 12 TM doménnel rendelkezik. (CAT1CAT9). Jóllehet, az APC-típusú fehérjék az ATF transzporterekkel szemben az emberi szervezetben és az élesztőben domináns szerepet töltenek be, növényekben működésük molekuláris szinten kevésbé ismert (Su et al, 2004).

12. ábra A CAT fehérjék filogenetikai származása, a Phylogenetic Analysis Using Parsimony, version 4.0b 10 (Sinaur Associates, Sunderland, MA) segítségével. Látható, hogy a CAT fehérjék négy nagyobb filogenetikai alcsoportot képeznek a szekvenciaelemzésük alapján. Verrey et al, 2004 és Wipf et al, 2002 alapján.

Az eddig ismert CAT fehérjék 14 transzmembrán doménnel rendelkeznek. Filogenetikusan közel állnak egymáshoz, kisebb alcsoportokat képezve (12. ábra). Génexpressziós analízisük során kiderült, hogy szárban, virágban, gyökérben, levélben egyaránt kifejeződnek – a CAT2 a legerősebben és a CAT7 a leggyengébb mértékben, – alátámasztva azt az elméletet, hogy a CAT gének megléte kulcsfontosságú az összes sejt normális működése szempontjából. Kivételt képez a CAT6, melynek transzkriptumait csak | Irodalmi áttekintés

25

a gyökerekben találták meg. A CAT5 és a CAT8 a plazmamembránban, míg a CAT2 a tonoplasztban lokalizált. A többféle, nitrogénforrást felhasználni képtelen 22-delta-8AA élesztőtörzzsel végzett

kísérletek

rávilágítottak

a

CAT

fehérjecsalád

több

tagjának

transzportmechanizmusokban betöltött szerepére. A CAT1 (régebbi nomenklatúra szerint AAT1 aminosav transzporter, Frommer et al, 1995) és a CAT5 közel azonos módon, elsősorban bázikus aminosavak nagy affinitású transzportereként működik, de kisebb mértékben megfigyelhető volt, hogy neutrális és savas karakterű aminosavakat is szállít. Toxikus aminosavakkal történt kezeléseket vizsgálva a CAT fehérjék működését. Feltételezhető, hogy a CAT3, CAT6 és CAT8 inkább a semleges és savas karakterű aminosavakat transzportálja. A CAT4 fehérje működését, mely a CAT2, CAT7, CAT9 és PotE putreszcin transzporterhez leginkább hasonló, eddig még nem vizsgálták részletesen. Mindezek alapján feltételezhettük, hogy a Conyza canadensis (L.) Cronq. esetén is valamilyen, többféle poliamin transzportjára alkalmas rendszer is kulcsfontosságú szerepet játszik a rezisztencia mechanizmusában.


26

CÉLKITŰZÉSEK Korábbi eredményeink és irodalmi adatok arra utaltak, hogy a rezisztencia nem a korlátozott penetráció illetve az antioxidáns enzimrendszer fokozott működésének eredménye. A paraquat bejut a sejtbe, ott kifejti hatását, de a rezisztens biotípus esetén egy átmeneti gátlást követően az inaktív partikulumba, a vakuolumba kerül és az életképességet jellemző értékekben helyreállást tapasztalunk. A folyamatban – mint ez korábbi kísérleteink igazolták – nem ABC-transzporterek vesznek részt és a rezisztencia jelenségét az alkalmazott biotípusban kizárólag a paraquat kezelés hatására tapasztaltuk. Kutatómunkám céljaként a Conyza canadensis (L.) Cronq. magas fokú paraquat rezisztenciájának hátterében álló molekuláris mechanizmus feltárását jelöltem ki. Ezért meg kívántam határozni, melyek azok a rezisztencia gének illetve egyéb, ABC-transzporterektől

különböző

molekuláris

rendszerek,

melyek

a

paraquat

szekvesztrációs mechanizmusában részt vesznek. Célul tűztem ki azon gének meghatározását is, melyek aktivitásukkal az átmeneti gátlási fázisban a védekezést biztosítják. A

rezisztencia

kialakításában

kulcsfontosságú

gének

meghatározásán

túl

expressziójuk változását is vizsgálni kívántam. A

molekuláris

biológiai

eredményeket

in

silico

szerkezetelemzéssel,

homológiakutatással illetve molekuláris törzsfák elkészítésével kívántam alátámasztani.

| Célkitűzések

27

ANYAG ÉS MÓDSZER A NÖVÉNYEK NEVELÉSE A repce (Brassica napus) és betyárkóró (Conyza canadensis /L./ Cronq.) paraquatrezisztens és paraquatra érzékeny biotípusú növényeit laboratóriumi körülmények között neveltük, 130 mol*m-2*s-1 fénymennyiség, 16 órás fényperiódus és 22-25°C hőmérséklet mellett, vízkultúrában, ¼ erősségű Hoagland-tápoldaton. A betyárkóró esetén transzportmechanizmusok vizsgálatára 3-4 hónapos, 8-10 tőlevéllel rendelkező, rozetta állapotú növényeket használtuk fel, a molekuláris biológiai kísérletes munkák során 3-4 hetes példányokat alkalmaztunk. A repce esetén 2-3 hetes példányokat használunk.

A NÖVÉNYEK KEZELÉSE A paraquatkezelést az ICI Agrochemicals Gramoxone nevű, 20% hatóanyagtartalmú

készítményével

végeztük

csapvízben

feloldott,

5*10-4

M

hatóanyag

koncentrációban. A vakuoláris H+ATP-áz gátló kálium-nitrátot (Muller és Taiz, 2002) 10-2 M koncentrációban alkalmaztuk. A gátlót 1 órával a paraquat kezelés előtt (0h) juttattuk a növényekre, majd ezt követően óránként megismételtük a nitrát metabolizációja miatt.

FUNKCIONÁLIS AKTIVITÁS MÉRÉSE A funkcionális aktivitást a klorofill-a-nak változó fluoreszcenciája alapján határoztuk meg és a változó és a maximális fluoreszencia hányadosával (Fv/Fm érték) jellemeztük. A kinetikai mérések során a rozetta állapotú Conyza növényekből a gyártó ajánlásának megfelelő méretű mintákat használtuk fel. A sötétadaptáció 10 percig tartott, ezt követően alacsony fényintenzitású (1 μmol*m-2*s-1), 1600 Hz frekvenciájú vörös fénnyel gerjesztettük. A méréseket impulzus amplitúdó modulált fluoriméterrel (Walz, Effeltrich, Németország) végeztük. Az emittált fluoreszcenciát detektáló fotódióda a jelet szaggatottan, a mérőfénnyel szinkronizáltan, szelektíven erősítette és mérte. A maximális (Fm)

fluoreszcencia

értéket

telítési

intenzitású

(kb.

7500

μmol*m-2*s-1),

fehér

fényfelvillanást követően kaptuk meg (fényforrás: Schott KL 1500 Electronic).

| Anyag és módszer

28

DEZOXI-RIBONUKLEINSAV KINYERÉSE A dezoxi-ribonukleinsav a PlantDNAzol reagenssel (Invitrogen, USA) az alábbi, módosított protokoll alapján végeztük. 0,1g friss tömegű növényi mintát folyékony nitrogénben elporítottunk, majd 300 µl DNAzol oldatban feltártuk. 300 µl kloroform hozzáadása és 1 perc extrahálás után 12000g 10 perc centrifugálással választottuk el a fázisokat. A különválasztott, felülúszó vizes fázishoz 225 µl 100% etanollal precipitáltuk a DNS-t. 5000g 4 perc centrifugálás után a csapadékot 300 µl DNAzol-etanol oldattal mostuk, majd újabb 5000g 4 perc centrifugálás után a csapadékot 300 µl 75% etanollal mostuk, és újra centrifugáltuk 5000g 4 perc időtartamig. Az utolsó 300 µl 75% alkoholos mosási fázis és centrifugálás ismétlése után a képződött DNS csapadékot 50 µl molekuláris biológiai tisztaságú vízben vettük fel, a koncentráció meghatározása után a DNS oldatot a PCR reakcióban használtuk fel.

RIBONUKLEINSAV KINYERÉSE A ribonukleinsav kinyerését a GenoVision gyártó GenoPrep™ DirectmRNA Kit segítségével végeztük, a gyártó ajánlott preparációs eljárását részben módosítva. A mintavétel a három hetes rozetta állapotot elért növények leveleiből. 0,3 g friss tömegű levelet folyékony nitrogén segítségével elporítottuk, majd 1,2 ml izoláló pufferban, 30mp 700rpm rázatás mellett feltártuk a növényi szöveteket. 5 perces 5000g 4°C-on történő centrifugálással elválasztott felülúszót leszívtuk, majd 70 µl mágneses gyöngy oldatot adtuk hozzá. 5 percig szobahőmérsékleten inkubáltuk, óvatos forgatás mellett. Az RNS gyöngyökhöz kötődését követően 5 perc mágnesezés után 700 µl mosópuffer (Washing Buffer I) segítségével mostuk. Ismételt mágnesezést követően ezt a lépést megismételtük. Ezután 700 µl másodlagos mosópuffer (Washing Buffer II)-vel mostuk, mely lépést szintén megismételtük. Ezt követően 20 µl eluációs folyadékot (Elution Solution) oldatot adtunk a gyöngyökhöz, és 65°C -on, 2 perces elúcióval választottuk le a gyöngyök felületéről az mRNS pool-t. Az eluálás után 4°C-os jégre helyeztük 5 percig, majd a koncentráció meghatározása után azonnal felhasználtuk a reverz transzkripció során.


29

REVERZ TRANSZKRIPCIÓ, CDNS KÉSZÍTÉSE A GenoVision GenoPrep™ DirectmRNA készlettel preparált mRNS poolból a cDNS készítését a Fermentas cég RevertAid First Strand PCR Synthesis kitjével végeztük az alábbi oligo dT primerekkel: H-T11-M: 5’-HTT H-T11-N: 5’-HTT H-T11-A: 5’-HTT DLP4: 5'-C ACT DLPG: 5'-C ACT DLPA: 5'-C ACT DLPC: 5'-C ACT

TTT TTT TTT ATA ATA ATA ATA

TTT TTT TTT GGG GGG GGG GGG

TTT TTT TTT AAG AAG AAG AAG

M-3’ N-3’ A-3’ CTT TTT CTT TTT CTT TTT CTT TTT

TTT TTT TTT TTT

TTT TTT TTT TTT

VT-3' GN-3' AN-3' CN-3'

A gyártó által ajánlott protokollt módosítottuk az alábbiak szerint: 11 µl DEPC vízben oldott, 1 µg RNS-t 1 µl 0,5 µg/µl koncentrációjú oligo (dT) primerrel, 100 µl-es PCR csövekben inkubáltuk 70°C-on 5 percig. A mintákhoz 4 µl reakciópuffert (Reaction Buffer), 1 µl RNáz inhibitort, 2 µl dNTP-t adtunk, majd inkubáltuk 37°C-on 5 percig. 1 µl M-MuLV reverz transzkriptáz enzimmel végeztük a reverz transzkripciót, 60 percig 42°Con majd 10 percig 70°C-on inkubáltuk a mintákat. A reakció végeztével 4°C-ra helyeztük a mintákat. Az elkészített cDNS poolt -20°C-on, fagyasztott állapotában legfeljebb 1 hétig tároltuk.

DIFFERENTIAL-DISPLAY-RT-PCR A cDNS felszaporítása PCR reakcióban a GenHunter Corp. gyártó protokoll útmutatásai nyomán 4 l cDNS felhasználásával az alábbi univerzális primerekkel (H Arbitrary Primer, HAP 1-8) történt: HAP HAP HAP HAP HAP HAP HAP HAP

1: 2: 3: 4: 5: 6: 7: 8:

5’-AAG 5’-AAG 5’-AAG 5’-AAG 5’-AAG 5’-AAG 5’-AAG 5’-AAG

CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT CTT

GAT CGA TGG CTC AGT CGA AAC TTA

TGC CTG TCA AAC AGG CCA GAG CCG

C-3’ T-3’ G-3’ G-3’ C-3’ T-3’ G-3’ C-3’

A FRAGMENTEK ELVÁLASZTÁSA ÉS VISSZAIZOLÁLÁSA A DDRT-PCR termékek elválasztása állandó 55W futási teljesítménnyel történt (Bio-Rad DNA Sequencing System, USA), 0,4 mm vastag, 6%-os denaturáló 24:1 akrilamid - bisz-akrilamid arányú poliakrilamid gélen. A gél előhívását, ezüst-nitráttal festését a Silver Sequence® DNA Sequencing System gyártója, a Promega előírásai szerint végeztük. A 4 független kísérletben megjelent csíkokat kivágtuk, 100 µl molekuláris biológiai célra megfelelő tisztaságú vízben forraltuk 20 percig, majd a megfelelő HAP1-8 és oligo-dT primerekkel, a GenHunter „cDNS recovery” PCR protokollja szerint szaporítottuk fel, negyedére csökkentett dNTP mennyiség mellett (Liang és Pardee, 1998). | Anyag és módszer

30

A FRAGMENTEK KLÓNOZÁSA ÉS SZEKVENÁLÁSA Az újra felszaporított fragmentek elválasztása 1,5%-os TAE pufferral készített agaróz gélen történt. A visszaizolálás a Millipore DNA Gel Extraction Kitjével történt. A klónozás pGEM-T Easy (T/A cloning, Promega pGEM-T® Easy Vector System II.) vagy pBluescript vektorba (blunt end cloning, Stratagene, USA) ill. JM-109 kompetens sejtekbe történt. A plazmid DNS-t alkalikus lízis módszerrel tisztítottuk (Sambrook et al. 1989), az inszert meglétét EcoR1 és BstZ1 restrikciós hasítással erősítettük meg. A pozitív klónok tisztítása a QIAPrep Spin Miniprep Kit (QIAGEN, USA) felhasználásával történt a szekvenálást megelőzően. A szekvenálás közvetlenül a plazmidból az ABI BigDye® Terminator Cycle Sequencing v. 3.1 Kit (Applied Biosystems, USA) segítségével történt M13 primerekkel, 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, USA) készüléken.

PRIMERTERVEZÉS A primerek tervezését az alábbi web-alapú alkalmazásokkal végeztük: SGD Web Primer

Primer3

http://seq.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

A tervezett primerek in silico validálását hajtűképződésre, dimerképzési hajlandóságra nézve az alábbi web-alapú alkalmazásokkal végeztük: GeneWalker IDT Oligo Analyzer®

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html http://www.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer

Az PCR és RT-PCR reakciók során akalmazott primerek a következők voltak: ACTIN2 forward ACTIN2 reverse FERRITIN2a forward FERRITIN2a reverse FERRITIN2b forward FERRITIN2b reverse CAT4 forward CAT4 reverse

5’-GTG 5’-GAC 5’-GGG 5’-GTG 5’-TGT 5’-CTT 5’-ACG 5’-AAC

GGAS ATG GAA GCT GCT GG-3’ CTG CCT CAT CAT ACT CGG-3’ GAT ACA TCG TCA TGC TTC-3’ ATC AAA CTC AGA CAA CGG C-3’ GTA CCA TGC TAT GTA TGC-3’ TAC ATT TGA CGT CTC TGG-3’ GAC CAT CGTCAT CTT AGT CGA-3’ CCT AGT ATA GAT TAC CAG-3’

A kationos aminosavtranszporter direkt amplifikáláshoz a további primereket terveztük: CATJB1AF (fwd) CATJB1AR (rew) CATJJ1F: CATJJ1R: CATJJ2F: CATJJ2R: CATJJ3F: CATJJ3R:

5’-GGA 5’-CGC 5’-AAA 5’-CCA 5’-TGA 5’-TAG 5’-AGG 5’-CAA

CAA ATA ACG AGG ATG CAC CAC GTC

CAA ATG ATG TGC TTT ACA TCT ATT

TTG ATA GAC AAA GCA GAC AAT GTG

GAG AGC CTC CAT CCT TGC GGC GGA

CAG G-3’ ACT CCC-3’ ATC AGC-3’ TCA C-3’ TGG-3’ AAC G-3’ ATT C-3’ ACG-3’


31

PCR REAKCIÓ A DNS amplifikáló PCR reakció során 1 ng templát DNS-t tartalmazó oldatot használtunk fel, az 50 µl végtérfogatú reakcióelegyet az alábbiak alapján mértük össze molekuláris biológiai tisztaságú vízben. 10x Taq puffer

1x

2mM dNTP mix

0,2 mM nukleotidonként

Forward primer

1µM

Reverse primer

1µM

Taq DNS polimeráz (Fermentas, Litvánia)

1,25unit

25mM MgCl2

2mM

A PCR reakciót az alábbi protokoll alapján Techne 512 (Techne, USA) thermal cycler készüléken végeztük el: PCR-lépés Denaturáció Amplifikáció

Amplifikáció

Termináció

°C

Ciklusok száma

Időtartam

95 1 5 perc 95 10 15 mp 60-54* 45 mp 72 45 mp 95 35 15 mp 56 45 mp 72 45 mp 72 1 10 perc * ciklusonként 0,6°C-kal csökkentve a hőmérsékletet

SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR REAKCIÓ A szemikvantitatív RT-PCR Su et al (2004) kidolgozott módszere alapján történt, az alábbi módosításokkal Techne 512 (Techne, USA) thermal cycler készüléken: PCR-lépés Denaturáció Amplifikáció

Amplifikáció

Termináció

°C

Ciklusok száma

Időtartam

95 1 5 perc 95 10 15 mp 60-54* 35 mp 72 35 mp 95 35 15 mp 56 35 mp 72 35 mp 72 1 10 perc * ciklusonként 0,6°C-kal csökkentve a hőmérsékletet

Konstitutív, állandóan expresszálódó, konzervatív háztartási génként az aktin 300 bázis hosszú szakaszát vettük.


32

IN SILICO ELEMZÉSEK A bioinformatikai elemzések során több fajból származó nukleotid- és fehérjeszekvenciákkal

dolgoztunk.

A

fajok

nevei

és

a

szekvenciák

listája,

azonosítószámokkal együtt az 1. számú függelékben találhatók meg. A felhasznált szekvenciák a GenBank, EMBL, PDB és a SwissProt (később UniProt) adatbázisokból származnak. A szekvenciakereséseknél és összehasonlításoknál a BLAST (blastn, blastx, tblastx) 2.2.8 algoritmust használtuk. (Altschuh et al, 1997). Az adatbázisok elérhetőségét az 5. táblázat tartalmazza. Adatbázis neve GenBank

Internetes elérhetőség (URL) www.ncbi.nlm.nih.gov

EMBL

www.ebi.ac.uk/embl

PBD

www.wwpdb.org

SwissProt

www.expasy.org/sprot

UniProt

www.uniprot.org

Adatbázis jellege Elsődleges nukleotid adatbázis, fehérjetranszlátumok Elsődleges nukleotid adatbázis, fehérjetranszlátumok Nukleotidszekvenciák és fehérjék 3D strukturális adatbázisa, Hieararchikusan rendezett, magasan annotált fehérjeszekvencia adatbázis Egységesített, redundanciakerülő fehérjeszekvencia adatbázis

5. táblázat Az in silico elemzések során használt bioinformatikai adatbázisok

Az elemzések során a szekvenciákat FASTA formátumban alkalmaztuk (Hingap et al, 1999). A szakaszok megjelenítéséhez, rendszerezéséhez és elemzéséhez a BioEdit programcsomag 5.09-es verzióját használtuk. A szekvenciaillesztéseket a CLUSTALW (Thompson et al, 1997) alapértelmezett beállításaival végeztük, mely a BioEdit programcsomag részét képezi (Tippman, 2004). Az aminosavszekvenciák karaktereinek (negatív és pozitív töltöttség, amin és alkohol, alifás és aromás, kis méretű és kéntartalmú oldalláncok befolyása) elemzésénél és az ábrázolás során a Genedoc programcsomagot is igénybe vettük (Nicholas and Nicholas, 1997). Az illesztéseket Genedoc-ra jellemző *.msf és Bioedit által előnyben részesített *.gb és *.fas fájltípusban tároltuk. A filogenetikai törzsfát PAUP 4.0 szoftverrel készítettük el a neighbor-joining módszerrel elvégzett evolúciós távolsági adatokból (Swofford, 2001). A konzervatív régiókat az NCBI Conserved adatbázisban

Domain kerestük

elhelyezkedésének

Search

http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi

(Marchler-Bauer előrejelzése

és

Bryant,

2004).

során

A a

TM

domének TMNMM

(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM ) szoftvert használtuk. | Anyag és módszer

33

EREDMÉNYEK DDRT-PCR A kísérletek során a elsődleges feladatom annak a kérdésnek a megválaszolása volt, hogy mely gének vesznek részt a Conyza canadensis (L.) Cronq. paraquat-rezisztenciájában. Ezért elsőként a paraquat kezelésre indukálódó géneket határoztuk meg, Differential Display PCR technika segítségével. Annak érdekében, hogy a paraquatra adott specifikus válasz során indukálódó géneket el tudjuk különíteni az általános

reaktív

oxigénformák

okozta

stresszválasztól, az expressziós különbségeket mindkét biotípusban, paraquat és szuperoxidanion gyök generáló menadion kezelés után vizsgáltuk. A

kezelések

hatására

mindkét

biotípusban több új kifejeződő részszekvencia,

expressed sequence tag (EST) megjelenését tapasztaltuk, ami kezelésre indukálódó géneket jelez. A menadionkezelés lehetővé tette, hogy kizárjuk azokat a fragmentumokat, melyek reaktív oxigénformák okozta általános stressz válasz esetén is megnövekedett génkifejeződést mutatnak, így egyedül a paraquat hatására expresszálódó

fragmentumokra

koncentrálhattunk. A fragmentumok tisztítását és klónozását szekvenálás követte, ami által meghatározhatóvá

váltak

szekvenciái (13. ábra).

az

egyes

EST-k

13. ábra A szenzitív (S) és rezisztens (R) biotípus Differential Display RT-PCR mintázata paraquat (pq) és menadion (men) kezelést követően. Az izolált sávokat nyilak jelölik. 1.: S kontroll; 2.: S 5x10-4 M pq 3.: S 5x10-3 M men 4.: R kontrol, 5.: R 5x10-4 M pq 6.: R 5x10-3 M men 7.: DNS marker

| Eredmények

34

A DDRT-PCR gélből kinyert szakaszok szekvenálása után, azokat az adatbázisokkal összevetve négy EST-t azonosítottunk (6. táblázat). Ebből kettő a szenzitív és rezisztens biotípusból származó mintákban is hasonló mértékben megnövekedett expressziós szintet mutatott a kezelés hatására. A hasonlósági keresések után a 189 nukleotidnyi EST-t MYB transzkripciós faktorként, a 373 nukleotidnyit pedig az AtFerr2-vel mutatott hasonlósága alapján ferritinként azonosítottuk. A másik két gén lényegesen magasabb expressziós szintet a paraquattal kezelt rezisztens mintákban. Ezek közül az egyik, 149 nukleotidnyi fragmentum a CAT4 aminosav transzporterrel mutatott egyezést, a másik, 276 nukleotidnyi a vakuoláris H+ATP-ázokkal tűnt homológnak.

Név

Hossz S

R

Szekvencia

MYB

189

+

>Feltételezett MYB szekvencia, kromatogram alapján

+

TGACGTAACACAATCTTTCTACGTGTTTCTCTTTTATTCTTGACCATCATCATACCATAG TTTATAGGTTCTGTTGCTTTTTCTTTCACTGCAGCTTCATGCTTCTCATCCTTTTGTCCT CATCACGAGTGCCTAGCAGCCTGCCCTTAGTGCTGCCTCCATTAGTCTTGTAGTTAGGGA ATGCCATTA FER

373

+

+

>Feltételezett FER szekvencia, kromatogram alapján GTTCTATGTGTCCATGCCTATGTATGCCTTACTTTGATAGCAGCATAATGTAGCTCTCAA GGGATTAGCCAAGTTTTTTAAGGAGTCTAGTGAAGAGGAAAGGGAACATGCTGAAAAGTT TATGGAATACCAGAACAAACGTGGTGGTAAGGTGAAATTACAATCTATTTTGATGCCGTT GTCTGAGTTTGATCACGCTGAGAAAGGGGATGCACTTTATGCTATGGAGCTTGCATTGTC ATTGGAGAAATTGACAAATGAGAAACTTCTACATGTCCATGCGGTGGCCACCAAGAACAA TGATGTGCAATTGGCTGATTTTGTTGAAAGCGAGTTCTTGGGTGAACAGGTTGAGGCAAT CAGAAAAATCTCA

CAT

149

-

+

>Feltételezett CAT szekvencia, kromatogram alapján TGGACAACAATTGGAGCAGGAGTGTATATTCTAGTGGGAACAGTAGCTAGACAACACACA GGACCTGCTCTTGCTGTATCATTCTTCATCGATGGAGTAGCAGCTGCTCTCTCCGCTGTG AGCTATGCTGAGCTTGTCTCTCGTTGCTC

EmrE / DET3

276

-

+

>Feltételezett vakuoláris H-ATPáz szekvencia, kromatogram alapján TGTGTTTTTCCAGCCTAGCAGTAGACTCATATGAGATTAATGGTGAACGAGACATAAGGA TGAGTGTCAGCATCACCACCTAAGCCACCCATATTTCCATCGTCATCCGTTTTCCAGAAC GTGCTGTTAGAACTGTCAGATAGAGTTTCTAGGATGGAACGTACTTTCTTCTCACTCTTC ACAGATGGTGACAACACAACAGACTGAAATAAACAAAATAATCTGTAAAAAATATAAAGG ATAGTAAAAATGCCGACGGGAAAGAGAGTCAGAAGA

6. táblázat Paraquat kezelés hatására megjelenő EST-k szekvenciái

| Eredmények

35

CAT-HOMOLÓG A DDRT-PCR gélből izolált fragmentumok között megkülönböztetett figyelemmel vizsgáltuk a kationos aminosavtranpszorter-homológként azonosított szakaszt. Ezt a fragmentumot paraquatkezelést követően mind a szenzitív, mind a rezisztens biotípusból képesek voltunk izolálni, utóbbi biotípusban jelentősen megnövekedett expressziós szint mellett. Az általunk meghatározott szakasz a növényi transzporterek közül a CAT4-gyel nukleotid szinten 84%-ban egyezik (14. ábra), a transzlált fehérje szintjén pedig csupán 4% a különbség (15. ábra).

14. ábra CLUSTALW analízis alapján a 149 nukleotid hosszúságú szekvencia a prokarióta poliamin és növényi kationos aminosav transzporterkhez hasonlít (Thompson et al, 1997). PotE: E. coli putreszcin transzport protein (PotE) (gi|147330), CAT4 (Cationic amino acid transporter 4) (gi|30678908), CAT4: Arabidopsis thaliana, CAT: Conyza canadensis EST. A nukleotidszekvencia alapján a fekete részek teljes, a szürke részek részleges egyezést jelölnek. A gének alatti sorban a konszenzus szekvenciát tünteti fel a program.

15. ábra Transzlált aminosav-szekvenciarészletek CLUSTALW analízise (Thompson et al, 1997). CAT4 (Cationic amino acid transporter 4) (gi|30678908), CAT: Conyza canadensis EST, CAT4: Arabidopsis thaliana, PotE: E. coli putreszcin transzport protein (PotE) (gi|147330). Az egyezményes egykarakterből álló rövidítés szerinti aminosavak az alábbi színkód szerint jelölve: Prolin Glycin Apró Kisméretű Pozitív Negatív Töltött Amfoter Poláros Alifás Aromás Hidrofób

| Eredmények

36

POLIAMIN TRANSZPORTEREK IN SILICO VIZSGÁLATA A kapott fragmentumunk nagyfokú hasonlósága alapján in silico vizsgálatokat végeztünk

a

alátámasztandó

növényi a

poliamin-

hasonlósági

és

keresés

kationos

aminosavtranszporterek

eredményeit

(16.

ábra).

között,

Meghatározásuk

kiindulópontjaként az E. coli PotE génje által kódolt fehérje szekvenciáját vettük. (Igarashi és Kashiwagi, 1999, Tomitori et al, 1999, Tomitori et al, 2001) A PotE, ősi jellegű poliamin transzporter fehérje térszerkezetéhez hasonlót találtak az élesztőben is, így várható volt, hogy hasonló többféle poliamin és aminosav transzportjára képes rendszereket a növényi genomokban is találunk. Rendkívül fontos ismét kiemelni, hogy a PotE-vel homológ TPO fehérjét élesztősejtben fokozott mértékben expresszálva megnövekedett paraquatrezisztenciát tapasztaltak. Ezen kívül a PotE fehérjén putreszcin-kötőhelyet sikerült lokalizálni, amely hasonlóság a poliamin-transzportfolyamatokra és a paraquat-rezisztenciára nézve kulcsfontosságú (Tomitori et al, 2001, Uemura et al, 2005).

| Eredmények

37

16. ábra Arabidopsis kationos aminosav transzporterek Thompson et al, 1997 szerinti CLUSTALW hasonlósági analízise. A hasonló karakterű aminosavak egyezését a diagram színmegfeleléssel ábrázolja. Az aminosavak jellemzését Az egyezményes egykarakterből álló rövidítés szerinti aminosavak az alábbi színkódot lásd 15. ábra.

| Eredmények

38

A PotE-vel homológ illetve ortológ fehérjéket az NCBI BLASTP programjával detektáltuk a növényi genomokban. Ez az alkalmazás az illesztéseknél jobban figyelembe veszi a lokális hézagokat, tehát a hasonlósági kereséseknél alkalmazott helyettesítési mátrix lehetővé teszi a divergálódott szekvenciák jobb illesztését. Az inkább lokális, mint globális illesztések jobban a figyelembe veszik a strukturális és funkcionális hasonlóságot. A program grafikus kimenetele és kapcsolódási pontjai könnyebb áttekinthetőséget biztosítanak. Feltétel volt, hogy a várhatósági érték (expecting rate, E) minél kisebb maradjon, ezért a statisztikai határnak elfogadott 0.05-ös értéknél nagyobb E értékeket már nem vettük figyelembe. A keresést standard BLOSUM 62 helyettesítési mátrix-szal végeztük a növényeken (Viridiplantae) belül. Az eredmények azt mutatták, hogy a PotEhez a növényi genomokból leginkább a CAT4 Arabidopsis thaliana genomból származó gén hasonlít, melyhez a DDRT-PCR kísérletünk CAT fragmentuma is hasonlított (7. táblázat). gi Azonosító Acc.szám Meghatározás Szignifikáns hasonlóságot mutató fehérjék gi:22330822 NP_187022.2 CAT4 kationos aminosav tpt,

Pontszám

E érték

63,2

5,0E-10

59,7

7,0E-09

56,6

5,0E-08

53,1

6,0E-07

47,0

4,0E-05

43,9

4,0E-04

41,6

2,0E-03

35,8

8,6E-02

33,5

4,8E-01

33,5

5,1E-01

A.thaliana gi:18390592

NP_563754.1

CAT9 kationos aminosav tpt,


NP_849822



NP_198510.2



NP_196097.1

gi:30685317

NP_193844.2


A.thaliana CAT1 kationos aminosav tpt,


NP_173155.1


A.thaliana Kevésbé szignifikáns hasonlóságot mutató fehérjék gi:15226868 NP_181041.1 CAT5 kationos aminosav tpt,


NP_566460.1

gi:15228334

NP_187671.1

Aminosav permeázok családjába tartozó feh. CAT7 kationos aminosav tpt,

A.thaliana 7. táblázat A PotE prokarióta poliamin transzporterhez szekvenciájukban szignifikáns hasonlóságot mutató növényi transzporterek. Szignifikáns a hasonlóság, amennyiben az E várhatósági érték 5,0E-02 alatt marad. Amennyiben E meghaladta az 5,0E-01 értéket, a hasonlóságot elvetettem. | Eredmények

39

A PotE-vel mutatott homológiát egyéb, páros hasonlításokkal is alá kívántuk támasztani, ehhez az NCBI Pairwise BLAST felületét választottuk. A két fehérje hasonlóságát többféle helyettesítési mátrixokkal is ellenőriztük, mivel a BLOSUM és a PAM algoritmus más-más aminosav-cserékre érzékeny. A pontozást és a számszerű eredményeket a 8. táblázatban tüntettem fel.

Helyettesítési mátrix

pontszám

E érték

egyezés

pozitiv tal.

hézag

BLOSUM50

55,2 (181)

3,00E-06

77/378 (20%)

159/378 (41%)

33/378 (8%)

BLOSUM62

61,2 (147)

4,00E-08

75/378 (19%)

158/378 (40%)

33/378 (8%)

PAM250

45,8 (154)

2,00E-03

65/330 (19%)

139/330 (41%)

21/330 (6%)

8. táblázat Prokarióta PotE és Arabidopsis CAT4 páros illesztése, eltérő helyettesítési mátrixokkal

Grafikusan egyértelművé válik az egyezés: minél inkább lineáris a vonal, annál magasabb fokú az egyezés (17. ábra).

17. ábra E.coli PotE és Arabidopsis CAT4 páros illesztése, eltérő helyettesítési mátrixokkal. Az X tengelyen az Arabidopsis-ból, az Y tengelyen a Coli-ból származó fehérje szekvenciáját ábrázoltuk.

| Eredmények

40

A PotE és CAT4 elsődleges szerkezetéből eredő homológiák feltárása után a másodlagos szerkezeti jellegek feltárását végeztük el a SWISS-PROT oldalán található analitikai szoftverek segítségével (18. ábra). ____________HEE_______HHHHHHHHHHEEEE___EEE__EEEEEE__E________EEEEEEHHHHHHHHHHHHHHHH___________ EEEEEE_____HHHHHHHHEEEEEE___EEE______HEHHHHHEEE______EE_______HHHH_________EEE___HHHHHHHHEEEEE E_______EEEEEEEE___EEEEEEEE___EE_____________________EE___EEEEEEEE___EE___H_H______________EEE EHHHHHHEEEEEEEE_____________E_______HHHHHHEE____EHHHHHHHH_______HHHHHHH______________________E EEEHHHHHHHHHHHHHHHH_HHHHH__EEHHHHHHHHHHE_________________E__________H__HHHH______________HHHHH ______HHHHHHEEEEEEHH_H_HHHHH________EEEE___EEEEE__EEEE________H_________E_________EEEE___EEEEE _____EEHHEEEHEH__EEEEEE_____H_____________________

18. ábra A CAT4 másodlagos struktúrája a SWISSPROT szoftverelemzése alapján. (H=hélix, E=lánc, _ = nincs előrejelzés)

A transzporterek in silico elemzése során központi kérdésnek tekintettük a szubsztrát kötőhelyek meghatározását. Mivel a paraquat és a putreszcin töltéseloszlása hasonló, az elemzés során a potenciális putreszcinkötő-helyeket kívántuk feltérképezni a transzmembrán domének meghatározásával. Az ábrákon az elsődleges szerkezetből előrejelzett transzmembrán doméneket a piros, a citoplazma felé eső aminosavszekvencia részeket a kék, míg a külső tér felé néző régiókat a lila szín jelöli. A belső tér felé néző régiókban található glutaminsavakat zöld nyilak jelölik. A transzmembrán domének elemzését elvégeztük az összes Arabidopsis CAT, az E. coli PotE, az Ochrobactrum PqrA és az élesztő TPO1 génterméke esetén (2.sz. függelék). Mutáns E. coli törzseken végzett korábbi kísérletek igazolták, hogyha a PotE Glu77, Glu277, illetve Glu433 pozíciójú glutaminsav módosul, akkor a putreszcin felvétel jelentős mértékben csökken, így elmondható, hogy mindhárom aminosav részt vesz a PotE putreszcin kötőhelyének kialakításában. (Igarashi és Kashiwagi, 1999) A kötőhelyekben résztvevő glutaminsavak (zöld nyíl) az N-terminális felől haladva a II., a VI. és a XII. transzmembrán domént (piros szín) követő citoplazma felé néző hidrofil részen (kék szín) találhatóak meg (2.sz. függelék). Az élesztőből származó TPO1 hasonló térszerkezettel bír: a putreszcin-ornitin antiporter ligandkötőhelyét kialakító három glutaminsav, a Glu207, a Glu324 és a Glu574 itt is a II., a VI. és a XII. transzmembrán domént követő citoplazma felé mutató, hidrofil oldalon helyezkednek el. A TPO1 N-terminális felöli oldalán, az első transzmembrán régió előtt majdnem kétszáz aminosavnyi hosszban szerinben és treoninban gazdag régiót találunk, melyet a proteinkinázok foszforilálhatnak (Igarashi és Kashiwagi, 1999).

| Eredmények

41

A fentiek alapján a kationos aminosav transzporterek családjában is olyan fehérjét kerestünk, melynél a II., VI. és XII. transzmembrán domént követő, citoplazma felé néző régióban glutaminsavakat találunk. Bár a család több tagjának N-terminálisa is a citoplazma felé néz (CAT1, CAT2, CAT3, CAT4, CAT5), közülük mégis a CAT4 az, amelyik mindhárom kritériumot teljesíti (II., VI., XII. TMD-t követő helyeken Glu). Ezt azért tartottuk fontosnak meghatározni, mert így könnyebben kialakítható az a specifikus töltéseloszlással és kötési távolságokkal bíró térszerkezet, melyhez a putreszcin, illetve adott esetben a hasonló méretű és töltéssel rendelkező paraquat képes kötődni. A PotE fehérjével paraquat-transzport szempontjából analóg molekula, az

Ochrobactrum-ból származó PqrA fehérjénél megfigyelhető, hogy a fehérje citoplazma felé néző régiói között is csupán háromnál találunk glutaminsavat, viszont itt egy régión belül akár többet is: a IX.-et három, a XI-et négy is követi (V: Glu194, IX: Glu327, Glu332, Glu337, XI: Glu396, Glu399, Glu407, Glu410). A CAT4 transzporternél is megfigyelhetjük, hogy az aminosav-transzportereknél már felsorolt régiók közül mind a VI., mind a XII. transzmembrán domént követő régióban több glutaminsav helyezkedik el: vélhetőleg a kationok számára energetikailag kedvező, kapcsolódást megkönnyítő, negatív töltésű környezet létrehozásában fontosak.

DIREKT SZEKVENÁLÁS In silico elemzések alapján a CAT4 teljesítette azokat a feltételeket, melyeket egy akár paraquat transzportjára is alkalmas növényi kationos aminosav transzporterrel szemben támasztottunk, így a további, molekuláris biológiai elemzések alkalmával a CAT4, illetve az ahhoz hasonló Conyza-gén paraquat transzportban betöltött szerepét kívántuk tisztázni. Az Arabidopsis forrásszekvencia alapján tervezett primereket először az

Arabidopsis-hoz rendszertanilag és genomjában is igen hasonló repcén (Brassica napus) alkalmaztuk, majd a szekvenálási eredményeket összevetettük a genomi adatbázisokkal. Ezek alapján kiderültek azok a régiók, melyek a rokon növényekben azonosak, illetve azok, melyek a közeli rokonokban is különböznek.

| Eredmények

42

Az eredmények alapján a primerek szekvenciáját oly módon pontosítottuk, hogy feltételezhetően az Arabidopsis-tól genomjában markánsan eltérő Conyza-ban is képes legyen a CAT4 szekvencia parciális szakaszát felszaporítani PCR-reakció során. A polimeráz láncreakció protokolljának optimalizálásával sikerült elérni, hogy egy 490 nukleotid hosszú, parciális szekvenciát nyertünk a repce genomiális DNS-éből. Az ennek alapján újratervezett, pontosabban kötődő primerekkel 148 nukleotidnyi expresszálódó szekvenciarészletet amplifikáltunk a repcéből nyert, reverz transzkripció során preparált cDNS poolból. Ezt a primerpárt használtuk a Conyza esetében, amivel hasonló hosszúságú, a CAT4-gyel majdnem teljes hasonlóságot mutató szakaszt sikerült kimutatni (19. ábra). A >0204_A CAT sequence from rape TGCAGACTACAGCCTTTGACTTGTCGCTAtTGGTAATGAAACTTTTTCTCCCCATTTGTGAAACCAACCA GCATTTGTGTTCCTGTCAATGTTTGTTGATTGTGTTCCTTAATTTTTTTCAAAGGAGTTGGAACAACAAT AGGAGCAGGAGTGTATATTCTCGTGGGAACAGTAGCTAGAGAACACACAGGACCTGCTCTTGCTGTTTCC TTCTTCATCGCTGGAGTAGCAGCTGCTCTCTCCGCGTGTTGTTACGCTGAGCTTGCTTCTCGATGTCCAT CTGCTGGCAGTGCTTATCATTATGCTTACATATGTCTCGGAGAAGGGTATGGAATAAATGGATTCTTATG GTAGAATTGATCTGCTTTAAAGCTGAGACTCTCTCTTGTTGTTGTTGTTTCATAGGATTGCTTGGTTGGT TGGTTGGGCACTGGTGTTGGATTATACTATTGGTGGATCAGCCATTGCACGTGGCATAACTCCAAATCTG

B GGAGTTGGAACAACAATAGGAGCAGGAGTGTATATTCTCGTGGGAACAGTAGCTAGAGAACACACAGGAC CTGCTCTTGCTGTTTCCTTCTTCATCGCTGGAGTAGCAGCTGCTCTCTCCGCGTGTTGTTACGCTGAGCT TGCTTCTCGATGTCCATCTGCTGGCAGTGCTTATCATTATGCTTACATATGTCTCGGAGAAGGGGGATTG CTTGGTTGGTTGGTTGGGCACTGGTGTTGGATTATACTATTGGTGGATCAGCCATT

19. ábra A, Repcéből származó PCR-reakció során nyert CAT DNS szekvencia (exonok / intronok). B, Repcéből származó RT-PCR során nyert CAT cDNS szekvencia

A szekvenciát Pairwise BLASTn elemzéssel összehasonlítottuk az Arabidopsis CAT4-gyel. BLOSUM62 helyettesítési mátrixot használtunk (20. ábra). Az intronok kivágása után, aminosavra transzlált szekvenciát Pairwise BLASTp elemzéssel összehasonlítottuk az Arabidopsis CAT4-gyel, BLOSUM62 helyettesítési mátrixot alkalmazva (21. ábra). Mint látható, a két Brassicaceae családba tartozó faj, a repce és az Arabidopsis CAT4 parciális szekvenciája nukleotid szinten több mint 90%-os hasonlóságot mutat, míg aminosav szekvenciájában teljesen egyezik.

| Eredmények

43

Score = 294 bits (153), Expect = 2e-76 Identities = 187/204 (91%), Gaps = 0/204 (0%) Strand=Plus/Plus Query

124

Sbjct

349

Query

184

Sbjct

409

Query

244

Sbjct

469

Query

304

Sbjct

529

GGAGTTGGAACAACAATAGGAGCAGGAGTGTATATTCTCGTGGGAACAGTAGCTAGAGAA |||||||| |||||||| |||||||||||||||||||| |||||||| ||||||||||| GGAGTTGGGACAACAATTGGAGCAGGAGTGTATATTCTTGTGGGAACGGTAGCTAGAGAG

183

CACACAGGACCTGCTCTTGCTGTTTCCTTCTTCATCGCTGGAGTAGCAGCTGCTCTCTCC ||||||||||||||||||||||| || |||||||| ||||||||||| ||||||||||| CACACAGGACCTGCTCTTGCTGTATCATTCTTCATTGCTGGAGTAGCTGCTGCTCTCTCT

243

GCGTGTTGTTACGCTGAGCTTGCTTCTCGATGTCCATCTGCTGGCAGTGCTTATCATTAT || |||||||| ||||||||||||||||| |||||||||||||| ||||||||||||||| GCCTGTTGTTATGCTGAGCTTGCTTCTCGTTGTCCATCTGCTGGGAGTGCTTATCATTAT GCTTACATATGTCTCGGAGAAGGG || ||||| ||||| ||||||||| GCGTACATTTGTCTTGGAGAAGGG

408

468 303 528

327 552

Score = 154 bits (80), Expect = 4e-34 Identities = 84/86 (97%), Gaps = 0/86 (0%) Strand=Plus/Plus Query

405

Sbjct

551

Query

465

Sbjct

611

GGATTGCTTGGTTGGTTGGTTGGGCACTGGTGTTGGATTATACTATTGGTGGATCAGCCA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||| GGATTGCTTGGTTGGTTGGTTGGGCACTGGTGTTGGATTATACAATTGGTGGATCAGCCA TTGCACGTGGCATAACTCCAAATCTG |||| ||||||||||||||||||||| TTGCCCGTGGCATAACTCCAAATCTG

464 610

490 636

20. ábra Repcéből és Arabidopsisból származó CAT4 szekvenciák nukleotidszintű Pairwise BLAST elemzése.

Query

1

Sbjct

37

Query

61

Sbjct

97

GVGTTIGAGVYILVGTVAREHTGPALAVSFFIAGVAAALSACCYAELASRCPSAGSAYHY GVGTTIGAGVYILVGTVAREHTGPALAVSFFIAGVAAALSACCYAELASRCPSAGSAYHY GVGTTIGAGVYILVGTVAREHTGPALAVSFFIAGVAAALSACCYAELASRCPSAGSAYHY AYIC AYIC AYIC

60 96

64 100

21. ábra Repcéből és Arabidopsisból származó CAT4 szekvenciák aminosavszintű, Pairwise BLASTp elemzése | Eredmények

44

TRANSZPORTER-INHIBITOR (KNO3) ALKALMAZÁSA Az in silico vizsgálatok után meg kívántuk erősíteni hipotézisünket, miszerint a rezisztencia-mechanizmus során a paraquat a hatáshelyről metabolikusan inaktív kompartementbe, a vakuólumba jut. A transzportmechanizmus során az aktív ágensnek akár natív, akár konjugátum formájában legalább két membránon is át kell jutnia. Korábbi kísérleteink során kiderült, hogy az ioncsatornák membránban lokalizált (Fo) részének blokkolásával, valamint az E. coli paraquat rezisztenciáért felelős kis moltömegű, a transzporterek Fo régiójával homológ EmrE fehérje speciális gátlásával a helyreállás megakadályozható (Halász et al 2002). Jelen kísérleteink során vakuoláris protonpumpa ATP-ázokat gátló kálium-nitrátot alkalmaztunk

(22.

ábra).

Az

inhibitor

hatásosnak

bizonyult

a

helyreállás

megakadályozásában a rezisztens biotípusban. Ha a nitrátot 1 órával a paraquat kezelést követően adtuk, mintegy 50 %-ban gátolta a helyreállás folyamatát. Többszöri nitráttal történő permetezés (1, 2, 3 és 4 órával a paraquat kezelés után), valamint a paraquattal kezelt levelek úsztatása nitrát tartalmú oldatban megakadályozza a helyreállás folyamatát. Mivel a nitrát szelektíven blokkolja a vakuólumokban található ATP-ázokat, melyek a vakuoláris membránok energizálásában vesznek részt, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a paraquat szekvesztráció protongrádiens energiája terhére történik. A szenzitív biotípusban korábbi adataink szerint a N4N1 -diciklohexil-karbodiimid (DCCD), valamint a tetrafenil-foszfonium-klorid (TPP) 2 órával a Pq kezelés után alkalmazva csekély mértékben ugyan, de fokozta a paraquat által okozott gátlást (Halász et al. 2002). Jelen kísérletek során azt tapasztaltuk, hogy a nitrát alkalmazása a szenzitív biotípusban is súlyosbítja a paraquat hatását. Mivel a szenzitív növényeknél nem figyelhető meg helyeállás, ez a hatás úgy értelmezhető, hogy a gáltók által befolyásolt mechanizmusok mindegyike részt vehet egy korlátozott ideig a szenzitív növények általános stresszválaszának kialakításában és a paraquat transzportban .

| Eredmények

45

Nitrátkezelés hatása rpq

rpqKNO3

spq

spqKNO3

1 0,9 0,8

Fv/Fm

0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

1

2

3

4

5

6

Idő (h)

22. ábra 10mM nitrát hatása a Conyza canadensis szenzitív és a rezisztens biotípusának a klorofilla fluoreszcencia indukciójával (Fv/Fm) jellemzett funkcionális aktivitására paraquatos kezelést (5*10-4 M) követően. A gátlót 1h-val a paraquat kezelés előtt (0h) juttattuk a növényekre, majd ezt követően óránként megismételtük a nitrát metabolizációja miatt. rpq: rezisztens kontroll rpqKNO3: rezisztens, nitráttal kezelt; spq: szenzitív kontroll; psqKNO3: szenzitív, nitráttal kezelt; (n=15).

Összhangban

a

bevezetőben

említett

ABC-transzportergátlókkal

végzett

kísérletekkel (Halász et al, 2002) eredményeink is arra utaltak, hogy a helyreállás folyamatában valószínűleg nem a bonyolult szerkezetű ABC transzporterek, hanem kisebb szállítófehérjék vesznek részt.

| Eredmények

46

A TELJES FERRITIN SZEKVENCIA MEGHATÁROZÁSA ÉS ELEMZÉSE A differential display RT-PCR kísérletben további fontos eredmény volt a Conyza ferritin gén azonosítása. A mindkét biotípusból nyert, paraquatkezelés hatására azonos expressziós szint növekedést mutató, egymással egyező EST-k mind nukleotid-, mind transzlált aminosav-szekvenciájukban nagyfokú hasonlóságot mutatnak más, növényi ferritin molekulákkal (23. ábra).

23. ábra DDRT-PCR gélből izolált EST és a dohány ferritin molekulájának CLUSTALW analízise (Thompson et al, 1997). EST: általunk izolált és kromatogram alapján meghatározott szekvenciájú nukleotidszakasz, Nicotiana: dohány ferritin szekvencia (gi|22859013). A nukleotidszekvencia alapján a fekete részek teljes, a szürke részek részleges egyezést jelölnek. A gének alatti sorban a konszenzus szekvenciát tünteti fel a program.

A

részszekvenciát

követően

mindkét

biotípusból

származó

génszakaszt

meghatároztuk teljes hosszában. A szenzitív és a rezisztens növényekből nyert minták teljes szekvenciái között sem találtunk különbséget. A teljes hosszában meghatározott szekvenciát elhelyeztük a GenBank elsődleges nukleotid-szekvencia adatbázisban, az AJ786262 GI:50787936 hozzáférési szám alatt (3.sz. függelék). Ezt követően a Conyza ferritin szekvenciáját in silico elemzéseknek vetettük alá. A

Conyza ferritin szekvenciájának elemzése során azonosítottuk mind a prekurzor plasztiszba juttatásához szükséges TP tranzit peptidet, mind az érett fehérje stabilitásáért felelős EP extenziós peptidet (Lobreaux et al, 1992) (24. ábra).

| Eredmények

47

24. ábra Conyza canadensis (gi|50787936), Arabidopsis thaliana (gi|20148572), Nicotiana tabacum (gi|22859013) , Vigna unguiculata (gi|2970653) ferritinek Thompson et al, 1997 szerinti CLUSTALW analízise. Az azonos aminosavak fekete, a nagymértékben hasonlók szürke kiemeléssel jelölve. A csillagok azokat az aminosavakat mutatják, melyek megfeleltethetőek a humán H ferritinek ferredoxáz centrumának. A fehér nyíl a tranzitpeptid hasítási helyét jelöli.

A szekvenciát ezek után ismételten összevetettük az eddig ismert ferritinekkel (9. táblázat). Forrásként a cDNSről transzlált Conyza canadensis szekvenciája mellett a főbb, ismert növényi aminosav szekvenciákat vettük, melyet követően filogenetikai analízisnek vetettük alá a szekvenciákat. Az eredmények azt mutatták, hoyg a Conyza-ból származó ferritin szekvencia leginkább a dohánynövény, az Arabidopsis ferritin3, illetve a szójabab ferritin3 molekuláival mutat filogenetikai rokonságot. (25. ábra és 26. ábra)

| Eredmények

48

Rövidítés

UniProt azonosító

Latin név

ARA1

Q39101

Arabidopsis thaliana

ARA2

Q9S756


ARA3

Q9SRL5


CON

Q6A196

Conyza canadensis

MAL

Q94FY2

Malus xiaojinensis

MED

Q9ZP90

Medicago sativa

NIC1

Q8RX97

Nicotiana tabacum

NIC2

Q8H1T3

Nicotiana tabacum

ORY A,

Q6VVA5

Oryza sativa

ORY B

Q8L5K0

Oryza sativa

ORY C

Q8LK80

Oryza sativa

PIS

P19975

Pisum sativum

PHA

P25699

Phaseolus vulgaris

PHA AN

Q66N72

Phaseolus angularis

SOY 1

P19976

Glycine max

SOY 2

Q94IC4

Glycine max

SOY 3

Q948P6

Glycine max

SOY 4

Q948P5

Glycine max

SOY B

Q941G7

Glycine max

TRI

Q5G1L6

Triticum aestivum

TRI MC

Q6DQK1

Triticum monococcum

VIG2

Q41709

Vigna unguiculata

VIG3

Q65100

Vigna unguiculata

ZEA1

P29036

Zea mays

ZEA2

P29390

Zea mays

9. táblázat Ismert növényi ferritin gének

| Eredmények

49

25. ábra Ismert ferritin fehérjék CLUSTALW analízise (Thompson et al, 1997). Az egyezményes egykarakterből álló rövidítés szerinti aminosavak színkóddal jelöltek, jellemzést lásd 15. ábra.

| Eredmények

50

26. ábra Ferritinek molekuláris törzsfája. Az analízis során az alábbi fajok ferritinjeinek aminosavszekvenciáit vettük figyelembe: Arabidopsis thaliana ARA1, ARA2, ARA3 (Q39101, Q9S756 and Q9SRL5), Conyza canadensis CON (Q6A196), Malus xiaojinensis MAL (Q94FY2), Medicago sativa MED (Q9ZP90), Nicotiana tabacum NIC1 és NIC2 (Q8RX97, Q8H1T3), Oryza sativa ORY A, ORY B és ORY C (Q6VVA5, Q8L5K0, Q8LK80), Pisum sativum PIS (P19975), Phaseolus vulgaris PHA (P25699), Phaseolus angularis PHA AN (Q66N72), Glycine max SOY 1, SOY 2, SOY 3, SOY 4 és SOY B (P19976, Q94IC4, Q948P6, Q948P5, Q941G7), Triticum aestivum TRI (Q5G1L6), Triticum monococcum TRI MC (Q6DQK1), Vigna unguiculata VIG2 és VIG3 (Q41709, Q65100) és Zea mays ZEA1 és ZEA2 (P29036, P29390). A zárójelekben az Uniprot adatbázisból származó elsődleges hozzáférési számot (primary accession number) adtuk meg. A filogenetikai törzsfát a “neighbor-joining” módszerrel számolt evolúciós távolsági adatok alapján származtattuk (Saitou and Nei, 1987).

| Eredmények

51

A GÉNEXPRESSZIÓ VÁLTOZÁSOK MEGERŐSÍTÉSE SZEMIKVANTITATÍV RT-PCR TECHNIKÁVAL

A DDRT-PCR-ben kapott expressziós eredményeket szemikvantitatív RT-PCR vizsgálattal erősítettük meg. A kromatogramból származtatott szekvenciák alapján a kiemelten fontos EST-kre specifikus primereket terveztünk. A vizsgálatot mindkét biotípusban, natív és paraquat-kezelt mintán végeztük el. A PCR termékek mennyiségi összehasonlítása egy konstitutíven expresszálódó háztartási gén, az aktin (ACT) termékéhez viszonyítva történt. Az itt kapott eredmények összhangban álltak a DDRTPCR foretogramjával (27. ábra).

27. ábra Szemikvantitatív RT-PCR eredménye. S: szenzitív, PqR: paraquat rezisztens, S+Pq: paraquat kezelt szenzitív, PqR+Pq paraquat kezelt rezisztens minta.

A FER gén expressziója mindkét biotípusban, egyaránt megnövekedett a paraquatkezelésre. A CAT gén expressziója a kezelés hatására indukálódott, és szintjük a rezisztens biotípusban volt magasabb, miközben az aktin primerekkel készített minták végig állandó expressziós szintet mutattak.

| Eredmények

52

EREDMÉNYEK MEGVITATÁSA A

betyárkóró

herbicidhasználat

(Conyza

canadensis

következményeként

/L./

kialakult

Cronq.)

az

ismétlődő,

paraquat-rezisztens

tartós

biotípusát

a

nyolcvanas években észlelték. Rezisztencia faktora az összes ismert rezisztens növényfaj közül a legmagasabb. Ellenállóképességének magyarázatára több elmélet született, de egyik sem bizonyult cáfolhatatlannak. A korábbi kutatásainkból kiderült, hogy a paraquat a kloroplasztiszba, a hatáshelyére bejutva, fényindukált mechanizmus során mindkét biotípusban kifejti gátló hatását és funkcionális aktivitás csökkenést okoz, amit a rezisztens biotípus esetében 3-4 óra múlva helyreállás követ (Lehoczki és Szigeti, 1988, Váradi et al 2000). A helyreállási folyamat fehérjeszintézis gátlóval (cikloheximid) megakadályozható, tehát a folyamathoz

de novo fehérjeszintézis szükséges (Darkó et al, 1994). A rezisztencia mechanizmusban a aktív oxigén formákat elimináló rendszerek (SOD, APX, CAT) aktivitása nem növekedett meg. A szenzitív és rezisztens biotípus egyaránt érzékenyen reagál szuperoxid-anion gyök generáló (menadion, bengálvörös) vegyületekkel történtő kezelésre. A paraquat nem metabolizálódik, a rezisztens növényekben a kezelést követően hónapok múlva is magas koncentrációban található meg az intracelluláris térben. Sejtfrakcionálási kísérleteink során a kezelt növények sejtfal, valamint citoplazmatikus és vakuoláris frakcióinak paraquat tartalmát megvizsgálva kiderült, hogy a herbicid feltehetően egyfajta szekvesztrációs mechanizmus segítségével metabolikusan inaktív kompartmentben, a vakuólumban halmozódik fel. A szekvesztrációban résztvevő, paraquat transzportjára képes fehérjék feltárása választ adhat a Conyza canadensis (L.) Cronq. rendkívül magas herbicidrezisztenciájára. Korábbi cikloheximides kezelések (Darkó et al, 1994) de novo fehérjeszintézisre engedtek következtetni, ezért a paraquatkezelés hatására indukálódó gének meghatározása megfelelő kiindulási alapot képezett a további kérdések megválaszolására. A paraquat számos más herbicidhez hasonló módon szuperoxid gyökök generálásával fejti ki hatását, azonban egyéb gátlós kísérleteink alapján kimutattuk, hogy a rezisztencia csak a paraquattal szemben áll fenn. Ezért az expressziós kísérletek során mindkét biotípus esetén az indukálódó gének közül a szuperoxid-stresszel összefüggő „expressziós háttérzajt” megszűrendő, a kizárólag paraquat-indukáltakat úgy választottuk ki, hogy párhuzamosan a szuperoxidgyök generáló menadionnal is kezeltük a növényeket. | Eredmények megvitatása

53

Az expressziós vizsgálatokat először differential-display PCR technikával végeztük el, majd eredményeinket szemikvantitatív PCR-rel is megerősítettük. A vizsgálatok során négy gén, egy myb-faktor, egy vakuoláris H+ATPáz, egy ferritin és egy kationos aminosavtranszporter homológ magasabb expresszióját mutattuk ki. Ezek közül a ferritin mindkét biotípus esetén egyformán indukálódott, ezért az általános, paraquatkezelésre adott molekuláris válaszok megismerése érdekében a ferritin szerepét is tisztázni kívántuk. A leginkább a lipidmembránokat roncsoló reaktív hidroxil gyök termelődése szempontjából fontos a szabad Fe3+ szint intracelluláris szabályozottsága. (Halliwell, 1993) Ezt a feladatot legfőképpen a multimer vasraktározó fehérjék, a vasháztartás egyensúlyáért felelős ferritinek látják el (Dellagi et al, 2005). A 24 alegységből összeálló ferritinek minden sejtben megtalálhatóak, és akár 4500 vas atomot is képesek Fe(OH) formájában a molekula középső részén tárolni, így szabályozva a sejtben a szabad formában előforduló vas szintjét (Briat et al, 1999). A ferritin a vasat redukált formájában köti meg, és juttatja középső magjába, majd a sejt szükségleteinek megfelelően ferroxidáz aktivitása következtében képes annak oxidált formáját felszabadítani. (Balla et al, 1992) Általános, védekezésben betöltött funkcióját sikerült közvetlenül is bizonyítani. Transzgénikus dohányban fokozott ferritin expresszió mellett azt tapasztalták, hogy a növény sokkal jobban képes ellenállni az oxidatív és a patogének által okozott stressznek, mint vad típusú társai. (Deák et al, 1999) A ferritin gének differenciált expressziójával kapcsolatban több kutatást is végeztek. Lupinus esetében ABA és vas, Arabidopsis-ban pedig ABA, vas és H2O2 hatását vizsgálták a ferritin expressziójára. Arabidopsis-ban ezen kívül a ferritin gén paraquat indukált expresszióját tapasztalták, míg ez a szint szingletoxigén jelenlétében az expressziós szint nem változott. (Camp op den et al, 2003). A megfigyelést megerősítik a paraquat kezelt Conyza-n végzett expressziós vizsgálataink. Eredményeink azt mutatják, hogy a ferritinek mind a szenzitív, mind a rezisztens biotípusban, csak a paraquat kezelés hatására mutatnak megnövekedett expressziós értéket. Ez bizonyítékként szolgálhat, hogy a paraquat által okozott stresszre a növény átmeneti válaszként a ferritinek fokozott expressziójával válaszol, kivonva a rendszerből a Fenton-reakcióban résztvevő Fe3+ ionokat.

| Eredmények megvitatása

54

Mivel a ferritin teljes szekvenciáját meghatároztuk, fontosnak tartottuk a ferritinek alapján a filogenetikai kapcsolatok tisztázását is, mellyel további gének kimutatásának tervezését segíthetjük elő. Azért is fontos kiemelni a Conyza ferritin génjének szekvenciáját, mivel az általunk kimutatott volt a legelső, teljes hosszában meghatározott, genomi adatbázisokban általunk közölt kódoló szakasz az eddig teljesen ismeretlen genomú Conyza canadensis-ből. Ferritineket több fajból sikerült már izolálni, különálló, kisebb géncsaládok kódolják. Eddig az Arabidopsis-ban, lóbabban és szójában négy külön ferritin gént azonosítottak a családon belül, míg hármat találtak a Lupinus luteus-ban, kettőt pedig a kukoricában és a Vigna unguiculata-ban (Petit et al, 2001, Connolly és Guerinot 2002). A hasonlósági keresések alapján és a Conyza ferritin szekvenciájának elemzése során megtaláltuk mind a prekurzor plasztiszba juttatásához szükséges TP tranzit peptidet, mind az érett fehérje stabilitásáért felelős EP extenziós peptidet (Lobreaux et al, 1992). Ezek a peptidek különböztetik meg a növényi és állati szervezetekben található ferritineket. A következtetett aminosav szekvencia alapján prediktált térszerkezeti elemzés kimutatta a ferritinek konzervált régióit, melyek a ferredoxáz aktivitásért és vasnukleációért felelősek. (Lobreaux et al, 1992). A filogenetikai elemzést követően kiderült, hogy a Conyza-ból nyert, paraquat hatására megnövekedett expressziót mutató ferritin molekula leginkább a dohány ferritin2, az Arabidopsis ferritin3, illetve a szójabab ferritin3 molekulákkal áll a filogenetikai rokonságban. A másik kulcsfontosságú, a rezisztens biotípusban paraquatkezelésre jóval magasabb szinten indukálódó EST egy, a CAT4 Arabidopsis thaliana kationos aminosavtranszporterrel nagyfokú hasonlóságot mutató szekvenciarészlet volt. A CAT4 az

Arabidopsis aminosav-poliamin-kolin transzporter APC fehérjék családjába tartozik, a CAT kationos aminosavtranszporterek alcsaládjába. Az CAT transzporterek tág szubsztrátspecificitást mutatnak: többféle, egymástól eltérő karakterű aminosav és egyéb molekulák transzportját is elvégzik. A család tagjai közül többnek feltárták pontos működését és lokalizáltságát. (Su et al, 2004, Frommer et al, 1995) Expressziós vizsgálataink során a tonoplaszton lokalizált CAT4-hez hasonlító fehérjét kódoló gént azonosítottunk. Valószínűsíthető, hogy egy, a vakuoláris membránon lokalizált antiporter felel a kationos aminosavak, poliaminok és töltéseloszlásukban illetve méretükben hasonló egyéb molekulák transzportjáért, így adott esetben kompetíció | Eredmények megvitatása

55

alakulhat ki a poliaminok valamint a méretében és kationos töltésében hasonlatos bipiridil, a paraquat között (Mornet et al., 1997). Feltevésünket alátámasztják az in silico elemzések, melyek során a putreszcin illetve

paraquat

kötőhelyeket

határoztuk

meg

(2.

sz.

függelék).

A

kationos

aminosavtranszportereken kívül forrásként szolgált három további gén: a paraquat transzportjára képes 12-TMS másodlagos multidrogrezisztens fehérjecsaládba tartozó,

Ochrobactrum anthropii transzporter PqrA (Jo et al, 2004), a fokozott mértékű expresszáltsága

esetén

poliamintranszporter

paraquatrezisztenciához

TPO,

valamint

a

TPO

vezető, őse,

a

élesztőből

származó

prokarióta

homológ

poliamintranszporter PotE (Tomitori et al, 1999, Uemura et al, 2005). A PqrA és a TPO bizonyítottan szubsztrátjaként használja a paraquatot, illetve expresszáltságuk szintje összefügg a paraquat-rezisztenciával (2. sz. függelék). A paraquatot is szubsztrátként használó, Saccharomyces poliamintranszporter TPO és prokarióta homológjának, a PotE-nek szerkezeti elemzése során feltárták, hogy a putreszcin- és így a paraquatkötés szempontjából is a legfontosabb pozíciók az N terminális felől haladva a II, a VI. és a XII. transzmembrán domént követő, citoplazmatikus régióban elhelyezkedő glutaminsavak. A kationos aminosavtranszporter CAT család tagjai közül kizárólag a CAT4 teljesítette a feltételeket, valamint hasonlósági keresések alapján is ez az a növényi antiporter, mely a leginkább hasonlít primer szerkezetében is az élesztő illetve E. coli putreszcin transzporteréhez. A transzmembrán domének és glutaminsavak hasonló konfigurációjú elhelyezkedése lehetővé teszi azt a specifikus töltéseloszlással és kötési távolságokkal bíró térszerkezetet, melybe a putreszcin, illetve adott esetben a hasonló méretű és hasonló töltéssel rendelkező paraquat képes kötni (2.sz. függelék). Az Ochrobactrum anthropi PqrA génjének in silico elemzése is érdemi tanulságokkal szolgált. A gén szerkezeti elemzése számunkra kiemelkedően fontos volt, mivel talajlakó baktérium membrántranszportert kódoló PqrA génjével létrehozott transzgénikus dohány esetén a Conyza-hoz hasonló mértékű paraquat-rezisztenciát figyeltek meg. A dohánynövény így ellenállt a magas dózisú paraquatkezelésnek, azonban más, reaktív oxigén gyököket generáló ágensekre nem bizonyult rezisztensnek. A gén tehát, amelynek terméke egy membránban lokalizált transzporterfehérje, egyedül felelős a transzgénikus növény nagyfokú paraquat rezisztenciájáért (Jo et al., 2004). | Eredmények megvitatása

56

Ennél a génnél, az in silico elemzések során megfigyelhető az előbbi poliamin transzporterekhez képest kismértékben eltérő szerveződés. A citoplazma felé néző régiói között is csupán háromnál találunk glutaminsavat, viszont itt egy régión belül akár többet is. Ezzel paralell a CAT4 transzporternél is több glutaminsav helyezkedik el a VI és a XII. transzmembrán domént követő régióban. Vélhetőleg a kationok számára energetikailag sokkal kedvezőbb, kapcsolódást megkönnyítő, negatív töltésű környezet létrehozásában fontosak. Az in silico elemzések alapján elmondhatjuk, hogy a CAT4 antiporter hasonlít leginkább primer szerkezetében a prokarióta putreszcintranszporter PotE-re, melynek homológja

az

élesztőben

putreszcinkötőhelyek

képes

a

meghatározásával

paraquatot

szubsztrátként

megállapítottuk,

hogy

elfogadni.

a CAT4

A

kationos

aminosavtranszporter transzmembrán doménjei és glutaminsavban rendkívül gazdag régióinak PqrA paraquatrezisztencia fehérjével egybevágó topográfiája alkalmassá teszi a putreszcin, illetve egyéb kationos molekulák – így a bipiridil paraquat – vakuoláris membránon keresztüli transzportjára. Ez a tény megerősíti azt a jelen kísérletekkel közvetve alátámasztott feltételezésünket, hogy akár egyetlen transzporter megváltozása vagy fokozott expressziója felelőssé tehető jelentős mértékű rezisztencia kialakulásáért. A CAT4 génjének repcéből történő kimutatása is fontos eredménynek számít a későbbi kísérletek és a CAT gének filogenetikai kapcsolatainak feltárása szempontjából. A genomiális DNS-ből származó nukleotidszekvenciánál rendkívül nagy, összességében 93%-os hasonlóságot tapasztaltunk. A reverz transzkripcióval nyert EST szekvenciát in

silico transzlálva a repce és az Arabidopsis CAT fehérje részlet elsődleges szerkezetében megegyezett. Mindent

összevetve

a

paraquat

felvételi

kinetikája

és

sejten

belüli

kompartmentalizációja alapján azt állíthatjuk, hogy a paraquat szekvesztrálódik a rezisztens Conyza canadensis (L.) Cronq. növényekben. A hatáskifejtés kezdeti stádiumában általános válaszreakcióként indukálódó, a reaktív oxigéngyökök által okozott akut károsodásokat csökkentő ferritin után a szekvesztrációban központi szerepet tölthet be a CAT4 kationos aminosavtranszporter. A rezisztens biotípus CAT4 génje vélhetőleg nagyobb affinitást mutat a paraquattal szemben, köszönhetően vélhetőleg a fehérje transzmembrán szakaszán elhelyezkedő módosult, glutaminsavban gazdag putreszcinkötőhelyeinek. Az is lehetséges, hogy a | Eredmények megvitatása

57

rezisztens biotípus tonoplasztjában több transzporter helyezkedik el. A szekvesztrációs hipotézist korábbi frakcionálási méréseink is alátámasztják, amikor a kloroplasztisz paraquatszintje lecsökkent, azonban a vakuoláris-citoplazmatikus frakció paraquatszintje megnövekedett (Jóri et al, 2007). A vakuoláris szekvesztrációt alátámasztják a gátlós kísérleteink, ahol a CAT4 vakuoláris lumen felé történő paraquat transzportjának elektrokémiai gradiens

igényét

biztosító, molekuláris

vakuoláris

H+-ATP-ázokat

blokkoltuk. Az eredményeink azt mutatják, hogy a Conyza CAT4 gén alkalmas lehet a paraquat intracelluláris transzportjára és szekvesztrációjára (28. ábra).

28. ábra A paraquat rezisztenciát okozó, vakuoláris szekvesztráció valószínűsített folyamata. A paraquat a plazmalemmán át egy ismeretlen transzporter közvetítésével jut be a sejtbe. Az intracelluláris térből további transzporterek révén a kloroplasztisz sztrómájába kerül, majd újra a citoszólba transzlokálódik. A vakuólumba a CAT4-gyel homológ, kationos aminosavtranszporter juttatja a paraquatot. Az antiporter energiaigényét egy vakuoláris H+ATP-áz fedezi, melyet a NO3kezeléssel tudtunk blokkolni. Valószínűsíthető, hogy a rezisztens biotípusú Conyza-ban a CAT4 homológ transzporter nagyobb affinitással képes a paraquatot szubsztrátjaként kezelni, mint a szenzitívben, illetve fokozott expressziója révén több transzporter épül be a vakuoláris membránba, így hatékonyabban képes a paraquatot a vakuólum irányába szekvesztrálni.


58

Mivel jelenleg a génnek csupán parciális szekvenciája ismert, elkerülhetetlennek tűnik a teljes gén meghatározása a jövőben. Erre kiválóan alkalmasak a közelmúltban kifejlesztett, teljes genomi analízist elvégző, új generációs genomszekvenátorok, melyek több millió bázist képesek akár egyetlen nap leforgása alatt meghatározni. Így a nemrég még több évnyi, kutatócsoportok összehangolt és megfeszített munkáját igénylő teljes genomanalízis bárki számára hozzáférhetővé vált. A Conyza genomjának esetében a CAT4 parciális szekvenciájának ismerete jelentős mértékben megkönnyíti a gént körülvevő genomiális környezet meghatározását. A CAT4 teljes szekvenciájának birtokában pedig beazonosíthatók azok a térszerkezetbeli különbségek, esetleges kötőhelyben történt mutációk, melyek a paraquat iránt mutatott nagyobb affinitásért illetve gyorsabb transzportrjáért és ezen keresztül a rezisztenciáért felelnek. Emellett az expressziós különbségeket is könnyebb lesz vizsgálni a teljes szekvencia birtokában. A genom akár részleges ismeretében is lehet olyan expressziós paneleket tervezni, melyek több gén episztázisát, expressziós mintázatát figyelik. Lehetőség nyílik olyan real-time esszék tervezésére is, melyek több gén pontos kópiaszámát illetve expressziós szintjét is képesek pontosan meghatározni. Ezek után meghatározhatjuk az összes olyan gént és anyagcsereútvonalat is, mely a rezisztenciában részt vesz. A kulcsfontosságú gének szerepét RNS interferencia módszerekkel illetve transzgénikus knock-out növények létrehozásával bizonyíthatjuk. Az intracelluláris transzportfolyamatok szekvesztrációban betöltött szerepét nemcsak a Conyza, de más, herbiciddel szemben ellenálló növényfajok esetén is érdemes lenne megvizsgálni. Így a szekvesztráción alapuló herbicidrezisztencia molekuláris hátterének feltárásával lehetőség nyílhat transzgénikus növények létrehozására, de akár teljesen újszerű, az antibiotikum-rezisztenciát kikerülő, a paraquat rezisztenciájáért felelős gént szelekciós markerként felhasználó transzformációs módszer kidolgozására is.


59

FÜGGELÉK 1.SZÁMÚ FÜGGELÉK: ADATBÁZIS AZONOSÍTÓK LISTÁJA NCBI azonsító

Uniprot

gi:186518351

Q84MA5

gi:186497660

Q9ASS7

gi:186532933 gi:186511376

NCBI

rövid

faj

leirás

827860

CAT1


cationic amino acid transporter 1

842170

CAT2



Q8GYB4

833664

CAT3



Q8W4K3

821176

CAT4



gi:186509467

O64759

818060

CAT5



gi:186532933

Q9LZ20

830355

CAT6



gi:186511376

Q9SQZ0

820229

CAT7



gi:186497660

Q9SHH0

838282

CAT8



gi:186497660

Q9C5D6

837104

CAT9


cationic amino acid transporter9

gi:186532933

Q39101

831720

ATFER1


ferritin 1, ferric iron binding

gi:186509467

Q9S756

818622

ATFER4



gi:186511376

Q9SRL5

820276

ATFER2



gi:75289753

Q6A196

*

CONCD

Conyza canadensis

ferritin

gi :29839253

Q94FY2

*

APF1

Malus xiaojinensis

ferritin

gi:75315621

Q9ZP90

*

MEDSA

Medicago sativa

ferritin

gi :29839371

Q8RX97

*

NtFer1

Nicotiana tabacum

ferritin 1

gi:29839345

Q8H1T3

*

NtFer2

Nicotiana tabacum

ferritin 2

gi:75292791

Q6VVA5

*

Q6VVA5

Oryza sativa

ferritin

gi:115489835

Q8L5K0

4351264

Q8L5K0

Oryza sativa

ferritin 1

gi :75301478

Q8LK80

*

Q8LK80

Oryza sativa

ferritin

gi: 417006

P19975

*

FRI_PEA

Pisum sativum

ferritin-1

gi :120531

P25699

*

FRI_PHAVU

Phaseolus vulgaris

chloroplast ferritin

gi:75288881

Q66N72

*

Q66N72_PHAAN

Phaseolus angularis

chloroplast ferritin

gi:120532

P19976

547824

FRI1_SOYBN

Glycine max

ferritin light chain

gi:29839388

Q94IC4

547988

FRI2_SOYBN

Glycine max

SferH-2 ferritin

gi :29839387

Q948P6

547476

FRI3_SOYBN

Glycine max

SFerH-3 ferritin

gi :29839386

Q948P5

547477

FRI4_SOYBN

Glycine max

SFerH-4 ferritin

gi:75305965

Q941G7

*

Q941G7_SOYBN

Glycine max

ferritin

gi :75284501

Q5G1L6

*

Q5G1L6_WHEAT

Triticum aestivum

ferritin

gi :75289899

Q6DQK1

*

Q6DQK1_TRIMO

Triticum monococcum

ferritin

gi: 29839287

Q41709

*

FRI2_VIGUN

Vigna unguiculata

ferritin-2, chloroplastic

gi:29840836

P29036

542553

FRI1_MAIZE

Zea mays

ferritin1

gi :29840837

P29390

542392

FRI2_MAIZE

Zea mays

Ferritin-2, chloroplastic

gi:49175990

P0AAF1

945422

POTE_ECOLI

Escheridia coli

putrescine transport protein

gi :85666119

Q07824

850631

TPO1_YEAST

Saccharomyces cerevisae

Polyamine transporter 1

gi:9438231

*

*

PqrA

Ochrobactrum anthropi

paraquat resistance protein PqrA

Gene ID

* Az adatbázis felé nincs annotálva. .

| Függelék

60

2. SZÁMÚ FÜGGELÉK: TRANSZMEMBRÁN DOMÉNEK ÉS PUTRESZCINKÖTŐHELYEK IN SILICO ELŐREJELZÉSE

Az ábrákon az elsődleges szerkezetből előrejelzett transzmembrán doméneket a piros, a citoplazma felé eső aminosavszekvencia részeket a kék, míg a külső tér felé néző régiókat a lila szín jelöli. A belső tér felé néző régiókban található glutaminsavakat zöld nyilak jelölik.

Arabidopsis CAT1

Arabidopsis CAT2

| Függelék

61

Arabidopsis CAT3

Arabidopsis CAT4

| Függelék

62

Arabidopsis CAT5

Arabidopsis CAT6

| Függelék

63

Arabidopsis CAT7

Arabidopsis CAT8

| Függelék

64

Arabidopsis CAT9

E. coli PotE

| Függelék

65

Ochrobactrum PqrA

Saccharomyces TPO1

| Függelék

66

3.SZÁMÚ FÜGGELÉK: FERRITIN SZEKVENCIA LOCUS DEFINITION ACCESSION VERSION KEYWORDS SOURCE ORGANISM

AJ786262 765 bp mRNA linear PLN 28-JUL-2004 Conyza canadensis mRNA for ferritin (fer gene). AJ786262 AJ786262.1 GI:50787936 fer gene; ferritin. Conyza canadensis Conyza canadensis Eukaryota; Viridiplantae; Streptophyta; Embryophyta; Tracheophyta; Spermatophyta; Magnoliophyta; eudicotyledons; core eudicotyledons; asterids; campanulids; Asterales; Asteraceae; Asteroideae; Astereae; Conyza. REFERENCE 1 AUTHORS Jori,B. and Soos,V. TITLE Ferritin sequence from horseweed (Conyza canadensis (L.) Cronq.) JOURNAL Unpublished REFERENCE 2 (bases 1 to 765) AUTHORS Jori,B. TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (27-JUL-2004) Jori B., Department of Plant Physiology, Eotvos Lorand University, Budapest, Pazmany Peter setany 1/c., H-1117, HUNGARY FEATURES Location/Qualifiers source 1..765 /organism="Conyza canadensis" /mol_type="mRNA" /db_xref="taxon:72917" /tissue_type="leaf" /country="Hungary" gene 1..765 /gene="fer" CDS 1..765 /gene="fer" /codon_start=1 /product="ferritin" /protein_id="CAH05075.1" /db_xref="GI:50787937" /translation="MLLKTAPASRLSSVPASVDNLTGSSRSIPSASHSPAIVCAAAKG GGSNNKPITGVVFEPFEEVKKELNLVPTVPQQSLARQKYADDSESIINEQINVEYNVS YVYHAMYAYFDRDNVALKGLAKFFKESSEEEREHAEKFMEYQNKRGGKVKLQSILMPL SEFDHAEKGDALYAMELALSLEKLTNEKLLHVHAVATKNNDVQLADFVESEFLGEQVE AIKRISEYVAQLRRVGKGHGVWHFDQMLLQEEGLVA" ORIGIN 1 atgcttctca aaacagctcc tgcttctcgg ctatcttctg tcccggcatc ggtagataat 61 ctcaccggat cttcgcgttc aattccgtct gcttcacatt ctccggcgat cgtttgtgcg 121 gcagcgaaag gcggcggctc aaacaacaaa ccgataactg gtgttgtgtt tgaaccgttt 181 gaagaagtga aaaaagagct taatcttgtt cctactgttc ctcaacaatc tcttgctcgt 241 cagaaatacg ctgatgattc tgaatccatc atcaatgaac agatcaatgt tgagtacaat 301 gtttcatatg tgtaccatgc tatgtatgct tactttgata gagataatgt agctctcaag 361 ggattagcca agttttttaa ggagtctagt gaagaggaaa gggaacatgc tgaaaagttt 421 atggaatacc agaacaaacg tggtggtaag gtgaaattac aatctatttt gatgccgttg 481 tctgagtttg atcacgctga gaaaggggat gcactttatg ctatggagct tgcattgtca 541 ttggagaaat tgacaaatga gaaacttcta catgtccatg cggtggccac caagaacaat 601 gatgtgcaat tggctgattt tgttgaaagc gagttcttgg gtgaacaggt tgaggcaatc 661 aagagaatct ctgaatatgt ggctcagctg agaagagttg gcaaaggaca tggtgtttgg 721 cactttgatc agatgcttct gcaagaggaa gggcttgtag catga//

| Függelék

67

IRODALOMJEGYZÉK Altschul SF, Gish W, Miller W, Myers EW & Lipman DJ (1990): "Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410. Aouida et al (2005): AGP2 Encodes the Major Permease for High Affinity Polyamine Import in Saccharomyces cerevisiae J Biol Chem. 280:24267-76. Babbs C. F., Pham J. A., Coolbaugh R. C. (1989): Lethal hydroxyl radical production in paraquat-treated plants. Plant Physiol 90: 1267-1270 Bagni N, Torrigiani P (1992): Polyamines: a new class of growth substances. In CM Karssen, LC Van Loon, D Vreugdenhil, eds, Progress in Plant Growth Regulation. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 264-275 Balla, G., Jacob, H.S., Balla, J., Rosenberg, M., Nath, K., Apple, F., Eaton, J.W. and Vercellotti, G.M. (1992) Ferritin: a cytoprotective antioxidant stratagem of endothelium. J. Biol. Chem. 267:18148–18153 Bowyer J. R., Camilleri P. (1985): Spin-trap study of the reactions of ferredoxin with reduced oxygen species in pea chloroplasts. Biochim Biophys Acta 808: 235–241. Briat, J.-F., Lobreaux, S., Grignon, N. and Vansuyt, G. (1999): Regulation of plant ferritin synthesis: how and why. Cell. Mol. Life Sci. 56:155–166 Brooke-Taylor S, Smith LL, Cohen GM. (1983): The accumulation of polyamines and paraquat by human peripheral lung. Biochem Pharmacol. 32:717-20. Bush DR (1993) Proton-coupled sugar and amino acid transporters in plants. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 29: 513–542 Camp op den RG, Przybyla D, Ochsenbein C, Laloi C, Kim C, Danon A, Wagner D, Hideg E, Gobel C, Feussner I, Nater M, Apel K. (2003): Rapid induction of distinct stress responses after the release of singlet oxygen in Arabidopsis, Plant Cell. 10:2320-32. Carr RJG, Bilton RF, Atkinson T (1985): Mechanism of biodegradation of paraquat by Lipomyces starkeyi. Appl. Environ.Microbiol.,49: 1290-1294 Chen N, Bowles MR, Pond SM. (1992): Competition between paraquat and putrescine for uptake by suspensions of rat alveolar type II cells. Biochem Pharmacol. 44:1029-36. Cheung AY, Bogorad L., Montagu M. V.,Schell J. (1988): Relocating a gene for herbicide tolerance: a chloroplast gene is converted into a nuclear gene. Proc Nat Acad Sci USA 85: 391-395. Chun JC, Kim JC, Hwang IT, Kim SE (2002): Acteoside from Rehmannia glutinosa nullifies paraquat activity in Cucumis

sativus. Pestic Biochem Physiol 72: 153-159. Chun JC, Ma SJ, Kim SE, Lee HJ (1997): Physiological responses of Rehmannia glutinosa to paraquat and its tolerance mechanisms. Pestic Biochem Physiol 59: 51–63. Connolly EL, Guerinot M (2002): Iron stress in plants. Genome Biol. 3:1024. Cronquist A (1976): Conyza. In: Flora Europea, Vol.4. (Tutin TG, Hewood VH, Burges NA, Moore DM, Valentin DH, Walters SM and Webb DA eds.). Cambridge Univ. Press, Cambridge, NY, p120 Darkó É, Lehoczki E, Szigeti Z (1994): Nuclear coded protein can be involved in the mechanism of paraquat resistance. Biol Plantarum Suppl. 36: S342.

| Irodalomjegyzék

68

Deak, M., Horvath, G.V., Davletova, S., Torok, K., Sass, L., Vass, I., Barna, B., Kiraly, Z. and Dudits, D. (1999) Plants ectopically expressing the iron-binding protein, ferritin, are tolerant to oxidative damage and pathogens. Nat. Biotechnol. 17, 192–196 Dellagi A, Rigault M, Segond D, Roux C, Kraepiel Y, Cellier F, Briat JF, Gaymard F, Expert D. (2005): Siderophoremediated upregulation of Arabidopsis ferritin expression in response to Erwinia chrysanthemi infection. Plant J. 43:26272. DiTomaso JM, Hart JJ, Kochian LV. (1993) Compartmentation Analysis of Paraquat Fluxes in Maize Roots as a Means of Estimating the Rate of Vacuolar Accumulation and Translocation to Shoots. Plant Physiol. 102:467-472. Doige CA, Ames GFL (1993): ATP-dependent transport systems in bacteria and humans: relevance to cystic fibrosis and multidrug resistance. Annu Rev Microbiol 47: 291-319. Frommer WB, Hummel S, Unseld M, Ninnemann O. (1995): Seed and vascular expression of a high-affinity transporter for cationic amino acids in Arabidopsis. Proc Natl Acad Sci U S A. 92:12036-40. Fuerst EP, Nakatani HY, Dodge AD, Penner D, Arntzen CJ. (1985): Paraquat Resistance in Conyza. Plant Physiol. 77:984-989. Fujii T, Yokoyama E, Inoue K, Sakurai H (1990): The sites of electron donation of photosystem I to methyl viologen. Biochim Biophys Acta 1015: 41-48 Funderburk HH Jr. , Bozarth GA (1967): Review of the metabolism abd decomposition of diquat and paraquat. J. Agric. Food Chem., 15:563-567. Gaudreault P, Karl PI, Friedman PA (1984) Paraquat and putrescine uptake by lung slices of fetal and newborn rats. Drug Metab Dispos 12: 550-552 Goffeau A, Barrell BG, Bussey RW, Davis RW, Dujon B, Feldmann H, Galibert F, Hocheisel JF, Jacq C, Johnston M (1996) Life with 6000 genes Science, 274:546-567 Goffeau A, Park J, Paulsen IT, Jonniaux JL, Dinh T, Mordant P, Saier Jr MH (1997): Multidrug-resistant transport proteins in yeast, complete inventory and phylogenetic characterization of yeast open reading frames with the major facilitator superfamily. Yeast 13:43-54 Gottesmann MM, Pastan I(1993): Biochemistry of multidrug resistance mediated by the multidrug resistance transporter Annual Review of Biochemistry 62, 385-427. Gros P, Ben Neriah YB, Croop JM, Housman DE (1986): Isolation and expression of a complementary DNA that confers multidrug resistance. Nature. 323:728-31. Halász K, Soós V, Jóri B, Rácz I, Lásztity D, Szigeti Z (2002): Effect of transporter inhibitors on paraquat resistance of horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.) Acta Biologica Szegediensis, 46:23-24 Halliwell, B. ( 1993) The chemistry of free radicals. Toxicol. Ind. Health, 9, 1– 21. Hart JJ, Ditomaso JM, Linscott DL, Kochian LV. (1992) Transport Interactions between Paraquat and Polyamines in Roots of Intact Maize Seedlings. Plant Physiol. 99:1400-1405. Harvey BMR, Fraser TW (1980): Paraquat tolerant and susceptible perennial ryegrasses: effects of paraquat treatment on carbon dioxide uptake and ultrastructure of photosynthetic cells. Plant Cell Environ 3: 107-117. Harvey BMR, Harper DB (1982): Tolerance to bipyridilium herbicides. In LeBaron HM, Gressel J, eds, Herbicide Resistance in Plants. John Wiley and Sons, New York, pp 215-233 Hashimoto Y, Soderling TR (1989): Regulation of calcineurin by phosphorylation. Identification of the regulatory site phosphorylated by Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase II and protein kinase C The Journal of Biological Chemistry, 264:16524-16529

| Irodalomjegyzék

69

Hasne , Ullman (2005): Identification and Characterization of a Polyamine Permease from the Protozoan Parasite

Leishmania major J Biol Chem. 280:15188-94. Hingamp P, van den Broek AE, Stoesser G, Baker W (1999): The EMBL Nucleotide Sequence Database. Contributing and accessing data Mol Biotechnol. 12:255-67. Hiyama T., Ohinata A., Kobayashi S. (1993): Paraquat (methylviologen): its interference with primary photochemical reactions. Z. Naturforsch. 48C, 374–378 Hongo, E., Morimyo, M., Mita, K., Machida, I., Hama-Inaba, H., Tsuji, H., Ichimura, S., and Noda, Y. (1994) The methyl viologenresistance-encoding gene smvA of Salmonella typhimurium. Gene 148, 173–174. Horánszky A., Járainé KM (1990): Növényrendszertani praktikum, Tankönyvkiadó, 462.o. Hunyadi K, Almádi L (1981): Szántóföldi gombafajok csíranövényei és herbicidérzékenységük, Mezőgazdasági Kiadó, p. 142-144. Igarashi K, Kashiwagi K (1999): Polyamine transport in bacteria and yeast, The Biochemical Journal, 344:633-642 Jo J, Won SH, Son D, Lee BH (2004): Paraquat resistance of transgenic tobacco plants over-expressing the Ochrobactrum

anthropi pqrA gene Biotechnol Lett. 18:1391-6. Jóri B, Soós V, Szegő D, Páldi E, Szigeti Z, Rácz I, Lásztity D (2007): Role of transporters in paraquat resistance of horseweed Conyza canadensis (L.) Cronq. Pesticide Biochemistry and Physiology 88: 57-65 Kakinuma Y, Maruyama T, Nozaki T, Wada Y, Ohsumi Y, Igarashi K. (1995): Cloning of the gene encoding a putative serine/threonine protein kinase which enhances spermine uptake in Saccharomyces cerevisiae.Biochem Biophys Res Commun. 216:985-92. Kaouass M, Audette M, Ramotar D, Torossian K, Gamache I, DeMontigny D, Verma S, Poulin R (1997): Molecular and Cellular Biology, 17:2994-3004 Kashiwagi K, Shibuya S, Tomitori H, Kuraishi A, Igarashi K. (1997): Excretion and uptake of putrescine by the PotE protein in Escherichia coli. J Biol Chem. 272:6318-23. Kinraide TB (1981): Interamino acid inhibition of transport in higher plants. Plant Physiol 68: 1327–1333 Kurepa J, Smalle J, Van Montagu M, Inze D (1998): Oxidative stress tolerance and longevity in Arabidopsis: the lateflowering mutant gigantea is tolerant to paraquat. Plant J. 14:759-64. Lasat MM, Hart JJ, DiTomaso JM, Kochian LV (1997): Evidence for vacuolar sequestration of paraquat in roots of paraquat-resistant Hordeum glaucum biotype. Plant Physiol 99: 255-262. Lehoczki E (1993): Fotoszintézis módosított összetételű kloroplasztisz membránokban Gyomnövények rezisztenciája fotoszintézisgátló herbicidekkel szemben. Tézisek a biol.tud.doktora fokozat megszerzéséhez, Szeged 46 pp. Lehoczki E, Laskay G, Gaál I, Szigeti Z (1992): Mode of action of paraquat in leaves of paraquat-resistant Conyza

canadensis (L.) Cronq. Plant Cell Environ 15: 531-539. Lehoczki E, Szigeti Z (1988): Characterization of paraquat-resistant Conzya leaves through delayed fluorescence. In: Applications of Chlorophyll Fluorescence (ed. U.K. Lichtenthaler),. pp. 115-120. Liang P, Pardee AB (1998): Differential display: A general protocol. Mol Biotechnol 10: 261–267. Lobreaux S, Massenet O, Briat JF (1992):Iron induces ferritin synthesis in maize plantlets. Plant Mol Biol. 19:563-75. Marchler-Bauer A, Bryant SH (2004), "CD-Search: protein domain annotations on the fly.", Nucleic Acids Res, 32:327331 Morimyo, M. (1988) Isolation and characterization of methyl viologen-sensitive mutants of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 170, 2136–2142.

| Irodalomjegyzék

70

Morimyo, M., Hongo, E., Hama-Inaba, H., and Machida, I. (1992): Cloning and characterization of the mvrC gene of

Escherichia coli K-12 which confers resistance against methyl viologen toxicity. Nucleic Acids Res. 20, 3159–3165. Mornet C, Mondory C, Gaillard C, Martinoia E (1997): Transport of paraquat and polyamines across the vacuolar membrane of barley mesophyll cells. Plant Physiol Biochem 35: 589-594. Muller M. L., Taiz L. (2002): Regulation of the lemon-fruit V-ATPase by variable stoichiometry and organic acids.J Membr Biol 185: 209-220. Nicholas KB, Nicholas Jr HB (1997) GeneDoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. http://www.cris.com/~ketchup/genedoc.shtml Distributed by the authors Norman M. A., Fuerst E. P., Smeda R. J., Vaughn K. C. (1993): Evaluation of paraquat resistance mechanisms in Conyza. Pestic Biochem Physiol 46:236-247. Nozaki T, Nishimura K, Michael AJ, Maruyama T, Kakinuma Y, Igarashi K (1996) Biochemical and Biophysical Research Communications, 228:452-458 Paraquat Information Center, Syngenta Crop Protection AG http://www.paraquat.com Persson L, Svensson F, Lökvist Wallström E, (1996): Regulation of polyamine metabolism Polyamins in Cancer – Basic Mechanisms and Clinical Approaches (K. Nishioka ed.) pp. 14-43, R.G. Landes Company, Austin Petit JM, Briat, JF Lobréaux, S. (2001): Structure and differential expression of the four members of the Arabidopsis

thaliana ferritin gene family. Biochem. J. 359:575–582. Pistocchi R, Antogoni F, Bagni N, Zanonni D (1990): Spermidin uptake by mitochondria of Helianthus tuberosus Plant Physiology 92:690-695 Powles, S. B., Cornic G. (1987): Mechanism of paraquat resistance in Hordeum glaucum. I. Studies with isolated organelles and enzymes. Aust J Plant Physiol 14: 81-89. Pölös E., Mikulás J., Szigeti Z., Hai D. Q., Párducz Á., Lehoczki E. (1987): Paraquat and atrazine co-resistance in Conyza

canadensis (L.) Cronq. Pestic Biochem Physiol. 30: 142-148. Preston C, Holtum JA, Powles SB (1992): On the Mechanism of Resistance to Paraquat in Hordeum glaucum and H.

leporinum: Delayed Inhibition of Photosynthetic O(2) Evolution after Paraquat Application. Plant Physiol. 100:630-636. Putman M, van Veen HW, Konings WN. (2000): Molecular properties of bacterial multidrug transporters. Microbiol Mol Biol Rev. 64:672-93. Rial-Otero R, Cancho-Grande B, Perez-Lamela C, Simal-Gandara J, Arias-Estevez M. (2006) Simultaneous determination of the herbicides diquat and paraquat in water. J Chromatogr Sci. 44:539-42. Rose MS, Lock EA, Smith LL, Wyatt I (1976) Paraquat accumulation: tissue and species specificity. Biochem Pharmacol 25: 419-423 Ross JH, Krieger RI (1980): Synthesis and properties of paraquat (methyl viologen) and other herbicidal alkyl homologues. J Agric Food Chem 28:1026-1031 Rotem D, Schuldiner S (2004): EmrE, a multidrug transporter from Escherichia coli, transports monovalent and divalent substrates with the same stoichiometry. J Biol Chem. 279:48787-93. Ryan GF (1970): Resistance of common groundsel to simazine and atrazine. Weed Sci 18:614-16. Saitou N, Nei M (1987): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol Evol. 4:406-25. Sambrook J; Fritisch EF and Maniatis T (1989): Molecular cloning: laboratory manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press. p.1626

| Irodalomjegyzék

71

Schuldiner S (2007): Controversy over EmrE structure Science. 317:748-51. Schuldiner S (2007): When biochemistry meets structural biology: the cautionary tale of EmrE. Trends Biochem Sci. 32:252-8 Seiler N, Dezeure F (1990) Poliamine transport in mammalian cells. Int J Biochem 22:211-218 Shaaltiel Y, Gressel J, (1986): Multienzyme oxygene radical detoxifying system correlated with the paraquat resistance in

Conyza bonariensis. Pestic. Biochem. Physiol. 26, 22-28. Silverman FP, Petracek PD, Fledderman CM, Ju Z, Heiman DF, Warrior P. Salicylate activity. 1. Protection of plants from paraquat injury. J Agric Food Chem. 2005 Dec 14;53(25):9764-8. Smith LL (1982): The identification of an accumulated system for diamines and polyamines into the lung and its relevance to paraquat toxicity, Arch. Toxicol. Suppl. 5:1-14. Soulet D, Gagnon B, Rivest S, Audette M, Poulin R (2004): A fluorescent probe of polyamine transport accumulates into intracellular acidic vesicles via a two-step mechanism. J Biol Chem. 279:49355-66 Su YH, Frommer WB, Ludewig U (2004): Molecular and functional characterization of a family of amino acid transporters from Arabidopsis. Plant Physiol. 136:3104-13 Swofford, D. L. 2001. PAUP* . Phylogenetic Analysis Using Parsimony (*and Other Methods). Version 4. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Szigeti Z., (2000): A gyomnövények paraquatrezisztenciája a Conyza canadensis (L.) Cronq. példáján. Bot. Közlem. 8687. kötet 1-2. füzet Szigeti Z., Rácz I., Lásztity D. (2001): Paraquat resistance of Weeds – the Case of Conyza canadensis (L.) Cronq. Z Naturforsch 65c: 319-328. The Herbicide Resistance Action Committee (HRAC) http://www.hracglobal.com Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F, Higgins DG (1997): The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tools Nucleic Acids Res. 25:4876-82. Tiburcio AF., Altabella T, Borrell A, Masgrau C (1997): Polyamine metabolism and its regulation, Phsysiologia Plantarum 100:664-474 Tippmann HF (2004): Analysis for free: comparing programs for sequence analysis Brief Bioinform. 5:82-7. Tomitori H, Kashiwagi K, Asakawa T, Kakinuma Y, J Michael A, Igarashi K (2001): Multiple polyamine transport systems on the vacuolar membrane in yeast, The Biochemical Journal, 353:681-688. Tomitori H, Kashiwagi K, Sakata K, Kakinuma Y, Igarashi K (1999): Identification of a Gene for a Polyamine Transport Protein in Yeast , The Journal of Biological Chemistry 274: 3265-3267 Toursarkissian B, Endean ED, Aziz SM (1994): Characterization of polyamine transport in rat aortic smooth muscle cells J Surg Res. 57:401-7. Uemura T, Kashiwagi K, Igarashi K (2007): Polyamine Uptake by DUR3 and SAM3 in Saccharomyces cerevisiae.The Journal of Biological Chemistry, 282: 7733–7741 Uemura T, Tachihara K, Tomitori H, Kashiwagi K, Igarashi K (2005): Characteristics of the polyamine transporter TPO1 and regulation of its activity and cellular localization by phosphorylation. J Biol Chem. 280:9646-52. USDA, NRCS. 2007. The PLANTS Database (http://plants.usda.gov , 14 February 2007). National Plant Data Center, Baton Rouge, LA 70874-4490 USA.

| Irodalomjegyzék

72

Varadi G, Darko E, Lehoczki E. (2000): Changes in the xanthophyll cycle and fluorescence quenching indicate lightdependent early events in the action of paraquat and the mechanism of resistance to paraquat in Erigeron canadensis (L.) Cronq. Plant Physiol. 123:1459-70. Vaughn KC, Vaughan MA, Camilleri P (1989): Lack of cross-resistance of paraquat-resistant hairy fleabane (Conyza

bonariensis) to other toxic oxygen generators indicates enzymatic protection is not the resistance mechanism. Weed Science 37: 5-11. Vaughn KC (2003): Herbicide resistance work in the United States Department of Agriculture-Agricultural Research Service. Pest Manag Sci. 59:764-9. Vermeulen CJ, Van De Zande L, Bijlsma R (2005): Resistance to oxidative stress induced by paraquat correlates well with both decreased and increased lifespan in Drosophila melanogaster. Biogerontology 6:387-95. Verrey F, Closs EI, Wagner CA, Palacin M, Endou H, Kanai Y (2004) CATs and HATs: the Park next to us or thereabouts, and our door is the one in front of where the cars are SLC7 family of amino acid transporters. Pflugers Arch 447: 532–542 Vile GF, Winterbourn CC, Sutton HC. (1987): Radical-driven Fenton reactions: studies with paraquat, adriamycin, and anthraquinone 6-sulfonate and citrate, ATP, ADP, and pyrophosphate iron chelates. Arch Biochem Biophys. 259:616-26. Wauchope, R. D., Buttler, T. M., Hornsby A. G., Augustijn Beckers, P. W. M. and Burt, J. P. (1992): SCS/ARS/CES Pesticide properties database for environmental decisionmaking. Rev. Environ. Contam. Toxicol. 123: 1-157 Weed Science Society of America. Herbicide Handbook, Seventh Edition. Champaign, IL, 1994 Wipf D, Ludewig U, Tegeder M, Rentsch D, Koch W, Frommer WB (2002) Conservation of amino acid transporters in fungi, plants and animals. Trends Biochem Sci 27: 139–147 Won, B.-H. Lee and J. Jo (2000): Characterization of a paraquat resistance of Ochrobactrum anthropi JW2. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 28: 1–7. Wyatt I, Soames AR, Clay MF, Smith LL (1988) The accumulation and localization of putrescine, spermidine, spermine and paraquat in the rat lung. Biochem Pharmacol 37: 1909-1918 Wyse RE, Komor E (1984) Mechanism of amino acid uptake by sugar cane suspension cells. Plant Physiol 29: 865–870 Yerushalmi H, Lebendiker M, Schuldiner S. (1995) EmrE, an Escherichia coli 12-kDa multidrug transporter, exchanges toxic cations and H+ and is soluble in organic solvents. J Biol Chem. 270:6856-63.

| Irodalomjegyzék

73

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 12 TM 14 TM AAT1 ABC ACT AGP2 APC APX AtAAP AtANT AtAUX ATF AtFerr2 AtLHT ATP AtProT CAD CadB CAT CAT1-9 cDNS DCCD DDRT-PCR DNS dNTP DUR3 EmrE EP EST Fv/Fm GAP1 Glu LIZ, Lys MATE MDR MFS

12 transzmembrán domén szerkezet 14 transzmembrán domén szerkezet Arabidopsis aminosav transzporter 1 ATP-binding casette protein, ATP-kötő alegységgel bíró fehérje aktin arabinogalaktán protein 2 aminosav-poliamin-organokation transzporter fehérje aszkorbát peroxidáz Arabidopsis thaliana aminosav-permeázok családja Arabidopsis thaliana aromás és neutrális aminosav transzporter Arabidopsis thaliana auxin transzporter amino acid transporter family, aminosavtranszporter család Arabidopsis thaliana ferritin 2 Arabidopsis thaliana lizin-hisztidin transzporter adenozil-trifoszfát Arabidopsis thaliana prolin transzporter kadaverin kadaverin transzporter “B” kataláz cationic amino acid transporter 1-9, kationos aminosavtranszporter komplementer dezoxi-ribonukleinsav N4N1 -diciklohexil-karbodiimid differential display reverse transcriptase polimerase chain reaction dezoxi-ribonukleinsav dezoxi-ribonukleotid trifoszfát ureatranszport protein 3 etídium metil-viologén rezisztencia protein “E” extenziós peptid expressed sequence tag változó és maximális fluoreszcencia hányadosa gamma-aminovajsav permeáz 1 glutaminsav lizin multidrug and toxic compound extrusion, multidrog - és toxikus ágenseket kilökő fehérjék családja multidrog-rezisztencia major facilitator superfamily, a legfőbb facilitátor fehérjék családja

| Rövidítések jegyzéke

74

mvrA mvrC MYB ORN PAM PCR pGOL PMF PotA-I Pq PqrA PSI PSII PTK1 PTK2 PUT PVS QacA RND RNS RT-PCR SAM3 SMR SOD SPD SPM TAE TEXAN TM TMD TMS TP TPO TPP tpt UGA4 VAC YAT

metil-viologén rezisztencia protein „A” metil-viologén rezisztencia protein „C” myeloblastoma transzkripciós faktor ornitin pulzus amplitúdó moduláció polimerase chain reaction, polimeráz láncreakció Post-Golgi partikulum proton motive force, protonhajtóerő poliamin transzporter “A”-“I” paraquat paraquat rezisztencia faktor “A” a fotoszintézis I-es fotokémiai rendszere a fotoszintézis II-es fotokémiai rendszere protein-kináz 1 protein-kináz 2 putreszcin poliamin szekvesztrációs vezikula quaternary ammonium compounds transporter resistance-nodulation-cell division, rezisztencia- noduláció-sejtosztódás- fehérjék családja ribonukleinsav reverse transcriptase polimerase chain reaction S-adenozil metionin transzporter, élesztő small multidrug resistance, kisméretű multidrog-rezisztencia fehérjék szuperoxid dizmutáz spermidin spermin tris-acetát-etiléndiamin-tetraecetsav toxin extruding antiporters, toxinkizáró antiporter család transzmembrán transzmembrán domain transzmembrán szegmens tranzitpeptid transporters for polyamines, élesztő poliamintranszporter család tetrafenil-foszfonium-klorid transzporter univerzális gamma-aminovajsav transzporter vakuólum Yeast Amino acid Transporter, élesztő aminosav transzporter

| Rövidítések jegyzéke

75

ÖSSZEFOGLALÁS A gyomnövények ellen a világon legszélesebb körben alkalmazott herbicidek egyike a paraquat. Intenzív használata következtében az elmúlt évtizedekben egyre gyakrabban jelentek meg a gátlószerrel szemben toleráns és rezisztens gyomfajok. Számos elmélet kívánt magyarázatot adni a rezisztenciafaktorában kiemelkedő betyárkóró (Conyza canadensis /L./ Cronq.) paraquat rezisztenciájára, azonban egyik sem bizonyult cáfolhatatlannak. Munkám célja a betyárkóró paraquattal szembeni rezisztenciamechaniumusának feltárása volt, melynek során az alábbi fontos megállapításokat tettem: A rezisztencia oka a szekvesztráció, melynek során a paraquat metabolikusan inaktív kompartmentbe, a vakuólumba jut. Kimutattam, hogy a szekvesztrációs mechanizmusban központi szerepet tölt be egy, az ABC-fehérjéktől különböző transzporter. Ez a transzporter protein a szekvenciaelemzések alapján az Arabidopsis CAT4 kationos aminosav transzporter homológja, mely a 14-transzmembrán doménnel rendelkező aminosav-poliamin-kolin (APC) transzporterek családjába tartozik. A CAT4 homológon elvégzett in silico elemzésekkel kimutattam a transzmembrán fehérje azon kötőhelyeit, melyek kulcsfontosságú szerepet töltenek be a szubsztrát putreszcinhez hasonló töltéseloszlású paraquat kötésében és transzportjában. A CAT4 a tonoplaszton lokalizált; a paraquatot vakuoláris térbe szállító transzporter energiaigényéhez protongrádienst biztosító vakuoláris H+-ATPáz specifikus gátlása esetén a paraquat rezisztencia megszűnt. A CAT4 expressziója paraquat kezelés hatására indukálódott, mely indukció a rezisztens növényben lényegesen nagyobb mértékű volt, mint a szenzitívben. A rezisztencia mechanizmus hátterében a CAT4 fehérje szerkezetének módosulásából eredő, paraquattal szemben megnövekedett affinitása, illetve fokozott expressziója révén a vakuoláris membránon nagyobb számban elhelyezkedő transzporterek eredményezte intenzívebb paraquat-transzport állhat.

| Összefoglalás

76

A citoplazmatikus vas atomok a gátlószer alkalmazását követően a paraquattal kölcsönhatásba lépve membránkárosító hidroxil-gyököket generálnak, így a vaskötő fehérjék szerepe a paraquat kezdeti károsító hatásának mérsékelésében kulcsfontosságú. Bebizonyítottam, hogy a szabad vas atomok kötéséért felelős ferritin expressziós szintje a szenzitív es a rezisztens betyárkóróban egyaránt megnövekedett a gátlószer hatására. Az expresszálódó szekvenciarészek alapján meghatároztam a teljes ferritin gént és elhelyeztem a genomikai adatbázisokban. A ferritin filogenetikai törzsfájának elemzésével megállapítottam, mely, már ismert genomú növényfajok állnak legközelebb molekuláris szempontból a betyárkóróhoz. Összegezve: molekuláris biológiai és in silico elemzésekkel sikerült alátámasztanom azt a hipotézist, mely szerint a betyárkóró rezisztens biotípusú növényében a CAT4 kationos aminosav transzporter a paraquatot metabolikusan inaktív partikulumba, a vakuólumba szekvesztrálja, emellett az átmeneti védekezésben a ferritin csökkenti a paraquat regenerációját és kezdeti károsító hatását.

| Összefoglalás

77

SUMMARY Paraquat belongs to one of the widest used herbicides against weeds. Its intensive use caused increasing appearance of tolerant and resistant species against the herbicide. There are several theories explaining the resistance and outstanding resistance factor of horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.) but none of them proved to be irrefutable. The aim of my work was the definition of the mechanism of resistance of horseweed against paraquat, where I made the following important suggestions: The cause of resistance is the sequestration, where paraquat ends in the metabolic inactive compartment vacuole. I demonstrated the key role of a transporter protein in the sequestration mechanism that differs from ABC-transporters. Based on sequence analysis the protein is a homologue of Arabidopsis cationic amino acid transporter CAT4, which belongs to the 14 transmembrane subfamily of APC (Amino acid- Polyamine- Choline) transporters. I showed with in silico analysis the putative key positions in the primary sequence of the protein, where binding and transport of paraquat may occur according to the similarities of charge distribution of paraquat and natural substrates like cationic amino acids and polyamines. CAT4 is localized on the tonoplast; the phenomenon of paraquat resistance could be eliminated by the use of specific inhibition of vacuolar H+-ATPase which supplies the proton gradient needed for CAT4 and paraquat translocation into the vacuole. CAT4 showed paraquat treatment induced expression especially in the case of resistant biotype of horseweed. The background of the resistance mechanism may be the increased affinity of transporter against paraquat caused by modification in the structure of CAT4 protein or the more intensive paraquat transport caused by the higher expression and enlarged number of CAT4 transporter proteins.

| Summary

78

Following the use of inhibitor cytoplasmic iron reserves interact with paraquat building hydroxyl radicals that damage membranes therefore iron binding proteins have a key role during the initial phase of the destruction effect of paraquat. I verified that paraquat treatment increased the expression level of the iron binding protein ferritin in both sensitive and resistant biotypes of horseweed. Derived from expressed sequence tags I identified the whole coding sequence of ferritin and uploaded the data into genomic databases. Based on the analysis of the phylogenic tree of ferritins I showed molecularly neighbor species possessing a known genome that stands the nearest to horseweed. These molecular and in silico biological results support the hypothesis that in the resistant biotype of horseweed paraquat is sequestrated into a metabolic inactive particle vacuole and this transport occur through the cationic amino acid transporter CAT4 moreover ferritin reduces during initial phase of protection the further damaging effects and regeneration of paraquat.

| Summary

79

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Szeretném megköszönni Dr. Gyurján Istvánnak és Dr. Szigeti Zoltánnak, hogy a Ph. D. tanulmányaimat az általuk vezetett „Kísérletes Növénybiológia” doktori programban végezhettem az Eötvös Loránd Tudományegyetem, Természettudományi Karán. Hálával tartozom témavezetőmnek, Dr. Lásztity Demeternek és Dr. Rácz Ilonának a szakmai vezetésért, a rengeteg tudományos és emberi támogatásért. Köszönöm Dr. Soós Vilmos kollegámnak, hogy mindig szakított időt kérdéseim megválaszolására. Hasonlóképpen köszönöm az Eötvös Loránd Tudományegyetem Természettudományi Kar, Molekuláris Növénybiológia és Növényélettani Tanszékén dolgozó munkatársaknak, név szerint Dr. Bratek Zoltánnak, Dr. Rudnóy Szabolcsnak, Szegő Dórának, Dr. Halász Krisztiánnak, valamint Tóth Attiláné asszisztensnek, hogy akár eszközökkel, akár hasznos tanácsokkal segítették munkámat. Köszönöm jelenlegi munkatársaimnak, a Semmelweis Egyetem I.sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézet, Molekuláris Terápia Labor és a KPS Orvosi Biotechnológiai és Egészségügyi

Szolgáltató

Kft.

részéről,

hogy

türelemmel

viselték

dolgozatom

megszületését. Köszönet illeti Dr. Székely Annát, Dr. Boross Pétert, Dr. Kalmár Évát, Dr. Varga Mátét és Dr. Rancz Ede Attilát, akikhez bármikor fordultam, kérdéseimre mindig választ adtak és mindvégig bátorítottak. Végül családomnak és szüleimnek mondanék köszönetet. Az ő kitartásuk, szeretetük és támogatásuk nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre.

| Köszönetnyilvánítás

80

AZ ÉRTEKEZÉSHEZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE REFERÁLT TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT CIKKEK: Soós V., Páldi E., Jóri B., Szigeti Z., Rácz I., Lásztity D. (2006): Ferritin2 gene in paraquat susceptible and resistant biotypes of horseweed Conyza canadenesis (L.) Cronq. Journal of Plant Physiology, 163(9):979-982. Jóri B., Soós V., Szegő D., Páldi E., Szigeti Z., Rácz I., Lásztity D. (2007): Role of transporters in the paraquat resistance of horseweed (Conyza canadenesis /L./ Cronq.). Pesticide Biochemistry and Physiology, 88(1):57-65

TOVÁBBI TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT CIKKEK: Visnovitz T., Soós V., Jóri B., Rácz I., Szigeti Z. (2008): Staying alive: Insight into the resistance mechanism of Conyza

canadensis to xenobiotic paraquat. Acta Biologica Iugoslavia Seria Acta Herbologica, 17:173-178

REFERÁLT TUDOMÁNYOS FOLYÓIRATOKBAN MEGJELENT KONFERENCIA KIVONATOK: Soós V., Jóri B., Szegő D., Páldi E., Szigeti Z., Rácz I., Lásztity D. (2005): Paraquat-induced genes in horseweed (Conyza

canadensis /L./ Cronq.). FEBS Journal, Vol 272. Suppl., p. 429. Soós V., Jóri B., Szegő D., Bratek Z., Rácz I., Lásztity D. Szigeti Z. (2005): Role of transporters in the mechanism of paraquat resistance of horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.). Acta Biologica Szegediensis, 49: 191-193. Szigeti Z., Soós V., Jóri B., Rácz I., Lásztity D. (2004): Resistance of Conyza canadensis (L.) Cronq. Acta Physiologiae Plantarum, Vol. 26. Suppl., p. 227 Halász K., Soós V., Jóri B., Rácz I., Lásztity D., Szigeti Z. (2002): Effect of transporter inhibitors on paraquat resistance of horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.). Acta Biologica Szegediensis, 46.(3-4): 23-24.

ÖSSZEFOGLALÓK KONFERENCIA KIADVÁNYOKBAN: Szigeti Z., Visnovitz T., Jóri B., Soós V., Lásztity D., Rácz I. (2009): Insight into the Resistance Mechanism of Conyza

canadensis to Xenobiotic Paraquat. International Conference of Plant Abiotic Stress Tolerance, Vienna, Austria; p. 142 Szigeti Z., Soós V., Jóri B., Páldi E., Rácz I., Lásztity D. (2006): Transporters in the paraquat resistance of horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.). Proc. of the 15th FESPB Congress Lyon, France; p. 157. Szigeti Z., Jóri B., Soós V., Páldi E., Rácz I., Lásztity D. (2006): Role of transporters in the paraquat resistance of horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.). Proc. of the 3th EPSO Conference Visegrád, Hungary; p. 164. Soós V., Szigeti Z., Jóri B., Rácz I., Bratek Z., Lásztity D. (2004): Novel aspects of the paraquat resistance of Conyza

canadensis (L.) Cronq. Proc.of the 4th International Weed Science Congress, Durban, Republic of South Africa; p. 53. Jóri B., Lásztity D., Soós V., Rácz I., Szigeti Z. (2004): Paraquat resistance and polyamine transporters. Proc. of the 4th International Weed Science Congress, Durban, Republic of South Africa; p. 50. Szigeti Z., Soós V., Jóri B., Rácz I., Lásztity D., Lehoczki E. (2004): Paraquat resistance of Conyza canadensis (L.) Cronq. Proc. of the 4th International Weed Science Congress, Durban, Republic of South Africa; p. 40. Halász K., Soós V., Jóri B., Rácz I., Lásztity D., Szigeti Z. (2002): Influence of transporter inhibitors on paraquat resistance in horseweed (Conyza canadensis /L./ Cronq.). Proc. of European Workshop of ESSA, Varna, Bulgaria; p.27.

TOVÁBBI KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK Jóri B (2004): Növényi genomika, Botanikai közlemények 91:39-55

| Az értekezéshez kapcsolódó közlemények jegyzéke

81

CRONQ.) PARAQUAT-REZISZTENCIÁJÁBAN

Recommend Documents