Nagy Zóra1 - Györffyné Jahnke Gizella2 - Koltai Gábor3 - Májer János4
A Szigetközben és a Fertő-Hansági Nemzeti Park területén előforduló ligeti szőlő (Vitis sylvestris GMEL.) genotípusok összehasonlító mikroszatellit (SSR) vizsgálata Compare microsatellite (SSR) analysis of some Vitis sylvestris (GMEL.) accessions of the Szigetköz and Fertő- Hanság National Park
[email protected] 1NAIK 2NAIK
Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Badacsonyi Kutató Állomás, kutatási referens
Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Badacsonyi Kutató Állomás, tudományos főmunkatárs
3Nyugat-Magyarországi
4NAIK
Egyetem, Mezőgazdaság- és Élelmiszertudományi Kar; Mosonmagyaróvár, tudományos főmunkatárs
Szőlészeti és Borászati Kutatóintézet Badacsonyi Kutató Állomás, tudományos főmunkatárs, mb. igazgató
1. Bevezetés
A termesztett szőlő (Vitis vinifera L) kialakulására több elmélet létezik. DE CANDOLLE (1894) szerint a szőlő őshazája a legnagyobb valószínűség szerint Oroszországnak a transzkaukázusi része lehetett. Az ott kialakult szőlő faj, vagy fajok magvai azután a természetes tényezők hatására (madarak, szél, légáramlatok) még az ember által termesztésbe vonás előtt nagy területen elterjedtek. Később a szőlő az emberi termesztés hatására nagymértékben megváltozott, és egyre nagyobb területeken elterjedt. A vadon termő szőlők ezután a már termesztésbe vont alakok hatására jelentős mértékben átalakultak. A jégkorszak után felmelegedő Eurázsiában a fennmaradt ligeti szőlő (Vitis sylvestris GMEL.) elterjedt egész Európában, s felhatolt egészen Skandinávia déli részéig is. Termését természetes elterjedési területén a negyedidőszakban megjelenő ember kedvelte, gyűjtögette és fogyasztotta. Az i. e. II. évezred elejéről, közepéről származó ásatási leletek között találták meg az első Vitis vinifera L. típusú magvakat (5 mm-nél hosszabb, fejlett csőrű magvak). Nyugat és dél felé haladva fokozatosan későbbi korokból maradtak fenn Vitis vinifera típusú magleletek. Ez azt bizonyítja, hogy a Vitis sylvestris-t a Kaukázuson túlról vonták be a termesztésbe egykor az ősi Ázsia népei. Tőlük vették át később a már Vitis vinifera-t az ókori nyugat-ázsiai és az Égei-tenger szigetein élő népek, akik továbbterjesztették a Földközi-tenger északi és déli partvidékein (KOZMA, 1991). TERPÓ (1986) véleménye szerint a Vitis vinifera L. faj ugyanakkor nem egységes, hanem több eredeti szőlőfaj származéka, fő alapfajai a Vitis sylvestris GMEL. mellett a kétivarú virágú V. hissarica és a V. nuristanica lehetett. TERPÓ (1988) a Vitis sylvestris GMEL. új fajon belüli rendszerét dolgozta ki. Rendszerének lényege, hogy a ligeti szőlőket a levél szőrzet alapján alfajokba, a levél formája alapján, pedig változatokba sorolta. A Vitis vinifera faj földrajzi-ökológiai fajtacsoportjait (convarietas) ezekből a típusokból közvetlenül vagy közvetve vezette le. KOZMA (1967) szerint a természetes evolúció teremtette meg a Vitis sylvestris GMEL. fajt és ebből alakult ki a termesztés hatására a Vitis vinifera L. faj. A kultúrevolúció jelentős foka volt a hímnős virágú szőlő (Vitis vinifera) megjelenése. A legtöbb Vitis faj, köztük a Vitis sylvestris GMEL. is funkcionálisan váltivarú, kétlaki. Ez a váltivarúság a törzsfejlődés során az idegen megporzáshoz való alkalmazkodás folyamatában, a hímnős virág
524
porzó -, illetve termőleveleinek a redukciója révén jött létre. A Vitis sylvestris GMEL. hímnős virágú formája rügymutációval jött létre a funkcionálisan hímvirágú egyedeken. A kultúrában megváltozott anyagcsere-folyamat válthatta ki a növényeken ezt az ősi szőlőfélékre (Cissites) atavisztikusan visszaütő jelenséget. A Vitis vinifera L. földrajzi fajtacsoportjai tehát valószínűleg nem egyszerre, hanem különböző ligeti szőlő változatokból egymás mellett, illetve egymással kereszteződve alakultak ki a következők szerint: A legkorábban a pontuszi (convar. pontica) fajtacsoport alakult ki Nyugat- és Kelet-Grúziában valamint KisÁzsiában. Kiindulási formája a helyi ligeti szőlő a Vitis sylvestris GMEL. var. balcanica, Vitis sylvestris GMEL. var. typica (var. sylvestris) lehetett. A keleti (convar orientalis) fajtacsoporton belül a subconvar. caspica az ókori elő-ázsiai szőlőtermesztő államokban jött létre a Kaszpi-tóval határos területek ligeti szőlőjéből (Vitis sylvestris GMEL. var. abberans). A convar. orientalis subconvar. antasiatica későbbi eredetű. A nyugati (convar. occidentalis) fajták kiindulási formái a helyi ligeti szőlők (Vitis sylvestris) és pontuszi fajták természetes úton létrejött hibridjei (KOZMA, 1991). Hasonló nézeteket vall TERPÓ (1986) is, aki szerint a Vitis vinifera földrajzi változat-csoportjai az egyes Vitis sylvestris GMEL. változatokból levezethetők. A szőlő genomjának vizsgálatára nemzetközi együttműködés, a GENRES 081 (European Network for Grapevine Genetic Resources Conservation and Characterisation) keretein belül 1997 és 2002 között indult el Európában a szőlőfajták jellemzése mikroszatellit DNS markerekkel. A kutatási programban 6 mikroszatellit primerpárt határoztak meg és ajánlottak a fajták jellemzésére. Először a Furmint, Merlot, Sultanina, Touriga nacional és a Trebbiano Toscano fajták mikroszatellit profilját határozták meg 11 laboratóriumban. Első lépésként a résztvevő országoknak azt javasolták, hogy a saját őshonos fajtáit, majd az ott előállított új fajtákat jellemezzék az ajánlott primer párokkal. Magyarországon ezt a munkát az FVM SzBKI Pécs a SZIE Genetika és Növénynemesítés Tanszékével együttműködve több mint 100 kárpát-medencei fajta és néhány új fajta esetében elvégezte. 2007 januárjában indult, az előző projekt folytatását jelentő európai együttműködés, a GRAPEGEN 06 további DNS mikroszatellit markereket tervez bevonni a kísérletekbe és nagy hangsúlyt kíván helyezni a szőlő géncentruma közelében lévő, még nem Európai Uniós országok ősi fajtáinak jellemzésére. A GRAPEGEN kiemelt feladatként kezeli a Vitis sylvestris GMEL. populációk felkutatását, in-situ és ex-situ fenntartását, valamint jellemzését molekuláris markerek segítségével. A Vitis sylvestris Gmel. faj védett növényünk. Populációinak felkutatása és megőrzése ezért természetvédelmi szempontból, valamint a biodiverzitás megőrzésének szempontjából is jelentős. Az eddigi elméleti és gyakorlati kutatási eredmények alapján feltételezik, hogy ez a faj egyedül, vagy esetleg más fajokkal kereszteződve lehetett a mai kerti szőlő (Vitis vinifera L.) őse. Vizsgálati eredményeink ezért nagymértékben hozzájárulhatnak a Vitis vinifera L. származásának, valamint a kerti szőlő földrajzi-ökológiai fajtacsoportjainak (convarietas) kialakulásának tisztázásához. Gyakorlati szempontból is fontos lehet a falkutatott egyedek ex-situ megőrzése, mivel azok esetlegesen rezisztenciagének forrásaként szolgálhatnak, és a későbbi szőlőnemesítési programokban felhasználhatóvá válhatnak.
2. Anyag és módszer
DNS –t vontunk ki 10 szőlőalanyból, 10 Vitis vinifera (L.) fajtából és 20 Vitis sylvestris genotípusból (1. táblázat). A szőlőalanyok és a vizsgált Vitis vinifera (L.) fajták a NAIK Szőlészeti és Borászati Kutatóintézetéből, Badacsonyból és a Pannon Egyetem Georgikon Kar cserszegtomaji szőlőültetvényéből származtak. A Vitis sylvestris egyedek a Szigetközből és a Fertő – Hansági Nemzeti Parkból kerültek Badacsonyba és ex-situ megőrzés szempontjából zöldoltással alanyra lettek oltva. A vizsgálatokhoz szükséges mintákat 2013-ban gyűjtöttük.
525 525
Sorszám
Jelölés
Fajta neve
Genetikai származás
1
S1
Sylvestris B1
Vitis sylvestris GMEL.
2
S2
Sylvestris B2
Vitis sylvestris GMEL.
3
S3
Sylvestris B3
Vitis sylvestris GMEL.
4
S4
Sylvestris B4
Vitis sylvestris GMEL.
5
S5
Sylvestris B5
Vitis sylvestris GMEL.
6
S6
Sylvestris B6
Vitis sylvestris GMEL.
7
S7
Sylvestris B7
Vitis sylvestris GMEL.
8
S8
Sylvestris B8
Vitis sylvestris GMEL.
9
S9
Sylvestris B9
Vitis sylvestris GMEL.
10
S10
Sylvestris B10
Vitis sylvestris GMEL.
11
S11
Sylvestris B11
Vitis sylvestris GMEL.
12
S12
Sylvestris B12
Vitis sylvestris GMEL.
13
S13
Sylvestris B13
Vitis sylvestris GMEL.
14
S14
Sylvestris B14
Vitis sylvestris GMEL.
15
S15
Sylvestris B15
Vitis sylvestris GMEL.
16
S16
Sylvestris B16
Vitis sylvestris GMEL.
17
S17
Sylvestris B17
Vitis sylvestris GMEL.
18
S18
Sylvestris B18
Vitis sylvestris GMEL.
19
ALHAROS
Alháros
Vitis sylvestris GMEL.
20
DORGO
Dorgó
Vitis sylvestris GMEL.
21
Sarga_ortlibi
Sárga ortlibi
Vitis vinifera L.
22
Purcsin
Purcsin
Vitis vinifera L.
23
Budai_goher
Budai góhér
Vitis vinifera L.
24
Torok _goher
Török góhér
Vitis vinifera L.
25
Balafant
Balafánt
Vitis vinifera L.
26
Valtozo_Furmint
Változó Furmint
Vitis vinifera L.
27
Piros_Furmint
Piros furmint
Vitis vinifera L.
28
Koverszolo
Kövérszőlő
Vitis vinifera L.
29
Primitivo
Primitivo
Vitis vinifera L.
30
Fiano
Fiano
Vitis vinifera L.
31
N._Mex.
V. Novo Mexicana
V. riparia x V. candicans
32
Aramon_rup_G1
Aramon Ganzin N1
V. vinifera x V. rupestris
33
V._vip._Ggb
Riparia Grand glabre
V. riparia
34
V._rip._GdM
Gloire de Montpellier
V. riparia
35
V._rup._FW1
Fort Worth N1
V. rupestris
36
V._rup._FW2
Fort Worth N2
V. rupestris
37
V._rup._FW3
Fort Worth N3
V. rupestris
38
T5C
Teleki 5C E20
V. berlandieri x V. riparia
39
SO4
Teleki-Fuhr SO4 (133)
V. berlandieri x V. riparia
40
5BB
Teleki-Kober 5BB
V. berlandieri x V. riparia
1 Táblázat: A vizsgált fajták
526
Származási hely
Badacsony, Hungary (Collected form Szigetköz and Fertő-Hanság National Park)
Cserszegtomaj, Hungary
Badacsony, Hungary
Cserszegtomaj, Hungary
DNS kivonás
A DNS kivonást a növény nyugalmi állapotában gyűjtött veszző háncs részőből végeztük, melyhez a DNS Plant Mini Kit-et (Quiagen) használtuk, a gyártó utasítása szerint. A DNS mennyiségét és minőségét spektrofotométerrel határoztuk meg. A DNS –t 10 ng/ml. koncentrációra higítottuk. SSR analízis A mikroszatellit (SSR) vizsgálatokat 15 lókuszban végeztük el (2. Táblázat) A lókuszok kiválasztásánál azt vettük figyelembe, hogy köztük ne legyen kapcsoltság, ugyanakkor nagymértékű polimorfizmussal rendelkezzenek. A lókuszok kiválasztásánál figyelembe vettük azt is, hogy mely lókuszokról állnak rendelkezésre saját, hazai és külföldi irodalmi adatok (HALÁSZ et al., 2005.; SEFC et al., 2003.; COSTANTINI et al., 2007;). A PCR reakciókhoz a következő reakcióelegy bizonyult megfelelőnek (25 µl): 12,5 µl Hot Start Master Mix (Quiagen), 0.2 µM forward és reverse primer, és 50 ng templát DNS. A következő hőmérséklet profilt használtuk: (1) 45 perc 94°C-on ; (2) 1 perc 94°C-on , annealing hőmérsékletnél (3. Táblázat ) 1 perc, 73°C- on - 1 perc/35 fordulat-on ; (3) 7 perc 73°C-on Minden primer pár egy primerjét fluorescensen megjelöltük FAM-al (6FAM) a DNS lánc 5’ végén. A PCR reakcióval kapott fragmensek hosszát a PE-Applied Biosystem 3100 félautomata DNS szekvenáló készülékkel végztük el. A fragmenshosszokat Gene Scan 2.o szoftverrel értékeltük ki (Applied Biosystem).
Kapcsoltsági SSR locus név csoporta
annealing hőmérséklet
Kapcsoltsági SSR locus név csoport
annealing hőmérséklet
1
VMC8A7
64 oC
2
VMC7G3
60 oC
3
VVMD28
62 oC
4
VrZag21
62 oC
5
VrZag79
60 oC
8
VMC1F10
57 oC
9
VMC1C10
60 oC
10
VrZag25
67 oC
13
VMC3D12
57 oC
12
VMC2H4
57 oC
15
VMC5G8
58 oC
14
VMCNG1E1
58 oC
17
Scu06vv
60 oC
18
VVIM10
57 oC
19
VMC5E9
58 oC
aKapcsoltsági
csoportok ADAM-BLONDON et al. (2004) alapján
2. Táblázat: Vizsgált SSR lókuszok
527 527
Adatok elemzése
A fajták közti genetikai különbségek becslésére az un. Jaccard indexet használtuk (JACCARD, 1908). A nemzedékeknél a távolság matrix és UPGMA dendogramm szerkesztésére a MolMarker nevű platform független szoftver demo verzióját használtuk.
3. Eredmények és értékelésük
Az SSR analízis eredményei a 3. táblázatban vannak feltüntetve. Az adatok egyszerűségi mártixxal a Jaccard index segítségével lettek számolva (nincsenek feltüntetve ezek az adatok). A matrix által UPGMA- dendogram lett szerkesztve (1. ábra). A V. sylvestris, V. vinifera, és az alany fajták négy fő csoportba sorolhatók. Látható, hogy a Vitis sylvestris GMEL. egyedek – kivéve Dorgó- két elkülönülő csoportot alkot. Az Aramon Genzin N1 (V. vinifera x V. rupestris) alany a nagyobbik V. sylvestris csoport és V. vinifera csoport között helyezkedik el, ami nem meglepő a fajták hibrid eredetét tekintve. A nagyobbik V. sylvestris csoport közelebb van a Vitis vinifera fajtákhoz, mint az alanyokhoz. Ez azt valószínűsíti, hogy ezek a ligeti szőlők valóban Vitis sylvestris-ek. A kisebbik V. sylvestris csoport és a Dorgó hasonlóságot mutatnak az alanyokkal. , ami valószínűleg a hibrid eredetükre utal (V. sylvestris x V. ripara). A kapott eredmények pontosításához további genetikai, molekuláris és morfológiai erelmzések szükségesek.
4. Irodalmi áttekintés
ADAM-BLODON A. F., ROUX C., CLAUX D., BUTTERLIN G., MERDINOGLU D., THIS P. (2004): Mapping 245 SSR markers on the Vitis vinifera genome: a tool for grape genetics. Theoretical and Applied Genetics 109 : 1017-1027.
COSTANTINI L., GRANDO M. S., FEINGOLD S., ULANOVSKY S., MEJIA N., HINRICHSEN P., DOLIGEZ A, THIS P., CABEZAS J. A., MARTINEZ-ZAPATER J. M. (2007): Generation of a Common Set of Mapping Markers to Assist Table Grape Breeding American Journal of Enology and Viticulture 2007 58: 102-111.
DE CANDOLLE A. (1894): Termesztett növényeink eredete. 201- 204. p. Budapest: Királyi Magyar Természettudományi Társulat 516 p.
HALÁSZ G., VERES A., KOZMA P., KISS E., BALOGH A., GALLI ZS., SZŐKE A., HOFMANN S., HESZKY L. (2005): Microsatellite fingerprinting of grapevine (Vitis vinifera L.) varieties of the Carpatihian Basin. Vitis 44: 173-180.
528
KOZMA P. (1967): Szőlőtermesztés 1. Budapest: Mez_gazdasági Kiadó, 7-53. p.
KOZMA P. (1991): A szőlő és termesztése I. Budapest: Akadémiai Kiadó
SCOTT K. D., LEE L. S., DOW T., HENRY R. J. (2000): Isolation and characterisation of new grape microsatellites. Acta Horticulturae 528: 199-200.
SEFC K. M., LOPES M. S., LEFORT F., BOTTA R., ROUBELAKIS-ANGELAKIS K. A., IBAÑEZ J., PEJIC I., WAGNER H. W., GLÖSSL J., STEINKELLNER H. (2000): Microsatellite variability in grapevine cultivars from different Eurpean regions and evaluation of assignment testing to assess the geographic origin of cultivars. Theoretical and Applied Genetics 100: 498-505.
TERPÓ A. (1986): A kultúrfajok eredete. 108-109. p. In: TERPÓ A (szerk.): Növényrendszertan az ökonómbotanika alapjaival I. Budapest: Mezőgazdasági Kiadó
THOMAS M. R., SCOTT N. S. (1993): Microsatellite repeats in grapevine reveal DNA polymorphism when analysed as sequence tagged sites (STSs). Theoretical and Applied Genetics 86:895-990.
Munkánkat az Országos Tudományos és Kutatási Alap (OTKA-PD-109386) támogatta.
529 529
1. Ábra: Dendogramm a mikroszatellit vizsgálatok eredményei alapján (Jelölések a 1. táblázatban)
3. Táblázat: A mikroszatellit (SSR) vizsgálatok eredményei 15 lókuszon (-1 jelölés hiányzó adat vagy null allél)
530
ID VMC 1F10 2 2 0 0 4 4 2 2 0 0 4 4 2 2 0 0 4 4 2 2 0 0 4 4 1 1
VMC 3D12 2 2 2 3 6 6 2 2 0 3 6 6 2 2 2 3 6 6 2 2 2 3 6 6 1 1
VMC 7G3 1 1 2 2 8 8 1 1
2 0 4 1 9 0 2 0 2 1 9 2 1
2 0 4 1 9 8 2 0 4 2 0 8 1
1
S11
1
1
S12
1 9 0 1
1 9 0 1
1 9 0 1 9 0 1 9 0 1
2 0 8 2 0 8 2 0 8 1
S18
1
1
AL HA RO S DO RG O Sar ga_ ortli bi Pur csin
1 9 0
S1
S2
S3
S4
S5
S6
S7
S8
S9
S10
S13
S14
S15
S16
S17
Bud ai_g oher Tor ok _go her Bal afan t Valt ozo _Fu rmi
VV MD2 8 1 1 1
1
VMC 2H4 2 2 0 0 4 4 1 1
VVI M10 3 3 5 5 3 3 1 1
2 0 4 2 0 4 1
2 0 4 2 0 4 1
3 5 3 1
3 5 3 1
1
2 0 0 1
2 0 0 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2 2 8 1
2 3 4 1
1 2 8 1
1 3 2 1
1
1
1
1 1 6 1 3 0 1 2 8 1 1 6 1 2 8 1 2 8 1 2 8 1 2 8 1
1 2 8 1 3 2 1 3 2 1 2 8 1 2 8 1 3 2 1 3 2 1 3 2 1
2 0 4 2 0 0 1
2 1 2 2 0 4 1
1
1
1
1
2 3 8 2 3 8 2 3 8 1
2 3 8 2 3 8 2 3 8 1
2 0 4 2 0 0 2 0 0 2 0 0 2 0 0 1
2 0 4 2 0 4 2 0 4 2 0 4 2 0 4 1
1
1
1
1
1
1
1 9 6
2 1 6 2 2 8 2 0 2 2 0 2 2 2 6 2 3 4 2 3 4 2 3 4 2 2 6 2 2 6 2 0 2
2 5 0 2 5 0 2 2 2 1
1
2 0 2 2 2 8 2 0 2 2 0 2 2 0 2 2 2 6 2 2 6 2 2 6 2 2 4 2 2 4 2 0 0
2 5 0 2 3 8 2 2 2 1
1 2 4
1 3 2
2 5 0
2 6 4
2 1 4
2 1 8
2 0 4 1 9 0
2 0 4 1 9 6
2 1 0 2 2 2
2 1 2 2 3 8
1 1 6 1
1 2 6 1
2 4 4 2 3 0
2 6 0 2 3 8
1 9 6 2 0 0
1 9 6 1 9 6 1
2 0 4 2 0 2 1
2 1 6 1 9 4 2 1 6
2 1 6 2 0 8 2 2 2
1
1
1
1
1 1 6 1 1 6
1 1 6 1 1 6
1
1
1
1
1 9 0 1 9 2
1 9 2 2 0 4
2 0 2 2 1 6
2 2 2 2 2 2
1 1 6 1 1 6
1 1 6 1 1 6
1
1
2 3 0
2 5 0
VMC 1C10 1 1 5 6 6 8 1 1 5 6 6 8 1 1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
3 2 7 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 3 5 3 1
3 2 7 3 7 5 3 6 5 3 6 5 3 6 5 3 5 3 3 6 5 3 6 5 3 6 5 3 5 3 3 5 3 1
1 6 8 1
1 6 8 1
1 6 8 1 5 6 1 6 8 1 5 6 1 5 6 1 5 6 1 5 6 1 5 6 1
1 6 8 1 6 8 1 6 8 1 5 6 1 6 8 1 6 8 1 6 8 1 6 8 1
1
1
1 5 0
1 5 6
2 1 4 2 2 4
1
1
3 5 3
3 5 3
1 4 2 1
1 9 8 1 9 4 1 9 4
2 2 0 2 1 2 2 1 2
3 5 3 3 6 5 3 6 5
3 6 5 3 7 5 3 7 3
2 2 4 2 0 6
2 3 4 2 3 6
3 6 5 3 6 5
3 7 3 3 6 5
VrZa g21 1 1 9 9 0 0 1 1 9 9 0 0 1 1 9 9 0 0 1 1 9 9 0 0 1 1 9 9 0 4 1 1 9 9 4 4 1 1 9 9 0 0 1 1
VMC NG1 E1 9 1 3 0 1 9 1 3 0 1 9 1 3 0 1 9 1 3 0 1 9 9 3 3
VMC 5G8 1 1 1
1
3 0 3 1
3 0 3 1
1
Scu0 6vv 1 1 6 7 8 4 1 1
VMC 5E9 1 1
VMC 4G6 1 1
VrZa g79 1 1
VVS 2 1 1
1 9 1 1 9 1 1 9 1 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
2 5 3 2 5 3 1
1
1
2 5 1 2 5 1 1
1
1
1 0 7 1
1 0 7 1
1
1
1 3 3 1
1 5 1 1 1 1 5 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 5 1 1 3 5
1
1 6 8 1 6 8 1
1 7 4 1 7 4 1
1 9 1 1 9 1 1 9 1 1
9 3
9 3
1
1
1
1
1
1
1
1
1
1
9 3
9 3
1 7 2 1
1 7 4 1
1
1
3 1 1 1
1
1
3 1 1 1
1
1
2 5 5 1
1 0 5 9 3
1
1
2 0 7 2 0 5 1
2 2 9 2 0 7 1
2 5 1 2 5 1 1
9 5
1 6 8 1 6 8 1 6 8 1
2 4 9 2 5 1 1
9 3
1 6 4 1 6 8 1 6 8 1
1
9 3
3 1 1 3 1 1 1
1
9 3
3 0 3 3 1 1 1
9 3
9 3
1
1
1
9 3
2 2 1 1
2 2 1 1
9 3
9 3
1
1
1
1
9 3
1
1
8 9
1 0 1 1 0 1 9 1
2 9 9
3 1 1
1 9 6 1 9 6 1 9 6 1 7 4 1 7 4 1 7 4
2 4 9 2 5 1 1
9 3
1 9 6 1 9 6 1 9 6 1 6 8 1 6 8 1 7 2
2 4 9 2 5 1 1
9 3
3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 1
1
9 3
3 1 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 1
1 0 8 1 0 8 1 2 8 1 3 2 1 1 4 1 0 6 1 3 2 1 3 2 1
2 5 5 1
1 0 1 9 3
1 0 8 1 0 8 1 2 4 1 3 2 1 0 6 1 0 6 1 3 2 1 3 2 1
2 0 5 2 0 5 1 9 1
2 0 7 2 0 7 2 0 5
1 2 4 1 2 4 1 2 4
1 3 2 1 3 2 1 2 4
2 5 1 2 5 1 2 5 1 2 5 1 2 5 5
2 5 5 2 5 5 2 5 5 2 5 5 2 6 5
1 1 5 1 3 3 1 4 7 1 3 1 1 3 1 1 3 1 1 4 7 1 4 7 1 3 1
3 0 5 3 1 3
1 6 8 1 6 4
1 6 8 1 7 2
1 9 9 1 9 1
2 0 3 2 2 1
1 2 2 1 2 2
1 2 2 1 3 8
2 5 5 2 3 7
2 6 3 2 4 5
1 3 1 1 4 1
1 4 3 1 4 1
1 7 6 1 7 6 1
1 9 1 1 9 3 1
2 1 1 2 1 7 1
1
1
1
1
1
1
1 0 8 1
1 3 4 1
1
1
1
1
1
1
1
1
1 7 6 1 7 6
1 9 3 1 9 3
2 1 7 2 1 7
1 2 8 1 0 6
1 3 8 1 0 6
2 3 7 1
2 4 9 1
1
1
1
531 1
1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 0 1 9 4
2 0 6 1 9 4 1 9 0 2 0 0 1 9 4 1 9 4 1 9 4 1 9 4 1 9 4 1 9 4 1 9 8
1 4 2 1
2 0 4 2 0 0
2 0 4 2 0 6
8 7
9 5
9 5
1 2 3
3 0 3 3 1 1
1
1
9 7
1
1
1 6 8 1
2 0 6 1
9 7
1 6 8 1
2 0 2 1
9 5
1
1
1 0 5
1 0 5 1 0 5
3 1 7 1
3 1 7 1
1 6 4 1 7 6 1
1 4 2 1 4 2
1 6 8 1 6 8
1 9 0 2 0 0
1 9 0 2 0 6
1
1
9 5
9 5
3 0 3 3 0 3
3 1 7 3 1 7
1 6 4 1 6 4
9 3
531