Návod k použití REF: PMP 009/PMP 008/ PMP 007
Chromoprobe Multiprobe- T System
Pouze pro profesionální použití Fluorescenční In Situ Hybridizace (FISH) je technika, která umožňuje detekci DNA sekvencí na kultivovaných metafázních chromozomech a interfázních jádrech z kultivovaných nebo nekultivovaných cytogenetických vzorků. Tato technika využívá DNA sondy, které hybridizují buď s celými chromozomy nebo s jednotlivými jedinečnými sekvencemi a slouží jako efektivní doplněk ke klasické cytogenetice. Cílová DNA je po fixaci a denaturaci připravená na vpuštění podobně denaturované fluorescenčně značené DNA sondy, která má komplementární sekvenci. Následuje hybridizace. Pomocí série rychlých bez-formamidových omytí se odstraní nenavázaná a nespecificky navázaná DNA sonda. Provede se podbarvení pro vizualizaci. Fluorescenční mikroskop umožňuje pozorování nahybridizované sondy na vybraném vzorku. Informace o sondě Chromozomální přestavby zahrnující konce chromozomů se ukazují jako závažné příčiny genetických onemocnění. Význam subtelomerických chromozomálních přestaveb byla jasně prokázána sledováním jejich vztahu s neobjasněnými mentálními retardacemi a vrozenými abnormalitami. Jednotlivé subtelomerově specifické sondy se používají se zaměřením na konkrétní subtelomerické oblasti a ve výsledku stanoví syndromy jako mikrodeleční syndrom 1p36 a mikrodeleční syndrom 22q13.3. Sondy se rovněž aplikuji při vyšetřování autistických chorob, opakujících se potratů a hematologických malignit. Subtelomerické specifické sondy fy Cytocell jsou umístěné v co jak nejvzdálenější oblasti chromozomově specifické DNA na každém chromozomu. Kromě toho pokrývá materiál unikátní sekvence 100 až 300kb dlouhou oblast související telomery . Sondy byly vybrané z co jak nejvzdálenější unikátní sekvence pro zajištění nejlepší možné specificity, tak aby byly vhodné pro rutinní použití k vyšetření subtelomerických enumerací a integrity. Druhá generace originální soupravy sond je derivována z PAC klonů a byla vytvořená ve spojení s Institutem Molekulární Medicíny, která je součástí Oxfordské Univerzity ve Velké Británii. Další vylepšování tohoto produktu umožňuje některé výměny za pomocí alternativních vektorů klonů ( 35-40Kb) nebo BAC ( 150Kb) vedoucí k vylepšení intenzity signálu nebo specificity chromzomů. Průměrná velikost jedné sondy je 100Kb a všechny leží uvnitř na max. 600Kb dlouhé skutečné telomeře.
Specifikace sondy Každý čtverec soupravy Chromoprobe Multiprobe T obsahuje subtelomerově specifické sondy pro p-raménka a q-raménka (pro každé jednu) ze 23 chromozomů ( kromě akrocentrických chromozomů ). Sondy pro p-raménka a q-raménka každého chromozomu jsou značené různou barvou pomocí dvou spektrálně nezávislých fluorochromů ( p-raménka zeleně a q-raménka červeně ). Jsou umístěné společně v příslušném čtverci. Toto uspořádání umožňuje kontrolu jedné druhou jako interní kontrolou hybridizace a efektivní identifikaci chromozomů. Materiál obsažený v soupravě Každá souprava obsahuje následující reagencie, které jsou vhodné pro vyšetření 2 ( PMP009), 5 ( PMP008 ) nebo 10 ( PMP007) vzorků pacientů :
2, 5 nebo 10 destiček Chromoprobe Multirpobe –T obsahujících 42 přímo značených subtelomerických sond ( min. 20ng sondy na čtverec ). 4, 7 nebo 12 skleněných sklíček, potištěných speciální šablonou 4, 7 nebo 12 velkých krycích sklíček ( 24x60mm) 500l hybridizačního činidla ( Formamid, Dextran Sulfát, SSC) 500l podbarvení ((DAPI antifade ES : 0.125g/ml DAPI (4,6 diamidino-2-phenylindole)) 1 destičkový povrchový teploměr 1 hybridizační komůrka
Bezpečnostní opatření 1. Pouze pro diagnostické použití in vitro. Pouze pro profesionální využití. 2. Noste rukavice pokud manipulujete s DNA sondami a DAPI. 3. Hybridizační roztok obsahuje formamid, který je teratogen; nevdechujte výpary a zabraňte styku s kůží. Noste rukavice, laboratorní kabát a pracujte při zapnutém odsávači par. Po použití spláchněte velkým množství vody. 4. DAPI je potencionální karcinogen; zacházejte s opatrností, noste rukavice a laboratorní kabát. Po použití spláchněte velkým množstvím vody. 5. Všechen nebezpečný material by měl být zlikvidován dle vašich interních předpisů o likvidaci nebezpečného odpadu. Skladobání a manipulace Souprava Chromoprobe Multiprobe-T by měla být skladována při 2-8°C do data expirace, uvedeného na etiketě výrobku. Nemrazte. Zkumavka obsahující DAPI musí být uskladněná v temnu. Materiál potřebný, nedodaný v souparvě 1. Ohřívací plotýnka (s pevným povrchem a přesnou kontrolou teploty do 80C) 2. Mikropipety a špičky různé velikosti – rozsah 1l - 200l 3. Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 72C 4. Mikrocentrifugační zkumavky (0.5 ml) 5. Fluorescenční mikroskop ( viz sekce doporučení pro fluorescenční mikroskop ) 6. Plastové nebo skleněné nádoby 7. Kleště 8. Kvalitní imerzní olej pro fluorescenční mikroskop 9. Odstředivka 10. Stopky 11. Vodní lázeň s přesnou kontrolou teploty při 37*C bez míchání Doporučení fluorescenčního mikroskopu Pro optimální vizualizaci sondy doporučujeme 100 watovou rtuťovou výbojku a planapochromatické objektivy 63x nebo 100x. Trojpásmový filtr DAPI/FITC/Texas Red je optimální pro prohlížení všech fluorochromů a DAPI současně.
Příprava vzorků Souprava Chromoprobe Multiprobe – T je určená pro použití se vzorky kultivovaných fixovaných buněk periférní krve. Tyto by měly být připravené dle laboratorních směrnic. Naneste připravené vzorky ( volně uschnuté ) na skleněnou desku se sondami Chromoprobe Multiprobe-T dle níže uvedeného návodu. Zapékaní nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, může způsobit slabší fluorescenční signál.
Chromoprobe Multiprobe protokol Nezapomeňte: Sondy použité na destičce Chromoprobe Multiprobe-T jsou přímo značené pomocí fluorochromů, které jsou citlivé na světlo. Zabraňte zbytečnému kontaktu se světlem ( není potřeba pracovat ve tmě ). 1.Příprava skla a, Očistěte skleněné sklíčko se speciální šablonou. Ponořte na 2 minuty do 100% metanolu a utřete jemnou čistou tkaninou b, Zajistěte správný mitotický index. Je důležité, aby měl vyšetřovaný vzorek dostatečně vysoký mitotický index k umožnění detekce chromozomálních abnormalit. Pro ověření hustoty vzorku použijte mikropipetu ( např. Gilson P10 nebo P20) – napipetujte 2µl buněčné suspenze na jeden ze čtverců potištěného skla a nechte volně uschnout. Malé množství použitého vzorku znamená, že je potřeba jemně se dotknout pipetou skla a vzorek rozetřít. Pozorujte pod fázovým kontrastním mikroskopem. Pokud je hustota buněk příliš vysoká, nařeďte suspenzi čerstvým fixativem. Pokud je mitotický index příliš nízký, odstřeďte fixovanou buněčnou suspenzi při 160xg 10 minut. Najděte supernatant, odstraňte a vložte buněčný sediment do malého množství čerstvého fixativu. Pokud se hustota používaného vzorku změnila, naneste 2µl koncentrovaného vzorku na další čtverec potištěného skla a znovu ověřte pod fázovým kontrastním mikroskopem. Nezapomeňte: 50µl je minimální množství potřebné k provedení testu c, Kontrola kvality vzorků. Mělo by být ověřené množství cytoplasmy ve vzorku, protože může narušit in situ protokol. Pokud se chroromozomy při pozorování pod fázovým mikroskopem jeví jako uzavřené granulovaným materiálem, může to způsobit horší výsledky. Jedna z metod vedoucí k odstranění cytoplasmy je: naneste 2µl vzorku na potištěné sklíčko a pozorujte jak se fixativ rozprostírá – v normální situaci se fixativ rozprostře na maximum, ustoupí a poté se vypaří. Pro vyčištění cytoplasmy jsme zjistili, že můžeme dosáhnout efektivních výsledků, když čerstvá kapka fixativu spadne na čtverec v bodě, ve kterém dosáhlo rozprostření fixativu maxima. Nechte fixativ vypařit a opět zkontrolujte pod mikroskopem. d, Nanášení vzorku na speciálně potištěné sklo. Napipetujte 2µl buněčné suspenze na všech 24 ploch ve sledu jak je popsáno níže. Toto zamezí rozprostření buněk jedné přes druhou.
e, Jakmile uschne první skupina nanesených kapek, nakápněte na zbývající čtverce stejným způsobem 2µl suspenze. Jakmile sklo uschne, ověřte pod fázovým kontrastním mikroskopem jestli jste nezapomněli nakápnout některý ze čtverců. Pokud jste na některý ze čtverců zapomněli nebo je na některých pouze několik málo buněk, jednoduše napipetujte tyto místa znovu; není potřeba nanášet suspenzi na nové sklo. Pokud po ověření skla zjistíte, že čtverce mají nedostatečné množství buněk/metafází, můžete přidat další suspenzi k dosažení větší hustoty buněk. Nezapomeňte: Pokud jsou metafáze buněk rozprostřené do jiných čtverců, omyjte nové speciálně potištěné sklo v metanolu a znovu naneste suspenzi a nechte každou kapku uschnout před nanesením další.
Příprava multisondy a skla se vzorky a, Vložte hybridizační komůrku obsaženou v soupravě do vodní lázně při 37°C a nechte ji zahřát na tuto teplotu. Může to trvat až hodinu než se vodní lázeň po zapnutí zahřeje. b, Promíchejte hybridizační roztok pipetou a předehřejte 25µl na 37°C alikvotně na destičku. Rovněž předehřejte každou destičku tak, že ji položíte na ohřívací plotýnku při 37°C potištěnou stranou dolů. Nedotýkejte se povrchu destičky. c, Ponořte skleněné potištěné sklíčko obsahující fixované vzorky do 2xSSC na 2 minuty při pokojové teplotě bez třepání. d, Zatímco se destička stále předehřívá při 37°C, vysušte sklíčko se vzorky v etanolové řadě ( každý 2 minuty, 70%, 85% a 100% ) při pokojové teplotě. Nechte volně uschnout a položte na ohřívací plotýnku při 37°C. e, Přidejte 1µl předehřátého hybridizačního roztoku na každý z 24 čtverců předehřáté destičky pomocí P10 mikropipety. Při tomto kroku je destička stále položená na ohřívací plotýnce při 37°C. Spojení skla se vzorky s destičkou se sondami a, opatrně obraťte sklo se vzorky nad destičku se sondami tak, aby číslo 1, které je nyní převrácené směrem dolů, bylo umístěné nad povrch pravé strany destičky se sondami – viz. obrázek
8p 8q
7p 7q
6p 6q
5p 5q
4p 4q
3p 3q
2p 2q
1p 1q
16p 16q
15q
14q
13q
12p 12q
11p 11q
10p 10q
9p 9q
22q
21q
20p 20q
19p 19q
18p 18q
17p 17q
XpYp XqYq
Obrázek 1. Poloha sond na destičce Chromoprobe Multiprobe – T. b, Ujistěte se, že sklíčko se sondami je důkladně spojené s odpovídajícími čtverci na destičce. Opatrně spusťte sklo nad destičkou tak, aby kapky hybridizačního roztoku byly v kontaktu s destičkou a sklem. Jemně přitiskněte k sobě a ujistěte se, že je hybridizační roztok rozprostřený i na koncích každého ze čtverců. c, Opatrně obraťte destičku, tak, že uchopíte matné konce skleněné destičky a otočíte – takže sklo se vzorky je pod destičkou se sondami. Ujistěte se, že destička nepřesahuje přes sklo se sondami – toto by mohlo způsobit cross-kontaminaci sond. d, Vložte na ohřívací plotýnku nebo do inkubátoru na 10 minut při 37°C. Návod k použití destičkového teploměru a, Před provedením denaturace, by měla být ověřená teplota plotýnky 75°C pomocí destičkového teploměru, který je součástí soupravy. b, Pro správné použití teploměru položte na povrch ohřívací plotýnky a vyčkejte až různé segmenty teploměru přestanou měnit barvu. Aktuální teplota je indikována pomocí tmavě modrého zbarvení. Nezapomeňte: a, Pokud segmenty vypadají granulovaně a barvy nejsou stejnoměrné a pravidelné, měl by být teploměr zlikvidován, protože uplynula doba jeho použití. Životnost každého teploměru by měla být dostačující pro provedení 10 testů s multisondou. b, Tento teploměr je destička s kapalnými krystaly vhodná pro více použití. Mělo by se sním zacházet s opatrností pro zajištění rozumné životnosti. Teploměr by se měl používat pouze k ověření teploty ohřívací plotýnky, nesmí se používat k monitorování výkonu plotýnky po celou dobu práce.
Denaturace Nezapomeňte: PCR cykler NENÍ vhodný k použití namísto pevného povrchu ohřívací plotýnky a, Položte destičku na ohřívací plotýnku. Zvláště dbejte nato, abyste ji přemístili v rovnoměrné hladině. Ujistěte se, zda je destička ve správném kontaktu s ohřívací plotýnkou . b, Denaturujte na ohřívací plotýnce při 75°C 2 minuty. Hybridizace Vložte destičku do předehřáté hybridizační komůrky, zakryjte víčkem a nechte komůrku plavat ve vodní lázni při 37°C přes noc. Nezapomeňte: a, Nezalepujte víko na hybridizační komůrce b, Nezakrývejte vodní lázeň víkem c, Nehybridizujte v inkubátoru d, Zajistěte, aby hybridizační komůrka byla zcela suchá ( tzn. žádná voda nebo vlhká tkanina uvnitř komůrky ). Vlhkost uvnitř komůrky je nezbytná pro optimální hybridizaci. Post-hybridizační omytí Nezapomeňte: Neomývejte více než 2 destičky najednou a, Sejměte opatrně destičku ze skla b, Ponořte sklo do 0.4xSSC ( pH 7.0) při 72°C na 2 minuty bez třepání c, Nechte odtéci přebytečnou kapalinu a ponořte do 2xSSC, 0.05% Tween-20 při pokojové teplotě ( pH 7.0) na 30 sekund bez třepání Nanesení DAPI a vizualizace výsledků a, Nechte odtéci přebytečnou kapalinu a napipetujte 20µl DAPI na každý konec skla. b, Přikryjte krycím sklíčkem ( 24x60mm), odstraňte všechny bubliny a nechte vyvinout barvu v temnu 10 minut. c, Pozorujte pomocí fluorescenčního mikroskopu Nezapomeňte: Některé typy mikroskopů mají držák sklíček, který ztěžuje pozorování krajních konců skla. V tomto případě jednoduše otočte sklo o 180°, což pomůže při pozorování skla. Stabilita výsledných sklíček Nafishované skla by měly být analyzovatelné až 1 měsíc, pokud jsou uložené v temnu a při pokojové teplotě. Doporučení při postupu 1. Zapékání nebo zestaršování sklíček se nedoporučuje, může to způsobit slabší fluorescenční signál. 2. Hybridizační podmínky mohou být nepříznivě ovlivněné použitím jiných reagencí které doporučuje nebo dodává Cytocell Ltd. 3. Používejte kalibrovaný teploměr pro měření teploty roztoků, vodní lázně a teploty inkubátorů. Tyto teploty jsou rozhodující pro optimální provedení testu. 4. Koncentrace omývacích roztoků, jejich pH a teplota jsou důležité, protože nízká stringence může způsobit nespecifické navázání sondy a vysoká stringence může způsobit chybění signálu. 5. Nekompletní denaturace může mít za výsledek chybění signálu nebo dlouhá denaturace může rovněž způsobit nespecifické navázání sondy. Očekávané výsledky 1. Normální vzorek by měl vykazovat signál v telomerické oblasti každého relevantního chromozomu nebo 2 signály v interfázní buňce. 2. Sonda 2q PAC (dj1011O17) zjišťuje běžný polymorfismus popsaný Macina et al v roce 1994. Delece 2q by měla být zjišťována u rodičů ke stanovení dědičnosti. Studie zdůrazňují důležitost testování delece pomocí FISH s použitím druhé sondy mapující tuto oblast. Proto byla druhá sonda
2q BAC. 172I13, D2S447, která je situována proximálněji a značená červeně, přidána na čtverec Y. Jakékoli patrné delece musí být sledované testováním ostatních členů rodiny, aby nedošlo ke špatné interpretaci klinicky významných distálních delecí 2q jako je polymorfismus nebo běžná varianta.
Sonda 8p 9q 11p 11q 12p 17q 20q 22q
známá cross-hybridizace 8p s 1p a 3q 9q s 10p, 16p, 18p a XqYq 11p se 17p 11q s 12q ( intersticiálně ) 12p se 6p a 20q 17q s 1p a 6q 20q se 6p 22q s 2q ( intesticiálně)
