AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN

Pannon Egyetem Vegyészmérnöki- és Anyagtudományok Doktori Iskola

AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEM-KONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN DOKTORI (PH.D.) ÉRTEKEZÉS Készítette:

Major Brigitta

okleveles vegyészmérnök Témavezet :

Dr. Gubicza László egyetemi tanár

Pannon Egyetem Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet 2013

AZ ETIL-LAKTÁT ENZIMKATALITIKUS SZINTÉZISE NEMKONVENCIONÁLIS KÖZEGEKBEN Értekezés doktori (PhD) fokozat elnyerése érdekében Írta: Major Brigitta okleveles vegyészmérnök Készült a Pannon Egyetetem, Vegyészmérnöki Tudományok és Anyagtudományok Doktori Iskolája keretében Témavezet : Dr. Gubicza László Elfogadásra javaslom (igen / nem)

(aláírás)

A jelölt a doktori szigorlaton …......... % -ot ért el,

Az értekezést bírálóként elfogadásra javaslom: Bíráló neve: …........................ …................. igen /nem ……………………….

(aláírás)

Bíráló neve: …........................ ….................) igen /nem ……………………….

(aláírás)

A jelölt az értekezés nyilvános vitáján …..........% - ot ért el Veszprém

…………………………. a Bíráló Bizottság elnöke

A doktori (PhD) oklevél min sítése….................................

i

………………………… Az EDT elnöke

KIVONAT A disszertációban egy az élelmiszer- és a gyógyszeripar által felhasznált aromaanyag, az etil-laktát különböz , nem-konvencionális körülmények között történ szintézisét mutatom be. Az észter el állítását természetes alapanyagokból – tejsavból és etanolból – immobilizált Candida antarctica lipáz enzimmel valósítottam meg, hogy „természetes” min sítés terméket kapjak. A vizsgált nem-konvencionális közegek közül szerves oldószerekben kezdtem a kísérleteket. Meghatároztam a különböz

körülmények hatását a reakcióra és az

elérhet maximális hozamot (94 %). Ezeket az eredményeket összehasonlítási alapul véve kísérleteket végeztem foszfónium típusú ionos folyadékokban, és megállapítottam, hogy a vizsgált 7 közeg közül 2-ben ment végben enzimkatalizált reakció, míg 5 ionos folyadék maga is katalizálta a folyamatot. A különböz paraméterek hatását vizsgálva az el állításra azt találtam, hogy bár azonos hozamot értem el Cyphos 104 közegben (95 %), mint toluolban, mégis az ionos folyadék sok el nyös tulajdonsággal rendelkezett. Ilyen pozitívum pl. az elérhet

nagyobb szubsztrátkoncentráció, a

szükséges kisebb mennyiség enzim és a lipáz jobb újrafelhasználhatósága. Ezen kívül a felhasznált ionos folyadék család lehet séget ad a tejsav fermentléb l való kinyerésére és közegváltás nélkül az észterezés végrehajtására. Kísérleteket

végeztem

mikrohullámú

h közlés,

energiaforrás használata mellet több különböz

mint

nem-konvencionális

ionos folyadék közegben, és

megállapítottam, hogy a mikrohullámú sugárzás képes megnövelni az elérhet észter hozamot és lecsökkenteni a reakcióid t. Ismeretes, hogy a tejsav kb. 20 %-nál töményebb vizes oldatokban dimereket képez, ezeknek a molekuláknak az észterezési reakció körülményei között való viselkedése nem teljesen ismert. Ennek megértését segítették el

a mikrohullámú

sugárzás, illetve konvencionális h közlés és vízelvonás mellett végrehajtott kísérletek. Ezek a vizsgálatok rávilágítottak arra, hogy a mikrohullámú sugárzás meggyorsítja a laktilsav tejsavvá történ bomlását, ami magyarázza a megnövekedett észter hozamot és reakciósebességet. A vízelvonás pedig – az észterezési reakcióknál általában tapasztaltakkal ellentétben – csökkenti a hozamot, mivel a tejsav dimerizációját segíti el , ami fogyasztja az etil-laktát szintézis szubsztrátját.

ii

ABSTRACT THE ENZYMATIC SYNTHESIS OF ETHYL LACTATE IN NONCONVENTIONAL MEDIA In the dissertation synthesis of ethyl lactate, a flavour compound applied in the food and pharmaceutical industry is presented. The ester was manufactured under nonconventional conditions from natural raw materials: lactic acid and ethanol by immobilized lipase enzyme from Candida antarctica. Firstly organic solvents were used as a non-conventional media. Its effects on the reaction and the maximal yield (94 %) were determined. Then – based on the results – experiments were carried out in phosphonium type ionic liquids and it turned out that 2 of them were suitable for the enzymatic reaction. The synthesis was optimized in Cyphos 104 media and similar yield was achieved as in toluene (95 %), however the ionic liquid has more beneficial features like higher initial substrate concentration, lower amount of enzyme needed, recycling of the lipase. Moreover the ionic liquid family can be simultaneously applied for the direct recovery of lactic from the fermentation broth as well as the esterification reaction. Experiments were conducted to study the effect of microwave irradiation (as a non-conventional energy source) in various ionic liquids. It was found that higher ester yield and shorted reaction time were achieved by using microwave irradiation. It is known that lactic acid forms dimers in higher than 20 % concentration in aqueous solutions, and the behaviour of these molecules in the esterification reactions has not been thoroughly described. To study it measurements by microwave irradiation, conventional heating and water removal were carried out. The experiment results proved that microwave irradiation accelerate the hydrolysis of lactil lactate to lactic acid, which explains the higher ester yield and reaction rate. Water removal, however – unlike the other esterification reactions – decreased the yield, since it helps to form lactic acid dimers, consuming the substrate of the synthesis of ethyl lactate.

iii

AUSZUG ENZYMKATALITISCHE SYNTHESE VON ETHYLLACTAT IN NICHTKONVENTIONELLEN MEDIEN In der Dissertation die Synthese von Ethyllactat, ein Aromastoff, das in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie verwendet wird, ist vorgelegt. Das Ester wurde unter nichtkonventionellen Bedingungen aus natürlichen Ausgangsstoffen, aus Milchsäure und Ethanol mit Hilfe von immobilisierter Lipase aus dem Organismus Candida antarctica hergestellt. Zuerst

wurden

organische

Lösungsmittel

als

nichtkonventionelle

Reaktionsmedien verwendet. Ihre Wirkung auf die Reaktion und der maximale Umsatz (94 %) wurden bestimmt. Basierend auf den Ergebnissen die weitere Untersuchungen wurden in ionischen Flüssgkeiten von Phosphonium-Typ vorgenommen. Die Synthese wurde optimiert in Cyphos 104 Medium and ähnliche Umsätze wurden erreicht als in Toluol (95 %), aber die ionische Flüssigkeit hat viel günstigere Eigenschaften wie höhere Ausgangskonzentrationen, die erforderliche Enzymmenge ist kleiner, Recycling von Lipase-Enzyme. Ausserdem die verwendete Familie der ionischen Flüssigkeiten ermöglicht die unmittelbare Ausgewinnung der Milchsäure aus der Fermentationsbrühe und die Durchführung der Veresterung ohne Änderung des Reaktionsmediums. Um

die

Wirkung

der

Mikrowellenbestrahlung

(als

nichtkonventionelle

Energiequelle) zu untersuchen, Versuche wurden in verschiedenen ionischen Flüssigkeiten durchgeführt. Hierbei zeigte sich, dass höherer Umsatz und kürzere Reaktionszeiten bei Verwendung der Mikrowellenbestrahlung konnten erreicht werden. Es ist bekannt, dass die Milchsäure in wässrigen Lösung höher als 20 % unter Abspaltung von zwei Wassermolekülen Dilactid bildet. Das Verhalten dieser Moleküle während der Veresterung ist noch weitgehend unbekannt. Um es zu verstehen, Versuche wurden bei konventionellen Heizung und Mikrowellenbestrahlung durchgefürt, weiterhin wurde die Wirkung der Wasserentfernung untersucht. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Mikrowellenbestrahlung beschleunigte die Bildung von Milchsäure aus dem Dilactid. Es ist eine Erklärung für den erhöhten Umsatz und Reaktionsgeschwindigkeit. Die Wasserentfernung verringerte den Umsatz, weil sie die Bildung von Dimere aus der Milchsäure unterstüzt, wobei die freie Milchsäure, Substrat für die Ethyllactat Bildung verwendet wird. iv

JELÖLÉSJEGYZÉK Rövidítés

Teljes név

α

Szeparációs faktor

[Ac]-

Acetát ion

[bmim]PF6

1-butil-3-metil-imidazólium-hexafluoro-foszfát

[C4py][HSO4]

N-butil-piridínium-hidrogén-szulfát

[(C4)3PC1] [MeSO4]

Tributil-metil-foszfónium-metil-szulfát

[C4py][HSO4]

N-butil-piridinium-hidrogénszulfát

[(C6)3 PC14][FAP]

Trihexil-tetradecil-foszfónium-trisz(pentafluoroetil)trifluorofoszfát

[(C6)3PC14][Cl]

Trihexil-tetradecil-foszfónium-klorid

[(C6)3PC14][DCA],

Trihexil-tetradecil-foszfónium-dicián-amid

[(C6)3PC14][NTf2],

Trihexil-tetradecil-foszfóniumbisz((trifluorometil)szulfonil)-imid

CAL-A

Candida antarctica lipáz A

CAL-B

Candida antarctica lipáz B

DC

Cirkuláris dikroizmus készülék

CE

Kapilláris elektroforézis

Cyphos 102

Trihexil-tetradecil-foszfónium-bromid

Cyphos 104

Trihexil-tetradecil-foszfónium-bisz -(2,4,4-trimetil-pentil)foszfinát

Cyphos 105

Trihexil-tetradecil-foszfónium-dicián-amid

Cyphos 106

Triizobutil-metil-foszfónium-tozilát

Cyphos 109

Trihexil-tetradecil-foszfónium bisz-(trifluorometánszulfonil)-amid

Cyphos 110

Trihexil-tetradecil-foszfónuim-hexafluoro-foszfát

Cyphos 163

Tetrabutil-foszfónium-bromid

Cyphos 166

Tetraoktil-foszfónium-bromid

Cyphos 202

Trihexil-tetradecil-foszfónium-dodecilbenzol-szulfonát

[DCA] dX/dx ’’

-

Dicián-amid ion A pervaporáció hajtóereje Dielektromos veszteség -1-

’ [EMIM][NTf2]

Dielektromos állandó 1-etil-3-metil-imidazólium-bisz((trifluorometil)szulfonil)imid

GC

Gázkromatográf

IL

Ionos folyadék

IPA

2-propanol

J

Fluxus Elektormos vezet képesség

logP

Adott oldószer víz és n-oktanol fázisok közötti megoszlási hányadosának tizes alapú logaritmusa

MALDI-TOF MS

Mátrixszal-segített lézer deszorpciós/ionizációs- repülési id tömegspektrométer

[MEBu3P][NTf2]

2-metoxi-etil(tri-n-butil)foszfónium- bisz(trifluorometánszulfonil)imid

n

Minta elemszáma

NMR

Nukleáris mágneses rezonancia

PLU

Propil-laurát egység

RP-HPLC

Fordított fázisú folyadékkromatográf

s

Korrigált tapasztalati szórás

t

/2,n

Az n-1 szabadsági fokhoz, bizonytalansághoz tartozó t eloszlás

tg

Dielektromos veszteségi tényez

THF

Tetrahidrofurán

VACEM 42

1-(2-etoxi-etil)-3-metil-imidazolium-hexafluor-foszfát

VACEM 44

1-{2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etil}-3-metil-imidazoliumhexafluor-foszfát

VACEM 47

1-[2-{2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi}-etil]-3-metil-imidazoliumhexafluor-foszfát

VACEM 58

1-(2-metoxi-etil)-3-metil-imidazolium-hexafluor-foszfát

xA és xB

Az A ás B komponensek koncentrációja a pervaporáció betáplálási áramában

yA és yB

Az A és B komponensek koncentrációja a pervaporáció permeátumában

-2-

TARTALOMJEGYZÉK 1

Bevezetés ......................................................................................................- 6 -

2

Irodalmi összefoglaló....................................................................................- 8 2.1

Tejsav....................................................................................................- 8 -

2.1.1

El fordulása és tulajdonságai .......................................................- 8 -

2.1.2

El állítás .......................................................................................- 9 -

2.2

2.1.2.1

Kémiai szintézis .....................................................................- 10 -

2.1.2.2

Bioszintézis ............................................................................- 10 -

Tejsav észterek, etil-laktát ..................................................................- 16 -

2.2.1

Észterek el állítása .....................................................................- 16 -

2.2.2

Észterek felhasználása ................................................................- 19 -

2.2.3

Etil-laktát tulajdonságai ..............................................................- 20 -

2.3

Candida antarctica lipáz B enzim ......................................................- 21 -

2.3.1

Tulajdonságok.............................................................................- 21 -

2.3.2

Immobilizálás..............................................................................- 22 -

2.4

Enzimes reakciók nem-konvencionális közegei .................................- 24 -

2.4.1

Szerves oldószer .........................................................................- 25 -

2.4.2

Ionos folyadék.............................................................................- 26 -

2.4.2.1 2.5

Foszfónium típusú (Cyphos®) ionos folyadékok....................- 28 -

Mikrohullámú sugárzás.......................................................................- 33 -

2.5.1

Mikrohullámú sugárzás definíciója ............................................- 33 -

2.5.2

Mikrohullámú h közlés alapelvei...............................................- 34 -

2.5.3

Mikrohullámú f tés és a konvencionális f tés összehasonlítása - 36 -

2.5.4

A mikrohullámú h közlés használata .........................................- 37 -

2.5.5

Mikrohullámú sugárzás kémiai reakciókra gyakorolt hatásai ....- 38 -

2.6

2.5.5.1

Mikrohullám hatása észterezési reakcióra..............................- 41 -

2.5.5.2

Mikrohullám hatása az enzimekre és enzimes reakciókra .....- 41 -

Víztartalom szabályozás, pervaporáció ..............................................- 43 -

2.6.1

Membrános m veletek alapegyenletei........................................- 44 -

2.6.2

Pervaporációs membránok..........................................................- 45 -

2.6.2.1 2.6.3

Hidrofil membránok ...............................................................- 45 -

Pervaporációval segített enzimes észterezési reakciók...............- 46 -

-3-

3

Célkít zések................................................................................................- 47 -

4

Anyagok és analitikai módszerek ...............................................................- 48 4.1

4.1.1

Alkalmazott enzim......................................................................- 48 -

4.1.2

Vegyszerek..................................................................................- 48 -

4.1.3

Ionos folyadékok.........................................................................- 50 -

4.1.4

Membránok .................................................................................- 51 -

4.2

5

Anyagok..............................................................................................- 48 -

Analitikai módszerek ..........................................................................- 52 -

4.2.1

Víztartalom meghatározás ..........................................................- 52 -

4.2.2

Sav-bázis titrálás .........................................................................- 53 -

4.2.3

Gázkromatográfiás elemzés........................................................- 54 -

4.2.4

Folyadékkromatográfiás elemzés ...............................................- 58 -

4.2.5

Kísérleti módszerek, berendezések bemutatása a dolgozatban ..- 61 -

4.2.6

A mérések pontossága, reprodukálhatósága ...............................- 62 -

Kísérleti munka és eredmények ..................................................................- 63 5.1

Tejsav viselkedése h hatására ...........................................................- 63 -

5.1.1

Kísérleti módszer ........................................................................- 63 -

5.1.2

Eredmények és értékelésük.........................................................- 63 -

5.2

Konvencionális h közléssel végrehajtott rázatott lombikos reakciók - 64 -

5.2.1

5.2.1.1

Kísérleti módszer....................................................................- 64 -

5.2.1.2

Eredmények és értékelésük ....................................................- 67 -

5.2.2

Kísérletek ionos folyadékban......................................................- 75 -

5.2.2.1

Kísérleti módszer....................................................................- 75 -

5.2.2.2

Eredmények és értékelésük ....................................................- 79 -

5.2.3 5.3

Kísérletek szerves oldószerben ...................................................- 64 -

Enzim visszaforgatás vizsgálata .................................................- 84 -

Mikrohullámú h közléssel végrehajtott kísérletek .............................- 87 -

5.3.1

Kísérleti berendezés ....................................................................- 88 -

5.3.2

Kísérleti módszer ........................................................................- 89 -

5.3.3

Eredmények és értékelésük.........................................................- 91 -

5.4

Víztartalom szabályozás pervaporációval és zeolittal ........................- 96 -

5.4.1

Kísérleti berendezések ................................................................- 97 -

5.4.2

Kísérleti módszer ........................................................................- 98 -

5.4.3

Eredmények és értékelésük.......................................................- 100 -4-

6

Összefoglalás ............................................................................................- 107 -

7

Irodalomjegyzék .......................................................................................- 109 -

8

Tézisek ......................................................................................................- 127 -

9

Thesis ........................................................................................................- 130 -

10

Publikációk és proceedingek ................................................................- 133 -

-5-

1 Bevezetés Napjainkban egyre növekv igény tapasztalható az egészségre ártalmatlan „zöld” vegyszerek

és

oldószerek

el állítására

és

használatára,

„zöld”

technológiák

kidolgozására a környezet és a gazdaság kímélése céljából. Ez tulajdonképpen azt jelenti, hogy törekedni kell: • az emberre és a környezetre ártalmatlan, megújuló forrásból származó alapanyagok használatára; • a felhasználás után biológiai hatásra lebomló, ártalmatlan termékek el állítására; • az energiafelhasználás minimalizálására, az energiakihasználtság növelésére; • a hulladéktermelés elkerülésére; • a

segédanyagok,

koncentráltabb,

oldószerek

kisebb

használatának

térfogatú

csökkentésére,

elegyekben,

katalizátorral

a

minél történ

szintézisekre; • a vegyipari balesetek (robbanások, tüzek) lehet ségének minimalizálására [Pereira 2011]. A tejsav jelent sége abból ered, hogy természetes forrásokból, biológiai úton (fermentációval), a kémiai szintézishez képest kisebb költséggel el állítható optikailag aktív formában is. Molekulaszerkezete – hidroxil és karboxil csoporttal is rendelkezik – reakciók sokaságára ad lehet séget, ezért felhasználható számos környezetre ártalmatlan, ipari jelent ség termék szintézisében [Holten 1971]. Az észterezés a tejsav kinyerése, tisztítása és környezetbarát, nagy érték termékek el állítása szempontjából is fontos reakció. Ha az észterezést az ugyancsak természetes forrásból el állítható etanollal végezzük, egy a természetben is el forduló aromaanyagot, etil-laktátot kapunk, amelyet az élelmiszeriparon kívül a gyógyszeripar és az elektronikai ipar is felhasznál [Pereira 2011]. Ismeretes, hogy a természetes kiindulási anyagokból, enzimatikus átalakítással nyert aromaanyagok „természetes” min sítést kapnak, ami tovább növeli az el állított termék értékét. Az ionos folyadékok viszonylag új és még kevéssé megismert családja a foszfónium kationt tartalmazó vegyületek. Rájuk is igazak az ionos folyadékok kedvez tulajdonságai, úgymint az elhanyagolható g znyomás, a tervezhet ség, a különleges

-6-

oldószer-tulajdonságok, melyek lehet vé teszik enzimes reakciók lejátszatását bennük, és amik alapján „zöld” oldószernek tekintjük ket [Keskin 2007]. Az imidazólium és ammónium típusú ionos folyadékokhoz képest azonban számos további el nyös vonással is rendelkeznek. Ilyen sajátosság pl. a nagyobb kémiai [Martinis 2010] és h stabilitás [Bradaric 2003], az, hogy feltételezhet leg kedvez bb környezetet biztosítanak az enzimek számára [Abe 2008], illetve az a tapasztalat, hogy felhasználhatók a tejsav fermentléb l való kinyerésére [Marták 2007]. A mikrohullámú sugárzást, mely ionvezetés vagy dipólus polarizáció révén közvetlenül a reakcióelegynek adja át az energiát, egyenletes és a konvencionális h közlésnél hatékonyabb h átadási módszernek tartják. További el nye, hogy egyes esetekben megnöveli az enzimek szelektivitását, aktivitását és stabilitását [CarrilloMunoz 1996], bár a lejátszódó folyamatok mechanizmusa legtöbbször nem ismert. A tejsav felhasználása kapcsán az egyik legnagyobb akadály, amit l a mai gyártástechnológiák szenvednek, a kis konverzió és a tisztaság, amik a termelést technológiai és ökológiai szempontból versenyképtelenné teszik. Ezért hatékony katalizátorok és elválasztási m veletek alapvet

fontosságúak a tejsav-észterek

versenyképes technológiáinak kifejlesztéséhez. Erre nyújthat lehet séget a tejsav foszfónium típusú ionos folyadékban történ enzimes észterezése, ha a tejsav kinyerését és az észterképzést sikerül ugyanazzal az ionos folyadékkal megvalósítani. A legkedvez bb technológia kidolgozásához az észterezési reakció jobb megértése is fontos tényez , mivel a tejsav hajlamos a felhasználás körülményei között dimereket képezni, illetve ezekb l visszaalakulni. Ez a mellékreakció a limitáló lépés mind a tejsav tisztításánál, mind az észterek el állításánál [Engin 2003]. Kutatómunkámnak ezért kett s célja volt: az etil-laktát enzimatikus el állításának vizsgálata különböz

nem-konvencionális körülmények (szerves oldószer és ionos

folyadék közeg, illetve mikrohullámú h közlés) alkalmazása mellett, illetve a lejátszatott észterezési reakció jobb megértése érdekében a tejsav dimerizációs, és dimeréb l történ hidrolízisre való hajlamának vizsgálata.

-7-

2 Irodalmi összefoglaló 2.1 Tejsav 2.1.1

El fordulása és tulajdonságai A 2-hidroxipropánsav, más néven tejsav, a természetben is megtalálható szerves

sav. Felfedezése a svéd származású vegyész, Carl Wilhelm Scheele nevéhez f z dik, akinek 1780-ban sikerült izolálnia más szerves molekulákkal (pl.: citromsav, glicerin) együtt [Datta 2006]. Számos élelmiszer természetes összetev je. Megtalálható a legtöbb tejtermékben (joghurtban, íróban, túróban), mivel fermentációkor a tej cukortartalmából keletkezik. Hatására a fehérjék kicsapódnak, és kocsonyás álagúvá állnak össze, ezt nevezzük aludttejnek [Kajtár 1984]. A tejtermékeken kívül a tejsav megtalálható borban [Peres 2009], savanyú káposztában, kovászban és az állati és emberi izmokban is. Az emberi vérben nyugalmi állapotban 1-2 mmol/l, de ez az érték nagymérték

fizikai

igénybevétel esetén 20 mmol/l fölé is emelkedhet [Kajtár 1984]. Felépítését tekintve a tejsav a legegyszer bb asszimertikus szénatomot tartalmazó hidroxikarbonsav. Két optikailag aktív formája létezik, kémiai szintéziskor racém elegy képz dik. Izomereinek elnevezésére több különböz nevezéktan használható. Az egyik a glicerinaldehid szerkezetét alapul vev , a XIX. században, Emil Fischer által kidolgozott rendszer. Ez alapján a lineárisan polározott fény rezgési síkját jobbra forgató enantiomert L-nek, míg a balra forgatót D-nek nevezzük. A másik lehet ség a Cahn, Ingold és Prelog által kidolgozott (C.I.P.) szabály használata. Ekkor az L enantiomer megfelel je az S, a D-é pedig az R [Markó 2001]. Mivel a szakirodalomban többségében az L, illetve D megjelölést használják, a dolgozatomban én is ezt a nevezéktant fogom követni. A 2-1. ábra mutatja a tejsav enantiomereinek szerkezetét. COOH * HO C H

COOH H *C OH

CH3

CH3

L(+)-tejsav

D(-)-tejsav

2-1. ábra: Tejsav enantiomereinek szerkezeti képlete.

A természetben töbségében a jobbraforgató L enantiomer fordul el . Ez a forma található meg az állati izmokban, továbbá ezt állítja el számos mikroorganizmus. Meg -8-

kell említeni azonban, hogy vannak D izomert [Németh 2011], illetve racém elegyet el állító törzsek is [Bartholomé 1979]. Fizikai és kémiai tulajdonságai alapján a tejsav színtelen, szagtalan er sen higroszkópos anyag. Vízben és vízzel elegyed vízzel nem elegyed benzolban

és

oldószerekben korlátlanul, számos

szerves oldószerben (hexán, toluol) nehezebben oldódik, míg

kloroformban

oldhatatlan

[Bartholomé

1979].

Néhány

fizikai

tulajdonságát a 2-1. táblázat tartalmazza. 2-1. táblázat: A tejsav fizikai tulajdonságai [Perry 1963].

Tulajdonság

Számérték

Moláris tömeg

90,08 g/mol

Olvadáspont Forráspont

16,8 °C 122 °C (14 Hgmm-en)

Relatív s r ség

1,1249 (15 °C-on 4 °C-os vízhez képest)

Savasság (pKa)

3,85

Forgatóképesség (α αD25)

2,53 (L-tejsav, 20 %-os vizes oldatban)

A tejsavat különböz töménység vizes oldatok formájában forgalmazzák. Ennek oka, hogy vízelvonás hatására az egyik molekula karboxil csoportja egy másik molekula hidroxil csoportjával észter kötést alkot (víz kilépése mellett). Az oldatban ennek következtében dimerek, trimerek és egyéb oligomerek jelennek meg. Ezzel az egyensúlyi folyamattal 20 %-nál töményebb oldatokban már számolni kell [Vu 2005]. A keletkez oligomerek nemcsak a monomer tejsav tartalmat befolyásolják, hanem pl. a forgatóképességet is. Míg a 20 %-os vizes oldatban αD25 = 2,53 addig 80 %-os oldatban már 5,1 [Bartholomé 1979]. 2.1.2

El állítás A tejsav el állítására számos technológiát dolgoztak ki. Ezek között kémiai

szintéziseket és fermentációs utakat is találunk. A két módszer közötti legnagyobb különbség, hogy a termék az els

esetben optikailag inaktív, racém elegy, ezzel

ellentétben, fermentáció használatakor a forgatóképességét az alkalmazott törzs határozza meg. El állítható tehát L(+), D(-)-tejsav vagy racém elegy is, bár többnyire a jobbra forgató izomert részesítik el nyben, mivel a két legnagyobb felhasználó az élelmiszeripar (kizárólag) és a m anyagipar (többségében) ezt igényli [Datta 2006]. -9-

2.1.2.1 Kémiai szintézis Szintetikus eljárások a hatvanas évek elejét l léteznek, és többnyire laktonitril (2hidroxi-propánnitril) er s savakkal történ hidrolízisén alapszanak. Ezt a technológiát használta a Monsanto illetve a Sterling Chemicals. A laktonitrilt acetaldehidnek hidrogén-cianiddal

való

reagáltatásakor

vagy

az

akrilnitril

gyártásának

melléktermékeként kapták [Datta 2006, Kajtár 1984]. Ezen kívül tejsav el állítása lehetséges acetaldehidnek szén-monoxiddal és vízzel történ

reagáltatásával nikkel(II)-jodid vagy kénsav katalizátor mellett, magas

h mérsékleten és nyomáson [Bartholomé 1979]. Alternatív el állítási mód lehet a klórpropionsav hidrolízise, cukrok lúgokkal katalizált dehidratációja, propilénglikol oxidációja vagy propilén oxidálása salétromsavval [Mussatto 2008]. 2.1.2.2 Bioszintézis Ipari méretekben el ször 1881-ben állítottak el tejsavat biológiai úton, és 1990 óta a nagy volumenben történ termelése szinte kizárólag szénhidrátok fermentációjával történik. Ennek egyik oka a már említett tény, hogy a kémiai szintézissel el állított termék racém elegy, amib l a gyakran el nyben részesített L-izomer kinyerése csak igen magas költségek árán lehetséges. A másik indok, hogy az olcsóbb, megújuló források használata célszer bb az amúgy is fogyatkozó petrolkémiai alapanyagoknál [Vu 2005]. A legnagyobb tejsavtermel

vállalatok a hollandiai CCA Biochemical BV, -

aminek vannak üzemei Európában, Brazíliában és az USA-ban – az Archer Daniels Midland és a Natureworks LLC az USA-ban és a Musashino a Távol-Keleten [Datta 2006]. 2.1.2.2.1 Bioszintézis alapanyaga Szénhidrátforrásként számos különféle haszonnövény használható, pl.: kukorica, árpa, cukornád, cukorrépa [Joglekar 2006], cukorcirok [Hetényi 2010] vagy búza [Hetényi 2011a]. A legf bb különbség köztük a tisztaságukban, illetve az árukban van. Természetesen a legtisztább alapanyag a cukor lenne, de az nagyon költséges, így csak laboratóriumi méretekben használják. A melasz, a savó vagy más hulladékok jóval olcsóbb források, bár ezeknél figyelembe kell venni a szennyez anyagokat, mivel azok befolyásolhatják a feldolgozást. A fent felsorolt szénhidrátforrásokon kívül a fermentációt végz

mikroorganizmusoknak fehérjékre, foszfát- és ammóniumsókra,

illetve más egyéb tápanyagokra is szükségük van. Ezeket éleszt - 10 -

extraktum, szója

hidrolizátum stb. hozzáadásával biztosítják [Joglekar 2006], bár egyes alapanyagok, mint pl. a búza fehérjetartalma nitrogénforrásként is szolgál, ezzel csökkentve a szükséges éleszt mennyiségét [Hetényi 2008]. A fent említett, ipari méretekben alkalmazott alapanyagokon kívül kísérletek folynak egyéb növényi hulladékok hasznosítására tejsav fermentációban. Ilyen anyagok pl. a szilázs [Thang 2008], konyhai hulladékok [Zhao 2009a], rizshéj és Eucalyptus globulus (golyós eukaliptusz) fa [Vila 2008], Brassica juncea (barna mustár) levelek [Zhao 2008] vagy a sörgyártáskor keletkez cellulóz tartalmú pép [Mussatto 2008]. 2.1.2.2.2 A fermentációt végz mikroorganizmusok A használt mikroorganizmusokat több szempont szerint csoportosíthatjuk. Rendszertani szempontból vizsgálva elmondható, hogy tejsav el állítására általában gomba vagy baktériumtörzseket használnak. A termelt vegyületek tekintetében beszélhetünk: • Homofermentatív törzsekr l: Kizárólag tejsavat termelnek. • Heterofermentatív törzsekr l: A tejsav mellett pl.: etanolt és szén-dioxidot is termelnek. A fermentációt végz

mikroorganizmusok csoportosíthatók a termelt tejsav

forgatóképessége alapján is. • Jobbra forgató tejsavat termelnek. • Balra forgató tejsavat termelnek. • Racém elegyet termelnek [Reddy 2008]. A 2-2. táblázat tartalmaz a teljesség igénye nélkül néhány tejsavtermel mikroorganizmust.

- 11 -

2-2. táblázat: Tejsavtermel mikroorganizmusok.

Mikroorganizmus

El állított

El állított tejsav

neve

termék(ek)

forgatóképessége

Irodalom

Baktériumok Bacillus

homofermentatív

L(+)

coagulans Lactobacillus.

[Zhang 2008, Zhao 2008, Akao 2007]

homofermentatív

racém

[Panesar 2007]

L. amylophilus

homofermentatív

L(+)

[Reddy 2008]

L. bulgaricus

homofermentatív

L(+)

[Datta 2006,

acidophilus

Bartholomé 1979] L. casei

heterofermentatív

L(+)

[Panesar 2007]

L. curvatus

heterofermentatív

D(-)

[Panesar 2007]

L. delbrueckii

homofermentatív

L(+)

[Mussatto 2008]

L. fermentum

heterofermentatív

L(+)

[Panesar 2007]

L. helveticus

homofermentatív

racém

[Panesar 2007]

L. leichmanii

homofermentatív

L(+)

[Datta 2006]

L. paracasei

heterofermentatív

L(+)

[Panesar 2007]

L. plantarum

heterofermentatív

racém

[Charalampopoulos 2009]

L. rhamnosus

heterofermentatív

L(+)

[Panesar 2007]

Lactococcus lactis

homofermentatív

L(+)

[Panesar 2007]

Leuconostoc sp.

heterofermentatív

D(-)

[Panesar 2007]

Streptococcus

homofermentatív

L(+)

[Panesar 2007]

homofermentatív

L(+)

[Zhang 2008, Jiménez

thermophilus S. salivarius

2010] Gombák Rhizopus oryzae

heterofermentatív

L(+)

[Lin 2007]

Saccharomyces

heterofermentatív

L(+)

[Gao 2009a, van

cerevisiae

Maris 2004]

- 12 -

2.1.2.2.3 Fermentáció és termékkinyerés Hagyományos módon napjainkban f leg szakaszos eljárásokkal hajtják végre a fermentációt. Ebb l az következik, hogy a tenyésztés el rehaladtával – beavatkozás nélkül – a termel d tejsav lecsökkenti a fermentlé pH-ját, ami negatívan befolyásolja a mikroorganizmusok termelékenységét. A szabályozás nélkül elérhet hozam általában csak a fele a szabályozás mellett tapasztaltaknak [Li 2004]. Ezért a pH-t valamely lúg, általában Ca(OH)2 adagolásával állandó értéken tartják. Ennek következtében a keletkez tejsav egy része kálcium-laktáttá alakul át. Az ezt követ feldolgozás savas kezeléssel történik. Általában kénsavat adnak a rendszerhez, hogy visszanyerjék a tejsavat. A technológia nagy hátránya, hogy minden tonna termelt tejsav mellett keletkezik kb. 1 tonna CaSO4 csapadék, ami a benne oldott szerves szennyez k miatt nehezen kezelhet , ezen kívül a több lépésb l álló kinyerés, tisztítás képezi a termék tejsav el állítási költségének felét [Yi 2008, Joglekar 2006]. Számos kísérlet folyik a fenti technológia fejlesztése érdekében. Az egyik kutatási irány olyan törzsek kifejlesztésével foglalkozik, amik alacsony pH-n is megfelel hatékonysággal termelnek [Gao 2009a]. Megoldást jelenthet egyéb lúgok – pl.: nátrium-hidroxid, (v. –karbonát), illetve ammónium-hidroxid [Hetényi 2011b] – használata. Ezek szulfátja már nem képez oldhatatlan csapadékot, így egy megfelel technológiával visszaforgathatók. A harmadik kutatási irány egyéb – a csapadékképzésen kívüli – elválasztási módszerek kidolgozását t zte ki célul. Ha a fermentációt folyamatos üzemmódban m ködtetjük, lehet ség van a tejsav folyamatos elvételére a következ módokon: Reaktív extrakció: A tejsav hidofil tulajdonsága miatt rosszul extrahálható vízzel nem elegyed

szerves oldószerekkel, de ha az extrahálószer reagál a tejsavval és

komplexet képez vele, azzal átvihet a szerves fázisba. Az extrahálószer lehet valamely hosszú szénláncú, alifás amin, amit sok esetben valamilyen szerves oldószerben (pl.: trin-decilamin, cis-9-oktadekán-1-ol oldva alkalmaznak [Gao 2009b] vagy trialkilfoszfónium-oxid [Lin 2007]. A szerves fázisból a tejsav sztrippeléssel, sav, lúg vagy valamely er sebb, és illékony amin hozzáadásával nyerhet ki, amit az extrahálószer és az oldószer regenerálása és visszaforgatása követ. Ezen technológiának természetesen alapfeltétele, hogy se az oldószer, se az extrahálószer ne legyen toxikus a fermentációt végz mikroorganizmusokra [Joglekar 2006]. A membrános elválasztási m veletek az extraktív fermentáció számos hátrányát kiküszöbölik. Nem kell tartani a visszakeveredést l, a mikroorganizmusok nincsenek - 13 -

közvetlenül kitéve egyéb vegyszereknek, nincs szükség külön keverésre és viszonylag nagy hatékonyság érhet

el. Többfajta membrános m velet is szóba jöhet.

Elektrodialízis, elektrodialízis bipoláris membránnal, illetve ezek bioreaktorral történ kombinálása (elektrokinetikus bioreaktor). Problémát jelent viszont a membránok rövid élettartama és magas ára [Li 2004]. Adszorpciós/kromatográfiás módszerek: Tejsav adszorpciója lehetséges számos ioncserél gyantával, úgymint Dowex MWA-1, Alamine 336, IRA-92 vagy Amberlite IRA-400. A legjobb eredményeket az utóbbival érték el metanol és 1 M kénsav eluens használata mellett. Kísérletek alapján a gyanta el nye az, hogy széles pH tartományban használható, továbbá az etanolos, kénsavas elúcióval egy lépésben az észterezés is végrehajtható. A technológia hátránya, hogy szükség van a fermentlé pH-jának szabályozására a szorpciós hatás növelése érdekében, továbbá a gyanta regenerálásához nagy mennyiség vegyszer szükséges [Joglekar 2006]. Ezen hátrányok kiküszöbölése sikerült osztrák és vietnámi kutatóknak [Thang 2008] semleges polimer gyanta (Amberlite XAD1600) alkalmazásával, mivel így eluensként vizet használhattak. Meg kell azonban említeni, hogy mindkét esetben szükség volt valamilyen egyéb tisztítási lépésre, mivel a termékben maradtak aminosav és egyéb szerves sav szennyez k. Észterezés: Ennek a technológiának nagy el nye, hogy nagy tisztaságú termék állítható el a nyers tejsav vagy tejsavsó alkohollal való reagáltatásával, rektifikálásával, majd az észter hidrolizálásával. Ezzel a módszerrel lehet legkönnyebben a különböz szerves savakat elválasztani. Az észterezés, illetve a hidrolizált tejsav kinyerése megoldható savkatalizátor és pervaporáció kombinálásával [Datta 1998], illetve ioncserél gyantával [Zhao 2009a, Sun 2006]. A technológia továbbfejleszthet azzal, hogy a desztillálás egy id ben zajlik az észterezéssel és a hidrolízissel. Ekkor reaktív desztillációról beszélünk [Lin 2007]. Látható tehát, hogy a feldolgozás számos úton lehetséges, éppen ezért Joglekar és társai [Joglekar 2006] becslést készítettek néhány tejsav kinyerési technológia költségeire. Minden esetben az üzem kapacitását 1000 t/év-nek vették. A költségek számításának alapját az alapanyagköltségek és a közm

költségei képezték indiai

telephelyet feltételezve. A három technológia részleteit mutatja a 2-2. ábra.

- 14 -

Extrahálószer(a), oldószer

Folyamatos fermentáció

Reaktív extrakció

I. technológia:

Extrahálószer(b)

Vissza extrahálás

MeOH

Kinyerés

Mész

II. technológia:

Észterezés

MeOH

Szakaszos fermentáció

Sz rés

CaCa-laktát csapadék laktát képzése, sz rés

Sejttömeg

Hidrolízis

Tejsav

H2SO4

Oldás, savas kezelés, sz rés

Tejsav metanolban észterezéshez

CaSO4

NH4OH

III. technológia:

Szakaszos fermentáció

Sz rés

NH4laktát

Elektrodialízis

NH4laktát

Bipoláris elektrodialízis

Tejsav észterezéshez

Sejttömeg

2-2. ábra: Tejsav el állító technológiák [Joglekar 2006].

A költségbecslés adatait tartalmazza a 2-3. táblázat. 2-3. táblázat: Költségbecslés [Joglekar 2006].

Becsült költségek

I. techn.

II. techn.

III. techn.

2,12

2,08

3,04

0,37

0,17

0,26

Közm ($/kg tejsav)

0,52

0,55

0,53

M ködési ktg. ($/kg tejsav)

0,12

0,12

0,13

Fix ktg. ($/kg tejsav)

0,58

0,56

0,82

Összes ktg. ($/kg tejsav)

1,59

1,40

1,74

Beruházási ktg. (millió $) Vegyszerek,

tartalék

membránok

($/kg tejsav)

A táblázat adatai alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy a II. – hagyományos, csapadékképzésen alapuló – technológia a leggazdaságosabb, bár a szerz k nem részletezik, hogy a hulladékkezeléssel és -elhelyezéssel kapcsolatos költségekkel számoltak-e. 2.1.2.2.4 A tejsav felhasználása A világ tejsav termelése évr l évre n . A termelt volumen 2006-ban 120 000 t/év [Datta 2006] és 350 000 t/év [Joglekar 2006] közötti érték volt, és világviszonylatban

- 15 -

évenként 12-15 %-os növekedést jósoltak. Ennek oka, hogy a hagyományos, ruhaipari – b rök cserzése, gyapjú festése –, illetve élelmiszeripari - tartósító- és pácolószer, pH szabályzó, emulgeálószer – felhasználás mellett a tejsav hasznosításának lehet ségei egyre b vülnek. Dehidratálással akrilsav, polimerizációval politejsav, kondenzációval pentán-2,3-dion, hidrogénezéssel propilén-glikol állítható el

bel le, észterezhet ,

el állítható a kalcium- illetve nátriumsója. Ez is azt bizonyítja, hogy a tejsav kiváló platform vegyület, hiszen, bel le egyszer kémiai átalakításokkal számos alapvegyület el állítható (több esetben megújuló forrásból). [Datta 2006].

2.2 Tejsav észterek, etil-laktát A tejsav hidroxil és karboxil csoportja révén számos vegyülettel képes protonkatalizált egyensúlyi reakcióban észtert képezni. A reakció a karbonsavakra jellemz addíciós-eliminációs mechanizmus szerint játszódik le. Az észterezési reakció általános reakcióegyenletét a 2-3. ábra mutatja [Markó 2002]. O R C

+

R'

OH

H+

O R C

OH

+

H2O

OR'

2-3. ábra: Észterezési reakció általános egyenlete.

2.2.1

Észterek el állítása Az észterezési reakció végbemeneteléhez mindenképpen szükség van valamilyen

katalizátorra, mivel nélküle az egyensúly rendkívül lassan áll be. A h mérséklet emelésével a folyamat ugyan gyorsítható, de az egyensúlyi összetétel a h fokkal alig változik, mivel a reakció során nincs számottev

entrópiaváltozás. Az egyensúly a

tömeghatás törvénye szerint eltolható az észterképzés felé, ha az egyik reakciópartnert (rendszerint az alkoholt) feleslegben alkalmazzuk vagy a keletkez termékek egyikét folyamatosan eltávolítjuk a reakcióelegyb l [Markó 2002]. Az észter hozam maximalizálása érdekében számos különböz megoldás született a fönt említett befolyásoló tényez k eltér kombinációinak alkalmazásával vagy újszer technológiák használatával. Az etil-laktát egyedi el állítási módjairól számolnak be Adams, illetve Pereira és munkatársai. Az általuk kidolgozott egyik technológia rektifikáló oszlopból, folyamatos kevert tankreaktorból és pervaporációs egységb l álló félfolyamatos eljárás [Adams - 16 -

2008], a másik pedig egy szimulált mozgóágyas reaktor (12 ioncserél gyantával töltött oszlopból álló rendszer, melyek között a betáplálás és a termékelvétel helyét ciklikusan változtatták) használata az észter el állítására és elválasztására [Pereira 2011]. Asthana és társai koncentrált (88 tömeg %-os) tejsav és 40 % etanolfeleslegb l kiindulva ioncserél gyanta katalizátorral és reaktív desztillációjával értek el 95 %-os konverziót, némi laktát oligomer észter és sav melléktermékek keletkezése mellett. [Asthana 2005]. Ugyanakkor Gao és társai úgynevezett „szuper-finom mágneses szilárd szupersav SO2-4/ZrO2-Fe3O4” katalizátort alkalmazva értek el 53 %-os hozamot [Gao 2007]. Az észterezési reakció hatékony katalizárotai lehetnek a lipázok is. Parida és társai Candida cylindracea (más néven Candida rugosa) enzimet használtak egyenes láncú 2hidroxi savak (köztük tejsav) els rend alkoholokkal történ észterezésére. A legjobb reakcióközegnek a toluolt találták, ahol az enzim aktivitása kb. 100-szorosa volt a tetrahidro-furánban vagy dioxánban tapasztaltaknak, továbbá 1-butanol esetén közel 100 % enantioszelektivitással ment végbe a reakció [Parida 1991]. From és munkatársai ezzel ellentétben Candida antarctica lipázt használták sikeresen tejsav alkoholokkal és karboxilsavakkal való észterezésére hexán közegben [From 1997]. Munkájukat kiegészíti Hasegawa és társainak eredménye, mely szerint etil-laktát enzimes el állítása (16 különböz

lipázzal tesztelve) nagy hozammal lehetséges hidrofób éterekben és

ketonokban is, mivel ezek az oldószerek a nagyobb hidrofóbicitásuk miatt kevésbé toxikusak az enzimekre. Méréseik során azonban a n-hexán és az oldószermentes közeg kevésbé bizonyult megfelel nek [Hasegawa 2008]. Roenne és társai ugyancsak több immobilizált lipáz enzimet – úgy, mint Candida antarctica lipáz B (Novozym 435), Thermomyces lanuginosa lipáz (Novozym LT IM) és Rhisomucor miehei lipáz (Novozym RM IM) – teszteltek tejsav egyenes láncú alkoholokkal (C6-C18) való észterezésének katalizátoraként. Vizsgálták a reakció körülményeinek a hatását, tehát a használt enzim típusát, mennyiségét, reakció h mérsékletét, az alkohol : sav mólarányt, a szubsztrát koncentrációt. A hozam tovább növelése érdekében a keletkez

vizet

reakcióelegyhez adott megfelel mennyiség 4A zeolittal szabályozták. A legmagasabb észter hozamot a 2-4. táblázatban megadott reakciókörülmények között érték el [Roenne 2005]. Megjegyzend , hogy az alkalmazott 20 tömeg % enzim rendkívül magas érték, okára a cikk nem tér ki.

- 17 -

2-4. táblázat: A legjobbnak ítélt reakciókörülmények.

Számérték Tejsav

30 mM

Alkohol

30 mM

Novozym 435 enzim

20 tömeg % (a reaktánsokra vonatkoztatott)

Zeolit

100 mg

Oldószer: ciklohexán

10 ml

Reakcióid

24 óra

Reakcióh mérséklet

50 °C

Rázatás intenzitása

150 rpm

A fermentáció termékeként a tejsavat gyakran ammónium-laktát formájában kapjuk meg, ezért több kutatócsoport is [Filachione 1952, Sun 2006] kísérletezett ammónium-laktátból kiinduló észter el állítással, hiszen így egy lépéssel rövidebb a folyamat, ami jelent s költségmegtarkítást jelent. Az eredmények alapján azonban csak magasabb forráspontú alkoholokkal – mint pl.: butanol – ment végbe a reakció megfelel hozammal, mivel a reakcióh mérsékletet ezekben az esetekben 100 °C fölé lehetett emelni, ami el segíti az ammónia és a víz reakcióközegb l való eltávolítását. Alternatív megoldási lehet ség az ammónia inert gázzal való eltávolítása, illetve szárítószer használata, bár Halpren eredményei alapján az elérhet konverzió nem túl jelent s (45 % 96 óra után) [Halpern 2003]. Kasinathan és társai ugyancsak ammóniumlaktátból indultak ki, a tejsavat tributil-foszfáttal extrahálták, majd ezt követ en hajtották végre az etanollal való észterezést savas ioncserél

gyanta katalizátor

jelenlétében. A 10 órás reakció eredményeként 78 %-os konverziót és 95 %-os (etillaktát) szelektivitást értek el, ami abból adódott, hogy az extrakció nélkül tapasztaltakhoz képest visszaszorultak a mellékreakciók [Kasinathan 2010]. Az egyensúly eltolásához a melléktermékként keletkez

víz vagy a termék

eltávolítására az egyik legkorszer bb módszer a pervaporáció alkalmazása. Delgado és társai savas ioncserél

gyanta katalizátort és PERVAP® 2201 típusú hidrofil

pervaporációs membránt használva 90 %-os konverziót értek el tejsav etanollal való észterezésében. A szerz k megállapították továbbá, hogy 20 tömeg %-nál töményebb

- 18 -

tejsavban már oligomerek is jelen vannak, amik ugyancsak észterez dnek a reakció során [Delgado 2010]. A tejsav és etanol savas ioncserél gyanta katalizátorral való észterezésének és a megfelel észter hidrolízisének alaposabb megértése céljából Delgado és társai kinetikai méréseket is végeztek. Meghatározták a reakcióelegyben el forduló komponensek ioncserél

gyantára való adszorbciós hajlamát és azt találták, hogy az adszorpciós

konstansok a következ sorrendben csökkennek: víz > etanol > tejsav > etil-laktát. Meghatározták az észterezés és a hidrolízis aktiválási energiáját: 52,29 és 56,05 kJ/mol [Delgado 2007]. 2.2.2

Észterek felhasználása A tejsav észterezésével kapott termékek többségének gyakorlati jelent sége is

van. A tejsav sóinak hosszú szénláncú zsírsavakkal alkotott észtereit, mint pl. glicerollaktosztearátot el szeretettel használják az élelmiszeriparban, f leg pékárukban emulgeálószerként. A tejsav kis molekulatömeg alkoholokkal alkotott észterei, (pl.: etil-laktát,

propil-laktát,

butil-laktát) környezetbarát

„zöld” oldószerek,

mivel

elhanyagolható a toxicitásuk, kicsi az illékonyságuk és biológiai hatásra lebomlanak [Aparicio 2009]. A tejsav észterek felhasználási területe nagymértékben növelhet , ha más természetes eredet oldószerekkel, mint pl. zsírsav-metil-észterekkel elegyítik ket. A tejsav, illetve tejsav észterek optikai aktivitását is ki lehet használni, pl. királis szintéziseknél, gyógyszerek és mez gazdasági vegyszerek el állítására. Erre példa az R-(+)-fenoxipropionsav és származékainak (gyomirtó szerek) el állítása [Datta 2006]. Az etil-laktátnak több felhasználási területe is van. Alkalmazzák a tinta összetev jeként, ízesít szerként, parfümökben, [Delgado 2010] bevonatként, továbbá ken anyagok és szilikonolaj eltávolítására. A nagy tisztaságú etil-laktát alkalmas elektronikai és precíziós készülékek tisztítására. Az FDA (Amerikai Élelmiszer és Gyógyszer Hatóság) jóváhagyta az etil-laktát használatát aroma és illatanyagok, valamint gyógyszerkészítmények oldószereként [http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?fr=73.1001 2012. 01. 27.]. Így érthet , hogy az élelmiszeripar mellett széles körben használja a gyógyszer- és kozmetikai ipar is, f leg ken csökben, krémekben els sorban oldószerként vagy viv anyagként, de az etil-laktát az aktív hatóanyag számos pattanás elleni készítményben is [Datta, 2006]. McConville és társai arról számoltak be, hogy - 19 -

szilárd, orális gyógyszerkészítmények bevonásához is kiváló oldószer a nagy tisztaságú etil-laktát, kiváltva ezzel a hagyományosan használt szerves oldószereket, így csökkentve többek között az oldószer belégzéséb l fakadó akut egészségkárosító hatásokat. Kutatásuk alapján az etil-laktát számos egyéb gyógyszergyári felhasználásra is alkalmas lehet. Alkalmazható tablettabevonat alkotóelemeként, használható granulálásnál, ízesít anyagként, illetve inhalálók hajtóanyagaként [McConville, 2009]. Ugyancsak az élelmiszeripar számára van nagy jelent sége, hogy az etil-laktát – az acetonnal, etil-acetáttal, hexánnal és etanollal összehasonlítva – hatékonyabb extrahálószernek bizonyult karotinoidok paradicsom hulladékokból történ kinyerésére [Strati 2011], illetve alkalmas -tokoferol olivaolajból való extrakciójára is [Vicente 2011]. A fenti felhasználási területeken kívül a rövid szénláncú alkoholokkal történ észterezés lehet séget nyújt a tejsav fermentléb l történ

kinyerésére is, ezzel

egybeolvasztva a tisztítás és az észter el állítás lépéseit, ahogy az már a 2.1.2.2.3 fejezetben olvasható volt. 2.2.3

Etil-laktát tulajdonságai Az etil-laktát színtelen vagy enyhén sárgás szín , lágy „krémes” illatú folyadék.

Molekulatömege 118,13 g/mol, -26 és 154 °C között folyadék halmazállapotú, és s r sége a vízével közel azonos (1,03 g/cm3) [Bartolomé 1979]. Az etil-laktát iránti növekv érdekl dés ellenére keveset tudunk az anyag fázisviselkedésér l, oldatának termodinamikai tulajdonságairól. A kevés, ezen a területen dolgozó kutatócsoport egyike Aparicio és társai, akik az etil-laktát vizes oldatának fázisviselkedését termodinamikai és spektroszkópiai szempontból vizsgálták, ezen kívül molekuláris dinamikai szimulációkat végeztek [Aparicio 2009, Aparicio 2008]. Ferreira és társai meghatározták az etil-laktát / poli-tejsav fázisdiagramját [Ferreira 2008], míg Tombokan és társai a szklareol ((1R,2R,8aS)-dekahidro-1-(3-hidroxi-3-metil-4pentenil)-2,5,5,8a-tetrametil-2-naftol) / etil-laktát / szuperkritikus CO2 terner elegy fázis tulajdonságait vizsgálták [Tombokan 2008].

- 20 -

2.3 Candida antarctica lipáz B enzim A lipázokat (E.C.3.1.1.3), vagyis triglicerol hidrolázokat a hidroláz enzimek osztályába (E.C.3), ezen belül azok közé az enzimek közé soroljuk, amik hatásukat észter kötéseken (E.C.3.1), konkrétabban karboxil-észterek kötésein (E.C.3.1.1) fejtik ki [Hou 2009, Magnusson 2005]. 2.3.1

Tulajdonságok A Candida antarctica éleszt gombát, ahogy azt a név is sejteti, eredetileg az

Antarktiszon izolálták. A törzs két különböz (CAL-A és CAL-B) lipáz enzimet termel, amelyek egymástól eltér

vonásokkal rendelkeznek (2-5. táblázat), így két jól

elkülönül felhasználási területet alkotnak [Kirk 2002]. 2-5. táblázat: CAL-A és CAL-B tulajdonságai [Kirk 2002, Magnusson 2005, Martinelle 1995].

Tulajdonság

CAL-A

CAL-B

Molekulatömeg (kDa)

45

33

Izoelektromos pont (pI)

7,5

6,0

7

7

420

435

100 [100]

15 [0]

6-9

7-10

Van (de kicsi)

Nincs

Sn-2

Sn-3

Legmegfelel bb pH Specifikus aktivitás (LU/mg)1 H stabilitás 70°C-on2 pH stabilitás3 Határfelületi aktiválódás4 Pozíció specifikusság trigliceridekkel szemben 1

: Mérési körülmények: 1,5 ml, 0,2 M tributirin, 5 % gumiarábikum és 0,2 M CaCl2, 25°C, 7,5es pH. A szubsztrát oldatot emulgeálták és 1 percig ultrahangfürd ben kezelték. A reakciót az enzim oldatnak a szubsztrát oldathoz adásával indították.

2

: Maradék aktivitás 70°C-on, 0,1 M tris pufferben (pH: 7,0) 20 percig, [illetve 120 percig] történ inkubálás után.

3

: A pH, amin 20 óra szobah mérsékleten történ inkubálás után a maradék aktivitás legalább 75 %.

4

: A triacilglicerol lipázok egy jellemz

tulajdonsága a víz/lipid határfelületeken történ

aktiválódásuk. Martinell és munkatársainak cikke alapján CAL-B esetén egyáltalán nem befolyásolta az új fázis megjelenése az enzim aktivitását, míg CAL-A esetén kismérték aktivitásnövekedés volt tapasztalható.

- 21 -

Szerkezete alapján a CAL-B egy 317 aminosavból felépül globuláris fehérje, méretei kb.: 30 Å x 40 Å x 50 Å, aktív centruma körülbelül 10 Å x 4 Å széles és 12 Å mély [Idris 2012]. Képes hidrolizálni észtereket, tioésztereket, fehérjéket, epoxidokat, alkil-halogenideket, valamint hasítani hidroxil-nitrilek szénkötéseit [Magnusson 2005]. Nem-természetes nukleofilek lipáz-katalizált reakciója is végrehajtható vele, lehet vé téve az észterek aminolízisét [García 1994], perhidrolízisét [Hernandez 2011] vagy hidrazinolízisét [Yadav 2010]. Az ilyen reakciók el nyösek lehetnek olyan észterek átalakításánál, amikor a hagyományos kémiai katalízis nem m ködik, vagy a mellékreakciók dominálnak [Faber 1997]. Mint általában a lipázoknak, a CAL-B-nek is nagy a stabilitása nem-vizes közegekben (pl.: szerves oldószerekben, ionos folyadékokban). Ez a tulajdonsága nagyon hasznossá teszi, mivel így az ellentétes irányú reakciók – észterezés vagy átészterezés – is lejátszathatók, szélesítve ezzel a felhasználás lehet ségeit [Hollmanna 2009, van Rantwijk 2007]. 2.3.2

Immobilizálás Az egyes biokatalizátorok elterjedésének sok esetben a kulcsfontosságú

momentuma az immobilizáció megvalósítása, mivel így biztosítható a drága enzim reakcióelegyb l való könny , gyors eltávolítása és újra felhasználhatósága. A szilárd hordozóra történ

kötés ezen kívül megakadályozza a termék enzimmel való

elszennyez dését, és lehet vé teszi a szakaszos technológiák folyamatossá tételét. Ezen kívül az immobilizáció – általában – növeli az enzim stabilitását, a magas h mérséklettel és a szerves oldószerekkel szembeni t r képességét [Kirk 2002, Idris 2012]. Ez CAL-B enzim esetén különösen nagy jelent ség tény, mivel a stabilitása natív formában már 70°C-on elhanyagolható (2-5. táblázat). Immobilizálva viszont Chu és munkatársainak publikációja alapján már stabilnak és jól használhatónak bizonyult 65°C-on vizes közegben pálmazsírsav hidrolízisére [Chu 2003]. Az

immobilizált

enzimet

körülvev

mikrokörnyezet

számos

tényez je

befolyásolja az enzim m ködését. A legf bb tényez ket és azok hatását tartalmazza a 2-6. táblázat.

- 22 -

2-6. táblázat: Az immobilizálás enzimet befolyásoló tényez i és azok hatása [ReliZymeTM and SEPABEADS® EC Enzyme carriers http://www.resindion.com 2012. 03. 12.].

Mátrix tulajdonságai

Hatás a katalitikus

Befolyásolt tulajdonság

A funkciós csoport típusa,

Enzim orientációja

felület polaritása

hatékonyságra Az aktív hely elérhet sége változik

Porozitás

Anyagátadás

Reakciósebesség változik

Távtartó molekula

Anyagátadás,

Stabilitás és aktív hely

rendszer flexibilitása

hozzáférhet sége változik

kötéstávolsága

Számos technológia használható lipázok immobilizálására. A leggyakoribbak a következ típusok: • polimer alapú (pl. makropórusos akril gyanta) hordozón történ adszorpció; • ionos kölcsönhatás útján való megkötés; • funkciós csoport révén kovalens kötéssel rögzítés; • keresztkötés; • a – sok esetben alginát alapú sziloxán – mátrixba zárás; • hidrofil, szervetlen hordozóra kötés [Kirk 2002]. A

CAL-B

leggyakrabban

használt,

kereskedelmi

forgalomban

kapható

immobilizált preparátuma a Novozyme 435. Irodalmi adatok alapján a készítményben az enzim egy makropórusos, divinil-benzol keresztkötött polimer alapú metakril-észter gyantán van immobilizálva. Az enzimtartalom kb. 8,5 - 20 tömeg %, és a lipáz egy 50 – 100

m széles rétegben helyezkedik el a gyanta felületi régiójában [Chen 2008,

Nakaoki 2005]. A Novozyme 435 sikerét az is bizonyítja, hogy a ScienceDirect adatbázisa alapján 230 darab 2000 és 2011 között megjelent publikációban használták észterezési reakciók katalízisére. Ez, az ugyanebben az id szakban megjelent CAL-B enzimmel történ észterezést leíró publikációk (471 darab) majdnem 50 %-a, ami alátámasztja azt az Intézetünkben is tapasztalt tényt, hogy az immobilizált CAL-B kiváló választás észterezési reakciók katalízisére [Fráter 2007, Fehér 2009].

- 23 -

2.4 Enzimes reakciók nem-konvencionális közegei Az enzimek él szervezetekben végbemen kémiai reakciók katalizátorai, ami azt jelenti, hogy általában vizes oldatokban, semleges körüli pH-n, kis sótartalom mellett, enyhe h mérsékleten és atmoszférikus közeli nyomáson fejtik ki hatásukat [Magnusson 2005]. Minden ett l eltér

körülményt nem-konvencionálisnak nevezünk. A

szemléletesség kedvéért ez látható a 2-4. ábrán. 120 °C

1000 bar

Nyomás

H mérséklet

1 bar

0 °C

Víz

pH: 12

Konvencionális biokatalízis

Oldószer

pH

sc CO2

pH: 0 0%

Sótartalom

40 %

2-4. ábra: Biokatalízis konvencionális és nem-konvencionális körülményei. (A zöld terület jelöli a nem-konvencionális biokatalízist.)

Az 1980-as évek közepének fontos felismerése volt, hogy az enzimek nemcsak vizes oldatokban, hanem szerves oldószerekben is képesek kifejteni hatásukat [Gubicza 1990], így elkezd dtek a kutatások, melyekben az egyik reaktáns feleslegét (oldószermentes közeg), vagy valamilyen szerves oldószert használnak az enzimes reakció közegeként. Az utóbbi évtizedekben nagy figyelem fordult újabb, nemkonvencionális közegek keresésére figyelembe véve toxikológiai és környezetvédelmi szempontokat. A kutatások eredményeként az oldószerek több új csoportja bizonyította el nyös tulajdonságait. Ilyen oldószerek pl. az ionos folyadékok [van Rantwijk 2007] és a szuperkritikus fluidumok [Cantone 2007].

- 24 -

2.4.1

Szerves oldószer Szerves oldószerek használatának, a 2.3.1 fejezetben említett tényen kívül számos

egyéb el nyös hatása van a vizes közeggel szemben: Az egyik legfontosabb sajátosság az enzimek szerves oldószerben tapasztalt megnövekedett h stabilitása. A jelenség azzal magyarázható, hogy vizes közegben a fehérje részleges kitekeredése, az els dleges szerkezetben kialakuló módosulások, deamidáció, peptid hidrolízis vagy a cisztein elbomlása az enzim reverzibilis vagy irreverzibilis inaktivációját okozza. A fönt említett reakciók lejátszódása azonban vizet igényel, ezért nagyon lassúak nem-vizes környezetben. A víz hiánya nemkonvencionális oldószerekben tehát az enzim megnövekedett h stabilitását eredményezi [Krishna 2002]. A stabilitás növekedésére jó példa, hogy Turner és munkatársai 130°Con hajtottak végre CAL-B enzimmel katalizált átészterezési reakciót [Turner 2000]. Szintetikus reakciók, mint pl. észterezés esetén a víztartalom kontrollálása különösen fontos, mivel az enzimnek szüksége van nyomnyi mennyiség vízre az aktív konformációjának megtartásához [Zaks 1988]. A reakcióban keletkez

túl sok víz

viszont csökkenti az egyensúlyi hozamot és az enzim aktivitását, vagy hosszútávú stabilitását egyaránt [Krishna 2002]. Az enzimek – különösképpen a lipázok – katalitikus tulajdonságai, mint pl.: reakciósebesség,

szelektivitás

vagy

specifikusság

befolyásolható

az

oldószer

min ségének (dipólus momentum, vízoldhatóság, egyenes láncú vagy gy r s szerkezet, hidrogén-híd létrehozó képesség) variálásával, bár a hatások jóslása nagyon nehéz és általában még nem ad megbízható eredményt [Faber 1997]. A szerves oldószerek enzimek m ködésére gyakorolt hatásának összetettségét bizonyítja McCabe és társainak munkája,

akik

a CAL-B szerkezetét

vizsgálták

CD-vel

különböz

szerves

oldószerekben (toluol és hexán). Eredményeik alapján nincs jelent s változás az enzim másodlagos szerkezetében a fönti két szerves oldószer használata esetén a semleges pHjú, vizes közegben lév

állapothoz képest. Ebb l az következik, hogy az enzim

m ködésében – toluol vagy hexán oldószer hatására – tapasztalt eltéréseket nem az enzim másodlagos szerkezetében beállt változások okozzák [McCabe 2005]. A fentieken kívül a szerves oldószerek további el nyös tulajdonsága, hogy a szerves szubsztrátok jobban oldódnak bennük, mint vízben, és hogy csökken a mikrobiális elszennyez dés veszélye. Hátrányok között kell viszont megemlíteni, hogy kétfázisú rendszerekben felületi inaktiválódás léphet fel; a szerves oldószerek

- 25 -

gyúlékonyak, alacsony a forráspontjuk és denaturálhatják az enzimeket. A felsorolt negatív tulajdonságok többsége ionos folyadékok használatával kiküszöbölhet [Gubicza 2007]. 2.4.2

Ionos folyadék Az ionos folyadékok olyan tisztán ionos, sószer

anyagok, amik meglep en

alacsony h mérsékleten – általában szobah mérsékleten – folyadék halmazállapotúak. Néhányuk olvadáspontja akár 0°C alatti is lehet. A szokatlanul alacsony olvadáspont könnyen megérthet , ha összehasonlítjuk egy tipikus ionos folyadék, – pl.: 1-etil-3-metil-imidazólium-etilszulfát (olvadáspont kisebb, mint -20°C) – és egy szervetlen só – pl.: nátrium-klorid (olvadáspont: 801 °C) – szerkezetét (2-5. ábra). Míg a nátrium-klorid ionjai méretük miatt könnyen alkotnak szabályos

rácsszerkezet

kristályokat,

addig,

az

ionos

folyadékok

kevésbé

szimmetrikus, nagyobb méret , tehát kisebb töltéss r ség ionjaik miatt már alacsony h mérsékleten megolvadnak, vagy – néhány esetben, az alifás oldalláncok hatásának következtében – meglágyulnak [Enabling Technologies Ionic iquids http://www. sigmaaldrich.com, 2012. 04. 03.].

2-5. ábra: Egyszer sók (balra) és ionos folyadékok (jobbra) általános szerkezete [Enabling Technologies Ionic iquids, http://www. sigma-aldrich.com, 2012. 04. 03.].

Az ionos folyadékok mára már széles körben vizsgált, és sokrét en felhasznált vegyületekké váltak. Az Intézetben is évek óta vizsgálják alkalmazásuk lehet ségeit, és a témában számos Ph.D. dolgozat született [Fráter 2007, Fehér 2008, Cserjési 2011]. Ezért a további, általános tulajdonságokat a dolgozatban csak felsorolás formájában mutatom be, és csak egy kis ízelít t adok az ionos folyadékok lehetséges változtaiból (2-6. ábra) és a különböz felhasználási területekb l (2-7. ábra).

- 26 -

Az ionos folyadékok az

ket felépít

ionok alapján csoportosíthatók

legegyszer bben. A lehetséges szerkezetek nagy számát a kationok és anionok listája jól szemlélteti: Az ionos folyadékok kationja lehet szervetlen, mint pl. a lítium, de többnyire szerves ion, ami különböz mértékben lehet szulfonálva, és az alkilláncok hossza is széles tartományban változhat. Az ionos folyadékokat felépít anionok száma is jelent s, bár elmarad a kationok számossága mellett [Jain 2005]. A leggyakoribb ionokat a 2-6. ábrán soroltam föl.

2-6. ábra: Az ionos folyadékokat felépít leggyakoribb ionok [Jain 2005].

Az ionos folyadékok nagy szerkezeti változatossága magával hozza a felhasználhatóság sokrét ségét. Az eddigi sikeres alkalmazási területek közül szemléltet néhányat a 2-7. ábra.

- 27 -

Elválasztás - Gáz szeparáció [Yokozeki 2007] - Extraktív desztilláció [Álvarez 2009] - Extrakció [Marták 2007]

Elektrolízis - Üzemanyagcellák [Guo 2010] - Elemek [Rezaei 2009] - Bevonatok [Yagci 2011]

Segédanyag - Ken anyag [Wang, 2004] - Enantioszelektivitás növel ko-szolvens [Mohile 2010]

TULAJDONSÁGOK -H stabilitás -Kis g znyomás

-Elektromos vezet képesség -Különleges oldószer-tulajdonságok -Kétfázisú rendszer lehet sége -Nagy h kapacitás -Nem gyúlékonyak -Tervezhet ség

Szenzorok - CO2 szenzor [Oter 2006] - NO2 szenzor [Nádherná 2011]

Katalizátor - Hidrogénezés [Lou 2010] - Észterezés [Xu 2010]

Oldószerek - Bio-katalízis [Erbeldinger 2000] - Asszimmetrikus szintézis [Baudequin 2005] - Nanorészecskék el állítása [Zhu 2006] - Polimerizáció [Baudequin 2005]

Analítika - MALDI-TOF MS mátrix [Armstrong 2001] - GC g ztér analízishez oldószer [Andre 2005] - RP-HPLC [Wang 2009] - CE elektrolit [Yanes 2001] - NMR reagens [Baudequin 2005]

2-7. ábra: Ionos folyadékok f tulajdonságai és néhány felhasználási lehet ségük.

2.4.2.1 Foszfónium típusú (Cyphos®) ionos folyadékok Foszfónium kation (általános képlete: [PR3R’]+), és megfelel anion használatával az ionos folyadékok egy új csoportját kapjuk, melyek számos el nyös tulajdonsággal rendelkeznek az ammónium és imidazólium típusúakhoz képest. A legfontosabb tulajdonságok a következ k: • A foszfónium kation általánosan megtalálható él

szervezetekben, ezért

feltételezhet leg a foszfónium sók és az enzim fehérjék affinitása révén ezek az ionos folyadékok kedvez környezetet biztosítanak az enzimeknek [Abe 2008]. • Nagyobb a kémiai stabilitásuk, mivel a foszfónium kationoknak nincs savas protonja. Tehát ezek az ionos folyadékok lúgos körülmények között is stabilak,

- 28 -

ami számos imidazólium típusú ionos folyadék esetén nem mondható el [Martinis 2010]. • Foszfónium sók s r sége a 0,8 - 1,2 g/cm3 tartományba esik, de általában kisebb a vízénél, és a kation szénatomszámának növelésével, illetve az anion változtatásával a következ sorrend szerint [PF6]- > Br- > [BF4]- > Cl- könnyen csökkenthet [Bradaric 2003]. • A foszfónium kation töltéss r sége kisebb, mint a megfelel ammónium ioné, a

foszforatom

nitrogénatomnál

nagyobb

mérete

miatt.

Ennek

a

méretkülönbségnek a következtében a foszfónium típusú ionos folyadékok olvadáspontja kissé magasabb, mint az imidazólium megfelel iké [Asikkala 2008]. • Szobah mérsékleten mért viszkozitásuk sok esetben valamennyivel nagyobb, mint a hasonló szerkezet

ammónium típusú ionos folyadékoké [Martinis

2010], de találni példákat az ellenkez esetre is [Tsunashima 2007]. • H stabilitásuk nagyobb, mint a megfelel ammónium és imidazólium sóké. Ez nagyon fontos tényez , például, ha a reakcióterméket desztillációval kell eltávolítani, mert így elkerülhet

a termék ionos folyadékból származó

bomlástermékekkel való elszennyez dése [Bradaric 2003]. • Foszfónium típusú ionos folyadékokkal az imidazólium típusúaknál kisebb ionos folyadék veszteséggel lehet végrehajtani vizes / sósavas közegb l fémion extrakciót [Regel-Rosocka 2012]. Regel-Rosocka és munkatársainak tapasztalatai ellenére sok esetben mégsem zárhatjuk ki a termék ionos folyadék nyomokkal való elszennyez dését. Ennek a problémának a kezelésére dolgoztak ki membrános eljárást Han és munkatársai. A kísérletekhez egy keresztkapcsolási Suzuki reakció termékét (4-acetil-bifenilt), illetve gyakran használt szerves oldószereket (metanol, toluol, etil-acetát) használtak modellközegként, amib l a benne lév

ionos folyadék nyomokat dúsították, pl.

STARMEMTM 122 nanosz r membránnal [Han 2005]. Míg nagy figyelem fordult az imidazólium, ammónium és piridínium sók fizikaikémiai tulajdonságainak vizsgálatára, addig a foszfónium típusúakról még csak kevés adat található az irodalomban, annak ellenére, hogy a Cytech Industries nagy tapasztalattal rendelkezik az el állításukban, és több tonnát gyárt bel lük évente

- 29 -

[Bradaric 2003]. Ezért nagy jelent ség Del Sesto-nak és társainak munkája, melyben foszfónium típusú ionos folyadékokat állítottak el [P(C6)3C14]+ kation és számos (18 darab) különböz

anion felhasználásával, majd a termékeket több szempont szerint

jellemezték. Tapasztalataik alapján a [P(C6)3C14]+ kation egy kivétellel, minden általuk vizsgált anionnal ionos folyadékot eredményez. Az így nyert termékek molekulatömege 631-2228 g/mol közötti értékek. A kapott anyagok többsége szobah mérsékleten folyadék halmazállapotú, s r ségük 20 °C-on mérve 0,90 és 1,08 g/cm3 közötti érték, és a h mérséklet növelésével lineárisan csökkent. A legkisebb viszkozitása (20 °C-on mérve: 310 cP) a [Co(N(CN)2)4]2- anionnal alkotott ionos folyadéké volt, bár keletkeztek ennél egy nagyságrenddel viszkózusabb termékek is. Ugyan az el állított ionos folyadékok viszkozitása magasabb, mint az egyéb, általánosan használt ionos folyadékoké, de a kation méretének és szimmetriájának módosításával az értékük módosítható. Az ionos folyadékok mindegyike (kett kivételével) legalább 255 °C-ig stabil volt [Del Sesto 2005]. Azonos kutatási témában jelentettek meg publikációt Tsunashima, illetve Sun és munkatársai is. Kutatásuk alapján kiderül, hogy számos foszfónium típusú ionos folyadéknak kiváló elektrokémiai tulajdonsága van. Vezet képesség szempontjából a tiofoszfát és tiofoszfonát anionokat tartalmazók bizonyultak a legjobbnak, valószín leg azért, mivel ez a két anion gyenge bázisként viselkedik, így biztosítva a megfelel disszociáltságot [Tsunashima 2007, Sun 2008]. A foszfónium típusú ionos folyadékok h kapacitását vizsgálták Ferreira és társai kalorimetriás módszerrel. Azt találták, hogy mind a kation, mind az anion változtatása jelent s befolyásoló tényez . Például az [NTf2]- és [FAP]- anionokkal majdnem dupla nagyságú h kapacitást értek el, mint a [Cl]- ionnal, amit az anionok komplex kémiai szerkezetével magyaráztak. Másrészr l az [NTf2]- anion [P(C6)3C14]+ kationnal közel háromszor akkora h kapacitású anyagot eredményezett, mint [EMIM]+ kationnal [Ferreira 2012]. Goncalves és munkatársai különböz

folyadékok h tágulását és izoterm

kompresszibilitását vizsgálták. Méréseik alapján a foszfónium típusú ionos folyadékok h tágulási együtthatója a h mérséklet változására sokkal kevésbé változik, mint a hagyományos oldószereké, izoterm kompresszibilitási tényez jük pedig leginkább a vízéhez hasonlít (2-7. ábra) [Goncalves 2011].

- 30 -

2-8. ábra: Ionos folyadékok és általános oldószerek h tágulása (a) és izoterm kompresszibilitása (b) 0,1 MPa nyomáson. Ionos folyadékok: 1.) [(C6H13)3P(C14H29)] [Cl]; 2.) [(C6H13)3P(C14H29)] [DCA]; 3.) [(C6H13)3P(C14H29)] [Ac]; 4.) [(C6H13)3P(C14H29)] [NTf2] [Goncalves 2011].

Minden ionos folyadék közeg reakció / vegyipari m velet esetén fontos ismerni a használt ionos folyadéknak a többi oldószerrel szemben mutatott folyadék-folyadék fázis viselkedését. Míg ezek az adatok hagyományos oldószerekre már jól ismertek, ionos folyadékok esetén még feltárásra szorulnak. Chowdhury és munkatársai Cyphos 104 és 105 ionos folyadék vízzel és etanollal alkotott terner elegyének fázisdiagramját határozták meg (2-8. ábra) [Chowdhury 2008].

Víz (tömeg%)

Víz (tömeg%)

EtOH (tömeg%)

®

EtOH (tömeg%)

®

Cyphos 104 (tömeg%)

Cyphos 105 (tömeg%)

2-9. ábra: Cyphos 104 és 105 ionos folyadékok vízzel és etanollal alkotott terner elegyének fázisdiagramja [Chowdhury 2008].

- 31 -

A fázisdiagramokról leolvasható, hogy jelent s különbség van a két ionos folyadék fázis viselkedése között, de mindkét esetben az etanol és a víz arányának változtatásával a fázisok száma könnyen befolyásolható. 2.4.2.1.1 Felhasználás Foszfónium típusú ionos folyadékok el nyös tulajdonságai és fizikai-kémiai sajátságai több felhasználási területen kiaknázhatók. McNulty és társai arról számolnak be, hogy Cyphos 109 közegben számos karbonsav alkilezése hajtható végre 74 %-nál nagyobb hozammal, a termék desztillációval való eltávolítása és az ionos folyadék újra felhasználása mellett [McNulty 2005]. Ezen kívül foszfónium típusú ionos folyadékok használhatók korrózióvédelemre [Sun 2008], aminok gázkromatográfiás meghatározásának javítására [Krzy aniak 2011], elemekben elektrolitként [Tsunashima 2007]. Nagy felhasználási terület a fémek kinyerése. Számos publikáció igazolja, hogy a nehézfémek szilárd hulladékokból történ

feltárását követ

extrakciós lépés

extrahálószere lehet foszfónium típusú ionos folyadék [Guibal 2010]. A legújabb kutatásokban alginát és zselatin polimeren immobilizálva használják az ionos folyadékokat pl. Pt(IV) [Vincent 2008a], Pd(II) [Vincent 2008b és Cieszynska 2010], Au (III) [Campos 2008b ], Bi(III) [Campos 2008a], As(III), As(V), illetve szerves arzén [Monasterio 2010], Hg(II) [Guibal 2008] és Fe (III) kinyerésére [Regel-Rosocka 2011]. A kinyerés mechanizmusa bonyolultabb, mint hagyományos szerves oldószerek esetén, és nem teljesen tisztázott, de az ionos folyadékok egyedi oldóképességével és ioncserél tulajdonságaival áll kapcsolatban [Regel-Rosocka 2011]. A szorpciós izotermát az ionos folyadék anionja (klorid, diciánamid, tetrafluoro-borát) nem befolyásolja [Guibal 2010]. Az eddig felsorolt sikeres alkalmazásokkal szemben – ritkaságnak számító – negatív eredményr l számolnak be Letcher és társai. 2008-ban megjelent közleményük alapján, a Cyphos 104 ionos folyadékot megpróbálták aromás és alifás szénhidrogének elválasztására használni, de számos szénhidrogén aktivitási koefficiensének kimérése után arra a következtetésre jutottak, hogy ez az ionos folyadék erre a feladatra nem alkalmas [Letcher 2008]. A fémek kinyerésén kívül vizsgálták szerves savak, mint például a penicillin G enzimes hidrolíziséb l származó 6-amino penicilánsav [Jiang 2008], illetve tejsav fermentléb l való [Marták 2007, Marták 2008] kinyerhet ségét is. Marták és munkatársai

folyadék/folyadék

extrakcióval,

- 32 -

illetve

támasztóréteges

folyadék

membránnal hajtották végre a kinyerést. Ugyancsak támasztóréteges ionos folyadék membránt használtak Matsumoto és munkatársai [Matsumoto 2011]. A kinyerésekhez a Cyphos 104, illetve 102 ionos folyadékok voltak a legmegfelel bbek. Több publikáció is beszámol róla, hogy foszfónium típusú ionos folyadékok megfelel

közegei enzimes észterezéseknek. Abe és munkatársai lipáz katalizált

átészterezést hajtottak végre [MEBu3P][NTf2] ionos folyadékban növelve a reakció sebességét és a lipáz újrafelhasználhatóságát hagyományos szerves oldószer (pl.: diizopropil-éter) közegekhez képest [Abe 2008]. Findrik és munkatársai tejsav, szakaszos bioreaktorban történ

enzimes észterezését vizsgálták Cyphos 104 ionos

folyadékot használva reakcióközegként. Megállapították, hogy a víztartalom nem befolyásolja az enantiomer felesleget, de – a reakcióh mérséklet mellett – nagy hatással van a tejsav konverzióra [Findrik 2012a]. A fenti felhasználási lehet ségekb l kit nik a foszfónium típusú ionos folyadékok egyik legjelent sebb tulajdonsága, hogy a szerves savak kinyerését és észterezését akár közegváltás nélkül is meg lehet valósítani, majd végül desztillációval a terméket eltávolítani, és az ionos folyadékot újra felhasználni. Ezzel számos tisztítási, elválasztási lépés fölöslegessé válik, csökkentve ezzel az el állítás költségeit.

2.5 Mikrohullámú sugárzás 2.5.1

Mikrohullámú sugárzás definíciója A mikrohullámú sugárzás az elektromágneses spektrum kb. 0,3 – 300 GHz

frekvencia tartományba (kb. 1 mm - 1 m hullámhossz tartományba) es része (2-10 ábra). A mikrohullámú régió tehát az infravörös és a rádióhullámok tartománya között található [Asikkala 2008].

2-10. ábra: A mikrohullámú sugárzás helye az elektromágneses spektrumban.

- 33 -

A különböz

felhasználási területek elkülönítése céljából a mikrohullámú

sugárzás spektrumát két f régióra osztották. Az 1-25 cm-es hullámhossz tartományt f leg radarok, a fennmaradó részt pedig a telekommunikáció használja. Minden háztartási mikrohullámú készülék és a legtöbb, kereskedelmi forgalomban kapható, kémiai szintéziseknél használt mikrohullámú reaktor 2,45 GHz frekvencián, azaz 12,25 cm hullámhosszon m ködik, hogy elkerüljék a telekommunikációs eszközökkel és mobil telefonokkal való interferenciát [Kappe 2007, Nüchter 2004]. 2.5.2

Mikrohullámú h közlés alapelvei A mikrohullámú sugárzással történ h közlés az anyagok (oldószerek, reagensek

stb.) azon tulajdonságán alapszik, hogy képesek elnyelni és h vé alakítani a mikrohullámú energiát. Általában az elektromágneses mez elektromos komponense felel s a hullám-anyag kölcsönhatásokért. A h fejl dés két mechanizmus révén mehet végbe: ionvezetés, illetve dipólus polarizáció. Az ionvezetés lényege, hogy a reakcióelegyben lév töltött részecskék (általában ionok) a mikrohullámú tér hatására el re, hátra oszcillálnak, és összeütköznek a szomszédos molekulákkal. Ezek az ütközések feszültséget és mozgást idéznek el , ami h t generál. Az ilyen, ionos vezetés következtében keletkez hatásokkal számolnunk kell, ha pl. ionos folyadékokat használunk mikrohullámú mez ben. Az ionvezetéses mechanizmus h mérsékletnövel hatása nagyobb, mint a dipólus polarizációé [Kappe 2007]. Ahhoz, hogy egy anyag mikrohullámú besugárzás hatására dipólus polarizáció révén képes legyen h t generálni, dipólus momentummal kell rendelkeznie. Ha az ilyen anyagot mikrohullámú frekvencia éri, a vegyület dipólusai igyekeznek követni az elektromos mez váltakozását. Abban az esetben, ha a dipólusnak nincs elég ideje, hogy igazodjon az elektromágneses térhez (nagy frekvenciájú sugárzás esetén), vagy túl gyorsan képes követni azt (kis frekvenciájú sugárzás esetén) nem történik h felszabadulás. A h mérséklet csak abban az esetben fog emelkedni, ha a dipólus molekulának elég ideje van az alkalmazkodáshoz, de ahhoz nem, hogy pontosan kövesse a váltakozó mez

irányát. Ekkor a kialakuló fáziskülönbség molekuláris

súrlódás és ütközés révén dipólus energiavesztést okoz, és ez eredményezi a h felszabadulást. A kereskedelmi forgalomban kapható mikrohullámú készülékek számára kijelölt 2,45 GHz frekvencia éppen a két fönt említett széls érték között helyezkedik el [Mingos 1991, Gabriel 1998]. - 34 -

Egy adott anyag azon tulajdonsága, hogy az elektromágneses energiát milyen mértékben tudja h vé alakítani, nagyban függ az adott anyag dielektromos tulajdonságaitól, és a dielektromos veszteségi tényez vel (tg ) jellemezhet . tgδ =

ε '' ε'

Ahol: ’’: dielektromos veszteség,

azt a hatékonyságot jellemzi, amivel az

elektromágneses sugárzás h vé alakul. ’: dielektromos állandó, a molekulák azon tulajdonságát írja le, hogy az elektromos mez mennyire képes ket polarizálni. Általánosságban az anyagokat a mikrohullámú sugárzással való kölcsönhatásuk alapján három csoportba sorolhatjuk • Az oldószerek többsége a mikrohullámokat elnyel

(abszorbeáló) anyagok

közé tartoznak. Ezen belül a veszteségi tényez

alapján 3 alcsoportot

különböztethetünk meg: magas (tg > 0,5), közepes (0,5 > tg > 0,1) és alacsony (tg < 0,1) abszorbeáló képesség ek. • Az elnyel anyagokon kívül léteznek a mikrohullámok számára gyakorlatilag átereszt

(transzparens)

anyagok,

amiknek

nincs

permanens

dipólus

momentumuk. Szerves oldószerek közül ide tartozik, pl. a szén-tetraklorid, a benzol, vagy a dioxán, de ebbe a csoportba sorolható több szerkezeti anyag is, mint pl. a porcelán, kvarc, üveg, boroszilikát, teflon. • A harmadik csoport a mikrohullámú sugárzást visszaver k, mint pl. a fémek vagy a grafit. A reakcióedénynek tehát mindenképpen transzparens anyagot kell használni. Reakcióközegként általában nagy veszteségi tényez j

(jól elnyel ) oldószerek

szükségesek a hatékony sugárzásabszorpcióhoz, tehát a gyors f téshez, de használhatók átereszt

tulajdonságú oldószerek is, hiszen valamelyik reaktáns vagy a katalizátor

valószín leg poláros anyag, így az egész reakcióelegyre vonatkozó dielektromos tulajdonságok már megfelel ek lesznek mikrohullámú f tés használatához. Meg kell jegyezni továbbá, hogy a veszteségi tényez nem csak az anyagi min ségt l, de a frekvenciától és a h mérséklett l is függ [Hayes 2002, Dávid 2006]. Néhány általánosan használt oldószer veszteségi tényez jét tartalmazza a 2-7. táblázat.

- 35 -

2-7. táblázat: Különböz oldószerek veszteségi tényez je (2,45 GHz, 20°C) [Kappe 2007].

Oldószer

2.5.3

tg

Oldószer

tg

Etilénglikol

1,350

N,N-Dimetil formamid

0,161

Etanol

0,941

1,2-Diklór-etán

0,127

Dimetil-szulfoxid

0,825

Víz

0,123

2-Propanol

0,799

Klórbenzol

0,101

Hangyasav

0,722

Kloroform

0,091

Metanol

0,659

Acetonitril

0,062

Nitrobenzol

0,589

Etil-acetát

0,059

1-Butanol

0,571

Aceton

0,054

2-Butanol

0,447

Tetrahidrofurán

0,047

1,2-Diklórbenzol

0,280

Diklórmetán

0,042

1-Metil-2-pirrolidon

0,275

Toluol

0,040

Ecetsav

0,174

Hexán

0,020

Mikrohullámú f tés és a konvencionális f tés összehasonlítása Tradícionálisan a szerves szintéziseket küls

h forrásból (pl. olajfürd ,

f t köpeny) származó, konduktív f téssel játszatják le. Ez egy lassú és kis hatékonyságú módja az energiaközlésnek, mivel konvektív áramlástól és az anyag h átadó képességét l függ. További hátránya még, hogy a reakcióedény h mérséklete magasabb, mit a reakcióelegyé, ezért – megfelel

intenzitású kevertetés nélkül –

jelent s h mérsékletgradiens jön létre az elegyben, és a helyi túlmelegedések a szubsztrátok, a reagensek vagy a termékek bomlásához vezethetnek. Ezzel ellentétben a mikrohullámú sugárzás hatékony és egyenletes, „bels ” h közlést eredményez azáltal, hogy a mikrohullámú energia közvetlenül a reakcióelegyben lév oldószer, reagens vagy katalizátor molekuláival reagál. Mivel a használt reakcióedények (közel) teljesen mikrohullám átereszt k, ezért a sugárzás áthalad az edény falán és a konvencionális f téshez képest fordított irányú h mérsékletgradienst hoz létre az edény és a reakcióelegy között. Ha a mikrohullámú készülék reakciótere jól van megtervezve, a h mérséklet mindenhol azonosnak tekinthet

az egész reakcióelegyben [Kappe 2007]. A mikrohullámú h közléssel

létrejöv egyenletes h mérsékletprofilnak azonban van egy hátrányos következménye is, hogy a forrás gyakorisága csökken, és a minta lokálisan könnyen túlhevül. Ezért a - 36 -

megfelel

intenzitású keverés mikrohullámú h közlés esetén még fontosabb, mint

konvencionális f tésnél [Dávid 2006].

2.5.4

A mikrohullámú h közlés használata A mikrohullámú technológia fejl dése a radar feltalálásával kezd dött. A kezdeti

kísérletek során véletlenül fedezték föl a mikrohullámú sugárzás f t tulajdonságát, de ezt követ en hamar felismerték az ebben rejl potenciális felhasználási lehet ségeket és az 1950-es években elkészültek az els általános mikrohullámú süt k [Spencer 1952]. Ezzel egyid ben a mikrohullám ipari alkalmazásának lehet ségeit is elkezdték kutatni, és 1986-ban publikálták az els mikrohullámú h közléssel végrehajtott szerves kémiai reakciókat [Gedye 1986, Giguere 1986]. Beletelt némi id be, amíg a mikohullámú h közlést széles körben elfogadták szerves szintézisek energiaforrásaként, de a népszer sége azóta egyre növekszik. Ezt támasztja alá a 2-11. és 2-12. ábra.

2-11. ábra: A „microwave synthesis not plasma not discharge not spectroscopy” kulcsszavak alapján megtalált publikációk száma évenként ábrázolva. (jelmagyarázat *: Csak két szerves szintézisr l szóló publikációt tartalmaz. **: 483 gyógyhatású növény extrakciójáról szóló kínai szabadalmat tartalmaz. ***: 2003 decemberéig megjelent publikációk.) [Nüchter 2004]

2-12. ábra: A mikrohullámmal el segített szerves szintézisek témában 1986 és 2007 között megjelent publikációk. Szürke oszlopok: 7 szintetikus szerves kémiai folyóiratban – J. Org. Chem., Org. Lett., Tetrahedron, Tetrahedron Lett., Synth. Commun., Synthesis, Synlett – a témában megjelent publikációk (SciFinder keres ben a „microwave” kulcsszóra kapott találatok száma). Fekete oszlopok: dedikált mikrohullámú reaktorokban végrehajtott reakciók száma. (kb. 50 folyóiratban keresve a „microwave” kulcsszó alapján. A publikációk közül csak a szerves kémiai szintézisekkel foglalkozók.) [Kappe 2009]

- 37 -

A kezdeti lassú elterjedés oka, hogy el ször a szerves reakciókat még háztartási mikrohullámú süt kben játszatták le. Ezek a készülékek általában a magnetron ki-be kapcsolgatásával szabályozzák a besugárzás erejét, ami inhomogén mez t generál, és az eredmények rossz reprodukálhatóságát eredményezte. A háztartási készülékek másik hátránya, hogy nem lehetséges bennük a h mérséklet megbízható mérése sem. Ezzel ellentétben, a napjainkban forgalomban lév

szintetikus reakcióknak dedikált

mikrohullámú reaktorok beépített mágneses kever t és h t rendszert, száloptikás infravörös szenzoros direkt h mérséklet mér t és olyan szoftvert tartalmaznak, ami lehet vé teszi a kibocsátott mikrohullám energiájának változtatása révén az on-line h mérséklet/nyomás szabályozást [Kappe 2007]. A készülékek mono- és multiüzem ek lehetnek, azaz a mikrohullámú térben csak egy, vagy akár több reaktor is elhelyezkedhet [Keglevich 2008]. A méretnövelés az egyik sarkalatos kérdés a mikrohullámú technológiák esetén, mivel limitáló tényez , hogy a sugárzás milyen mélyre képes behatolni a reakcióelegybe. Ha poláros, abszorbeálni képes oldószer a reakcióközeg, a mikrohullámú sugárzás energiája minden kb. 2,5 cm után felez dik. Ez a sajátosság határt szab a reaktor átmér jének. A megoldásra több módszer is létezik. A behatolás mélysége függ a használt hullámhossztól, ezért kisebb hullámhosszú sugárzás mélyebbre képes hatolni, bár kisebb az energiája. Másik megoldás a folyamatos technológiák, átfolyó kivitel

(flow through) reaktorok használata [Kappe 2007,

Keglevich 2008].

2.5.5

Mikrohullámú sugárzás kémiai reakciókra gyakorolt hatásai A mikrohullámú sugárzás szerveskémiai reakciókra gyakorolt hatásmechanizmusa

nem teljesen ismert, ezért az eredmények értékelése sokszor vita tárgyát képezi. A néhány tény közül, amit biztosan állíthatunk, az egyik legfontosabb, hogy ha kiszámoljuk a 2,45 GHz frekvenciájú mikrohullámú foton energiáját és összehasonlítjuk a szerves vegyületekben található tipikus kémiai kötések (C-C, C-O, C-H) energiájával, azt az eredményt kapjuk, hogy a mikrohullámú sugárzás energiája nem elegend a fenti kötések elszakításához (2-8. táblázat). Ez azt jelenti, hogy ellentétben az ultraibolya vagy láthatófény sugárzással (fotokémiai reakciók), a mikrohullámú sugárzás nem tud kémiai reakciót el idézni azáltal, hogy a vegyületek elnyelik az elektromágneses energiát [Nüchter 2004, Kappe 2007].

- 38 -

2-8. táblázat: A leggyakoribb kémiai kötések és a különböz frekvenciájú mikrohullámú sugárzások energiája [Nüchter 2004].

Energia (eV)*

Energia (kJ/mol)

C – C kötés

3,61

347

C = C kötés

6,35

613

C – O kötés

3,74

361

C = O kötés

7,71

744

C – H kötés

4,28

413

O – H kötés

4,80

463

0,04 - 0,44

4 - 42

Mikrohullám: 0,3 GHz

1,2x10-6

1,1x10-4

Mikrohullám: 2,45 GHz

1,0x10-5

9,6x10-4

Mikrohullám: 30 GHz

1,2x10-3

0,11

Hidrogén-híd kötés

*: 1 eV = 1,602177 x10-19 J

A mikrohullámú sugárzás hatásait két csoportba szokás sorolni az alapján, hogy mi okozza a jelenséget: • A h hatások a vizes vagy szerves közeg által elnyelt mikrohullámú energia miatt keletkez

h vel állnak összefüggésben. A konvencionális h közlés

mellett tapasztaltaktól eltér

jelenségek egy része magyarázható ezzel, ha

figyelembe vesszük a következ három, a mikrohullámú h közlésre jellemz faktort:

o A reakcióelegy túlf tésének lehet sége, ami nagy mennyiség

ionos

anyag jelenlétében következhet be. Ennek el fordulása a háztartási mikrohullámú

süt k

használatakor

jellemz ,

mivel

ezekben

a

készülékekben a pontos h mérsékletmérés nem megoldott.

o A konvencionális h közlésnél sokkal gyorsabb f t

hatás, ami azt

eredményezi, hogy a kémiai reakcióhoz szükséges h mérséklet eléréséhez rövidebb id szükséges.

o A fázishatárokon keresztül történ diffúziós folyamatok felgyorsulása. • Nem-h

hatásoknak nevezünk minden olyan jelenséget, amit a reaktorban

kialakult h mérséklettel nem lehet megmagyarázni. Kutatók azt feltételezik, hogy a következ faktorok lehetnek felel sek nem-h hatásokért. - 39 -

o Forró pontok kialakulása a mikrohullám és az anyag kölcsönhatásának eredményeként.

o A reagensek transzportjának felgyorsulása a reakcióelegyben. Ez a jelenség leginkább oldószermentes közeg reakcióknál valószín .

o A h mérsékletemelés sebességének megnövekedése miatt a reakció szelektivitásának megváltozása. Erre egy példa, hogy a naftalinnak kénsav jelenlétében történ

szulfonálásakor a h mérsékletnövekedés

sebessége befolyásolta a termékként keletkez 1- ill. 2-naftalinszulfonsav izomerek arányát. Bogdal és munkatársai a jelenséget azzal magyarázták, hogy a h mérsékletnövekedés sebességének változtatásával lehet ség volt befolyásolni, hogy kinetikai vagy termodinamikai kontrollal menjen végbe a reakció. Megfigyelték továbbá, hogy a keletkez

izomerek

aránya nem függött a h közlés módjától (tehát hogy mikrohullámú vagy konvencionális h közlést használta-e), csak a h mérsékletemelkedés sebességét l.

o A reaktánsok alapállapotában tapasztalható dipólus momentumához képest

eltér

dipólus

momentum

kialakulása

és/vagy

annak

megnövekedése az átmeneti állapotban [Porcelli 1997, Bogdal 2005]. A kialakult elméletek ellenére napjainkban nagyon keveset tudunk a molekuláris mechanizmusokról, amik kialakítják ezeket a vélt nem-h különböz

hatásokat. Számos,

kutatási területr l származó publikáció számol be h mérséklettel nem

összefügg hatásról. Ilyen pl. a membránszerkezet és funkció módosulások [Phelan 1994], liposzómák és izolált sejtek permeabilitásának megváltozása [Saalman 1991], vagy a poli-amiksav (poli-imid típusú m anyagok gyártásának köztiterméke) szintézis reakciósebességének növekedése [Mendoza Tellez 2011]. Másrészr l viszont néhány szerz

megkérd jelezi a h höz nem kapcsolódó hatások létezését [Bergqvist 1994,

Marani 1993]. Különösen az enzimes rendszerek területén tapasztalt eredmények nagyon vitatottak. Whittaker és munkatársa [Whittaker 1995] úgy gondolja, hogy a mikrohullámmal el segített reakciók sebessége sok esetben olyan nagy, hogy nem lehet kizárólag a nagy hatékonyságú h közléssel magyarázni. Másrészr l Kappe [Kappe 2002] azt írja, hogy a nem-h hatások, tulajdonképpen a reakcióelegy forráspontja fölé történ

f téssel magyarázhatók. A legnagyobb problémát a kérdés eldöntésében az - 40 -

okozza, hogy nehéz az egyes kísérletek során tapasztalt jelenségeket h és nem-h hatásra szétválasztani. A pontos mechanizmus ismeretének hiánya azonban nem hátráltatja a mikrohullámú h közlés egyre gyorsuló ütem elterjedését [Roy 2003].

2.5.5.1 Mikrohullám hatása észterezési reakcióra Már a mikrohullám használatának korai szakaszától kezdve vizsgálnak észterezési reakciókat [Loupy 2006] különböz eredménnyel. Egyes publikációk arról számolnak be, hogy nem tapasztaltak különbséget a mikrohullámú és a hagyományos h közléssel lejátszatott reakció között [Toukoniitty 2005], de nagyszámú példa van az ellenkez jére is (lásd kés bb). Az ionos folyadékok és a mikrohullámú h közlés kombinálása észterezési reakciók lejátszatására elég ritka, annak ellenére, hogy számos publikáció megjelent mikrohullámú h közléssel el segített vagy ionos folyadékban lejátszatott észterezési reakciókról. A cikkek, amik mikrohullámú h közléssel el segített észterezésr l szólnak ionos folyadék vagy savkatalizátor használatával [Toukoniitty 2005, Zhu 2003, Arfan 2005], arról számolnak be, hogy a reakciósebesség nagyobb, mint konvencionális h közlés mellett. Az ionos folyadék sok esetben nem csak a katalizátor szerepét tölti be, de az oldószerét is, illetve a termék kinyerését is segíti [Asikkala 2008].

2.5.5.2 Mikrohullám hatása az enzimekre és enzimes reakciókra Ahogy az már az el z ekben olvasható volt, a mikrohullámú sugárzás enzimekre gyakorolt hatása vegyes képet mutat. Nem tapasztaltak mérhet nem-h hatást számos izolált enzim katalitikus aktivitásában, ezzel ellentétben viszont más enzim rendszerek, úgy t nik, reagálnak a sugárzásra [Roy 2003]. Porcelli és munkatársai megpróbáltak különbséget tenni a mikrohullámú sugárzás vizes pufferekben lév

S-adenozil-homocisztein hidroláz és 5' -metil-tioadenozin

foszforiláz enzimekre gyakorolt h és nem-h hatásai között. Vizsgálataik alapján a 10,4 GHz frekvenciájú mikrohullámú besugárzás mindkét enzim irreverzibilis, id t l és h mérséklett l független inaktivációját okozta. Mivel az enzimek stabilitása a kísérletek h mérsékletén (70-90°C) megfelel volt konvencionális h közlés mellett, a tapasztalt jelenséget a mikrohullámú sugárzás nem-h mérséklettel összefügg

hatásaként

értékelték. Fluoreszcens spektroszkópiával és cirkuláris dikroizmus készülékkel vizsgálva az enzimeket konformációs változásokat tapasztaltak, amib l arra következtettek, hogy a mikrohullámú sugárzás szerkezeti átrendez dést indukál, így magyarázható a tapasztalt hatás [Porcelli 1997]. - 41 -

Szerves oldószerekben a lipázok már konvencionális h közlés mellett is nagyon stabilnak mutatkoztak, ezért nem meglep , hogy mikrohullámú h közlés mellett is ezzel az enzimtípussal kísérleteznek a leggyakrabban [Roy 2003]. Carrillo-Munoz és munkatársai hajtottak végre lipáz katalizált reakciókat mikrohullámú h közlés mellett, szerves oldószerekben, immobilizált enzimek segítségével. A kísérleteikben az immobilizálás hatását is vizsgálták. A tesztelt 4 hordozó közül (FlorisilTM, Celite, HyfloSuper CelTM és AccurelTM) a FlorisilTM elnyelte a mikrohullámú energiát, ezért nem volt megfelel . Az els fontos következtetés tehát, hogy immobilizált enzim esetén a hordozó anyaga is fontos tényez . Kísérleteik alapján az immobilizált enzimet többször lehetett újra felhasználni, a kezdeti reakciósebesség és az enantiomerarány jelent sen magasabb volt mikrohullámú h közlés mellett, mint konvencionális h közlés használatakor [Carrillo-Munoz 1996]. Ezzel egy id ben Parker és munkatársai egy másik átészterezést vizsgáltak, az etil-butirát reakcióját butanollal butil-butiráttá. A katalizátor egy kutinra specifikus lipáz volt. Az eredmények alapján a reakciósebesség 2-3-szorosa volt a konvencionális h közléskor tapasztaltaknak, és függött a reakcióelegy vízaktivitásától. Ezen kívül a szerz k megállapították, hogy a mikrohullámú sugárzás nem okoz maradandó változást az enzim aktivitásában, mivel ha a mikrohullámú reakcióban megnövekedett aktivitást mutató enzimet normál h közlés mellett használták újra, már nem volt tapasztalható a nagyobb reakciósebesség [Parker 1996]. Ahogy a nem enzimes észterezések esetén, a szerves oldószer közeg enzimkatalizált reakcióknál is a mikrohullámú h közlés egyik leggyakrabban megfigyelt következménye a 2-5-szörösére megnövekedett reakciósebesség, ami az enzim hidratáltságától is függ. Ezt több h mérsékleten (25°C, 40°C, 60°C), 6 különböz szerves oldószer használatával (n-oktanol, toluol, t-amil-alkohol, tetrahidrofurán, acetonitril, dioxán), szubsztilizin által katalizált átészterezési és

-kimotripszin által

katalizált észterezési modellreakción vizsgálta Roy és munkatársa [Roy 2003]. Hasonló következtetésre jutottak Candida antarctica lipáz B enzim használatakor is pl. Bachu és munkatársai másodrend alkoholok rezolválását vizsgálva [Bachu 2007]. Zhao és munkatársai az etil-butirát 1-butanollal történ átészterezésén vizsgálták az immobilizált Candida antarctica lipáz B enzim aktivitását 21 különböz (imidazólium és piridínium) típusú ionos folyadékban és 5 szerves oldószerben. A kísérletek során, mikrohullámú sugárzás mellett megnövekedett enzimaktivitás volt megfigyelhet , ha az enzim hidratáltsága megfelel volt, de ez az el ny elveszett, ha a - 42 -

reakcióelegyet (vagy az enzimet) kiszárították. A mikrohullám hatásának jobb megértése érdekében a kapott enzimaktivitás értékeket összehasonlították az ionos folyadékok viszkozitás, polaritás, hidrofobicitás (logP) adataival, és azt találták, hogy a kezdeti reakciósebesség nem hozható közvetlen kapcsolatba a viszkozitással és a polaritással, és csak kismérték korreláció figyelhet meg a logP értékkel [Zhao 2009b]. Az irodalmi adatokat vizsgálva megállapítható, hogy a mai napig nagyon kevés [Zhao 2009b, Yu 2012] publikáció született mikrohullámú sugárzás ionos folyadék közegben végbemen

enzimes észterezésre gyakorolt hatásának vizsgálatáról. A

kísérleti munka elvégzésének idején (2006 és 2009 között) pedig még nem volt a témában

publikált

közlemény,

tehát

kijelenthetjük,

hogy

a

tejsav

enzimes

észterezésének vizsgálata ionos folyadék közegben mikrohullámú h közlés mellet nagy újdonság érték kutatási terület.

2.6 Víztartalom szabályozás, pervaporáció A pervaporáció egy olyan membránm velet, ami folyékony elegyek, víztartalmú szerves oldószerelegyek, jellemz en azeotrópos elegyek [Smitha, 2004] szétválasztására szolgál.

Néhány évtizeddel

ezel tt

a

pervaporációt

tekintették

a legkisebb

energiafelhasználású, leghatékonyabb módszernek azeotróp elegyek megtörésére [Huang 2008], így napjainkig több mint 100 üzem használ pervaporációt alkohol víztelenítésére világszerte [Dong 2006]. A pervaporáció folyamata lényegében három lépésb l áll: szelektív szorpció a membrán primer oldalán, szelektív diffúzió a membránon keresztül és deszorpció a g zfázisba a permeátum oldalon [Bélafiné 2002]. A membránon át történ anyagtranszport hajtóereje a transzportált komponensnek a membrán betáplálási és permeátum

oldala

közötti

parciális

nyomásának

különbsége.

A

folyamat

lejátszódásához – a permeátum elpárologtatásához – szükséges h energiát a modul el tt kell közölni a folyadékárammal [Fonyó 1998]. A folyamat hajtóerejének növelésére, permeátum oldalon a kinyerni kívánt komponens parciális nyomásának csökkentésére két f

eljárás létezik: inert gáz – általában nitrogén – áramoltatása (viv gázos

pervaporáció), illetve vákuumm használata (vákuum pervaporáció) [Börjesson, 1996]. Pervaporáció használata számos el nnyel jár. Energiatakarékos m velet, kb. ötszörös energiamegtakarítást jelent a hagyományos azeotróp desztillációval szemben. Környezetbarát, mivel nem igényli idegen szerves vegyület, mint segédanyag - 43 -

használatát, és nem termel hulladékot [Fonyó 1998]. Használatával nemcsak a reakció konverziója növelhet , de a mellékreakciók száma is csökkenthet . Exoterm reakciók esetén a reakcióh

felhasználható a szeparációhoz [Assabumrungrat 2003]. A

pervaporáció folyamatossá tehet , könny illeszteni, kombinálni más m veletekkel, enyhe körülményeket igényel, egyszer a méretnövelése [Gorri 2006]. A számos el ny mellett viszont néhány hátránnyal is számolni kell: A membránok eltöm dhetnek, koncentráció-polarizáció léphet fel. Ennek oka, hogy membrános m veletek esetén az elválasztandó elegy a membrán felületével párhuzamosan áramlik. A visszatartott molekulák a membrán el tti áramlási határrétegben fokozatosan koncentrálódnak, és egy ún. polarizációs réteget alakítanak ki, ami növelik a hajtóer vel szembeni ellenállást. Többek között az el z ek miatt rövid a membránok élettartama. El fordulhat kicsi szelektivitás vagy fluxus, és a méretnövelési faktor közel lineáris [Bélafiné Bakó 2002, Takács 2010].

2.6.1

Membrános m veletek alapegyenletei

A membrános m veletek jellemzésére többféle mér számot használhatunk. Ezek közül a legfontosabbak a következ k: A szelektivitási vagy szeparációs faktor (α) kétkomponens (A és B) betáplált elegy esetén:

α A/ B =

yA / yB , x A / xB

ahol: xA és xB: az A ás B komponensek koncentrációja a betáplálásnál yA és yB: az A és B komponensek koncentrációja a permeátumban A fluxus (J): Pervaporáció esetén az a permeátum mennyiség, amely egységnyi id alatt a membrán egységnyi felületén átjut. Mértékegysége lehet kg/m2h, mol/ m2h stb. J = − AdX / dx , ahol: A: az adott jelenségt l függ állandó, dX/dx: a hajtóer [Bélafiné Bakó 2002].

- 44 -

2.6.2

Pervaporációs membránok A membrán anyaga lehet hidrofób vagy hidrofil. Általánosságban elmondható,

hogy a legtöbb membrán hidrofíl (vízre permszelektív), mivel a víz kisméret molekula (2-13. ábra), és így viszonylag könnyen elválasztható egyéb, nagyobb méret komponensekt l. A hidrofób membránok közül – részben az el bbi indok alapján – a leggyakoribbak az etanolt átereszt k. A membrán anyaga lehet szervetlen, polimer vagy kompozit [Huang 2008].

10 n-hexán

kinetikus átmér (Å)...

8 6 4

etanol metanol

IPA

THF

o-, m-xilol

piridin ciklohexán p-xilol benzol

víz

2 0 -1

1

3

5

7

9

szénatomszám 2-13. ábra: Különböz oldószerek kinetikus átmér je [Shao 2007].

2.6.2.1 Hidrofil membránok A kémiai reakció-mérnökség területén használható szervetlen pervaporációs membránok napjainkban váltak kereskedelmi forgalomban elérhet vé, majd ezt követ en rövid id n belül közkedveltté, nagyszer

h mérséklet stabilitásuk és

mechanikai állóképességük miatt [Huang 2008]. A stabilitásukra egy példa, hogy csöves zeolit és szilika membránok 300°C fölött és 100 bar-t meghaladó nyomáson is még mindig használhatók [Kondo 1997]. Széles választék áll rendelkezésre különböz

anyagú polimer pervaporációs

membránokból is, például cellulóz-acetát-butirát membrán [Wu 1993], PDMS (polidimetil-sziloxán) membrán [O’Brien 1996], PDMS-PS IPN (polidimetil-sziloxán polisztirol keverék) támasztóréteges membrán [Ruckenstein 1996] és aromás poliéterimid membránok [Qariouh 1999]. - 45 -

A szervetlen és polimer membránok el nyös tulajdonságainak kombinálása és a pervaporáció

költségeinek

csökkentése

érdekében

napjainkban

számos

szervetlen/polimer, vagy polimer/polimer kompozit membránt vizsgáltak. Ilyen membránok a polisztirol-szulfonát/alumínium [Martin 1995] vagy a PVA/SA (polivinil-alkohol nátrium alginát) keverék membránok [Dong 2006], melyekkel etanol/víz elegyek pervaporációval történ szétválasztását vizsgálták.

2.6.3

Pervaporációval segített enzimes észterezési reakciók A biokatalítikus reakciók sok esetben alacsony hozammal mennek végbe, ezért az

in situ termék / melléktermék elvonás nagyon el nyös lehet. Csökkenti a termékinhibíciót, javítja a termodinamikus egyensúlyt és az enzim aktivitását, továbbá lehet vé teszi a terméknek a reakcióelegyb l történ szelektív eltávolítását. Több publikáció is beszámol arról, hogy szerves oldószerben hajtottak végre lipáz katalizált észterezést pervaporációs vízelvonással. Ilyen reakció a racém ibuprofen (gyulladásgátló) kinetikus rezolválása [Won 2006], a geranil-acetát (íz és illatanyag) szintézise [Bartling 2001, Kang 2005], a fruktóz-palmitát (nem-ionos felületaktív anyag) [Sakaki 2006] és a glicerol-monosztearát (emulgálószer) [Ziobrowski 2009] el állítása. Minden fönti példában a pervaporációval történ vízelvonás pozitív hatással volt a szubsztrátkonverzióra és a reakciósebességre. Ionos folyadék közeg használatával is találhatunk hasonló témájú publikációkat. Ilyen Schäfer és munkatársainak cikke, melyben termékek [bmim]PF6 ionos folyadékból történ

kinyerését vizsgálták. Kísérleteikkel bebizonyították, hogy a

pervaporáció egy kvantitatív, enyhébb körülményeket igényl és sokkal hatékonyabb elválasztási módszer, mint a desztilláció [Schäfer 2001]. Konkrétan, pervaporációval segített, ionos folyadékban történ

enzimes

észterezéssel kapcsolatban kevés publikáció létezik (4 darab). Ezek közül 2 egy enantioszelektív reakció, a racém 2-klór-propionsav kinetikus rezolválását írja le [Bélafi-Bakó 2002, Ulbert 2004]. A másik kett az etil-acetát [Gubicza 2008] és az izoamil-acetát szintézisér l szól [Fehér 2009]. Szerves oldószer közegben végzett kísérletekhez hasonlóan a szerz k itt is bebizonyították, hogy a biokatalízist pervaporációval kombinálva a reakciók hozama megnövelhet .

- 46 -

3 Célkít zések A nem-konvencionális körülmények között végrehajtott enzimes észterezések – a reakciók nagy száma és a nem-konvencionálisnak tekintett körülmények sokasága miatt – széles és sokak által kutatott tématerület. Az eddig összegy lt tapasztalatok ellenére azonban minden reakciótípus tartogat meglepetéseket. Kutatásaim során egy természetes aroma és gyógyszeripari alapanyag, az etillaktát enzimatikus el állítását t ztem ki célul különböz

nem-konvencionális

körülmények (szerves oldószer és ionos folyadék közeg, illetve mikrohullámú h közlés) alkalmazása mellett. A reakció kiválasztásában szerepet játszott, hogy az irodalmat áttekintve azt találtam, hogy a 2-hidroxisavak alkoholokkal történ

észterezése területén ugyan

folytak már kutatások, de kizárólag szerves oldószer közegben és nem az általam eltervezett szubsztrátok és enzim használatával. Kísérleteim másik célja az volt, hogy ionos folyadék közegben vizsgáljam a tejsavnak, a lejátszatott észterezési reakció során tapasztalt egyedi viselkedését – dimerizációs, és dimeréb l történ hidrolízisre való hajlamát – mind konvencionális (rázatott lombikban történ ), mind mikrohullámú h közlés és víztartalom szabályozás mellett.

- 47 -

4 Anyagok és analitikai módszerek 4.1 Anyagok 4.1.1

Alkalmazott enzim Candida antarctica lipáz B. Az enzim egy Aspergillus niger-ben termelt

rekombináns lipáz, kb. 0,3-0,9 mm szemcseméret

akril gyantán immobilizálva.

Márkanév: Novozym 435 (Novo Nordisc, Basvaerd, Dánia). Min sége: • Aktivitása: 7000 mol PLU/g, 15 min, 1 bar, (1 PLU definíció szerint az az

érték mol-ban kifejezve, amennyi n-propil-laurát keletkezik laurilsav n-propil alkohollal való észterezése során 15 perc alatt atmoszférikus nyomáson.) • Víztartalom: 1-2%.

4.1.2

Vegyszerek A felhasznált vegyszerek a 4-1. táblázatban láthatók. 4-1. táblázat: Felhasznált vegyszerek.

Vegyszer neve Ioncserélt víz L-2-hidroxi-propionsav (L-tejsav) (90 %-os) L-etil-laktát

Min ség < 10 µS

Magyarország Reanal Finomvegyszergyár

laktilsav

Zrt, Budapest, Magyarország

enantiomerek összesen

Sigma-Aldrich Chemie GmbH,

min. 98,0%

Steinheim, Németország

min. 98,0 %

Toluol

min. 99,9 %

n-Hexán

PE MÜKKI, Veszprém,

min. 88,0 % tejsav és

Nátrium-hidroxid

Etil-alkohol

Gyártó v. forgalmazó

abszolút min. 97,0 %

- 48 -

VWR (Spektrum 3D), Debrecen, Magyarország Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország VWR (Spektrum 3D), Debrecen, Magyarország Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország

4-1. táblázat (folytatás): Felhasznált vegyszerek.

Vegyszer neve

Min ség

Metil-alkohol

min. 99,8 %

Fenolftalein

min. 98,0 %

Karl-Fisher reagens Zeolit Sósav oldat Nátrium-dihidrogénfoszfát-monohidrát Acetonitril Foszforsav oldat Szárazjég Aceton

1 cm3

5 mg H2O

4 Å, aktivált 0,1 M min. 99,0% min. 99,9% min. 50%

Gyártó v. forgalmazó VWR (Spektrum 3D), Debrecen, Magyarország VWR (Spektrum 3D), Debrecen, Magyarország Reanal Finomvegyszergyár Zrt, Budapest, Magyarország Zeolyst International, Kansas, USA Reanal, Budapest, Magyarország Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország Linde, Répcelak,

-

Magyarország

min. 99,8 %

- 49 -

Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Németország

4.1.3

Ionos folyadékok A felhasznált ionos folyadékok a 4-2. táblázatban láthatók.

4-2. táblázat: Felhasznált ionos folyadékok, gyártó: IoLiTec GmbH (Heilbronn, Németország) tisztaság: min. 98 %.

Ionos folyadék neve Trihexil-tetradecil-foszfónium-bis (2,4,4-trimetil-pentil)-foszfinát

Trihexil-tetradecil-foszfóniumbromid

Trihexil-tetradecil-foszfóniumdodecilbenzol-szulfonát

Rövidítés

Cyphos 104

Cyphos 102

Cyphos 202

Tetrabutil-foszfónium-bromid

Cyphos 163

Tetraoktil-foszfónium-bromid

Cyphos 166

Trihexil-tetradecil-foszfónuimhexafluoro-foszfát

Triizobutil-metil-foszfónium-tozilát 1-butil-3-metil-imidazoliumhexafluoro-foszfát

Cyphos 110

Cyphos 106

[bmim]PF6

- 50 -

Szerkezeti képlet

4-2. táblázat (folytatás): Felhasznált ionos folyadékok, gyártó: PE MÜKKI (Veszprém,

Magyarország), tisztaság: min. 98 %.

Név

Rövidítés

1-(2-etoxi-etil)-3-metil-

Szerkezeti képlet

VACEM 42

imidazolium-hexafluoro-foszfát 1-{2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etil}3-metil-imidazolium-hexafluoro-

VACEM 44

foszfát 1-[2-{2-[2-(2-etoxi)-etoxi]-etoxi}etil]-3-metil-imidazolium-hexafluoro-

VACEM 47

foszfát 1-(2-metoxi-etil)-3-metilimidazolium-hexafluoro-foszfát

4.1.4

VACEM 58

Membránok A pervaporációs kísérleteim során tesztelt hidrofil lapmembránokat a következ

táblázat tartalmazza: 4-3. táblázat: Pervaporációs hidrofil lapmembránok.

Membrán neve

Gyártó

Pervap 2205

Sulzer Chemtech GmbH, Winterhur, Svájc

Pervap 2201

Sulzer Chemtech GmbH, Winterhur, Svájc

Pervap 2211

Sulzer Chemtech GmbH, Winterhur, Svájc

Pervap 2216

Sulzer Chemtech GmbH, Winterhur, Svájc

CMC-CF-23

CM-Celfa Membrantrenntechnik AG, Seewen, Svájc

STANDARD

Beroplan GmbH, St.Ingbert, Németország

STANDARD 95 °C

Beroplan GmbH, St.Ingbert, Németország

GFT 1005

Gesellschaft für Trenntechnik GFT mbH, Hameln, Németország

GFT 2001

Gesellschaft für Trenntechnik GFT mbH, Hameln, Németország

- 51 -

4.2 Analitikai módszerek Az észterezési reakciók követése – a lejátszódó folyamatok minél jobb megismerése érdekében – több mérési technika alkalmazásával történt. Ezen analitikai módszerek felsorolása és az alkalmazott körülmények találhatók a következ alfejezetekben.

4.2.1

Víztartalom meghatározás Az enzimm ködés és az észterezési reakció egyensúlyának szempontjából

egyaránt nagy jelent sége van a víztartalomnak, mint azt az irodalmi részben már láthattuk. Ezért a kiindulási anyagok, szerves oldószerek és ionos folyadékok víztartalmát és a reakcióban keletkez víz mennyiségét automata Mettler Toledo DL 31 Karl-Fisher titrátorral vizsgáltam. A Karl-Fischer titrálás egyike a leggyakrabban alkalmazott víztartalom meghatározási módszereknek, mivel széles mérési tartományban (kb. 0,01 % – 100 % víztartalom), nagy pontossággal (± 0,3 %), gyorsan mérhet k szilárd és folyadék minták egyaránt. [http://www.opticsplanet.net/mettler-toledo-dl31-karl-fischer-titrator-mettlertoledo-dl31.html 2012. 05. 21.]. A víztartalom meghatározást minden esetben 3 párhuzamos mérés eredményének átlagolásával végeztem. A mérések alapján a használt reagensek és egyéb vegyszerek víztartalma következ képpen alakult: 4-4. táblázat: A kísérletekhez használt reagensek és vegyszerek víztartalma.

Vegyszer neve

Víztartalom (%)*

Vegyszer neve

Víztartalom (%)*

Tejsav

14,0

Cyphos 163

0,3

Etanol

0,1

Cyphos 166

0,4

Toluol

< 0,01

Cyphos 202

0,1

Hexán

< 0,01

VACEM 42

0,5

Cyphos 102

0,8

VACEM 44

0,8

Cyphos 104

0,03 (kerekítve: 0,0)

VACEM 47

0,6

Cyphos 106

0,2

VACEM 58

1,2

Cyphos 110

1,1

[bmim]PF6

0,3

*: A kísérletek során a mért víztartalom értékeket egy tizedesjegyre kerekítve használtam, mivel az egyéb mérések pontossága nem igényelt precízebb értékeket, bár a meghatározás pontossága ennél nagyobb.

- 52 -

4.2.2

Sav-bázis titrálás A kereskedelemben kapható kb. 20 %-nál töményebb tejsav oldatok a monomer

savon kívül annak módosulatait is tartalmazzák. Tehát tulajdonképpen víz, szabad hidroxipropionsav, laktilsav (más néven anhidro-tejsav) és egyéb módosulatok keverékei. Az összetétel egy egyensúly eredménye, ezért nagymértékben függ az oldat koncentrációjától.

A

módosulatok

kialakulásának

módja

a

következ képpen

magyarázható: A tejsav híg vizes oldatának töményítésekor, két tejsav molekula vízkilépés mellett összekapcsolódik egymással. Ha az oldatot tovább koncentráljuk, a laktilsav molekula egy molekula víz elvesztése következtében gy r vé záródik laktid molekulát képezve [Watson 1940, Vu 2005]. A lejátszódó reakciók egyenletei a következ k: OH

CH3 C

2 H3C H C

OH

H3C

C H

C

OH C O

O

C

OH

H3C laktilsav

tejsav

C H

H C

O

O

H3C

O

O

O

O H C

H3C

C

OH

H3C

laktilsav

O C

H C

C H

C O laktid

+

H2O

CH3

+ H2O O

4-1. ábra: A tejsav vízelvonás hatására végbemen reakciói.

Mivel az észterezési reakció kiindulási anyagaként koncentrált (kb. 90 %-os) tejsavat használtam, ezért a fönt leírt jelenségre számítani kell, és fontos megállapítani a tejsav oldat pontos összetételét. Ennek legegyszer bb módja a sav-bázis titrálás. Ha a tejsav oldatot szobah mérsékleten lúggal titráljuk, akkor nemcsak a monomer tejsavat, hanem a laktilsavat is megtitráljuk. Ha a megtitrált oldathoz fölöslegben lúgot adunk, majd vízfürd n melegítjük, a laktilsav észterszer

kötése

felbomlik és a felszabaduló karboxil csoport újabb lúgot köt meg. Így a tejsav- és laktilsav tartalom pontosan meghatározható [Erdey 1969]. A titrálás menete a következ volt: A kísérletekhez használt tömény (kb. 90 %-os) tejsav oldatból 0,1 g/l-es törzsoldatot készítettem egy gramm tejsav 100 ml–re való

- 53 -

hígításával, majd (a lehet legrövidebb id n belül) 20 ml törzsoldatot titráltam 0,1 M-os NaOH-dal, fenolftalein indikátor jelenlétében. Az átcsapási tartomány elérése után további 10 cm3 NaOH oldatot tettem az elegyhez, majd egy órán át vízfürd n (kb. 95 °C-on), visszacsepeg h t vel ellátott lombikban h kezeltem. A vízfürd r l való levétel után 10 ml 0,1 M-os HCl oldatot adtam az elegyhez, és a szabad savtartalmat visszatitráltam. A második fogyásból a laktilsav mennyisége, az els és a második fogyás különbségéb l a tejsavtartalom számolható. A NaOH oldat faktorozása 0,1 M-os sósav oldattal történt. Három párhuzamos mérés eredményének átlagaként a kiindulási anyagként használt tejsav oldat összetételére a következ k adódtak: • Tejsav: 52,5 % • Laktilsav: 26,3 %

Ha a sav-bázis titrálással kapott savtartalom eredményeket és a Karl-Fischer titrálás eredményét összegezzük, megállapítható, hogy 7,2 % anyagmérleg hiány van. Ez a hiány magyarázható karboxil csoportot nem tartalmazó tejsav származékok (pl. laktid) jelenlétével. Érzékelve a titrálásos módszer lehetséges hibáját, ami abból adódhat, hogy a tömény tejsavat a kísérletekhez vízzel hígítani kell, és ez befolyásolhatja a savösszetételt, HPLC-vel is végeztem méréseket, (lásd 4.2.4 fejezet), illetve vizsgáltam a savösszetétel esetleges változását különböz

h mérsékletekre inkubált oldatokban

(lásd 5.1 fejezet).

4.2.3

Gázkromatográfiás elemzés A tejsav rövid szénláncú alkoholokkal alkotott észterei illékony vegyületek, ezért

a mennyiségi meghatározásukra a gázkromatográfia kézenfekv megoldás volt. A mérésekhez HP 5890 A típusú, lángionizációs detektorral felszerelt gázkromatográfot használtam. A hidrogén (éghet gáz) és leveg (égést el segít gáz) mellett a viv gáz a nitrogén volt. A méréseket egy HP-FFAP, 30 m x 0,53 mm x 1 µm típusú oszlopon (Macherey-Nagel GmbH & Co., Düren, Németország) hajtottam végre.

- 54 -

A kromatográfiás mérések körülményei a következ k voltak: • Fejnyomás: 80 kPa • N2 áramlási sebesség: 19 ml/min, • Injektor h mérséklet: 200 °C • Detektor h mérséklet: 250 °C • Kolonnatér h mérséklete: a beállított h mérsékletprogram szerint (4-5.

táblázat). Egy mérés id tartama: 15 min.

4-5. táblázat: Gázkromatográfiás elemzés során használt h mérsékletprogram.

H mérséklet (°C)

Id tartam (min)

60

3

10 °C/min

8,5

145

3,5

Kiindulás Felf tés Végs h mérséklet A fenti módszerrel a következ

retenciós id kkel jelentkeztek a vizsgált

vegyületek: 4-6. táblázat: Gázkromatográfiás elemzés során tapasztalt retenciós id k.

Komponens

Retenciós id (min)

Etanol

1,6

Toluol

2,7

Etil-laktát

7,5

Megjegyzés: Az alternatív oldószerként használt hexán retenciós ideje 0,9 perc. Az etanol és az etil-laktát retenciós ideje nem függött a használt oldószert l.

4-2. ábra: Gázkromatográfiás mérés jellemz kromatogramja toluol oldószer használata esetén.

- 55 -

Meg kell jegyezni, hogy a gázkromatográfiás kromatogramok alapján nem láttam arra utaló jelet (azonosítatlan csúcsot), hogy a reakciók során a laktilsav reagál az etanollal és laktilsav-etil-észter keletkezik, de mivel nem állt rendelkezésre standard, ezt nem tudom egyértelm en bizonyítani. A 0,5

l mintaoldat oszlopra való felvitele Hamilton fecskend vel, manuális

injektálás révén történt. Szerves oldószerben végzett reakciók esetén a minták nem igényeltek mintael készítést, ionos folyadék közeg

reakciók esetén azonban a

vizsgálatra szánt reakcióelegy etil-laktát tartalmát toluollal vagy hexánnal extraháltam az analízis el tt, hogy megvédjem a készüléket a nem-illékony oldószer injektorban és az oszlop elején történ

lerakódásától. A kiértékelést küls

standard módszerrel,

egypontos kalibráció alapján végeztem. A mérés pontosságának igazolását a következ képpen végeztem el minden reakcióelegy-típus esetén: Kalibráló egyenest vettem föl a mérés várható koncentrációtartományában, 5 koncentrációpontban, pontonként két beméréssel, véletlenszer

sorrendben történ

injektálással. Meghatároztam a mérési pontokra illeszthet

egyenes illesztési

pontosságát (R2), 95 %-os konfidencia intervallumát, és annak y-tengely metszetét. Ábrázoltam a mérési pontoknak az illesztett egyenes körüli szóródását az injektálás illetve a koncentráció növekedése sorrendjében (4-3. ábra). A koncentráció-csúcsterület összefüggést akkor tekintettem megfelel nek, tehát az egypontos kalibráció használatát megengedhet nek: • ha az egyenes illesztésének pontossága: R2 0,99; • az egyenes 95 %-os konfidencia intervalluma tartalmazta az origót; • a mérési pontok véletlenszer en szóródnak az illesztett egyenes körül mind az

injektálás sorrendjében, mind a koncentrációnövekedés sorrendjében ábrázolva [Kemény 2011].

- 56 -

Toluol oldószer esetén a fönt említett értékek a következ knek adódtak: Scatterplot area = -10986,2589+20575,8559*x; 0,95 Conf.Int. 700000

600000

500000

area

400000

300000

200000

100000

0

0

5

10

15

20

25

30

konc (mg/ml) 4-3. ábra: A koncentráció csúcsterület összefüggés és a 95 %-os konfidencia intervallum toluol oldószer esetén.

Mérési pontok szóródása az illesztett egyenes körül b.)

Mérési pontok szóródása az illesztett egyenes körül a.)

20000

10000 0 -10000 0

10

20

-20000

30

maradékok...

maradékok...

20000

10000 0 -10000 0

2

4

6

8

10

-20000 injektálás sorrendje

konc. (mg/ml)

4-4. ábra: A mérési pontok szóródása az illesztett egyenes körül a.) a koncentráció b.) az injektálás sorrendjének függvényében toluol oldószer esetén.

A különböz mérések során tapasztalt koncentráció-csúcsterület összefüggések és a kalibráció pontosságát jelz

egyéb mér számok összefoglalva a 4-7. táblázatban

láthatók.

- 57 -

4-7. táblázat: Az etil-laktát meghatározás pontosságának igazolása különböz oldószerek esetén.

Oldószer

Hexán

Toluol

1-30 mg/ml

1-30 mg/ml

0,9946

0,9976

Y = 27645 X + 8001,7

Y = 20576 X - 10986

[-22012; 38016]

[-25575; 3602]

véletlenszer

véletlenszer

véletlenszer

véletlenszer

Megfelel

Megfelel

Koncentráció tartomány R2 Egyenes egyenlete 95%-os konfidencia intervallum Mérési pontok szóródása a koncentráció növekedésével Mérési pontok szóródása az injektálás sorrendjében Értékelés

4.2.4

Folyadékkromatográfiás elemzés Mivel a tejsav nem illékony, de vízben jól oldódó vegyület, ezért meghatározására

folyadékkromatográfiás módszerrel volt lehet ség. A mérés körülményei: • Oszlop: ZORBAX SB-Aq, 150 x 4,6 mm 5 µm, (Agilent Technologies, USA) • „A” eluens: 100 % acetonitril • „B” eluens: 94 % 10 mM-os nátrium-dihidrogén foszfát puffer (pH: 2,3) + 6 %

acetonitril • Kolonnatér h mérséklet: 30°C • Detektálás: UV, 215 nm • Áramlási sebesség: 1 ml/min • Injektált térfogat: 30 l • Gradiensprogram: a 4-8. táblázatban leírtak szerint

- 58 -

4-8. táblázat: Gradiensprogram.

Id (min)

A eluens

B eluens

0

0

100

1

0

100

8

10

90

12

10

90

15

0

100

20

0

100

A kiértékelést – a mennyiségi meghatározást és a tejsav módosulatainak azonosítását – nehezítette, hogy csak monomer tejsavra szerezhet be tiszta referencia anyag (a kb. 20 %-nál hígabb tejsav oldat). A módosulatok külön-külön nem állíthatók el , mivel egyensúlyi reakciók termékei. Ezért az egyes komponensek azonosítása a kromatográfiás csúcs területének és a sav-bázis titrálással kapott összetételnek az összevetésével történt. Ezek alapján a következ

komponensek váltak el a fönti

rendszerben: 4-9. táblázat: Retenciós id k a folyadékkromatográfiás elemzés során.

Komponens

Retenciós id (min)

Tejsav

2,1

Laktilsav

3,8

Etil-laktát

4,6

Laktid

8,7

Megjegyzés: 2,4 percnél egy rendszercsúcs látható.

- 59 -

4-5. ábra: Folyadékkromatográfiás mérés jellemz kromatogramja.

A mennyiségi kiértékelést küls

standard módszerrel végeztem, egypontos

kalibráció alapján, a 90 %-os tejsav oldatból készült hígítást használva standardként. A mérésekhez a standardból és a reakcióelegyb l egyaránt kb. 2 mg/ml koncentrációjú (összes tejsav módosulatra nézve) vizsgálandó oldatokat készítettem „B” eluensben történ hígítással. Ionos folyadékot tartalmazó reakcióelegy esetén a mintákat mérés el tt 0,22 µm-es pórusátmér j

cellulóz-acetát sz r n sz rtem az ionos folyadék

eltávolítása érdekében. A mérés pontosságának igazolását az el z (4.2.3) fejezetben leírtak alapján a monomer tejsavra végeztem el, és a következ jellemz ket kaptam: 4-10. táblázat: A tejsav meghatározás pontosságának igazolása folyadékkromatográfiás mérés esetén.

Jellemz

Érték

Koncentráció tartomány

0,5 – 2,5 mg/ml

R2

0,9966

Egyenes egyenlete

Y = 468835 X + 3532,9

95%-os konfidencia intervallum Mérési pontok szóródása a

[-33905; 40971] Véletlenszer

koncentráció növekedésével Mérési pontok szóródása az

Véletlenszer

injektálás sorrendjében Értékelés

Megfelel - 60 -

A tejsav összetételének meghatározása az egész dolgozat analitikájának legnehezebb része volt. A minél pontosabb meghatározás érdekében a titrálással kapott eredményeket HPLC-vel is ellen riztem, illetve vizsgáltam azt, hogy mennyire tekinthet állandónak a higított tejsav oldat összetétele. Ezért a hígítást követ en 10, 20 és 30 perc késleltetéssel is elemeztem a tejsav összetételét. Az eredmények a 411.táblázatban láthatók.

4-11. táblázat: Tejsav összetétele a hígítástól számított különböz id pontokban.

Mérés id pontja

Tejsav

Laktilsav

Laktid

(tömeg%)

(tömeg%)

(tömeg%)

Hígítás után azonnal

59,8

32,2

8,0

Hígítás után 10 perccel

59,5

32,4

8,1

Hígítás után 20 perccel

59,7

32,3

8,0

Hígítás után 30 perccel

59,3

32,5

8,2

Megjegyzés: A táblázatban szerepl százalékos összetételek nem tartalmazzák a víztartalmat. A sav-bázis titrálással meghatározott savösszetétel (víztartalom nélkül): Tejsav: 61,0 %; laktilsav: 30,6 %; laktid: 8,4 %.

A sav/bázis titrálással meghatározott és a HPLC-vel mért eredmények jó egyezést mutattak. Nem tapasztaltam a vízzel való hígítás hatására fellép gyors változást a tejsav összetételben, így a kapott eredményt megfelel en megbízhatónak tekintettem ahhoz, hogy a méréseim kiindulási adataként használjam. Ha a számok abszolút értékeiben esetleg tévedek is, az oldószerek kiválasztását, az enzim és mikrohullámú kezelés hatásának tendenciáját mindenképpen helyesen határozom meg.

4.2.5

Kísérleti módszerek, berendezések bemutatása a dolgozatban A dolgozat szerkesztése során úgy ítéltem meg, hogy az átláthatóságot és az

eredmények megértését az segíti el , ha az egyes vizsgálatokhoz tartozó kísérleti módszereket, berendezéseket és eredményeket egy fejezetben tárgyalom. Ezért eltértem a szokásos formátumtól és nem külön fejezetben, hanem mindig az aktuális kísérlettípust leíró rész elején mutatom be a felhasznált berendezéseket és a kísérleti módszert. - 61 -

4.2.6

A mérések pontossága, reprodukálhatósága Kísérleti munkám során minden vizsgált reakciót háromszor ismételtem. A

mérések jól reprodukálhatók voltak, az eredmények szórása kisebb volt, mint 6 %. A dolgozatban, az eredmények táblázatos megadása esetén az átlagolt eredmények láthatók, a diagramokon azonban fölt ntettem a konfidencia intervallumot is.

xátlag körüli kétoldali konfidencia intervallum az a tartomány, amelyen belül a várható érték (1- ) valószín séggel megtalálható, és amelynek adott valószín séghez tartozó alsó és fels határa a következ képpen számolható:

Konfidencia intervallum = xátlag ±

tα / 2 , n ⋅ s n

ahol: n: minta elemszáma s: korrigált tapasztalati szórás t

/2,n:

n-1 szabadsági fokhoz,

bizonytalansághoz tartozó t eloszlás

[Kemény 2011] A különböz analízisek eltér mintamennyiséget igényeltek. Gázkromatográfiás, illetve HPLC mérésekhez 50

l mintát vettem, Karl-Fischer féle víztartalom

meghatározáshoz kb. 10 l mintára volt szükség mérési pontonként. A szerves oldószerben, illetve az ionos folyadékokban végzett el kísérletek esetén nem alkalmaztam mindhárom analízistípust egyszerre, egyazon reakcióelegyb l. Egy általános reakció esetén szerves oldószerben maximum a reakcióelegy 5 %-a fogyott el a mintavételek során, amit elhanyagolhatónak tekintettem. Ionos folyadék közeg esetén ez kb. 15 % volt, ami már nem elhanyagolható, ezért az oldattérfogat változásával a reakciók értékelése során korrigáltam. A vízelvonás mellet végzett, méretnövelt reakciók esetén a mintavételre felhasznált mennyiség már kisebb volt, mint 1 %.

- 62 -

5 Kísérleti munka és eredmények A kísérletek során etil-laktát enzimkatalizált szintézisét vizsgáltam különböz nem-konvencionális körülmények – szerves oldószer vagy ionos folyadék közeg, illetve mikrohullámú h közlés – alkalmazásával. Következ

lépésként végrehajtottam a

reakció méretnövelését – ionos folyadék közeget és konvencionális h közlést alkalmazva – továbbá vizsgáltam a víztartalom szabályozás hatását a reakcióra. Ezen kísérletek ismertetése és az eredmények értékelése található a dolgozat további részében.

5.1 Tejsav viselkedése h hatására 5.1.1

Kísérleti módszer Az észterezési reakciók megkezdése el tt fontos annak vizsgálata, hogy a

kísérletek h mérsékletén a laktilsav és a laktid vajon visszaalakul-e tejsavvá, tehát tud-e az etil-laktát kiindulási anyagaként szolgálni. Ehhez 20-20 ml 0,1 g/l-es koncentrációjú tejsav törzsoldatot 40, illetve 60 °C-on rázó inkubátorban (típus: GFL 3031) 24 órán át h kezeltem, majd sav-bázis titrálással meghatároztam az összetételét.

5.1.2

Eredmények és értékelésük A 4.2.2 fejezetben leírt módszerrel elvégezve a titrálást, a következ eredményt

kaptam: 5-1. táblázat: A különböz h mérsékleteken inkubált tejsav oldat összetétele sav-bázis titrálás alapján.

Tejsav (tömeg %)

Laktilsav (tömeg %)

Szobah mérséklet

52,5

26,3

40 °C

50,9

27,5

60 °C

51,7

27,7

Ha a szobah mérséklet és h kezelt tejsav oldatok összetételét összehasonlítjuk, megállapítható, hogy az észterezési kísérletek h mérséklettartományában a h fok növelése nem befolyásolja a tejsav és származékai közötti egyensúlyt. Ezért a kísérletek során a termékhozamot a sav-bázis titrálás alapján meghatározott monomer tejsav - 63 -

tartalomra vonatkoztattam, illetve az alkohol : sav mólarány számolásához a monomer tejsav mennyiségét vettem alapul.

5.2 Konvencionális

h közléssel

végrehajtott

rázatott

lombikos

reakciók 5.2.1

Kísérletek szerves oldószerben A szerves oldószerek az enzimes észterezési reakciók nem-konvencionális

közegei közül a legrégebb óta kutatottak. Ez az oka, hogy a 2-hidroxi savak szerves oldószerekben történ

enzimes észterezése témában már születtek publikációk. Az

irodalomban fellelhet

reakciókörülmények azonban nem egyeztek meg a kísérleti

terveimmel – hosszabb szénláncú alkoholokat és/vagy karbonsavakat, illetve nem Candida antarctica lipáz B enzimet használtak – ezért indokolt volt a vizsgálatokat

szerves oldószerben kezdeni. Az így kapott eredmények továbbá jó összehasonlítási alapul szolgáltak a további nem-konvencionális körülmények hatásainak vizsgálatához. Irodalmi adatok alapján a szerves oldószerek közül a két leggyakrabban használtban, a toluolban és a n-hexánban vizsgáltam az észterezési reakciót.

5.2.1.1 Kísérleti módszer A kísérletek menete általánosan a következ volt: Jódszám lombikba megfelel arányban etanolt, 90 %-os tejsavat, vizet és szerves oldószert tettem, majd immobilizált enzimet adtam hozzá. A reakcióelegyet rázóinkubátorba helyeztem, meghatározott h mérsékleten, 150 min-1 intenzitású rázatás mellett végrehajtottam a reakciót. Az észterezés folyamán rendszeres id közönként mintát vettem GC mérés, illetve víztartalom meghatározás céljából. A reakciót befolyásoló paraméterek hatásának vizsgálata érdekében és az elérhet hozam maximalizálásához változtattam a használt enzim mennyiségét, a kiindulási elegy összetételét – etanol : tejsav mólarányt, a kiindulási víztartalmat, az oldószer mennyiségét (ezáltal a szubsztrátkoncentrációt) – és a reakció h mérsékletét az 5-2. táblázatban összefoglalt módon toluol oldószerben.

- 64 -

5-2. táblázat: A reakciót befolyásoló paraméterek vizsgálatához alkalmazott körülmények

toluol oldószer esetén.

Etanol (mmol) Tejsav1 (mmol) Víz2 (tömeg %) Enzim (mg) H mérséklet (°C) Reakciótérfogat (ml) Savkoncentráció (mmol/ml) 1

Katalizátor-

Sav-

Kiindulási

mennyiség

koncentráció

víztartalom

változtatása

változtatása

változtatása változtatása

5

5

3

Szubsztrátfelesleg

Reakcióh mérséklet változtatása

etanol :

5

tejsav = 1

1

1

7:1-1:3

1

2,5

2,5

0,53-5,5

4,5

4,5

0-500

250

250

250

250

40

40

40

40

30-50

5

1-10

5

5

5

0,2

1 - 0,1

0,2

0,2 – 0,6

0,2

: Monomer tejsav mennyisége. (1 mmol monomer tejsav kb. 171 mg 90 %-os tejsav oldatban

van.) 2

: Az enzim nélküli reakcióelegy tömegére vonatkoztatott kiindulási víztartalom, ami a tejsav

víztartalmából, és a hozzáadott víz mennyiségb l tev dik össze. (Az etanol és a szerves oldószer víztartalma elhanyagolható.) 3

: 0,5 tömeg % kiindulási víztartalom a reakcióelegy víztartalma hozzáadott víz nélkül.

A toluolban meghatározott, legjobbnak bizonyult körülmények között – 5 : 1 etanol : tejsav mólarány, 4,5 tömeg % kezdeti víztartalom, 5 ml oldattérfogat (tehát 0,2 mmol/ml savkoncentráció), 250 mg enzim, 40 °C – vizsgáltam egy alternatív szerves oldószer, a hexán használatának lehet ségeit. Toluollal ellentétben, hexán esetén – annak apolárosabb jellege miatt – a reakcióelegy két (folyadék) fázist alkotott, ezért a kísérletek megkezdése el tt az észter kalibrációs egyenes felvétele mellett vizsgálni kellett a két fázis között a termék megoszlását is. Ehhez 20 %-os, 40 %-os, 60 %-os, és 80 %-os átalakulást modellez elegyeket készítettem, és a hexános fázis észtertartalmát gázkromatográfiásan - 65 -

meghatároztam. Az így kapott csúcsterület adatokat a modellelegy elméleti összes észterkoncentrációja függvényében ábrázoltam. A mérési pontokra illeszked egyenes, és a hexánban mért etil-laktát kalibráló egyenes meredekségének hányadosából az észter megoszlása számolható. Meg kell jegyezni, hogy – a különböz h mérsékleteken inkubált tejsav oldat savbázis titrálása alapján – az észterezési reakció során, csak a monomer tejsav mennyisége fogy, a dimerek és egyéb származékok mennyisége nem változik, aminek modellezése nem volt megoldható, mivel az egyes komponensek tisztán nem álltak rendelkezésre. Ezért a modellelegyek mindegyikében a szubsztrátként használt tejsav oldatot használtam. Az észter megoszlásának szempontjából elhanyagolhatónak tekintettem annak a hatását, hogy a tejsav származékok aránya nem egyezik a modellben és a valós reakcióelegyben. A modellelegyek összetételét az 5-3 táblázat tartalmazza: 5-3. táblázat: Az etil-laktát megoszlás kiméréséhez használt modellelegyek összetétele.

Átalakulás foka

Tejsav oldat

Etanol

Észter

Víz

Észter konc.

(%)

(mg)

(mg)

(mg)

(mg)

(mg/ml)

20

157

129

24

95

4,8

40

139

120

47

98

9,4

60

121

111

71

102

14,2

80

103

102

95

105

19,0

A modellelegyek mérése alapján kapott csúcsterület-koncentráció összefüggéseket a 4.2.3 fejezetben leírtak alapján statisztikailag kiértékeltem. Az eredményeket az 5-4. táblázat tartalmazza. A modellelegyek (5-4. táblázat) és a hexánban oldott etil-laktát (4-7. táblázat) gázkromatográfiás mérése alapján kapott egyenesek meredekségét felhasználva megállapítható, hogy az észternek kb. 81 %-a található a hexános fázisban. Ezen kívül a statisztikai elemzés alapján elmondható, hogy a reakcióelegyb l származó minták mérését mátrix hatás nem torzítja.

- 66 -

5-4. táblázat: A modellelegyek csúcsterület-koncentráció összefüggésének statisztikai értékelése.

Jellemz

Érték

R2

0,9962

Egyenes egyenlete

Y = 22342 X -6317,9

95%-os konfidencia intervallum Mérési pontok szóródása a

[-24644; 12008] Véletlenszer

koncentráció növekedésével Mérési pontok szóródása az

Véletlenszer

injektálás sorrendjében Értékelés

Megfelel

Költséghatékonysági és környezetvédelmi szempontokat szem el tt tartva a legalkalmasabbnak ítélt összetételt, enzimmennységet, reakcióh mérsékletet és közeget használva vizsgáltam az enzim újrafelhasználhatóságát, meghatározva ezzel, hogy a lipáz milyen mértékben károsodik egy észterezési reakció során. A kísérlet a következ képpen zajlott: A reakció lejátszatását követ en az enzimet lesz rtem, 5 ml toluollal, majd 5 ml vízzel felváltva háromszor mostam, majd vákuum szárítószekrényban tömegállandóságig szárítottam. Ezt követ en újabb reakcióelegyet készítettem friss szubsztrátokkal és a megtisztított enzimmel, majd újra lejátszattam a reakciót. Az egész ciklust összesen négyszer ismételtem két különböz reakcióid – 24 óra és 8 óra – használatával. A tapasztaltakat összehasonlítottam az ionos folyadék közegben megfigyeltekkel, ezért a mérési eredmények és az értékelés az 5.2.3 fejezetben található.

5.2.1.2 Eredmények és értékelésük 5.2.1.2.1 Kísérletek toluolban Els

lépésként az enzim mennyiségét változtattam, kimérve ezzel a Candida

antarctica lipáznak azt a minimális tömegét, ami elegend

hozammal történ végbemeneteléhez.

- 67 -

a reakció megfelel

A kísérletek során tapasztalt észter hozam - reakcióid

függvények minden

esetben egyensúlyi görbét írtak le különböz elérhet hozamot produkálva (lásd 5-1. ábra).

észter hozam (%)..

100 90

vak (0 mg enzim) 250 mg enzim

24 mg enzim 400 mg enzim

100 mg enzim 500 mg enzim

80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

5

10

15

20

25

reakcióid (óra)

5-1. ábra: Az alkalmazott enzim mennyiségének hatása az észterezési reakció hozamára 40°C-on.

A reakció minden esetben kb. 8 óra alatt elérte az egyensúlyi állapotot. Az ekkor

észter hozam 8 óra után (%)..

tapasztalt hozam értékeit szemlélteti az 5-2 ábra. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

100

200

300

400

500

600

enzim mennyisége (mg)

5-2. ábra: Az alkalmazott enzim mennyiségének hatása az észterezési reakció hozamára.

- 68 -

Az ábráról leolvasható, hogy az elérhet

hozam n

az enzimmennyiség

növekedésével, míg el nem ér egy maximális értéket. Hasonló tendenciát figyeltek meg Roenne és munkatársai Novozyme 435®, illetve Candida sp. 99-125 (helyben el állított és

gyapot-textil

membránon

immobilizált)

enzimmel

tejsav

és

hexadekanol

ciklohexánban történ észterezése során [Roenne 2005], illetve Wei és munkatársai, akik acetonban és acetonitrilben hajtottak végre kísérleteket [Wei 2003]. Ezeknek ellentmondó eredményre jutottak Kiran és kutatócsoportja, akik kloroformban alacsony enzim-szubsztrát aránynál érték el a termék (lauroil-laktát) legmagasabb hozamát. A szerz k úgy gondolták, hogy nagyobb enzim koncentrációt használva több tejsav köt dik az enzimhez, ezzel csökkentve az észterezési reakció számára elérhet tejsav mennyiségét és ez okozta az általuk tapasztalt jelenséget [Kiran 2001]. Az egyes kutatócsoportok mérési eredményeiben tapasztalt különbségben valószín leg nagy szerepe van a használt szerves oldószerek eltér tulajdonságainak. A savkoncentrációnak, vagyis a reakcióelegy térfogatának a hozamra gyakorolt hatását vizsgálva a következ eredményeket kaptam:

hozam 8 óra után (%)...

50

(7 ml)

40

(5 ml) 30

(2 ml)

(10 ml) (1 ml)

20 10 0 0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

savkoncentráció (mmol/ml)

5-3. ábra: A kiindulási savkoncentráció hatása a hozamra. (Zárójelben a reakciótérfogat értékeivel.)

Az ábra alapján megállapítható, hogy 2 ml-nél kisebb oldattérfogatban a reakcióelegy koncentrációja túl magas, ami már negatívan hat az elérhet hozamra. A

- 69 -

legalkalmasabb térfogat 2-5 ml tartományban található, ami a 0,5-0,2 mmol/ml savkoncentrációnak felel meg. A reakcióelegyet tovább hígítva újra hozam csökkenés tapasztalható. Ezen kísérlet eredményei alapján a 2 ml reakcióelegy tehát már megfelel nek tekinthet , de figyelembe véve a reakció követéséhez szükséges mintavételek mennyiségét az 5 ml térfogat alkalmazása mellett döntöttem. Kezdeti víztartalom mennyiségének meghatározása els dleges fontosságú, mivel az befolyásolja az észterezési reakciót. Irodalmi adatok alapján a lipáz enzimek megfelel

m ködéséhez legalább monomolekuláris rétegben rendelkezésre álló

vízmennyiség szükséges [Zaks 1988]. Ennél kevesebb víz esetén nem m ködnek megfelel en, túl sok víz pedig a fordított irányú reakciónak kedvez. Ennek talán legels megfogalmazása Zaks és munkatársai publikációjában olvasható [Zaks 1985]: A szerz k szerint „az általános tapasztalatok azt mutatják, hogy víz szükséges az enzimm ködéshez. Ez a következtetés abból a tényb l ered, hogy a víz közvetlen, vagy közvetett módon részt vesz minden nem-kovalens jelleg kölcsönhatásban, ami a natív, katalitikusan aktív enzim konformációjának fönntartásához szükséges. Ugyan ez az érvelés kétségtelenül helyes, a valóban fontos kérdés nem az, hogy a víz valóban szükséges-e, hanem hogy mennyi víz szükséges. Nehéz elképzelni, hogy az enzim molekula több mint néhány molekularétegnyi vizet még „lát” maga körül. Amíg ez a minimális vízmennyiség az enzim molekula körül helyezkedik el, a többi vizet (közeg f tömege) valószín leg le lehet cserélni szerves oldószerre anélkül, hogy hátrányosan befolyásolnánk az enzimet. Mivel ez az enzim körül szükséges vízmennyiség nagyon kicsi, tulajdonképpen elmondhatjuk, hogy az enzimek közel vízmentes szerves oldószerben képesek m ködni.” Az enzimek megfelel borítottságához szükséges víz mennyiségéhez figyelembe kell venni az alkalmazott reakcióközeget is, hiszen annak hidrofobicitása jelent s befolyásoló tényez . A toluol közegben elért mérési eredményeket az 5-4. ábra szemléleti.

- 70 -

hozam 8 óra után (%)..

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

1

2

3

4

5

6

kiindulási víztartalom (tömeg %)

5-4. ábra: A kiindulási víztartalom hatása az észter hozamra.

Az ábrán jól látható, hogy ebben az esetben kb. 1,5 tömeg % vízre van minimálisan szükség az enzimm ködés megindulásához. Ennél kisebb vízmennyiség esetén a reakció gyakorlatilag nem játszódik le. Növelve a kiindulási víztartalmat az enzim egyre aktívabbá válik, és ezáltal megnövekszik az elérhet hozam. Jelen esetben a 4,5 % kiindulási víztartalomnál volt a legmagasabb. 4,5 %-nál nagyobb kiindulási víztartalom esetén az észterezési reakció egyensúlya már a hidrolízis irányába tolódott el. Ha az eredmények értékelésénél figyelembe vesszük, hogy a reakciókat 250 mg enzim felhasználásával játszattam le – ami az 5-2. ábra alapján csak közepes hozamot (41 %) eredményezett – akkor levonhatunk még egy fontos következtetést, mégpedig, hogy ezzel a lipázmennyiséggel is el lehet érni magas hozamot – közel 80 %-ot – a kezdeti víztartalom változtatása révén. Tehát nem szükséges 400 mg enzim használata, ami jelent s költségmegtakarítást jelent.

- 71 -

Szubsztrátok arányának változtatása a következ eredményt hozta: 100

hozam 8 óra után (%)...

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1:3

1:2

1:1

3:1

5:1

6:1

7:1

alkohol : sav mólarány

5-5. ábra: A szubsztrátarány hatása az észter hozamra.

Az ábrán jól látható, hogy a tejsavnak nagyobb inhíbeáló hatása van, mint az etanolnak, hiszen már háromszoros felesleg is 50 %-ra csökkentette a hozamot. Kísérleteimmel egy id ben hasonló eredményre jutottak Hasegawa és munkatársai is, akik a Novozyme 435® enzimet különböz

közegekben inkubálták, vizsgálva azok

enzimkárosító hatását. Ennek során azt tapasztalták, hogy az etanol dehidratáció révén kis mértékben károsítja az enzimet, míg a tejsav majdnem teljes inaktivációt okoz a 30 °C-on 24 óra alatt végrehajtott inkubálás során [Hasegawa 2008]. Ezeket a megállapításokat jól kiegészíti Pirozzinak és munkatársainak a publikációja, ami alapján az etil-laktátnak és butil-laktátnak is nagymérték enzimkárosító hatása van [Pirozzi, 2004]. Az alkohol és a sav sztöchiometrikus arányban történ alkalmazása esetén sem tapasztaltam magas hozamot, mivel az a termék képz dése szempontból kevésbé el nyös, mint az egyik reaktáns feleslege. A legmagasabb hozamot (92 %) a kevésbé káros etanol ötszörös feleslegénél kaptam, bár ett l a hatszoros felesleggel tapasztalt hozam (89 %) csak csekély mértékben tért el. A kísérletek alapján a legjobb összetételnek tehát a következ adódott: 5 : 1 etanol : tejsav mólarány, 4,5 tömeg % kezdeti víztartalom, 5 ml oldattérfogat (tehát 0,2 mmol/ml savkoncentráció), 250 mg enzimmel, 40 °C-on lejátszatva a reakciót. Az

- 72 -

így elért maximális hozam 94 % volt, ezért a további kísérleteket ezzel az összetétellel hajtottam végre. A reakcióh mérséklet hatásának vizsgálatára tehát, a már korábban meghatározott reakcióelegy összetétellel került sor, és a következ eredményt hozta: 100 90 80 hozam (%)

70 60 50 40 30

30 °C 40 °C 50 °C

20 10 0 0

5

10

15

20

25

reakcióid (óra)

5-6. ábra: A reakcióh mérséklet hatása az észterezési reakcióra.

Az ábra alapján megállapítható, hogy míg 30 °C-on kissé lassabban játszódott le a reakció, 40 és 50 °C h mérséklet használatával az észter hozam már 4 óra után megközelítette az egyensúlyi értéket. Mivel a reakció lefutásában kis különbséget tapasztaltam, amikor 40 °C-ról 50 °C-ra emeltem a h mérsékletet, továbbá a szerves oldószerek illékonysága nagyban nehezíti a velük való munkát magas h fokon, ezért a 40 °C-ot választottam a további reakciók h mérsékletének.

5.2.1.2.2 Kísérletek hexánban Jól ismert tény, hogy nem-konvencionális közegek használata esetén az oldószer polaritása jelent s befolyással van az enzim aktivitására, így az elérhet hozamra. A szerves oldószerek logP értékét ezért széleskörben használják arra, hogy az oldószerek polaritását, és ezáltal az enzimre gyakorolt lehetséges hatásaikat jellemezzék [Radzi 2005]. („P” a szóban forgó oldószer megoszlási hányadosa n-oktanol és víz fázisok között.) A különböz kísérletek sok esetben jól definiálható összefüggést találtak az egyensúlyi állapotban elérhet észter mólarány és az oldószer logP értéke között, ami a következ szabályban foglalható össze: - 73 -

• Ha a logP < 2, akkor a fehérje körüli vízburok szerkezete torzul, ami negatívan

befolyásolja az enzim stabilitását és ezáltal az elérhet hozamot. • Ha 2 < logP < 4, az oldószer hatása nehezen megjósolható. • Ha logP > 4, az enzim körüli vízburok sértetlen marad, biztosítva ezzel a

biokatalizátor aktív konformációját. Tehát az enzimes észterezési reakciók sebessége annál nagyobb, minél hidrofóbabb az oldószer, minél nagyobb a logP értéke [Verma 2008]. Azonban a fönti szabályszer ségnek ellentmondó eredményre jutottak Wei és kutatócsoportja, akik tejsav propil-glikoziddal való észterezését vizsgálták és a kis logP érték

oldószereket (aceton, acetonitril) találták megfelel nek. A jelenséget a

szubsztrátok jobb oldhatóságával magyarázták [Wei 2003]. Ha összehasonlítjuk a toluol és a hexán logP értékét – rendre 3,1 és 4,6 [Stephens 2011] – megállapítható, hogy a hexán a hidrofóbabb tulajdonságú, tehát a kedvez bbnek várt közeg enzimes észterezésekhez. Azonban a fönti irodalmi példák is mutatják, hogy csupán a hidrofobicitás alapján nem lehet pontosan jósolni. Meg kell jegyezni továbbá, hogy az egyes szerves oldószerek logP értéke változik, attól függ en melyik publikációt használjuk referenciaként – pl.: logPtoluol = 2,8 [Horikoshi 2011], vagy logPtoluol = 2,5; logPhexán = 3,5 [Roenne 2005] – bár a két szerves oldószer viszonya minden esetben azonos. A hexánban és toluolban lejátszatott észterezés reakcióid – hozam függvényét mutatja az 5-7. ábra. 100 90 80 hozam (%)

70 60 50

toluol

40

hexán

30 20 10 0 0

5

10

15

20

reakcióid (óra)

5-7. ábra: A közeg min ségének hatása az észterezési reakcióra.

- 74 -

25

Az ábra alapján megállapítható, hogy a szerves oldószerek hidrofobicitása alapján vártakkal ellentétben, ha azonos körülmények között (de eltér szerves oldószerben) lejátszatjuk az észterezési reakciót a hexánban elért hozam töredéke a toluolban kapottnak. Ennek különböz okai lehetnek. A legvalószín bb, hogy a hexánban a két folyadék fázis jelenléte miatt létrejött kinetikai gátlás befolyásolja a reakciót, illetve hogy az enzim így jobban ki van téve a tejsav inhíbeáló hatásának. Elképzelhet magyarázat továbbá az, hogy a legmegfelel bb víztartalom a reakcióelegyben alkalmazottól jelent sen eltér. Mivel hexánban a reakció gyakorlatilag nem ment végbe, továbbá a reakcióelegy kétfázisú rendszert alkotott, ami megnehezítené az ionos folyadék közegekben (egyfázisú reakcióelegyekben) történ

mérésekkel való korrekt összevetést, ezért a

dolgozat további részében a toluolban elért eredményeket használtam összehasonlítási alapként.

5.2.2

Kísérletek ionos folyadékban A nem-konvencionáis közegek közül a szerves oldószerekhez képest az ionos

folyadékok

rendelkeznek

számos

el nyös

tulajdonsággal,

úgy

mint

pl.

az

elhanyagolható g znyomás, vagy a nagy szerkezeti változatosság [Keskin 2007], ezért a bennük lejátszatott enzimes reakciók eredménye gyakran eltér a szerves oldószerben tapasztaltaktól. A fönti tények indokolták azt, hogy ionos folyadékokban is megvizsgáljam az etil-laktát szintézisének lehet ségét. A vizsgált téma újszer ségét támasztja alá, hogy ugyan az ionos folyadékban végrehajtott enzimes észterezés széleskörben kutatott terület, de kutatómunkám idején nem volt az irodalomban tejsav ionos folyadékban történ észterezésér l szóló publikáció fellelhet .

5.2.2.1 Kísérleti módszer A kísérletek általános menete megegyezett a szerves oldószerben végrehajtott kísérletek menetével. Mivel szerves oldószerben a reakciók többségét 40 °C-on végeztem, a jó összehasonlíthatóság kedvéért ionos folyadékok esetén is ezt a h mérsékletet alkalmaztam. A reakciók pontos körülményei a következ alfejezetekben olvashatók.

5.2.2.1.1 Ionos folyadékok kiválasztása A kísérletek els lépése az ionos folyadékok kiválasztása volt. Az ennek során végrehajtott kísérletek két csoportra bonthatók: - 75 -

a) A kezdeti szakaszában megvizsgáltam két ionos folyadék család – az imidazólium és a foszfónium típusúak – több tagját, hogy kiválasszam a reakció lejátszatásához leginkább megfelel típust. A választásom azért erre a két családra esett, mivel az imidazólium típusú ionos folyadékok – irodalmi adatok és az Intézetünkben tapasztaltak alapján egyaránt – megfelel közegek enzimes észterezések végrehajtására [Jain 2005, Fehér 2008, Fráter 2007]. A foszfónium típusú ionos folyadékok pedig, hozzájuk képest is számos további kedvez

tulajdonsággal rendelkeznek (lásd irodalmi rész), ami alapján

megfelel

közegek

lehetnek

az

etil-laktát

szintézishez.

A

kísérleti

körülményeket lásd az 5-5. táblázatban.

b) A kísérletek következ

lépésében vizsgáltam a kiválasztott ionos folyadék

család több tagjában az észterezési reakció lefutását, azzal a céllal, hogy összefüggést találjak a közeg tulajdonságai és a lejátszódó reakció eredménye között. A kísérleti körülményeket szintén az 5-5. táblázat tartalmazza. 5-5. táblázat: Alkalmazott reakciókörülmények és összetétel.

1

a)

a) vak3

b)

Etanol (mmol)

17

17

14

Tejsav1 (mmol)

2

2

2

Víz2 (tömeg %)

3

3

3

Enzim (mg)

25

25

25

H mérséklet (°C)

40

40

40

IL (ml)

1,5

0

1

Savkoncentráció (mmol/ml)

0,7

1,6

0,9

: Monomer tejsav mennyisége. (1 mmol monomer tejsav kb. 171 mg 90 %-os tejsav oldatban

van.) 2

: Az enzim nélküli reakcióelegy tömegére vonatkoztatott kiindulási víztartalom.

3

: Ez a reakcióelegy tulajdonképpen az oldószermentes közegnek felel meg.

A

reakciókban

keletkez

észter

mennyiségének

nyomonkövetését

gázkromatográffal végeztem. A mérések el tt a reakcióelegyb l vett minták észtertartalmát szerves oldószerrel extraháltam, hogy a GC-t megvédjem a nem illékony ionos folyadék lerakódásától. A reakciók hozamát az extrakció hatásfokának figyelembe vételével számoltam. - 76 -

Az extrakció hatékonyságának megállapításához az 5.2.1.1. fejezetben leírthoz hasonlóan 20 %-os, 40 %-os, 60 %-os, és 80 %-os átalakulást modellez elegyeket készítettem. A modellelegyekb l vett mintákat extraháltam, majd az extraktumok észter tartalmát gázkromatográfiásan meghatároztam. Az így kapott csúcsterület adatokat a modellelegy elméleti összes észterkoncentrációja függvényében ábrázoltam. A mérési pontokra illeszked

egyenes és az etil-laktát kalibráló egyenes meredekségének

hányadosából az extrakciós hatásfok számolható. A különböz ionos folyadékok esetén az extrakció módját és az extrakciós hatásfokokat a következ táblázat tartalmazza: 5-6. táblázat: Különböz ionos folyadékok esetén az extrakció menete és az extrakció hatásfoka. (extrahált minta mennyisége: 50 l).

Ionos folyadék

Extrahálószer

Extrakciós hatásfok (%)

Cyphos 202

80 l víz +4 x 80 l toluol

81

Cyphos 104

4 x 80 l hexán

82

Cyphos 163

40 l víz +4 x 80 l toluol

78

Cyphos 166

4 x 80 l hexán

73

Cyphos 102

4 x 80 l hexán

49

Cyphos 106

4 x 80 l hexán

57

VACEM 42

4 x 80 l hexán

68

VACEM 44

4 x 80 l hexán

72

VACEM 47

4 x 80 l hexán

76

VACEM 58

4 x 80 l hexán

59

[bmim]PF6

4 x 80 l toluol

71

-

93

Cyphos 110*

*: A Cyphos 110 esetén a reakcióelegy két fázisú rendszer volt, ezért ebben az esetben nem volt szükség extrakcióra, viszont meg kellett állapítani az észter megoszlását az ionos folyadékos és az etanolos fázis között. A táblázat ebben az esetben az etanolos fázisban lév észter arányát mutatja.

Az 5-6. táblázat alapján látható, hogy az extrakcióval a terméket nem tudtam tökéletesen kinyerni. Figyelembe véve, hogy az extrakció célja a nem-illékony ionos folyadék eltávolítása és a reprodukálható észterkinyerés volt, nem pedig a minél nagyobb kihozatal, ezért az alacsony hatásfok értékek is megfeleltek a hozam számolásához. - 77 -

5.2.2.1.2 Reakciókörülmények hatása az elérhet észterhozamra Ugyanúgy, mint a szerves oldószerben végrehajtott észterezésnél, ionos folyadék közeg esetén is fontos volt megvizsgálni az egyes reakciókörülmények elérhet hozamra gyakorolt hatását. Ezeket a vizsgálatokat Cyphos 104-ben hajtottam végre, mivel Marták és munkatársainak publikációja alapján ez az az ionos folyadék, ami jól alkalmazható tejsav fermentléb l való kinyerésére [Marták 2007]. A kísérleti körülményeket lásd az 5-7. táblázatban. 5-7. táblázat: Alkalmazott reakciókörülmények és összetétel.

Katalizátor-

Sav-

mennyiség

koncentráció

víztartalom

változtatása

változtatása

változtatása változtatása

Etanol (mmol)

14

18

14

Tejsav1 (mmol)

2

2

2

Víz2 (tömeg %) Enzim (mg) H mérséklet (°C) IL (ml) Savkoncentráció (mmol/ml) 1

Kiindulási

3

Szubsztrátfelesleg etanol : tejsav = 4 :2 - 18 : 2

2,0

3,0

0,3 – 4,0

3,0

25-100

25

25

25

40

40

40

40

0,67

0,25 – 1,20

0,67

0,67

1,1

1,3 – 0,8

0,8

1,6 – 1,0

: Monomer tejsav mennyisége. (1 mmol monomer tejsav kb. 171 mg 90 %-os tejsav oldatban

van.) 2

: Az enzim nélküli reakcióelegy tömegére vonatkoztatott kiindulási víztartalom.

3

: Annak érdekében, hogy 2,5 tömeg %-nál kisebb kiindulási víztartalom értékeket is be tudjak

állítani, a szubsztrátként használt tejsavat közvetlenül a felhasználás el tt 3A zeolittal víztelenítettem, majd víz hozzáadásával pontosan beállítottam a reakcióelegyben szükséges vízmennyiséget.

5.2.2.1.3 Enzimvisszaforgatás Az 5.2.1.1 fejezetben leírt, toluolban végrehajtott kísérletsorozat folytatásaként, ionos folyadékban is vizsgáltam az enzim visszaforgathatóságát. A kísérlet általános menete megegyezett az 5.2.1.1 fejezetben leírtakkal, bár a visszaforgatást 6 cikluson keresztül végeztem. A reakciókörülmények a következ k voltak: 2 mmol monomer tejsav, 14 mmol etanol, 0,67 ml Cyphos 104 ionos folyadék (ami 1,1 mmol/ml - 78 -

savkoncentrációt jelent), 2 tömeg % kiindulási víztartalom, 25 mg enzim, 40 °C reakcióh mérséklet, 24 óra reakcióid . A kísérletsorozat eredménye az 5.3.2 fejezetben található.

5.2.2.2 Eredmények és értékelésük 5.2.2.2.1 Ionos folyadék kiválasztása: a) Annak eldöntésére, hogy foszfónium, vagy imidazólium típusú ionos folyadékokban folytatom-e a kísérleteket kezdetben az 5-8. táblázatban felsorolt vegyületek álltak rendelkezésemre. 5-8. táblázat: Foszfónium és imidazólium típusú ionos folyadékok összehasonlítása.

IL típusa Foszfónium

Imidazólium

-

IL neve

Elért észter hozam 24 óra után (%)

Cyphos 202

87

Cyphos 104

59

VACEM 42

5

VACEM 44

5

VACEM 47

5

VACEM 58

8

[bmim]PF6

24

Vak (IL nélkül)

18

A táblázatban összesített adatok alapján elmondható, hogy míg a foszfónium típusú ionos folyadékok nagyon ígéretesnek látszanak, az imidazólium típusúakban jóval alacsonyabb hozamot értem el. Közülük a VACEM-ekben gyakorlatilag nem ment végbe a reakció. Az elért hozam ezekben a közegekben minden esetben kisebb volt, mint a vak reakcióban (IL nélküli, tehát tulajdonképpen oldószermentes közegben) kapott eredmény, ami az ionos folyadékok enziminaktiváló hatásával magyarázható. Az általam tapasztaltak egybevágnak az izo-amil-acetát szintézise során megfigyeltekkel [Fehér 2008]. A táblázatban összegy jtött eredmények alapján foszfónium típusú ionos folyadékokban folytattam a kísérleteket.

b) Az így kiválasztott ionos folyadék család 7 tagját teszteltem, és a következ eredményeket kaptam:

- 79 -

5-9. táblázat: Az elérhet észter hozam különböz foszfónium típusú ionos folyadékokban.

Észter hozam IL neve

Katalízis típusa

24 óra után (%)

Folyadék fázisok száma

Enzimmel

Enzim nélkül

Cyphos 104

80

2

Enzim

1

Cyphos 202

95

2

Enzim

1

Cyphos 163

104*

102*

IL (+ enzim)

1

Cyphos 166

90

87

IL (+ enzim)

1

Cyphos 106

74

72

IL (+ enzim)

1

Cyphos 102

60

59

IL (+ enzim)

1

Cyphos 110

36

32

IL (+ enzim)

2

*: Cyphos 163 esetén a (monomer tejsav mennyiségére vonatkoztatott) hozam 100 %-nál magasabb értékre adódott. Ennek okát és magyarázatát az 5.3 fejezetben fogom tárgyalni.

A táblázat alapján elmondható, hogy a vizsgált közegek két csoportra oszthatók. Cyphos 104-ben és 202-ben az enzimnek van katalitikus hatása, míg a többi közeget használva f leg az ionos folyadék felel s az elért hozamért. Ezekben az utóbbi esetekben az enzimet nem tartalmazó vak reakcióelegyben és az enzimet is tartalmazó reakcióelegyben közel azonos hozamot értem el. Minden felsorolt ionos folyadék esetén egyfázisú reakcióelegyet kaptam, kivétel a Cyphos 110. Ez a tulajdonság párhuzamba állítható a tapasztalt alacsony (36 %) hozammal. További következtetéseket vonhatunk le, ha figyelembe vesszük a tesztelt ionos folyadékok szerkezetét, ezért a következ csoportosítást alkalmaztam: • Ionos folyadékok kationja ([trihexil-tetradecil-foszfónium]+) azonos: Cyphos

104, Cyphos 102, Cyphos 202, Cyphos 110. • Ionos folyadékok anionja (Br-) azonos: Cyphos 102, Cyphos 166, Cyphos 163. • Egyik fönti csoportba sem sorolható: Cyphos 106.

Irodalmi adatok alapján ismert, az az általános szabály, hogy f leg az ionos folyadékok kationja felel s a vegyület stabilitásáért, és az anionja a vegyület által betöltött funkcióért [Enabling Technologies Ionic iquids, http://www. sigmaaldrich.com, 2012. 04. 03.]. Ez alátámasztja az általam tapasztaltakat, hiszen a kation - 80 -

min ségét l függetlenül minden bromid aniont tartalmazó ionos folyadék katalitikus hatással bírt. A tapasztalt katalitikus jellegre egy másik lehetséges magyarázatot ad Tseng és munkatársainak kutatási eredménye.

k azt tapasztalták, hogy a Cyphos 101

(trihexil(tetradecil)foszfónium klorid) rendelkezik némi savas jelleggel. A foszfónium kation deprotonálódásra hajlamos, és szubsztituált benzoát sókkal SN2 reakcióban vesz részt észter keletkezése mellett [Tseng 2007].

5.2.2.2.2 Reakciókörülmények hatása az észterezési reakcióra Az ionos folyadékok magas ára miatt különösen fontos volt meghatározni a reakció lejátszatásához minimálisan szükséges ionos folyadék mennyiséget, vagyis azt a legnagyobb savkoncentrációt, amit alkalmazva a reakció hozama még megfelel . A kapott eredményeket (lásd 5-8. ábra) vizsgálva megállapítható, hogy 0,25 ml ionos folyadék alkalmazása még semmilyen pozitív hatással sincs a reakcióra, hiszen az elért észter hozam megegyezik az oldószermentes közegben tapasztalttal (18 %). Növelve a Cyphos 104 mennyiségét (ezzel csökkentve a savkoncentrációt) az elért hozam monoton n , egészen 0,67 ml felhasznált ionos folyadékig (1,0 mmol/ml savkoncentrációig). Ennél nagyobb mennyiség közeg alkalmazása már nincs további pozitív hatással a reakcióra. Tehát a kísérlet alapján 0,67 ml ionos folyadék használata már elegend , ami

hozam 24 óra után (%)...

1,0 mmol/ml-nél kisebb monomer tejsav koncentrációt jelent. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

(1,20 ml)

(0,67 ml) (0,45 ml) (0,25 ml)

0,8

1

1,1

1,3

savkoncentráció (mmol/ml) 5-8. ábra: A savkoncentráció hatása az észter hozamra. (Zárójelben az ionos folyadék mennyiségének jelölésével)

- 81 -

Figyelembe véve a használt etanol – feleslegben lév szubsztrát – mennyiségét (1 ml) megállapíthatunk még egy fontos tényt: az ionos folyadék nem is tekinthet oldószernek, helyesebb a koszolvens megnevezés! Az

ionos

folyadék,

mint

koszolvens

alkalmazása

többször

el fordul

publikációkban, mint például Young és kutatócsoportjának cikkében, ahol arról számolnak be, hogy ionos folyadék-alkohol koszolvens rendszerben hajtották végre lipidek zsírsav-metil-észterekké való savkatalizált átészterezését. Az ionos folyadéknak ebben az esetben speciális szerepe volt. Az apoláros lipid és a poláros alkohol fázisok reakcióját és a termék elválasztását segítette el [Young 2011]. Az etanol : tejsav mólarány hatásának vizsgálatakor a toluolban tapasztaltak alapján csak különböz

arányú alkoholfelesleggel játszattam le reakciót, mivel az

ekvimoláris szubsztrátaránynak, illetve savfeleslegnek a hozamra gyakorolt negatív hatását a szerves oldószerben elvégzett kísérletek és irodalmi adatok [Hasegawa 2008] egyaránt igazolják. Az elvégzett kísérletsorozat eredménye (5-9. ábra) alapján megállapítható, hogy a legmagasabb észter hozamot 7:1 alkohol : sav mólaránynál értem el. 100 hozam 24 óra után (%)...

90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 2:1

4:1

7:1

8:1

9:1

alkohol : sav mólarány

5-9. ábra: Az alkohol : sav mólarány hatása az észter hozamra.

A kiindulási víztartalom (5-10. ábra) változtatása 2 tömeg %-ig pozitív hatással volt az elérhet észter hozamra, de a további vízmennyiség már a termékképz dés visszaszorulását eredményezte. Ez nem csupán az egyensúly hidrolízis irányába való

- 82 -

eltolódásának eredménye, hanem Páez és munkatársainak publikációja alapján egy másik jelenség is közrejátszik. Immobilizált enzim esetén a vízmolekulák eltömik az enzim hordozójának pórusait, és így gátolják a szubsztrátoknak az enzimhez való

hozam 24 óra után (%)...

hozzáférését [Páez 2003]. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0

0,5

1

1,5

2

2,5

3

3,5

4

4,5

kiindulási víztartalom (tömeg %)

5-10. ábra: A kiindulási víztartalom hatása az észter hozamra.

A szükséges enzimmennyiség meghatározása során (5-11. ábra) azt tapasztaltam, hogy a reakció a legkisebb lipáztömeg használata mellett is 24 óra alatt lejátszódik. Az enzim mennyiségének növelése hatására a reakció lefutása változott jelent sen, és 100 mg enzimmel már 8 óra alatt eléri a reakció az egyensúlyi szakaszt. A toluolban tapasztaltakkal ellentétben az egyensúlyi hozam az enzimmennyiség változtatásának hatására gyakorlatilag nem változott. Ez magyarázható azzal, hogy az ionos folyadék az enzim számára kedvez bb környezetet biztosít, mint a toluol, és ezáltal az kevésbé van kitéve az inaktiváló hatásoknak. A 24 óra alatt lejátszódó reakciót már elfogadható hosszúságúnak tekintettem, ezért a 25 mg enzim (2 mmol tejsav reagáltatásához) megfelel mennyiségnek volt tekinthet , és ezzel a mennyiséggel folyatattam a kísérleteket.

- 83 -

100 90

hozam (%)

80 70 60 50 40 30 20

25 mg

10 0

100 mg

50 mg 75 mg

0

5

10

15

20

25

reakcióid (óra)

5-11. ábra: Az enzim mennyiségének hatása az észterezési reakció lefutására.

5.2.3

Enzim visszaforgatás vizsgálata Toluolban

és

Cyphos

104

ionos

folyadékban

újrafelhasználhatóságát a kapott eredményeket a következ

vizsgálva

az

enzim

ábrán összegeztem. Az

egyes ciklusokban kapott hozam értékek az els ciklusban elért hozamra normálva láthatók. toluol / 24óra

toluol / 8 óra

Cyphos 104 / 24 óra

normált hozam (%)...

100 80 60 40 20 0 1

2

3

ciklus

4

5

6

5-12. ábra: Enzimvisszaforgathatóság toluol és Cyphos 104 ionos folyadékban 24, illetve 8 óra reakcióid t alkalmazva.

- 84 -

Az 5-12. ábra alapján elmondható, hogy szerves oldószerben az enzim újrafelhasználása csak kis mértékben lehetséges, hiszen már 4 ciklus alatt 10 %-ra csökken az elérhet hozam (24 óra reakcióid esetén). Abban az esetben, ha 8 óra reakcióid t alkalmazunk – hiszen toluolban ennyi id alatt már végbemegy a reakció – az elérhet

hozamok minden ciklusban kissé magasabbak, bár a növekedés nem

jelent s. A tapasztalt hozamnövekedés annak a következménye, hogy az enzim kevesebb ideig van kitéve a reakcióelegy káros hatásainak. Szerves oldószerrel szemben ionos folyadék esetén 6 ciklus alatt (24 óra reakcióid t alkalmazva) csupán kb. 20 % hozamcsökkenést tapasztaltam, ami jelent sen megnöveli az enzim újrafelhasználhatóságát. Foszfónium típusú ionos folyadékokról ugyan még nem jelent meg olyan publikáció, ami az enzim stabilitását és az ionos folyadék szerkezetének kapcsolatát vizsgálná, de imidazólium típusú ionos folyadékokkal már több alkalommal kimutatták, hogy az ionos folyadékban kialakuló rendezett térszerkezet folytán az enzim aktív szerkezete stabilizálódik, ezzel sok esetben kedvez bb környezetet biztosítanak, mint a szerves oldószerek [Lozano 2005, de Diego 2005]. Valószín leg foszfónium típusú ionos folyadékokban is fennáll ez a jelenség, és ezzel magyarázható Cyphos 104 kiemelked en pozitív hatása. Az enzimre gyakorolt kedvez hatás másik magyarázata az lehet, hogy a foszfónium kation megtalálható él szervezetekben, ezért a foszfónium sók és az enzim fehérjék affinitása valószín síthet [Abe 2008]. Toluolban és Cyphos 104 ionos folyadékban tapasztaltak összehasonlítása érdekében

táblázatosan

összegy jtöttem

reakciókörülményeket és a tapasztalt különbségeket.

- 85 -

a

legalkalmasabbnak

ítélt

5-10. táblázat: Toluolban és Cyphos 104-ben megállapított legmegfelel bb reakciókörülmények.

Reakcióközeg

Toluol

Cyphos 104

0,2 - 0,5 mmol/ ml

0,8 – 1,0 mmol/ml

Alkohol : sav mólarány

5:1

7:1

Kiindulási víztartalom

4,5 tömeg %

2,0 tömeg %

8 óra

24 óra

250 mg/ mmol tejsav

12,5 mg/mmol tejsav

Elért maximális hozam

94 %

95 %

Reakcióh mérséklet

40 °C

40 °C

Visszaforgathatóság

Gyenge

Megnövekedett

Savkoncentráció (a legkedvez bb reakciótérfogat alapján)

Reakcióid Enzimmennyiség

A táblázat adatai alapján elmondható, hogy mindkét közeg használatával azonos hozamot tudtam elérni, bár eltér

körülmények alkalmazására volt szükség. A

legjelent sebb eltérés a két reakcióelegy között az, hogy ionos folyadék használata esetén töményebb oldatban is lejátszódik a folyamat. Ez azzal a már mások által is tapasztalt ténnyel magyarázható, hogy az ionos folyadék kedvez bb környezetet biztosít az enzim számára [Lozano 2005, de Diego 2005], mint a szerves oldószer. A fönti megállapítást támasztja alá az is, hogy ionos folyadék használata mellett huszad annyi enzim kellett egy mmol tejsav észterezéséhez, mint toluolban, az enzim újrafelhasználhatósága jelent sen megn tt, illetve, hogy ionos folyadékban a használt enzim mennyiségének csökkentésével nem csökkent az egyensúlyi hozam. Különbség tapasztalható a legjobbbnak talált kiindulási víztartalomban is, ami arra utalhat, hogy a toluol polárosabb jelleg , mint a Cyphos 104, és jobban elszívja a vizet az enzim felületér l. Ennek ellentmond az a tény, hogy az ionos folyadékok logP értéke általában negatív [Ulbert 2004], tehát valószín leg a a korábban említett általános szabály az ionos folyadékok esetén nem érvényes. A toluolban végrehajtott reakció egyetlen pozitívuma a rövidebb reakcióid . Amennyiben az ionos folyadékban megnöveljük a lipáz tömegét 50 mg/mmol tejsav-ra, ugyanúgy 8 óra reakcióid t kapunk és a szükséges enzim mennyisége még mindig csak az ötöde a toluolban alkalmazottnak. - 86 -

Végkövetkeztetéseként elmondhatjuk, hogy a tejsav enzimes észterezését sikerült megvalósítani a szerves oldószerek közül toluolban és a foszfónium típusú ionos folyadékok közül Cyphos 104-ben és Cyphos 202-ben. Cyphos 104-ben végrehajtva a reakciót az ionos folyadék több szempontból (pl. nagyobb savkoncentráció, kisebb mennyiség enzim, jobb újrafelhasználhatóság) kedvez bb közegnek bizonyult, mint a szerves oldószer. Megállapítottam továbbá, hogy más foszfónium típusú ionos folyadékok, mint pl.: Cyphos 163, Cyphos 166, Cyphos 106, Cyphos 102 maguk is katalizálják az észterezést, ezzel lehet séget nyújtva egy alternatív katalízist használó észterezés lejátszatására, ha feladjuk azt az igényünket, hogy enzimkatalízissel természetes anyagot állítsunk el . Az általam vizsgált ionos folyadék család több tagjairól Marták és munkatársai [Marták 2007, Marták 2008] bebizonyították, hogy alkalmasak a tejsav fermentléb l való kinyerésére, így – a kísérleti munkám eredményei alapján – lehet ség nyílik egy kombinált eljárás kidolgozására, amiben az extrahálószerben végrehajtható az észterezési reakció, ezzel megspórolva egy költséges elválasztási lépést. Ezen technológia kidolgozása nem volt a doktori munkám feladata, de a lehet ség fennállását bizonyították a méréseim.

5.3 Mikrohullámú h közléssel végrehajtott kísérletek A minimális környezeti terhelést jelent , a „zöld” kémiai követelményeknek megfelel reakciók végrehajtására egyre nagyobb az igény és a törekvés. Ennek egyik új megvalósítási módja a mikrohullámú sugárzás, mint h forrás használata, mivel ez egy tiszta, kényelmesen használható, gyors és hatékony energiaközlési mód, mely sok esetben a reakció valamely pozitív változásával is jár [Yadav 2006]. Ilyen változás, pl. a megnövekedett

enantioszelektivitás,

hozam,

vagy

lecsökkent

reakcióid .

A

mikrohullámú sugárzás vonzerejét még az sem csökkenti, hogy sok esetben nem tisztázott a tapasztalt jelenségek magyarázata [Asikkala 2008]. Az intenzív kutatások ellenére még mindig meglév

számos nyitott kérdés

érdekessé és kihívásokkal telivé teszi az ezen a területen végzett munkát.

- 87 -

5.3.1

Kísérleti berendezés A kísérleteket egy CEM Discover, BatchMate típusú (CEM Corporation, USA)

mikrohullámú reaktorban végeztem (5-13 ábra). A készülék egy monoüzem reaktor, tehát egyid ben csak egy reakció játszatható le benne. A reakcióelegy térfogata – a használt reakcióedényt l függ en – 200 l-t l 300 ml-ig terjedhet. Az általam használt reakcióedény 200 l - 4 ml térfogatú reakciók lejátszatására volt alkalmas (5-13. ábra). A készülékben a h mérséklet precíz mérése száloptikás vagy infravörös szenzor segítségével

történhet,

melynek

révén

pontos

és

megbízható

(±

1

°C)

h mérsékletszabályozás érhet el minimális mennyiség reakcióelegy esetén is.

5-13. ábra: A mikrohullámú reaktor és a vezérlést végz számítógép (balra), illetve a reakcióedény (jobbra).

A készülék speciális h t rendszerrel (PowerMAX®) volt ellátva. Zárt, kisebb térfogatú vagy nyomás alatti mérések esetén a h t közeg s rített leveg , míg nyitott reakcióedény használata esetén az el bbi mellett vízh tés (pl. visszacsepeg

h t )

alkalmazására is lehet ség volt. A h tési funkciót besugárzás közben is lehetett használni, ezzel fokozva a felhasznált mikrohullámú energiát, és növelve annak pozitív hatását a kémiai reakcióra [Kappe 2007]. A készülék beépített billenty zettel rendelkezett, de számítógépr l is vezérelhet volt. Én a második megoldást használtam, mivel a vezérl szoftver a h mérséklet, a - 88 -

nyomás és a leadott teljesítmény folyamatos monitorozását is lehet vé tette. A reakcióelegy homogenitását mágneses kever biztosította.

5.3.2

Kísérleti módszer A rázatott lombikban végrehajtott kísérletekhez képest tulajdonképpen csak a

h forrást változtattam meg, de az eddigiekt l eltér kialakítás miatt néhány kisebb változtatást kellett alkalmaznom a reakcióelegy el készítésében. Ett l eltekintve a reakcióelegyek összetétele a következ volt: 25 mg enzim, 2 mmol monomer tejsav, 14 mmol etanol, 0,67 ml ionos folyadék és 3 tömeg % kiindulási víztartalom. A reaktor speciális volta miatt a kísérletsorozat elkezdése el tt meg kellett határozni azt az energiamennyiséget, amely a reakció elindításához szükséges, hogy a lehet legrövidebb id alatt és a legkisebb túlf téssel lehessen a kívánt h mérsékletet elérni. (A mikrohullámú készüléken lehet ség volt a reakció megindításakor használt energiamennyiség beállítására, de a reakció folyamán, természetesen a beállított h mérséklet

alapján

a

készülék

már

maga

szabályozta

a

felhasznált

energiamennyiséget.) A reakcióeleggyel végzett el kísérletek alapján elmondható, hogy kb. 10 W energia elég 40 °C-on a reakciók lejátszatásához. A szükséges teljesítmény sok tényez t l függ, ilyen az elérend h mérséklet, a reakcióelegy összetétele, térfogata és a mikrohullámú reaktor kialakítása is [Toukoniitty 2005, Yu 2012]. Ez az oka, hogy nehéz

összehasonlítani

a

különböz

szerz k

által

szükségesnek

ítélt

energiamennyiségeket. Erre bizonyíték, pl. Arfan és munkatársának közleménye. Ebben egy észterezésr l számolnak be, az általam vizsgálthoz nagyon hasonló körülményeket használva – mono üzem

mikrohullámú reaktor (Synthewave 402) ionos folyadék

közeg ([C4py][HSO4]) – mégis kissé nagyobb energiamennyiségre volt szükségük. A reakció 80 °C-on történ

lejátszatásához 75 W energiát használtak [Arfan 2005].

Emellett el fordulnak néhány 100 W energia felhasználásáról szóló publikációk is [Toukoniitty 2005, Fang 2008], bár sok esetben ez az adat egyszer en hiányzik, és csak a reakció h mérsékletét közlik a szerz k. Annak vizsgálatához, hogy a mikrohullámú sugárzás milyen hatást gyakorol a reakció egyes komponenseire (enzim, ionos folyadék) stabilitási méréseket végeztem. Ennek során 2 óráig mikrohullámú sugárzással kezeltem az egyes reakcióelegy komponenseket 40 °C-on, majd a reakcióelegy többi összetev jével kiegészítettem ket,

- 89 -

rázó inkubátorban reakciót indítottam velük, és a 24 óra alatt elért hozamokat összehasonlítottam. A mikrohullámú sugárzással terhelt rendszerek összetételét a lenti táblázatban gy jtöttem össze. A könnyebb érthet ség kedvéért a táblázatban a megnevezés mellett felt ntettem az 5.3.3 fejezetben használt rövidítéseket és a kontroll reakciókat, amelyekhez az egyes méréseket hasonlítottam: 5-11. táblázat: A stabilitási vizsgálatok során használt terhelt rendszerek és a kontroll reakcióik.

Rövidítés IL

Megnevezés és mennyiség 0,67 ml Cyphos 104 ionos folyadék 25 mg Novozyme 435 immobilizált

Enz

lipáz 0,67 ml Cyphos 104 + 25 mg

IL+Enz

Novozyme 435

IL+Enz+Alk

0,67 ml Cyphos 104 + 25 mg Novozyme 435 + 14 mmol etanol

Kontroll reakció, amire a mérést vonatkoztattam K1/a K1/a, (K1/b) K1/a K2

Az eredmények értékeléséhez a következ kontroll reakciókat hajtottam végre: • K1/a: Kontroll1/a, melyben a komponensek mikrohullámú el kezelése nélkül

játszattam le a reakciót rázó inkubátorban. • K1/b: Kontroll1/b, melyben az enzimet el z leg rázó inkubátorban h kezeltem

2 óra hosszat 40 °C-on. • K2: Kontroll 2, melyben 14 mmol etanol, 670 l ionos folyadék és 25 mg

enzim elegyét el z leg rázó inkubátorban 2 óra hosszat 40 °C-on h kezeltem. Annak megállapítása érdekében, hogy milyen hatása van a mikrohullámú sugárzásnak az etil-laktát el állítására az 5-9. táblázatban látható 7 foszfónium típusú ionos folyadékban, a fejezet elején leírt elegyösszetétel alkalmazása mellett hajtottam végre a reakciót. A kapott eredményeket a konvencionális f tés mellett elértekkel összehasonlítva értékelem.

- 90 -

5.3.3

Eredmények és értékelésük A mikrohullámú sugárzással, Cyphos 104 ionos folyadékban végrehajtott els

kísérletek során meglep dolgot tapasztaltam: A reakció jelent sen kisebb hozammal ment végbe, mint konvencionális h közlés mellett. Ennek alapján az enzim mikrohullámú sugárzás általi inaktivációjára vagy az ionos folyadék elbomlására gyanakodtam. Ennek ellentmondott, hogy vannak irodalmi hivatkozások, melyek arról szólnak, hogy a Novozyme 435 aktivitása javul mikrohullámú h közlés mellett [Yu 2007] illetve, hogy mikrohullámú sugárzás alkalmazható, pl. imidazólium és piridinium alapú ionos folyadékokkal [Lundell 2005]. Foszfónium típusú ionos folyadékok mikrohullámú sugárzással történ használatáról nem jelent meg még publikáció, de Bradaric és kutatócsoportja szerint konvencionális h közlés mellett h stabilitásuk nagyobb, mint a megfelel

ammónium és imidazólium sóké [Bradaric 2003]. Ez

indokolta, hogy a tapasztalt jelenség okának kiderítésére stabilitási méréseket végezzek, amiknek eredményét a következ ábrán foglaltam össze:

100

relatív hozam (%)...

80 60 40 20 0 K1/a

IL

enz

K1/b IL+enz inkubált rendszer

K2

IL+enz+alk

5-14. ábra: Stabilitási mérések mikrohullámú h közlés mellett.

A fenti diagramot a következ képpen lehet értelmezni: Az ábra 2. oszlopa alapján a mikrohullámú sugárzásnak nem volt maradandó hatása a Cyphos 104-re, hiszen annak mikrohullámú el kezelése után azonos hozamot kaptam, mint a konvencionális h közléssel lejátszatott reakcióban (Kontroll1/a).

- 91 -

Ezzel szemben az ábra 3. oszlopát megfigyelve az enzim mikrohullámú kezelése után, a vele lejátszatott reakcióban a kontrollhoz képest csak 72 % hozamot értem el. Ennek a csökkenésnek az oka valószín leg nem a mikrohullámú sugárzás, hanem az a tény, hogy az enzimek nem stabilak oldószer nélkül magasabb h mérsékleten, még akkor sem, ha immobilizáltak. Ezt igazolja, hogy a Kontroll 1/b reakció (ahol mikrohullám helyett konvencionális h közléssel történt az enzim h terhelése), vele egyez eredményt adott. Az eddigi kísérletek után, meglep módon az enzim és az ionos folyadék együttes terhelése a reakció hozamának drasztikus csökkenéséhez vezetett (5. oszlop). A jelenség magyarázata az, hogy az ionos folyadék nagy viszkozitása miatt a keverés nem volt megfelel , és lokális túlmelegedés lépett föl, ami az enzim denaturációjához vezetett. Tehát valószín leg ez volt az oka az els kísérletek során tapasztalt csökkent hozamnak. A probléma felismerése után a megoldás magától adódott, a reakcióelegy el zetes homogenizálásával a benne lév etanol már eléggé lecsökkentette a viszkozitást, hogy ne legyenek keverési problémák. Ezek után még mindig fennáll a kérdés, hogy vajon a mikrohullámú sugárzás milyen hatással van az enzimre? Ennek a kísérletnek az eredménye látható az ábra utolsó két oszlopán, és elmondható, hogy miután az el z ekben leírtakat figyelembe vettem a kísérlet közegének megválasztásánál, a kontrollal (Kontroll2) azonos hozamot értem el. Ez arra utal, hogy nincs maradandó hatása a mikrohullámú sugárzásnak az enzimre, ami természetesen még nem zárja ki, a besugárzás id tartama alatt pozitív hatások jelentkezését. Az általam tapasztaltak egybevágnak Parker és kutatócsoportjának eredményeivel kutinra specifikus lipáz esetén [Parker 1996]. Mikrohullámú sugárzás hatását vizsgálva a különböz

ionos folyadékokban a

kapott eredmények alapján (5-12. táblázat) két megállapítást tehetünk: 1.) Az ionos folyadékokat két csoportra oszthatjuk abból a szempontból, hogy a mikrohullámú h közlés okozott-e bármilyen javulást a reakció lefutásában: Voltak ionos folyadékok, amikben nem tapasztaltam jelent s különbséget konvencionális és a mikrohullámú h közléssel a reakció lefutása között. Ezzel szemben Cyphos 202, Cyphos 163, Cyphos 166 és Cyphos 102 esetén az egyensúlyi hozam eléréséhez szükséges id hozam megn tt. A reakcióid

lerövidült, illetve a maximális

felére, harmadára való csökkenése jó

- 92 -

összhangban van más szerz k tapasztalataival [Parker 1996, Roy 2003, Bachu 2007]. 2.) Két esetben mikrohullámú h közlés mellett és egy esetben konvencionális h közlés alkalmazása során kapott észter hozam meghaladta a monomer tejsav mennyisége alapján számolt maximális hozamot (100 %-ot). 5-12. táblázat: Mikrohullámú sugárzás hatása az észterezési reakcióra különböz ionos folyadékok esetén.

Konvencionális h közlés

Mikrohullámú h közlés

hozam / reakcióid

hozam / reakcióid

Cyphos 202

95 % / 24 óra

106 % / 8 óra

Cyphos 163

104 % / 8 óra

104 % / 4 óra

Cyphos 166

90 % / 24 óra

93 % / 7 óra

Cyphos 102

60 % / 24 óra

65 % / 7 óra

IL neve

Cyphos 104

Nincs hatás

Cyphos 110

Nincs hatás

Cyphos 106

Nincs hatás

Annak magyarázata, hogy milyen különbség okozta a két csoport kialakulását, nagyon nehéz. Hasonló típusú kísérletekben – 21 különböz

(imidazólium és

piridínium) típusú ionos folyadékban és 5 szerves oldószerben az etil-butirát 1butanollal történ enzimes átészterezésének vizsgálata során – Zhao és munkatársai sem találtak egyértelm

összefüggést a mikrohullámú sugárzás hatására tapasztalt

enzimaktivitás és a reakcióközeg tulajdonságai között. Megfigyeléseik alapján a kezdeti reakciósebesség nem hozható közvetlen kapcsolatba se a viszkozitással, se a polaritással, és csak kismérték korreláció figyelhet meg a logP értékkel [Zhao 2009b]. Annak magyarázata, hogy hogyan keletkezhetett a kiindulási monomersav tartalomnál (100 %-nál) nagyobb hozam, talán kicsit egyszer bb. Ehhez elméletileg az szükséges, hogy a reakcióelegyben lév

tejsav dimerek (laktilsav, laktid) képesek

legyenek monomer tejsav molekulákká bomlani a reakció körülményei között, és elreagálni etil-laktáttá. Engin és munkatársai [Engin 2003] azt tapasztalták, hogy se a h mérséklet változása, se katalizátor (ioncserél gyanta) hozzáadása nem befolyásolja a tejsav és a laktilsav közötti dinamikus egyensúlyt. A megnövekedett víztartalom azonban – az észterezési reakció körülményei között – már a laktilsav hidrolízisét - 93 -

okozták. A különböz h mérsékleteken inkubált tejsav híg vizes oldatának sav-bázis titrálása során a saját mérési eredményeim is azt mutatták, hogy a nagy víztartalom és a megemelt h mérséklet együttesen sem okozzák a laktilsav tejsavvá történ hidrolízisét, de a h mérséklet, a katalizátor és a reakcióban keletkez víz együttesen a fönti mérések eredménye alapján már kiváltják ezt a hatást. Ennek igazolására a reakcióelegy tejsav komponenseinek összetételét HPLC-vel vizsgáltam a reakció során Cyphos 202 ionos folyadékban. A konvencionális és mikrohullámú h közlés alkalmazása mellett mért tejsav elegy összetételeket az alábbi két diagrammon ábrázoltam (5-15. ábra és 5-16. ábra). A mérési pontokat úgy választottam meg, hogy a reakcióelegy elkészítése után vettem mintát (kiindulás), majd a reakció els szakaszából több ponton és az egyensúlyi észter hozam elérését követ en. Mikrohullámú h közlés esetén a reakció 8 óra alatt végbement, ez okozta a két kísérlet

tejsav összetétel (tömeg %)...

vizsgálati pontjaiban az eltérést.

100%

8

80%

32

9

10

38

40

60

53

50

kiindulás

3

7

7 34

60% 40% 20%

laktid laktilsav tejsav

58

0% 24

reakcióid (óra)

5-15. ábra: A tejsav komponenseinek összetétele a reakcióelegyben az észterezés során konvencionális h közlés mellett.

- 94 -

tejsav összetétel (tömeg %)...

100% 80%

8 33

8

10

11

10

43

45

43

42

49

46

46

47

0.1

2

4

8

60% 40% 59 20%

laktid laktilsav tejsav

0% kiindulás

reakcióid (óra)

5-16. ábra: A tejsav komponenseinek összetétele a reakcióelegyben az észterezés során mikrohullámú h közlés mellett.

A HPLC mérések eredményét a következ képpen értelmezhetjük: • A kiindulási reakcióelegyben végrehajtott folyadékkromatográfiás mérés

igazolta a sav-bázis titrálás alapján számolt tejsav komponens összetételt. (A HPLC méréssel kapott százalékos értékek a víztartalmat nem tartalmazzák.) • Konvencionális h közlés esetén a monomer tejsav (laktilsavhoz és laktidhoz

képesti) aránya lassan csökken a reakció els szakaszában, ami várható, hiszen az etil-laktát keletkezése fogyasztja azt. Az utolsó mérési pontban, a reakció végén viszont újra a kiinduláskor tapasztalt értékre (58 tömeg %-ra) emelkedett, ami csak akkor lehetséges, ha a reakció során a tejsav keletkezése is végbemegy. Engin és kutatócsoportja szerint a laktilsav hidrolízise egy nagyon lassú folyamat, ezért az etil-laktát szintézis sebesség-meghatározó lépése lehet [Engin 2003]. Ez a megfigyelés egybevág az általam tapasztaltakkal, miszerint a vizsgált észterezési reakciók körülményei között a monomer tejsav nem keletkezik nagy mennyiségben a dimereib l, lásd 5-15. ábra, ahol a savak aránya csak kismértékben változott. Ezért valóban helytálló lehet a feltételezés, hogy a laktilsav bomlásának sebessége befolyásolja az etillaktát szintézis sebességét. • Mikrohullámú h közlés esetén a reakció kb. els

5 percében beáll egy

egyensúly a tejsav a laktilsav és a laktid mennyisége között, és ez az arány a - 95 -

reakció során nem változik, annak ellenére, hogy az etil-laktát keletkezése gyorsabban, nagyobb hozammal megy végbe, mint konvencionális h közlés mellett. Ez arra utal, hogy a tejsav amilyen sebességgel fogy az észterezési reakcióban, olyan sebességgel képes keletkezni a tejsav dimerekb l. Az, hogy ennek a két reakciónak a sebessége közel azonos, lehet vé teszi a szubsztrát tejsav elegy monomer-sav tartalma alapján számolt maximális hozam (100 %) felülmúlását. Mivel a h forráson kívül minden egyéb körülmény azonos a két reakcióban, a fönt leírt jelenség a mikrohullámú sugárzás (nem-h ) hatásának tulajdonítható. Összegzésként elmondható, hogy a mikrohullámú h közlés pozitív hatással volt az etil-laktát szintézisére 4 ionos folyadék közeg esetén. A reakciók közül egy enzimkatalizált és 3 az ionos folyadék által katalizált folyamat volt. A tapasztalt pozitív hatás magasabb hozamban és 2-3-szor rövidebb reakcióid ben nyilvánult meg. Cyphos 202 ionos folyadék esetén a mikrohullám egy újabb el nyös hatását sikerült igazolni, mégpedig, hogy a reakcióelegyben lév tejsav dimereinek hidrolízisét meggyorsítva lehet vé teszi a szubsztrát tejsav elegy monomer-sav tartalma alapján számolt maximális hozam (100 %) felülmúlását.

5.4 Víztartalom szabályozás pervaporációval és zeolittal A mikrohullámú sugárzással végrehajtott kísérletek rávilágítottak arra, hogy a víztartalomnak egyedi szerepe van az etil-laktát el állítása során. Hogy ezt a szerepet alaposabban megvizsgáljam, víztartalom szabályozás mellett hajtottam végre ionos folyadék közegben az észterezési reakciókat. Biokatalitikus reakciókban keletkez

víz elvonására különböz

léteznek. Ezek közül a legegyszer bb valamely molekulasz r

technikák

reakcióelegybe

helyezése, bár ennek hátránya, hogy el fordulhat túlzott vízelvonás, ezért a hozzáadott molekulasz r mennyiségét és az adagolás idejét optimalizálni kell. A molekulasz r t kolonnába töltve és a reakcióelegyet azon átáramoltatva az el z megoldás sok káros hatása kiküszöbölhet . Még mindig hátrány marad azonban, hogy a molekulasz r csak véges mennyiség vizet tud adszorbeálni, ezért nem lehet vele folyamatos vízelvonást megvalósítani, ezen kívül a méretnövelése is nehézkes. További lehetséges technikák a

- 96 -

vákuum használata, (nitrogén) gáz átbuborékoltatása, azeotróp desztilláció és a talán legkedveltebb, a pervaporáció [Park 2003, Guo 2007, Yan 1999, Findrik 2012b]. A lehet ségek számbavétele után a víztartalom szabályozást a két legelterjedtebb módszerrel, pervaporációval és zeolitos adszorpcióval hajtottam végre. Az így kivitelezett mérések az eddigi kísérletekhez képest egyben a reakció méretnövelését és egy kombinált eljárás megvalósítását is jelentették.

5.4.1

Kísérleti berendezések A pervaporációval kombinált észterezési reakció lejátszatását a következ

folyamatábrán látható rendszerben hajtottam végre (5-17. ábra):

5-17. ábra: Pervaporációs víztartalom szabályozással kombinált eljárás etil-laktát el állítására.

A bioreaktor egy kb. 50 ml térfogatú, duplafalú lombik. A membránmodul egy saválló acél köpeny , termosztálható egység, melyben síklap membrán helyezkedett el (szabad átmér : 3,9 cm, átadási felület: 12 cm2). A reakcióelegy pulzálásmentes, egyenletes keringetése a membránmodul és a bioreaktor között perisztaltikus pumpával, 30 ml/min áramlási sebességgel történt. Az enzimnek a bioreaktorból történ kiáramlását a perisztaltikus pumpa szívó ágának elején elhelyezett mechanikus sz r akadályozta meg. A reakcióelegy homogenitását mágneskever

biztosította. A

permeátumként keletkez víz gy jtését vákuum (kb. 1,3 kPa) segítségével, acetonos szárazjéggel h tött (-70 °C) csapdában valósítottam meg. A vákuum szivattyú védelmének érdekében a melléktermék gy jtéséért felel s edény után további biztonsági csapdákat

helyeztem.

Az

így

kialakított

rendszerben

(a

csövekben

és

a

membránmodulban) visszatartott anyagmennyiség (hold-up) 19 ml volt. Az észterezési

- 97 -

reakció szempontjából a folyamat szakaszosnak, míg a vízelvonás szempontjából folyamatosnak tekinthet . A zeolitos vízelvonással kombinált észterezési reakció lejátszatását a következ folyamatábrán látható rendszerben hajtottam végre (5-18 ábra):

5-18. ábra: Zeolitos adszorpcióval történ víztartalom szabályozással kombinált eljárás etillaktát el állítására.

A bioreaktort ebben az esetben egy molekulasz r vel töltött adszorberrel kötöttem össze. Ez tulajdonképpen egy 2,0 cm bels

átmér j , 6,5 cm magasságú,

duplafalú üveg oszlop volt, amelyben 40 g 3A zeolit töltet fért el. Az így kialakított rendszerben (a csövekben és az adszorberben) visszatartott anyagmennyiség (hold-up) 34 ml volt. Mivel a zeolit id vel telít dik vízzel, ezért ezt a folyamatot a vízelvonás szempontjából is szakaszosnak kell tekinteni.

5.4.2

Kísérleti módszer Mind pervaporáció, mind zeolitos adszorpció esetén a reakcióelegy összetétele a

következ volt: 18 ml Cyphos 202 ionos folyadék, 0,42 mol etanol, 0,06 mol monomer tejsav (8,4 ml tejsav oldat), 3 tömeg % kiindulási víztartalom és 750 mg enzim. Az észterezést 40 °C-on hajtottam végre 13 óra reakcióid t alkalmazva, mivel mindkét típusú vízelvonás mellett ennyi id

alatt már leállt az észterképz dés. A

reakciók közegeként Cyphos 202 ionos folyadékot használtam, hogy az itt kapott eredményeket összehasonlíthassam a mikrohullámú h közlés mellett tapasztaltakkal.

- 98 -

Pervaporációs rendszernél az elvett vízben gazdag permeátum mennyiségét és víztartalmát, ezen kívül a reakcióelegy észter és víztartalmát követtem nyomon. Zeolitos adszorpció esetén a lejátszódó folyamatok követésére csak a reakcióelegyb l volt lehet ség, ezért ennek tejsav, észter és víztartalmát mértem. Modelleleggyel végrehajtott el kísérletekre volt szükség mindkét típusú vízelvonás használata el tt.

a.) Pervaporáció esetén a megfelel membránt kellet kiválasztani. Ehhez etanol : víz = 95 térfogat % : 5 térfogat % arányú elegyét használtam, 40 °C-on végrehajtva az elválasztást. Delgado és munkatársai végeztek pervaporációs kísérleteket bináris – víz / etanol, víz / etil-laktát és víz / tejsav – elegyekb l hidrofil lapmembránnal vízeltávolítás céljából. Azt tapasztalták, hogy a permeátum víztartalma víz / tejsav elegy illetve víz / alkohol elegy elválasztásakor közel azonos (kb. 95 tömeg %), és a betáplált folyadék víztartalmától független. Ett l eltér en víz / észter elegy esetén – ha 20 tömeg %-nál kisebb az elválasztandó elegy víztartalma – a permeátum víztartalma kb. 80-90 tömeg % között változik a betáplált elegy víztartalmának csökkenésével. Ezen kívül kimutatták, hogy a teljes permeátum fluxus növekedett a következ sorrendben: etanol etil-laktát < tejsav mell l történ elválasztás, amit az utolsó esetben a membrán nagyobb duzzadásával magyaráztak. Megállapították továbbá, hogy mindhárom vizsgált elegy esetén a fluxus n

a betáplált elegy víztartalmának növekedésével és az

elválasztás h mérsékletével [Delgado 2008]. Ezek alapján azt a következtetést vontam le, hogy reakcióelegy pervaporációjakor érdemes megvizsgálni a permeátum észter tartalmát, de a többi komponens szempontjából a használt elegy megfelel en modellezi a reakcióelegyb l történ vízeltávolítást.

b.) Molekulasz r

használata esetén, annak adszorpciós kapacitását kellett

meghatározni a fenti modelloldat segítségével. Erre két okból volt szükség. Az els , hogy meg tudjam becsülni, hogy a pervaporációhoz képest összemérhet kapacitás áll-e a rendelkezésemre az észterezési reakcióban keletkez víz eltávolításához. A második, hogy csak ebb l a kísérletb l tudtam következtetni arra, hogy az észterezési reakció során mennyi vizet távolít el a zeolit. Erre az adatra azért volt különösen nagy szükség, mivel az eddigi kísérletek alapján a reakcióelegy víztartalmát több faktor párhuzamos hatása alakítja. Ezek közül víztartalom növekedéssel jár: • etil-laktát keletkezése, • a tejsav dimerizációja laktilsavvá (és/vagy laktiddá).

- 99 -

A víztartalom csökkenését okozza: • a laktilsav (és/vagy laktid) hidrolízise tejsavvá, • adszorpció a molekulasz r n.

Az el kísérletek után mindkét vízelvonás mellett végeztem észterképzési kísérleteket, és a tapasztaltakat összehasonlítottam az azonos összetétellel, de vízelvonás nélkül, konvencionális és mikrohullámú h közléssel végrehajtott reakciók eredményeivel.

5.4.3

Eredmények és értékelésük El kísérletek

a.) Az 5-10. táblázatban foglaltam össze a pervaporáció során tesztelt hidrofil síklap membránokat és azok hatékonyságát. A táblázat adatai alapján a STANDARD nev membránt megfelel nek ítéltem a kísérletek folytatására. 5-13. táblázat: Hidrofil síklap membránok tesztelése.

Membrán neve

Fluxus

Permeátum víztartalma

(kg/m2h)

(tömeg %)

Pervap 2205

0,03

69

Pervap 2201

0

-

Pervap 2211

0,04

40

Pervap 2216

0

-

CMC-CF-23

0

-

STANDARD

0,04

98

0

-

GFT 1005

0,08

72

GFT 2001

0

-

STANDARD 95 °C

b.) Az adszorber kapacitásának megállapítása az 5-18. ábra alapján lehetséges. Az ábra és a modellelegy térfogata, illetve összetétele alapján kiszámolható, hogy a használt mennyiség molekulasz r vel 0,6 mmol/ml víztartalom csökkenést sikerült elérni (reakcióelegy térfogatára vonatkoztatva). Ez nagyságrendileg megegyezik a modellkísérlet adatai alapján a 13 óra pervaporációval eltávolítható víz mennyiségével (0,69 mmol/ml). - 100 -

víztartalom (tömeg %)...

6 5 4 3 2 1 0 0

2

4

6

8

10

12

14

id (óra) 5-19. ábra: Zeolitos adszorpcióval eltávolítható víz mennyisége (modelleleggyel kimérve).

Különböz típusú vízelvonások hatása a reakcióra Az el kísérletek és a membrán kiválasztása után elvégeztem az enzimes észterezést különböz mechanizmusú víztartalom szabályozások mellett és vízelvonás nélkül is. Az 5-19. ábra az elért észter hozamokat mutatja a reakcióid függvényében, míg az 5-20. ábra a víztartalom változását a reakció során. Az ábrák nem tartalmazzák, de a további értékelés szempontjából fontos eredmény, hogy az ionos folyadék közeg

reakcióelegy pervaporációja során a

modelleleggyel kimértnél alacsonyabb fluxust tapasztaltam (J: 0,015 kg/(m2h)). Ez részben magyarázható a modellelegynél kisebb víztartalommal, ami Delgado és kutatócsoportja szerint a fluxus csökkenését okozza [Delgado 2008], másrészt a viszkózus ionos folyadék is kiválthatta a membrán kismérték eltöm dését. Ez alapján a zeolitos adszorpció gyorsabb vízelvonási technikának tekinthet , különösen a folyamat elején, amikor a száraz molekulasz r reakcióelegy víztartalmával.

- 101 -

el ször találkozik a

100 rázatott lombik pervaporáció zeolit

hozam (%)

80 60 40 20 0 0

2

4

6

8

10

12

14

reakcióid (óra) 5-20. ábra: Az etil-laktát hozam két különböz típusú víztartalom szabályozási technika alkalmazása mellett, illetve vízelvonás nélkül.

víztartalom (tömeg %)...

rázatott lombik

pervaporáció

zeolit

4

3

2 0

1

3

5

7

9

11

13

reakcióid (óra) 5-21. ábra: A tejsav észterezése során a reakcióelegy víztartalmának alakulása két különböz típusú víztartalom szabályozási technika alkalmazása mellett, illetve vízelvonás nélkül.

Az eredményeket a következ képpen értelmezhetjük: Az 5-20. ábra azt mutatja, hogy az észter hozam csökkent a vízelvonás hatására, szemben a vízelvonással kombinált

- 102 -

észterezési reakciókban általában [Gubicza 2008, Fehér 2009] tapasztaltakkal. A két kombinált m velet közül pervaporációval értem el magasabb hozamot. Zeolitos adszorpció esetén az észterezési reakció sokkal lassabban érte el az egyensúlyi hozamot, bár a reakcióid

végére megközelítette a pervaporáció mellett keletkez

termék

mennyiségét (31 illetve 33 % hozam). Az 5-21. ábra alapján látható, hogy a víztartalom szabályozás megtörtént mindkét esetben, de a nagyobb vízelvonó képesség ellenére zeolit használata esetén volt magasabb a reakcióelegy víztartalma. A reakciók során a víztartalmat több paraméter egyidej leg befolyásolja, ezért az eredmények helyes értelmezése meglehet sen bonyolult. A szemléletesség kedvéért anyagmérleget állítottam föl a reakciókban keletkez víz és észter mennyiségére (5-14. táblázat). A táblázat a mikrohullámú h közlés mellett (vízelvonás nélkül), de ett l eltekintve azonos körülmények között lejátszatott reakció eredményeit is tartalmazza. 5-14. táblázat: Anyagmérleg a reakcióban 13 óra alatt keletkez termékekre különböz reakciótípusok esetén.

Koncentráció (mmol/ml)

Reakció típusa Rázatott lombik Mikrohullámú sugárzás Pervaporációs vízelvonás Zeolitos vízadszorpció

Víz

Észter

Reakcióelegyben*

Eltávolított

Összes

Összes

0,65

0

0,65

0,7

1,00

0

1,00

1,20

0,24

0,26

0,50

0,39

0,46

0,61**

1,07

0,36

*: A reakcióelegy kiindulási víztartalmával korrigálva. **:Az etanol-víz eleggyel végzett el kísérlet alapján becsült.

- 103 -

A táblázatban lév adatok 3 tényt bizonyítanak: 1) Víztartalom szabályozás nélkül a keletkez termék etil-laktát mennyisége kissé nagyobb, mint a keletkez víz mennyisége, annak ellenére, hogy – a tejsav etanollal való észterezésének reakcióegyenlete alapján – sztöchiometrikus arányban kellene keletkezniük. Ez magyarázható azzal az irodalomban is megtalálható adattal, hogy a laktilsav hidrolízise (lassan, kis mértékben) végbemegy a tejsav észterezésének körülményei között a megnövekedett víztartalom hatására, ez pedig vízfogyással jár [Engin 2003]. 2) Mikrohullámú besugárzás hatására a laktilsav tejsavvá történ visszaalakulása felgyorsul, ami meggyorsítja az etil-laktát szintézisét (lásd 5.3 fejezet), és lecsökkenti a víztartalmat. Ez az oka, hogy mikrohullámú h közlés mellett nagyobb különbég (0,2 mmol/ml) tapasztalható a keletkezett víz és észter mennyisége között, mint rázatott lombikban (konvencionális h közlés mellett) lejátszatott reakció esetén (0,05 mmol/ml). 3) Az el z ekkel ellentétben mindkét esetben, mikor vízelvonást alkalmaztam, a keletkezett víz mennyisége nagyobb volt, mint a keletkezett észteré. A vízelvonás hatására kialakult magasabb víztartalom els re ellentmondásnak t nik, de magyarázható azzal, hogy az etil-laktát szintézis mellett a tejsav dimerizációja is végbemegy – ami víz keletkezésével jár – és ez eredményezi az észtertartalomnál magasabb víztartalmat a reakcióelegyben. Minél nagyobb vízelvonási sebességet alkalmaztam (pervaporációról zeolitos adszorpcióra való áttérés), annál nagyobb mértékben ment végbe a tejsav dimerizációja, és annál több víz keletkezett. Továbbá azért mert a dimerizáció, mint mellékreakció, a tejsavat fogyasztja, alacsonyabb etil-laktát hozam volt tapasztalható, mint vízelvonás nélkül. A fenti elméletet HPLC méréssel is sikerült alátámasztanom, melyben a reakcióelegy savtartalmát vizsgáltam, és az így kapott eredményeket összehasonlítottam az észter és víztartalom eredményekkel zeolitos adszorpció esetén (5-22. ábra).

- 104 -

tejsav

laktilsav

észter

koncentráció (mmol/ml) ...

1,60 1,40 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0,20 0,00 0

3

7

11

13

reakcióid (óra) 5-22. ábra: A reakcióelegy tejsav, laktilsav és észter tartalma zeolitos adszorpcióval végrehajtott víztartalom szabályozás mellett.

Az ábra azt mutatja, hogy 13 óra alatt 0,66 mmol/ml-el csökkent a tejsav koncentrációja (tejsav koncentráció kiinduláskor: 1,5 mmol/ml, reakció végén: 0,84 mmol/ml), de csak 0,36 mmol/ml észter keletkezett. A tejsav fönnmaradó része a dimerizációs reakcióban fogyott el laktilsav és víz keletkezése közben, ami egybevág a reakcióelegyben kialakult észter-víz aránnyal (5-14. táblázat). Végkövetkeztetésként elmondható, hogy a mérések alapján a tejsav észterezése során több egyensúlyi reakció játszódik le egyid ben. Ezek a következ k:

1.)

tejsav + etanol

2.)

2 tejsav

tejsav-etil-észter + víz laktilsav + víz

Konvencionális h közléssel, de víztartalom szabályozás nélkül lejátszatva az etillaktát szintézisét a 2.) reakció kis mértékben lejátszódik, és a hidrolízis irányába van eltolva, ez okozza a különbséget a méréssel meghatározott észter és víz mennyiségében.

- 105 -

Mikrohullámú h közlés katalizálja a laktilsav hidrolízisét, aminek folytán a rendszer sebesség-meghatározó folyamata gyorsabbá válik és ez jótékony hatással van az etil-laktát szintézisére. Vízelvonás hatására a laktilsav keletkezése megy végbe, ami növeli a reakcióelegy víztartalmát, és közben csökkenti az elérhet észter hozamot azáltal, hogy a szabad tejsavat fogyasztja. Az etil-laktát szintézise során tehát a tejsav dimerizációja a víz és a vízelvonás szerepe nagyban különbözik a gyümölcsaroma szintézisekt l – etilacetát [Gubicza 2008], izoamil-acetát [Fehér 2009] – amikor a vízelvonás jelent s hozamnövekedéssel járt együtt. Ebben a reakcióban a víztartalom szabályozása a hozam csökkenését eredményezte, egyedi jelleget adva a reakciónak és a végrehajtásra legmegfelel bb reakcióparamétereknek.

- 106 -

6 Összefoglalás Doktori munkám során egy, a gyógyszeripar és az élelmiszeripar által egyaránt használt természetes aroma, az etil-laktát szintézisét vizsgáltam többféle nemkonvencionális, a „zöld” kémia követelményeinek eleget tev körülmény alkalmazása mellett. A reakció lejátszatását etanol és tejsav szubsztrátok alkalmazása mellett, immobilizált Candida antarctika lipáz katalizátorral két szerves oldószer és 12 ionos folyadék közegben vizsgáltam. Az ionos folyadékok közül a foszfónium kationt tartartalmazók – melyekr l bebizonyították, hogy használhatók a tejsav fermentléb l való kinyerésére – megfelel nek bizonyultak az észterezési reakció lejátszatására is, ezzel lehet séget adva egy kombinált eljárás kidolgozására a tejsav egy közegben történ kinyerésére és feldolgozására. A vizsgált szerves oldószerek közül a toluolt találtam megfelel közegnek. A foszfónium típusú ionos folyadékok közül 6-ban legalább 60 % hozammal végbement a reakció, de csak a Cyphos 104 és Cyphos 202 volt alkalmas enzimes észterezés végrehajtására. A többi közeg maga is katalizálta az észterezést. Toluolban és Cyphos 104-ben vizsgáltam az egyes paramétereknek a reakcióra gyakorolt hatását, és végrehajtottam az észterezés legalkalmasabb paramétereinek meghatározását. A kapott eredmények alapján elmondható, hogy mindkét közegben közel azonos észter hozam érhet el (toluolban: 94 %, Cyphos 104-ben: 95 %), de az ehhez szükséges körülmények között jelent s eltérés tapasztalható. Ionos folyadékban töményebb oldatban megy végbe a reakció kisebb mennyiség lipáz használata mellett, ezen kívül az enzim visszaforgathatósága is jelent sen megn . Ezek a különbségek mind azt mutatják, hogy az ionos folyadék kedvez bb környezetet biztosít a lipáz számára. A kísérleteim következ szakaszában az ionos folyadékban lejátszódó reakciót mikrohullámú h közléssel hajtottam végre. Ezt a tisztának és hatékonynak tartott energiaforrást egyre gyakrabban használják kémiai szintézisekhez, mivel sok esetben pozitív hatással van a reakcióra vagy a katalízist végz

enzimre, megnövelve az

enantioszelektivitását, a hozamot, vagy csökkentve a reakcióid t. Az etil-laktát szintézise esetén is 4 ionos folyadékban magasabb hozamot és rövidebb reakcióid t eredményezett, mint a konvencionális h közlés mellett tapasztaltak.

- 107 -

A pozitív hatás független volt attól, hogy az enzim vagy az ionos folyadék végezte a katalízist. A magyarázatot a szubsztrátként használt tejsav elegy reakciókörülmények közötti viselkedésének alaposabb vizsgálatával sikerült megkapni. Az irodalomból ismeretes, hogy kb. 20 %-nál töményebb vizes oldat esetén a tejsav dimereket képez, amiknek a mennyiségét sem a h mérsékletemelés, sem katalizátor hozzáadás vagy víztartalom növekedése külön-külön nem befolyásol. A mikrohullámú h közléssel végrehajtott reakciók alapján azt a következtetést vontam le, hogy a fönti körülmények együttesen mégis hatással vannak a tejsav – laktilsav (tejsav dimer) között kialakult egyensúlyra. HPLC mérésekkel igazoltam, hogy konvencionális h közlés mellett az észterezési reakció sebessége nagyobb, mint a laktilsav hidrolízise, de mikrohullámú h közlés mellett a hidrolízis felgyorsul. Ez okozta, hogy a megnövekedett hozam néhány esetben fölülmúlta a szubsztrát monomer-sav tartalma alapján számolt maximális hozamot. A tejsav egyedi viselkedését tovább vizsgáltam pervaporációval illetve zeolitos adszorpcióval kombinált m veletekben. Ekkor azt tapasztaltam, hogy vízelvonás hatására a laktilsav keletkezése megy végbe, ami növeli a reakcióelegy víztartalmát, és közben csökkenti az elérhet észter hozamot azáltal, hogy a szabad tejsavat fogyasztja. Így ellentétben például az etil-acetát vagy izoamil-acetát szintézisével, amikor a vízelvonás jelent s hozamnövekedéssel járt együtt, ebben az esetben a víztartalom szabályozása a hozam csökkenését eredményezi. A konvencionális h közléssel és vízelvonás nélkül, a mikrohullámú sugárzás mellett, illetve a víztartalom szabályozás mellett végrehajtott etil-laktát szintézis során lejátszódó folyamatok jól nyomon követhet k a keletkez víz és észter mennyiségének összehasonlításával. A fölállított anyagmérleg azt mutatja, hogy rázatott lombikos kísérletekben az észter mennyisége kis mértékben meghaladja a keletkezett víz mennyiségét. Ez a különbség mikrohullámú sugárzás hatására megnövekszik. Ezzel ellentétben a vízelvonás sebességének növelésével (pervaporációról áttérve zeolitos adszorpcióra) csökken az elérhet

észter hozam és n

mennyisége, ezzel alátámasztva a fönt tárgyalt elméleteket.

- 108 -

a reakcióban keletkez

víz

7 Irodalomjegyzék Abe Y., Kude K., Hayase S., Kawatsura M., Tsunashima K., Itoh T.: Design of phosphonium ionic liquids for lipase-catalyzed transesterification, J. Mol. Catal. B: Enzym., 51 81–85 (2008) Adams T. A., Seider W. D.: Semicontinuous distillation for ethyl lactate production, AIChE J., 54 (10) 2539–2552 (2008) Arfan A., Bazureau J. P.: Efficient Combination of Recyclable Task Specific Ionic Liquid and Microwave Dielectric Heating for the Synthesis of Lipophilic Esters, Org. Process Res. Dev., 9 (6) 743-748 (2005) Akao S., Tsuno H., Horie T., Mori S.: Effects of pH and temperature on products and bacterial community in L-lactate batch fermentation of garbage under unsterile condition, Water Res., 41 2636– 2642 (2007) Andre M., Loidl J., Laus G., Schottenberger H., Bentivoglio G., Wurst K., Ongania K.H.: Ionic liquids as advantageous solvents for headspace gas chromatography of compounds with low vapor pressure, Anal. Chem., 77 702-705 (2005) Aparicio S., Alcalde R. : The green solvent ethyl lactate: an experimental and theoretical characterization, Green Chem., 11 65–78 (2009) Aparicio S., Halajian S., Alcalde R., Garcıa B., Leal J.M.: Liquid structure of ethyl lactate, pure and water mixed, as seen by dielectric spectroscopy, solvatochromic and thermophysical studies, Chem. Phys. Lett., 454 49–55 (2008) Armstrong D. W., Zhang L.-K., He L., Gross M. L.: Ionic Liquids as Matrixes for MatrixAssisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Anal. Chem., 73 (15) 3679– 3686 (2001) Asikkala J.: Application of ionic liquids and microwave activation in selected organic reactions, Academic dissertation, Faculty of Science of the University of Oulu, (2008) Assabumrungrat S., Phongpatthanapanich J., Praserthdam P., Tagawa T., Goto, S.: Theoretical study on the synthesis of methyl acetate from methanol and acetic acid in pervaporation membrane reactors: effect of continuous-flow modes, Chem. Eng. J., 95 57-65 (2003) Asthana N., Kolah A., Vu D.T., Lira C., Miller D.J.: A continuous reactive separation process for ethyl lactate formation, Org. Process Res. Dev., 9 599–607 (2005)

- 109 -

Álvarez V. H., Alijó P., Serrão D., Filho R. M., Aznar M., Mattedi S.: Production of Anhydrous Ethanol by ExtractiveDistillation of Diluted Alcoholic Solutions with IonicLiquids, Comp. Aid. Chem. Eng., 27 1137–1142 (2009) Bachu P., Gibson J. S., Sperry J., Brimble M. A.: The influence of microwave irradiation on lipase-catalyzed kinetic resolution of racemic secondary alcohols, TetrahedronAsymmetr., 18 1618–1624 (2007) Bartholomé E., Biekert E., Hellmann H., Ley H., Weigert W. M., Weise E.: Ullmanns Encyklopädie der technischen Chemie, Band 17 Milchsäure bis Petrolkoks, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, 1-6 (1979) Bartling K., Thompson J.U.S., Pfromm P.H., Czermak P., Rezac M.E.: Lipase-catalyzed synthesis of geranyl acetate in n-hexane with membrane-mediated water removal, Biotechnol. Bioeng., 75 676-681 (2001) Baudequin C., Brégeon D., Levillain J., Guillen F., Plaquevent J.-C., Gaumont A.-C.: Chiral ionic liquids, a renewal for the chemistry of chiral solvents? Design, synthesis and applications for chiral recognition and asymmetric synthesis, Tetrahedron-Asymmetr., 16 3921–3945 (2005) Bergqvist B., Arvidsson L., Pettersson E., Galt S., Saalman E., Hamnerius Y., Nordén B.: Effect of microwave radiation on permeability of liposomes. Evidence against nonthermal leakage, BBA – Gen. Subjects, 1201 (1) 51–54 (1994) Bélafiné Bakó K.: Membrános M veletek, Veszprémi Egyetemi Kiadó, Veszprém, pp. 211 (2002) Bélafi-Bakó K., Dörm N., Ulbert O., Gubicza L.: Application of pervaporation for removal of water produced during enzymatic esterification in ionic liquids, Desalination., 149 267-268 (2002) Bogdal D.: Microwave-assisted Organic Synthesis, Chapter2: Microwave effect vs. Thermal effect, Tetrahedron Org. Chem. Ser., 25 13-25 (2005) Börjesson J., Karlsson H.O.E., Trägärdh G.: Pervaporation of a model apple juice aroma solution: Comparison of membrane performance, J. Membrane Sci., 119 229-239 (1996) Bradaric C. J., Downard A., Kennedy C., Robertson A. J., Zhou Y.: Industrial Preparation of Phosphonium Ionic Liquids, Green Chem., 5 143-152 (2003) Campos K., Domingo R., Vincent T., Ruiz M., Sastre A.M., Guibal E.: Bismuth recovery from acidic solutions using Cyphos IL-101 immobilized in a composite biopolymer matrix, Water Res., 42 4019 – 4031 (2008)

- 110 -

Campos K., Vincent T., Bunio P., Trochimczuk A., Guibal E.: Gold Recovery from HCl Solutions using Cyphos IL-101 (a Quaternary Phosphonium Ionic Liquid) Immobilized in Biopolymer Capsules, Solvent Extr. Ion Exc., 26 570–601 (2008) Cantone S., Hanefeld U., Basso A.: Biocatalysis in non-conventional media—ionic liquids, supercritical fluids and the gas phase, Green Chem., 9 954–971 (2007) Carrillo-Munoz J.-R., Bouvet D., Guibe-Jampel E., Loupy A., Petit A.: Microwavepromoted lipase-catalysed reactions. Resolution of (±)-1-phenylethanol, J. Org. Chem., 61 7746–7749 (1996) Charalampopoulos D., Vázquez J. A., Pandiella S. S.: Modelling and validation of Lactobacillus plantarum fermentations in cereal-based media with different sugar concentrations and buffering capacities, Biochem. Eng. J., 44 96–105 (2009) Chen B., Hu J., Miller E.M., Xie W., Cai M., Gross R.A.: Candida antarctica lipase B chemically immobilized on epoxy-activated micro- and nanobeads: catalysts for polyester synthesis, Biomacromolecules, 9 (2) 463–71 (2008) Chowdhury S. A., Scott J. L., MacFarlane D. R.: Ternary mixtures of phosphonium ionic liquids + organic solvents + water, Pure Appl. Chem., 80 (6) 1325–1335 (2008) Chu B.S., Quek S.Y., Baharin B.S.: Optimisation of enzymatic hydrolysis for concentration of vitamin E in palm fatty acid distillate, Food Chem., 80 (3) 295-302 (2003) Cieszynska A., Wisniewski M.: Extraction of palladium(II) from chloride solutions with Cyphos® IL 101/toluene mixtures as novel extractant, Sep. Purif. Technol., 73 202–207 (2010) Cserjési

P.:

Gázszeparáció

ionos

folyadékkal

készített

támasztóréteges

folyadékmembránnal, Doktori (PhD) értekezés, Pannon Egyetem, M szaki Kémiai Kutató Intézet, (2011) Datta R., Tsai S-P.: Esterification of fermentation-derived acids via pervaporation, United States Patent, Patent number: 5,723,639 (1998) Datta R., Henry M.: Lactic acid: recent advantages in products, processes and technologies – a review, J. Chem. Technol. Biotl., 81 1119-1129 (2006) Dávid Ádám Zoltán: Mikrohullámú és közeli infravörös elektromágneses sugárzás alkalmazása a korszer gyógyszertechnológiai eljárásokban és vizsgálatokban, Doktori (Ph.D.) értekezés, Semmelweis Egyetem, (2006)

- 111 -

Delgado P., Sanz M. T., Beltrán S.: Kinetic study for esterification of lactic acid with ethanol and hydrolysis of ethyl lactate using an ion-exchange resin catalyst, Chem. Eng. J., 126 111–118 (2007) Delgado P., Sanz M. T., Beltrán S.: Pervaporation study for different binary mixtures in the esterification system of lactic acid with ethanol, Sep. Purif. Technol., 64 78–87 (2008) Delgado P., Sanz M. T., Beltrán S., Nú ez L. A.: Ethyl lactate production via esterification of lactic acid with ethanol combined with pervaporation Chem. Eng. J. 165 693–700 (2010) Del Sesto R. E., Corley C., Robertson A., Wilkes J. S.: Tetraalkylphosphonium-based ionic liquids, J. Organomet. Chem., 690 2536–2542 (2005) de Diego T., Lozano P., Gmouh S., Vaultier M., Iborra J.L.: Understanding structure Stability relationships of Candida antartica lipase B in ionic liquids, Biomacromolecules 6 1457-1464 (2005) Dong Y.Q., Zhang L., Shen J.N., Song M.Y., Chen H.L.: Preparation of poly(vinyl alcohol)-sodium alginate hollow-fiber composite membranes and pervaporation dehydration characterization of aqueous alcohol mixtures, Desalination 193 202–210 (2006) Engin A., Haluk H., Gurkan K.: Production of lactic acid esters catalyzed by heteropoly acid supported over ion-exchange resins, Green Chem., 5 460-466 (2003) Erbeldinger M., Mesiano M.J., Russel A.J.: Enzymatic catalysis of formation of Zaspartame in ionic liquid - An alternative to enzymatic catalysis in organic solvents, Biotechnol. Progr. 16 1129-1131 (2000) Erdey L.: Bevezetés a kémiai analízisbe, Tankönyvkiadó, (1969) Faber K.: Biotransformations of non-natural compounds: state of the art and future development, Pure Appl. Chem., 69( 8) 1613-1632 (1997) Fang Y., Huang W., Xia Y.: Consecutive microwave irradiation induced substrate inhibition on the enzymatic esterification, Process Biochem., 43 306–310 (2008) Fehér E.: Oldószermérnökség alkalmazása izoamil-acetát enzimatikus el állítására, Doktori (PhD) értekezés, Pannon Egyetem, M szaki Kémiai Kutató Intézet, (2008) Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol-ionic liquid biphasic system, Desalination, 241 8-13 (2009)

- 112 -

Ferreira R., Pedrosa N., Marrucho I.M., Rebelo L.P.N.: Biodegradable polymerphase behavior: liquid–liquid equilibrium of ethyl lactate and poly(lactic acid), J. Chem. Eng. Data, 53 588–590 (2008) Ferreira A. F., Simoes P. N., Ferreira A. G.M.: Quaternary phosphonium-based ionic liquids: Thermal stability and heat capacity of the liquid phase, J. Chem. Thermodyn., 45 16–27 (2012) Filachione E.M., Costello J.: Lactic esters by reaction of ammonium lactate with alcohols, Ind. Eng. Chem., 44 2189–2195 (1952) Findrik Z., Németh G., Gubicza L., Bélafi-Bako K., Vasi -Ra ki .: Evaluation of factors influencing the enantioselective enzymaticesterification of lactic acid in ionic liquid, Bioprocess Biosyst. Eng., DOI 10.1007/s00449-011-0645-5 (2012) Findrik Z., Németh G., Vasi -Ra ki

., Bélafi-Bakó K., Csanádi Zs., Gubicza L.:

Pervaporation-aided enzymatic esterifications in non-conventional media, Process Biochem., In Press, Accepted manusscript (2012) Food and Drug Administration Department of Health and Human Services, The Code of Federal

Regulations

Title

21,

Food

and

Drugs,

http://www.accessdata.fda.gov/scripts/cdrh/cfdocs/cfcfr/CFRSearch.cfm?fr=73.1001 (2012. 01. 27.) Fonyó Zs., Fábri Gy.: Vegyipari m velettani alapismeretek, Nemzeti tankönyvkiadó, 995997 (1998) Fráter Tamás: Ionos folyadékok alkalmazása katalitikus reakciók közegeként, Doktori (PhD) értekezés, Pannon Egyetem, M szaki Kémiai Kutató Intézet, (2007) From M., Adlercreutz P., Mattiasson B.: Lipase catalised esterification of lactic acid, Biotechnol. Lett., 19 315-317 (1997) Gabriel C., Gabriel S., Grant E. H., Halstead B. S. J., Mingos D. M. P.: Dielectric parameters relevant to microwave dielectric heating, Chem. Soc. Rev., 27 213–223 (1998) García M. J., Rebolledo F., Gotor V.: Lipase-catalyzed aminolysis and ammonolysis of ketoesters. Synthesis of optically active -ketoamides, Tetrahedron, 50 (23) 6935–6940 (1994) Gao M.-T., Shimamura T., Ishida N., Takahashi H.: Application of metabolically engineered Saccharomyces cerevisiae to extractive lactic acid fermentation, Biochem. Eng. J., 44 251–255 (2009)

- 113 -

Gao M.-T., Shimamura T., Ishida N., Nagamori E., Takahashi H., Umemoto S., Omasa T., Ohtake H.: Extractive lactic acid fermentation with tri-n-decylamine as the extractant, Enzyme Microb. Tech., 44 350–354 (2009) Gao J., Zhao X. M., Zhou L. Y., Huang Z. H.: Investigation of ethyl lactate reactive distillation process, Chem. Eng. Res. Des., 85 (A4) 525–529 (2007) Gedye R., Smith F., Wetway K., Ali H., Baldisera L., Laberge L. Rousel J.: The use of microwave ovens for rapid organic synthesis, Tetrahedron Lett., 27 (3) 279-282 (1986) Giguere R. J., Bray T. L., Duncan S. M.: Application of commercial microwave ovens to organic synthesis, Tetrahedron Lett., 27 (41) 4945-4948 (1986) Goncalves F.A.M.M., Costa C.S.M.F., Ferreira C.E., Bernardo J.C.S., Johnson I., Fonseca I.M.A., Ferreira A.G.M.: Pressure–volume–temperature measurements of phosphonium-based ionic liquids and analysis with simple equations of state, J. Chem. Thermodyn., 43 914–929 (2011) Gorri D., Ibañez R., Ortiz, I.: Comparative study of the separation of methanol-methyl acetate mixtures by pervaporation and vapor permeation using a commercial membrane, J. Membrane Sci., 280 582-593 (2006) Gubicza L., Bodnár J.: Szerves oldószerekben lejátszódó enzimkatalitikus reakciók, M. K. L., 46 2-6 (1990) Gubicza L.: Enzimkatalitikus reakciók ionos folyadékokban, M.K.F., 113 (3) 116-120 (2007) Gubicza L., Bélafi-Bakó K., Fehér E., Fráter T.: Waste-free process for continuous flow enzymatic esterification using a double pervaporation system, Green. Chem., 10 12841287 (2008) Guibal E., Figuerola Piñol A., Ruiz M., Vincent T., Jouannin C., Sastre A. M.: Immobilization of Cyphos ionic liquids in alginate capsules for Cd(II) sorption, Sep. Sci. Technol., 45 1935-1949 (2010) Guibal E., Gavilan, K. C., Bunio P., Vincent T., Trochimczuk A.: CYPHOS IL 101 (Tetradecyl(Trihexyl)Phosphonium Chloride) Immobilized in Biopolymer Capsules for Hg(II) Recovery from HCl Solutions, Sep. Sci. Technol., 43 (9-10) 2406-2433 (2008) Guo M., Fang J., Xu H., Li W., Lu X., Lan C., Li K.: Synthesis and characterization of novel anion exchange membranes based on imidazolium-type ionic liquid for alkaline fuel cells, J. Membrane Sci., 362 (1–2) 97-104 (2010)

- 114 -

Guo Z., Sun Y.: Solvent-free production of 1,3-diglyceride of CLA: Strategy consideration and protocol design, Food Chem., 100 (3) 1076-1084 (2007) Halpern Y.: Direct esterification of ammonium salts of carboxylic acids, USP 6,583,310, (2003) Han S., Wong H.-T., Livingston A. G.: Application of organic solvent nanofiltration to separation of ionic liquids and products from ionic liquid mediated reactions, Chem. Eng. Res. Des., 83 (A3) 309–316 (2005) Hasegawa S., Azuma M., Takahashi K.: Stabilization of enzyme activity during the esterification of lactic acid in hydrophobic ethers and ketones as reaction media that are miscible with lactic acid despite their high hydrophobicity, Enzyme Microb. Tech.., 43 309–316 (2008) Hayes B. L.: Microwave Synthesis: Chemistry at the Speed of Light; CEM Publishing: Matthews, NC, (2002) Hernandez K., Fernandez-Lafuente R.: LipaseB from Candidaantarctica immobilized on octadecyl Sepabeads: A very stable biocatalyst in the presence of hydrogen peroxide, Process Biochem., 46, (4) 873–878 (2011) Hetényi K, Németh Á, Sevella B. Examination of medium supplementation for lactic acid fermentation, H. J. I. C., 36 49-53 (2008) Hetényi K, Németh Á., Sevella B.: Use of sweet sorghum juice for lactic acid fermentation: preliminary steps in a process optimization, J. Chem. Technol. Biotechnol., 85 (6) 872-877 (2010)

Hetényi, K.; Németh, Á.; Sevella, B.: Investigation and modeling of lactic acid fermentation on wheat starch via SSF, CHF and SHF technology, Per. Pol. Chem. Eng., 55 (1) 11-16 (2011) Hetényi, K.; Németh, Á.; Sevella, B., Role of pH-regulation in lactic acid fermentation: second steps in a process improvement, Chem. Eng. Process.-Proc. Intensif., 50, 293-299 (2011) Hollmanna F., Grzebyk P., Heinrichs V., Doderer K., Thum O.: On the inactivity of Candida antartica lipase B towards strong acids, J. Mol. Catal. B-Enzym., 57 257–261 (2009) Holten C. H.: Lactic Acid; Properties and Chemistry of Lactic Acid and Derivatives, , Verlag Chemie, Weinheim, (1971)

- 115 -

Horikoshi K.: Extremophiles Handbook, Springer, (2011) Hou C.T., Shimada Y.: Encyclopedia of Microbiology, Lipases, 3rd Edition 385-392 (2009) Huanga H.-J., Ramaswamya S., Tschirner U.W., Ramarao B.V.: A review of separation technologies in current and future biorefineries, Sep. Purif. Technol., 62 1–21 (2008) Idris A., Bukhari A.: Immobilized Candida antarctica lipase B: Hydration, stripping off and application in ring opening polyester synthesis, Biotechnol. Adv., 30 (3) 550-563 (2012) Jain N., Kumar A., Chaunhan S., Chaunhan S.M.S.: Chemical and biochemical transformations in ionic liquids, Tetrahedron, 61 1015-1060 (2005) Jiang Y., Xia H., Guo C., Mahmood I., Liu H.: Enzymatic Hydrolysis of Penicillin for 6APA Production in Three-Liquid-Phase System, Appl. Biochem. Biotechnol. 144 145– 159 (2008) Jiménez E., Martín R., Maldonado A., Martín V., de Segura A. G., Fernández L., Rodríguez J. M.: Complete Genome Sequence of Lactobacillus salivarius CECT 5713, a Probiotic Strain Isolated from Human Milk and Infant Feces, J. Bacteriol., 192, (19) 5266-5267 (2010) Joglekar H.G., Rahman I., Babu S., Kulkarni B.D., Joshi A.: Comparative assessment of downstream processing options for lactic acid, Sep. Purif. Technol., 52 1–17 (2006) Kajtár M.: Változatok négy elemre, Serves kémia, 1. kötet, Gondolat Könyvkiadó, Budapest, 337-339 (1984) Kang I.J., Pfromm P.H., Rezac M.E.: Real time measurement and control of thermodynamic water activities for enzymatic catalysis in hexane, J. Biotechnol. 119 147154 (2005) Kappe, C. O., High-speed combinatorial synthesis utilizing microwave irradiation, Curr. Opin. Chem. Biol., 6 314–320 (2002) Kappe C.O.: Microwave-Assisted Chemistry, Compr. Med. Chem. II, 3 837-860 (2007) Kappe C.O., Dallinger D., Murphree S. S.: Practical Microwave Synthesis for Organic Chemists: Strategies, Instruments, and Protocols, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, (2009)

- 116 -

Kasinathan P., Kwak H., Lee U., Hwang D. W., Hwang Y. K., Chang J.-S.: Synthesis of ethyl lactate from ammonium lactate solution by coupling solvent extraction with esterification, Sep. Purif. Technol., 76 1–7 (2010) Keglevich Gy., Sallay P., Greiner I.: Folytonos üzem mikrohullámú reaktorok, M. K. L., 8 278-283 (2008) Kemény S., Deák A.., Komka K., Vágó E.: Hogyan használjuk a STATISTICA programot, Perfect Kiadó, Budapest, (2011) Keskin S., Kayrak-Talay D., Akman U., Hortaçsu Ö.: A review of ionic liquids towards supercritical fluid applications, J. Supercrit. Fluid., 43 150–180 (2007) Kiran K.R., Manohar B., Divakar S.: A Central Composite Rotatable Design Analysis of Lipase Catalyzed Synthesis of Lauroyl Lactic Acid at Bench-scale Level, Enzyme Microb. Tech.. 29 122–128 (2001) Kirk O., Christensen M. W.: Lipases from Candida antarctica: Unique Biocatalysts from a Unique Origin, Org. Proc. Res. Dev., 6 (4) 446–451 (2002) Kondo M., Komori M., Kita H., Okamoto K.: Tubular type pervaporation module with zeolite NaA membrane, J. Membrane. Sci., 133 133–141 (1997) Krishna S. H.: Developments and trends in enzyme catalysis in nonconventional media, Biotechnol. Adv., 20 239–267 (2002) Krzy aniak A., Weggemans W., Schuur B., de Haan A. B.: Ionic liquids as silica deactivating agents in gas chromatography for direct analysis of primary amines in water, J. Chromatogr. A, 1218 9086– 9090 (2011) Letcher T.M., Ramjugernath D., Laskowska M., Królikowski M., Naidoo P., Doma ska U.: Activity coefficients at infinite dilution measurements for organic solutes in the ionic liquid trihexyltetradecylphosphonium-bis-(2,4,4-trimethylpentyl)-phosphinate using g.l.c. at T = (303.15, 308.15, 313.15, and 318.15) K, J. Chem. Thermodyn., 40 1243–1247 (2008) Li H., Mustacchi R., Knowles C. J., Skibar W., Sunderland G., Dalrympleb I., Jackman S. A.: An electrokinetic bioreactor: using direct electric current for enhanced lactic acid fermentation and product recovery, Tetrahedron, 60 655–661 (2004) Lin J., Zhou M., Zhao X., Luo S., Lu Y.: Extractive fermentation of l-lactic acid with immobilized Rhizopus oryzae in a three-phase fluidized bed, Chem. Eng. Proces., 46 369–374 (2007)

- 117 -

Lozano P., Diego de T., Gmouh S., Vaultier M., Iborra J.L.: Dynamic structure-function relationships in enzyme stabilization by ionic liquids, Biocatal. Biotransform., 23 169176 (2005) Lou L.-L., Dong Y., Yu K., Jiang S., Song Y., Cao S., Liu S.: Chiral Ru complex immobilized on mesoporous materials by ionic liquids as heterogeneous catalysts for hydrogenation of aromatic ketones, J. Mol. Catal. A: Chem., 333 (1–2) 20-27 (2010) Loupy A.: Microwaves in organic synthesis. Wiley-VCH, Weinheim (2006) Lundell K., Kurki T., Lindroos M., Kanerva L. T.: Room Temperature Ionic Liquids in the Kinetic Resolution of Adrenaline-Type Aminoethanols by Burkholderia cepacia Lipase under Normal and Microwave Conditions, Adv. Synth. Catal., 347 1110-1118 (2005) Magnusson A.: Rational redesign of Candida antarctica lipase B, Doctoral dissertation, Royal Institute of Technology, 12-16 (2005) van Maris A. J. A., Winkler A. A., Porro D., van Dijken J. P., Pronk J. T.: Homofermentative Lactate Production Cannot Sustain Anaerobic Growth of Engineered Saccharomyces cerevisiae: Possible Consequence of Energy-Dependent Lactate Export, Appl. Environ. Microbiol., 70 (5) 2898-2905 (2004), Markó L.: Szerves Kémia I., Veszprémi Egyetemi Kiadó, Veszprém, 47-56 (2001) Markó L.: Szerves Kémia III., Veszprémi Egyetemi Kiadó, Veszprém, 47-56 (2002) Marták J., Schlosser Š.: Extraction of lactic acid by phosphonium ionic liquids, Sep. Purif. Technol., 57 483–494 (2007) Marták J., Schlosser Š., Vl ková S.: Pertraction of lactic acid through supported liquid membranes containing phosphonium ionic liquid, J. Membrane Sci., 318 (1-2) 298-310 (2008) Martin R., Aranda P., Chen W.-J.: Pervaporation separation of ethanol/water mixtures by polystyrenesulfonate/alumina composite membranes, J. Membrane. Sci., 107 199–207 (1995) Martinelle M., Holmquist M., Hult K.: On the interfacial activation of Candida antarctica lipase A and B as compared with Humicola lanuginosa lipase, BBA, 1258 272-276 (1995) Martinis E. M., Berton P., Monasterio R. P., Wuilloud R. G.: Emerging ionic liquid-based techniques for total-metal and metal-speciation analysis, Trac-Trend. Anal. Chem., 29 (10) 1184-1201 (2010)

- 118 -

Matsumoto M., Panigrahi A., Murakami Y., Kondo K.: Effect of Ammonium- and Phosphonium-Based Ionic Liquids on the Separation of Lactic Acid by Supported Ionic Liquid Membranes (SILMs), Membranes, 1 98-108 (2011) McCabe R.W., Rodger A., Taylor A.: A study of the secondary structure of Candida antarctica lipase B using synchrotron radiation circular dichroism measurements, Enzyme Microb. Tech., 36 70–74 (2005) McConville J. T., Carvalho T. C., Kucera S. A., Garza E.: Ethyl Lactate as a Pharmaceutical-Grade Excipient and Development of a Sensitive Peroxide Assay, Pharma. Techn. 33, (5) 74-84 (2009) McNulty J., Cheekoori S., Nair J. J., Larichev V., Caprettaa A., Robertson A. J.: A mild esterification process in phosphonium salt ionic liquid, Tetrahedron Lett., 46 3641–3644 (2005) Mendoza Tellez H., Palacios Alquisira J., Rius Alonso C., López Cortés J. G., Toledano C. A.: Comparative Kinetic Study and Microwaves Non-Thermal Effects on the Formation of Poly(amic acid) 4,4 -(Hexafluoroisopropylidene) diphthalic Anhydride (6FDA) and 4,4 -(Hexafluoroisopropylidene) bis(-phenyleneoxy)dianiline (BAPHF). Reaction Activated by Microwave, Ultrasound and Conventional Heating, Int. J. Mol. Sci., 12 6703-6721 (2011) Mingos D. M. P., Baghurst D. R.: Application of dielectric heating effects to synthetic problems in chemistry, Chem. Soc. Rev. 20 1–47 (1991) Mohile S. S., Potdar M. K., Harjani J. R., Nara S. J., Salunkhe M. M.: Ionic liquids: efficient additives for Candida rugosa lipase-catalysed enantioselective hydrolysis of butyl 2-(4-chlorophenoxy)propionate, J. Mol. Catal. B: Enzym., 30 (5–6) 185-188 (2004) Monasterio R. P., Wuilloud R. G.: Ionic liquid as ion-pairing reagent for liquid–liquid microextraction and preconcentration of arsenic species in natural waters followed by ETAAS, J. Anal. Atom Spectrom., 25 1485–1490 (2010) Mussatto S. I., Fernandes M., Mancilha I. M., Roberto I. C.: Effects of medium supplementation and pH control on lactic acid production from brewer’s spent grain, Biochem. Eng. J., 40 437–444 (2008) Nakaoki T., Mei Y., Miller L.M., Kumar A., Kalra B., Miller M.E., Kirk O., Christensen M., Gross R. A.: Candida antarctica lipase B catalyzed polymerization of lactones: effects of immobilization matrices on polymerization kinetics & molecular weight, Ind. Biotechnol., 1 (2) 126–34 (2005)

- 119 -

Nádherná M., Opekar F., Reiter J.: Ionic liquid–polymer electrolyte for amperometric solid-state NO2 sensor, Electrochim. Acta, 56 (16) 5650-5655 (2011) Németh., Á.; Kiss., Á.; Sevella., B.: Experiments for D-lactic acid production with fermentation, H. J. I. C., 39 (3) 359-362 (2011) Nüchter M., Ondruschka B., Bonrath W., Gum A.: Microwave assisted synthesis – a critical technology overview, Green Chem., 6 128 – 141 (2004) O’Brien D.J., Craig J.C.: Ethanol production in a continuous fermentation/membrane pervaporation system, Appl. Microbiol. Biot. 44 699–704 (1996) Ohtani

T.,

Nakatsukasa

H.,

Kamezawa

M.,

Tachibana

H.,

Naoshima

Y.:

Enantioselectivity of Candida antarctica lipase for some synthetic substrates including aliphatic secondary alcohols, J. Mol. Catal. B-Enzym., 4 53-60 (1998) Oter O., Ertekin K., Topkaya D., Alp S.: Room temperature ionic liquids as optical sensor matrix materials for gaseous and dissolved CO2, Sensors Actuators B: Chem., 117 (1) 295-301 (2006) Ottosson J., Hult K.: Influence of acyl chain length on the enantioselectivity of Candida antarctica lipase B and its thermodynamic components in kinetic resolution of secalcohols, J. Mol. Catal. B- Enzym., 11 1025–1028 (2001) Páez B. C., Medina A. R., Rubio F. C., Moreno P. G., Grima E. M.: Modeling the effect of free water on enzyme activity in immobilized lipase-catalyzed reactions in organic solvents, Enz. Microb. Technol. 33 845–853 (2003) Panesar P. S., Kennedy J. F., Gandhi D. N., Bunko K.: Bioutilisation of whey for lactic acid production, Food Chem., 105 1–14 (2007) Parida S, Dordick J. S.: Substrate structure and solvent hydrophobicity control lipase catalysis and enantioselectivity in organic media, J. Am. Chem. Soc., 113 2253-2259 (1991) Park S., Kazlauskas R.J.: Biocatalysis in ionic liquids-advantages beyond green technology, Curr. Opin. Biotech., 14 432-437 (2003) Parker M.-C., Besson T., Lamare S., Legoy M.-D.: Micro wave-radiation can increase the rate of enzyme-catalysed reactions in organic media, Tetrahedron Lett., 37 8383–8386 (1996)

- 120 -

Pereira C. S. M., Silva V. M. T. M., Rodrigues A. E.: Ethyl lactate as a solvent: Properties, applications and production processes – a review, Green Chem., 13 2658 – 2671 (2011) Perry J. H.,: Chemical Engineers’ Handbook, McGraw-Hill Book Company, London, chapter 3, 35 (1963), Peres R. G., Moraes E.P., Micke G.A., Tonin F.G., Tavares M.F.M., Rodriguez-Amaya D.B.: Rapid method for the determination of organic acids in wine by capillary electrophoresis with indirect UV detection, Food Control, 20 548–552 (2009) Phelan A.M., Neubauer C.F., Timm R., Neirenberg J., Lange D.G.: Athermal Alterations in the Structure of the Canalicular Membrane and ATPase Activity Induced by Thermal Levels of Microwave Radiation, Radiat. Res., 137 52-58. (1994) Pirozzi D., Greco G.Jr.: Activity and stability of lipases in the synthesis of butyl lactate, Enzyme Microb. Tech., 34 94-100 (2004) Porcelli M., Cacciapuoti G., Fusco S., Massa R., d' Ambrosio G., Bertoldo C., De Rosa M., Zappia V.: Non-thermal effects of microwaves on proteins: thermophilic enzymes as model system, FEBS Lett., 402 102-106 (1997) Qariouh H., Schué R., Schué F., Bailly C.: Sorption, diffusion and pervaporation of water/ethanol mixtures in polyetherimide membranes, Polym. Int., 48 171–180 (1999) Radzi S. M., Basri M., Salleh A. B., Ariff A., Mohammad R., Rahman M. B. A., Rahman R. N. Z. R. A.: High performance enzymatic synthesis of oleyl oleate using immobilised lipase from Candida antartica, Electron. J. Biotechn., 8 (15) 291-298 (2005) van Rantwijk F., Sheldon R. A.: Biocatalysis in Ionic Liquids, Chem. Rev., 107 27572785 (2007) Reddy G., Altaf Md., Naveena B.J., Venkateshwar M., Vijay Kumar E.: Amylolytic bacterial lactic acid fermentation — A review, Biotechnol. Adv., 26 22–34 2008 Regel-Rosocka M., Wisniewski M.: Ionic Liquids in Separation of Metal Ions from Aqueous Solutions, Applications of Ionic Liquids in Science and Technology, Scott Handy, Middle Tennessee State University, USA ISBN: 978-953-307-605-8, Available from: http://www.intechopen.com/articles/show/title/ionic-liquids-in-separation-of-metalions-from-aqueous-solutions. (2012. 03. 01.) ReliZymeTM

and

SEPABEADS®

EC

http://www.resindion.com (2012. 03. 12.)

- 121 -

Enzyme

carriers

(termékkatalógus)

Rezaei B., Mallakpour S., Taki M.: Application of ionic liquids as an electrolyte additive on the electrochemical behavior of lead acid battery, J. Power Sources, 187 (2), 605-612 (2009) Roenne T. H., Xu X., Tan T.: Lipase-catalised esterification of lactic acid with straightcain alcohols, J.A.O.C.S., 82 (12) 881-885 (2005) Roy I., Gupta M. N.: Applications of microwaves in biological sciences, Curr.Sci. India, 85 (12) 1685-1693 (2003) Ruckenstein E., Liang L.: Pervaporation of ethanol–water mixtures through polydimethylsiloxane-polysstyrene

interpenetrating

polymer

network

supported

membranes, J. Membrane. Sci., 114 227–234 (1996) Saalman E., Norden B., Arvidsson L., Hamnerius Y., Hojevik P., Connell K. E., Kurucsev T.,: Effect of 2.45 GHz microwave radiation on permeability of unilamellar liposomes to 5(6)-carboxyfluorescein, B. B. A., 1064 (1) 124-130 (1991) Sakaki K., Aoyama A., Nakane T., Ikegami T., Negishi H., Watanabe K., Yanagishita H.: Enzymatic synthesis of sugar esters in organic solvent coupled with pervaporation, Desalination, 193 260-266 (2006) Schäfer T., Rodrigues C.M., Alfonso C.A.M., Crespo J.G.: Selective recovery of solutes from ionic liquids by pervaporation-a novel approach for purification and green processing, Chem. Commun., 1622-1623 (2001) Shao P., Huang R.Y.M.: Polymeric membrane pervaporation, J. Membrane Sci., 287 162–179 (2007) Smitha B., Suhanya D., Sridhar S., Ramakrishna M.: Separation of organic-organic mixtures by pervaporation - a review, J. Membrane Sci., 241 1-21 (2004) Spencer P. L.: Means for treating foodstuff. US patent US patent office. 2,605,383 (1952) Stephens T. W., Loera M., Quay A. N., Chou V., Shen C., Wilson A., Acree W. E., Jr., Abraham M. H.: Correlation of Solute Transfer Into Toluene and Ethylbenzene from Waterand from the Gas Phase Based on the Abraham Model, Open Thermodyn. J., , 5, 104-121 (2011) Strati I.F., Oreopoulou V.: Effect of extraction parameters on the carotenoid recovery from tomato waste, Int. J. Food Sci. Tech., 46 23–29 (2011) Sun J., Howlett P. C., MacFarlane D. R., Lin J., Forsyth M.: Synthesis and physical property characterisation of phosphonium ionic liquids based on P(O)2(OR)2 − and

- 122 -

P(O)2(R)2 − anions with potential application for corrosion mitigation of magnesium alloys, Electrochim. Acta, 54 254–260 (2008) Sun X., Wang Q., Zhao W., Ma H., Sakata K.: Extraction and purification of lactic acid from fermentation broth by esterification and hydrolysis method, Sep. Purif. Technol., 49 43–48 (2006) Takács L.: A membránszeparáció szerepe borok alkoholcsökkentésében és ipari alkoholok dehidratációjában, Doktori (PhD) értekezés, Budapesti Corvinus Egyetem, (2010) Thang V. H., Novalin S.: Green Biorefinery: Separation of lactic acid from grass silage juice by chromatography using neutral polymeric resin, Bioresource Technol., 99 4368– 4379 (2008) Tombokan X.C., Aguda R.M., Danehower D.A., Kilpatrick P.K., Carbonell R.G.: Threecomponent phase behavior of the sclareol–ethyl lactate–carbon dioxide system for GAS applications, J. Supercrit. Fluids, 45 146–155 (2008) Torres C., Otero C.: Part III. Direct enzymatic esterification of lactic acid with fatty acids, Enzyme Microb. Tech., 29 3–12 (2001) Toukoniitty B., Mikkola J.P., Eränen K., Salmi T., Murzin D.Y.: Esterification of propionic acid under microwave irradiation over an ion-exchange resin, Catal. Today, 100 (3-4) 431-435 (2005) Tseng M.-C., Kan H.-C., Chu Y.-H.: Reactivity of trihexyl(tetradecyl)phosphonium chloride, a room-temperature phosphonium ionic liquid, Tetrahedron Lett., 48 9085–9089 (2007) Tsunashima K., Sugiya M.: Physical and electrochemical properties of low-viscosity phosphonium ionic liquids as potential electrolytes, Electrochem. Commun., 9 2353–2358 (2007) Turner N. A., Vulfson E. N.: At what temperature can enzymes maintain their catalytic activity?, Enzyme Microb. Tech., 27 108–113 (2000) Ulbert O., Fráter T., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enhanced enantioselectivity of Candida rugosa lipase in ionic liquids as compared to organic solvents, J. Mol. Catal. B- Enzym., 31 39–45 (2004) Verma M. L., Azmi W., Kanwar S. S.: Microbial lipases: at the interface of aqueous and non-aqueous media, Acta Microbiol. Immunol. Hung., 55 (3) 265–294 (2008)

- 123 -

Vila C., Campos A.R., Cristovão C., Cunha A.M., Santos V., Parajó J.C.: Sustainable biocomposites based on autohydrolysis of lignocellulosic substrates, Compos. Sci. Technol., 68 944–952 (2008) Vicente G., Paiva A., Fornari T., Najdanovic-Visak V.: Liquid–liquid equilibria for separation of tocopherol from olive oil using ethyl lactate, Chem. Eng. J., 172 879– 884 (2011) Vincent T., Parodi A., Guibal E.: Pt recovery using Cyphos IL-101 immobilized in biopolymer capsules, Sep. Purif. Technol., 62 470–479 (2008) Vincent T., Parodi A., Guibal E.:Immobilization of Cyphos IL-101 in biopolymer capsules for the synthesis of Pd sorbents, React. Funct. Polym., 68 1159–1169 (2008) Vu D. T., Kolah A. K., Asthana N. S., Peereboom L., Lira C. T., Miller D. J.: Oligomer distribution in concentrated lactic acid solutions, Fluid Phase Equilibr. 236 125–135 (2005) Wang H., Lu Q., Ye C., Liu Q., Cui Z.: Friction and wear behaviors of ionic liquid of alkylimidazolium hexafluorophosphates as lubricants for steel/steel contact, Wear, 256 44-48 (2004) Wang Y., Tian M., Bi W., Row K. H.: Application of Ionic Liquids in High Performance Reversed-Phase Chromatography, Int. J. Mol. Sci., 10 2591-2610 (2009) Watson P. D.: Composition of lactic acid. Production of a highly concentrated acid, Ind. Eng. Chem., 32 (3) 399-401 (1940) Wei D., Gu C., Song Q., Su W.: Enzymatic Esterification for Glycoside Lactate Synthesis in Organic Solvent, Enzyme Microb. Tech., 33 508–512 (2003) Whittaker A. G., Mingos D. M. P.: Microwave-assisted solidstate reactions involving metal powders, J. Chem. Soc., Dalton Trans., 2073–2079 (1995) Won K., Hong J.-K., Kim K.-J., Moon S.-J.: Lipase-catalyzed enantioselective esterification of racemic ibuprofen coupled with pervaporation, Proc. Biochem., 41 264269 (2006) Wu W. S., Lau, W.W.Y., Rangaiah, G.P., Sourirajan, S.: Pervaporation of water and ethanol using a cellulose acetate butyrate membrane, J. Colloid Interf. Sci. 160 502–504 (1993)

- 124 -

Xu Z., Wan H., Miao J., Han M., Yang C., Guan G.: Reusable and efficient polystyrenesupported acidic ionic liquid catalyst for esterifications, J. Mol. Catal. A-Chem., 332 (1– 2) 152-157 (2010) Yadav G.D., Lathi P. S.: Intensification of enzymatic synthesis of propylene glycol monolaurate from 1,2-propanediol and lauric acid under microwave irradiation: Kinetics of forward and reverse reactions, Enzyme Microb. Tech., 38 814–820 (2006) Yadav G.D., Borkar I. V.: Lipase-catalyzed hydrazinolysis of phenyl benzoate: Kinetic modeling approach, Process Biochem., 45 (4) 586-592 (2010) Yagci B., Bolca S., Heuts J.P.A., Ming W., de With G.: Antimicrobial polyurethane coatings based on ionic liquid quaternary ammonium compounds, Progr. Org. Coat., 72 (3) 343-347 (2011). Yan Y., Bornscheuer U.T., Cao L., Schmid R.D.: Lipase-catalyzed solid-phase synthesis of sugar fatty acid esters: Removal of byproduct by azeotropic distillation, Enzyme Microb. Tech., 25 725-728 (1999) Yanes E.G., Gratz S.R., Baldwin M.J., Robinson S.E., Stalcup A.M.: Capillary electrophoretic application of 1-alkyl-3-methylimidazolium-based ionic liquids, Anal. Chem., 73 3838-3844 (2001) Yi S.S., Lu Y.C., Luo G.S.: Separation and concentration of lactic acid by electroelectrodialysis, Sep. Puri. Technol., 60 308–314 (2008) Yokozeki A., Shiflett M. B.: Hydrogen purification using room-temperature ionic liquids, Appl. Energ., 84 351–361 (2007) Young G., Nippen F., Titterbrandt S., Cooney M. J.: Direct transesterification of biomass using an ionic liquid co-solvent system, Biofuels, 2 (3) 261-266 (2011), Yu D., Ma D., Wang Z., Wang Y., Pan Y., Fang X.: Microwave-assisted enzymatic resolution of (R,S)-2-octanol in ionic liquid, Process Biochem., 47 (3) 479-484 (2012) Yu D., Wang Z., Chen P., Jin L., Cheng Y., Zhou J., Cao S.: Microwave-assisted resolution of (R,S)-2-octanol by enzymatic transesterification, J. Mol. Catal. B- Enzym., 48 51–57 (2007) Zaks A, Klibanov AM.: Enzymatic catalysis in nonaqueous solvents., J. Biol. Chem., 263 3194 –201 (1988) Zaks A., Klibanov A.M.: Enzyme-catalyzed processes in organic solvents, Proc. Natl. Acad. Sci. 82 3192-3196 (1985)

- 125 -

Zhang B., He P.-j., Ye N.-f., Shao L.-m.: Enhanced isomer purity of lactic acid from the non-sterile fermentation of kitchen wastes, Bioresource Technol., 99 855–862 (2008) Zhao D., Ding X.: Studies on the low-salt Chinese potherb mustard (Brassica juncea, Coss.) pickle. I—The effect of a homofermentative L(+)-lactic acid producer Bacillus coagulans on starter culture in the low-salt Chinese potherb mustard pickle fermentation, LWT, 41 474–482 (2008) Zhao W., Sun X., Wang Q., Ma H., Teng Y.: Lactic acid recovery from fermentation broth of kitchen garbage by esterification and hydrolysis method, Biomass Bioenerg., 33 21– 25 (2009) Zhao H., Baker G. A., Song Z., Olubajo O., Zanders L., Campbell S. M.: Effect of ionic liquid properties on lipase stabilization under microwave irradiation, J. Mol. Catal.BEnzym., 57 (1–4) 149-157 (2009) Zhu H., Huang J.-F., Pan Z., Dai S.: Ionothermal Synthesis of Hierarchical ZnO Nanostructures from Ionic-Liquid Precursors, Chem. Mater., 18 (18) 4473–4477 (2006) Zhu H.-P., Yang F., Tang J. He M.-Y.: Brønsted acidic ionic liquid 1- methylimidazolium tetrafluoroborate: a green catalyst and recyclable medium for esterification, Green Chem., 5 38-39 (2003) Ziobrowski Z., Kiss K., Rotkegel A., Nemestóthy N., Krupiczka R., Gubicza L.: Pervaporation aided enzymatic production of glycerol monostearate in organic solvents, Desalination, 241 212-217(2009)

- 126 -

8 Tézisek 1. Tézis: Megállapítottam, hogy az aromaként, gyógyszer- és élelmiszeripari adalékként egyaránt felhasználásra kerül

természetes etil-laktát (L)-tejsavból és természetes

etanolból Candida antarctica lipáz B enzim jelenlétében többféle nem-konvencionális reakcióközegben el állítható. A

szerves

oldószerek

közül

a

toluol

bizonyult

a

legalkalmasabb

reakcióközegnek. Megállapítottam, hogy a vizsgált összesen 12 ionos folyadék közül több foszfónium típusú, a tejsav oldására is alkalmas. Egyes foszfónium típusú ionos folyadékok, mint pl.: Cyphos 163, Cyphos 166, Cyphos 106, Cyphos 102 maguk is katalizálják az észterezést, vagyis szerepük a reakcióban kett s: oldószer és egyúttal katalizátor. A Cyphos 104 és a Cyphos 202 ionos folyadékok megfelel közegei a reakciónak, mivel csak oldószerként viselkednek, a reakciót csak az enzim katalizálja. Kísérleteim alapján megállapítottam, hogy konvencionális h közlés mellett közel azonos hozam érhet el Cyphos 104 és toluol közegben, ugyanakkor az ionos folyadék több szempontból (pl. nagyobb alkalmazható savkoncentráció, kisebb mennyiség enzim, a lipáz jobb újrafelhasználhatósága) kedvez bb közegnek bizonyult, mint a szerves oldószer. A kétféle oldószerrel végzett kísérletek paramétereit és eredményeit táblázatban foglaltam össze (1). Az etil-laktát el állítás legmegfelel bb paraméterei és eredményei toluolban és Cyphos 104-ionos folyadékban.

Reakcióközeg

Toluol

Cyphos 104

0,2 - 0,5 mmol/ ml

0,8 - 1 mmol/ml

Alkohol : sav mólarány

5:1

7:1

Kiindulási víztartalom

4,5 tömeg %

2,0 tömeg %

8 óra

24 óra

250 mg/ mmol tejsav

12,5 mg/mmol tejsav

Elért maximális hozam

94 %

95 %

Reakcióh mérséklet

40 °C

40 °C

Visszaforgathatóság

Gyenge

Megnövekedett

Savkoncentráció

(a

reakciótérfogat alapján)

legkedvez bb

Reakcióid Enzimmennyiség

- 127 -

2. Tézis: Kísérleteim bizonyították, hogy a Cyphos ionos folyadék család több tagja többes funkciót képes ellátni a tejsav el állítás és feldolgozás során. Nemcsak alkalmasak – az irodalom szerint ismert módon – a tejsav extrakciójára a fermentléb l, de kinyerés nélkül felhasználhatók a további enzimkatalitikus észterezési reakció közegeként. Ezzel lehet ség nyílik egy olyan kombinált természetes etil-laktát el állítási eljárás kidolgozására, ahol kiküszöbölhet egy költséges kinyerési lépés. (1) 3. Tézis: Bebizonyítottam, hogy a mikrohullámú h közlés pozitív hatással van az etillaktát szintézisére 4 ionos folyadék közeg esetén, melyek közül Cyphos 202-ben csak enzimkatalizált folyamat megy végbe. A tapasztalt pozitív hatás magasabb hozamban és 2-3-szor rövidebb reakcióid ben nyilvánul meg a konvencionális h közlés mellett tapasztaltakhoz képest. Cyphos 202 ionos folyadék esetében a konvencionális h közlésnél szükséges 24 órás reakcióid 8 órára csökken, miközben növekszik az elért etil-laktát hozam. (2) Mikrohullámú sugárzás hatása az észterezési reakcióra különböz ionos folyadékok esetén.

Konvencionális h közlés

Mikrohullámú h közlés

hozam / reakcióid

hozam / reakcióid

Cyphos 202

95 % / 24 óra

106 % / 8 óra

Cyphos 163

104 % / 8 óra

104 % / 4 óra

Cyphos 166

90 % / 24 óra

93 % / 7 óra

Cyphos 102

60 % / 24 óra

65 % / 7 óra

IL neve

Cyphos 104

Nincs hatás

Cyphos 110

Nincs hatás

Cyphos 106

Nincs hatás

- 128 -

4. Tézis Cyphos 202 ionos folyadék esetén a mikrohullámú h közlés egy újabb, eddig nem ismert el nyös hatását is igazolták mérési eredményeim. A reakcióelegyben jelen lev víz és észter mennyiségekre fölállított anyagmérleg alapján a reakcióban keletkez észter mennyisége nagyobb, mint a keletkez vízé. Eszerint a mikrohullámú sugárzás a reakcióelegyben lév tejsav dimereinek hidrolízisét meggyorsítja, és ezáltal megn a szabad (az enzim számára hozzáférhet ) tejsav mennyisége. Mivel a h közlésen kívül minden egyéb körülmény azonos a két reakcióban, a fönt leírt jelenség a mikrohullámú sugárzás (nem-h ) hatásának tulajdonítható. A hidrolízis sebességének megnövekedése lehet vé teszi a dimerekben kötött tejsav szubsztrátként történ felhasználását és a szabad tejsavra számolt hozam akár 100 % fölé történ emelkedését. (2) 5. Tézis Vízelvonás, így az általam alkalmazott pervaporáció, illetve zeolitos adszorpció hatására laktilsav keletkezik a reakcióelegyben, ami növeli a reakcióelegy víztartalmát, és közben csökkenti az elérhet

észter hozamot azáltal, hogy a fogyasztja a

rendelkezésre álló szabad tejsavat. Így, ellentétben például az etil-acetát, vagy izoamilacetát szintézisével (ahol nem játszódnak le dimerizációs folyamatok), amikor a vízelvonás jelent s hozamnövekedéssel járt együtt, ebben az esetben a víztartalom szabályozása (a keletkez víz elvonása) a hozam csökkenését eredményezi. (3)

- 129 -

9 Thesis 1st Thesis: It was proven that natural ethyl lactate – as a flavour or additive in the pharmaceutical and food industry – was possible to manufacture from (L) lactic acid and natural ethanol by Candida antarctica lipase B enzyme in various non-conventional reaction media. Among organic solvents, toluol was found the most suitable reaction medium. It was stated that several phosphonium type ionic liquids out of 12 investigated were able to dissolve lactic acid. Certain phosphonium type ionic liquids like e.g. Cyphos 163, Cyphos 166, Cyphos 106, Cyphos 102 can catalyse the esterification, thus their role is two-fold: solvent as well as catalyst. Cyphos 104 and Cyphos 202 ionic liquids are the proper media of the reaction, since they behave only as a solvent, the reaction is catalysed only by the enzyme. Based on the experiments I found that similar yields were reached in Cyphos 104 and toluol media using conventional heating, while ionic liquid seemed more beneficial medium from several point of view (e.g. higher initial acid concentration, lower amount of enzyme, better recycling of lipase) than the organic solvent. The proper parameters and results of the experiments carried out in the two types of solvents are summarised in the table (1). The most suitable parameters and results of ethyl lactate synthesis in toluol and Cyphos 104 ionic liquid

Reaction medium

Toluol

Cyphos 104

Acid concentration

0.2 – 0.5 mmol/ ml

0.8 - 1 mmol/ml

5:1

7:1

4.5 mass %

2.0 mass %

8h

24 h

250 mg/ mmol LA

12.5 mg/mmol LA

Highest yield

94 %

95 %

Reaction temperature

40 °C

40 °C

Ability for recycling

Weak

Enhanced

Alcohol : acid mol ratio Initial water content Reaction time Amount of enzyme

- 130 -

2nd Thesis: My experiments have proven that a couple of members of the Cyphos ionic liquid family can work in various functions during the manufacture and processing of lactic acid. They were suitable – according to the literature – for extraction of lactic acid from the broth on one hand, and it was possible to use them as a media – without a further recovery step – for the enzyme catalytic esterification reaction, on the other hand. Thus there is an opportunity to elaborate a combined process for production of natural ethyl lactate, where a costly recovery step could be eliminated (1). 3rd Thesis: I proved that microwave irradiation has a positive effect on synthesis of ethyl lactate in cases of four ionic liquids, among them in Cyphos 202 only the enzyme catalytic process takes place. The positive effect resulted in higher yield and 2-3-fold shorter reaction time compared to the conventional heating. In Cyphos 202 ionic liquid the reaction time was only 8 hours while in conventional heating it was 24 hours, moreover the obtained yield of ethyl lactate increased (2). The effect of microwave irradiation on the esterification reaction in various ionic liquids

Conventional heating

Microwave irradiation

yield / reaction time

yield / reaction time

Cyphos 202

95 % / 24 h

106 % / 8 h

Cyphos 163

104 % / 8 h

104 % / 4 h

Cyphos 166

90 % / 24 h

93 % / 7 h

Cyphos 102

60 % / 24 h

65 % / 7 h

IL name

Cyphos 104

No effect

Cyphos 110

No effect

Cyphos 106

No effect

- 131 -

4th Thesis In case of Cyphos 202 ionic liquid another beneficial effect of microwave irradiation was proven by my measurements. Based on the mass balance of the water and ester amount in the reaction mixture, I found that the amount of ester formed was higher than the water produced. Thus microwave irradiation accelerates hydrolysis of lactic acid dimers, therefore the amount of „free” (available for the enzyme) lactic acid increases. Since all the other circumstances were the same (except heating method) in the two reactions, this phenomenon was undoubtedly caused by the microwave irradiation (non-heating) effect. The higher rate of hydrolysis made it possible to use the lactic acid – bound earlier in dimers – as substrate, and to reach yield over 100 % (related to the initial free lactic acid) (2). 5th Thesis As a result of water removal by pervaporation or adsorption with zeolite, lactilic acid is formed in the reaction mixture, which increases the water content of the reaction mixture as well as decreases the maximal ester yield, since it consumes the free lactic acid available. Thus in this case controlling water content (removal of the water formed) resulted in lower yield, unlike synthesis of ethyl acetate or i-amyl acetate, where water removal caused considerable yield increase (no dimerisation occurred) (3).

- 132 -

10 Publikációk és proceedingek Publikációk: 1. Major B., Nemestóthy N., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic Esterification of Lactic Acid Under Microwave Conditions In Ionic Liquids, Hungarian J. Ind. Chem., 36 (1-2) 77-81 (2008)

2. Major B., Kelemen-Horváth I., Csanádi Zs., Bélafi-Bakó K. and Gubicza L.: „Microwave assisted enzymatic esterification of lactic acid and ethanol in phosphonium type ionic liquids as co-solvents”, Green Chem. 11 (5) 614-616 (2009) (IF: 5,836, hivatkozás: 7) 3. Major B., Németh G., Bélafi-Bakó K., and Gubicza L.: Unique role of water content in enzymatic synthesis of ethyl lactate using ionic liquid as solvent, Chem. Pap., 64 (2) 261–264 (2010) (IF: 0,754, hivatkozás: 2)

A témához kapcsolódó egyéb publikációk 4. Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K. and Gubicza L.: On the background of enhanced stability and reusability of enzymes in ionic liquids, Biochem. Soc. Trans., 35, 1624-1627 (2007) (IF: 3,447, hivatkozás: 37) 5. Fehér E., Major B., Bélafi-Bakó K.and Gubicza L.: Semi-continuous enzymatic production and membrane assisted separation of isoamyl acetate in alcohol - ionic liquid biphasic system, Desalination, 241 8-13 (2009), (IF: 2,034, hivatkozás: 6)

Proceedingek, el adások, poszterek: 1. Major B., Fehér E., Vass A., Gubicza L.: Tejsav enantioszelektív észterezése Candida antarctica lipáz enzimmel ionos folyadék közegben, M szaki Kémiai Napok, Veszprém, 2007. április 25-27, el adás pp. 133-138.

2. Major B., Vrsalovi Prese ki A., Kelemenné Horváth I., Vass A., Gubicza L.: A mikrohullámú h közlés hatása tejsav enzimes észterezésére ionos folyadékban, M szaki Kémiai Napok, Veszprém, 2008. április 22-24, el adás pp. 127-132.

3. Major B., Kelemenné Horváth I., Bélafiné Bakó K., Gubicza L.: A víztartalom szerepe a tejsav enzimkatalitikus észterezése során, M szaki Kémiai Napok, Veszprém, 2009. április 21-23, el adás pp. 20-23 - 133 -

4. Dobaj A.; Bányai T.; Major B.; Gubicza L.: Tejsav észterek el állítása ionos folyadékban végzett enzimkatalitikus észterezéssel, M szaki Kémiai Napok, Veszprém, 2009. április 21-23, el adás pp. 15-19 5. Hunorfi A., Kelemenné Horváth I., Major B., Gubicza L.: Ionos folyadékok alkalmazása észterezési reakciókban oldószerként és katalizátorként, M szaki Kémiai Napok, Veszprém, 2009. április 21-23, el adás pp. 178-182

6. Major B., Fehér E., Vass A., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic production of lactates in ionic liquids, 34th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering (SSCHE), Tatranské Matliare, Szlovákia, 2007. május 21-

25., el adás, pp. 126 és proceedings CD-ROM 7. Major B., Bányai T., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: The effect of water content on the enzymatic esterification of lactic acid in ionic liquid as co-solvent, 36th International conference of the Slovak Society of Chemical Engineering, Tatranské

Matliare, Szlovákia, 2009. május 25-29 el adás p. 56 és proceedings CD-ROM 8. Major B., Marták J., Gubicza L., Bélafiné Bakó K., Schlosser S.: Tejsav kinyerése és észterezése ionos folyadékok segítségével, M szaki Kémiai Napok, Veszprém, 2008. április 22-24, poszter, pp. 326-328. 9. Major B., Nemestóthy N., Kelemen-Horváth I., Gubicza L.: Ethyl Lactate Production in Non-Conventional Media under Normal and Microwave Conditions, EUCHEM 2008 Conference on Molten Salts and Ionic Liquids, Koppenhága,

Dánia, 2008. augusztus 24-29, poszter p. 182 10. Major B., Kelemen-Horváth I., Bélafi-Bakó K., Gubicza L.: Enzymatic Production of Ethyl Lactate in Non-Conventional Solvents under Normal and Microwave Heating, 4th International Congress on Biocatalysis 2008, Hamburg, Németország, 2008. augusztus 31 − szeptember 4, poszter p. 256 11. Gubicza L., Bélafi-Bakó K., Bányai T, Major B.: Effect of Ionic Liquids on the Stability and Reusability of Immobilized Candida antarctica lipase B, 8th International Conference on Protein Stabilisation, Graz, Ausztria, 2009. április 14-

17., poszter p. 61

- 134 -

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Ezúton szeretném

szintén megköszönni témavezet mnek, Dr. Gubicza László

egyetemi tanárnak, a PhD munka elkészítése során nyújtott szakmai segítséget és támogatását. Köszönöm Bélafiné Dr. Bakó Katalin intézetigazgató egyetemi tanárnak, hogy támogatta munkámat és dolgozatom elkészítését. Megkülönböztetett köszönet illeti a M szaki Kémiai Kutatóintézet és a Biomérnöki, Membrántechnológiai és Energetikai Kutató Intézet alábbi dolgozóit és volt doktoranduszait: Bányai Tamás, Dr. Búcsú Dénes, Dr. Csanádi Zsófia, Dr. Fehér Erika, Dr. Fráter Tamás, Hunorfi Andrea, Kelemenné Horváth Ilona, Dr. Kiss Katalin, Dr. Koroknai Balázs, Dr. Kovács Sándor, L vitusz Éva, Dr. Molnár Ferencné, Prof. Dr. Nagy Endre, Dr. Nemestóthy Nándor, Németh Gergely, Dr. Vass András Nagy tisztelettel köszönöm a Richter Gedeon Centenáriumi Alapítványnak, a Magyar Mérnökakadémia – Rubik Nemzetközi Alapítványnak, a Peregrinatio Alapítványnak, a Doktoranduszok Országos Szövetségének, a Nemzeti Kutatási és Technológiai Hivatalnak, és a Veszprémi Egyetem Hallgatói Alapítványnak, hogy konferenciákon történ részvételemet támogatták.

- 135 -