Časově rozlišená fluorescence Pokročilé biofyzikální metody v experimentální biologii Ctirad Hofr
5
18.10.2007
1
Ustálená a časově rozlišená fluorescence • Ustálená fluorescence (Steady State) se měří při buzení kontinuálním zářením a dostáváme potom časovou střední hodnotu intenzity či polarizace fluorescence. • Časově rozlišená fluorescence se měří pomocí pulzní excitace (délka pulzu je obvykle kratší než doba dohasínání fluorescence vzorku) nebo fázově modulovaného budícího záření a umožňuje analyzovat časové závislosti měřených parametrů. 5
2
Proč měřit časově rozlišenou fluorescenci? • Udává nám informaci o poklesu intenzity fluorescence v čase • Měření je relativní, často nezáleží na skutečné hodnotě intenzity • Je závislá na vlastnostech okolí • Dává informace o dynamice – rotaci molekul 5
3
Časový průběh fluorescence • Nejjednodušší je exponenciální pokles pro sférické částice −t
I(t) = I0 e
τ
1.2 1 0.8
I I0
0.6 0.4 0.2 0
5
-2
0
2
4
6
time (ns)
8
10 12
4
Čas dohasínání fluorescence τ • τ je střední doba mezi excitací molekuly (tj.absorpcí fotonu) a emisí světla při návratu molekuly do základního stavu log I(t)
Jaká je intenzita
1.2
fluorescence v čase τ po absorpci fotonu? −t
I(t) = I0 e
5
1
τ
Doba dohasínání τ = 2 ns, potom v tomto čase t = τ má fluorescence 37% z intenzity než jakou měla čase 0
Doba dohasínání 2 ns 37% z intenzity v čase 0
37%
1
0.8
0.1
0.6
0.01
0.4
0.01
0.2
0.001
0
-2
0
2
4
6
čas (ns)
8
10 12
0
5
Proč měřit dobu dohasínání fluorescence τ ?
5
•
Absolutní měření – doba dohasínání nezávisí na koncentraci vzorku
•
Doba dohasínání je závislá na okolním prostředí a může být použita k určení jeho polarity, pH, teploty, koncentrace iontů, přítomnosti zhášedla
•
Přidává další rozměr při fluorescenčním mapování – zvyšuje jeho selektivitu
•
Umožňuje měřit rotační korelační čas molekul – rotační pohyblivost
6
Hlavní způsoby měření časové závislosti fluorescence • Pulzní metoda (time-domain) zdrojem excitačního záření je krátký pulz • Metoda fázově modulovaného budícího záření (frequency domain) zdrojem excitačního záření je sinusově modulované světlo 5
7
Pulzní metoda •
•
5
Vzorek je excitován krátkým pulzem s trváním mnohem kratším než doba dohasínání τ Závislost intenzity fluorescence na čase (dohasínání) je použita pro výpočet doby dohasínání τ
8
Počítání fotonů: Time-Correlated Single Photon Counting TSCP Při každém pulzu excitačního světla může být zaznamenán jeden emitovaný foton.
Měří se čas mezi excitačním pulzem a zaznamenaným fotonem.
time
Typické uspořádání je, že jeden foton připadá na 100 excitačních pulzů.
Vytváří se histogram, který znázorňuje časovou distribuci fotonů
5
Pro vyhodnocení křivky dohasínání je potřeba mít soubor alespoň 4000 fotonů
9
Časové značení fotonu (Time Tagged Time-Resolved )
• Zapisuje se nejen čas vyzáření fotonu po jednotlivém pulzu (start-stop-time; ps), ale také čas od začátku experimentu (real-time; ns) Podle firemní literatury PicoQuant http://www.picoquant.com/dl_notes/TechNote_TTTR.pdf 5
10
Zdroje pro TCSPC Laserové diody Ší5ka pulzu FWHM = 70 ps (plná šířka v polovině maxima) Rychlost opakování pulzu 40 MHz
LED (Light Emitting Diode) FWHM = 1,4 ns (plná šířka v polovině maxima) Rychlost opakování pulzu 40 MHz
5
11
Rychlý detektor (MCP PMT)
5
•
Je nejdůležitější při sledování časové závislosti fluorescence
•
V současností jsou nejrychlejší mikrokanálové deskové fotonásobiče (MicroChannel Plate PhotoMultiplier Tube)
•
Mají rychlou odezvu, elektron putuje v detektoru méně než 1 ns. Ve srovnání s klasickým fotonásobičem je odezva 10 krát rychlejší.
12
Detektor - fotonásobič Fokusační elektroda Boční okno 24 mm2 foton Fotokatoda
fotoelektron Vakuum 10-4 Pa Násobiče elektronů (dynody) Anode
5
Light Detectors: Photomultiplier Tube (R928 Side-on)
13 Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
Princip přístroje s TCSPC TBX-04 PHOTON COUNTS
12000 10000 8000 6000
Kumulativní histogram
4000 2000 0 36 35 34 33 32 31 30 29 28 27 26 25 24 23 22 21 20 19 18 17 16 15 14 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1
statistical single photon events
TIME, CHANNELS
nanoLED
S
periodic pulses CFD
SYNC
α ≤ 2%
TAC rate 1MHz Coaxial Delay 50 Ns Sync delay 20 ns
MCA
IBH 5000U
5
V
TAC
Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
14
Praktické určení τ
−t
I(t ) = I0 e
τ
−1
I (τ ) = I 0 e = I 0 ⋅ 0.37 5
15
100000
počet fotonů
10000
Princip skládání (konvoluce) signálů
dohasínání po pulzu δ
1000
Intenzita je funkcí času: I(t)=α exp (-t/τ)
100 10 1 -10
-5
0 ČAS, KANÁLY
100000
δ−1
PHOTON COUNTS
10000 1000
δ−2
5
10
δ0 Složený signál dohasínání
δ−3
Intenzita zdroje světla je také funkcíčasu L(t)
Konvoluce fluorescence : F(t)= I(t) ⊗ L(t)
100 10
δ−4
1
5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 TIME, CHANNELS
16
Časově rozlišená fluorescence fluoresceinu • • •
Fluorescein ve vodě při pH 9.0 Excitace 450 nm Pulzní LED s opakovací frekvencí 20 MHz IRF Instrument Response Function signál zdroje a odezva přístroje
IRF je křivka odpovídající nejkratšímu možnému času dohasínání, který lze na daném přístroji měřit IRF
5
17
Více fluoroforů v systému: multiexponenciální dohasínání I(t) =α1 e +α2 e ...+αN e τN −t
τ1
−t
τ2
−t
I(t) =αi exp(−t /τi )
5
•
αι poměrné zastoupení fluoroforu
•
τι doba dohasínání daného fluoroforu
•
Celková intenzita je dána součtem (konvolucí) příspěvků od každého fluoroforu
•
Při analýze je nutno použít dekonvoluce – rozklad signálu na příspěvky jednotlivých fluoroforů
18
Rozlišení skládání signálů dvou fluoroforů (dekonvoluce)
5
•
Při určování příspěvků od jednotlivých fluoroforů někdy není možno přesně určit α a τ, protože ke stejnému proložení můžeme použít jejich různé kombinace
•
Různé dvojice αι a τι mohou dát velmi podobný tvar křivky dohasínání
19
Časově rozlišená fluorescence lidského sérového albuminu HSA
Fluoroforem je tryptofan V proteinu je tryptofan jenom jeden, přesto je časová závislost dohasínání vícexponenciální. Je to dáno různými konformacemi proteinu v roztoku Tryptofan se nachází ve více různých lokálních prostředích 5
Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
20
Metoda fázově modulovaného budícího záření 1. Vzorek je excitován sinusově modulovaným světlem s vysokým frekvenčním rozsahem srovnatelným s převrácenou hodnotou doby dohasínání 2. Když dojde k excitaci vzorku modulovaným zářením, emitované záření fluorescence odpovídá modulační frekvenci budícího absorbovaného záření 3. Emise je časově zpožděna ve srovnání s budícím zářením, což se projeví fázovým posunem. Fázový posun je použit k výpočtu doby dohasínání fluorescence τ
5
21
Určení doby dohasínání metodou fázové modulace 2
Φ
fázový posun
excitační záření emise fluorescence
Modulace excitace b/a
Intenzita
1
(výška peaku/střední intenzita)
b
Modulace emise B/A
B
0
-1
a
Relativní modulace m A
B/ A m= b/a
-2 0
2π (360°)/T
4π (720°)/2T
6π (1080°)/3T
stupně/čas Určení času dohasínání z fázového posunu Φ
tan Φ = ωτ Φ 5
Určení času dohasínání z modulace m
m=
1 1 + ω 2τ m2
22
1.5 M
AMPLITUDE
1
=
(
)
(
)
Princip měření pomocí fázové modulace
0.5 0 -0.5 -1
φ
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1
5
TIME
10 100 Frequency, MHz
1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1000
M
%φ
-1.5
B/ A m= b/a
Poskytnuto HORIBA Jobin Yvon
23
Praktický příklad výpočtu
m= 0.4
Φ = 68° tan Φ = ωτ Φ
τΦ = 5
tan Φ
ω
m=
1 1 + ω 2τ m2
1⎡ 1 ⎤ − 1⎥ τm = 2 ⎢ ω ⎣m ⎦ 24
Závislost parametrů získaných metodou fázové modulace na τ • Čím je kratší doba dohasínání τ, tím více se posunuje průnik křivek k vyšším frekvencím • Pro delší dobu dohasínání τ = 10 µs je nutno použít modulační frekvence 10 kHz až 1 MHz • Pro kratší dobu dohasínání τ = 100 ps je nutno použít modulační frekvence až 2GHz tedy 10 000 krát větší 5
25
Časově rozlišená fluorescence fluoroforů v rozdílném prostředí • Protein se dvěma fluorofory - tryptofany
I(t ) = α1 e
−t
•
•
• •
5
τ1
+ α2 e
−t
τ2
Flourofory mají ve stejném prostředí stejnou hodnotu τ Po přidání zhášedla se sníží doba fluorescence u fluoroforu na povrchu τ2 Výsledkem je „prohnutá“ křivka Úkolem dekonvoluce je pak určit τ1, τ2 a poměrné příspěvky fluoroforů α1,α2
26
Změna rotačního korelačního času při multimerizaci proteinu • Časové závislosti polarizované fluorescence lze použít při sledování změny dynamiky systému molekul • Sledování multimerizace fosfofruktokinázy
θ T = 20 ns o r(t)l g
θM = 5 ns 0
10
20
30
40
Čas (ns)
5
27
Fluorescence LifeTime Imaging Microcsopy
FLIM
• Sledování časové závislosti fluorescence v 2D prostoru • Umožňuje rozlišit prostředí ve kterém se fluorofory nacházejí • Umožňuje sledovat zhášení flouroforů, ať už vlivem prostředí, zhášedla nebo interakce s jinými molekulami 5
28
Použití FLIM při sledování interakce proteinů Rychlejší dohasínání v přítomnosti zhášejícího proteinu
Normální dohasínání H. Wallrabe and A. Periasamy, Imaging protein molecules using FRET and FLIM microscopy, Current Opinion in Biotechnology, Volume 16, Issue 1, Analytical biotechnology, 2005, Pages 19-27.
5
29
Příklad detailního zobrazení FLIM
Závislost doby dohasínání fluorescence NADH je dvouexponenciální s hodnotou 0.4 ns pro volnou a 3 ns pro navázanou molekulu NADH 5
30
Využití časově rozlišené fluorescence při proteomické analýze Gel barvený
Intenzita
Časové rozlišení
Sypro-Ruby
Intenzita je doplněna o pseudobarevné časové rozlišení, aby mohly být oba parametry zviditelněny současně 5
Časové rozlišení fluorescence může pomoci při analýze proteinů v překrývajících Upraveno podle materiálů Materialů Photonic Research Systems Ltd. www.prsbio.com 31 se pásech
Literatura • Lakowicz J.R.: Principles of Fluorescence Spectroscopy. Third Edition, Springer + Business Media, New York, 2006. • Fišar Z.: FLUORESCENČNÍ SPEKTROSKOPIE V NEUROVĚDÁCH http://www1.lf1.cuni.cz/~zfisar/fluorescence/Default.htm Poděkování Grafika z knihy Principles o Fluorescence byla pro účely této přednášky laskavě poskytnuta profesorem J.R. Lakowitzem. 5
32
