ÊÇÍÑÕW ËXÛÒS ÌÛÝØÒ×ÝÕW Ê ÞÎÒT ÞÎÒÑ ËÒ×ÊÛÎÍ×ÌÇ ÑÚ ÌÛÝØÒÑÔÑÙÇ
ÚßÕËÔÌß ÝØÛÓ×ÝÕ_ FÍÌßÊ ÚÇÆ×Õ_ÔÒS ß ÍÐÑÌHÛÞÒS ÝØÛÓ×Û ÚßÝËÔÌÇ ÑÚ ÝØÛÓ×ÍÌÎÇ ×ÒÍÌ×ÌËÌÛ ÑÚ ÐØÇÍ×ÝßÔ ßÒÜ ßÐÐÔ×ÛÜ ÝØÛÓ×ÍÌÎÇ
×ÆÑÔßÝÛ ÚËÔÊ×ÒÑÊCÝØ ÕÇÍÛÔ×Ò Æ ÐGÜÒSÝØ ÊÆÑÎÕG ß ÍÌËÜ×ËÓ ÖÛÖ×ÝØ ÚÔËÑÎÛÍÝÛÒÝÛ ×ÍÑÔßÌ×ÑÒ ÑÚ ÚËÔÊ×Ý ßÝ×ÜÍ ÚÎÑÓ ÍÑ×Ô ÑÎ×Ù×Ò ßÒÜ ÚÔËÑÎÛÍÝÛÒÝÛ ÍÌËÜÇ
ÞßÕßÔ_HÍÕ_ ÐÎ_ÝÛ ÞßÝØÛÔÑÎùÍ ÌØÛÍ×Í
ßËÌÑÎ ÐÎ_ÝÛ
ÛÊß ÎËÞSÒÕÑÊ_
ßËÌØÑÎ
ÊÛÜÑËÝS ÐÎ_ÝÛ ÍËÐÛÎÊ×ÍÑÎ
ÞÎÒÑ îððç
Ó¹®ò ÒßÜT’Üß ÚßÍËÎÑÊ_ô иòÜò
ʧ-±µ7 «8»²3 ¬»½¸²·½µ7 ª Þ®²4 Ú¿µ«´¬¿ ½¸»³·½µ? Ы®µ§.±ª¿ ìêìñïïèô êïîðð Þ®²± ïî
Æ¿¼?²3 ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½» X3-´± ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»æ F-¬¿ªæ ͬ«¼»²¬øµ¿÷æ ͬ«¼·¶²3 °®±¹®¿³æ ͬ«¼·¶²3 ±¾±®æ Ê»¼±«½3 ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»æ Õ±²¦«´¬¿²¬· ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»æ
ÚÝØóÞßÕðîêçñîððè ßµ¿¼»³·½µ# ®±µæ îððèñîððç F-¬¿ª º§¦·µ?´²3 ¿ -°±¬(»¾²3 ½¸»³·» Ûª¿ Ϋ¾3²µ±ª? ݸ»³·» ¿ ½¸»³·½µ7 ¬»½¸²±´±¹·» øÞîèðï÷ Í°±¬(»¾²3 ½¸»³·» øîèðêÎððî÷ Ó¹®ò Ò¿¼4‚¼¿ Ú¿-«®±ª?ô иòÜò
Ò?¦»ª ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»æ צ±´¿½» º«´ª·²±ª#½¸ µ§-»´·² ¦ °'¼²3½¸ ª¦±®µ' ¿ -¬«¼·«³ ¶»¶·½¸ º´«±®»-½»²½»
Æ¿¼?²3 ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»æ Ñ°¬·³¿´·¦¿½» °±-¬«°« ·¦±´¿½» º«´ª± µ§-»´·² ¦ °'¼ ¿ ²?-´»¼²7 ³4(»²3 ¶»¶·½¸ º´«±®»-½»²½»ò Æ°®¿½±ª?²3 ²¿³4(»²#½¸ ¼¿¬ò Ô·¬»®?®²3 -¬«¼·»ò
Ì»®³3² ±¼»ª¦¼?²3 ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»æ îçòëòîððç Þ¿µ¿´?(-µ? °®?½» -» ±¼»ª¦¼?ª? ª» ¬(»½¸ »¨»³°´?(3½¸ ²¿ -»µ®»¬¿®·?¬ &-¬¿ª« ¿ ª »´»µ¬®±²·½µ7 º±®³4 ª»¼±«½3³« ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»ò ̱¬± ¦¿¼?²3 ¶» °(3´±¸±« ¾¿µ¿´?(-µ7 °®?½»ò
óóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóó Ûª¿ Ϋ¾3²µ±ª? ͬ«¼»²¬øµ¿÷
Ê Þ®²4ô ¼²» ïòïîòîððè
óóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóó Ó¹®ò Ò¿¼4‚¼¿ Ú¿-«®±ª?ô иòÜò Ê»¼±«½3 °®?½»
óóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóó ¼±½ò ײ¹ò Ó·´±-´¿ª лµ¿(ô Ýͽò H»¼·¬»´ &-¬¿ª« óóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóóó ¼±½ò ײ¹ò Ö¿®±³3® Ø¿ª´·½¿ô ܮͽò Ü4µ¿² º¿µ«´¬§
ANOTACE Cílem bakalářské práce bylo nalézt optimální postup a podmínky pro izolaci půdní fulvokyseliny (FK) z půdního typu Kambizem modální (lokalita Vatín). Zvolená půda Kambizem obsahovala vyšší zastoupení fulvokyselin než huminových kyselin (37,5 %). V práci se podařilo izolovat a přečistit vzorky fulvokyseliny s výtěžkem 0,3 %. Dále bylo provedeno měření fluorescence synchronní metodou a výsledné spektrum bylo podobné spektru standardu FK Elliot II. Dále byl zjištěn z SFS spekter hlavní fluorofor FK vzorku, který byl určen při excitaci 358 a emisi 448 nm.
ANNOTATION Aim of this bachelor thesis was to find the optimal procedure and evaluation of soil fulvic acid (FA) isolation (soil type Eutric Cambisol, locality Vatín). Soil Cambisol contained higher amount of fulvic acid than humic acid (37,5 %). Isolation and purifying of fulvic acid was made with 0,3 % yield. Fluorescence measurement by synchronous mode was used and compared with spectra of FA standard Elliot II. SFS spectra were similar. The main fluorophore of FA sample at excitation 358 and emission 448 nm from SFS spectra was determined.
KLÍČOVÁ SLOVA Fulvinové kyseliny, fluorescence, charakterizace půdních vzorků
KEYWORD Fulvic acids, fluorescence spectroscopy, characterization of soil origin samples
3
RUBÍNKOVÁ, E. Izolace fulvinových kyselin z půdních vzorků a studium jejich fluorescence. Brno: Vysoké učení technické v Brně, Fakulta chemická, 2009. 34 s. Vedoucí bakalářské práce Mgr. Naděžda Fasurová, Ph.D.
PROHLÁŠENÍ Prohlašuji, že jsem bakalářskou práci vypracovala samostatně a že všechny použité literární zdroje jsem správně a úplně citovala. Bakalářská práce je z hlediska obsahu majetkem Fakulty chemické VUT v Brně a může být využita ke komerčním účelům jen se souhlasem vedoucího bakalářské práce a děkana FCH VUT.
................................................ podpis studenta
PODĚKOVÁNÍ Děkuji tímto své vedoucí Mgr. Naděždě Fasurové, Ph.D. za podnětné návrhy a připomínky, veškerou pomoc a ochotu při tvorbě bakalářské práce a dále rodině za podporu a trpělivost.
4
OBSAH 1 2
3
4 5 6
ÚVOD ........................................................................................................................6 Teoretická část............................................................................................................7 2.1 Půda....................................................................................................................7 2.1.1 Podmínky půdotvorného faktoru .................................................................7 2.1.2 Fyzikální charakteristika půd.......................................................................7 2.1.3 Formy půdní vody .......................................................................................7 2.1.4 Klasifikace půd ...........................................................................................8 2.2 Humus ................................................................................................................8 2.2.1 Humusové látky ..........................................................................................8 2.3 Huminové látky – rozdělení ................................................................................9 2.4 Koloidy.............................................................................................................10 2.4.1 Kationtová výměnná kapacita půd .............................................................11 2.5 Půdní typy.........................................................................................................11 2.6 Izolace huminových látek z půd ........................................................................12 2.6.1 Metoda izolace huminových látek podle Hayes .........................................13 2.6.2 Postup podle Piccolo .................................................................................13 2.6.3 Postup izolace HK z půd z AF MZLU v Brně............................................13 2.6.4 Frakcionace HL – MZLU ..........................................................................14 2.7 Fluorescence teorie ...........................................................................................14 2.7.1 Elektronová spektroskopie, elektronové přechody .....................................14 2.7.2 Emise z elektronových excitovaných stavů – luminiscenční jevy...............15 2.7.3 Fluorescence .............................................................................................15 2.8 Literární studie..................................................................................................16 Experimentální část ..................................................................................................18 3.1 První použití Supelite........................................................................................19 3.2 Příprava kolony.................................................................................................19 3.2.1 Určení objemu pryskyřice v koloně ...........................................................19 3.2.2 Průtoky a objemy roztoků..........................................................................19 3.3 Postup izolace pro naše vzorky FK....................................................................20 3.3.1 Výsledky izolace FK a elementární analýzy preparátu FK .........................21 3.4 Měření fluorescence – spektra, výsledky ...........................................................23 3.4.1 Vyhodnocení synchronních emisních spekter ............................................28 Závěr ........................................................................................................................30 Použité zkratky a symboly ........................................................................................31 Seznam použitých zdrojů ..........................................................................................32
5
1
ÚVOD
Půdní typ Kambizem je nejrozšířenější na území České republiky. Lokalita Vatín je pokusná plocha AF MZLU. Tato bakalářská práce byla zaměřena na izolaci fulvokyselin z Kambizemě modální lokalita Vatín. Této práci předcházela izolace HK z půdy Kambizem, která byla provedena kolektivem právě na MZLU. V případě této půdy bylo nejprve zjištěno, že obsahuje jak huminové (HK) tak i fulvokyseliny (FK), obsah fulvokyselin byl vyšší (37,5 %). Z tohoto důvodu byl k izolaci FK vybrán tento půdní typ. Výtěžek fulvokyselin z půd je vždy mnohem nižší než u huminových kyselin. Obsah huminových a fulvinových kyselin, respektive jejich poměr, udává kvalitu huminových látek dané půdy. Práce byla zaměřena na vypracování optimálního postupu izolace a přečištění a následně byla studována fluorescence izolovaného preparátu FK.
6
2
TEORETICKÁ ČÁST
2.1 Půda Půda je složka přírodního prostředí, která je v úzkém vztahu s ostatními geosférami. Spolu s atmosférou, hydrosférou a biocenózou tvoří ekosystém. Vyvíjejí se v důsledku působení půdotvorných faktorů a podmínek. Člověk je s půdou existenčně spojen – je to základní, omezený a neobnovitelný zdroj produkce potravin a přírodního bohatství [1]. Půda se od hornin a zvětraliny liší výraznou charakteristickou vlastností – úrodností. Úrodnost je schopnost poskytnout životní podmínky pro rostliny a organismy. Je to dynamická vlastnost, závislá na řadě fyzikálních, biologických a chemických faktorů, kterou půda získává během svého vývoje. Úrodnost půdy potenciální (přirozená) je určena genetickým vývojem a přírodními podmínkami, efektivní (skutečná) úrodnost bývá obvykle vyšší, je to přirozená úrodnost obohacená zásahy člověka [2].
2.1.1 Podmínky půdotvorného faktoru K podmínkám půdotvorného faktoru řadíme hlavně nadmořskou výšku, zeměpisnou polohu a stáří půdy. Půdotvorné faktory tvoří mateční hornina, což je převládající součást hmoty půdy, která ovlivňuje zrnitost a tím pádem i ostatní půdní vlastnosti [3]. Dalším faktorem je podnebí (klimatický faktor). Teplo podmiňuje účinnost půdní vody a stupeň ovlhčení půdy. Vzájemný poměr srážek a vypařování ovlivňuje vnitřní pochody v půdě. Biologický činitel půdotvorného procesu má značný vliv na úrodnost, podzemní voda se uplatňuje zejména materiálně a díky kultivaci dochází k zásadním změnám fyzikálních vlastnostech a úrodnosti půdy [2]. Hlavní význam v přírodě je skutečnost, že půda tvoří pedosféru, což je složka přírodního prostředí [1].
2.1.2 Fyzikální charakteristika půd Půdu můžeme popsat fyzikální charakteristikou půdy. K základním fyzikálním vlastnostem patří zrnitost, měrná a objemová hmotnost, pórovitost a struktura, hydrofyzikální a aerační vlastnosti půdy jsou vlhkost, vodní kapacita, propustnost, vzlínavost a vzdušná kapacita. Teplotní vlastnosti charakterizuje tepelná a teplotní vodivost a teplota. Fyzikálně mechanické vlastnosti zastupuje soudržnost, přilnavost, konzistence, uléhavost, hutnost a hrudovatění [4]. 2.1.3 Formy půdní vody − − − − − −
chemicky vázaná (součást molekul, uvolňována při vysokých teplotách) hydratační (tvoří kolem iontů hydratační obaly, pevně vázaná voda) hygroskopická (absorbují ji půdní částice z půdního vzduchu, je nepohyblivá) obalová (vytváří obaly na povrchu půdních částic, obtížně přijatelná pro rostliny) kapilární (nachází se v kapilárních pórech) gravitační voda (nachází se v nekapilárních pórech, pohybuje se vlivem gravitačních sil) [4]
7
2.1.4 Klasifikace půd Půdy klasifikujeme podle procentuálního zastoupení jednotlivých velikostních frakcí zrn. Zrnitost ovlivňuje technologickou povahu půdy, patří mezi základní charakteristiky půd. Ovlivňuje zvětratelnost půdy, poměry hrubých nekapilárních a jemných kapilárních pórů má vliv na vsakování vody, dále významně působí na sorpční schopnost půd. Podle zastoupení částic menších než 0,01 mm rozlišujeme 7 druhů zemin v jemnozemi. Obsahuje-li zemina více jak 75 % skeletu, označujeme ji jako kamenitou (štěrkovitou). Při obsahu 50 – 75 % silně štěrkovitá, do 50 % středně štěrkovitá a při obsahu 10 – 25 % slabě štěrkovitá. Vápenité zeminy rozlišujeme podle obsahu CaCO3 na vápenaté zeminy (více jak 60 % CaCO3), slízy (do 60 %), vápenité (do 25 %) a slabě vápenité (do 3 %). Humusové zeminy obsahují přes 20 % humusu a podle množství jílnatých částic (větších jak 0,01 mm) je dělíme na jílovité (nad 45 %), hlinité (do 45 %) a písčité (do 20 %) [1].
2.2 Humus Organické látky v půdě zásobují rostliny živinami. Humus tvoří zbytky rostlinných a živočišných organismů, přispívá k formování prostředí pro růst rostlin a je nezbytný pro biologickou činnost půd [3]. Z chemického hlediska jde o soubor tmavě zbarvených organických dusíkatých polyfunkčních látek kyselinové povahy, které jsou převážně koloidního charakteru. V orných půdách jsou hlavním zdrojem humusového materiálu (což je organická hmota nedotčená rozkladnými procesy) rostliny, které po sklizni plodin zůstanou v půdě. Prvním procesem přeměny organické hmoty – mineralizace je proces úplného rozkladu organických látek za příznivých teplotních a vlhkostních podmínek, který vede až k jednoduchým složkám – CO2, H2O, NH3, oxidy různých prvků a jiné. Druhým procesem, který probíhá souběžně s mineralizací, je rašelinění a uhelnatění organické hmoty, které probíhá anaerobně za nízkých teplot. Vlastní humifikace probíhá převážně anaerobně, je to soubor mikrobiologických, převážně enzymatických a biochemických pochodů, při nichž dochází k rozkladu organických látek na zcela nové látky – látky huminové. V našich podmínkách podléhá mineralizaci 50 – 58 % humusového materiálu, zbytek pak humifikaci. Podle chemického složení rozdělujeme humus na 2 skupiny: nespecifické humusové látky (nehuminové neboli primární látky – látky organické povahy, lehce rozložitelné, snadno odbouratelné mikroorganismy) a specifické (huminové neboli sekundární látky – vysokomolekulární organické látky, biologicky rezistentní) [1].
2.2.1 Humusové látky V procesu humifikace vznikají humusové látky, pro které je typické, že je vliv na metabolismus rostlin se projeví již při nízkých koncentracích. V nejčastějším případě rozlišujeme dvě základní skupiny humusových látek – fulvokyseliny a huminové kyseliny. V procesu extrakce humusových látek se působením NaOH nejprve oddělí nerozpustné humusové látky (humín, ulmen) a roztok hnědé látky. Přidáním HCl do tohoto roztoku vznikne sraženina a rozpustná část - fulvokyseliny (krenová a apokrenová kyselina). Působíme-li na sraženinu alkoholem, získáme rozpustnou (hymatomelanovou kyselinu) a nerozpustnou část (huminové a ulmínové kyseliny) [1], [5]. Postup je názorně popsán na obrázku 1.
8
Organické sloučeniny v půdě
Žijící organismy
Půdní organická hmota
Stabilní
Nestabilní
Alkalické srážení
Alkalicky rozpustný humusový fragment
Nerozpustný zbytek HUMIN
Kyselé srážení Nerozpustný zbytek HUMINOVÉ KYSELINY
Rozpustná část FULVOKYSELINY
Obrázek 1: Schéma dělení huminových látek v závislosti na rozpustnosti [6]
2.3 Huminové látky – rozdělení Huminové kyseliny, podskupina huminových látek, která není rozpustná ve vodě ani v kyselém prostředí, ale je rozpustná v alkalickém prostředí. V běžných podmínkách jsou pevně vázány na minerální podíl půdy. Základní složkou je aromatické jádro fenolického nebo chinoidního typu s cyklickými i alifatickými dusíkatými sloučeninami. Barva huminových kyselin se mění od hnědé po šedou. Mají vyšší stupeň kondenzace a polymerace i vyšší molekulovou hmotnost [5]. Huminové kyseliny výrazně ovlivňují vlastnosti půdy, které podmiňují vysokou úrodnost [1].
9
Obrázek 2: Příklad možné chemické struktury huminové kyseliny [7] Z huminových kyselin se alkoholovou extrakcí oddělují hymatomelanové kyseliny. Tyto žlutě až žlutohnědě zbarvené sloučeniny mají oproti huminovým kyselinám menší molekulovou hmotnost. Silně karbonizované organické hmoty, pevně vázány na minerální podíl v půdě jsou humíny a humusové uhlí. Humíny bývají charakterizovány jako nerozpustné formy huminových kyselin, humínové uhlí je vývojově nejstarší složkou produktů humifikace. Žlutě nebo hnědě zbarvené fulvokyseliny jsou zlomek huminových látek, které jsou rozpustné za všech podmínek pH. Mají charakteristickou dobrou rozpustnost ve vodě, minerálních kyselinách, louzích i v roztocích hydrolyticky zásaditých solí. Vodní roztoky fulvokyselin jsou výrazně kyselé (pH 2,6 – 2,8), v důsledku toho a dobré rozpustnosti jsou ve vodě velmi agresivní na minerální část půdy, kterou připravují o živiny a koloidní látky. V porovnáním s huminovými kyselinami mají fulvokyseliny jednodušší stavbu makromolekuly, nižší molekulovou hmotnost, stupeň kondenzace i polymerace [1].
Obrázek 3: Příklad možné chemické struktury fulvokyseliny [7]
2.4 Koloidy Soustavy, kde se jedna látka vyskytuje v malých částečkách (koloidní částice) a tyto částečky jsou rozptýleny v látce druhé, nazýváme koloidní systém (koloidní roztok). Složitý koloidní systém organických i anorganických sloučenin je prostředí půda a rostlina. Velikost koloidních částic se pohybuje v rozmezí 1-1000 nm
10
Koloidy lze klasifikovat podle fáze (skupenství) dispergované látky a prostředí, v němž je látka dispergována (disperzní prostředí), dále podle struktury dispergované látky. Odlišné rozdělení se používá, když je disperzní prostředí kapalina – existují lyofilní (částice mají velkou afinitu k rozpouštědlu) a lyofobní systémy (afinita mezi disperzním prostředím a částice není, nevytváří se solvatační obal). Podle tvaru koloidy můžeme dělit na izometrické (stejné rozměry jednotlivých stran, kulovitý tvar) a anizometrické (nestejné rozměry jednotlivých stran jílové materiály). Další možné rozdělení je podle schopnosti disociace a adsorpce na acidoidy – uvolňují a adsorbují kationty, tvoří je jílové minerály, v půdě převažují, bazoidy – uvolňují a adsorbují anointy a amfolytoidy – v kyselém prostředí se chovají jako bazoidy, v alkalickém jako acidoidy. Důležitou vlastností koloidů je malá velikost (menší než 2 μm) a adsorpce díky velkému aktivnímu povrchu. Koloidní částice mají elektrický náboj a vykazují koligativní vlastnosti (snížení bodu tuhnutí, zvýšení bodu varu, osmotický tlak). Koloidní látky v půdě se vyskytují v sekundárních jílových materiálech, dále jsou to hydratované oxidy Fe a Al (převážně v tropických a subtropických oblastech), alofán (amorfní koloidní materiál půdy, Al silikát se složením Al2O3·2SiO2+H2O) a humus [8]. 2.4.1 Kationtová výměnná kapacita půd Výměnná kapacita se značí písmenem T. Jde o množství iontů, které je půda schopná absorbovat. Je možno určit zastoupení jednomocných i dvojmocných kationtů. Výslednou S hodnotu udává poměr . Podle nasycení sorpčního komplexu jednotlivými ionty nastává T - sorpční komplex nasycený převahou H+ iontů - sorpční komplex nasycený dvojmocnými kationty - sorpční komplex nasycený jednomocnými kationy Dělení humusu podle reakce a sorpčního nasycení - neutrální, sorpčně nasycený (účastní se tvorby sorpčního komplexu, slouží jako zásobárna pro rostliny) - kyselý, sorpčně nenasycený (zvyšuje půdní kyselost, má vliv na biologickou činnost edafonu) [4].
[Micela ]Ca 2+ (koloid ) + 2H + (roztok) ↔ [Micela ] HH (koloid ) + Ca 2+ (roztok) + +
Obrázek 4: Princip kationtové výměny [4]
2.5 Půdní typy Na Zemi se vyskytuje obrovské množství nejrůznějších půdních forem – tisíce půdních profilů, které mají různou hloubku, mocnost horizontů, obsah humusu, zrnitost. Půdy se mohou třídit podle různých kritérií (matečná hornina, klima, vegetace, …), nejvhodnějším způsobem třídění půd je půdní geneze, při kterém je kritériem pro třídění způsob, jak půda vznikla. Tyto klasifikace podle genetiky využívají ke třídění vnitřní znaky půd a jednotky, podle kterých se tato klasifikací třídí se nazývají půdní typy. Půdní typ je souhrn půd stejného vývojového stupně, jejichž půdotvorné procesy byly vyvolány a řízeny obdobnými půdotvornými faktory, a které tudíž mají souhlasné znaky a tím i horizonty. První genetickou klasifikaci půd sestavil v r. 1886 ruský pedolog Dokučajev, od té doby vzniklo nepřeberné množství nejrůznějších půdních klasifikací [3]. 11
Území České republiky se vyznačuje poměrně velkou rozmanitostí půdních typů a přechodů mezi nimi. K nejznámějším půdním typům podle klasifikačního systému půd ČR patří černozem – CE, vyskytující se ve spraších, bývalých stepích a nížinách s kontinentálním klimatem, vyznačujícím se horkým létem a chladnou zimou, kde je vyšší průměrná teplota a srážky 450-600 mm, jsou charakteristické orničním Ap a černickým Ac horizontem a obsahem humusu okolo až 3 %. Černozemě patří k nejúrodnějším půdám, mají dobré fyzikální, chemické i biologické vlastnosti, jejich pH je neutrální až slabě alkalické. Dalším půdním typem je hnědozem – HN, která je součástí hornice (Ap orniční horizont, Ap (E) eluviální horizont – ojediněle, Bt – luvický horizont) s neutrálním pH. Vzniká ze spraší v rovinatém a mírně hornatém reliéfu, má příznivé množství humusu 1,3 – 2,5 %. Luvizem – LU (illimerizovaná půda) patří mezi úrodné půdy, které bývají zemědělsky obhospodařované. Tyto půdy se vyvíjejí v rovinatých nebo mírně hornatých plochách v oblastech mírného klimatu nebo v teplých oblastech se střídáním suchého a vlhkého období s přirozenou vegetací opadavých nebo smíšených lesů, případně travních porostů. V oblastech s mírným klimatem se na nich pěstují obiloviny, krmné plodiny a cukrovka. Jejich název pochází od dominantního procesu, kterým je vymývání jílu a jeho přesunu do akumulačního B horizontu. Luvisoly bývají pórovité, dobře provzdušněné a mají příznivé fyzikální vlastnosti. Kambizem – KA (hnědá půda) patří k nejrozšířenějším půdním typům s pH slabě kyselým a obsahem humusu okolo 2 %. Mají kambikový B horizont, který je diagnostickým horizontem pro všechny kambisoly. V kambisolech probíhá proces brunifikace, což je uvolňování a zvýšená aktivita Fe, která dává B horizontu hnědou barvu. V mírných klimatických podmínkách jsou zemědělsky využívané, bývají často lesnicky obhospodařovány, vyskytují se ale i v tropech. Podzol – PZ (podzolová půda) má popelavě šedou barvu. Tyto půdy se vyskytují zejména pod jehličnatými lesy a vřesovišti, jejichž opad je obtížně rozložitelný. Půdy nejsou vhodné pro zemědělství, jejich charakteristickým znakem je nízký obsah živin, kyselá reakce a malá biologická aktivita. Fluvizem – FL (nivní půda) rozšířen na celém světě ve všech klimatických zónách, vyvíjejí se především v zaplavovaných oblastech v okolí řek. Sedimenty, materiál, který se dostal do vodních toků erozí v povodí, obsahují značné množství živin. Půdy jsou často úrodné, vlhčí, ale znečištěné [1 – 4]. V Jihomoravském kraji se nejčastěji vyskytuje ve formě orné půdy hnědozem, dále černozem a fluvizem. V oblasti Žďáru nad Sázavou jsou lesnaté krajiny s půdou typu Kambizemě, v oblasti Břeclav, Hodonín a Znojmo převládá černozemě a hnědozemě a luvizemě se vyskytují v okolí Znojma [2].
2.6 Izolace huminových látek z půd Existuje celá řada možných postupů izolace huminových kyselin, například podle Schnitzer a kol. (1978) [9], Aiken (1985) [10], Clapp a Hayes (1996) [11], Swift (1996) [12]. Metody izolace se liší hlavně v použité extrakční směsi a také jsou již zavedeny postupy pro izolaci huminových kyselin z různých přírodních zdrojů. Postup pak závisí na tom, v jaké fázi je výchozí vzorek a také kolik procent huminové kyseliny obsahuje. Přesto, že obsah huminových látek v minerálních půdách je obvykle v rozmezí jednoho až pěti procent, mají významný vliv na půdní vlastnosti. Půdní vzorky bývají ve výzkumných
12
zprávách charakterizovány frakcionací, to znamená kolik % obsahuje vzorek půdy HK a FK. Za standardní způsob izolace je považován postup, který popsal Hayes (1985). Tato studie poukázala hlavně na rozdíly mezi huminovými látkami izolovanými z vod v různých obdobích roku a půdními HL [13]. 2.6.1 Metoda izolace huminových látek podle Hayes Hayes předložil podrobnou úvahu zásad a postupů, které se vztahují k izolaci huminových látek. Pro izolaci huminových látek z půdy využíváme vhodných rozpouštědel. Rozpustnosti je nejlépe dosaženo prostřednictvím solvatace aniontových částí huminových látek. Zodpovědnost za charakter a podstatu má vyvážení kationtů a negativních nábojů v huminové látce. Dominantou vyměnitelných kationů jsou di- a trivalentní (především Ca2+, Mg2+, Fe3+ a Al3+) a tyto kationy se pevně drží na huminové aniontové části. Takové kationy v podobě inter- a intramolekulárních mostů mezi aniontovými lokalitami potlačují odpor a zabraňují solvataci. Hayes dospěl k závěru, že dobrá organická rozpouštědla pro huminové látky mají elektrostatický faktor (součin relativní permitivity a dipól okamžiku) hodnoty větší než 140 a pHKB hodnoty menší než 2. Dimethylformamid a dimethylsulfoxid splňují tyto požadavky a jsou tedy dobrá rozpouštědla pro huminové kyseliny. V literatuře byl popsán tento obecný způsob používaný k izolaci huminových a fulvinových kyselin. Nejprve je třeba půdu okyselit (pomocí HCl), odstředit a oddělit supernatant - roztok (frakce 1), potom se ke zbytku půdy přidává 1 M NaOH na hodnotu pH 7 a extrahují s 0,1 M NaOH, odstřeďují a následně se supernatant upravuje na pH 1 (pomocí 6 M HCl). Takto se nejprve izolují huminové, poté fulvinové kyseliny. Huminové kyseliny se srážejí a oddělují od frakce fulvinových kyselin, které zůstanou v roztoku. Fulvinové kyseliny se pak sorbují na hydrofobní pryskyřici v koloně [13].
2.6.2 Postup podle Piccolo 50 g jemnozemě z organického horizontu nebo 100 g jemnozemě z minerálního horizontu je nejprve promyto 0,1 M HCl (do doby, až je test na AgNO3 negativní). Zemina se poté třepe 24 hodin s 0,5 l směsí, která obsahuje 25 ml 0,5 M NaOH a 25 ml 0,1 M Na4P2O7 a zbytek je destilovaná voda. Suspenze se odstředí (5 minut, 11 000 rpm), roztok se odlije a okyselí koncentrovanou HCl na hodnotu pH 1. Sediment se protřepe a opakovaně extrahuje. Roztoky byly po okyselení spojeny a hodnota pH byla upravena na hodnotu 1 pomocí HCl. Vysrážené huminové kyseliny se odstředily a roztok obsahující fulminové kyseliny byl odlit. K sedimentu bylo přidáno asi 0,5 l 1 M NaOH a následně byl protřepán. Huminové kyseliny se rozpustily a poté pomocí koncentrované HCl znovu sraženy – tento postup byl opakován celkem třikrát. Odstředěné huminové kyseliny byly znovu extrahovány a pak okyseleny ještě dvakrát, následně bylo provedeno přečištění huminových kyselin pomocí směsi 0,5 l směsi HF+HCl (5 ml od obou kyselin je dolito destilovanou vodou) a čisté huminové kyseliny přelity do dialyzačního vaku. Vak je umístěn do destilované vody, která je pravidelně měněna, dokud nejsou odstraněny veškeré chloridové anionty. Poté je roztok vymražen [14].
2.6.3 Postup izolace HK z půd z AF MZLU v Brně Izolace HK z půdy je prováděna v souladu se standardní mezinárodní IHSS metodou. 100 g vzduchem prosušeného vzorku půdy, přesetého přes síto s velikostí ok 1 mm, se
13
nejprve promyje 10% HCl a pak se míchá po dobu 1 – 2 hodin. Po negativní reakci na CO2 se půda promyje 0,05 M HCl. Po negativní reakci na Ca2+ (zjištění pomocí šťavelanu amonného) půda se promyje destilovanou vodou. Po negativní reakci na Cl- (zjištění pomocí AgNO3) se zbytek půdy protřepe s 0,1 M NaOH po dobu 7 – 8 hodin. Získaná sraženina se poté odstředí po dobu 15 minut při 5000 rpm. Následně se provede eluce roztokem 0,1 M NaOH a pak se směs odstředí dvojnásobnou extrakcí a následně se spojí s roztokem Supernatantu. Získá se tmavě hnědý roztok, ze kterého se huminové kyseliny vysráží pomocí koncentrované HCl při pH = 1. Vysrážené huminové kyseliny se dekantují a promyjí vodou a pak přečistí 0,5% směsi HCl + HF a dialyzují v destilované vodě a vymrazí [15].
2.6.4 Frakcionace HL – MZLU Navážených 5 g vzorku (jemnozem I) se v 250 ml PE láhve zalije 100 cm3 směsí pyrofosforečnanu sodného a NaOH (pH = 13) a ponecháme stát 24 h. Poté se důkladně protřepe a odstředí (10 minut při 2000 otáčkách). Získaný čirý eluát se sbírá do 250 cm3 odměrky. Usazenina se opět zalije 50 cm3 pyrofosforečnanu sodného, důkladně se promíchá a odstředí se. Postup se opakuje třikrát. Eluát se sbírá do 250 cm3 odměrky a do požadovaného objemu se doplní zbylou směsí pyrofosforečnanu sodného. Tento výluh se použije ke stanovení UVVIS spekter HK. Pro stanovení frakčního složení (veškerých huminových látek) se odpipetuje 2 x 25 cm3 do Erlenmayerových baněk a 2 x 50 cm3 výluhu do kádinek. Výluhy v baňkách se nechají odpařit dohněda. Po vychladnutí se přidá spalovací směs a nechá stát 24 h. Poté se naředí deionizovanou vodou, přidá kyselina fosforečná a indikátor. Titrujeme roztokem Mohrovy soli a stanovíme obsah veškerých huminových látek. Do kádinek se přidá 1 ml konc. kyseliny sírové, opatrně promíchá a spaluje 15 minut v sušárně vyhřáté na 60 °C. Po vychladnutí se sraženinu huminové kyseliny odstředí (10 minut, 1800 otáček). Eluát, který obsahuje FK se vylije a sraženina HK se kvantitativně přenese zpět do kádinky a nechá se odpařit. Titrací se stanoví obsah CHK [16].
2.7 Fluorescence teorie Emise záření, která nastává při přechodu excitované molekuly do základního stavu se nazývá luminiscence. K fluorescenci dochází při přechodu z první hladiny excitovaného singlového stavu do základního singletového stavu. Měření fluorescence se provádí na fluorescenčních mikroskopech, fluorescenčních skenerech a spektrofluorimetrech. Výsledky měření mohou být ovlivněné různými faktory, jako jsou například intenzita zdroje, účinnost optického systému, velikost štěrbiny monochromátoru nebo citlivost detektoru [17]. 2.7.1 Elektronová spektroskopie, elektronové přechody Absorpce nebo emise záření v infračervené, viditelné nebo ultrafialové oblasti spekter způsobují přechody mezi různými elektronovými stavy molekul. Tyto elektronové přechody doprovází přechody mezi různými vibračními a rotačními stavy molekul, které způsobují složení elektronových spekter z velkého počtu čar. Důsledkem rozšíření je tzv. elektronový pás. Díky podmínění elektronovými přechody jsou fluorescence a fosforescence řazeny k elektronovým spektrům. Elektronový přechod z jednoho elektronového stavu do jiného je současně doprovázen přechody mezi různými vibračními a rotačními stavy: ΔE = ΔEe + ΔEv + ΔEr , kde ∆Ee energetickou hladinu elektronových stavů, ∆Ev hladinu vibračních stavů a ∆Er energetickou hladinu rotačních stavů.
14
Při excitaci ze základního do excitovaného stavu mohou nastat čtyři možnosti: 1) Elektronový přechod se uskuteční do vyššího, stabilního elektronového stavu (kde může být molekula v různém vibračním a rotačním stavu). 2) Elektronový přechod se uskuteční do vyššího, nestabilního elektronového stavu (může vést k disociaci molekuly). 3) Elektronový přechod se uskuteční do vyššího, stabilního stavu (tak vysokého, že může dojít k vibrační disociaci molekuly). 4) Elektronový přechod způsobí ionizaci molekuly. Intenzita přechodů mezi různými elektronovými stavy nacházejících se v různých vibračních a rotačních stavech je často velmi rozdílná. Vysvětlení rozdílných intenzit přechodů do různých vibračních stavů poskytuje Franck-Condonův princip. Je založený na myšlence, že čas potřebný na elektronovou excitaci je mnohem kratší než čas potřebný na změnu souřadnic jader. Proto ihned po excitaci elektronu má molekula stejnou geometrii jako v počátečním stavu [17].
2.7.2 Emise z elektronových excitovaných stavů – luminiscenční jevy Deaktivace elektronového stavu může být způsobena emisí záření (luminiscence) nebo nezářivým přechodem. Emise záření při přechodu mezi elektronovými stavy o stejné multiplicitě (přechod excitovaný singletový stav – základní singletový stav) nazýváme fluorescence [17].
2.7.3 Fluorescence Excitace ze základního stavu bude probíhat podle Franck-Condorova principu. Molekula může vzájemnou interakcí a srážkami s okolními molekulami ztrácet svoji vibrační energii – tzv. vnitřní konverze. Vibračně excitovaná molekula proto přejde do základního vibračního stavu v elektronově excitovaném stavu. Vibrační struktura fluorescenčního spektra je závislá na vibračních hladinách základního elektronového stavu. Energie vyzářená při fluorescenci je v důsledku neradiačních přechodů menší než při absorpci, fluorescenční spektrum je posunuté k nižším frekvencím. V porovnání s absorpčním spektrem je spektrum fluorescenční zrcadlovým obrazem (díky podobným vibračním hladinám základního a prvního singletového elektronově excitovaného stavu). Fluorescence je sekundární záření, které po absorpci elektromagnetického záření látka vydává. Každá molekula vykazující fluorescenci má dvě charakteristická spektra. Excitační spektrum charakterizuje relativní účinnost různých vlnových délek excitujícího záření při vyvolání fluorescence. Je to závislost relativní intenzity na vlnové délce excitujícího záření při konstantní vlnové délce emise. Emisní spektrum je závislost intenzity fluorescence na vlnové délce při konstantní vlnové délce excitačního záření. Typy fluorescenčních spekter jsou např. excitační spektra, emisní, synchronní, excitačně emisní [17]. Synchronní fluorescenční spektroskopie (SFS) je rychlý, selektivní a relativně jednoduchý způsob, který charakterizuje molekulární prostředí mnohem citlivěji než většina jiných spektroskopických metod [18]. Používá pro analýzu multifluoroforních vzorků [19]. Při této metodě excitační a emisní monochromátory pracují současně při konstantním rozdílu mezi nastavením jejich vlnových délek. Používá se z důvodu vyššího rozlišení spektrálních píků, kdy dochází oproti excitačním nebo emisním spektrům ke zúžení spektrální šířky pásu.
15
Spektra jsou skenována při zadané hodnotě delta lambda v zadaných rozmezích vlnových délek při podmínce λem=λex+Δλ [20 – 22]. U organické látky se s fluorescencí setkáváme poměrně často, nejintenzivnější a analyticky nejvýznamnější je u sloučenin obsahující aromatické cykly. Anorganické látky vykazují fluorescenci ve značně menší míře, např. u solí vzácných zemin, uranylu, thalia [17].
2.8 Literární studie Izolace HK a FK z půd je popsána v řadě prací, které charakterizují vlastnosti izolovaných huminových látek [23]. Z první generace evropských půd byly izolovány huminové kyseliny. Bylo srovnáváno 5 vzorků typově různých půd (Podzol, Distric a Vertic Kambizem, Luvisol a Redzina) podle jejich struktury, složení a vlastností užitím různých chemických metod (nukleární magnetická resonance, fluorescence a elektronově spinová resonance) [23]. Fluorescenční spektra HL jsou diskutována v řadě prací [24]. Vzorky půdních fulvinových kyselin, huminových kyselin a organických látek z vody byly rozděleny do frakcí metodou HPSEC (gelovou chromatografií) podle velikosti a frakce byly měřeny pomocí UV detektoru. Chromatogramy huminových látek měřené při 254 nm byly mezi sebou porovnány podle absorbance. Integrací těchto chromatogramů byl určen obsah absorbovatelného uhlíku ve vzorcích. Výsledky ukázaly rozdíly mezi frakcemi. Půdní fulvinové kyseliny mají 95 % absorbovaného uhlíku s vyšší fluorescencí než huminové kyseliny, které mají 50 % absorbovaného uhlíku. Dále byly v této prácí měřeny synchronní excitační a luminiscenční spektra stejných vzorků na spektrofluorimetru. Synchronní excitační spektra byla měřena při konstantním rozdílu mezi monochromátory delta lambda od 20 – 100 nm. Byly nalezeny rozdíly mezi frakcemi FK, HK a přírodní organické hmoty. Spektra byla porovnána jako podle intenzit, tak podle polohy hlavních píků. Bylo zjištěno, že KF mají hlavní maximum při nižších vlnových délkách než HK, frakce přírodní organické hmoty měly nejnižší hodnoty intenzit a hlavní pík byl pozorován ve formě širokého pásu v oblasti nižších vlnových délek. Dále synchronní excitační spektra zpracovali do 3D vrstevnicových sprektrofluorogramů [24]. Měření fluorescence může být provedeno různými metodami, např. excitační spektra, emisní, synchronní, excitačně emisní, kdy záleží na parametrech nastavení (vlnová délka excitace, emise a nebo konstantní rozdíl mezi monochromátory). Dále záleží na oblasti měření, na přípravě vzorků atd. Výsledky měření fluorescence jsou běžně porovnávány se standardy huminových látek nebo jsou porovnávány spektra vzorků izolovaných ze stejných matric, případně se porovnávají vzorky HK a FK. Dále mohou být výsledky fluorescence porovnávány s výsledky elementární analýzy, s výsledky frakčního složení nebo s jinými metodami (např. DTA, IR). V práci Borůvka, Mládková a kol. byla stanovena kvalita organické hmoty u kyselých lesních půd v Orlických horách – pod smrkovým a dubovým porostem. K měření vzorků použili spektrofotometrii při vlnové délce 400 a 600 nm a IR-DRIFT spektra. Z IR spektrofotometrie huminu a huminových kyselin bylo zjištěno, že spektra jsou více rozlišená než v případě fulvokyselin vzhledem k obsahu funkčních skupin ve vzorcích [25]. Luminiscenční fluorescenční spektroskopií byly měřeny vzorky a standardy IHSS fulvinových, huminových kyselin a přírodních organických látek izolovaných z různých matric v práci Alberts, Takás (2004). Fulvinové kyseliny získané z půdy, vody a rašeliny byly charakteristické dvěma píky, první s excitační vlnovou délkou v UV oblasti spektra (okolo 250 nm) a další ve viditelné oblasti v pásu 320 – 450 nm. Huminové kyseliny izolované z půd
16
obsahují jeden pík umístěný v excitačně/emisní oblasti vlnových délek, které jsou příbuzné vodním a půdním vzorkům fulvinových kyselin. Relativní intenzita fluorescence byla vyšší pro fulvinové kyseliny než pro huminové kyseliny. Relativní kvantové výtěžky byly zjištěny nejvyšší u FK, dále u přírodních organických látek a nejmenší u huminových kyselin [26]. Cílem práce Szombathová a kol. bylo prozkoumat rozdíly ve fluorescenčních spektrech huminových látek izolovaných z půd. Tyto půdy měly podobné chemické a fyzikální vlastnostmi, ale pocházely z různých ekosystémů. Luminiscenční spektra huminových kyselin vykazovaly dva hlavní píky – první λex/λem = 455/515 nm a druhý λex/λem = 310/480 nm. Hlavní píky fulvinových kyselin byly nalezeny v oblasti λex/λem = 320/430 nm a druhý λex/λem = 310/480 nm. Výsledky ukazují, že fluorescenční charakteristika huminových kyselin může být rozdílná mezi ornou a přírodní půdou. Fluorescenční spektra půdních HK a FK mohou být použity jako indikátory antropogenních jevů v půdě [27]. Na strukturu a složení huminových kyselin může mít vliv působení různých látek. V práci Pedra a kol. byl sledován efekt kompostu a anaerobně upraveného odpadního kalu na složení a strukturu huminových kyselin izolovaných z půd, ke kterým byly tyto komponenty přidány. Huminové kyseliny byly izolovány z dvou různých portugalských půd, pískovitého Haplic Podzol a jílovitého Calcic Vertisol. Bylo zjištěno, že aplikace kompostu do půdy způsobila vzrůst obsahu C, N, H a S a zároveň pokles O, -COOH skupin, fenolických -OH skupin a celkové kyselosti. Výsledky FTIR a fluorescence ukázaly vzrůst alifatického charakteru a pokles aromatické polykondenzace, polymerizace a humifikace půdních huminových kyselin. Obě složky výrazněji ovlivňují vlastnosti huminové kyseliny získané z jílovitých půd než z pískovitých, kvůli rozsáhlému mineralizačnímu procesu, který probíhá u jílovitých půd. V práci byla také měřena 3D EEM spektra, ze kterých bylo zjištěno, že vlivem odpadního kalu dochází k posunu hlavního píku izolované HK v případě půdy Calcic Vertisol k nižším vlnovým délkám emise přibližně o 5 nm [28]. Další studie Milori a kol. byla orientována na studium semichinonových radikálů, jejichž koncentrace v humusu vzrůstá díky humifikačním procesům půdních organických látek. Stanovení těchto radikálů bylo provedeno metodou elektronové spinové rezonance. Bylo porovnáváno 18 druhů HK ze 4 brazilských půd. Práce byla také zaměřena na shrnutí metod určení stupně humifikace, respektive humifikačních nebo fluorescenčních indexů z absorpčních, dále excitačních a emisních spekter. Dva fluorescenční indexy HK byly vypočítány na základě práce Zsolnay et. al and Kalbitz et al. v r. 1999 a třetí nový fluorescenční index byl v práci navrhnut – a to z hodnoty relativní intenzity fluorescence při vlnové délce 465 nm (metodou synchronní excitační fluorescenční spektroskopie) [29]. Využití kapalinové chromatografie (HPLC) při výzkumu huminových látek, které obsahují fenolickou skupinu se zabývají v literatuře Banach, Debska. Právě tato skupina se dá nalézt v huminových a fulvinových kyselinách izolovaných z půdy typu hnědozemě a černozemě. Analýza ukázala rozdíly v stavbě fenolických skupin huminových a fulvinových kyselin [30]. Výsledky biochemiluminescence (UWBL) napomohly k vyhodnocení růstu kořenového systému rostlin hrachu v přítomnosti mikroorganismů a huminových kyselin izolovaných z rašeliny. Experiment byl prováděn v přítomnosti nebo bez huminové kyseliny. Kontrolním vzorkem byla rašelinová usazenina s destilovanou vodou. Statistická analýza ukázala, že roztok huminové kyseliny v prostředí středního pH vykazuje prodloužení kořenů a mikroorganismů, nižší pH nemělo žádný zjištěný vliv [31].
17
3
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST
Použité chemikálie: Hydrofobní resin Supelite DAX-8, výrobce Sigma Aldrich Methanol p. a., výrobce Penta Chrudim 0,1M HCl, 0,5M NaOH – normansky Lach-Ner s.r.o., Neratovice Zásobní roztok NaOH 0,5M (Normanal→1 l odměrka) Roztok na eluci: 0,1M NaOH (200 ml 0,5M zásobního roztoku→1 l odměrka) Zařízení: Aminco Bowman Series 2 Lyofilizátor Labconco pH metr Hanna instruments 212 DSC Shimadzu Dialyzační membrány SpectraPor MWCO 3500 Světelný laboratorní mikroskop s binokulární hlavicí SM 4A a kamerou Sony Vzorky: FK Kambizem, lokalita Vatín FK Elliot Soil FA standard II (3S103F) Zvolený půdní typ: Kambizem modální, lokalita Vatín Půdní vzorky byly odebrány z humusového horizontu (0 – 20 cm) Kambizemě modální na VPS Vatín, AF MZLU v bramborářské výrobní oblasti. Lokalita se nachází v oblasti Českomoravské vrchoviny v nadmořské výšce kolem 530 m. n. m. Jedná se o slabě mírně teplou klimatickou oblast s průměrem ročních srážek 621 mm, které jsou zároveň hlavním limitujícím faktorem půdní úrodnosti. K izolaci byla vybrána varianta OP (orná půda). Půdní typ je identifikován jako Kambizem modální, varieta kyselá, na rule, půdní druh – lehčí střední zemina [32]. Z výsledků frakčního složení provedeného na AF MZLU v Brně vyplývá, že v uvedeném půdním typu je obsaženo 37,5 % fulvokyselin a 25 % huminových kyselin [33]. Z tohoto důvodu byl vybrán pro izolaci právě tento půdní typ. Půdní profil Kambizemě modální na lokalitě Vatín, ze které byl proveden odběr půdy Aop (0 – 23 cm) - ochrický humusový horizont, orán před založením stávajícího pokusu; barva za vlhka hnědá 7,5YR4/4 až 4/3; struktura drobtová, v drnu středně, pod drnem slabě vyvinutá; písčito - hlinitá s příměsí kamení ve spodní části horizontu (do 10 % skeletu); vlhká až vlahá, neplastická (AF MZLU). Podmínky měření fluorescence: Teplota měření: 20 °C (kontrolováno termostatem) Geometrie měření: 90° Excitační sken: při nastavení emise 520 nm, rozsah: 300 – 380 nm, s krokem 1 nm/s Emisní sken: při nastavení excitace 360 nm, rozsah: 380 – 600 nm, s krokem 1 nm/s
18
Synchronní sken (SFS): emisní mod (zaznamenává se závislost relativní intenzity na vlnové délce emise) Parametry měření SFS: rozsah od 200 do 600 nm, konstantní rozdíl ∆λ mezi monochromátory, byl měněn od 10 do 150 nm s krokem 5 nm
3.1 První použití Supelite Většina těchto materiálů je dodávána ve vlhké formě, proto může vystavování na vzduchu vést k vysušení materiálu. Pryskyřice Supelite (20 g) se nasype do kádinky (500 ml) a zalije methanolem (175 ml), tak aby hladina roztoku nad pryskyřicí byla 2,5 – 5 cm. Celkový objem je přibližně 200 ml. Poté se roztok promíchá s pryskyřicí (1 min.) a ponechá 15 minut stát. Methanol se opatrně odlije pryč a pryskyřice se zalije destilovanou vodou (175 ml). Roztok se zamíchá po dobu 1 minuty a pak nechá stát 5 – 10 min.
3.2 Příprava kolony Supelite už je předpřipraven podle postupu výše. Vždy používáme plně hydratovanou pryskyřici. Vrstva vody nebo rozpouštědla by měla být nad pryskyřicí kolem 2,5 cm. Zabrání se tím její dehydrataci a sníží se nebezpečí tvorby kanálků v loži pryskyřice. Do prázdné skleněné kolony se dá vrstva křemenné vaty (4 cm), pak se nalije destilovaná voda (2,5 ml). V případě potřeby se vata upraví a přidá se ještě trocha vody. Poté se přilije suspenze hydratovaného Supelite. Jak je kolona plněna, přebytek vytékající vody se odpustí spodem přes kohout do výlevky nebo do připravené nádoby. Kolona se naplní do její poloviny, aby bylo umožněno bobtnání pryskyřice, přičemž nesmí dojít ke snížení vrstvy kapaliny pod povrch pryskyřice.
3.2.1 Určení objemu pryskyřice v koloně Stanovení objemu pryskyřice (V) v koloně se vypočítá podle vztahu: 2
1 V = π ⋅ ⋅r ⋅ h 2
(1)
r je vnitřní poloměr trubice kolony a h značí výšku náplně kolony. Tato hodnota je důležitá pro optimální dávkování vzorku a stanovení doby průtoku. 3.2.2 Průtoky a objemy roztoků Zpětné promývání: Tato procedura přemísťuje vzduchové bubliny, třídí pryskyřicové částečky (vytváří se vrstvy podle velikosti, nejmenší částice jsou na povrchu kolony) a zbavuje nové vrstvy pryskyřičných úlomků. Zpětný proplach přemístí tyto částečky, které jsou umístěny na povrchu. Průtok a objem závisí na potřebě roztřídění velikosti částic a odstranění úlomků a pevných částic. Probíhá 15-30 minut, potřebný objem vody je 100 ml přiváděný z děličky ze spodu do kolony. Dávkování: Proces dávkování a vedení vzorku přes kolonu, který dovoluje směsi úspěšně se adsorbovat na pryskyřici. Adsorpce je rovnovážný jev, adsorbát není nikdy úplně adsorbovaný. Nejefektivnější rychlost je obvykle v rozsahu 2 – 16 objemů za hodinu, úroveň odpovídá prosakování směsi. Obvykle dávkování pokračuje, dokud prosakování adsorbátu v koloně vzrůstá k předurčené úrovni. V tomto momentě, adsorbovaná směs je přesunuta k promývání.
19
Eluce: Vhodnými organickými rozpouštědly, které budou efektivně vymývat adsorbovaný materiál, a které budou působit na pryskyřičný povrch (tzn. hydrofobní rozpouštědlo a hydrofobní pryskyřice) jsou obvykle methanol, isopropanol a aceton. Typická proudová rychlost pro vymývání absorbátu jsou 2 – 3 objemy za hodinu (nebo méně – podle rozpouštědla). Iontové nebo částečně iontové materiály obvykle bývají mnohem silněji absorbovány v beziontové formě než v iontové. A tak kyselé sloučeniny jsou lépe absorbované, když jsou neionizované a mohou být dobře vymývány zásadami, které ionizují kyselou formu. Protože proces vymývání oživuje adsorbovanou hladinu, může být taky nazýván regenerace. Rovnováha (ekvilibrace): Prázdný prostor ve vrstvě pryskyřice se vyplní vymývací směsí. Před použitím kolony znovu musí být tato směs přemístěna z kolony. Většinou jsou použity dvě vrstvy vyrovnávací směsi, standardní rychlost jsou 2 objemy vody za hodinu. Když použijeme čistou vodu nebo rozpouštědlo jako první vrstvu ve stejné rychlosti jako promývání, pak ekvilibrace ukazuje kompletní propírání. Ekvilibrace představuje ukončení elučního procesu.
3.3 Postup izolace pro naše vzorky FK K dispozici je roztok, který byl postupně sbírán při extrakci HK a byl uchováván v lednici. Rozpuštěné fulvokyseliny bylo potřeba z tohoto roztoku izolovat. Před adsorpcí na kolonu je nutné roztoky přefiltrovat, filtrace je ovšem velmi pomalá. Směs jdoucí přes vrstvu pryskyřice nesmí obsahovat suspendované částečky. Nashromáždění těchto částeček v pryskyřici může zapříčinit nerovnoměrné rozložení rychlosti vzorku, čímž se snižuje výkonnost separace. Fulvokyseliny jsou po oddělení huminových kyselin v kyselé formě, protože huminové kyseliny byly vysrážely s HCl, hodnota pH je nízká – kolem 1 – 2. Kolona se nejprve promyje NaOH (průtok kolonou je nutno regulovat), poté se použije HCl a totéž ještě jednou zopakováno. Následuje zpětné promytí destilovanou vodou (ze spodu kolony). Dalším krokem je postupné a pomalé nadávkování žlutě zbarveného vzorku, následně se kolona zpětně promyje vodou. K uvolnění všeho, co bylo naadsorbováno na pryskyřici, se využije eluce roztokem NaOH, kdy odtéká tmavě hnědý roztok zachycený do kádinky nebo nádoby. Na obrázku č. 6 je ukázka provedení izolace FK na koloně. Zbytek odtékajícího bezbarvého roztoku je odpad. Pryskyřice se promyje zpětně vodou, aby všechny zbytky byly odplaveny, pak NaOH a HCl. Pryskyřice se ponechá převrstvená roztokem HCl, kolona se zakryje parafilmem, aby nedošlo k vysušení Supelite. Další postup práce: čištění roztoku fulvokyselin se provádí po dobu 1 týdne dialýzou v membránách MWCO 1.000, umístěných plastových kádinkách, kde se 3x denně mění deionizovaná voda. Poté následuje vymražení při teplotě –50 °C. Z důvodu snížení obsahu popela ve vzorku je možné fulvokyselinu před dialýzou přečistit. Roztok po izolaci smícháme v plastových kyvetách s roztokem 5 ml HF a 22 ml HCl, který se doplní destilovanou vodou na celkový objem 100 ml a ponecháme 24 hodin třepat. Poté teprve necháme roztok dialyzovat, další postup se shoduje s předchozím.
20
3.3.1 Výsledky izolace FK a elementární analýzy preparátu FK Původní navážka půdy typu Kambizem byla 600 gramů, ze které bylo izolováno přibližně 3 gramy huminových kyselin, což odpovídá přibližně 0,5 % (AF MZLU). Po izolaci HK bylo získáno celkem 4 litry roztoku FK. K naší postupné izolaci FK bylo celkem použito ze zásobního roztoku 1650 ml. Po vymražení bylo získáno 1,789 g fulvinové kyseliny, což je přibližně 0,3 %. Analýza byla provedena na Strojírenském zkušebním ústavu Brno, CHNS/O analyzátor PE 2400. Obsah popela a vlhkosti ve vzorku FK byl měřen metodou TGA, TA Instruments Q5000IR, teplotní režim do 800 °C (Dr. Kučerík, Ing. David). Výsledky elementární analýzy jsou uvedeny v tab. 1. Po přečištění FK byla elementární analýzou získána hodnota obsahu popela 15,5 % Vlhkost Popel [%] [%] 56,33 34,02 4,41 5,37 14,19 17,08 FK Kambizem Tabulka 1:Výsledky analýzy a popela FK Kambizem Vatín (hmot. %)
Preparát FK
C [%]
O [%]
H [%]
N [%]
Na následujícím obrázku je vyobrazena kolona, na která byla prováděna separace FK.
Obrázek 5: Izolace fulvinové kyseliny na koloně s hydratovaným Supelite
21
Na získaných mikroskopických snímcích vymražené FK můžeme pozorovat vlákna, která vznikají lyofilizací.
Obrázek 6: Mikroskopické fotky fulvinové kyseliny (40krát zvětšeno)
22
3.4 Měření fluorescence – spektra, výsledky Vzorek půdní FK (lokalita Vatín, půdní typ Kambizem modální) byl rozpuštěn v 0,5M NaOH na konečnou koncentraci 50 mg.l-1. Nejprve bylo změřeno excitační spektrum při hodnotě emise 520 nm. Excitační spektrum bylo měřen v rozsahu 300 – 380 nm. Ve spektru bylo zjištěno maximum při 358 nm (obr. č. 7). 7
358
6
relativní intenzita
5 4 3 2 1 0 290
300
310
320
330
340
350
360
370
380
390
vlnová délka (nm)
Obrázek 7: Excitační spektrum při 520 nm Následně bylo změřeno emisní spektrum při hodnotě excitace 360 nm. Emisní spektrum bylo měřen v oblasti 380 – 600 nm. Ve spektru byl nalezen široký pás v rozmezí 441 - 454v nm (obr. č. 8). Hodnota vlnových délek pro nastavení monochromátorů byla převzata z literatury Senesi a kol. [34].
23
12
relativní intenzita fluorescence
441 – 454 10
8
6
4
2
0 350
400
450
500
550
600
650
vlnová délka (nm)
Obrázek 8: Emisní spektrum při 360 nm V dalším kroku bylo měřeno synchronní fluorescenční spektrum fulvokyseliny při nastavení rozdílu mezi monochromátory ∆λ = 70 nm. V případě tohoto spektra je na ose x zaznamenávána emisní vlnová délka. Excitační vlnová délka odpovídá vztahu: λ ex = λ em –∆λ. Toto spektrum bylo následně porovnáno se spektrem standardu FK (FK Elliot) měřené při stejných podmínkách v následujícím korigovaném grafu. Hodnota maxima standardu byla nalezena při vlnových délkách excitace a emise: 358/428 nm. Vzorek FK Vatín měl maximum při přibližně stejné vlnové délce (360/430 nm). Dále bylo zjištěno, že standard měl vyšší hodnotu relativní intenzity při tomto maximu oproti vzorku. Obecně můžeme říci, že vzorky fulvokyselin obsahují maxima fluorescence při nižších vlnových délkách (pod 450 nm) na rozdíl od HK [34], což bylo v této práci ověřeno.
24
12
428 relativní intenzita fluorescence
10 8
430 6 4 2 0 200
250
300
350
400
450
500
550
600
650
700
vlnová délka (nm) standard FK Elliot
FK Vatín
Obrázek 9: SFS spektrum standardu FK Elliot a vzorku FK Kambizem při ∆λ = 70 nm Hodnoty poloh hlavních píků byly srovnány s literaturou Alberts, Takács (2004) [26] a můžeme konstatovat, že námi zjištěná hodnota excitace je vyšší, zatímco hodnota emise odpovídá údajům v literatuře. Hodnota optimálního nastavení mezi monochromátory je závislá na typu měřeného vzorku a je nutné nejprve vzorek proměřit při různých hodnotách ∆λ. Z tohoto důvodu bylo navrženo provést experiment měření synchronních spekter vzorku FK Kambizem (Vatín). Rozdíl v hodnotě ∆λ byl při měření postupně měněn od 10 do 150 nm a spektra byla měřena v rozmezí emisních vlnových délek od 200 do 600 nm. Spektra byla měřena při stejné hodnotě napětí 935 V. Z naměřených dat bylo zjištěno, že pokud zvyšujeme ∆λ v případě měření vzorků FK, jsou maxima pozorována při nižších vlnových délkách a naopak.
25
520
500
460
λ
max em.
(nm)
480
440
420
400 0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100 110 120 130 140 150 160
∆ λ (nm)
Obrázek 10: Závislost emisní vlnové délky maxima na hodnotě rozdílu Δλ Naměřená data byla zpracována nejprve tak, že byl vynesen bodový graf hodnot emisních vlnových délek maxim na hodnotě rozdílu Δλ a potom byly lokalizovány oblasti přítomnosti píků. Na základě grafu na obr. 10 je možno vidět celkem tři skupiny hlavních píků, které by měly odpovídat hlavním fluoroforům. Následně byla vybrána spektra měřená s konkrétním nastavením a byly vytvořeny tři kombinované grafy. Na obrázku č. 11 jsou spektra od ∆λ = 10 do ∆λ = 35 nm, na obrázku č. 12 spektra měřená při ∆λ = 40 – 60 nm a obrázek č. 13 spektra nacházejí se v rozsahu ∆λ = 65 nm až ∆λ = 150 nm.
26
4
relativní intenzita fluorescence
3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 200
300
400
500
600
700
800
vlnová délka (nm) 10 nm
15 nm
20 nm
25 nm
30 nm
35 nm
Obrázek 11: Závislost relativní intenzity fluorescence na vlnové délce při ∆λ = 10 nm až ∆λ = 35 nm Nejvyšší relativní intenzita fluorescence hlavního píku vzorku FK Kambizem (Vatín) byla nalezena v této skupině od rozdílu 10 až 35 nm, při hodnotě ∆λ = 35 nm. Tomuto maximu odpovídá pík při vlnových délkách excitace a emise: 468/503 nm. 7
relativní intenzita fluorescence
6 5 4 3 2 1 0 200
300
400
500
600
700
800
vlnová délka (nm) 40 nm
45 nm
50 nm
55 nm
60 nm
Obrázek 12: Závislost relativní intenzity fluorescence na vlnové délce při ∆λ = 40 nm až ∆λ = 60 nm
27
Nejvyšší hodnota relativní intenzity fluorescence byla naměřena při ∆λ = 55 nm. Hlavní pík byl nalezen při vlnových délkách excitace a emise: 360/415 nm. Domníváme se, že při měření nastala chyba u jednoho vzorku (∆λ = 60 nm), kde v bodovém grafu (obr. 9) došlo k posunu hlavního píku (v oblasti emisní vlnové délky).
relativní intenzita fluorescence
7 6 5 4 3 2 1 0 200
300
400
500
600
700
800
vlnová délka (nm) 65 nm
70 nm
75 nm
80 nm
85 nm
90 nm
95 nm
100 nm
105 nm
110 nm
115 nm
120 nm
125 nm
130 nm
135 nm
140 nm
145 nm
150 nm
Obrázek 13: Závislost relativní intenzity fluorescence na vlnové délce při ∆λ = 65 nm až ∆λ = 150 nm Největší relativní intenzitu fluorescence má fluorofor při ∆λ = 90 nm, hlavní pík byl nalezen při vlnových délkách excitace a emise: 358/448 nm.
3.4.1 Vyhodnocení synchronních emisních spekter Celkem byly identifikovány podle maximální hodnoty relativní intenzity ve vzorku FK Kambizem 3 hlavní fluorofory při λ ex/λ em = 358/448 nm, 360/415 nm, 468/503 nm. Z uvedených výsledků zjišťujeme, že v případě prvních hlavních dvou píků byla nalezena téměř totožná hodnota excitace. To znamená, že se jedná zřejmě o jeden fluorofor a následně zjištěné maximum bude odpovídat hodnotě vlnových délek λ ex/λ em = 360/415 nm. Při porovnání s literárními údaji [26], kde byly publikovány data hlavních píků pro standard FK Elliot II, bylo zjištěno, že námi určené hodnoty prvního maxima se pohybují v přibližně stejných oblastech vlnových délek. Hlavní fluorofor měřené fulvokyseliny Kambizem byl určen při vlnových délkách excitace a emise: 358/448 nm (s přesností ± 5 nm). Výsledky standardu, které jsou uvedeny v práci Alberts, Takács (2004) byly následující: (319,2 ± 2,4) – (432,9 ± 5,9) nm. Případné posuny mohou být způsobeny jinou lokalitou odběru a jiným půdním typem našeho vzorku než v případě standardu. Poslední nalezené maximum při 468/503 nm bylo nalezeno při vyšších vlnových délkách a hodnoty RFI byly poměrně vysoké. Z hlediska složení fulvokyseliny nepředpokládáme přítomnost vysoce aromatických látek, a proto nelze tento pík považovat za další fluorofor.
28
Domníváme se, že pík ve spektru odpovídá zřejmě vzniku excimeru, a proto dochází k posunu píku k vyšším vlnovým délkám, nebo se jedná o tzv. inner filter effect, kdy při vyšších koncentracích vzorku dochází k posunu píku ve spektru [35]. Podle údajů v literatuře tento pík v oblasti vlnových délek nad 450 nm nebyl u standardu FK Elliot nalezen.
29
4
ZÁVĚR
V této bakalářské práci je popsán finální postup izolace fulvinových kyselin z půdního typu Kambizem modální. Samotná izolace probíhala na koloně s pryskyřicí Supelite. Práce byla zaměřena na zjištění optimálního množství použitých roztoků při izolaci a také na množství roztoku FK, které je možno během jedné izolace použít (vztažené na použitý objem náplně Supelite). Toto množství bylo po několika izolacích stanoveno na objem 150 ml při použítí 20 g Supelite, ze kterého lze získat přibližně 150 ml roztoku fulvinových kyselin, který je poté vymražen. Z důvodu snížení obsahu popela ve vzorku byla část fulvokyselin před dialýzou přečištěna. Izolace a přečištění proběhly úspěšně. Celkem bylo k naší postupné izolaci FK ze zásobního roztoku použito 1650 ml. Z tohoto objemu bylo po vymražení získáno 1,789 g fulvinové kyseliny, což je přibližně 0,3 %. Dále byla v experimentální části práce měřena synchronní fluorescenční spektra izolované fulvokyseliny a standardu půdní FK Elliot II. Vzorky byly rozpuštěny v 0,1M roztoku NaOH. Koncentrace vzorků byla 50 mg.l-1. SFS spektra byla měřena při nastavení delta lambda 70 nm, při stejném napětí 935 V. Tímto měřením byl zjištěn hlavní pík měřené fulvokyseliny Kambizem, který se nachází při vlnových délkách excitace a emise: 358/448 nm. Výsledky standardu FK Elliot byly přibližně stejné. Intenzivnější spektrum poskytoval vzorek standardu. Další částí práce bylo zjistit ze synchronních měření hlavní fluorofor vzorku FK Kambizem. Ze zpracování naměřených synchronních spekter při různých nastaveních Δλ bylo zjištěno, že optimální nastavení intervalu mezi vlnovými délkami monochromátorů je nad 70 nm. Hlavní fluorofor se podařilo nalézt a to při vlnových délkách excitace a emise: 358/448 nm. Tento pík souhlasí s údaji půdních fulvokyselin a standardu FK .
30
5
POUŽITÉ ZKRATKY A SYMBOLY
DTA FK HK HL IR-DRIFT FTIR RFI SFS 3D EEM ∆E ∆Ee ∆Ev ∆Er ∆λ λ ex λ em V r π h
diferenční termická analýza fulvinová kyselina huminová kyselina huminová látka infračervená difúzně reflexní spektroskopie infračervená spektroskopie s Fourierovou transformací relativní fluorescenční intenzita synchronní fluorescenční spektroskopie 3D excitačně emisní (nebo emisně excitační) spektrum změna energie energetická hladina elektronových stavů energetická hladina vibračních stavů energetická hladina rotačních stavů rozdíl vlnových délek v nastavení monochoromátorů vlnová délka excitace vlnová délka emise objem poloměr Ludolfovo číslo výška
31
6 [1] [2] [3]
[4]
[5] [6] [7]
[8] [9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16] [17]
SEZNAM POUŽITÝCH ZDROJŮ JANDÁK, Jiří Půdoznalství. 1. vyd. Brno, AF MZLU Brno, 2001. 142 s. ISBN 80-7157-559-3. Tománek, J. Pedologie. [HTML dokument]. Prosinec 2008 [cit. 19. 1. 2009]. Dostupný z: <www.lesaci.me.cz/borova_siska/materialy/pedologie/pedologie.doc> Máčka, Zdeněk. Globální půdy. [HTML dokument]. Brno, Masarykova Univerzita, listopad 2008 [cit. 5. 4. 2009]. Dostupný z: http://www.geogr.muni.cz/archiv/vyuka/FyzGeogr/Glob_Pudy.doc Vybrané pojmy z pedologie [HTML dokument]. Olomouc, Univerzita Palackého, prosinec 2005 [cit. 21. 1. 2009]. Dostupný z: <ekologie.upol.cz/ku/pedologie/Pedologie_vybrane_pojmy.pdf> Tipping, Edward. Cation binding by humic substance. 1st ed. Cambridge: Cambridge University Press, 2002, 434 p. ISBN 0521621461. Klarins, M. Aquatic Humic Substance: Characterisation, Structure and Genesis. Riga, 1998, 286 p. Slejška, A. Význam organické hmoty v půdě. [HTML dokument]. Praha, České sdružení pro biomasu. Listopad 2008 [cit. 19. 2. 2009]. Dostupný z: <www.ewa.cz/pages1/1094.ppt> Komers, Karel. Základy koloidní chemie. 1. vyd. Univerzita Pardubice. 1996, 64 s. ISBN 8071940453. Schnitzer, M. Humic Substance: chemistry and reactions. In: Soil Organic Matter. Developments in Soil Science. Vol. 8. Amsterdam. Ed. Schnitzer, M.; Khan, S. U. Amsterdam: Elsevier; pp. 1-64, 1978. Aiken, G. R.; MacCarthy, R. L. Isolation and concentration techniques for aquatic humic substances. In Humic Substances in Soil, Sediment, and Water., Ed. Swift, R. S., Wiley, Ney York. pp. 363-385, 1985. Clapp, C. E.; Hayes, M. H. B. Isolation of humic substance from an agricultural soil using a sequential and exhaustive extraction process. In: Humic Substance and Organic Matter in Soil and Water Environments. Ed. Clapp, C. E.; Hayes, M. H. B.; Senesi, N.; Griffith, S. M. IHSS, University Minnesota, St. Paul. pp. 3-11, 1996. Swift, R. S. Organic matter characterization.. In: Methods of Soil Analysis. Part 3. Chemical Methods. Ed. Sparks, D. L. et al. SSSA Book Series no. 5. Soil Science Soc. of America and Am. Soc. Agronomy, Madison, Wisconsin. pp. 1011-1069, 1991. Hayes, M. H. B. Extraction of humic substances from soil. In: Aiken, G. R.; Wershaw, R. L.; McKnight, D. M.; McCarthy, P. (Eds.): Humic Substances in Soil Sediments and Water. John Wiley New York, pp. 329-362, 1985. Piccolo, A.; Gelano, G.; Conte, P. Methods of isolation and characterization of humic substance to study thein interactions with pesticides. Proceedings of konference Pesticide/Soil Interactions, Paris, pp. 103-116, 2002. Pospíšilová, Ľ. et al. Spectral characteristics of humic acids isolated from the South Moravian lignite and soils. Petroleum&coal, 2008, vol. 50, no. 2, pp. 30-36. ISSN 1337-7027. Podlešáková, E. a kol. Rozbory půd, vod a rostlin. VÚMOP, Praha, 1992, 259 str. Pelikán, Peter; Lapčík, Lubomír; Zmeškal, Oldřich; Krčma, František. Fyzikální chemie: struktura hmoty. 1. vyd. Brno: VUTIUM, 2000. 238 s. ISBN 80-214-1583-5.
32
[18] Sikorska, E. et al. Characterization of Edible Oils Using Synchronous Scanning Fluorescence Spectroscopy. Polish Journal of Food and Nutrition Science, 2003, vol. 12, no. 53, pp.108-112. ISSN 1230-0322 [19] Debashis, P.; Anindya, D. Evidence of covalent binding of epicocconone with proteins from synchronous fluorescence spectra and fluorescence lifetimes. Chem. Sci., 2007, vol. 119, no. 2, pp. 99-104. ISSN 0002-7863. [20] Kwitkowska, J.; Provenzano, M. R.; Senesi, N. Long term effects of a brown coal-based amendment on the properties of soil humic acids. Geoderma, 2008, vol. 148, pp. 200-205. ISSN 0016-7061. [21] Mishra, A. K. Total synchronous fluorescence scan spectra of petroleum products. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2002, vol. 373, pp. 304-309. ISSN 1618-2642. [22] Carvalho, E. R. et al. Interactions of Chlorine with Tropical Aquatic Fulvic Acids and Formation of Intermediates Observed by Fluorescence Spectroscopy. Chem. Soc., 2004, vol. 15, no. 3, pp. 421-426. ISSN 0002-7863. [23] Senesi, N.; D`Orazio, V.; Ricca, G. Humic acids in the first generation of EUROSOILS. Geoderma, 2003, vol. 116, pp. 325-344. ISSN 0016-7061. [24] Alberts, J. J.; Takás, M. Comparison of the natural fluorescence distribution among size fraction of terrestrial fulvic and humic acids and aquatic natural organic matter. Organic Geochemistry, 2004, vol. 35, pp. 1141-1149. ISSN 0146-6380. [25] Mládková, L., Robotková, M.; Borůvka, L. Metody stanovení kvality humusových látek u lesních půd. In Sborník příspěvků konference: České pedologické dny, Nové Hrady 1. září 2005. Zemědělská fakulta Jihočeské univerzity v Českých Budějovicích. České Budějovice, 2005, s. 181-186. ISBN 80-7040-818-9. [26] Alberts, J. J.; Takás, M. Total luminiscence spectra of IHSS standard and reference fulvic acids, humic acids and natural organic matter: comparison of aquatic and terresttrial source terms. Organic Geochemistry, 2004, vol. 35, pp. 243-256. ISSN 0146-6380. [27] Szombathová, N.; Luster, J.; Zaujec, A.; Blaser, P. Fluorescence Spektra of Soil Humic and Fulvic Acids Isolated from Different Ecosystems. In Humic Substance in Ecosystems 4. Račkova Dolina 11. – 14. 6. 2001. Ed. Anton Zaujec et al. Bratislava: VÚPOP, 2001, pp. 168, ISBN 80-85361-93-0. [28] Pedra, F.; Plaza, C.; Fernadéz, J. M.; Gracka-Gil, J. C. et al. Effects of municipal solid waste compost and sewage sludge on chemical and spectroscopic properties of humic acids from a sandy Haplic Podzol and a clay loam Calcic Vertisol in Portugal. Waste Management, 2007, vol. 28, no. 11, pp. 2183-2191. ISSN 0191-815X. [29] Milori, D. M. B. P.; Martin-Neto, L.; Bayer, C. et al. Humification degree of soil humic acids determined by fluorescence spectroskopy. Soils Science, 2002, vol. 167, no. 11, pp. 729-749. ISSN 0038-075X. [30] Banach, M.; Debska, B. Characteristics of Phenolic Compounds in Soil Extracts by High Performance Liquid Chromatography. In Humic Substance in Ecosystems 6. Račkova Dolina 19. – 22. 6. 2005. Ed. Anton Zaujec et al. Bratislava: VÚPOP, 2005, pp. 216, ISBN 80-89128-16-5. [31] Golebiowska, D.; Gawlik, A.; Ekiert, J. The Influence of pH and Humic Acids on Ultraweek Biochemiluminiscence and Biometric Parametr sof Pea (Pisum Satium) in First Phases of Growth. In Humic Substance in Ecosystems 6. Račkova Dolina
33
[32] [33]
[34]
[35]
19. - 22. 6. 2005. Ed. Anton Zaujec et al. Bratislava: VÚPOP, 2005, pp. 216, ISBN 80-89128-16-5. Němeček a kol. Taxonomický klasifikační systém půd České republiky. 1. vyd. Praha: ČZU, VÚMOP, 98 str. ISBN 80-2387-9061-6. Pospíšilová, L.; Fasurová, N.; Barančíková, G.; Liptaj, T. Spectral characteristics of humic acids isolated from south Moravian lignite and soils. Petroleum & Coal, 2008, vol. 50, no. 2, pp. 30-36. ISSN 1337-7027 Senesi, N.; Miano, T. M.; Provenzano, M. R.; Bruneti, G. Characteristaion, differentiation, and classification of humic substances by fluorescence spectroscopy. Soil Science, 1991, vol. 152, no. 4, pp. 259-271. ISSN 0038-075X. Divya, O.; Mishra, A. K. Understanding the concept of concentration-dependent redshift in synchronous fluorescence spectra: Prediction of lambda max. SFS and optimization of delta lambda for synchronous fluorescence scan. Analytica Chimica Acta, 2008, vol. 630, pp. 47-56. ISSN 0003-2670
34
