Doktori Értekezés Tézisei
A NADPH-oxidáz szerepe neutrofil granulociták kalcium-anyagcseréjében és baktériumölésében
Rada Balázs
Témavezető: Dr. Ligeti Erzsébet Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Celluláris és Molekuláris Élettani Program Budapest, 2004
Összefoglaló A szervezet immunrendszerének fontos tagjai a neutrofil granulociták, melyek elsőként érkeznek a fertőzés helyére és vesznek részt a behatoló mikroorganizmusok elpusztításában. A folyamat kulcsfontosságú enzime a NADPH-oxidáz, mely a reaktív gyökök előanyagát, szuperoxid-anionokat termel. Az enzim elektrontranszportja miatt a membrán depolarizálódik, módosítva ezzel az ionokra ható elektromos grádienst. Értekezésemben a NADPH-oxidáz működését kisérő depolarizáció funkcionális következményeit tanulmányoztam. A membrándepolarizáció és a kalciumháztartás összefüggésének vizsgálatához modellként differenciáltatott, neutrofil granulocitaszerű mieloid sejteket használtam. Megállapítottam, hogy a vad típusú sejtek nagy mennyiségű szuperoxidot termelnek, membránjuk jelentős mértékben depolarizálódik és a kalciumbeáramlás gátlódik. Ezen jelenségek egyike sem figyelhető meg az oxidázhiányos, illetve működésképtelen oxidázt kifejező sejteken. A membrándepolarizáció és a kalciumbeáramlás gátlása újból megjelenik a működőképes oxidázzal visszatranszfektált sejtekben. A kemotaktikus peptiddel indukált kalciumszignál magasabb az oxidázhiányos modellsejtekben, illetve oxidázgátlószerrel (DPI) kezelt neutrofilekben, mint a vad típusú illetve kezeletlen sejtekben. Kisérleteinkben egyértelmű összefüggést kaptunk a NADPH-oxidáz indukálta depolarizáció és a sejtek kapacitatív kalciumbeáramlásának gátlása között. A baktériumölés klasszikus modellje szerint az oxidáz-termelte szabadgyökök felelősek a patogének lebontásáért. Újabb tanulmányok szerint azonban az oxidázkiváltotta depolarizáció káliumionokat hajt a fagoszómába, amelyek felszabadítják az addig inaktív proteázokat és azok fogják megtámadni a betolakodókat. Az oxidáz kiváltotta O2.--termelés illetve depolarizáció szerepének megértéséhez neutrofilek baktériumölését mértük különböző DPI-koncentrációk jelenlétében egy általunk beállított, ellenőrzött, félig-automatizált, validált, új módszerrel, 96-lyukú lemezen. A stimulált neutrofilek K+-leadása lineárisan, míg szabadgyök-termelése nem lineárisan függ a depolarizációtól. Alacsony gátlószer-koncentrációk esetén a O2.-termelés már csak 10-20 %-a, a depolarizáció viszont még 80 %-a a gátolatlan értéknek. Ekkor Staphylococcus aureus baktériumok ölése jelentősen károsodott, ami a szabadgyökök baktériumölésben betöltött, fontos szerepét jelzi. A legmagasabb gátlószerkoncent-rációt elérve a O2.--termelés már csak néhány %-ot csökken, a depolarizáció viszont az eredeti felére süllyed. Staphylococcus aureus baktériumok ölése ezen a szakaszon is jelentősen károsodott, ami ezzel a membrándepolarizáció baktériumölésben játszott jelentőségét hangsúlyozza. A protoncsatorna gátlószer, cink növeli és gyorsítja a membrándepolarizációt, csökkenti a szuperoxidtermelést; a baktériumölést ugyanakkor nem változtatja. A NADPH-oxidáz működését kisérő szabadgyöktermelés és membrándepolarizáció tehát egyaránt fontosak a bekebelezett mikróbák sikeres megölésében.
I. Bevezetés és irodalmi háttér A neutrofil granulociták az emberi szervezet veleszületett immunrendszerének fontos tagjai. Leggyakoribb fehérvérsejtjeink, melyek a gyulladás helyére érve fagocitálják a kórókozókat. Számos antimikrobiális enzimet és fehérjét tartalmaznak; közülük kiemelkedően fontos a NADPH-oxidáz. Jelentőségét jelzi, hogy az enzim genetikai hiányában krónikus granulomatózis (CGD) alakul ki, melyet visszatérő gombás és bakteriális fertőzések jellemeznek. Az enzim a fagoszómamembránban aktiválódik a baktérium bekebelezését követően. Öt alegysége közül kettő a membránban, három pedig a citoszólban található. Az enzimkomplex aktiválódásakor az utóbbiak áthelyeződnek a membránalegységekhez és összeáll a működőképes NADPH-oxidáz. Az enzim a citoszólikus oldalon NADPH bontásából nyert elektronokat átjuttatja a membránon, amelyek oxigénmolekulákkal reagálva a sejten kívüli ill. a fagoszómán belüli térben szuperoxid-anionokat (O2.-) képeznek. Belőlük további reaktív gyökök, ionok és vegyületek alakulnak ki, melyeket együttesen reaktív oxigéngyököknek nevezünk (angol nevük rövidítése: ROS). Közös jellemzőik, hogy rövid életűek, reakcióképesek és szerves vegyületek széles spektrumával lépnek reakcióba. Sokáig az a nézet volt elfogadott, hogy a neutrofilekbe bejutott kórokozók elpusztításáért döntően a szabadgyökök felelősek. Ezért a NADPH-oxidáz enzim fontosságát a ROS keletkezésének lehetővé tételében látták. Közben azonban számos megfigyelés az enzim töltésmegosztó működésének tulajdonított jelentőséget. A szuperoxidanionok keletkezése ugyanis kifelé irányuló elektrontranszporttal társul, és nagymértékű membrándepolarizációt vált ki. Az elektrontranszportot töltéskompenzáló kation (H+, K+)-
transzport követi. A megváltozott töltéseloszlás számos ion elektrokémiai grádiensét jelentősen megváltoztatja. Kutatócsoportunk korábbi adatai szerint az oxidázindukálta depolarizáció befolyásolhatja neutrofil granulociták kapacitatív kalciumbeáramlását. Neutrofil granulociták aktiválódását a legtöbb esetben az [Ca2+]ic emelkedése követi. A kalcium-szignál kialakulásának domináns módja neutrofilekben a kapacitatív kalciumbeáramlás, amely során először a belső kalciumraktárakból jutnak kalciumionok a citoplazmába, majd a raktár kiürülése kapacitatív kalciumcsatornákat nyit a sejthártyában és Ca2+-ok áramlanak be a külső térből. Az oxidáz a sejten belüli [Ca2+] befolyásolásán keresztül számos sejtfunkció szabályozásában szerepelhet. A.W. Segal és munkacsoportja 2 évvel ezelőtt publikált hipotézise szerint a NADPH-oxidáz indukálta elektronáramok káliumkiáramlást váltanak ki a sejtekből. A fagoszómába áramlott nagy mennyiségű ion felszabadítja az addig granulumok mátrixához kötött, így inaktív emésztőenzimeket, amelyek ezáltal aktiválódnak és látnak hozzá a baktérium megtámadásához. Elméletük szerint a NADPH-oxidáz elektrogén működése elengedhetetlen a sikeres baktériumöléshez, ugyanakkor a folyamatban keletkezett szabadgyökök csak melléktermékek, amelyekkel szemben a neutrofileknek saját magukat kell védeniük. A szabadgyökök in vitro mikrobakárosító hatásai bizonyítottak, így túlzás azt feltételezni, hogy csupán felesleges melléktermékei a folyamatnak. Ugyanakkor a korábbi, leegyszerűsített nézet sem tarthatja magát, hogy csak a NADPH-oxidáz a fontos a baktériumölésben, mikor a neutrofilek még számtalan enzimmel és peptiddel rendelkeznek.
II. Célkitűzések Doktori munkámban a NADPH-oxidáz neutrofil granulocitákban betöltött szerepének pontosabb megértését tűztük ki célul. 1. A NADPH-oxidáz és a kapacitatív kalciuminflux közötti összefüggést vizsgálatuk neutrofil-szerű modellsejteken (PLB985) és humán neutrofil granulocitákon. 2. A NADPH-oxidáz baktériumölésben betöltött szerepének vizsgálatához egy új esszé kifejlesztésén dolgoztunk, amellyel a hagyományos, higításos-szélesztéses módszernél könnyebben, kevesebb idő- és munkaráfordítással, több kisebb térfogatú minta alkalmazásával, gyorsabban határozhatjuk meg fagocitasejtek baktériumölő képességét. 3. A NADPH-oxidáz szerepének pontosabb megértéséhez a O2.-- termelés, a membránpotenciál-változás, a K+-leadás és a baktériumölés mennyiségi összefüggéseit vizsgáltuk neutrofil granulocitákban. Ehhez a NADPH-oxidáz aktivitását gátlószere (DPI=difenil-iodónium) segítségével lépésenként csökkentettük. Ezen kívül a baktériumölés farmakológiai vizsgálatával szerettünk volna pontosabb képet kapni a szabadgyökök illetve az ionmozgások baktériumölésben játszott szerepéről.
III. Kisérleti módszerek Sejtpreparálás Önkéntes, egészséges donorok véréből izoláltunk neutrofil granulocitákat. A preparátumok 95%-nál több neutrofil granulocitát tartalmaztak, melyek kevesebb, mint 5 %-a pusztult el. A PLB-985 sejtvonalakat RPMI-1640 folyékony médiumban tartottuk fenn, CO2-termosztátban. A sejteket 5-7 napos, 0,5% DMFA jelenlétében történt differenciáltatás után vizsgáltuk Rendelkezésünkre álltak vad típusú sejtek (Német Katalin, OVSZ, Bp), oxidázhiányos (X-CGD) sejtek (M. Dinauer ajándéka, Indianapolis, USA), illetve ez utóbbiak működés-képtelen, de kifejeződő oxidázzal (M1, D. Roos ajándéka, Amszterdam, Hollandia) illetve vad típusú oxidázzal (S1, Német Katalin ajándéka, OVSZ, Bp) visszatranszfektált módosított vonalai. Szabadgyök-termelés mérése Szuperoxid-diszmutázzal gátolható citokróm-c redukcióval a sejtek extracelluláris O2.--termelését mértük. Lucigenin-alapú kemilumineszcenciával a teljes sejt szabadgyök-termeléséről kaptunk információkat, míg az egyes sejtek egyedi szabadgyöktermelő képességéről NBT-teszttel győződtünk meg. Fluoreszcens mérések Az intracelluláris Ca2+-koncentrációt szuszpendált sejteken mértük PTI, kétfényutas fluoriméterben. FURA-2 AM kalciumérzékeny, fluoreszcens festéket használtuk (340/380: 505 nm). A kapott adatokat Grynkiewicz és mtsi egyenlete alapján számítottuk át koncentrációértékekre. A kapacitatív kalciumbeáramlás mérése kalciummentes médiumban történt, Ca2+-visszaadással illetve mangánkioltással mértük. A sejtek
membránpotenciál-változásait egy potenciálérzékeny, fluoreszcens festékkel, DiOC5(3) mértük (484:510 nm).
IV. Az eredmények összefoglalása
Izotópos mérések Neutrofil granulociták káliumleadásának mérésére 86Rb+mal töltött sejteket használtunk és a médiumba leadott izotópot mértük szcintillációs spektrométerben.
1. A kapacitatív Ca2+-influx és a NADPH-oxidáz kapcsolatát tanulmányozva kimutattuk, hogy ● mindegyik PLB-985 sejtvonalban kiváltható a kapacitatív kalciumbeáramlás a Ca2+-raktár pumpájának gátlószerével, tapsigarginnal (TG). ● a tapsigarginnal kiváltott kapacitatív úton keresztüli Ca2+beáramlás és Mn2+-beáramlás a NADPH-oxidáz aktivitásával arányos mértékben gátlódott. ● az oxidázfüggő influxgátlás megmutatkozott PLB-985 X-CGD és S1 sejtek formil-peptid(fMLP)-indukálta kalciumszignáljai között is. ● az oxidáz-gátlószer DPI megemelte egészséges neutrofil granulociták fMLP-kiváltotta kalciumjelének platófázisát; míg a kalciumjelet kiváltó, de az oxidázt nem aktiváló ATP esetében hatástalan volt rá.
Baktériumok tenyésztése és baktériumölés mérése Staphylococcus aureus (SOTE Mikrobiológiai Int. ajándéka) és Escherichia coli (D. Roos ajándéka, Amszterdam, Hollandia) baktériumokból mindennap friss tenyészetet növesztettünk LB-médiumban. 3 órás inkubálás után kétszer mostuk a sejteket, majd az optikai denzitás alapján állítottuk be a sejtsűrűséget. A baktériumölés mérésére használtuk egyrészt a hagyományos, higításos-szélesztéses esszét, amely során a baktériumneutrofil szuszpenzióból vett mintákat higítás után agarra szélesztettünk. 10-14 órás inkubáció után a kinőtt telepek számát a higítás fokával visszaszorozva kaptuk meg a baktériumszám időbeli változásait az esszé alatt. Használtuk másrészt az általunk kidolgozott új módszert, amelyben a baktérium-neutrofil szuszpenzióból vett mintákban a neutrofileket saponinnal és 20 percig tartó fagyasztásos kezeléssel feltártuk, majd a mintákat 1:500 arányban baktériumnövesztő LB-médiumban higítottuk. Belőlük 200 µl-es térfogatokat 96-lyukú fotométeres lemezre pipettáztunk, majd 4-8 órán át ELISA-leolvasóban inkubáltuk őket 37 ºC-on, erősen rázatva, és az OD változásait 650 nm-en nyomon követve mértük a baktériumszám emelkedését. Egy kiválasztott OD-érték eléréséhez szükséges idővel jellemeztük az egyes lyukak mintáit, ami fordított arányosságban van a kezdeti baktériumszámmal. Kalibrációs mintákból kapott egyenlet segítségével tudtuk számszerűsíteni a baktériumölést.
Tehát mind a kapacitatív út izolált kiváltásakor, mind fiziológiás stimulus alkalmazásakor (fMLP) a kapacitatív Ca2+beáramlás a NADPH-oxidáz aktivitásától függő mértékben gátlódott. ●
További kisérleteink kiderítették, hogy nem a szuperoxidanionok, hanem a membrándepolarizáció felelős az oxidáz kalciumbeáramlást gátló hatásáért.
2. Kifejlesztettünk egy új baktériumölési esszét (leírása a Módszerek fejezetben olvasható), amely számos előnnyel rendelkezik a hagyományos, higításos-kikenéses módszerrel szemben:
● ● ● ●
kis térfogatokkal dolgozik 96-lyukú lemezen, nem igényel sok sejtet, vegyszert és táptalajt, kicsi a munkaigénye, számos minta vizsgálható egyidejűleg, sok párhuzamossal dolgozva pontos eredményeket kapunk, kis szórásokkal, a baktériumok növesztése több órán át ELISA-leolvasóban történik, így a módszer félig automatizált, és a hagyományos módszerhez viszonyítva gyorsan megkapjuk az eredményt.
3. A NADPH-oxidáz baktériumölésben betöltött szerepének vizsgálatához az enzim két funkcióját (O2.--termelés és depolarizáció) szerettük volna egymástól minél jobban izolálni és ilyen körülmények között vizsgálni a baktériumölést. Az oxidázműködést különböző DPI-koncentrációkkal gátol-va nagyban eltérő gátlási kinetikát kapunk a két paraméterre. Már igen kis mennyiségű szuperoxidtermelés (a maximális néhány százaléka) is közel maximális depolarizációt vált ki. A szuperoxidtermelés növelésekor a membrándepolarizáció mér-téke már csak kissé változik. Méréseink szerint a káliumleadás és a membrándepolarizáció között lineáris összefüggés áll fent. A két oxidázparaméter DPI-függése egymással nem párhuzamosan változik, így a baktériumölés DPI-függésének a méréséből következtethetünk az egyik vagy másik funkció fontosságára. Escherichia coli túlélése független volt az alkalmazott [DPI]-tól, míg Staphylococcus túlélése erős DPIfüggést mutatott. 500 nM-nál kisebb gátlószer-koncentrációk esetén a membrándepolarizáció közel változatlan maradt, ugyanakkor a szuperoxidtermelés a maximális 15-20 százalékára esett le. Ekkor neutrofilek Staphylococcus-ölése erősen károsodott, mutatván, hogy a reaktív gyököknek, mint kémiai
anyagoknak igenis van szerepe a baktériumok sikeres elölésében. 500 nM feletti DPI-koncentrációk esetében a szuperoxidtermelés már alig csökkent, ugyanakkor a membrándepolarizáció (és a káliumleadás) mértéke a maximális 50 %-ára esett le. Ebben a fázisban a Staphylococcusok túlélése hirtelen megnőtt, ami a membrándepolarizáció baktériumölésben betöltött fontos funkcióját sejteti. Összefoglalva, kisérleteink alapján azt állítjuk, hogy a NADPH-oxidáz működését kisérő szabadgyöktermelés és membrándepolarizáció egyaránt fontosak a bekebelezett mikrobák sikeres megölésében.
V. Közlemények A tézisek alapjául szolgáló publikációk I. Balázs K. Rada, M. Geiszt, R. van Bruggen, K. Német, D. Roos and E. Ligeti: Calcium signalling is altered in myeloid cells with a deficiency in NADPH oxidase activity. Clinical and Experimental Immunology, 2003; 132: 53-60. if: 2,347 II. Balázs K. Rada, Miklós Geiszt, Krisztina Káldi, Csaba Timár and Erzsébet Ligeti Dual role of the phagocytic NADPH oxidase in bacterial killing. Blood First Edition Paper, elektronikus formában publikálva 2004. július 13-án. DOI 10.1182/blood-2004-03-1005 if: 10,12
III. Káldi K, Kalocsai A, Rada BK, Mező G, Molnár GZ, Bathori G, Ligeti E: Degranulation and superoxide production depend on cholesterol in PLB-985 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 310:241-6. if: 2,836 IV. Káldi K, Szeberényi J, Balázs K Rada, Kovács P, Geiszt M, Mócsai A and Ligeti E: Contribution of phospholipase D and a brefeldin A sensitive ARF to chemoattractant induced superoxide production and secretion of human neutrophils. Journal of Leukocyte Biology, 2002; 71: 695-700. if: 4,132
A szerző egyéb publikációi V. Rada Balázs: Baktériumokra vadászó fehérvérsejtek Természet Világa 2003. március, 121-124. VI. Rada Balázs: A legionáriusbetegség. Természet Világa 2003. október, 444-447
