2. AKTIN-KÖTŐ FEHÉRJÉK

A CITOSZKELETÁLIS RENDSZER 2011. 02. 15. Bugyi Beáta PTE ÁOK, Biofizikai Intézet

2. AKTIN-KÖTŐ FEHÉRJÉK

Citoszkeletális aktin HEp-2 sejtekben - rodamin-falloidin jelölés forrás: Nyitrai Miklós, Grama László, PTE ÁOK, Biofizikai Intézet

ÁTTEKINTÉS . Pi

hegyes vég (-)

szöges vég (+)

TAPOSÓMALOM EGYENSÚLY

ATP

ADP

D nukleotid csere

T

AZ AKTIN FUNKCIONÁLIS SOKSZÍNŰSÉGE EUKARIÓTA

NEM-IZOM SEJTEK

IZOM SEJTEK

sejthalál, apoptózis

sejtmozgás

FP

polaritás

FC FA

LP LM SF

alak, mechanikai stabilitás

fagocitózis Arc endocitózis endoszómák mozgása

izomösszehúzódás szabályozása

intarcelluláris pathogének mozgása

SEJTMAG NÖVÉNYEK organellum-, vezikula transzport exo-, endocitózis sejtciklus szabályozása

transzkripció kromatin remodelling jelátvitel

PROKARIÓTA ParM, MreB aktin homológ fehérjék sejtalak plazmid szegregáció

sejtosztódás kontraktilis gyűrű kromoszóma transzport

AZ AKTIN FUNKCIONÁLIS SOKSZÍNŰSÉGE EUKARIÓTA

NEM-IZOM SEJTEK

sejthalál, apoptózis

sejtmozgás

FP

polaritás

FC

alak, mechanikai stabilitás

IZOM SEJTEK

FA LP az aktin fehérje viszonylag egyszerűnek tűnik… LM

fagocitózis

SF

Arc endocitózis

endoszómák mozgása Mi teszi lehetővé a sejten belüli változatos funkciókat intarcelluláris pathogének sejtosztódás mozgása betöltő, különböző szerkezeti és dinamikai sajátságokkal izomösszehúzódás szabályozása SEJTMAG rendelkező aktin filamentumtranszkripció hálózatok kialakítását? NÖVÉNYEK kontraktilis gyűrű kromoszóma transzport

organellum-, vezikula transzport exo-, endocitózis sejtciklus szabályozása

kromatin remodelling jelátvitel

PROKARIÓTA ParM, MreB aktin homológ fehérjék sejtalak plazmid szegregáció

AKTIN FEHÉRJE A SEJTBEN Fluoreszcencia mikroszkópia - GFP-jelölt aktin (Green Fluorescent Protein) Fibroblaszt

forrás: Vic Small http://cellix.imba.oeaw.ac.at/

AZ AKTIN CITOSZKELETONHOZ ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK .

AZ AKTIN MONOMEREKHEZ/FILAMENTUMOKHOZ SPECIFIKUSAN KAPCSOLÓDÓ, KÜLÖNBÖZŐ FUNKCIÓJÚ FEHÉRJÉK

AZ AKTIN CITOSZKELETONHOZ ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK KAPCSOLÓDÁSUK SZERINT

.

monomerhez kötődő PROFILIN THYMOSIN B4 filamentumhoz kötődő véghez kapcsolódó SAPKA FEHÉRJE oldalhoz kapcsolódó TROPOMIOZIN MIOZIN CORTACTIN

AZ AKTIN CITOSZKELETONHOZ ASSZOCIÁLT FEHÉRJÉK FUNKCIÓJUK SZERINT

.

filamentum képződést (polimerizációt) befolyásoló – G : F aktin arányát szabályozó nukleációt/elongációt befolyásoló fehérjék NUKLEÁCIÓS FAKTOROK: formin, Arp2/3 komplex, … PROFILIN: nukleotid cserét katalizálja az aktin monomeren polimerizációt gátló: SAPKA FEHÉRJE: szöges vég dinamikáját blokkolja THYMOSIN B4: monomereket szekvesztrálja depolimerizációt elősegítő ADF/COFILIN: aktin elegységek disszociációjának elősegítése a szöges végen GELSOLIN: filamentumok darabolása filamentumot stabilizáló TROPOMIOZIN filamentumokat keresztkötő FILAMIN, SPEKTRIN: gélformáló A-AKTININ, FIMBRIN, FASCIN, VILLIN: kötegformáló motorfehérjék MIOZIN

G-aktin

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK Formin N-WASP/WAVE/Scar - Arp2/3 komplex WH2 domén – fehérjék (Spire, Cordon Bleu, Leiomodin)

FRAGMENTÁLÓ FEHÉRJÉK gelsolin

F-aktin

MONOMER-KÖTŐ profilin thymosin b4

KÖTEGFORMÁLÓ FEHÉRJÉK a-aktinin, fimbrin, fascin, villin

MOTORFEHÉRJÉK miozin GÉLFORMÁLÓ FEHÉRJÉK filamin, spektrin, … OLDALKÖTŐ FEHÉRJÉK tropomiozin, ADF/cofilin, kortaktin, talin, …

VÉGKÖTŐ FEHÉRJÉK sapkafehérje, gelsolin, vinculin

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK SPONTÁN FILAMENTUMKÉPZŐDÉS ~ 10

~ 10

10

~ 106

~ 102

1

-

G

G + G ↔ G2

G2 + G ↔ G3

G3 + G ↔ F

monomer

dimer

trimer / nukleusz

filamentum

Az aktin filamentumok spontán nukleációja lassú az aktin dimerek/trimerek instabilitása miatt.

+

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK NUKLEÁCIÓS FAKTOROK

-

+

az aktin filamentumok nukleációját segítik elő/katalizálják membránhoz kötött, jelátviteli utak által szabályozott fehérjék anarchikus filamentum képződés  az aktin filamentumok képződésének térbeli és időbeli szabályozása G : F aktin arányának szabályozása

egyedi mechanizmus: aktin oligomerek stabilizálása/monomerek filamentumba épülésének elősegítése különböző szerkezetű aktin filamentum hálózatok kialakítása

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK Az aktin filamentumok képződésének sebessége: dF  k  Nc  k  N dt dF  (k szöges  k hegyes ) Nc  (k szöges  k hegyes ) N dt

Hogyan növelhető a polimerizáció sebessége? N: filamentum végek koncentrációja ↑ k+: asszociációs sebességi állandó ↑

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK N-WASP/WAVE/Scar – Arp2/3 komplex ARPC4

ARPC3 ARPC2

Arp3

Arp2 ARPC5 ARPC1

Arp2/3 : Actin-related protein 7 alegységből álló komplex (Arp2, Arp3) inaktív, aktivátorai: WAVE/N-WASP/Scar/WHAMM/WASH/WAFL/JMY kortaktin/miozin I Arp2/3 komplex 3D röntgendiffrakciós szerkezete

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK N-WASP/WAVE/Scar – Arp2/3 komplex

Fibroblaszt Lamellipodium elektronmikroszkópós képe (0.1 mm)

elágazásos aktin filamentum hálózat: sejtmozgás – lamellipodium képződés patogének mozgása, idegnyúlványok formálása

Keratocita (Xenopus laevis) Fent: fluoreszcencia mikroszkópos képe: Arp 2/3 komplex Lent: Lamellipodium elektronmikroszkópos képe

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK N-WASP/WAVE/Scar – Arp2/3 komplex

nincs növekedés

aktív Arp2/3 komplex

inaktív Arp2/3 komplex

anya filamentum

Arp2/3 komplex – anya filamentum izomerizáció Arp2 – Arp3 laterális dimer növekedés a szöges végen

N: filamentumvégek koncentrációja ↑

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK

mDia1 FH1-FH2

N

C

1

1255

GDB

FH3

FH1 linker

profilin

FH2

DAD

G-aktin nukleációs aktivitás

Formin Homológia domének (FH1, FH2)

FH2: dimer, aktin kötő régió, szükséges és elégséges a nukleációt elősegítő hatás kifejtéséhez FH1: profilint kötő régió (profilin: aktin monomer kötő fehérje)

A Bni1p formin FH2 doménjének 3D röntgendiffrakciós szerkezete

inaktív (N-, és C terminális közötti intramolekuláris autoinhibíciós kölcsönhatás), aktivátorai: RhoGTPázok

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK

GFP-dDia2 / F-aktin

Filopodia (Dictyostelium)

Aktin kötegek (Drosophila melanogaster) 0.1 mm

egyenes aktin filamentumok: sejtosztódás: kontraktilis gyűrű, polaritás: aktin kábelek sejtmozgás: stressz szálak, filopodia, sejt-sejt kapcsolatok endocitózis aktin-mikrotubulus kölcsönhatás

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK

profilin-aktin: spontán nukleáció gátolt

ATP hidrolízis

FH2 domén elmozdul a + vég irányába

+

-

nukleáció

„nyitott”

„zárt”

„nyitott”

„zárt”

processziv elongáció a szöges végen a filamentumok szöges végéhez kötődik, ugyanakkor elősegíti a profilin-aktin filamentumba épülését

N: filamentum végek koncentrációja ↑ k+: asszociációs sebességi állandó ↑

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK FORMINOK

Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok polimerizációja formin jelenlétében Bni1p FH1-FH2 Aktin

Fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok elongációja mDia1 FH1-FH2 funkcionalizált mikrogyöngyökről

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFOGLALÁS Arp2/3 komplex

formin 2.5 mM aktin + 25 nM mDia1 FH1-FH2

2.5 mM aktin + 100 nM GST-VCA + 50 nM Arp2/3 1,0

pirén fluoreszcencia, a.u.

pirén fluoreszcencia, a.u.

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

0,0 0

500

1000

1500

2000

idõ, s

N: filamentum végek koncentrációja ↑

0

200

400

600

800

1000 1200

idő, s

N: filamentum végek koncentrációja ↑ k+: asszociációs sebességi állandó ↑

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFOGLALÁS Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok polimerizációja formin jelenlétében (DAAM FH1-FH2)

Teljes belső visszaverődéses fluoreszcencia mikroszkópia Egyedi aktin filamentumok polimerizációja Arp2/3 komplex jelenlétében

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: ADF/kofilin Az aktin ATPáz aktivitásának következménye: taposómalom egyensúly (treadmilling):

J(c)

Pi

növekedés a szöges végen

depolimerizáció a hegyes végen

ADP

CcB

ATP

T

D

0 [G-aktin]

Css

gyorsabb depolimerizáció a hegyes végen (~ 30x)

ADP

↑

J(c)

CcB

ATP

T

css

CcP

D

ADF

0

+ ADF [G-aktin] Css (ADF)

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: sapka fehérje J(c)

Pi

növekedés a szöges végen

depolimerizáció a hegyes végen

ADP

CcB

ATP

T

D

0 [G-aktin]

Css

CcP

capping/sapkázás  : gátolt növekedés a szöges végen

J(c) CP

capping gyorsabb növekedés a nem sapkázott szöges végeken

Ccb ADP

0

ATP

Css(Cp) = CcP T

css

↑

D

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: profilin J(c)

Pi

növekedés a szöges végen

depolimerizáció a hegyes végen

ADP

CcB

ATP

T

D

0 [G-aktin]

Css növekedés a szöges végen

gyorsabb ADP-ATP csere ADP

T

ATP

D

profilin

gátolt a spontán nukleáció

gátolt a hegyes végen való beépülés

CcP

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: összefoglalás -

capping

CP

polimerizáció

ADP

depolimerizáció

ATP

D

T

profilin

ADF thymosin b4 szekvesztráció

1.

spontán nukleáció

2.

nukleációs faktor által katalizált nukleáció

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 2. TAPOSÓMALOM EGYENSÚLYT SZABÁLYOZÓ FEHÉRJÉK: összefoglalás -

capping

CP

polimerizáció

depolimerizáció

~ 90 x ADP

ATP

D

T

profilin

ADF thymosin b4

szekvesztráció Filamentum turnover

in vitro in vivo 1.

2.

1 mm / 30 min mm / 20 spontán1nukleáció

s

nukleációs faktor által katalizált nukleáció

AZ AKTIN DINAMIKÁJÁNAK SZABÁLYOZÁSA 1. NUKLEÁCIÓS FAKTOROK

Aktin polimer mennyisége

Az aktin filamentumok képződésének sebessége: dF  k  Nc  k  N dt dF  (k szöges  k hegyes ) Nc  (k szöges  k hegyes ) N dt

Hogyan növelhető a polimrizáció sebessége?

N: filamentum végek koncentrációja ↑ k+: asszociációs sebességi állandó ↑ Idő, min

NUKLEÁCIÓS FAKTOROK ÖSSZEFOGLALÁS Arp2/3 komplex

formin 2.5 mM aktin + 25 nM mDia1 FH1-FH2

2.5 mM aktin + 100 nM GST-VCA + 50 nM Arp2/3 1,0

pirén fluoreszcencia, a.u.

pirén fluoreszcencia, a.u.

1,0

0,8

0,6

0,4

0,2

0,8 0,6 0,4 0,2 0,0

0,0 0

500

1000

1500

2000

idõ, s

N: filamentum végek koncentrációja ↑

0

200

400

600

800

1000 1200

idő, s

N: filamentum végek koncentrációja ↑ k+: asszociációs sebességi állandó ↑